KR101985719B1 - 베타글루칸-펩타이드 복합체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents
베타글루칸-펩타이드 복합체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 베타글루칸-펩타이드 복합체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는 베타-1,3-글루칸인 시조필란(Schizophyllan, SPG)과 c-Src 유래의 SH3 펩타이드를 공유결합시켜 SPG-c-Src-SH3 펩타이드 복합체를 제조하고, 상기 복합체를 유효성분으로 함유하는 패혈증 및 대장염과 같은 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 베타글루칸-펩타이드 복합체는 p47phox를 표적으로 하여, 활성산소(ROS) 및 염증성 사이토카인 생성을 현저하게 저해하므로, 패혈증 및 대장염과 같은 ROS와 관련된 치명적인 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다. 한편, p47phox를 표적으로하는 새로운 펩타이드 기반 약제 개발에도 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명에 따른 베타글루칸-펩타이드 복합체는 p47phox를 표적으로 하여, 활성산소(ROS) 및 염증성 사이토카인 생성을 현저하게 저해하므로, 패혈증 및 대장염과 같은 ROS와 관련된 치명적인 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다. 한편, p47phox를 표적으로하는 새로운 펩타이드 기반 약제 개발에도 유용하게 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 베타글루칸-펩타이드 복합체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는 베타-1,3-글루칸인 시조필란(Schizophyllan, SPG)과 c-Src 유래의 SH3 펩타이드를 공유결합시켜 SPG-c-Src-SH3 펩타이드 복합체를 제조하고, 상기 복합체를 유효성분으로 함유하는 패혈증 및 대장염과 같은 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
NADPH 산화효소(NADPH oxidase; NOX) 의존적인 활성산소(reactive oxygen species; ROS)와 산화제(oxidant)에 의해 유도된 단백질 또는 지질 변화(alteration)는 패혈증(sepsis) 및 대장염(colitis)과 같은 치명적 염증성 반응에서 관찰되는 조직 손상과 관련이 있다(Zhong Y et.al., Nature cell biology., 11(4):468-476, 2009; Gump JM et.al., Trends in molecular medicine., 13(10):443-448, 2007; Wadia JS et.al., Nature medicine., 10(3):310-315, 2004; Hotchkiss RS et.al., Journal of immunology., 176(9):5471-5477, 2006). 패혈증은 그람 음성 세균 감염에 대한 전신적인 염증 반응(systemic inflammatory response)이 특징이다. ROS가 Toll-like receptor(TLR) 4 활성화와 면역 세포 활성화 및 말단 기관 손상을 조절하여 패혈증의 병리학적 치료에 중요한 역할을 한다는 증거가 증가하고 있다(Fang FC., Nature reviews Microbiology., 2(10):820-832, 2004). 세포내(intracellular) 및 세포외(extracellular)의 과도한 ROS(초과산화물(superoxide) 및 과산화수소(hydrogen peroxide))는 식세포(대식세포(macrophage) 및 호중구(neutrophils))가 급성 과다 염증 반응(acute hyper-inflammatory response)에 대해 준비하는 능력을 갖추도록 한다(Matsunaga K et.al., Nature cell biology., 11(4):385-396, 2009; El Gazzar M. et.al., Molecular and cellular biology., 29(7):1959-1971, 2009). 세포의 ROS 수준을 조절하는 숙주 인자(host factor)는 패혈증의 병인에 중요한 조절자(modifier) 역할을 할 수 있다(Xu J. et.al., Nature medicine., 15(11):1318-1321, 2009; Jain A. et.al., Nature., 473(7348):484-488, 2011).
궤양성 대장염(Ulcerative colitis; UC)은 위장관(gastrointestinal tract)의 만성(chronic) 및 재발성(recurrent) 염증을 특징으로 하는 재발성 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease; IBD)이다. 대장염의 병인 기작(pathogenic mechanisms)은 복잡하며 유전적, 숙주 면역계(host immune system)와 환경적 요인 사이의 상호작용을 포함한다(Hubbard WJ. et.al., Shock., Shock. 2005;24 Suppl 1:52-57, 2005; Cavaillon JM. et.al., Scandinavian journal of infectious diseases., 35(9):535-544, 2003). 대장염 발병의 주요 인자 중 하나는 IBD 환자에서 점막 조직 손상과 만성 염증으로 이끄는 장내 미생물에 대한 부적절한 점막 면역 반응(mucosal immune response)이다(Victor VM. et.al., Current pharmaceutical design.. 11(24):3141-3158, 2005). 또한 IBD 환자의 염증이있는 점막에서 과도한 ROS 생성이 관찰되었다(Hutchins NA. et.al., Trends in molecular medicine., 20(4):224-233, 2014; Buchweitz JP. et.al., The Journal of pharmacology and experimental therapeutics., 323(2):675-683, 2007). 이러한 고도의 세포 독성 분자(cytotoxic molecules)는 IBD에서 조직 손상에 기여할 수 있으며, IBD 환자의 결장의 점막(colonic mucosa) 내로 비-식세포(non-phagocytes)(예컨대, 장 상피 세포)에 의해 세포 독성 분자가 방출 될 수 있다. 그러나, 급성 및 만성 염증 동안 원발성 장내 상피 세포(primary intestinal epithelial cells)에서 NOX 효소를 통해 ROS 생산을 조절하는 분자 경로(molecular pathways)는 잘 알려져 있지 않다.
NOX 복합체(NOX complex)는 두 개의 막 통과 단백질(transmembrane proteins로 구성되어 있는데, 플라보사이토크롬 b 컴포넌트(flavocytochrome b components; gp91phox/NOX2 및 p22phox)와 4개 세포질 단백질(cytosolic proteins)(p47phox, p67phox, p40phox, 및 Rac1/2)이 식세포(phagocyte)에 존재한다(Lambeth JD. et.al., Annual review of pathology., 9:119-145, 2014). 여러 세린 잔기에서 p47phox의 인산화는 손상되지 않은 세포에서 복합체의 활성화에 필수적이다. 활성화시, 세포질 성분은 막 투과 촉매 단백질(transmembrane catalytic protein) gp91phox/NOX2로 이동되어 기능성(functional) NOX 복합체(NOX complex)가 형성된다. ROS는 세포 신호 전달에서 2차 전달자(secondary messenger)로 여러 생리학적 및 병리학적 과정에 관여한다. 많은 연구가 TLR4 신호 전달(signaling), 염증 반응 및 질병 발병 기전을 조절하는 데 있어 NOX 의존성 ROS 생성(NOX-dependent ROS generation)의 역할을 입증했다. 특히 결장 상피 세포(colon epithelial cells)는 구조와 기능면에서 NOX2와 가장 밀접한 관련이 있는 동족체(homolog)인 NOX1을 풍부하게 발현한다(Victor VM. et.al., Current pharmaceutical design., 11(24):3141-3158, 2005; Hutchins NA. et.al., Trends in molecular medicine.. 20(4):224-233, 2014). 이 효소는 정상 및 병원성 박테리아와 밀접하게 접촉하며 장내에서 국소 선천 면역(local innate immune) 및 염증 반응에 중요한 역할을 할 수 있다(Bruno BJ. et.al., Therapeutic delivery.. 4(11):1443-1467, 2013). 몇몇 연구는 in vitro 상에서 장 상피 세포(intestinal epithelial cell) 배양에 있어, IL-18, IFN-γ 및 TNF-α와 같은 전-염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokines), 박테리아, 박테리아 생성물이 NOX 발현과 ROS 생성을 자극할 수 있다고 밝혔다. NOX의 활성화(activation)는 p22phox와의 상호작용과 이를 조절하는 파트너(NOX organizer 1(NOXO1), p47phox homolog, NOX activator 1(NOXA1), p67phox homolog, Rac1 GTPase)와의 결합을 필요로 한다. NOXO1과 NOXA1 전사체(transcripts)는 결장(colon)에서도 풍부하게 발현된다. 현재까지 NOX 발현과 활성이 패혈증과 IBD와 같은 병리학적 측면과 연관이 되어 있는지는 명확하게 밝혀져 있지 않다.
치마버섯(Schizophyllum commune) 유래 가용성 형태의 β-글루칸(β-glucan)인 시조필란(Schizophyllan, SPG)은 중성 용액(neutral solution)에서 3중 나선(triple helix)을 형성하는 β-(1-3)-글루칸계(β-(1-3)-glucan family) 다당류(polysaccharide) 구성원이다. 시조필란(SPG)의 알칼리성 용액이 중화되면, 변성되어 단일 사슬(single chain)을 형성하고 소수성(hydrophobic) 및 수소 결합 상호작용을 통해 원래의 3중 나선으로 되돌아간다. 이러한 물리화학적 상호작용(physicochemical interaction) 동안, β-(1-3)-글루칸의 2개의 주쇄(main-chain) 글루코스와 하나의 올리고뉴클레오타이드(Oligonucletide; ODN) 염기 또는 펩타이드는 원래의 3중 나선으로 되돌아가는 대신에 화학량론 복합체(stoichiometric complex)를 형성한다. 이 복합체를 이용함으로써 SPG-기반 약물 전달 시스템(SPG-based drug delivery system)은 표적 세포(targeted cell)에 기능성(functional) ODN을 전달하도록 고안되었다(Yang CS. et.al., Cell host & microbe., 11(3):277-289, 2012; Deretic V. et.al., Scientific American., 298(5):74-81, 2008; Deretic V. et.al., Cell host & microbe., 5(6):527-549, 2009; Craik DJ. et.al., Chemical biology & drug design., 81(1):136-147, 2013).
한편, 덱틴-1(Dectin-1)은 SPG와 같은 β-글루칸(β-glucan)에 결합하는 병원체 패턴 인식 수용체(pathogen pattern recognition receptor)로 확인되었으며, 대식세포(macrophage), 수지상 세포(dendritic cell) 및 비-식세포(non-phagocyte)(상피세포 및 내피세포)와 같은 항원 제시 세포(antigen presenting cell, APC)에서 주요 β-글루칸 수용체(β-glucan receptor)이다(Lee YS. et.al., EMBO molecular medicine., 7(5):577-592, 2015). 따라서, 상기 복합체는 항원 제시 세포(APCs)의 덱틴-1에 의해 인지될 것이며, ODN 또는 펩티드는 이들 세포에 의해 섭식(intake) 될 것이다. β-글루칸에 의한 덱틴-1의 결합(engagement)은 세포질 도메인(cytoplasmic domain) 내에서 면역 수용체 타이로신-기반 활성화 모티프-유사 서열(immunoreceptor tyrosine-based activation motif-like sequence)의 인산화를 유도한다. 이후 C-Src 또는 Syk 타이로신 인산화효소(tyrosine kinase)의 결합(association)은 수지상 세포와 대식세포에서 CARD9/BCL10/MALT1 복합체-NF-κB(CARD9/BCL10/MALT1 complex-nuclear factor-κB) 경로로 구성된 골격(scaffold)의 조립(assembly)을 유도한다(Kim SD. et.al., Journal of immunology., 185(7):4302-4310, 2010). 그러나, 현재까지 ROS에 의해 유도된 면역 반응(ROS-induced immune responses)에서 SPG의 역할은 상세하게 규명되어 있지 않다.
본 발명자들은 C-Src가 p47phox와의 물리적 및 기능적 상호작용을 통해 NOX 활성에 중요한 음성 조절자임을 규명하였다. 즉, C-Src가 p47phox와 다른 NOX 서브유닛(subunit)과의 결합을 경쟁적으로 저해하여 NOX 복합체(NOX complex)의 조립을 효과적으로 차단함을 규명하였다. 또한, C-Src 유래 SH3 펩타이드(peptide)는 시조필란(SPG)과 결합되어 NOX 상호작용을 차단하며, 결국 활성산소(ROS) 및 염증성 사이토카인 생성을 현저하게 저해하게 됨을 밝혔다. 아울러, CLP(cecal ligation procedure)-유도 다균성 패혈증(polymicrobial sepsis) 및 DSS(dextran sodium sulfate)-유도-궤양성 대장염(ulcerative colitis) 마우스 in vivo 동물 모델에 SPG/C-Src-SH3 펩티드 복합체(SPG/C-Src-SH3 peptide complex)를 처리하면, ROS 및 염증의 과도한 생성을 조절하여 현저하게 사망률을 감소시키고, 뿐만 아니라 마우스 동물 모델에서의 병리학적 반응 또한 개선시킴을 밝혔다. 종합하면, 본 발명자들은 C-Src가 p47phox와 직접 결합(direct binding)을 통해 NOX 활성에 있어 중요한 역할을 하며, 과도한 염증 반응을 저해할 수 있음을 규명하였다.
