KR20200081542A

KR20200081542A - 대황(Eisenia bicyclis) 추출물을 유효성분으로 하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR20200081542A
Application number: KR1020180170136A
Authority: KR
Inventors: 김명욱; 김은주; 임수빈; 김종석
Original assignee: 재단법인 환동해산업연구원; 영덕군
Priority date: 2018-12-27
Filing date: 2018-12-27
Publication date: 2020-07-08

Abstract

본 발명은 대황 추출물을 유효성분으로 하는 화장료 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로는 대황을 에탄올이나 물을 이용하여 유용성분을 추출하고 이를 이용하여 항산화, 항염증 및 피부 주름 개선에 효과가 있는 대황 추출물을 유효성분으로 하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

대황(Eisenia bicyclis) 추출물을 유효성분으로 하는 화장료 조성물{COMPOSITION FOR COSMETIC COMPRISING COMPOUNDS EXTRACTED FROM EISENIA BICYCLIS}

생활과 소득 수준이 높아지고 향상되면서 사람들은 의식주에 따른 일상적인 라이프스타일에서 벗어나 개인의 미적 생활에도 관심이 증대되고 있다(기능성 화장품과 기능성 식품의 구매 형태 및 선호도에 관한 연구. 편이숙. 서경대학교 대학원. 석사학위논문. 2010.). 특히, 현대의학의 발전으로 인하여 평균수명이 늘어나고 여유로워짐에 따라 노화방지, 피부건강 등에도 많은 관심을 가지고 있다(Kim, S.H. Yong, H.J. Shin, C. and Ko, S.G. Research of traditional herbal medicines for anti-aging, inhibition effect of wrinkle and whitening effect in the skin. Korean J . Ori. Physiol. Pathol. 2008, 22, 691-698.).

피부의 노화는 그 요인에 따라 내인적 노화와 외인적 노화로 구분할 수 있다. 내인적 노화는 피부의 구조와 생리적 기능이 나이를 먹으면서 쇠퇴하는 것이며, 외인적 노화는 태양광선 등 누적된 외부 스트레스에 의해 노화 현상이 나타나는 것이다. 특히 각종 오염물질과 자외선 노출 등 외인적 노화에 의해 피부가 얇아지며, 주름이 증가되고 탄력이 감소될 뿐만 아니라, 기미, 주근깨 및 검버섯이 증가하게 된다(Gilchrest BA. Skin aging and photoaging. Dermatol Nurs. 1990, 2, 79-82., Kang, K.S. Kim, I.D. Kwon, R.H. Heo, Y.Y. Oh, S.H. Kim, M.A. Jung, H.J. Kang, H.Y. Ha, B.J. The evaluation of anti-wrinkle effects in oriental herb extract. J . Life Sci , 2007, 17, 1147-1151.). 피부 노화가 진행될수록 피부를 구성하는 물질인 콜라겐, 엘라스틴, 히알루론산 등 구조 단백질을 생성하는 능력이 감소하고 type-1 collagenase의 생합성이 증가하여 matrix metalloproteinases(MMPs)의 발현이 증가되면 진피 내 교원 섬유, 탄력 섬유, fibronectin과 같은 기질 단백질 분해를 유도하여 피부탄력을 떨어뜨리고 피부 주름생성을 야기한다(Brenneisen P, Sies H, Scharffetter-Kochannek K. “Ultraviolet-B irradiation and matrix metalloproteinases: from induction via signaling to initial events” Ann. N. Y. Acad. Sci , 2002, 973, 31-43.).

이러한 피부 노화 및 주름 생성 방지 등 피부 건강뿐만 아니라 신체 전반적인 건강 유지 및 향상을 위해 다양한 천연물을 이용한 화장품, 식품 및 의약품 등의 연구가 활발하게 이루어지고 있다.

우리나라에는 3면이 바다로 이루어져 있어 해역에 서식하는 해조류의 종류가 매우 다양하고 풍부하다. 이들 해조류는 오래 전부터 식용, 호료, 약용, 해조공업의 원료, 비료 등으로 널리 이용되어 왔다. 최근에는 해조류에 식물 못지않게 다양한 기능성 성분을 함유하고 있어 이러한 기능성 성분의 분리와 그 효능의 검증 및 활용에 대해 활발히 연구되어지고 있다(Choi, D.M., Kim, D.S., Lee, D.S., Kim, H.R., and Pyeun, J.H. 1995. Trace components and functional sacchsrides in seaweed-1. J. Korean Fish. Soc. 28 : 49-59.).

대형 갈조류 대황(Eisenia bicyclis)은 갈조강 다시마목 감태과 대황속에 속하는 다년생 해조류로, 우리나라 울릉도, 독도에 대군락을 형성하고 있으며 동해안에서는 경북 영덕에 군락이 발달해 있다(대황 배우체와 아포체의 생장에 미치는 온도, 광량, 광주기의 영향. 이민정. 경상대학교 대학원. 석사학위논문. 2018.). 대황에는 요오드와 칼륨이 다량 함유되어 있고, 독특한 맛으로 인해 옛날부터 다시마 대용으로 식용이 되어 지고 있으며, 최근에는 알긴산의 원료로 이용되고 있다(대황 추출물의 생리활성과 응용. 김대용. 부경대학교 대학원. 석사학위논문.2009.).

대황의 기능성에 대한 연구도 활발하게 이루어지고 있는데, 특히 항균(Eom SH, Lee BJ and Kim YM. 2010. Effect of yeast fermentation on the antioxidant and anti-inflammatory activity of sea tangle water extract. Korean J Fish Aquat Sci 43, 117-124.), 항염증(Jung, HA, Jin SE, Ahn BR, Lee CM and Choi JS. 2013. Anti-inflammatory activity of edible brown alga Eisenia bicyclis and its constituents fucosterol and phlorotannins in LPS-stimulated RAW264.7 macrophages. Food Chem Toxicol 59, 199-206.), 항고지혈증(Jang YH, Choi SW and Cho SH. 2008. Effect of Eisenia bicyclis and its pill on serum lipid status in rats fed high fat diet. Korean J Food Nutri 41, 5-12.), 항당뇨(Okada Y, Ishimaru A, Suzuki R and Okuyama T. 2004. A new phloroglucinol derivative from the brown alga Eisenia bicyclis: potential for the effective treatment of diabetic complications. J Nat Prod 67, 103-105.) 등의 다양한 효능을 가지고 있다고 보고되어 있다. 또한, 대황은 플로로탄닌과 같은 생리활성 물질을 다량 함유하고 있고, 대황에서 분리된 플로로탄닌은 eckol과 phlorofucofuroeckol-A, dieckol, 8,8’-bieckol 등이 있으며 항산화 활성을 지닌다고 보고되고 있다(Okada Y, Ishimaru A, Suzuki R and Okuyama T. 2004. A new phloroglucinol derivative from the brown alga Eisenia bicyclis: potential for the effective treatment of diabetic complications. J Nat Prod 67, 103-105.).

한편, 한국공개특허 제10-2013-0141874호에는 대황 유래 플로로탄닌 화합물을 유효성분으로 하는 항균성 조성물에 관한 것으로서, 상기 항균제 조성물은 특히 MRSA(Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus)에 대해 매우 우수한 항균활성을 갖는 플로로탄닌 화합물을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물에 대해 개시하고 있다.

