PT116385B

PT116385B - Processo de obtenção de extrato enriquecido em florotaninos e extrato enriquecido em florotaninos de ação anti-enzimática para utilização em dermatologia

Info

Publication number: PT116385B
Application number: PT116385A
Authority: PT
Inventors: Filipe Pinto Pedrosa Rui; Isabel Mendes Martins Alice; Rita Martins Da Silva Joana; Miguel Da Maia Alves Celso; Filipa Gonçalves Pinteus Susete; Patrícia Freire Freitas Rafaela
Original assignee: Inst Politecnico De Leiria
Priority date: 2020-05-14
Filing date: 2020-05-14
Publication date: 2022-07-27
Also published as: PT116385A; EP3910064A1

Abstract

A PRESENTE INVENÇÃO ENQUADRA-SE NA ÁREA DA BIOTECNOLOGIA E DIZ RESPEITO A UM PROCESSO DE OBTENÇÃO DE UM EXTRATO ENRIQUECIDO EM FLOROTANINOS OBTIDO A PARTIR DE UMA ALGA MARINHA, PREFERENCIALMENTE FUCUS SPIRALIS. É TAMBÉM OBJETO DA PRESENTE INVENÇÃO, O EXTRATO ENRIQUECIDO EM FLOROTANINOS OBTIDO PELO DITO PROCESSO, COM AÇÃO ANTI-ENZIMÁTICA PARA APLICAÇÃO EM FORMULAÇÕES DERMATOLÓGICAS QUE RETARDAM O ENVELHECIMENTO DA PELE, NOMEADAMENTE ATRAVÉS DA INIBIÇÃO DA ATIVIDADE DAS ENZIMAS COLAGENASE E ELASTASE. O EXTRATO OBTIDO DO FRACIONAMENTO DA FUCUS SPIRALIS, OBJETO DA PRESENTE INVENÇÃO, É UM EXTRATO DE ACETATO DE ETILO CUJO O EFEITO INIBIDOR (IC50) SOBRE A ELASTASE É DE 3.0 ΜG/ML PARA UM INTERVALO DE CONFIANÇA ENTRE 2.54-3.57 ΜG/ML E UM EFEITO INIBIDOR(IC50)SOBRE A COLAGENASE DE 0.037 ΜG/ML PARA UM INTERVALO DE CONFIANÇA ENTRE 0.009-0.142 ΜG/ML.

Description

DESCRIÇÃO

PROCESSO DE OBTENÇÃO DE EXTRATO ENRIQUECIDO EM FLOROTANINOS E EXTRATO ENRIQUECIDO EM FLOROTANINOS DE AÇÃO ΑΝΤΙ-ENZIMÁTICA PARA UTILIZAÇÃO EM DERMATOLOGIA

ENQUADRAMENTO DA INVENÇÃO

A presente invenção enquadra-se na área da biotecnologia e diz respeito ao processo de obtenção de um extrato enriquecido em florotaninos obtido a partir de uma alga marinha, preferencialmente Fucus spiralis. É também objeto da presente invenção o extrato enriquecido em florotaninos obtido pelo processo, com ação anti-enzimática para aplicação em formulações dermatológicas que retardam o envelhecimento da pele, nomeadamente através da inibição da atividade das enzimas colagenase e elastase.

As metaloproteinases (MMPs) são enzimas responsáveis pela degradação de proteínas presentes na matriz celular. A nível dérmico, a colagenase destrói as fibras de colagénio e a elastase destrói a elastina, de modo a que possa ocorrer a substituição natural destas fibras no organismo humano. No entanto, ao longo do tempo, podem ocorrer estímulos extra e intracelulares que conduzem a um metabolismo desorganizado, destruindo de forma exacerbada a base estrutural da derme, contribuindo desta forma para o envelhecimento cutâneo.

- 2 Daí a importância da pesquisa de novos ingredientes bioativos que possam inibir o efeito destas enzimas, objetivo principal da presente invenção.