세포내(intracellular) 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)에 의해 유발되는 과도한 염증 반응은 패혈증 및 대장염을 비롯하여 다양한 질병을 유발할 수 있지만, 이 과정의 조절자는 여전히 잘 정의되어 있지 않다. 이에, 상기와 같은 규명을 통해 본 발명의 SPG-C-Src-SH3 펩타이드 복합체가 p47phox를 표적으로 하여, 패혈증 및 대장염과 같은 ROS와 관련된 치명적인 염증성 질환을 효과적으로 개선 또는 치료할 수 있으며, p47phox를 표적으로하는 새로운 펩타이드 기반 약제 개발에 유용하게 활용할 수 있음을 알 수 있다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 패혈증 및 대장염과 같은 염증성 질환 치료를 위한 치료제를 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, C-Src가 p47phox와의 결합을 통해 활성산소(ROS) 생성 및 NOX 복합체(NOX complex)의 조립을 저해함을 규명하고, C-Src의 아미노산 91-108과 121-140으로 구성된 C-Src SH3-유래 펩타이드와 β-1,3-글루칸(β-1,3-glucan)인 시조필란(schizophyllan, SPG)이 결합된 SPG-C-Src-SH3 펩타이드 복합체를 개발하게 되었다. 또한, 상기 복합체가 NOX 서브유닛(subunit) 조립(assembly) 및 전염증성 매개자(proinflammatory mediators)의 생성을 억제함을 확인하고, 이를 패혈증 또는 대장염 마우스 동물 모델에 적용해 본 결과, 패혈증 및 대장염과 같은 염증성 질환 개선 및 치료 효과가 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
Zhong Y et.al., Nature cell biology., 11(4):468-476, 2009
Gump JM et.al., Trends in molecular medicine., 13(10):443-448, 2007
Wadia JS et.al., Nature medicine., 10(3):310-315, 2004
Hotchkiss RS et.al., Journal of immunology., 176(9):5471-5477, 2006
Fang FC., Nature reviews Microbiology., 2(10):820-832, 2004
Matsunaga K et.al., Nature cell biology., 11(4):385-396, 2009
El Gazzar M. et.al., Molecular and cellular biology., 29(7):1959-1971, 2009
Xu J. et.al., Nature medicine., 15(11):1318-1321, 2009
Jain A. et.al., Nature., 473(7348):484-488, 2011
Hubbard WJ. et.al., Shock., Shock. 2005;24 Suppl 1:52-57, 2005
Cavaillon JM. et.al., Scandinavian journal of infectious diseases., 35(9):535-544, 2003
Victor VM. et.al., Current pharmaceutical design.. 11(24):3141-3158, 2005
Hutchins NA. et.al., Trends in molecular medicine., 20(4):224-233, 2014
Buchweitz JP. et.al., The Journal of pharmacology and experimental therapeutics., 323(2):675-683, 2007
Lambeth JD. et.al., Annual review of pathology., 9:119-145, 2014
Bruno BJ. et.al., Therapeutic delivery.. 4(11):1443-1467, 2013
Yang CS. et.al., Cell host & microbe., 11(3):277-289, 2012
Deretic V. et.al., Scientific American., 298(5):74-81, 2008
Deretic V. et.al., Cell host & microbe., 5(6):527-549, 2009
Craik DJ. et.al., Chemical biology & drug design., 81(1):136-147, 2013
Kim SD. et.al., Journal of immunology., 185(7):4302-4310, 2010
본 발명의 목적은 염증성 질환 예방 또는 치료용 베타글루칸-펩타이드 복합체를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 베타글루칸-펩타이드 복합체의 제조방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 베타글루칸-펩타이드 복합체를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하기 위한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 베타글루칸-펩타이드 복합체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 보다 상세하게는, 베타-1,3-글루칸인 시조필란(Schizophyllan, SPG)과 c-Src 유래의 SH3 펩타이드를 공유결합시켜 SPG-c-Src-SH3 펩타이드 복합체를 제조하고, 상기 복합체를 유효성분으로 함유하는 패혈증 및 대장염과 같은 염증성 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.
하나의 양태로서, 본 발명은 (ⅰ) 베타-1,3-글루칸(β-1,3-glucan), 및 (ⅱ) 상기 베타-1,3-글루칸과 결합되어 있는 서열번호 1 및/또는 2의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 포함하는, 염증성 질환 예방 또는 치료용 베타글루칸-펩타이드 복합체를 제공한다.
본 발명에서 용어 "베타-1,3-글루칸(β-1,3-glucan)"은 포도당(glucose)이 β-1,3 화학결합을 중심으로 중합된 다당류를 총칭하며, 버섯, 효모 등 미생물의 세포벽이나 세포외 다당류에서 분리함으로써 생산되는 미생물 유래의 베타-글루칸과, 보리, 귀리와 같은 곡물의 식이섬유에서 추출 생산되는 식물성 베타-글루칸이 있다. 구체적으로 베타-1,3-글루칸(β-1,3-glucan)은 포도당 분자간에 베타-1,3-결합을 이루는 고분자 다당류 물질이며, 이에 제한되지는 않으나, 시조필란(Schizophyllan, SPG), 자이모산(Zymosan), 커들란 AL(Curdlan AL), 스클로글루칸(Scleroglucan) 또는 라미나린(Laminarin) 일 수 있다.
상기 시조필란(Schizophyllan, SPG)은 치마버섯(Schizophyllum commune) 유래 가용성 형태(soluble form)의 β-글루칸(β-glucan)이며, 중성 용액(neutral solution)에서 3중 나선(triple helix)을 형성하는 다당류(polysaccharide)이다.
한편, 자이모산(Zymosan)은 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae)의 세포벽(cell wall) 유래 β-글루칸이며, 커들란 AL(Curdlan AL)은 알칼리제니스 페칼리스(Alcaligenes faecalis ) 유래 β-글루칸이며, 스클로글루칸(Scleroglucan)은 스크레로티움 롤프시(Sclerotium rolfsii) 유래 β-글루칸이며, 라미나린(Laminarin)은 라미나리아 디지타타(Laminaria digitata)유래 β-글루칸 일 수 있다.
본 발명에서 용어 "펩타이드(peptide)"는 c-Src 유래의 SH3 펩타이드로, c-Src의 아미노산 91 내지 108(서열번호 1: ALYDYESRTETDLSFKKG)과, 121 내지 140(서열번호 2: WWLAHSLSTGQTGYIPSNYV)으로 구성된다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 펩타이드는 각각 c-Src-SH-1 및 c-Src-SH2로 칭하였으며, c-Src-SH-1 또는 c-Src-SH2 단독으로 사용하거나, c-Src-SH-1 및 c-Src-SH2가 혼합된 형태로 사용하였다.
상기 펩타이드는 필요에 따라 N 말단에 형광물질을 표지할 수 있으며, 형광물질은 이에 제한되지는 않으나, TAMRA(카르복시테트라메틸로다민), 알렉사 플루오르 647, TMR(테트라메틸로다민), 로다민그린(Rhodamine Green), 알렉사 플루오르(Alexa fluor) 488, YOYO1, 에보블루(EVOblue) 50, 피코에리스린(phycoerythrin, PE), 텍사스 레드(Texas Red, TR), 로다민(tetramethylrhodamine isothiocyanate, TRITC), 플루오레신카복실산(fluorescein carboxylic acid, FCA), 플루오레신 티오우레아(fluorescein thiourea, FTH), 7-아세톡시쿠마린(acethocycoumarin)-3-1, 플루오레신-5-1, 플루오레신-6-1, 2',7'-디클로로플루오레신(dichlorofluorescein)-5-1, 2',7'-디클로로플루오레신-6-1, 디하이드로테트라메틸로사민(dehydrotetramethylosamine)-4-1, 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine)-5-1, 및 테트라메틸로다민-6-1로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
상기 베타-1,3-글루칸인 시조필란(Schizophyllan, SPG)과, 상기 서열번호 1 및/또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 c-Src 유래의 SH3 펩타이드는 화학적 결합에 의해 서로 결합되어 있는 것일 수 있다.
상기 화학적 결합은 이에 제한되지는 않으나, 공유결합 또는 비공유결합일 수 있으며, 상기 비공유결합은 수소결합, 정전기(이온) 결합 및/또는 반데르발스 인력을 비롯한 임의의 비공유결합력을 통해 매개될 수 있다.
한편, 상기 베타-1,3-글루칸인 시조필란(Schizophyllan, SPG)과, 상기 서열번호 1 및/또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 c-Src 유래의 SH3 펩타이드는 직접적으로 공유결합된 복합체일 수 있으며, 링커를 통해 간접적으로 공유결합된 복합체일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 숙신산 무수물(succinic anhydride)을 첨가하여 시조필란(Schizophyllan, SPG)의 히드록시기를 카르복실기로 변환시켜, 시조필란(Schizophyllan, SPG) 말단에 카르복실기(-COOH기)를 도입하고, 상기 시조필란(SPG)의 카르복실기(-COOH기)와 서열번호 1 및/또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 c-Src 유래의 SH3 펩타이드의 아민기를 공유결합시켜, 베타글루칸-펩타이드 복합체를 형성하였다(도 8).
상기 공유결합은 가교제(crosslinker)를 첨가하여 형성할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 가교제로는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(EDC; 1-Ethyl-3-(3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide), N-하이드록시숙신이미드(NHS; N-Hydroxy succinimide), 글루타르알데히드, NHS 에스터, 말레이미드, 피리딜 디설파이드, 하이드라지드, 및 알콕시 아민류 등을 사용할 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 베타글루칸-펩타이드 복합체를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 베타글루칸-펩타이드 복합체는 베타-1,3-글루칸인 시조필란(SPG)과, 서열번호 1 및/또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 c-Src 유래의 SH3 펩타이드가 공유결합되어 있는 형태이며, p47phox를 표적으로 하여, 활성산소(ROS) 생성 및 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-6, IL-1β 또는 IL-18의 생성을 억제할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, CLP(cecal ligation procedure)-유도 다균성 패혈증(polymicrobial sepsis) 및 DSS(dextran sodium sulfate)-유도-궤양성 대장염(ulcerative colitis) 마우스 in vivo 동물 모델에 SPG/C-Src-SH3 펩티드 복합체(SPG/C-Src-SH3 peptide complex)를 처리하면, ROS 및 전염증성 사이토카인의 과도한 생성을 조절하여 현저하게 사망률을 감소시키고, 뿐만 아니라 마우스 동물 모델에서의 병리학적 반응 또한 개선시킴을 확인하였다(도 11 및 도 12).
이에, 본 발명에 따른 SPG/C-Src-SH3 펩티드 복합체를 포함하는 조성물은 패혈증 및 대장염 동물 모델의 사망률을 감소시키고, ROS 및 염증성 사이토카인의 생성을 현저하게 저해시키는 효과를 갖는 바, 패혈증 및 대장염과 같은 염증성 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.
구체적으로, 상기 염증성 질환은 이에 제한되지는 않으나, 패혈증(sepsis), 패혈성 쇼크, 염증성 장질환(Inflammatory bowel disease, IBD), 복막염, 신장염, 급성 기관지염, 만성 기관지염, 골관절염, 장질환 척추염, 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 급성 폐손상(acute lung injury) 및 기관지 폐 형성장애(broncho-pulmonary dysplasia)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
한편, 이에 제한되지는 않으나, 상기 염증성 장질환(IBD)은 궤양성 대장염(Ulcerative colitis, UC) 또는 크론씨병(Crohns disease)일 수 있다.
본 발명에서 용어 "예방"이란, 본 발명의 약학적 조성물의 투여로 염증성 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"란, 본 발명의 약학적 조성물의 투여로 인해 이미 유발된 염증성 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 따른 상기 약학적 조성물은, 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용가능한 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등을 들 수 있다.
상기 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물은 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제한다.
또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 조성물의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 1 내지 100 mg/㎏의 양을 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다.
또한, 이러한 조성물의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
상기 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular)주사에 의해 투여될 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 다음을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 베타글루칸-펩타이드 복합체의 제조방법을 제공한다:
(a) 유기용매에 베타-1,3-글루칸(β-1,3-glucan)을 용해시키고, 고리형 무수물(cyclic anhydride)을 첨가하여 베타-1,3-글루칸의 히드록시기를 카르복실기로 변환시켜, 베타-1,3-글루칸 말단에 카르복실기(-COOH기)를 도입하는 단계; 및
(b) 단계 (a)의 베타-1,3-글루칸의 카르복실기(-COOH기)와 서열번호 1 및/또는 2의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드의 아민기를 결합시켜, 베타글루칸-펩타이드 복합체를 형성하는 단계.
본 발명의 일실시예에 있어서, 치마버섯(Schizophyllum commune) 유래 베타-1,3-글루칸인 시조필란(Schizophyllan, SPG)을 유기용매로 용해시키고, 고리형 무수물(cyclic anhydride)을 첨가하여 카르복실기(-COOH기) 말단을 갖는 시조필란(SPG)을 합성하고, 상기 카르복실기 말단을 갖는 시조필란(SPG)과, 서열번호 1 및/또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 c-Src 유래의 SH3 펩타이드의 아민기를 공유결합시킴에 따라 베타글루칸-펩타이드 복합체, 즉, SPG/C-Src-SH3 펩티드 복합체(SPG/C-Src-SH3 peptide complex)를 제조하였다(도 8).