한국등록특허 제10-0966128호는 해조류 대황으로부터 대황분말 제조, 압출성형 및 효소가수분해에 의하여 제조되는 고지혈증 및 당뇨 치료 효과를 갖는 대황 효소추출물, 상기 대황 효소추출물에 대황분말, 다시마분말 및 부형제를 혼합하여 제조되는 대황정제환 및 이의 제조방법에 대해 개시하고 있다.

한국공개특허 제10-2011-0057586호는 갈조류 대황 분말, 대황 효소추출물, 다시마 분말 및 부형제로 이루어진 당뇨병 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 당뇨병 개선용 건강기능식품 조성물에 대해 개시하고 있다.

상기와 같이 대황에 대한 다양한 연구가 진행되고 있으며 그 기능성이 알려지고 있으나, 아직까지 그 활용도가 미흡하며, 특히 피부 개선에 대한 기능성 검증 및 화장료 등에 대한 산업적 응용은 매우 저조한 실정이다.

한국공개특허 제10-2013-0141874호(2013.12.27.) 한국등록특허 제10-0966128호(2010.06.17.) 한국공개특허 제10-2011-0057586호(2011.06.01.)

본 발명은 상술한 것과 같은 문제점을 해결하고 필요한 기술을 제공하기 위해 안출된 것으로서,

본 발명은 항산화, 항염증 및 피부 주름 개선에 효과가 있는 화장료 조성물을 제공하기 위하여 해조류 대황을 이용하여 이를 추출 및 농축한 것을 이용한 화장료 조성물을 제공함에 그 목적이 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 실시 형태로서,

본 발명은 대황 추출물을 유효성분으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.

이때, 상기 대황 추출물은 건조하여 분쇄한 대황 100중량부에 대해 800 내지 1200중량부의 에탄올을 첨가한 후, 실온에서 20 내지 25시간 동안 추출하여 대황 추출액을 제조하는 추출단계; 상기 추출단계에서 제조된 대황 추출액에 함유된 고형분을 분리 제거하고, 고형분이 제거된 추출액을 40 내지 50℃의 온도에서 감압농축하여 10 내지 20Brix의 대황 농축액을 제조하는 농축단계; 및 상기 농축단계에서 제조된 대황 농축액을 -70 내지 -80℃의 온도에서 동결시킨 후 이를 동결건조하여 대황추출물을 제조하는 동결건조단계;를 포함하여 제조되는 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 상기 대황 추출물은 건조하여 분쇄한 대황 100중량부에 대해 800 내지 1200중량부의 물을 가한 후, 90 내지 100℃에서 2 내지 3시간 동안 추출하여 대황 추출액을 제조하는 추출단계; 상기 추출단계에서 제조된 대황 추출액에 함유된 고형분을 분리 제거하고, 고형분이 제거된 추출액을 60 내지 70℃의 온도에서 감압농축하여 10 내지 20Brix의 대황 농축액을 제조하는 농축단계; 및 상기 농축단계에서 제조된 대황 농축액을 -70 내지 -80℃의 온도에서 동결시킨 후 이를 동결건조하여 대황추출물을 제조하는 동결건조단계;를 포함하여 제조되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서 상기 화장료 조성물은 화장수, 로션, 세럼, 마사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 바디로션으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 제형으로 제조되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 일 실시형태에 따른 대황 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물은 대황을 에탄올이나 물을 이용하여 유용성분을 추출하고 이를 이용하여 화장료 조성물을 제조함으로써 항산화, 항염증 및 피부 주름 개선의 장점이 있음에 따라 다양한 제형의 화장료 조성물로 사용될 수 있다.

도 1은 대황 추출물에 대한 DPPH radical 소거능을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 대황 추출물에 대한 ABTS radical 소거능을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 대황 추출물에 대한 SOD 유사활성 측정 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 대황 추출물에 대한 Superoxide dismutase (SOD) 효소활성 측정 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 대황 추출물에 대한 세포생존률 확인 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 RAW 264.7 cell에 대한 대황 추출물의 세포 독성 측정 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 대황 추출물에 대한 Nitric oxide 저해율 측정 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 Western blot을 통한 대황 추출물의 iNOS 생성저해 측정 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9는 Western blot을 통한 대황 추출물의 COX-2 생성저해 측정 결과를 나타내는 그래프이다.
도 10은 Real-time PCR 분석을 통한 대황 추출물의 iNOS 및 COX-2 발현 억제 효능 결과를 나타내는 그래프이다.
도 11은 HaCaT cell에 대한 대황 추출물의 세포 독성 측정 결과를 나타내는 그래프이다.
도 12는 Western blot을 통한 대황 추출물의 MMP-1 단백질 발현 측정 결과를 나타내는 그래프이다.

이하, 본원의 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시형태를 들어 상세히 설명한다. 본 발명의 실시형태는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다. 따라서, 본 발명의 실시형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시형태로 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 “포함”한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 발명의 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 “약”, “실질적으로” 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용 오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본 발명의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다.

본 발명은 대황 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물(이하, ‘화장료 조성물’이라고도 함)을 제공한다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 대황에 에탄올이나 물을 가하여 추출한 대황 추출액을 농축 및 동결건조하여 제조한 대황 추출물을 유효성분으로 함유하는 것으로, 항산화, 항염증, 주름 개선 효과가 높을 것으로 기대된다.

본 발명의 일 실시형태에 따르면, 상기 화장료 조성물에 포함되는 대황 추출물은 건조하여 분쇄한 대황 100중량부에 대해 800 내지 1200중량부의 에탄올을 첨가한 후 실온에서 20 내지 25시간 동안 추출하여 대황 추출액을 제조하는 추출단계, 상기 추출단계에서 제조된 대황 추출액에 함유된 고형분을 분리 제거하고, 고형분이 제거된 추출액을 40 내지 50℃의 온도에서 감압농축하여 10 내지 20Brix의 대황 농축액을 제조하는 농축단계 및 상기 농축단계에서 제조된 대황 농축액을 -70 내지 -80℃의 온도에서 동결시킨 후 이를 동결건조하여 대황추출물을 제조하는 동결건조단계를 포함하여 제조한 것임을 특징으로 할 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시형태에 따르면, 상기 화장료 조성물에 포함되는 대황 추출물은 건조하여 분쇄한 대황 100중량부에 대해 800 내지 1200중량부의 물을 가한 후, 90 내지 100℃에서 2 내지 3시간 동안 추출하여 대황 추출액을 제조하는 추출단계, 상기 추출단계에서 제조된 대황 추출액에 함유된 고형분을 분리 제거하고, 고형분이 제거된 추출액을 60 내지 70℃의 온도에서 감압농축하여 10 내지 20Brix의 대황 농축액을 제조하는 농축단계 및 상기 농축단계에서 제조된 대황 농축액을 -70 내지 -80℃의 온도에서 동결시킨 후 이를 동결건조하여 대황추출물을 제조하는 동결건조단계를 포함하여 제조한 것임을 특징으로 할 수 있다.