Com o avançar da idade, o corpo humano deixa de produzir elastina e o colagénio começa a perder a sua elasticidade e a enfraquecer, dando origem a um dos principais sinais exteriores de envelhecimento, as rugas. Para combater o envelhecimento da pele torna-se então fundamental uma alimentação saudável incluindo alimentos que possam retardar a degradação da elastina e do colagénio. Atualmente existem inúmeros estudos que apontam que uma alimentação rica em antioxidantes pode contribuir significativamente para desacelerar o processo de envelhecimento celular da pele, devido à capacidade de estes inibirem a ocorrência de reações enzimáticas que estão na origem da redução da elastina e do colagénio, nomeadamente, através da ação das enzimas elastase e colagenase.

Por outro lado, a exposição contínua à luz ultra violeta promove o aumento dos níveis de espécies reativas de oxigénio nas células, contribuindo, entre outros fatores, para o aumento da produção da elastase e da colagenase, bem como a ocorrência de processos inflamatórios que promovem uma pele mais fina, danos e flacidez, resultando em rugas e outros sinais de envelhecimento. Pelas razões apresentadas, as referidas enzimas têm sido alvo de estudos preferenciais para o desenvolvimento de produtos dermatológico, em especial formulações tópicas.

- 3 As algas marinhas têm na sua constituição vários componentes funcionais, como aminoácidos e proteínas essenciais, hidratos de carbono, pigmentos, minerais, polissacarídeos, fibras alimentares, vitaminas, ácidos gordos polinsaturados, compostos fenólicos e outros metabolitos secundários bioativos, com grande potencial para serem utilizados em produtos inovadores. Entre as algas marinhas, várias divulgações têm demonstrado o alto valor nutricional e funcional do género Fucus, descrito como uma excelente fonte de fibras e minerais na dieta, com uma alta variedade de compostos bioativos como fucoidanos, florotaninos, fucoxantina, entre outros, com inúmeras atividades biológicas, incluindo antioxidantes, antiinflamatórios, anti tumorais, antimicrobianos e outros.

extrato enriquecido em florotaninos, objeto da presente invenção, é preferencialmente extraído a partir da alga Fucus spiralis. Trata-se de uma alga castanha que se encontra em substratos rochosos na zona intertidal em margens protegidas ou moderadamente expostas. Pode crescer até um tamanho máximo de 40 cm e viver até quatro anos. Esta espécie encontra-se amplamente distribuída no Atlântico Norte (Islândia, Noruega, Dinamarca, Holanda, Reino Unido, Irlanda, costa atlântica da França, Espanha, Marrocos, Açores, costa leste da América, de Nova Jersey a Nova Escócia) [1] . Nos Açores, é essencialmente comercializada para fins alimentares suportando claramente o potencial de comercialização desta alga para novas aplicações como a apresentada nesta proposta.

Importa ainda referir que, o facto da alga Fucus spiralis, preferencialmente selecionada para obtenção do

- 4 extrato, ser também edível, representa uma vantagem do ponto de vista toxicológico, prevendo-se uma utilização segura para fins dermatológicos. Nos Açores, esta espécie é considerada um petisco e conhecida como tremoço do mar, devido às porções reprodutivas terminais do seu talo serem recolhidas e consumidas frescas [2] .

Assim, para além das conhecidas vantajosas propriedades antioxidantes, anti-inflamatórias, anti tumorais, antimicrobianas da espécie Fucus spiralis, a presente invenção tem como principal objetivo o desenvolvimento de soluções que providenciem novos ingredientes bioativos que possam inibir o efeito destas enzimas e com utilização dermatológica.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A aplicação de extratos de macroalgas com efeitos inibidores sobre as enzimas hialuronidase, colagenase e elastase, responsáveis pela degradação da matriz cutânea, foi já divulgada para várias espécies de algas castanhas.

A presente invenção encontra antecedentes mais próximos na aplicação de outras espécies de algas castanhas, nomeadamente da espécie de Fucus, a Fucus vesiculosus, explorada há largos anos como fonte de ingredientes para aplicação dermatológica. Verifica-se que a utilização desta espécie, muito embora com resultados positivos, apresenta a desvantagem de já se encontrar amplamente explorada a nível industrial, pelo que a espécie selecionada na presente invenção, para além de estar largamente disponível na natureza, tem igualmente um elevado poder antioxidante,

- 5 contribuindo fortemente para a sua aplicação em dermocosmética, devido às suas propriedades antioxidantes, antienzimáticas, fotoprotetoras e manutenção do microbioma natural da pele.