상기 유기용매는 이에 제한되지는 않으나, 다이메틸설폭사이드(DMSO), 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 다이클로로메탄, 피리딘, N,N-다이메틸포름아미드(DMF), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 및 이들의 혼합용매로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
또한, 상기 고리형 무수물은 이에 제한되지는 않으나, 숙신산 무수물, 말레산 무수물 또는 글루타르산 무수물일 수 있다.
상기 c-Src 유래의 SH3 펩타이드의 아미노산 서열은, c-Src의 아미노산 91 내지 108(서열번호 1: ALYDYESRTETDLSFKKG)과, 121 내지 140(서열번호 2: WWLAHSLSTGQTGYIPSNYV)로 구성된다.
상기 SPG/C-Src-SH3 펩티드 복합체(SPG/C-Src-SH3 peptide complex)는 SPG-c-Src-ALYDYESRTETDLSFKKG(서열번호 1) 및 SPG-c-Src-WWLAHSLSTGQTGYIPSNYV(서열번호 2)로 구성된 군으로부터 하나 이상 선택될 수 있다.
한편, 상기 단계 (b)는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(EDC; 1-Ethyl-3-(3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide) 및 N-하이드록시숙신이미드(NHS; N-Hydroxy succinimide) 사이의 반응에 의해 수행되는 것일 수 있다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에 따른 베타글루칸-펩타이드 복합체는 p47phox를 표적으로 하여, 활성산소(ROS) 및 염증성 사이토카인 생성을 현저하게 저해하므로, 패혈증 및 대장염과 같은 ROS와 관련된 치명적인 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다. 한편, p47phox를 표적으로하는 새로운 펩타이드 기반 약제 개발에도 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따라 시조필란(Schizophyllan, SPG)이 p47phox 활성화의 억제를 통해 TLR4-ROS 신호를 차단함에 대한 결과를 나타낸 도이다. 다양한 농도(0, 1, 10 또는 100 ㎍/㎖)의 SPG로 1시간 동안 전처리(pretreatment)한 후, 세포를 (A) 30분, (B 및 F) 18시간, (C) 1시간, (D) 4시간, (E) 2시간 또는 (G의 우) 15분 동안 LPS(100 ng/㎖)로 자극을 주었다. (A) BMDM(Bone Marrow-derived Macrophage)의 NADPH oxidase(NOX) 활성은 SPG(0, 1, 10, 100 ㎍/㎖) 존재 하에서 LPS로 자극하여 확인하였다(좌). BMDM의 O2-와 H2O2 생성을 각각 검출하기 위해, DHE와 CM-H2DCFDA 형광 강도를 확인하였다(우). (B) 배양 상층액(supernatant)을 수집하고, ELISA assay(enzyme-linked immunosorbent assay)를 수행하여 사이토카인(cytokine) 생성 정도를 확인하였다. (C, F 및 G) BMDM을 수확(harvest)한 후, 인산화된 형태의 MAPK(p42/44, p38 및 SAPK/JNK)와, 인산화된 총 형태의 IκB-α(C), gp91phox, p22phox, p47phox 및 p67phox(F), p47phox의 인산화된 형태(S304, S345, S359와 S370)(G)는 면역 블롯(IB)을 수행하여 확인하였으며, 액틴(actin)은 내재적 대조군으로 사용하였다. (D) NF-κB 리포터 플라스미드(NF-κB reporter plasmid)와 표준화(normalization)를 위한 pRL-TK 레닐라 플라스미드(pRL-TK Renilla plasmid)를 RAW264.7 세포에 공-형질주입(co-transfection) 시켰다. 루시퍼라아제 분석(Luciferase assay)를 수행하기 위해, 2일 후, 시조필란(SPG) 존재하에서 세포를 LPS로 자극하였다. (E) 면역 형광 현미경(Immunofluorescence microscopy) 분석법으로 BMDM에서 p65(녹색)를 확인하였으며, 이때 핵은 DNA-삽입 염료(DNA-intercalating dye)인 DAPI(파란색)로 염색되었다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 베타-1,3-글루칸(β-1,3-glucan)인 자이모산(Zymosan), 커들란 AL(Curdlan AL), 스클로글루칸(Scleroglucan), 라미나린(Laminarin)이 LPS로 유도된 대식세포(LPS-induced macrophage)에서 NOX(NADPH oxidase) 활성과 염증성 사이토카인(inflammatory cytokines)인 TNF-α, IL-6, IL-10 생성에 미치는 영향에 대한 결과를 나타낸 도이다. 다양한 농도(0, 1, 10 및 100 ㎍/㎖)의 베타-1,3-글루칸(β-1,3-glucan)인 자이모산(Zymosan), 커들란 AL(Curdlan AL), 스클로글루칸(Scleroglucan), 라미나린(Laminarin)을 BMDM(Bone Marrow-derived Macrophage)에 (A) 1시간 또는 (B) 18시간 동안 전처리한 후, 30분 동안 LPS(100 ng/㎖)로 자극을 주었다. (A) BMDM(Bone Marrow-derived Macrophage)의 NADPH oxidase(NOX) 활성은 상기 베타-1,3-글루칸(0, 1, 10, 100 ㎍/㎖) 존재 하에서 LPS로 자극하여 확인하였다. (B) 배양 상층액(supernatant)을 수집하고, ELISA assay(enzyme-linked immunosorbent assay)를 수행하여 사이토카인(cytokine) 생성 정도를 확인하였다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따라 p47phox가 C-Src와 상호작용(interaction)하고 NOX(NADPH oxidase) 조립(assembly)을 조절함에 대한 결과를 나타낸 도이다. (A) p47phox 복합체(p47phox complex)는 시조필란(Schizophyllan, SPG; 10 ㎍/㎖)을 1시간 동안 처리하고 LPS로 30분 동안 자극한, 플래그(Flag)-p47phox-발현(expressed) THP-1 세포로부터 정제되었다. 아가로스 비드(agarose bead)가 결합된 αFlag 항체를 이용하여 상기 p47phox 복합체(p47phox complex)의 면역침강법(immunoprecipitation; IP) 분석을 수행하고, 질량 분석법(Mass spectrometry analysis)을 통해 분석하였다. (B 및 C) 시조필란(Schizophyllan, SPG; 10 ㎍/㎖)을 전처리(pretreatment)한 THP-1 세포에 LPS(100 ng/㎖)를 처리하여 15 내지 30분 동안 자극을 주었다. 상기 세포를 수확(harvest)한 후, p47phox에 대한 면역침강법(immunoprecipitation; IP)을 수행하고, C-Src 및 p47phox의 인산화된 형태(S304, S345, S359 및 S370)(B) 또는 gp91phox, p22phox, p47phox 및 p67phox(C)는 면역 블롯(IB)을 수행하여 확인하였다. (D) 결합 맵핑(binding mapping)으로 p47phox 및 C-Src의 구조를 개략적으로 나타내었다(위). 293T 세포에 V5-C-Src 또는 이의 돌연변이체(ΔSH2-KD, ΔKD)와 함께, 대조군 벡터(control vector)인 플래그(flag)-p47phox 또는 47phox의 절단된(truncated) 돌연변이체(ΔSH3-PRR, ΔAIR-PRR, ΔPRR)를 공-형질주입(co-transfection) 시켰다. 상기 세포는 V5 또는 플래그(flag)에 대한 항체로 공-면역침강법(co-immunoprecipitation; co-IP)을 수행한 후, 플래그(flag) 또는 V5에 대한 항체로 면역 블롯(IB)을 진행하였다(아래, 왼쪽). 293T 세포에 AU1-p67phox 또는 AU1-p40phox와 함께, V5-C-Src의 양을 증가시키면서 플래그(flag)-p47phox를 공-형질주입(co-transfection) 시키고, 플래그(flag)에 대한 항체로 면역침강법(immunoprecipitation; IP)을 수행한 후, 플래그(Flag), AU1, V5에 대한 항체로 면역 블롯(IB)을 진행하였다(아래, 오른쪽). 액틴(actin)은 내재적 대조군으로 사용하였다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따라 C-Src가 p47phox와 상호작용하고 p67phox 및 p40phox와의 결합은 저해함에 대한 결과를 나타낸 도이다. (A) p47phox 및 C-Src 구조의 개략도를 나타내었다. (B) 293T 세포에 AU1-p67phox 또는 AU1-p40phox와 함께, V5-C-Src의 양을 증가시키면서 플래그(flag)-p47phox를 공-형질주입(co-transfection) 시키고, AU1에 대한 항체로 면역침강법(immunoprecipitation; IP)을 수행하였다. 이후, 플래그(Flag), AU1, V5에 대한 항체로 면역 블롯(IB)을 진행하였으며, 액틴(actin)은 내재적 대조군으로 사용하였다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따라 시조필란(Schizophyllan, SPG) 처리에 따른 전신성 패혈증(systemic sepsis) 및 대장염(colitis)의 예방 또는 치료 효과에 대한 결과를 나타낸 도이다. (A) 시조필란(SPG) 또는, 대조군으로서 비히클(Vehicle)을 처리한 CLP 유도 동물 모델 구축을 위한 개략도이다(위). 마우스 당 20 ㎎/㎏의 시조필란(SPG)을 경구 투여로 처리한 CLP-유도 마우스의 생존율을 7일 동안 모니터링 하였으며, 그룹당 10마리의 마우스에 대해 사망률을 측정하였다(아래). (B) 그룹당 5마리의 마우스에서 CLP 유도 후 18시간에 수득한 폐(lung)와 비장(spleen)의 대표적인 H&E(Hematoxylin-eosin) 염색 결과(왼쪽)를 나타낸 것으로, 조직 병리학 점수는 폐 절편(section)의 H&E 염색 결과로부터 도출하였다(오른쪽). (C) 시조필란(SPG) 또는, 대조군으로서 비히클(Vehicle)을 처리한 5% DSS-유도 대장염 동물 모델 구축을 위한 개략도이다(위). 시조필란(SPG) 또는 비히클(Vehicle)을 처리한 DSS-유도 마우스의 생존율을 25일 동안 모니터링 하였다. 대조군(control) 마우스와 비교한 통계적 차이로 표시하였다(log-rank test). (D) 시조필란(SPG) 또는 비히클(Vehicle)을 처리한 DSS-유도 마우스의 체중 변화를 나타내었다. (E) 체중 감소, 대변 농도, 결장 출혈 등의 제안된 대장염 동물 모델의 임상적 매개 변수를 그래프화하여 나타내었다. (F) 그룹당 5마리의 마우스에서 DSS 처리 후 6일째 수득한 결장(colon)의 대표적인 H&E(Hematoxylin-eosin) 염색 결과(왼쪽)를 나타낸 것으로, 조직 병리학 점수는 중간(middle) 및 말단(distal) 부위의 결장 절편(section)의 H&E 염색 결과로부터 도출하였다(오른쪽).