대황 추출물 제조 시 상기와 같이 한정한 범위를 벗어날 경우, 추출물 내에 유용성분의 함량이 낮거나 묽은 농도로 인해 항산화, 항염증 및 피부 주름 개선 효과를 기대할 수 없으며, 반대로 추출물의 농도가 너무 높아 항산화, 항염증 및 피부 주름 개선 효과가 향상 효과를 가질 수 있을지라도 화장료 제조에 있어 제조단가가 높아지고 오히려 피부 독성 또한 발생할 수 있다는 우려가 있다.

이때, 대황 추출물을 화장료 조성물로 이용할 때 상기 화장료 조성물은 대황 추출물이 화장료 조성물 전체 중량%에 대해 0.1 내지 90중량%의 비율로 포함되는 것을 특징으로 할 수 있다.

이는 화장료 조성물 전체 중량%에 대해 대황 추출물이 0.1중량% 미만의 비율로 포함되는 경우에는 항산화, 항염증 및 피부 주름 개선 효과가 제대로 발현되지 않을 수 있으며, 화장료 조성물 전체 중량%에 대해 대황 추출물이 90중량%를 초과하는 비율로 포함되는 경우에는 화장료 제조에 있어 제조단가가 높아진다는 문제점이 발생할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 통상의 방법에 화장수, 로션, 세럼, 마사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 바디로션으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 제형으로 제형화하여 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 구체적인 실시예에 따라 상세히 설명한다. 본 발명의 일 실시형태에 따라 제조된 화장료 조성물은 대황 추출물 수율 및 수득량 측정 실험, 영양소 분석 실험, 무기질 및 중금속 측정 실험, 구성 아미노산 측정 실험, 유리 아미노산 측정 실험, 지방산 조성 실험, 항산화 효과 실험, 항염증 효과 실험, 주름 개선 효과 실험을 실시하였다. 본 발명의 일 실시형태에 따른 화장료 조성물은 후술하는 실험에 의하여 보다 명확하게 이해될 수 있다.

대황 추출물의 제조(1) : 에탄올 추출물 제조

1. 추출단계 : 건조하여 분쇄한 대황 100중량부에 대해 1000중량부의 에탄올을 첨가한 후 실온에서 24시간 동안 추출하여 대황 추출액을 제조한다.

2. 농축단계 : 상기 대황 추출액에 함유된 고형분을 필터(Advantec Filter paper No.2)를 이용하여 분리 제거하고, 고형분이 제거된 추출액을 45℃의 온도에서 감압농축하여 15Brix의 대황 농축액을 제조한다.

3. 동결건조단계 : 상기 대황 농축액을 -70℃의 온도에서 동결시킨 후 동결건조하여 대황 추출물을 제조한다.

대황 추출물의 제조(2) : 물(열수) 추출물 제조

1. 추출단계 : 건조하여 분쇄한 대황 100중량부에 대해 1000중량부의 물을 첨가한 후 100℃에서 2시간 30분 동안 추출하여 대황 추출액을 제조한다.

2. 농축단계 : 상기 대황 추출액에 함유된 고형분을 필터(Advantec Filter paper No.2)를 이용하여 분리 제거하고, 고형분이 제거된 추출액을 65℃의 온도에서 감압농축하여 15Brix의 대황 농축액을 제조한다.

대황 추출물 수율 및 수득량 측정 실험

에탄올을 이용하여 제조한 대황 추출물(이하 “에탄올추출물”이라고 함)과 물을 이용하여 제조한 대황 추출물(이하 “열수추출물”이라고 함)에 대해 수율 및 수득량을 측정하였다. 에탄올추출물의 경우 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 및 100%로 에탄올 농도를 달리하여 추출물을 제조한 후 그에 대한 수율 및 수득량을 측정하였다.

실험결과

에탄올 농도별 대황추출물의 경우 50~70% 에탄올을 이용한 추출물에서 추출 수율이 가장 높게 나타났다. 에탄올추출물과 열수추출물에 대한 수율 및 수득량에 대한 측정 결과는 표 1과 같다.

대황 추출	수율 (%)	수득량 (g)
열수	36.32	145.28 g (400g 추출)
10% EtOH	11.37	22.73 g (200g 추출)
20% EtOH	17.83	35.66 g (200g 추출)
30% EtOH	21.38	42.76 g (200g 추출)
40% EtOH	24.88	49.76 g (200g 추출)
50% EtOH	27.90	55.79 g (200g 추출)
60% EtOH	29.69	59.37 g (200g 추출)
70% EtOH	25.98	51.95 g (200g 추출)
80% EtOH	19.33	38.66 g (200g 추출)
90% EtOH	8.36	16.71 g (200g 추출)
100% EtOH	1.59	3.17 g (200g 추출)
*EtOH : 에탄올추출물

영양소 측정 실험

1. 조단백질 정량

조단백질 정량은 AOAC에 준하여 Kjeldahl법으로 측정하였다. 채취된 시료를 Kjeldahl 분해관에 취해 Kjeldahl(Foss, Sweden) 장치를 이용하여 0.1N NaOH용액으로 적정하고, 질소계수(6.25)를 곱하여 조단백질의 함량을 산출하였다.

2. 조지방 정량 실험

조지방은 Soxhlet법으로 측정하였다. 즉 시료 5g 내외를 원통여과지에 넣고, 시료 위를 탈지면으로 막고서 추출관 속에 넣어 수기 속에 에테르를 채운 후 60℃ 수욕상에서 8~16 시간 동안 추출하고서 수기 속의 에테르를 날려 보내고 지방의 무게를 측정하였다.

3. 조회분 정량

회분은 AOAC에 준하여 직접 회화법으로 항량을 알고 있는 도가니에 일정량의 시료를 취하여 550~600℃의 회화로에서 5~6시간 회화하고 데시케이터에서 일정 시간 방냉하여 항량을 구하여 회화 전후의 항량차로서 조회분량을 산출하였다.

4. 탄수화물 정량

시료 전체를 100%로 하1여 수분, 조단백질, 조지방, 회분, 함량 %를 감한 것을 탄수화물(carbohydrates) 함량(%)으로 하였다.

5. 유리당 정량

당류의 함량은 시료 약 5 g을 50 mL 메스플라스크에 정밀히 달아 물 25 mL를 가하여 녹인 후 아세토니트릴로 50 mL까지 채우고 이를 0.45 μL의 멤브레인 필터로 여과한 것을 시험용액으로 하였다.

Fructose, Glucose, Sucrose, Maltose, Lactose의 표준품(Sigma, USA)을 각각 100 mL용 메스플라스크에 0.1 g을 정밀히 달아 물 50 mL로 녹인 후 아세토니트릴로 100 mL까지 채운 후, 희석하여 표준용액으로 사용하였다. 시료 중 당류 함량은 HPLC를 이용하여 표 2와 같은 조건으로 분석하였다.