Além do mais, os estudos divulgados realizados com a espécie Fucus vesiculosus focam-se essencialmente na atividade anti enzimática de polissacarideos sulfatados, nomeadamente fucoidanos, pelo que diferem da presente invenção pelo facto de não incidirem sobre extratos enriquecidos em florotaninos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção tem como objetivo a obtenção de um extrato com ação anti enzimática com potencial para aplicação dermatológica, mais em concreto a obtenção de um extrato obtido a partir de uma alga com uma ação anti enzimática sobre as enzimas colagenase e elastase, responsáveis pela degradação da matriz cutânea associada ao envelhecimento da pele e formação de rugas.

A presente invenção refere-se assim a um processo de obtenção de um extrato enriquecido em florotaninos que se inicia com a colheita de algas do género Fucus, preferencialmente da espécie Fucus spiralis , seguida de uma extração da biomassa seca e pulverizada em Soxhlet, usando etanol/água a 70%, seguido de evaporação à secura da solução hidro-alcoólica obtida, ressuspensão do extrato seco resultante da evaporação e, por fim, o fracionamento dos

- 6 componentes em diferentes extratos, com a obtenção de um extrato de acetato de etilo enriquecido em florotaninos.

A presente invenção refere-se ainda a um extrato de acetato de etilo de Fucus, enriquecido em florotaninos, preferencialmente um extrato de Fucus spiralis.

Num modo preferencial de realização da invenção o extrato de acetato de etilo de Fucus spiralis enriquecido em florotaninos contém Trifucol, Tetrafucol ou Fucodiphloroethol ou os seus isómeros, Trifucophlorethol ou seus isómeros, Hexafucol ou seus isómeros, Difucotetraphloroethol ou Trifucotriphloethol ou seus isómeros e Tetrafucotetraphlorethol ou Pentafucodiphlorethol ou Hexafucophlorethol ou seus isómeros.

Num modo ainda mais preferencial de realização da invenção o extrato de Fucus spiralis enriquecido em florotaninos apresenta um IC50 (concentração do fármaco que induz metade do efeito máximo) de 0.037 pg/mL sobre a colagenase para um intervalo de confiança de 0.009-0.142 pg/mL e um IC50 de 3.0 pg/mL sobre a elastase para um intervalo de confiança de 2.54-3.57 pg/mL. O efeito inibidor do extrato sobre a colagenese e elastase é superior ao observado noutras espécies de algas utilizadas e reportadas na literatura.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1 - Atividade citotóxica do extrato de acetato de etilo de Fucus spiralis, enriquecido em

- 7 florotaninos, em queratinócitos (HaCat) numa concentração de 1 mg/mL.

Figura 2 - Atividade inflamatória do extrato de acetato de etilo de Fucus spiralis , enriquecido em florotaninos, numa concentração de 300 pg/mL num modelo celular do tipo RAW264.7 e usando lipopolissacarideos como controlo positivo.

Figura 3 - Atividade anti-colagenase do extrato de acetato de etilo de Fucus spiralis, enriquecido em florotaninos, num intervalo de confiança de 0.009-0.142 pg/mL e usando epigalocatequina gaiato como composto de referência.

Figura 4 - Atividade anti-elastase do extrato de acetato de etilo de Fucus spiralis , enriquecido em florotaninos, num intervalo de confiança de 2.54-3.57 pg/mL e usando epigalocatequina gaiato como composto de referência.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Descrevem-se, de seguida, as diversas etapas de execução da invenção bem como a demonstração de resultados que corroboram a ação anti-enzimática do extrato enriquecido em florotaninos.