도 6은 본 발명의 일실시예에 따라 시조필란(Schizophyllan, SPG) 처리에 따른 전신성 패혈증(systemic sepsis) 및 대장염(colitis)의 예방 또는 치료 효과에 대한 결과를 나타낸 도이다. (A) 마우스 당 20 ㎎/㎏의 시조필란(SPG)을 경구 투여로 처리한 마우스 또는 대조군으로서 비히클(vehicle)을 처리한 마우스의 체중을 4주 동안 측정하여 나타내었다(왼쪽). 또한, 시조필란(SPG) 또는 대조군으로서 비히클(vehicle)을 처리하고 2주째 수득한 혈청(serum)에서 사이토카인 분비량을 측정하여 나타내었다(오른쪽). (B) 시조필란(SPG) 또는 대조군으로서 비히클(vehicle)을 처리한 CLP-유도 마우스의 비장(spleen)의 형태적 차이를 비교하여 나타내었다. 여기에서, UN은 아무것도 처리하지 않은 테스트 군이다. (C) 시조필란(SPG) 또는 비히클(Vehicle)을 처리한 DSS-유도 마우스의 생존율을 25일 동안 관찰한 결과(왼쪽)와 체중 변화(오른쪽)를 나타내었다. (D) 시조필란(SPG) 또는 대조군으로서 비히클(vehicle)을 처리한 DSS-유도 마우스의 결장(colon)의 형태적 차이(왼쪽) 및 길이 차이(오른쪽)를 나타내었다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따라 SPG와 결합된 펩타이드의 합성 결과를 나타낸 도이다. (A) C-Src, p67phox 및 p47phox의 서열 얼라인먼트(sequence alignment)를 나타낸 도로, 박스는 본 발명의 SH3-1 펩타이드와 SH3-2 펩타이드를 나타낸다. (B) SPG(Schizophyllan), SGP/SA(Schizophyllan/succinic anhydride), SGP/SA/NHS(Schizophyllan/succinic anhydride/1-Ethyl-3(3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide(EDC) 및 N-Hydroxyl succinimide(NHS)) 및 SPG/SA/NHS/SH3(Schizophyllan/succinic anhydride/1-Ethyl-3(3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide(EDC) 및 N-Hydroxyl succinimide(NHS)/SH3 peptide; 즉, SPG/C-Src-SH3 펩타이드 복합체)의 FR-IR 스펙트럼 결과를 나타내었다. (C) SPG(Schizophyllan), SGP/SA(Schizophyllan/succinic anhydride) 및 SPG/SA/NHS/SH3(Schizophyllan/succinic anhydride/1-Ethyl-3(3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide(EDC) 및 N-Hydroxyl succinimide(NHS)/SH3 peptide; 즉, SPG/C-Src-SH3 펩타이드 복합체)의 1H NMR 스펙트럼 결과를 나타내었다. (D) 펩타이드의 흡광도(absorbance) 스펙트럼을 나타내었다. 여기에서, std는 standard의 약어이며, SH3-1 펩타이드 또는 SH-2 펩타이드/SPG는, SPG와 결합된 SH3 펩타이드 복합체(SH3 peptide conjugated SPG)이며, SPG는 DMSO에 1 ㎎/㎖의 농도로 용해되어 있는 시조필란(Schizohpyllan)이다. (E) TAMRA로 표지된 TAMRA-C-Src-SH3 펩타이드에 대한 Raw264.7 세포의 면역형광(immunofluorescence) 현미경 사진을 나타내었다. Raw264.7 세포에서의 면역형광은 C-Src-SH3를 TAMRA로 표지함으로써 수행하였다. Raw264.7 세포에 SPG/TAMRA-C-Src-SH3 펩타이드 복합체(10 ㎍/㎖)를 1시간 동안 처리하고, SPG/TAMRA-C-Src-SH3 펩타이드 복합체의 섭식(intake) 결과를 나타내었다.
도 8은 본 발명의 일실시예에 따라 베타-1,3-글루칸(β-1,3-glucan)인 SPG(Schizohpyllan)와 SH3 펩타이드(peptide)를 연결하여 베타글루칸-펩타이드 복합체를 제조하는 과정을 모식적으로 나타낸 도이다. 구체적으로 무수물(anhydride)을 이용한 교차결합(cross linking) 방법에 의한 SPG와 기능성 펩타이드의 생물학적 결합에 대해 도식화하여 나타내었다.
도 9는 본 발명의 일실시예에 따라 SPG/C-Src-SH3 펩타이드 복합체가 TLR4-ROS 신호전달(signaling)을 차단함에 대한 결과를 나타낸 도이다. (A) 293T 세포에 AU1-p67phox(왼쪽) 또는 AU1-p40phox(오른쪽)와 함께, 12시간 동안 플래그(flag)-p47phox를 공-형질주입(co-transfection) 시키고, 농도별(1, 5, 10 ㎍/㎖)로 대조군인 SPG-SC(Scramble) 펩타이드 복합체와, SPG-SH3-1 펩타이드 복합체, SPG-SH3-2 펩타이드 복합체, 또는 SPG-SH3-1 및 SH3-2 펩타이드 복합체를 6시간 동안 처리하였다. 이후 플래그(flag)에 대한 항체로 면역침강법(immunoprecipitation; IP)을 수행한 후, 플래그(Flag), AU1에 대한 항체로 면역 블롯(IB)을 진행하였다. 액틴(actin)은 내재적 대조군으로 사용하였다. (B) 플래그(Flag)-p47phox-발현 THP-1 세포(THP-1-Flag-p47phox)에 대조군인 SPG-SC(Scramble) 펩타이드 복합체와, SPG-SH3-1 펩타이드 복합체, SPG-SH3-2 펩타이드 복합체, 또는 SPG-SH3-1 및 SH3-2 펩타이드 복합체를 1시간 동안 전처리한 후, LPS(100 ng/㎖)로 30분 동안 자극을 주었다. 이후, 세포를 수확(harvest)하여 플래그(flag)에 대한 항체로 면역침강법(immunoprecipitation; IP)을 수행하고, p67phox, p40phox, p22phox, gp91phox 또는 플래그(Flag)에 대한 항체로 면역 블롯(IB)을 진행하였다. 액틴(actin)은 내재적 대조군으로 사용하였다. (C) 플래그(Flag)-p47phox-발현 Raw264.7 세포(Raw264.7-Flag-p47phox)에 대조군인 SPG-SC(Scramble) 펩타이드 복합체와, SPG-SH3-1 펩타이드 복합체, SPG-SH3-2 펩타이드 복합체, 또는 SPG-SH3-1 및 SH3-2 펩타이드 복합체를 처리하고, LPS(100 ng/㎖)로 자극을 준 후, NOX(NADPH oxidase) 활성을 측정하여 나타내었다. (D) NF-κB 리포터 플라스미드(NF-κB reporter plasmid)와 표준화(normalization)를 위한 pRL-TK 레닐라 플라스미드(pRL-TK Renilla plasmid)를 플래그(Flag)-p47phox-발현 Raw264.7 세포(Raw264.7-Flag-p47phox)에 공-형질주입(co-transfection) 시켰다. 2일 후, 상기 세포에 대조군인 SPG-SC(Scramble) 펩타이드 복합체와, SPG-SH3-1 펩타이드 복합체, SPG-SH3-2 펩타이드 복합체, 또는 SPG-SH3-1 및 SH3-2 펩타이드 복합체를 처리하고, LPS로 자극을 준 후, 루시퍼라아제 어세이(luciferase assay)를 수행하여 NK-κB 활성을 측정하여 나타내었다. (E) 플래그(Flag)-p47phox-발현 Raw264.7 세포(Raw264.7-Flag-p47phox)에 대조군인 SPG-SC(Scramble) 펩타이드 복합체와, SPG-SH3-1 펩타이드 복합체, SPG-SH3-2 펩타이드 복합체, 또는 SPG-SH3-1 및 SH3-2 펩타이드 복합체를 1시간 동안 전처리한 후, 18시간 동안 LPS로 자극을 주었다. 이후 배양 상층액을 수집(harvest)하고 효소면역측정법(ELISA)을 수행하여 사이토카인 분비량을 측정하여 나타내었다.
도 10은 본 발명의 일실시예에 따라 SPG/C-Src-SH3 펩타이드 복합체가 TLR(Toll-like receptor) 및 NLRP3 염증조절복합체-매개-NOX 조립(NLRP3 inflammasome-mediated NOX assembly)과 ROS-매개 전-염증성 신호(ROS mediated pro-inflammatory signaling)를 강하게 억제함에 대한 결과를 나타낸 도이다. (A) Raw264.7과 THP-1 세포에 농도별(1, 5, 10 ㎍/㎖)로 SPG-SH3-1 펩타이드 복합체, SPG-SH3-2 펩타이드 복합체, 또는 SPG-SH3-1 및 SH3-2 펩타이드 복합체를 72시간 동안 처리하고 배양한 후, MTT assay를 수행하여 세포 생존율을 측정하여 나타내었다. (B) 293T 세포에 AU1-p67phox과 함께, 12시간 동안 플래그(flag)-p47phox를 공-형질주입(co-transfection) 시키고, 농도별(1, 5, 10 ㎍/㎖)로 대조군인 SPG-SC(Scramble) 펩타이드 복합체와, SPG-SH3-1 펩타이드 복합체, SPG-SH3-2 펩타이드 복합체, 또는 SPG-SH3-1 및 SH3-2 펩타이드 복합체를 6시간 동안 처리하였다. 이후 플래그(flag)에 대한 항체로 면역침강법(immunoprecipitation; IP)을 수행한 후, 플래그(Flag), AU1에 대한 항체로 면역 블롯(IB)을 진행하였다. 액틴(actin)은 내재적 대조군으로 사용하였다. (C) 플래그(Flag)-p47phox-발현 Raw264.7 세포(Raw264.7-Flag-p47phox)에 대조군인 SPG-SC(Scramble) 펩타이드 복합체와, SPG-SH3-1 펩타이드 복합체, SPG-SH3-2 펩타이드 복합체, 또는 SPG-SH3-1 및 SH3-2 펩타이드 복합체를 1시간 동안 전처리한 후, LPS(100 ng/㎖)로 30분 동안 자극을 주었다. 이후, 세포를 수확(harvest)하여 플래그(flag)에 대한 항체로 면역침강법(immunoprecipitation; IP)을 수행하고, p67phox, p40phox, p22phox, gp91phox 또는 플래그(Flag)에 대한 항체로 면역 블롯(IB)을 진행하였다. 액틴(actin)은 내재적 대조군으로 사용하였다. (D) Raw264.7 세포에 대조군인 SPG-SC(Scramble) 펩타이드 복합체와, SPG-SH3-1 펩타이드 복합체, SPG-SH3-2 펩타이드 복합체, 또는 SPG-SH3-1 및 SH3-2 펩타이드 복합체를 처리하고, LPS(100 ng/㎖)로 자극을 준 후, NOX(NADPH oxidase) 활성을 측정하여 나타내었다. (E) LPS(100 ng/㎖)로 4시간 동안 자극을 준, 플래그(Flag)-p47phox-발현 J774A.1 세포(LPS-primed J774A.1-Flag-p47phox) 에 대조군인 SPG-SC(Scramble) 펩타이드 복합체와, SPG-SH3-1 펩타이드 복합체, SPG-SH3-2 펩타이드 복합체, 또는 SPG-SH3-1 및 SH3-2 펩타이드 복합체를 처리하고 18시간 동안 DSS(Dextran Sulfate Sodium)로 자극을 주었다. 이후 배양 상층액을 수집(harvest)하고 효소면역측정법(ELISA)을 수행하여 사이토카인 분비량을 측정하여 나타내었다.
도 11은 본 발명의 일실시예에 따라 SPG/C-Src-SH3 펩타이드 복합체 처리에 따른 CLP(cecal ligation and puncture)-유도 다균성 패혈증(polymicrobial sepsis)의 치료 효과에 대한 결과를 나타낸 도이다. (A) 대조군인 SPG-SC(Scramble) 펩타이드, SPG-SH3-1 펩타이드, SPG-SH3-2 펩타이드, 또는 SPG-SH3-1 및 SH3-2 펩타이드와, 음성대조군으로서 PBS를 처리한 CLP 유도 동물 모델 구축을 위한 개략도이다(위). 마우스 당 10 ㎎/㎏의 투여량으로 SPG-SC(Scramble) 펩타이드, SPG-SH3-1 펩타이드, SPG-SH3-2 펩타이드, 또는 SPG-SH3-1 및 SH3-2 펩타이드와, 음성대조군으로서 PBS를 복강 주사한 CLP-유도 마우스의 생존율을 7일 동안 관찰하였으며, 그룹당 20마리의 마우스에 대해 사망률을 측정하였다(아래). 대조군(control)인 SPG-SC(Scramble) 펩타이드를 투여한 CLP-유도 마우스와 비교한 통계적 차이로 표시하였다(log-rank test). (B 내지 G) 비장세포에서의 NOX(NADPH oxidase) 활성(B, n=6), 혈청(serum) 사이토카인 수준(C, n=5), 대표적인 폐와 비장의 H&E 염색(D, n=5), 면역블롯(IB)을 위해 사용한 비장세포(E 및 F), 세균 수 측정(G, n=8)은 CLP-유도 마우스에 대조군인 SPG-SC(Scramble) 펩타이드, SPG-SH3-1 펩타이드, SPG-SH3-2 펩타이드, 또는 SPG-SH3-1 및 SH3-2 펩타이드와, 음성대조군으로서 PBS를 처리한 후 20시간째 측정하였다. (D) 그룹당 5마리의 마우스에서 CLP 유도 후 SPG-SC(Scramble) 펩타이드, SPG-SH3-1 펩타이드, SPG-SH3-2 펩타이드, 또는 SPG-SH3-1 및 SH3-2 펩타이드와, 음성대조군으로서 PBS를 처리하고 20시간에 수득한 폐(lung)와 비장(spleen)의 대표적인 H&E(Hematoxylin-eosin) 염색 결과(왼쪽)를 나타낸 것으로, 조직 병리학 점수는 폐 절편(section)의 H&E 염색 결과로부터 도출하였다(오른쪽). (E) 비장세포를 이용하여 면역블롯(IB)을 수행하고, 비장세포에서의 iNOS 및 COX-2의 발현 수준을 확인하여 나타내었다. 액틴(actin)은 내재적 대조군으로 사용하였다. (F) 비장세포를 수확(harvest)한 후, p47phox에 대한 항체로 면역침강법(immunoprecipitation; IP)을 수행한 후, p67phox, p40phox 또는 p47phox에 대한 항체로 면역 블롯(IB)을 진행하였다. 액틴(actin)은 내재적 대조군으로 사용하였다. (G) 혈액(왼쪽)과 복막액(가운데) 내의 세균(bacteria) 수를 측정하여 나타내었다. 또한, LB broth 플레이트 상의 E. coli DH5α에 대해SPG/C-Src-SH3 펩타이드 복합체의 직접적인 세균 사멸 효과를 측정하였으며, 살아남은 콜로니의 수를 계수하여 나타내었다(오른쪽).