Items	Conditions
Instrument	Waters, USA (Empower system)
Column	250㎜×4.6㎜, Polyamine Ⅱ(YMC Pack)
Detector	RI
Mobile phase	Water : Acetonitrile (20:70, v/v)
Injection volume	20㎕
Flow rate	1.0㎖/min
Column temp	35℃

6. 콜레스테롤 측정

비누화 과정 : 검체(대황 추출물) 약 2g을 정밀히 칭량하여 삼각플라스크에 취하였다. 이때 검체의 지방량은 1 g이하가 되도록 검체량을 조절 하였다. 자석막대를 삼각플라스크에 넣고 95% 에탄올 40 mL과 8 mL 50% 수산화칼륨용액을 가하였다. 콘덴서를 설치하고 자석교반-가열기를 이용하여 교반하면서 가열하여 70±10분간 환류 시켰다. 비누화를 위해 시료를 지속적으로 관찰하면서 덩어리가 생길 경우 유리봉으로 분산시키거나 교반하면서 50% 수산화칼륨용액을 추가하여 시험용액을 교반하였다. 환류가 완료되면 가열기를 끄고 교반 중에 콘덴서의 상부를 통해 95% 에탄올 60 mL을 첨가 하였다. 약 15분 후, 콘덴서를 플라스크에서 제거하고 플라스크에 마개를 막아 실온으로 냉각시킨 후, 24시간 동안 시험용액을 안정화 하였다.

추출 : 비누화가 끝난 시험용액을 교반하면서 톨루엔 100 mL을 첨가하고 마개를 하여 30초 이상 교반하였다. 이를 세척과정 없이 500 mL 분액여두로 옮긴 후 110 mL 1M 수산화칼륨용액을 분액여두에 넣고 10초간 강렬하게 진탕하여 정치하고 분리된 아래층을 버렸다. 40 mL 0.5 M 수산화칼륨용액을 분액여두에 넣고 분액여두를 뒤집은 후 천천히 내용물이 소용돌이가 생기도록 10초간 섞어준 후 정치하여 분리된 아래층을 버렸다. 톨루엔 층을 40 mL 증류수로 천천히 분액여두를 돌려주며 수세하고 정치하여 분리된 아래층을 버리고 수세과정을 3회 이상 반복하였다. 이 때 수세과정이 반복될수록 더욱 강렬하게 진탕하였다. 톨루엔 층이 맑게 보일 때까지 수세과정을 계속하였다. 유리솜과 약 20 g의 무수황산나트륨이 채워진 유리깔때기를 통해 수세한 톨루엔을 약 2 g 무수황산나트륨이 채워진 삼각플라스크로 흘려주어 탈수하였다. 삼각플라스크에 마개를 막고 교반하여 혼합한 후 15분 이상 정치하였다. 추출한 톨루엔 층 25 mL을 바닥이 평평한 125 mL 둥근 플라스크에 취하고 이를 40±3℃에서 감압 농축하여 증발건조시키고 잔류물에 아세톤 약 3 mL을 가한 후 다시 감압 농축하여 완전 건고하였다.

유도체화 : 표준용액 및 상기의 시험용액 1.0 mL을 15 mL 원심분리관에 각각 취하고 각 원심분리관에 0.2 mL 헥사메틸디실란를 가한 후, 0.1 mL 트리메틸클로로실란를 가하여 마개를 닫고 이를 강렬하게 30초간 교반 혼합하고 15분간 정치하였다. 각각의 원심분리관에 1.0 mL 5α-콜레스탄(Cholestane) 내부표준용액과 증류수 10 mL을 넣은 후 마개를 닫고 30초간 강렬하게 교반하고 이를 3000 rpm에서 2분간 원심분리 하였다. 상층의 헵탄 층을 취하여 기체크로마토그래프(Shimadzu GC-2010) 측정용 시험용액으로 하였다. 콜레스테롤 정량을 분석하기 위한 분석 조건은 하기 표 3과 같다.

Items	Conditions
Instrument	Shimadzu GC2010
Column	HP-5(50m×0.25mm)
Carrier gas	N₂
Detector	FID
Flow rate	2(㎖/min)
Injection temp.	250℃
Column temp.	190℃ for 2min, 20℃/min(Rate), 230℃ for 3min, 40℃/min(Rate), 255℃ for 25min
Detector temp.	300℃
Injection volume	1㎕

7. 무기질 및 중금속 측정 실험

시료의 조제는 습식 분해법을 이용하여 시료 0.5g 내외를 정밀하게 측정하여 65％ HNO₃ 5mL와 30％ H₂O₂ 1mL를 teflon bottle에 담은 후 이를 전처리 시험용액으로 사용하였다. 전처리 방법은 microwave digestion system(Ethos-1600, USA)을 이용하여 최고 550W로 총 30분간 산 분해를 실시하였다. 전처리 과정을 거친 시료용액을 0.45 μm PTFE filter로 여과하여 분석시료로 사용하였다. 무기질 및 중금속정량은 정량은 Inductively Coupled Plasma spectrometer (SHIMADZU ICPE 9000, Japan)를 사용하여 분석하였으며 분석조건은 표 4와 같다. 모든 시약과 증류수는 무기질 분석용을 사용하였다.

Instrument	Conditions
Radio Frequency Power	1.20 kW
Plasma Gas	10.0 L/min
Auxiliary Gas	0.60 L/min
Carrier Gas	0.70 L/min
Wave length(㎚)	Na	589.592
	Pb	220.353
	Cd	214.438

실험결과

상기의 방법으로 실시한 영양소(조단백질, 조지방, 조회분, 탄수화물, 지방산, 유리당, 콜레스테롤 및 무기질) 및 중금속 측정 실험 결과는 하기 표 5와 같다. 본 실험은 (재)경북테크노파크 대구한의대특화센터 효능검증원에 의뢰하여 진행하였다.

시험항목	함량
열량	40.33 (Kcal/100g)
나트륨	353.93 (mg/100g)
탄수화물	7.67 (g/100g)
당류	0.15 (g/100g)
지방	0.19 (g/100g)
트랜스지방	0 (g/100g)
포화지방	0.03 (g/100g)
콜레스테롤	0 (mg/100g)
단백질	1.98 (g/100g)
납(Pb)	0.05 (mg/Kg)
카드뮴(Cd)	0.07 (mg/kg)
칼슘(Ca)	161.96 (mg/100g)
구리(Cu)	불검출
철(Fe)	0.78 (mg/100g)
칼륨(K)	564.55 (mg/100g)
마그네슘(Mg)	85.98 (mg/100g)
인(P)	139.68 (mg/100g)
아연(Zn)	0.43 (mg/100g)

구성 아미노산 및 유리 아미노산 측정 실험

1. 구성 아미노산 측정 실험

동결건조한 대황 추출물 50mg에 6N HCl을 첨가하여 밀봉한다. 밀봉한 샘플을 110℃에서 24시간동안 가수분해 후, 밀봉을 해제하여 80℃에서 24시간동안 열을 가하여 건조시킨다. 건조 완료된 샘플의 농도에 따라서 0.02N HCl로 희석한 후 0.45um 필터를 이용하여 filtration 후 아미노산 자동 분석기에 injection하여 구성 아미노산을 측정하였다. 분석 조건은 하기 표 6과 같다.

Column	Ion exchange
Pump	Pressure 0~19.6Mpa Flow Rate 0.05~0.99㎖/min
Auto sampler	200vials
Injection Volume	1~100㎕
Reaction Unit	Reaction Column(135℃)
Detector	Wavelength 570㎚. 440㎚

2. 유리 아미노산 측정 실험

동결건조한 대황 추출물 0.1g에 5% trichloroacetic acid를 첨가하여 균질화한 후 원심분리기를 이용하여 10,000rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액을 채취한다. 채취한 상층액을 0.45um 필터를 이용하여 filtration 후 아미노산 자동 분석기에 injection하여 유리 아미노산을 측정하였다. 분석 조건은 상기 표 6과 같다.