Preparação da biomassa algal

Para a obtenção de uma composição contendo florotaninos é colhida a macroalga Fucus spiralis. A título

- 8 informativo, os ensaios a ser demonstrados nas próximas seções correspondem à macroalga Fucus spiralis colhida na costa portuguesa, mais especificamente na praia da Consolação, em Peniche, a 1 de outubro de 2019. De seguida, a alga fresca é lavada, primeiro com água do mar e, posteriormente, com água destilada, de modo a remover organismos invertebrados, areia e outros contaminantes marinhos; é de seguida pesada, acondicionada, congelada a 80 °C e liofilizada. Por último, a alga, agora biomassa algal seca, é moida e armazenada em local fresco e seco, ao abrigo da luz, onde permanece até à etapa da extração.

Extração

Para a extração de florotaninos com elevado grau de pureza, isto é, sem a presença, ou com reduzida percentagem de outros grupos de compostos existentes nas macroalgas, procedeu-se a uma extração da biomassa seca e pulverizada de Fucus spiralis em Soxhlet, usando etanol/água (70%) como solvente. Após esgotamento, a solução hidroalcoólica obtida foi evaporada à secura, sob vácuo, a 40°C, em evaporador rotativo.

Selecionou-se o método de extração descrito pelo facto de ser um método de extração que permite uma separação prévia de diferentes grupos de compostos presentes nas algas. Ao proceder-se a este fracionamento cada um dos extratos fica enriquecido em diferentes grupos de constituintes, de acordo com a sua afinidade para cada um dos solventes utilizados.

- 9 Frações extraídas

Posteriormente, o extrato seco resultante foi ressuspendido em água Milli-Q a cerca de 80°C e homogeneizado. Após arrefecimento à temperatura ambiente, a suspensão foi filtrada em papel de filtro (n°4), tendo-se obtido duas frações: sólida (retida no papel de filtro) e aquosa (recolhida em balão Erlenmeyer). A fração aquosa foi submetida a uma extração L/L sequencial, primeiro com éter etílico e, seguidamente, com acetato de etilo. As fases orgânicas foram secas com sulfato de sódio, filtradas, e evaporadas à secura em evaporador rotativo. A fração aquosa remanescente foi congelada e liofilizada. Esta sequência de extrações permitiu o fracionamento dos diferentes componentes de Fucus spiralis, originando quatro extratos de composição química distinta:

• extrato sólido apoiar;

• extrato de éter etílico;

• extrato de acetato de etilo; e • extrato aquoso polar.

Caraterização do extrato de acetato de etilo de Fucus spiralis

Foi efetuada uma análise qualitativa do extrato enriquecido em florotaninos por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a espetrometria de massa (LCMS). Os dados espetrais obtidos foram comparados com os da literatura.

Segundo a literatura, muitos estudos recorrem ao uso de espetrometria de massa tandem (LCMS/MSⁿ) para a identificação

- 10 deste grupo de compostos. No presente caso foi utilizada a LCMS, tendo os espetros de massa sido adquiridos nos modos positivo [M+H]+ e negativo [M-H]~ de forma a confirmar as massas moleculares correspondentes a cada pico.

M (m/ z)	[M-H] - (m/z)	[M+H] ⁺ (m/z)	Outros iões	Tentativa de identificação	Referências
374	373	375	—	Trifucol	[3-5]
498	497	499	—	Tetrafucol ou
				Fucodiphloroethol	[4-7]
498	497	499	—	ou seus isómeros
	621	623		Trifucophlorethol ou	[3-5]
62 2	—
				seus isómeros
			1493
746	745	747	[2M+H] + *	Hexafucol ou seus isómeros	[5-8]
			1493
746	745	747	[2M+H]+ *
870	869	871	—	Difucotetraphloroethol ou Trifucotriphloethol	[4-7]
870	869	871	—	ou seus isómeros
994	993	995	496 [M—	Tetrafucotetraphlorethol
	2H] ²-	Λ
994	993	995	496 [M—	ou Pentafucodiphlorethol	[5-7]
	2H] ²-	ou Hexafucophlorethol ou
994	993	995	—	seus isómeros

Tabela 1 - Tentativa de identificação de florotaninos presentes no extrato de acetato de etilo de Fucus spiralis.