도 12는 본 발명의 일실시예에 따라 SPG/C-Src-SH3 펩타이드 복합체 처리에 따른 DSS(dextran sodium sulfate)-유도 궤양성 대장염(ulcerative colitis)의 치료 효과에 대한 결과를 나타낸 도이다. (A) 대조군인 SPG-SC(Scramble) 펩타이드, SPG-SH3-1 펩타이드, SPG-SH3-2 펩타이드, 또는 SPG-SH3-1 및 SH3-2 펩타이드와, 음성대조군으로서 PBS를 처리한 5% DSS-유도 대장염 동물 모델 구축을 위한 개략도이다(위). 마우스 당 10 ㎎/㎏의 투여량으로 SPG-SC(Scramble) 펩타이드, SPG-SH3-1 펩타이드, SPG-SH3-2 펩타이드, 또는 SPG-SH3-1 및 SH3-2 펩타이드와, 음성대조군으로서 PBS를 복강 주사한 CLP-유도 마우스의 생존율을 25일 동안 관찰하였으며, 그룹당 20마리의 마우스에 대해 사망률을 측정하였다(아래). 대조군(control)인 SPG-SC(Scramble) 펩타이드를 투여한 DSS-유도 마우스와 비교한 통계적 차이로 표시하였다(log-rank test). (B) 대조군인 SPG-SC(Scramble) 펩타이드 또는 SPG-SH3-1 및 SH3-2 펩타이드 복합체를 처리한 DSS-유도 마우스(n=15)의 체중 변화를 측정하여 나타내었다. (C) 체중 감소, 대변 농도, 결장 출혈 등의 제안된 대장염 마우스(n=15) 동물 모델의 임상적 매개 변수를 그래프화하여 나타내었다. (D 내지 I) 결장 파쇄액(colon homogenates)에서의 NOX(NADPH oxidase) 활성(D, n=6), 사이토카인 수준(E, n=5), 결장 파쇄액(colon homogenates)에서의 MPO(myeloperoxidase) 활성(F, n=5), 대표적인 결장의 H&E 염색(G, n=5), 면역블롯(IB)을 위해 사용한 결장 파쇄액(colon homogenates)(H 및 I)은 DSS-유도 대장염 마우스에 대조군인 SPG-SC(Scramble) 펩타이드, SPG-SH3-1 펩타이드, SPG-SH3-2 펩타이드, 또는 SPG-SH3-1 및 SH3-2 펩타이드와, 음성대조군으로서 PBS(UN;untreated)를 처리한 후 6일째 측정하였다. (G) 그룹당 5마리의 마우스에서 DSS 유도 후 SPG-SC(Scramble) 펩타이드, SPG-SH3-1 펩타이드, SPG-SH3-2 펩타이드, 또는 SPG-SH3-1 및 SH3-2 펩타이드와, 음성대조군으로서 PBS를 처리하고 6일째에 수득한 결장(colon)의 대표적인 H&E(Hematoxylin-eosin) 염색 결과를 나타낸 것으로, 조직 병리학 점수는 결장 절편(section)의 H&E 염색 결과로부터 도출하였다. (H 및 I) 결장 파쇄액(colon homogenates)은 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid)으로 침전시켜 단백질을 농축시켰다. 이후, IL-1β, IL-18 및 카스파제-1(Caspase-1) 단백질의 발현 수준을 확인하기 위해 면역블롯(IB)을 수행하였으며(H), p47phox에 대한 항체로 면역침강법(immunoprecipitation; IP)을 수행한 후, p67phox, p40phox 또는 p47phox에 대한 항체로 면역 블롯(IB)을 진행하였다(I). 액틴(actin)은 내재적 대조군으로 사용하였다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 베타-1,3-글루칸(β-1,3-glucan)인 자이모산(Zymosan), 커들란 AL(Curdlan AL), 스클로글루칸(Scleroglucan), 라미나린(Laminarin)이 LPS로 유도된 대식세포(LPS-induced macrophage)에서 NOX(NADPH oxidase) 활성과 염증성 사이토카인(inflammatory cytokines)인 TNF-α, IL-6, IL-10 생성에 미치는 영향에 대한 결과를 나타낸 도이다. 다양한 농도(0, 1, 10 및 100 ㎍/㎖)의 베타-1,3-글루칸(β-1,3-glucan)인 자이모산(Zymosan), 커들란 AL(Curdlan AL), 스클로글루칸(Scleroglucan), 라미나린(Laminarin)을 BMDM(Bone Marrow-derived Macrophage)에 (A) 1시간 또는 (B) 18시간 동안 전처리한 후, 30분 동안 LPS(100 ng/㎖)로 자극을 주었다. (A) BMDM(Bone Marrow-derived Macrophage)의 NADPH oxidase(NOX) 활성은 상기 베타-1,3-글루칸(0, 1, 10, 100 ㎍/㎖) 존재 하에서 LPS로 자극하여 확인하였다. (B) 배양 상층액(supernatant)을 수집하고, ELISA assay(enzyme-linked immunosorbent assay)를 수행하여 사이토카인(cytokine) 생성 정도를 확인하였다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따라 p47phox가 C-Src와 상호작용(interaction)하고 NOX(NADPH oxidase) 조립(assembly)을 조절함에 대한 결과를 나타낸 도이다. (A) p47phox 복합체(p47phox complex)는 시조필란(Schizophyllan, SPG; 10 ㎍/㎖)을 1시간 동안 처리하고 LPS로 30분 동안 자극한, 플래그(Flag)-p47phox-발현(expressed) THP-1 세포로부터 정제되었다. 아가로스 비드(agarose bead)가 결합된 αFlag 항체를 이용하여 상기 p47phox 복합체(p47phox complex)의 면역침강법(immunoprecipitation; IP) 분석을 수행하고, 질량 분석법(Mass spectrometry analysis)을 통해 분석하였다. (B 및 C) 시조필란(Schizophyllan, SPG; 10 ㎍/㎖)을 전처리(pretreatment)한 THP-1 세포에 LPS(100 ng/㎖)를 처리하여 15 내지 30분 동안 자극을 주었다. 상기 세포를 수확(harvest)한 후, p47phox에 대한 면역침강법(immunoprecipitation; IP)을 수행하고, C-Src 및 p47phox의 인산화된 형태(S304, S345, S359 및 S370)(B) 또는 gp91phox, p22phox, p47phox 및 p67phox(C)는 면역 블롯(IB)을 수행하여 확인하였다. (D) 결합 맵핑(binding mapping)으로 p47phox 및 C-Src의 구조를 개략적으로 나타내었다(위). 293T 세포에 V5-C-Src 또는 이의 돌연변이체(ΔSH2-KD, ΔKD)와 함께, 대조군 벡터(control vector)인 플래그(flag)-p47phox 또는 47phox의 절단된(truncated) 돌연변이체(ΔSH3-PRR, ΔAIR-PRR, ΔPRR)를 공-형질주입(co-transfection) 시켰다. 상기 세포는 V5 또는 플래그(flag)에 대한 항체로 공-면역침강법(co-immunoprecipitation; co-IP)을 수행한 후, 플래그(flag) 또는 V5에 대한 항체로 면역 블롯(IB)을 진행하였다(아래, 왼쪽). 293T 세포에 AU1-p67phox 또는 AU1-p40phox와 함께, V5-C-Src의 양을 증가시키면서 플래그(flag)-p47phox를 공-형질주입(co-transfection) 시키고, 플래그(flag)에 대한 항체로 면역침강법(immunoprecipitation; IP)을 수행한 후, 플래그(Flag), AU1, V5에 대한 항체로 면역 블롯(IB)을 진행하였다(아래, 오른쪽). 액틴(actin)은 내재적 대조군으로 사용하였다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따라 C-Src가 p47phox와 상호작용하고 p67phox 및 p40phox와의 결합은 저해함에 대한 결과를 나타낸 도이다. (A) p47phox 및 C-Src 구조의 개략도를 나타내었다. (B) 293T 세포에 AU1-p67phox 또는 AU1-p40phox와 함께, V5-C-Src의 양을 증가시키면서 플래그(flag)-p47phox를 공-형질주입(co-transfection) 시키고, AU1에 대한 항체로 면역침강법(immunoprecipitation; IP)을 수행하였다. 이후, 플래그(Flag), AU1, V5에 대한 항체로 면역 블롯(IB)을 진행하였으며, 액틴(actin)은 내재적 대조군으로 사용하였다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따라 시조필란(Schizophyllan, SPG) 처리에 따른 전신성 패혈증(systemic sepsis) 및 대장염(colitis)의 예방 또는 치료 효과에 대한 결과를 나타낸 도이다. (A) 시조필란(SPG) 또는, 대조군으로서 비히클(Vehicle)을 처리한 CLP 유도 동물 모델 구축을 위한 개략도이다(위). 마우스 당 20 ㎎/㎏의 시조필란(SPG)을 경구 투여로 처리한 CLP-유도 마우스의 생존율을 7일 동안 모니터링 하였으며, 그룹당 10마리의 마우스에 대해 사망률을 측정하였다(아래). (B) 그룹당 5마리의 마우스에서 CLP 유도 후 18시간에 수득한 폐(lung)와 비장(spleen)의 대표적인 H&E(Hematoxylin-eosin) 염색 결과(왼쪽)를 나타낸 것으로, 조직 병리학 점수는 폐 절편(section)의 H&E 염색 결과로부터 도출하였다(오른쪽). (C) 시조필란(SPG) 또는, 대조군으로서 비히클(Vehicle)을 처리한 5% DSS-유도 대장염 동물 모델 구축을 위한 개략도이다(위). 시조필란(SPG) 또는 비히클(Vehicle)을 처리한 DSS-유도 마우스의 생존율을 25일 동안 모니터링 하였다. 대조군(control) 마우스와 비교한 통계적 차이로 표시하였다(log-rank test). (D) 시조필란(SPG) 또는 비히클(Vehicle)을 처리한 DSS-유도 마우스의 체중 변화를 나타내었다. (E) 체중 감소, 대변 농도, 결장 출혈 등의 제안된 대장염 동물 모델의 임상적 매개 변수를 그래프화하여 나타내었다. (F) 그룹당 5마리의 마우스에서 DSS 처리 후 6일째 수득한 결장(colon)의 대표적인 H&E(Hematoxylin-eosin) 염색 결과(왼쪽)를 나타낸 것으로, 조직 병리학 점수는 중간(middle) 및 말단(distal) 부위의 결장 절편(section)의 H&E 염색 결과로부터 도출하였다(오른쪽).
도 6은 본 발명의 일실시예에 따라 시조필란(Schizophyllan, SPG) 처리에 따른 전신성 패혈증(systemic sepsis) 및 대장염(colitis)의 예방 또는 치료 효과에 대한 결과를 나타낸 도이다. (A) 마우스 당 20 ㎎/㎏의 시조필란(SPG)을 경구 투여로 처리한 마우스 또는 대조군으로서 비히클(vehicle)을 처리한 마우스의 체중을 4주 동안 측정하여 나타내었다(왼쪽). 또한, 시조필란(SPG) 또는 대조군으로서 비히클(vehicle)을 처리하고 2주째 수득한 혈청(serum)에서 사이토카인 분비량을 측정하여 나타내었다(오른쪽). (B) 시조필란(SPG) 또는 대조군으로서 비히클(vehicle)을 처리한 CLP-유도 마우스의 비장(spleen)의 형태적 차이를 비교하여 나타내었다. 여기에서, UN은 아무것도 처리하지 않은 테스트 군이다. (C) 시조필란(SPG) 또는 비히클(Vehicle)을 처리한 DSS-유도 마우스의 생존율을 25일 동안 관찰한 결과(왼쪽)와 체중 변화(오른쪽)를 나타내었다. (D) 시조필란(SPG) 또는 대조군으로서 비히클(vehicle)을 처리한 DSS-유도 마우스의 결장(colon)의 형태적 차이(왼쪽) 및 길이 차이(오른쪽)를 나타내었다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따라 SPG와 결합된 펩타이드의 합성 결과를 나타낸 도이다. (A) C-Src, p67phox 및 p47phox의 서열 얼라인먼트(sequence alignment)를 나타낸 도로, 박스는 본 발명의 SH3-1 펩타이드와 SH3-2 펩타이드를 나타낸다. (B) SPG(Schizophyllan), SGP/SA(Schizophyllan/succinic anhydride), SGP/SA/NHS(Schizophyllan/succinic anhydride/1-Ethyl-3(3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide(EDC) 및 N-Hydroxyl succinimide(NHS)) 및 SPG/SA/NHS/SH3(Schizophyllan/succinic anhydride/1-Ethyl-3(3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide(EDC) 및 N-Hydroxyl succinimide(NHS)/SH3 peptide; 즉, SPG/C-Src-SH3 펩타이드 복합체)의 FR-IR 스펙트럼 결과를 나타내었다. (C) SPG(Schizophyllan), SGP/SA(Schizophyllan/succinic anhydride) 및 SPG/SA/NHS/SH3(Schizophyllan/succinic anhydride/1-Ethyl-3(3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide(EDC) 및 N-Hydroxyl succinimide(NHS)/SH3 peptide; 즉, SPG/C-Src-SH3 펩타이드 복합체)의 1H NMR 스펙트럼 결과를 나타내었다. (D) 펩타이드의 흡광도(absorbance) 스펙트럼을 나타내었다. 여기에서, std는 standard의 약어이며, SH3-1 펩타이드 또는 SH-2 펩타이드/SPG는, SPG와 결합된 SH3 펩타이드 복합체(SH3 peptide conjugated SPG)이며, SPG는 DMSO에 1 ㎎/㎖의 농도로 용해되어 있는 시조필란(Schizohpyllan)이다. (E) TAMRA로 표지된 TAMRA-C-Src-SH3 펩타이드에 대한 Raw264.7 세포의 면역형광(immunofluorescence) 현미경 사진을 나타내었다. Raw264.7 세포에서의 면역형광은 C-Src-SH3를 TAMRA로 표지함으로써 수행하였다. Raw264.7 세포에 SPG/TAMRA-C-Src-SH3 펩타이드 복합체(10 ㎍/㎖)를 1시간 동안 처리하고, SPG/TAMRA-C-Src-SH3 펩타이드 복합체의 섭식(intake) 결과를 나타내었다.