실험결과

1. 구성 아미노산 측정 결과

대황 추출물에 대해 구성 아미노산 함량을 측정한 결과는 다음 표 7과 같다. 구성 아미노산 함량 측정 결과, glutamic acid, alanine 및 proline의 함량이 높은 것으로 확인되었다.

구성 아미노산 종류	함량 (mg/g)
aspartic acid	5.666
threonine	3.223
serine	2.810
glutamic acid	30.112
glycine	3.331
alanine	22.140
cystine	0.820
valine	3.435
methionine	1.385
isoleucine	2.417
leucine	4.538
tyrosine	2.700
phenylalanine	4.096
lysine	3.978
ammonia	3.768
histidine	1.098
arginine	2.730
proline	19.377
total amino acid	113.858
ND=Not Detected

2. 유리 아미노산 측정 결과

대황 추출물에 대해 유리 아미노산 함량을 측정한 결과는 다음 표 8과 같다. 유리 아미노산 함량 측정 결과, proline, cystathionine, clutamic acid의 함량이 높은 것으로 확인되었다.

유리 아미노산 종류	함량 (ug/g)
phosphoserine	230.846
taurine	ND
phospho ethanol amine	181.284
urea	ND
aspartic acid	392.447
threonine	124.128
serine	186.032
glutamic acid	877.961
sarcosine	ND
α-amino adipic acid	ND
glycine	64.400
alanine	ND
citrulline	ND
α-amino-n-butyric acid	ND
valine	202.537
cystine	55.933
methionine	25.653
cystathionine	565.690
isoleucine	153.545
leucine	108.290
tyrosine	100.030
phenylalanine	89.783
β-alanine	40.438
β-amino isobutyric acid	36.189
γ-amino-n-butyric acid	3.318
ethanol amine	59.848
hydroxylysine	15.184
ornithine	25.651
lysine	103.063
1-methylhistidine	ND
histidine	18.976
3-methylhistidine	ND
anserine	ND
carnosine	ND
arginine	340.833
hydroxy proline	5.132
proline	7369.833
total free amino acid	11.377
ND=Not Detected

지방산 조성 측정 실험

지방 추출에 앞서 검체(대황추출물)를 균질화 하였다. 균질화된 검체를 약 100~200 mg의 지방을 포함하는 양으로 정확히 칭량하여 마조니어(Mojonnier)관에 넣고 약 100 mg의 피로갈롤을 첨가한 후, 2 mL의 내부표준용액을 첨가하였다. 마조니어(Mojonnier)관에 끓임쪽을 넣고 2 mL 에탄올을 첨가하여 전체 검체가 잘 섞일 때까지 혼합한다. 8.3 M 염산용액 10 mL을 넣고 섞었다. 마조니어(Mojonnier)관의 마개를 고무줄 혹은 테프론테이프 등으로 밀봉한 후, 70~80℃의 수조에서 적당한 속도로 교반하면서 40분간 분해하였다. 마조니어(Mojonnier)관의 벽면에 붙어있는 입자들이 잘 혼합될 수 있도록 매 10분마다 교반기로 혼합하였다. 분해 후, 에탄올을 첨가하여 채운 후 부드럽게 섞었다. 준비된 마조니어(Mojonnier)관의 분해물에 25 mL 디에틸에테르를 첨가하고 마개를 한 후 5분간 진탕하여 추출하였다. 에테르 혼합 추출용매로 마개를 씻고 25 mL의 무수 석유에테르를 추가하여 5분간 다시 진탕 추출하고 600 rpm에서 5분간 원심분리 하였다. 에테르 혼합 추출용매로 마개를 씻고 150 mL 비이커에 에테르 층을 분액한 후 증발시키기 위해 질소를 사용하여 35~40℃ 수조에서 에테르를 천천히 증발 시켰다. 2~3 mL 클로로포름과 2~3 mL 디에틸에테르로 추출한 지방을 녹여 15 mL 시험관으로 옮긴 후, 40℃ 수조에서 질소 농축하고 2.0 mL 7% 트리플루오로보란메탄올 용액과 1.0 mL의 톨루엔을 첨가하였다. 테프론/실리콘 재질의 마개로 잘 밀봉하여 100℃ 오븐에서 45분간 가열한 후 실온으로 냉각하였다. 5.0 mL 증류수, 1.0 mL 헥산 및 약 1.0 g 무수 황산나트륨를 첨가한 후 진탕하여 정치하고 분리된 상층액을 취하여 약 1.0 g의 무수 황산나트륨을 담은 다른 바이알(Vial)에 넣고 탈수한 후 시험용액으로 하였다.

실험결과

지방산 조성 측정 결과는 다음 표 9에 나타내었다.

지방산 종류	검체중 지방산 (g/100g)
Methyl butyrate(C4:0)	0.0000
Methyl hexanoate(C6:0)	0.0000
Methyl octanoate(C8:0)	0.0000
Methyl decanoate(C10:0)	0.0000
Methyl undecanoate(C11:0)	0.0000
Methyl laurate(C12:0)	0.0000
Methyl tridecanoate(C13:0)	0.0000
Methyl myristate(C14:0)	0.0051
Myristoleic acid methyl ester(C14:1)	0.0000
Methyl pentadecanoate(C15:0)	0.0000
Cis-10-pentadecanoic acid methyl ester(C15:1)	0.0000
Methyl palmitate(C16:0)	0.0152
Methyl palmitoleate(C16:1)	0.0047
Methyl heptadecanoate(C17:0)	0.0000
Cis-10-heptadecanoic acid methyl ester(C17:1)	0.0000
Methyl stearate(C18:0)	0.0000
Trans-9-elaidic acid methyl ester(C18:1n9t)	0.0000
Cis-9-oleic acid methyl ester(C18:1n9c)	0.0090
Linolelaidic acid methyl ester(C18:2n6t)	0.0000
Methyl linoleate(C18:2n6c)	0.0033
Methyl arachidate(C20:0)	0.0000
Gamma-linolenic acid methyl ester(C18:3n6)	0.0000
Methyl cis-11 eicosanoate(C20:1)	0.0000
Methyl linolenate(C18:3n3)	0.0044
Methyl heneicosanoate(C21:0)	0.0000
Cis-11,14-eicosadienoic acid methyl ester(C20:2)	0.0066
Methyl behenate(C22:0)	0.0000
cis-8,11,14-eicosatrienoic acid methyl ester(C20:3n6)	0.0000
Methyl erucate(C22:1n9)	0.0000
Cis-11,14,17-eicosatrenoic acid methyl ester(C20:3n3)	0.0000
Methyl cis-5,,8,11,14-eicosatetraenoic acid methyl ester(C20:4n6)	0.0000
Methyl trcosanoate(C23:0)	0.0123
cis-13,16-docosadienoic acid methyl ester(C22:2)	0.0000
Methyl lignocerate(C24:0)	0.0000
Methyl cis-5,8,11,14,17-eicosapentaenoate(C20:5n3)	0.0046
Methyl nervonate(C24:1)	0.0000
Cis-4,7,10,13,16,19-docosahexaenoic acid methyl ester(C22:6n3)	0.0000

항산화 효과 실험

1. DPPH radical 소거능

실험군으로는 대황 열수추출물 및 함량별 에탄올추출물을 각각 50% ethanol에 1 g/10 ㎖의 농도로 희석하여 진행하였다. 본 실험은 항산화 분석법 중 Blois의 방법에 따라 측정하였고(Blois, 1958), ethanol에 용해시킨 0.1 mM DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl, Sigma, USA) 900 ㎕와 각 실험군 100 ㎕를 E.P. tube에 넣고 10분간 암반응 시킨 후 UV spectrophotometer (TECAN, Mannedorf, Switzerland)를 이용하여 517 nm에서 측정하였으며, 양성대조군으로는 ascorbic acid (Sigma, USA)을 사용하였고, 농도는 1 ㎎/㎖로 측정하였다. 실험군의 항산화능은 시료첨가구와 무첨가구의 흡광도를 구하여 계산하였다.