A metodologia usada para a obtenção do extrato rico em florotaninos permitiu obter este grupo de compostos com

- 11 um grau de pureza elevado e boa estabilidade química, uma vez que não foram observadas alterações no perfil químico ao longo do tempo, quando avaliadas por cromatografia em camada fina e cromatografia líquida de alta eficiência.

Avaliação do potencial biológico dos extratos potencial biológico foi analisado para cada extrato, mais em concreto a inibição da colagenase, a inibição da elastase, o potencial antioxidante (inibição de espécies reativas de oxigénio), potencial não citotóxico, fotoprotetor, e não indutor da inflamação.

Avaliou-se o efeito inibidor dos diferentes extratos obtidos (IC50 - concentração do fármaco que induz metade do efeito máximo) em função de um determinado intervalo de concentrações testado, sobre as enzimas colagenase e elastase, para cada extrato obtido, recorrendo a kits analíticos específicos para cada uma das enzimas, e seguindo as especificações do fabricante, demonstrando-se na seguinte tabela os resultados.

Extrato	IC50 Colagenase [pg/mL]	IC50 Elastase [pg/mL]
Etanólico total	391.6 (328.70-466.60)	>1000
Acetato de etilo	0.037 (0.009-0.142)	3.01 (2.54-3.57)
Aquoso	31.3 (28.40-34.50)	586.5 (445.80 - 771.60)

Epigalocatequina gaiato (composto de referência)

4.8 (4.10-5.50)

113.9 (80.70-160.00)

Tabela 2 - Efeito inibidor (ICso)dos diferentes extratos obtidos em função do intervalo de concentrações testado sobre as enzimas colagenase e elastase.

A fração de extrato de éter etílico não foi testada devido ao baixo rendimento obtido resultante da extração.

Os resultados da atividade anti-enzimática foram analisados tendo em conta os valores de IC50 obtidos.

Verificou-se assim que, o extrato de acetato de etilo, em muito baixas concentrações, é um potente inibidor da colagenase com um IC50 de 0.037 pg/mL para um intervalo de confiança de 0.009-0.142 pg/mL e da elastase com um IC50 = 3.0 pg/mL para um intervalo de confiança de 2.54-3.57 pg/mL.

Os resultados obtidos são muito relevantes quando comparados com a atividade inibidora de um extrato de Fucus vesiculosus (contendo 60% de fucoidano e 30% de polifloroglucinol), sobre as enzimas elastase (IC50 = 76 pg/mL) e colagenase (IC50 = 60 pg/mL) reportados por [9]

Extrato	IC50 Colagenase [pg/mL]	IC50 Elastase [pg/mL]
Extrato de acetato de etilo - Fucus spiralis	0.037 (0.009-0.142)	3.0 (2.5-3.6)
Fucus vesiculosus	76.0	60.0

- 13 Tabela 3 - Comparação entre o efeito inibidor do extrato de acetato de etilo da Fucus spiralis e de um extrato de Fucus vesiculosus sobre as enzimas colagenase e elastase.

Avaliação da atividade citotóxica do extrato de acetato de etilo

A atividade citotóxica do extrato de acetato de etilo foi igualmente avaliada num modelo in vitro de queratinócitos humanos (células HACaT), como descrito de seguida.

As células HaCat foram mantidas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro bovino, 100 U de penicilina G, 100 pg de estreptomicina, 2 mM L-glutamina e mantidas a 95% de humidade e 5% de CO2 a 37 °C. As células foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 4xl0⁴ células/poço) e incubadas durante a noite. Após este período, as células foram tratadas com o extrato a uma concentração de 1000 pg/mL durante 24 horas. O efeito citotóxico foi estimado através do ensaio colorimétrico MTT (brometo de 3-[4, 5dimetiltiazol-2-il]-2, 5-difeniltetrazólio).

O facto do extrato, na concentração referida, não revelar citotoxicidade num modelo in vitro de queratinócitos humanos, e tal como demonstrado através do gráfico na figura 1, constitui um primeiro indicador de que não existirá toxidade para a pele, mais em concreto na epiderme.