도 8은 본 발명의 일실시예에 따라 베타-1,3-글루칸(β-1,3-glucan)인 SPG(Schizohpyllan)와 SH3 펩타이드(peptide)를 연결하여 베타글루칸-펩타이드 복합체를 제조하는 과정을 모식적으로 나타낸 도이다. 구체적으로 무수물(anhydride)을 이용한 교차결합(cross linking) 방법에 의한 SPG와 기능성 펩타이드의 생물학적 결합에 대해 도식화하여 나타내었다.
도 9는 본 발명의 일실시예에 따라 SPG/C-Src-SH3 펩타이드 복합체가 TLR4-ROS 신호전달(signaling)을 차단함에 대한 결과를 나타낸 도이다. (A) 293T 세포에 AU1-p67phox(왼쪽) 또는 AU1-p40phox(오른쪽)와 함께, 12시간 동안 플래그(flag)-p47phox를 공-형질주입(co-transfection) 시키고, 농도별(1, 5, 10 ㎍/㎖)로 대조군인 SPG-SC(Scramble) 펩타이드 복합체와, SPG-SH3-1 펩타이드 복합체, SPG-SH3-2 펩타이드 복합체, 또는 SPG-SH3-1 및 SH3-2 펩타이드 복합체를 6시간 동안 처리하였다. 이후 플래그(flag)에 대한 항체로 면역침강법(immunoprecipitation; IP)을 수행한 후, 플래그(Flag), AU1에 대한 항체로 면역 블롯(IB)을 진행하였다. 액틴(actin)은 내재적 대조군으로 사용하였다. (B) 플래그(Flag)-p47phox-발현 THP-1 세포(THP-1-Flag-p47phox)에 대조군인 SPG-SC(Scramble) 펩타이드 복합체와, SPG-SH3-1 펩타이드 복합체, SPG-SH3-2 펩타이드 복합체, 또는 SPG-SH3-1 및 SH3-2 펩타이드 복합체를 1시간 동안 전처리한 후, LPS(100 ng/㎖)로 30분 동안 자극을 주었다. 이후, 세포를 수확(harvest)하여 플래그(flag)에 대한 항체로 면역침강법(immunoprecipitation; IP)을 수행하고, p67phox, p40phox, p22phox, gp91phox 또는 플래그(Flag)에 대한 항체로 면역 블롯(IB)을 진행하였다. 액틴(actin)은 내재적 대조군으로 사용하였다. (C) 플래그(Flag)-p47phox-발현 Raw264.7 세포(Raw264.7-Flag-p47phox)에 대조군인 SPG-SC(Scramble) 펩타이드 복합체와, SPG-SH3-1 펩타이드 복합체, SPG-SH3-2 펩타이드 복합체, 또는 SPG-SH3-1 및 SH3-2 펩타이드 복합체를 처리하고, LPS(100 ng/㎖)로 자극을 준 후, NOX(NADPH oxidase) 활성을 측정하여 나타내었다. (D) NF-κB 리포터 플라스미드(NF-κB reporter plasmid)와 표준화(normalization)를 위한 pRL-TK 레닐라 플라스미드(pRL-TK Renilla plasmid)를 플래그(Flag)-p47phox-발현 Raw264.7 세포(Raw264.7-Flag-p47phox)에 공-형질주입(co-transfection) 시켰다. 2일 후, 상기 세포에 대조군인 SPG-SC(Scramble) 펩타이드 복합체와, SPG-SH3-1 펩타이드 복합체, SPG-SH3-2 펩타이드 복합체, 또는 SPG-SH3-1 및 SH3-2 펩타이드 복합체를 처리하고, LPS로 자극을 준 후, 루시퍼라아제 어세이(luciferase assay)를 수행하여 NK-κB 활성을 측정하여 나타내었다. (E) 플래그(Flag)-p47phox-발현 Raw264.7 세포(Raw264.7-Flag-p47phox)에 대조군인 SPG-SC(Scramble) 펩타이드 복합체와, SPG-SH3-1 펩타이드 복합체, SPG-SH3-2 펩타이드 복합체, 또는 SPG-SH3-1 및 SH3-2 펩타이드 복합체를 1시간 동안 전처리한 후, 18시간 동안 LPS로 자극을 주었다. 이후 배양 상층액을 수집(harvest)하고 효소면역측정법(ELISA)을 수행하여 사이토카인 분비량을 측정하여 나타내었다.
도 10은 본 발명의 일실시예에 따라 SPG/C-Src-SH3 펩타이드 복합체가 TLR(Toll-like receptor) 및 NLRP3 염증조절복합체-매개-NOX 조립(NLRP3 inflammasome-mediated NOX assembly)과 ROS-매개 전-염증성 신호(ROS mediated pro-inflammatory signaling)를 강하게 억제함에 대한 결과를 나타낸 도이다. (A) Raw264.7과 THP-1 세포에 농도별(1, 5, 10 ㎍/㎖)로 SPG-SH3-1 펩타이드 복합체, SPG-SH3-2 펩타이드 복합체, 또는 SPG-SH3-1 및 SH3-2 펩타이드 복합체를 72시간 동안 처리하고 배양한 후, MTT assay를 수행하여 세포 생존율을 측정하여 나타내었다. (B) 293T 세포에 AU1-p67phox과 함께, 12시간 동안 플래그(flag)-p47phox를 공-형질주입(co-transfection) 시키고, 농도별(1, 5, 10 ㎍/㎖)로 대조군인 SPG-SC(Scramble) 펩타이드 복합체와, SPG-SH3-1 펩타이드 복합체, SPG-SH3-2 펩타이드 복합체, 또는 SPG-SH3-1 및 SH3-2 펩타이드 복합체를 6시간 동안 처리하였다. 이후 플래그(flag)에 대한 항체로 면역침강법(immunoprecipitation; IP)을 수행한 후, 플래그(Flag), AU1에 대한 항체로 면역 블롯(IB)을 진행하였다. 액틴(actin)은 내재적 대조군으로 사용하였다. (C) 플래그(Flag)-p47phox-발현 Raw264.7 세포(Raw264.7-Flag-p47phox)에 대조군인 SPG-SC(Scramble) 펩타이드 복합체와, SPG-SH3-1 펩타이드 복합체, SPG-SH3-2 펩타이드 복합체, 또는 SPG-SH3-1 및 SH3-2 펩타이드 복합체를 1시간 동안 전처리한 후, LPS(100 ng/㎖)로 30분 동안 자극을 주었다. 이후, 세포를 수확(harvest)하여 플래그(flag)에 대한 항체로 면역침강법(immunoprecipitation; IP)을 수행하고, p67phox, p40phox, p22phox, gp91phox 또는 플래그(Flag)에 대한 항체로 면역 블롯(IB)을 진행하였다. 액틴(actin)은 내재적 대조군으로 사용하였다. (D) Raw264.7 세포에 대조군인 SPG-SC(Scramble) 펩타이드 복합체와, SPG-SH3-1 펩타이드 복합체, SPG-SH3-2 펩타이드 복합체, 또는 SPG-SH3-1 및 SH3-2 펩타이드 복합체를 처리하고, LPS(100 ng/㎖)로 자극을 준 후, NOX(NADPH oxidase) 활성을 측정하여 나타내었다. (E) LPS(100 ng/㎖)로 4시간 동안 자극을 준, 플래그(Flag)-p47phox-발현 J774A.1 세포(LPS-primed J774A.1-Flag-p47phox) 에 대조군인 SPG-SC(Scramble) 펩타이드 복합체와, SPG-SH3-1 펩타이드 복합체, SPG-SH3-2 펩타이드 복합체, 또는 SPG-SH3-1 및 SH3-2 펩타이드 복합체를 처리하고 18시간 동안 DSS(Dextran Sulfate Sodium)로 자극을 주었다. 이후 배양 상층액을 수집(harvest)하고 효소면역측정법(ELISA)을 수행하여 사이토카인 분비량을 측정하여 나타내었다.
도 11은 본 발명의 일실시예에 따라 SPG/C-Src-SH3 펩타이드 복합체 처리에 따른 CLP(cecal ligation and puncture)-유도 다균성 패혈증(polymicrobial sepsis)의 치료 효과에 대한 결과를 나타낸 도이다. (A) 대조군인 SPG-SC(Scramble) 펩타이드, SPG-SH3-1 펩타이드, SPG-SH3-2 펩타이드, 또는 SPG-SH3-1 및 SH3-2 펩타이드와, 음성대조군으로서 PBS를 처리한 CLP 유도 동물 모델 구축을 위한 개략도이다(위). 마우스 당 10 ㎎/㎏의 투여량으로 SPG-SC(Scramble) 펩타이드, SPG-SH3-1 펩타이드, SPG-SH3-2 펩타이드, 또는 SPG-SH3-1 및 SH3-2 펩타이드와, 음성대조군으로서 PBS를 복강 주사한 CLP-유도 마우스의 생존율을 7일 동안 관찰하였으며, 그룹당 20마리의 마우스에 대해 사망률을 측정하였다(아래). 대조군(control)인 SPG-SC(Scramble) 펩타이드를 투여한 CLP-유도 마우스와 비교한 통계적 차이로 표시하였다(log-rank test). (B 내지 G) 비장세포에서의 NOX(NADPH oxidase) 활성(B, n=6), 혈청(serum) 사이토카인 수준(C, n=5), 대표적인 폐와 비장의 H&E 염색(D, n=5), 면역블롯(IB)을 위해 사용한 비장세포(E 및 F), 세균 수 측정(G, n=8)은 CLP-유도 마우스에 대조군인 SPG-SC(Scramble) 펩타이드, SPG-SH3-1 펩타이드, SPG-SH3-2 펩타이드, 또는 SPG-SH3-1 및 SH3-2 펩타이드와, 음성대조군으로서 PBS를 처리한 후 20시간째 측정하였다. (D) 그룹당 5마리의 마우스에서 CLP 유도 후 SPG-SC(Scramble) 펩타이드, SPG-SH3-1 펩타이드, SPG-SH3-2 펩타이드, 또는 SPG-SH3-1 및 SH3-2 펩타이드와, 음성대조군으로서 PBS를 처리하고 20시간에 수득한 폐(lung)와 비장(spleen)의 대표적인 H&E(Hematoxylin-eosin) 염색 결과(왼쪽)를 나타낸 것으로, 조직 병리학 점수는 폐 절편(section)의 H&E 염색 결과로부터 도출하였다(오른쪽). (E) 비장세포를 이용하여 면역블롯(IB)을 수행하고, 비장세포에서의 iNOS 및 COX-2의 발현 수준을 확인하여 나타내었다. 액틴(actin)은 내재적 대조군으로 사용하였다. (F) 비장세포를 수확(harvest)한 후, p47phox에 대한 항체로 면역침강법(immunoprecipitation; IP)을 수행한 후, p67phox, p40phox 또는 p47phox에 대한 항체로 면역 블롯(IB)을 진행하였다. 액틴(actin)은 내재적 대조군으로 사용하였다. (G) 혈액(왼쪽)과 복막액(가운데) 내의 세균(bacteria) 수를 측정하여 나타내었다. 또한, LB broth 플레이트 상의 E. coli DH5α에 대해SPG/C-Src-SH3 펩타이드 복합체의 직접적인 세균 사멸 효과를 측정하였으며, 살아남은 콜로니의 수를 계수하여 나타내었다(오른쪽).