2. ABTS radical 소거능

실험군으로는 대황 열수추출물 및 함량별 에탄올추출물을 각각 50% ethanol에 1 g/10 ㎖의 농도로 희석하여 진행하였다. 본 실험은 ABTS+ decolorization assay법을 응용하여 측정하였고, 증류수에 용해한 7.4 mM ABTS (Sigma, USA)와 2.6 mM potassium persulphate를 1:1로 섞어 12-16시간 동안 암소에 방치한 radical stock solution 1 ㎖에 각 실험군 50 ㎕을 가하여 60분간 반응시킨 후 UV spectrophotometer (TECAN, Mannedorf, Switzerland)를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 양성대조군으로는 ascorbic acid (Sigma, USA) 1 ㎎/㎖와 Trolox (Sigma, USA) 1 mM을 사용하였고, 실험군의 항산화능은 시료첨가구와 무첨가구의 흡광도를 구하여 계산하였다.

3. SOD 유사활성 측정

실험군으로는 대황 열수추출물 및 함량별 에탄올추출물을 각각 Tris-HCl buffer(pH 8.5) 0.5 g/10 ㎖의 농도로 희석하여 진행하였다. 본 실험은 Marklund등의 방법에 따라 측정하였고, 각 실험군 0.2 ㎖에 Tris-HCl buffer(pH 8.5) 3㎖와 증류수에 용해한 7.2 mM pyrogallol 0.2 ㎖을 가하여 25℃에서 10분간 방치 후, 1N HCl 1 ㎖로 반응을 정지시킨 후 UV spectrophotometer (TECAN, Mannedorf, Switzerland)를 이용하여 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 실험군의 항산화능은 시료첨가구와 무첨가구의 흡광도를 구하여 계산하였다.

4. Superoxide dismutase (SOD) 효소활성

세포실험 : 한국세포주은행(KCLB; Korean Cell Bank)에서 human hepatocellular liver carcinoma cell line을 구입하여 10% FBS(fetal bovine serum)과 penicillin-streptomycin이 첨가한 Dulbeccos modified Eaglesmedium (DMEM, Sigma, USA)를 배지를 사용하여 37℃ 온도에서 5% CO₂ 상태로 배양하였고, plate에 계대 후 세포가 일정수준의 confluency에 도달한 상태에서 대황 열수추출물 및 함량별 에탄올추출물을 100 ㎍/㎖의 농도로 약물 전처리후 tBHP (Sigma, USA) 100 uM을 처치한 후 반응시켰다.

SOD assay : Superoxide dismutase (SOD) 활성도 측정은 Cayman SOD assay kit를 사용하여 450 nm에서 측정하였고, 실험군의 SOD 효소활성능은 시료첨가구와 무첨가구의 흡광도를 구하여 계산하였다.

5. MTT assay를 통한 세포생존률 확인

세포실험 : 한국세포주은행(KCLB; Korean Cell Bank)에서 human hepatocellular liver carcinoma cell line을 구입하여 10% FBS(fetal bovine serum)과 penicillin-streptomycin이 첨가한 Dulbeccos modified Eaglesmedium (DMEM, Sigma, USA)를 배지를 사용하여 37℃ 온도에서 5% CO₂ 상태로 배양하였고, plate에 계대 후 세포가 일정수준의 confluency에 도달한 상태에서 대황 열수 및 ethanol 함량별 추출물을 100 ㎍/㎖의 농도로 약물 전처리후 tBHP (Sigma, USA) 100 uM을 처치한 후 반응시켰다.

MTT assay : 배양 후 MTT 시약을 최종 농도가 0.5 mg/ml 되도록 각 well에 넣고 37℃, 5% CO₂ incubator에서 4시간 동안 배양한 후 배양액을 버리고 DMSO를 처리하여 formazan을 용해시켜 UV spectrophotometer (TECAN, Mannedorf, Switzerland)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.

실험결과

1. DPPH radical 소거능 측정 결과

대황 추출물의 DPPH radical 소거능을 확인한 결과, 양성대조군인 ascorbic acid 1 ㎎/㎖ 기준으로 대황 열수추출물과 10% 대황 에탄올추출물, 20% 대황 에탄올추출물을 제외한 나머지 함량에서 높은 항산화 활성을 나타내었다. DPPH radical 소거능 분석 결과는 하기 도 1에 나타내었다.

2. ABTS radical 소거능 측정 결과

대황 추출물의 ABTS scavenging을 확인한 결과, 양성대조군인 ascorbic acid 1 ㎎/㎖와 Trolox 1 mM 기준으로 대황 열수추출물 및 에탄올 함량별 대황 에탄올추출물에서 모두 높은 항산화 활성을 나타내는 것을 알 수 있다. ABTS radical 소거능 분석 결과는 하기 도 2에 나타내었다.

3. SOD 유사활성 측정 결과

대황 추출물의 SOD 유사활성을 확인한 결과, 대황 열수추출물 및 100% 대황 에탄올추출물을 제외한 나머지 함량에서 50% 이상의 항산화 활성을 보여주며 특히, 50% 및 70~90% 에탄올 함량 추출물에서 높은 항산화 활성을 나타낸다. SOD 유사활성 측정 결과는 하기 도 3에 나타내었다.

4. Superoxide dismutase (SOD) 효소활성 측정 결과

대황 열수추출물 및 에탄올 함량별 추출물에서 SOD 효소활성능은 대조군과 비교하여 유사하거나 높은 활성을 나타냈으며, tBHP 단독 처리시 SOD 효소활성이 대조군에 비해 80.99%로 감소한 반면 tBHP와 실험군을 같이 처리한 경우 단독 처리군과 비교하여 감소하는 경향을 나타내었으나 tBHP 단독군과 비교시 효소활성이 증가하는 것을 알 수 있으며 특히 열수 및 10%, 70-90% 에탄올 함량 추출물에서 높은 효소활성을 나타내었다. Superoxide dismutase (SOD) 효소활성 측정 결과는 하기 도 4에 나타내었다.

5. MTT assay를 통한 세포생존률 확인 결과

대조군과 비교하여 대황 60, 100% 에탄올 추출물에서 세포독성을 나타냈으며, tBHP와 같이 처치 시 60, 100% 에탄올 추출물에서 세포독성이 높게 나타났다. MTT assay를 통한 세포생존률 확인 결과는 하기 도 5에 나타내었다.