- 14 A atividade inflamatória do extrato foi avaliada no modelo celular RAW264.7 a fim de verificar se este estimulava uma resposta inflamatória através da quantificação de óxido nítrico. As células RAW264.7 foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 5xl0⁴células/poço e incubadas durante a noite. Após este período, as células foram tratadas com o extrato enriquecido em florotaninos a uma concentração não tóxica (300 pg/mL) para avaliar se o extrato induzia uma resposta inflamatória. Esta resposta foi avaliada através da quantificação dos níveis de óxido nítrico. Foram utilizados lipopolissacarídeos como controlo positivo. Importa ainda referir que o extrato não revelou citotoxicidade a concentrações abaixo de 300 pg/mL nos modelos celulares testados, nem estimulou a produção de óxido nítrico. Os resultados encontram-se demonstrados no gráfico da figura 2.

Caso o extrato induzisse a inflamação no modelo estudado, não poderia ser utilizado em formulações dermatológicas. Os resultados obtidos nos ensaios in vitro permitiram concluir que, abaixo de 300 pg/mL, o extrato não induziu um processo inflamatório nas células estudadas. Trata-se de uma informação adicional que suporta a segurança do extrato para aplicação dermatológica.

Além da marcada atividade anti-enzimática evidenciada por este extrato enriquecido em florotaninos, também foi possível observar um elevado poder antioxidante, assim como uma potente capacidade de reduzir a produção de espécies reativas de oxigénio, no modelo celular de

- 15 queratinócitos (HaCat) quando expostos a peróxido de hidrogénio ou radiação ultravioleta.

Todos estes efeitos foram observados a concentrações não citotóxicas. Estes resultados sugerem que a utilização deste extrato em formulações dermatológicas poderá apresentar múltiplas atividades biológicas que contribuam para o retardamento do envelhecimento da pele.

Assim, o extrato enriquecido em florotaninos, objeto da presente invenção, é utilizado na inibição da atividade da colagenase e da elastase e utilizado na prevenção do envelhecimento da pele e no tratamento das rugas.

Uma formulação dermatológica contendo o extrato enriquecido em florotaninos é utilizado como ingrediente ativo único ou em combinação com um ou mais ingredientes ativos e utilizado na prevenção do envelhecimento da pele e tratamento das rugas.

REFERÊNCIAS

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[3] Lopes, G.; Barbosa, M.; Vallejo, F.; Gil-Izquierdo, Á.; Andrade, P.B.; Valentão, P.; Pereira, D.M.; Ferreres, F. Profiling phlorotannins from Fucus spp. of the Northern Portuguese coastline: Chemical approach by HPLC-DAD-ESI/MSn and UPLC-ESI-QTOF/MS. Algal Research 2018, 29, 113-120.

[4] Hermund, D.B.; Plaza, M.; Turner, C.; Jónsdóttir, R.; Kristinsson, H.G.; Jacobsen, C.; Nielsen, K.F. Structure dependent antioxidant capacity of phlorotannins from Icelandic Fucus vesiculosus by UHPLC-DAD-ECD-QTOFMS. Food Chemistry 2018, 240, 904-909.

[5] Catarino, M.D.; Silva, A.M.S.; Mateus, N.; Cardoso, S.M. Optimization of Phlorotannins Extraction from Fucus vesiculosus and Evaluation of Their Potential to Prevent Metabolic Disorders. Marine Drugs 2019, 17, 162.

[6] Ferreres, F.; Lopes, G.; Gil-Izquierdo, A.; Andrade, P.B.; Sousa, C.; Mouga, T.; Valentão, P. Phlorotannin Extracts from Fucales Characterized by HPLC-DAD-ESI-MSn: Approaches to Hyaluronidase Inhibitory Capacity and Antioxidant Properties. Marine Drugs 2012, 10, 2766-2781.

[7] Tierney, M.S.; Soler-Vila, A.; Rai, D.K.; Croft, A.K.; Brunton, N.P.; Smyth, T.J. UPLC-MS profiling of low molecular weight phlorotannin polymers in Ascophyllum nodosum, Pelvetia canaliculata and Fucus spiralis. Metabolomics 2014, 10, 524-535.