도 12는 본 발명의 일실시예에 따라 SPG/C-Src-SH3 펩타이드 복합체 처리에 따른 DSS(dextran sodium sulfate)-유도 궤양성 대장염(ulcerative colitis)의 치료 효과에 대한 결과를 나타낸 도이다. (A) 대조군인 SPG-SC(Scramble) 펩타이드, SPG-SH3-1 펩타이드, SPG-SH3-2 펩타이드, 또는 SPG-SH3-1 및 SH3-2 펩타이드와, 음성대조군으로서 PBS를 처리한 5% DSS-유도 대장염 동물 모델 구축을 위한 개략도이다(위). 마우스 당 10 ㎎/㎏의 투여량으로 SPG-SC(Scramble) 펩타이드, SPG-SH3-1 펩타이드, SPG-SH3-2 펩타이드, 또는 SPG-SH3-1 및 SH3-2 펩타이드와, 음성대조군으로서 PBS를 복강 주사한 CLP-유도 마우스의 생존율을 25일 동안 관찰하였으며, 그룹당 20마리의 마우스에 대해 사망률을 측정하였다(아래). 대조군(control)인 SPG-SC(Scramble) 펩타이드를 투여한 DSS-유도 마우스와 비교한 통계적 차이로 표시하였다(log-rank test). (B) 대조군인 SPG-SC(Scramble) 펩타이드 또는 SPG-SH3-1 및 SH3-2 펩타이드 복합체를 처리한 DSS-유도 마우스(n=15)의 체중 변화를 측정하여 나타내었다. (C) 체중 감소, 대변 농도, 결장 출혈 등의 제안된 대장염 마우스(n=15) 동물 모델의 임상적 매개 변수를 그래프화하여 나타내었다. (D 내지 I) 결장 파쇄액(colon homogenates)에서의 NOX(NADPH oxidase) 활성(D, n=6), 사이토카인 수준(E, n=5), 결장 파쇄액(colon homogenates)에서의 MPO(myeloperoxidase) 활성(F, n=5), 대표적인 결장의 H&E 염색(G, n=5), 면역블롯(IB)을 위해 사용한 결장 파쇄액(colon homogenates)(H 및 I)은 DSS-유도 대장염 마우스에 대조군인 SPG-SC(Scramble) 펩타이드, SPG-SH3-1 펩타이드, SPG-SH3-2 펩타이드, 또는 SPG-SH3-1 및 SH3-2 펩타이드와, 음성대조군으로서 PBS(UN;untreated)를 처리한 후 6일째 측정하였다. (G) 그룹당 5마리의 마우스에서 DSS 유도 후 SPG-SC(Scramble) 펩타이드, SPG-SH3-1 펩타이드, SPG-SH3-2 펩타이드, 또는 SPG-SH3-1 및 SH3-2 펩타이드와, 음성대조군으로서 PBS를 처리하고 6일째에 수득한 결장(colon)의 대표적인 H&E(Hematoxylin-eosin) 염색 결과를 나타낸 것으로, 조직 병리학 점수는 결장 절편(section)의 H&E 염색 결과로부터 도출하였다. (H 및 I) 결장 파쇄액(colon homogenates)은 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid)으로 침전시켜 단백질을 농축시켰다. 이후, IL-1β, IL-18 및 카스파제-1(Caspase-1) 단백질의 발현 수준을 확인하기 위해 면역블롯(IB)을 수행하였으며(H), p47phox에 대한 항체로 면역침강법(immunoprecipitation; IP)을 수행한 후, p67phox, p40phox 또는 p47phox에 대한 항체로 면역 블롯(IB)을 진행하였다(I). 액틴(actin)은 내재적 대조군으로 사용하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
1: 실험 재료 준비 및 실험 방법
실시예
1-1: 세포 준비
마우스 대식세포 세포주(macrophage cell line)인 RAW264.7(ATCC TIB-71; American Type Culture Collection)와 HEK293T(ATCC-11268) 세포는 10% FBS(fetal bovine serum; invitrogen), 소디움 피루베이트(sodium pyruvate), 비필수 아미노산(NAA; nonessential amino acids), 페니실린 G(penicillin G, 100 IU/ml), 스트렙토마이신(streptomycin, 100ug/ml)이 포함한 DMEM 배지(invitrogen)를 이용하여 배양하였다. 인간 단핵세포주(human monocytic cell line)인 THP-1(ATCC TIB-202)세포는 10% FBS가 포함된 RPMI 1640-GlutaMAXTM 배지를 사용하여 배양하였다. 일시적 형질주입(transient transfection)은 제조사의 메뉴얼에 따라 리포펙타민® 3000(Lipofectamine® 3000; Invitrogen), 또는 인산칼슘(calcium phosphate)(Clontech)을 사용하여 시행했다. THP-1과 Raw264.7의 안정적(stable) 세포주(cell line)는 2 ㎍/㎖의 퓨로마이신(puromycin)으로 표준 선택 프로토콜(standard selection protocol)을 사용하여 생성하였다.
실시예
1-2: 시약 준비
LPS(Escherichia coli O111:B4), Zymosan(사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae)의 세포벽(cell wall) 제조), 알칼리제니스 페칼리스(Alcaligenes faecalis)로부터 얻은 커들란 AL(Curdlan AL), 스크레로티움 롤프시(Sclerotium rolfsii)로부터 얻은 스클로글루칸(Scleroglucan), 라미나리아 디지타타(Laminaria digitata)로부터 얻은 라미나린(Laminarin)은 Invivogen사로부터 구입하였으며, 치마버섯(Schizophyllum commune)으로부터 얻은 시조필란(Schizophyllan, SPG)은 큐젠바이오텍(QueGen Biotech)으로부터 제공받았다. 숙신산 무수물(Succinic anhydride), DMSO(dimethyl sulfoxide), EDC(1-Ethyl-3-(3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide) 및 NHS(N-Hydroxy succinimide)은 한국 씨그마 알드리치사(Sigma-Aldrich Korea)에서 구입하였다. 나노퓨어수(Nanopure water)와 25 mM의 MES(2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid buffer, pH 5.0)는 SPG(Schizophyllan)-SH3 펩타이드(peptide)를 합성하는데 사용하였다.
실시예
1-3: 플라스미드 구축(
plasmid
construction)
p47phox(표지(Flag)-p47phox)의 전체-길이(full-length)를 암호화(encoding)하는 플라스미드(plasmid)와 NF-κB 루시퍼라아제 리포터(NF-κB luciferase reporter) 플라스미드는 Jain A et al., Nature protocols., 7(3):445-452 (2012) 및 Rice TW et al., Critical care medicine., 38(8):1685-1694 (2010)에 설명되어 있다. p47phox(ΔSH3-PRR, ΔAIR-PRR, ΔPRR)의 다른 부위(region), p67phox, p40phox, c-C-src 및 c-C-src(ΔSH2-KD, ΔKD) 유전자를 암호화(encoding)하는 플라스미드는 cDNA PCR 증폭(amplification)과 pEF-IRES 내의 AflⅡ와 XbaI 사이트(site) 사이에서의 서브클로닝(subcloning)을 통해 제조되었다. 모든 포유류 세포(mammalian cell)에서 일시적(transient)이고 지속적(stable)으로 발현되는 구조(construct)는 pEF-IRES-Puro 발현 벡터(pEF-IRES-Puro expression vector)에서 유래 되었다. 모든 구조(construct)는 원래 시퀀스(sequence)와의 100% 상동성을 확인하기 위하여 ABI PRISM 377 자동 DNA 시퀀서(ABI PRISM 377 automatic DNA sequencer)를 사용하여 시퀀싱(squencing) 하였다.
실시예
1-4:
면역침강법과
면역
블롯
분석
면역침강법(immunoprecipitation)과 면역 블롯 분석법(immunoblot assay)은 Jain A et al., Nature protocols., 7(3):445-452 (2012) 및 Rice TW et al., Critical care medicine., 38(8):1685-1694 (2010)에 기재되어 있는 방법에 따라 수행하였다. 항체 결합(antibody binding)은 화학 발광계(chemiluminescence; ECL: Millipore)를 사용하여 가시화하고, Vilber사의 화학 발광 분석기(Vilber chemiluminescence analyzer, Fusion SL 3;Vilber Lourmat)로 검출하였다.
실시예
1-5:
펩타이드
(peptide) 준비
C-Src-SH3 펩타이드는 상업적으로 합성하였으며, 전임상(pre-clinical) 연구에서 비정상적인 반응을 피하기 위해 아세트산 염 형태(acetate salt form)로 정제 하였다(Peptron, Korea). 본 발명에서 사용한 펩타이드의 아미노산 서열(amino acid sequence)은 하기 표 1과 같다. 한편, C-Src-SH3 펩타이드는 필요에 따라 N 말단에 형광물질(Fluorophore) TAMRA를 표지하여 사용하였다.
펩타이드 (peptide) |
아미노산 서열
(amino acid sequence, from N to C) |
서열번호 |
Src-SH3-1 (aa 91-108) | ALYDYESRTETDLSFKKG | 1 |
Src-SH3-2 (aa 121-140) | WWLAHSLSTGQTGYIPSNYV | 2 |
Src-SH3-1-Scramble | ETRKESFYLKDSTAGYDL | 3 |
Src-SH3-2-Scramble | NGTHSSGVLQSLITYPWAWY | 4 |
실시예
1-6: 말단에 -
COOH기를
갖는
SPG
(
COOH
-terminated
SPG
) 합성
합성(synthesis)은 Hsu CC et.al., Biochemical pharmacology., 85(3):385-395 (2013)에 보고된 변형된(modified) 프로토콜(protocol)에 따라 수행하였다. SPG(5 ㎎, 0.011 mM)은 연속적으로 마일드(mild)하게 교반하면서 6시간 동안 DMSO에 용해시켰다. 숙신산 무수물 용액(succinic anhydride solution; DMSO 중 0.1 mM)을 SPG(Schizophyllan) 용액에 한 방울씩 떨어뜨렸다. 상기 용액 혼합물을 50℃에서 12시간 동안 교반한 다음, 혼합물을 투석(dialysis)막으로 옮겼다(MWCO: 6-8 kDa, Spectra/Por., USA). 투석은 3일 동안 탈이온수(Deionized(DI) water)를 이용하여 수행하였다. 최종적으로 혼합물은 동결 건조시켰으며, 남은 생성물은 스펀지와 같은(sponge-like) 섬유(fiber) 형태였다. 표면 상에 COOH와 C=O의 존재는 FT-IR과 1H-NMR 분광법(spectroscopies)에 의해 분석되었다.
실시예
1-7:
말단에
NHS를
갖는
SPG
(
NHS
-terminated
SPG
) 합성
카르복실기(carboxyl group) 말단 SPG(Schizophyllan)는 NHS 작용기(functional group)와 반응할 수 있다. SPG/SA(COOH-SPG, 5 ㎎)와 EDC(10 ㎎; 0.1 mM)은 5 ㎖의 DMSO에 용해시켰다. EDC 가교제(crosslinker)와 교차결합된 COOH-SPG를 활성화(activation) 시킨 후 NHS(10 ㎎; 0.2 mM)를 용액에 첨가하고, 상기 혼합물을 실온(room temperature)에서 24시간 동안 교반하였다. 이후, 생성된 혼합물을 3일 동안 투석 처리하고 동결 건조시켰다. 정제된 샘플은 점착성(sticky) 겔 형태가 되었다. 완전히 동결 건조된 SPG/SA/EDC는 FT-IR과 1H-NMR 분광법(spectroscopies)으로 다시 분석하였다.
실시예
1-8:
펩타이드와
결합된
SPG
(peptide conjugated
SPG
)의 합성
먼저, 각각의 펩타이드, Src-SH3-1 (aa 91-108) 및 Src-SH3-2 (aa 121-140) (4.5 ㎎)를 교반하면서 DMSO에 용해시켰다. SPG/SA (COOH-SPG, 5 ㎎)를 1 ㎖의 DMSO에 녹인 후, 4 ㎖의 MES 완충액(buffer)을 가하여 pH 6으로 조정하였다. 그 다음, EDC(20 ㎎)와 NHS(10 ㎎)를 상기 용액 혼합물에 첨가하고, 4℃에서 24시간 동안 교반하였다. 최종적으로 투석은 6시간마다 완충 용액 (buffer solution, 투석액(diaysate))을 정기적으로 교체하면서 3일 동안 탈이온수(Deionized(DI) water)를 이용하여 수행하였다. 이후, 반응 혼합물을 동결 건조시키고, 사용하기 전까지 -20 ℃에서 보관하였다.