항염증 효과 실험

1. MTT assay에 의한 세포 독성 측정

세포 생존율 측정을 위해 사용된 macrophage cell(RAW 264.7)은 ameriacan type culture collection(Manassas, USA)에서 구입하였다. 세포 배양 배지는 10% FBS와 1% penicillin/streptomycin(100 unit/mL)의 비율로 혼합한 DMEM배지를 사용하였며, 37℃, 5% CO₂ incubator에 적응시켜 계대 배양하였다. RAW 264.7을 96-well plate에 5×104 cells/well이 되게 0.18 mL 분주하고, 시료를 농도 별로 제조하여 0.02 mL 첨가 후 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양하였다. 대황 70%ethanol 추출물은 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1000 μg/mL 농도별로 24시간 동안 처리 한 후 2.5mg/mL 농도로 제조한 MTT 용액을 0.02 mL 첨가하여 4시간 동안 배양시킨다. 그 후 배양액을 제거하고 각 well 당 DMSO(Dimethyl Sulfoxide, DUSAN) 0.1 mL를 가하여 실온에서 30분간 반응 시킨 뒤 ELISA reader로 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 독성 측정은 시료용액 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.

2. Nitric oxide 저해율 측정

Nitric oxide(NO) 생성량은 세포배양액 중에 존재하는 NO를 griess reagent를 이용하여 측정하였다. 96 well plate에 세포주 RAW 264.7을 5 x 10⁴cells/well이 되도록 seeding 하고 37 ℃, 5% CO₂incubator에서 24시간 동안 배양시킨다. 그 뒤에 배양액을 혈청 무첨가 DMEM 배지로 교환하고 염증 반응을 유도하기위해 lipopolysaccharide (LPS)를 1 ppm/well 이 되도록 처리하고 각 대황 70% 추출물은 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1000 μg/mL 농도별로 처리한뒤 37 ℃, 5% CO₂incubator에서 24시간 동안 배양시킨다. 그 뒤에 새로운 96 well plate에 세포 배양액을 100 μL 옮기고 griess reagent를 100 μL 첨가 하여 상온에서 5 min 동안 반응시킨 뒤에 540 nm 에서 흡광도를 측정하여 결과를 계산하였다.

3. Western blot을 통한 iNOS, COX-2 단백질 발현 측정

iNOS와 COX-2 단백질 발현을 확인하기 위하여 6 well plate에 세포주 RAW 264.7을 2 x 10⁵cells/well이 되도록 seeding 하고 37 ℃, 5% CO₂incubator에서 24시간 동안 배양시킨다. 그 뒤에 배양액을 혈청 무첨가 DMEM 배지로 교환한 후 세포의 염증 반응을 유도하기 위하여 lipopolysaccharide(LPS)를 1 ppm/well 이 되도록 처리하고 각 시료용액을 농도별로 처리한뒤 37 ℃, 5% CO₂incubator에서 24시간 동안 배양시킨다. 그 뒤에 배지를 제거하고 PBS로 1회 세척 후 phosphatase 와 protease inhibitor를 각각 0.1% 함유시킨 RIPA 버퍼를 60 μL/well로 처리하여 세포를 용해시키고 원심분리기를 이용하여 -4 ℃, 15,000 rpm에서 15 min 동안 원심분리 시키고 얻은 상층액을 새 튜브에 옮긴다. 그 이후, bradford assay로 단백질의 양을 정량하고 power supply electrophoresis 기기를 이용하여 10% SDS-PAGE로 질량별 분리시키고 PVDF membrane에 옮긴다. membrane은 digital reciprocating shaker 기기를 이용하여 5% skin milk 2시간, primary antibody 2 시간, TBST solution 10분 (3회 반복), secondary antibody 1 시간, TBST solution 10 분 (3회 반복) 순의 blocking 과정을 거친 다음 HRP substrate 발색시약으로 2 분 동안 반응시킨 후 western imaging system (CAS-400SM, Davinch-K Co., Ltd., Korea)기기를 이용하여 밴드를 확인하고 정량 및 결과를 산출하였다.

4. Real-time PCR 분석을 통한 iNOS 및 COX-2 발현 억제 확인

1) cell lysis 및 cDNA 합성

6 well plate에 cell seeding을 하고 24시간 동안 배양한 후 세포를 자극 시키고 시료 용액을 농도별로 처리한 뒤 37 ℃, 5% CO₂incubator에서 24시간 동안 배양시킨다. 상등액을 제거하고 Trizol lysis buffer 각 well에 1mL씩 분주하여 세포를 lysis 한 후 상온에 5분동안 방치한다. Trizol buffer 1mL 당 Chloroform 200 μL를 첨가여 30초동안 invert해준 5분 동안 방치한다. 원심분리기 -4℃에서 15,000rpm으로 15분 동안 원심분리 한 후 상등액을 500 μL를 e-tube로 옮긴다. 여기에 Iso-propanol 500 μL를 첨가해 천천히 invert해 준 후 5분 동안 방치한 후 다시 한번 원심분리기 -4℃에서 15,000rpm으로 15분 동안 원심분리시킨다. E-tube 바닥에 있는 RNA pellet을 확인한 후 상등액을 제거하고 75% ethanol로 RNA pellet을 세척한 후 남은 용매를 증발시켜 완전히 제거한다. RNA pellet을 diethylpyrocarbonate (DEPC) water 50 μL를 첨가하여 녹인 후 260 nm / 280 nm의 ratio를 확인하여 실험을 진행한다.

2) Real-time PCR

SYBR Green PCR Mastet Mix(applied biosystem, UK)를 이용하여 cDNA와 TOPreal^TM qPCR 2X PreMIX((Enzynomics, Daejeon, Korea), Primer를 넣고 ABI step one plus(Applied biosystem, California, USA) 기기를 이용하여 정량 분석을 하고 Stepone Software(Applied biosystem, California, USA)를 사용하여 95℃에서 2분간 denature시킨 후 95℃에서 10초, 60℃에서 15초, 72℃에서 20초간 반응하는 온도 순환 조건을 40회 반복한 결과를 분석하였다.

실험결과

1. MTT assay에 의한 세포 독성 측정 결과

RAW 264.7 cell에 대한 세포 독성을 측정한 결과 대조군과 비교하여 대황 70%ethanol 추출물은 농도 500 μg/mL에서부터 20% 이상의 세포 독성을 나타내었다. MTT assay를 통한 세포 독성 측정 결과는 하기 도 6에 나타내었다.

2. Nitric oxide 저해율 측정 결과

농도별로 샘플을 처리하여 NO의 양을 측정한 결과 농도 의존적으로 감소하는 결과를 보였다. 최고농도인 1,000 μg/mL에서 54.9%의 저해효과를 보였다. Nitric oxide 저해율 측정 결과는 하기 도 7에 나타내었다.

3. Western blot을 통한 iNOS, COX-2 단백질 발현 측정 결과

대황 70%ethanol 추출물의 iNOS 발현 억제율은 250 μg/mL에서 약 50.9%, COX-2에서는 약 17.3%의 효과를 나타내었다. Western blot을 통한 대황의 iNOS 생성저해 측정 결과는 도 8에 나타내었으며, Western blot을 통한 대황의 COX-2 생성저해 측정 결과는 도 9에 나타내었다. INOS 및 COX-2에 사용 된 프라이머의 서열은 표 10과 같다.