[8] Pan, Η. A non-covalent dimer formed in electrospray ionisation mass spectrometry behaving as a precursor for

- 17 fragmentations. Rapid Communications in Mass Spectrometry 2008, 22, 3555-3560.

[9] Fitton, J.H., Dell'Acqua, G., Gardiner, V-A., Karpiniec, S . S.,Stringer, D.N., Emma Davis, E.Topical Benefits of Two Fucoidan-Rich Extracts from Marine Macroalgae.Cosmetics 2015, 2, 66-81; doi:10.3390/cosmetics2020066

Leiria, 21 de maio de 2020

Claims

REIVINDICAÇÕES

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Figura 1

Figura 2

1. Processo de obtenção de um extrato enriquecido em florotaninos caracterizado por compreender as seguintes etapas:

a) colheita de algas da espécie Fucus spiralis;

b) extração da biomassa seca e pulverizada da alga colhida de Fucus spiralis em Soxhlet, usando etanol/água a 7 0%;

c) evaporação à secura, sob vácuo, da solução hidroalcoólica obtida na etapa b) a uma temperatura de 40°C;

d) ressuspensão do extrato seco obtido na etapa c) em água Milli-Q a 80°C;

e) fracionamento da suspensão contendo os componentes de Fucus spiralis em extrato sólido apoiar, extrato de éter etílico, extrato de acetato de etilo e extrato aquoso polar;

f) obtenção de um extrato de acetato de etilo enriquecido em florotaninos.

2. Processo de obtenção de um extrato enriquecido em florotaninos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o extrato obtido na etapa f) conter Trifucol, Tetrafucol ou fucodifloroetol ou seus isómeros, trifucofloroetol ou seus isómeros, Hexafucol ou seus isómeros, difucotetrafloroetol ou trifucotrifloroetol ou seus isómeros e tetrafucotetrafloroetol ou pentafucodifloroetol ou hexafucofloroetol ou seus isómeros.

3. Extrato enriquecido em florotaninos obtido pelo processo descrito nas reivindicações 1 e 2 caracterizado por ser um extrato de acetato de etilo e conter Trifucol, Tetrafucol ou fucodifloroetol ou seus isómeros, trifucofloroetol ou seus isómeros, Hexafucol ou seus isómeros, difucotetrafloroetol ou trifucotrifloroetol ou seus isómeros e tetrafucotetrafloroetol ou pentafucodifloroetol ou hexafucofloroetol ou seus isómeros.

4. Extrato enriquecido em florotaninos, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por apresentar um IC50 de 0.037 pg/mL sobre a colagenase para um intervalo de confiança de 0.009-0.142 pg/mL e um IC50 de 3.0 pg/mL sobre a elastase para um intervalo de confiança de 2.54-3.57 pg/mL.

5. Extrato enriquecido em florotaninos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 e 4, caracterizado por ser para uso na inibição da atividade da colagenase e da elastase.

6. Extrato enriquecido em florotaninos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 e 4, caracterizado por ser para uso na prevenção do envelhecimento da pele e no tratamento das rugas.

7. Formulação dermatológica contendo o extrato enriquecido em florotaninos conforme definido em qualquer uma das reivindicações 3 a 6, caracterizado por ser como ingrediente ativo único ou em combinação com um ou mais ingredientes ativos.

8. Formulação dermatológica, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por ser para uso na prevenção do envelhecimento da pele e tratamento das rugas.
- 2/2 120 η φ

§ 100Φ Q fõ 80 ο Α φ 8 60Ο

-τ- Lxtrato b. spirsfis: IC₅₅ = 0Ό37 ug/mL (0.012 - 0.12}

-· - Epigaiocatequifia gaiato s 4.08 μβ/ml (4.08 - 5.55)

0^J : i

I (

íog [ug/mL]

Figura 3

-a Extístrj F. jfràââS·: IC_3Ç -- 3.01 μ$ΛΆ {2.54 - 3.5?)

Esigaiocaisqotría gaiato : 1C_5S = 113.9 ^.g/mt (80.67 -160.0}

—f i-------1-------ία -2 0 2 iog íng^mll

Figura 4