Gene	Primer	Sequence(5’→ 3’)
INOS	Forward	ACA TCG ACC CGT CCA CAG TAT
INOS	Reverse	CAG AGG GGT AGG CTT GTC TC
COX-2	Forward	TCC CTA AAG GAA AAG TGG GAC
COX-2	Reverse	GAG CGC ATT AACCTC AGG ACC

4. Real-time PCR 분석을 통한 iNOS 및 COX-2 발현 억제 확인 결과

대황의 NO의 저해 기전을 보기 위해 iNOS의 발현율을 확인하고, PGE₂의 저해 경로를 보기 위해 COX-2의 발현을 mRMA 수준에서 측정한 결과 위와 같이 나타내었다. 대황의 iNOS 발현 억제 효과는 최고 농도인 250 μL에서 약 74.3%를 나타내었고, COX-2 발현 억제 효과는 약 22.8%를 나타내었다. Real-time PCR 분석을 통한 iNOS 및 COX-2 발현 억제 확인 결과는 하기 도 10에 나타내었다.

주름 개선 효과 측정 실험

1. MTT assay에 의한 세포 독성 측정

HacaT cell을 96-well plate에 5×10⁴ cells/well이 되게 0.18 mL 분주하고, 시료를 농도 별로 제조하여 0.02 mL 첨가 후 37℃, 5% CO₂ incubator에서 24시간 배양하였다. 대황 70%ethanol 추출물은 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500 μg/mL 농도별로 24시간 동안 처리 한 후 2.5mg/mL 농도로 제조한 MTT 용액을 0.02 mL 첨가하여 4시간 동안 배양시킨다. 그 후 배양액을 제거하고 각 well 당 DMSO(Dimethyl Sulfoxide, DUSAN) 0.1 mL를 가하여 실온에서 30분간 반응 시킨 뒤 ELISA reader로 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 독성 측정은 시료용액 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.

2. Western blot을 통한 MMP-1 단백질 발현 측정

MMP-1 단백질 발현을 확인하기 위하여 HaCat cell을 이용하여 6 well plate에 cell을 seeding 하고 37 ℃, 5% CO₂incubator에서 24시간 동안 배양시킨다. 그 뒤에 상등액을 최대한 제거하고 각 well 당 PBS를 2 mL씩 분주한 후 UV-B를 1분 동안 조사하여 자극시킨다. 배양액을 혈청 무첨가 DMEM 배지로 교환한 후 각 시료용액을 농도별로 처리한뒤 37 ℃, 5% CO₂incubator에서 24시간 동안 배양시킨다. 그 뒤에 배지를 제거하고 PBS로 1회 세척 후 phosphatase 와 protease inhibitor를 각각 0.1% 함유시킨 RIPA 버퍼를 60 μL/well로 처리하여 세포를 용해시키고 원심분리기를 이용하여 -4 ℃, 15,000 rpm에서 15분 동안 원심분리 시키고 얻은 상층액을 새 튜브에 옮긴다. 그 이후, bradford assay로 단백질의 양을 정량하고 power supply electrophoresis 기기를 이용하여 10% SDS-PAGE로 질량별 분리시키고 PVDF membrane에 옮긴다. membrane은 digital reciprocating shaker 기기를 이용하여 5% skin milk 2시간, primary antibody 2 시간, TBST solution 10분 (3회 반복), secondary antibody 1 시간, TBST solution 10 분 (3회 반복) 순의 blocking 과정을 거친 다음 HRP substrate 발색시약으로 2 분 동안 반응시킨 후 western imaging system (CAS-400SM, Davinch-K Co., Ltd., Korea)기기를 이용하여 밴드를 확인하고 정량 및 결과를 산출하였다.

실험결과

1. MTT assay에 의한 세포 독성 측정 결과

HaCaT cell에 대한 대황 70%ethanol 추출물의 세포 독성을 측정한 결과 대조군과 비교하여은 농도 50 μg/mL에서부터 20% 이상의 세포 독성을 나타내었다. MTT assay에 의한 세포 독성 측정 결과는 하기 도 11에 나타내었다.

2. Western blot을 통한 MMP-1 단백질 발현 측정 결과

MMPs는 피부의 섬유아세포, 각질형성세포를 비롯하여 많은 세포들로부터 분비된다. HaCaT cell(각질형성세포)에 대한 대황 70%ethanol 추출물의 발현 억제효과를 확인한 결과 25 μg/mL에서 약 50%의 발현 억제율을 나타내었다. Western blot을 통한 MMP-1 단백질 발현 측정 결과는 하기 도 12에 나타내었다.

결론적으로 상기 실시예 1 내지 8을 실시한 결과를 통해, 본 발명의 일 실시형태에 따른 화장료 조성물은 에탄올이나 물을 이용해 제조된 대황 추출물의 유효성분을 함유함으로써, 항산화 활성, 항염증, 세포 독성 및 주름 개선 효과가 있는 것을 확인하였다.

이상, 실시예를 들어 본 발명을 상세하게 설명하였으나, 본 발명은 상기 실시예에 한정되지 않으며, 여러 가지 다양한 형태로 변형될 수 있고, 본 발명의 기술적 사상 내에서 당 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의하여 여러 가지 많은 변형이 가능함이 명백하다. 또한, 청구범위의 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 형태의 치환, 변형 및 변경이 가능할 것이며, 이 또한 본 발명의 범위에 속한다고 할 것이다.

Claims

대황 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 대황 추출물은,
건조하여 분쇄한 대황 100중량부에 대해 800 내지 1200중량부의 에탄올을 첨가한 후, 실온에서 20 내지 25시간 동안 추출하여 대황 추출액을 제조하는 추출단계;
상기 추출단계에서 제조된 대황 추출액에 함유된 고형분을 분리 제거하고, 고형분이 제거된 추출액을 40 내지 50℃의 온도에서 감압농축하여 10 내지 20Brix의 대황 농축액을 제조하는 농축단계; 및
상기 농축단계에서 제조된 대황 농축액을 -70 내지 -80℃의 온도에서 동결건조하여 대황 추출물을 제조하는 동결건조단계;를 포함하여 제조되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 대황 추출물은,
건조하여 분쇄한 대황 100중량부에 대해 800 내지 1200중량부의 물을 가한 후, 90 내지 100℃에서 2 내지 3시간 동안 열수 추출하여 대황 추출액을 제조하는 추출단계;
상기 추출단계에서 제조된 대황 추출액에 함유된 고형분을 분리 제거하고, 고형분이 제거된 추출액을 60 내지 70℃의 온도에서 감압농축하여 10 내지 20Brix의 대황 농축액을 제조하는 농축단계; 및
상기 농축단계에서 제조된 대황 농축액을 -70 내지 -80℃의 온도에서 동결시킨 후 이를 동결건조하여 대황추 출물을 제조하는 동결건조단계;를 포함하여 제조되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 화장료 조성물은 화장수, 로션, 세럼, 마사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 바디로션으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 제형으로 제조되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.