실시예
1-9: 형광 표지된
펩타이드와
결합된
SPG
(fluorescence tagged peptide conjugated SPG)의 합성
SPG/SA(COOG-SPG, 5 ㎎)를 1 ㎖의 DMSO에 인 후, 4 ㎖의 MES 완충액(buffer)을 가하여 pH 6으로 조정하였다. 그 다음, EDC(10 ㎎)와 NHS(10 ㎎)를 상기 용액 혼합물에 첨가하여 1시간 동안 반응시켰다. 이후, 형광 표지된(fluorescently tagged) 펩타이드(1 ㎎)를 상기 혼합물에 첨가하고 4℃에서 12시간 동안 어두운 곳에 보관하였다. 다음으로, 싱기 반응 혼합물을 동결 건조시키고, 250 내지 450 nm 범위의 흡광도 스펙트럼 곡선(absorbance spectra curve)을 적분함에 따라 농도를 분석하였다.
실시예
1-10:
특징화
(characterization) 방법
생성물의 표면 작용기(functional group)는 FTIR(Fourier Transform IR; Perkin-Elmer Spectrim one)과 1H-NMR(Breker ARX 500 MHz spectrometer)로 분석하였다. SPF/펩타이드(peptide)의 특징은 표지된 펩타이드(tagged-peptide)의 SPG/펩타이드(peptide) 분액(aliquot) 200 ㎕에 대한 UV 흡광 스펙트럼(aabsorbance spectra)에 의해 측정되었다(Synergy Mix, Bioteck Inc.). 펩타이드의 흡광 스펙트럼을 각 샘플에 대해 통합하여 그 농도(250 내지 450 nm 사이의 곡선 아래 영역)를 계산하였다.
실시예
1-11:
NOX
(
NADPH
oxidase
) 활성(activity) 측정
세포 내 초과산화물(superoxide) 생성은 루시제닌(lucigenin; bis-N-methylacridinium nitrate)-ECL 방법으로 측정하였다(Wadia JS et.al., Nature medicine., 10(3):310-315, 2004; Jain A et.al., Nature protocols., 7(3):445-452, 2012).
실시예
1-12: 패혈증(sepsis)과 대장염(colitis) 마우스 동물 모델 구축
CLP(cecal ligation and puncture)로 유도된 패혈증 마우스 모델 및 DSS(dextran sodium sulfate)로 유도된 급성 대장염 마우스 모델은 6주령(6-week-old) C57BL/6 암컷 마우스(Samtako, Korea)를 사용하여 Opal SM et.al., Jama ., 309(11):1154-1162 (2013) 및 Hotchkiss RS et.al., Journal of immunology., 176(9):5471-5477 (2006)에 기재되어 있는 방법에 따라 준비하였다. 모든 동물 관련 절차는 한양대학교 동물 보호 기관과 사용 위원회에 의해 검토되고 승인되었다.
실시예
1-13: 임상 점수(clinical score) 및 조직학(histology)
대장염(colitis)의 임상 점수는 대장염 유발 기간 동안 체중(body weight), 직장(rectum) 당 잠재 출혈(occult blood) 및 총 출혈 손실과, 대변의 농도를 매일 측정하였다. 임상 점수는 처리 그룹에 대해 알지 못하는 2명의 숙련된 연구자에 의해 측정되었다(Huang L et.al., International immunopharmacology ., 28(1):444-449, 2015). 조직 절편(tissue section)의 면역조직화학검사(immunohistochemistry)를 위해 마우스의 비장(spleen), 폐(lung), 결장(colon)을 10 % 포르말린(formalin)으로 고정시키고 파라핀에 포매(embedding) 시켰다. 상기 파라핀 절편(paraffin section)을 4 ㎛ 두께로 절단하고 H&E(hematoxylin and eosin) 염색을 수행하였다. 조직 병리학 점수(histopathologic score)는 Osuchowski MF et.al., Journal of immunology., 177(3):1967-74 (2006) 및 Liu W et.al., Cell research., 25(6):691-706 (2015)에 기재되어 있는 기준에 따라 측정하였다.
실시예
1-14: 기타 실험(miscellaneous procedures)
항체(antibody), MTT 분석(MTT assay), 단백질 정제(protein purification), 질량 분석(Mass spectrometry), 루시퍼라아제 분석(Luciferase assay), 샌드위치 ELISA(sandwich ELISAs), 공초점 분석법(confocal analysis), ROS 측정, 세균 계수(bacteria count), MPO 분석(MPO assay) 등은 당업계에 알려져 있는 통상적인 방법에 따라 수행하였다.
실시예
1-15: 통계 분석(statistical analysis)
독립적인 실험(평균(means) ± 표준편차(SD))로부터 얻은 결과는 two-tailed Student's t-test를 사용하여 분석하였다. 차이(differences)는 p <0.05에서 유의한 것으로 간주되었다. 생존율(survival) 비교를 위해서는 log-rank(Mantel-Cox) 테스트를 사용하여 Kaplan-Meier 생존분석, 즉 누적한계추정법(product-limit method)에 따라 결과를 그래프화하고 분석하였다(Prism, version 5.0, GraphPad Software).
실시예
2: 실험 결과
실시예
2-1:
시조필란(schizophyllan, SPG)은
p47phox의
탈인산
화(dephosphorylation)를 통해 활성산소(Reactive oxygen species,
ROS
) 및 염증(inflammation) 생성을 강력하게 억제한다.
베타-글루칸(β-glucan)은 in vitro 및 in vivo 상에서 LPS-유도 염증 반응(LPS-induced inflammatory response)을 억제하는 것으로 알려져 있다(Cohen J., Nature., 420(6917):885-891, 2002; Balk RA., Critical care clinics., 16(2):179-192, 2000; Dombrovskiy VY. et.al., Critical care medicine., 35(5):1244-1250, 2007; Martin GS. et.al., The New England journal of medicine., 348(16):1546-1554, 2003). 그러나 대식세포(macrophage)에서 베타-글루칸(β-glucan)의 세포 내 조절 기작에 대해서는 알려진 바가 거의 없다. 활성산소(Reactive oxygen species, ROS) 및 염증(inflammation) 생성에 근거하여, LPS(Lipopolysaccharide)/TLR4(Toll-like receptor 4) 자극에 대해 가능성 있는 항-염증성 물질(anti-inflammatory agent)을 규명하기 위해, 본 발명자들은 먼저 여러 다른 출처에서 얻은 몇몇 베타-글루칸(β-glucan) 형태, 즉, 구체적으로 시조필란(schizophyllan, SPG), 자이모산(Zymosan), 커들란 AL(Curdlan AL), 스클로글루칸(Scleroglucan), 라미나린(Laminarin)이 NOX(NADPH oxidase) 활성과 염증성 사이토카인(inflammatory cytokines), TNF-α, IL-6, IL-10 생성을 억제하는지의 여부를 실험을 통해 확인하였다(도 1의 A, 도 1의 B 및 도 2).
그 결과, 치마버섯(Schizophyllum commune)의 수용성 베타-글루칸(β-glucan) 형태인 시조필란(Schizophyllan, SPG)이 LPS로 자극된 대식세포(LPS-stimulated macrophage)에서 NOX(NADPH oxidase) 활성, 활성산소(Reactive oxygen species, ROS) 및 염증(inflammation) 생성을 두드러지게 약화시킴을 확인하였다(도 1의 A 및 도 1의 B).
MAPK(Mitogen-activated protein kinase)/NF-κB 신호 전달(signaling)의 활성화는 LPS와 사이토카인 같은 전-염증성 자극(pro-inflammatory stimuli)에 대한 대식세포(macrophage)의 반응에서 필수적이다(Gay NJ. et.al., Annual review of biochemistry., 76:141-165, 2007). 따라서 본 발명자들은 LPS-처리된 세포(LPS-treated cell)에서 시조필란(Schizophyllan, SPG)이 MAPK/NK-κB 신호 캐스케이드(signaling cascades)에 영향을 미치는지 확인하였다.
그 결과, LPS-자극된 세포(LPS-stimulated cell)에 시조필란(Schizophyllan, SPG)을 전처리(pre-treatment) 함에 따라, 농도 의존적(dose-dependent)으로 p38 및 ERK1/2의 인산화(phosphorylation)가 하향 조절(down-regulation)됨을 확인하였으나, JNK/SAPK에는 영향을 미치지 않았다(도 1의 C). 또한, 시조필란(SPG)을 전처리한 BMDM(bone marrow derived macrophage)에서 농도 의존적으로 IκB-α의 분해 및 인산화가 유의하게 억제됨을 확인하였다. 이와 관련하여, 시조필란(SPG)을 처리한 BMDM에서는 LPS에 의해 유도되는 NF-κB 루시퍼라아제 프로모터 활성(LPS-induced NF-κB-luciferase promoter activity)과 NK-κB p65의 핵내 이동(nuclear translocation) 또한 현저하게 감소되었다(도 1의 D 및 도 1의 E).
NOX(NADPH oxidase) 활성과 활성산소(Reactive oxygen species, ROS) 생성은 NOX 서브유닛(subunit)의 발현(Lambeth JD., Nature reviews Immunology., 4(3):181-189, 2004)과, NOX의 p47phox 조절(regulatory) 서브유닛(subunit)의 C 말단 영역(C-terminal region; Ser-303 내지 Ser-379)에 위치한 몇몇의 세린(serine) 잔기의 인산화(phosphorylation)(Lambeth JD. et.al., Annual review of pathology., 9:119-145, 2014)를 동반하기 때문에, 본 발명자들은 LPS에 의해 유도된 NOX 발현(LPS-induced NOX expression)이 시조필란(SPG)에 의해 조절되는지 여부를 실험을 통해 확인하였다.
그 결과, 시조필란(SPG)을 다양한 농도(0, 1, 10, 100 ㎍/㎖)로 처리하여 배양한 대식세포(macrophage)에서 LPS에 의해 유도된 NOX 서브유닛(subunit)의 발현에는 유의한 차이가 없음을 확인하였으나(도 1의 F), p47phox S345, S359 및 S370의 인산화는 시조필란(SPG)의 전처리에 의해 완전히 저해됨을 확인하였다(도 1의 G). 따라서, 상기 결과들을 통해 치마버섯(Schizophyllum commune)의 수용성 베타-글루칸(β-glucan) 형태인 시조필란(Schizophyllan, SPG)이 LPS로 자극된 대식세포(LPS-stimulated macrophage)에서 p47phox 활성화 및 ROS-염증성 신호(ROS-inflammatory signaling)의 음성 조절(negative regulation)을 우선적으로 매개함을 알 수 있었다.
실시예
2-2:
p47phox는
대식세포에서 C-
Src와
상호작용(interaction)하고 NOX(NADPH oxidase) 조립(assembly)을 조절한다.
시조필란(schizophyllan, SPG)에 의해 조절되는 TLR4 신호전달(signaling)에서 p47phox의 역할을 규명하기 위해, 본 발명자들은 p47phox가 활성산소(Reactive oxygen species, ROS) 조절에 관여하는 분자와 상호작용하는지 여부를 실험을 통해 확인하였다. LPS로 자극된 세포(LPS-stimulated cell)에서 시조필란(SPG) 전처리에 의한 p47phox 복합체(p47phox complex)의 공면역침강법(co-immunoprecipitation; co-IP) 분석을 수행하였다. 또한, 정제된 p47phox 복합체는 질량 분석법(Mass spectrometry analysis)을 통해 분석을 수행하였으며, 그 결과 60-kDa 단백질인 C-Src가 p47phox와 관련되어 있음을 확인하였다(도 3의 A). 시조필란(SPG) 존재하에 LPS 자극시, p47phox S345, S359 및 S370의 탈인산화(dephosphorylation)가 일어나고, 이에 C-Src가 일시적(15 내지 30분)이기는 하나, 내인성 p47phox와 강력하게 상호작용함을 내인성(endogenous) 공면역침강법(co-immunoprecipitation; co-IP) 분석을 통해 확인하였다(도 3의 B). 흥미롭게도, 대식세포(macrophage)에서 C-Src와 결합한 후에 p47phox가 gp91phox, p22phox, p67phox 및 p40phox와의 상호작용이 현저하게 억제됨을 확인하였다(도 3의 B 및 도 3의 C). 상기 결과를 통해 C-Src가 p47phox-매개 NOX 복합체(p47phox-mediated NADPH oxidase complex) 조립(assembly)을 억제함으로써, 면역 조절자로서 작용할 수 있음을 알 수 있었다.
p47phox와 C-src의 다양한 절단된(truncated) 돌연변이체(mutant)(van der Vliet A., Free radical biology & medicine., 44(6):938-955 (2008); Yang CS. et.al., Journal of immunology., 182(6):3696-3705 (2009))를 이용한 보다 상세한 맵핑(mapping) 연구는 HEK 293T 세포에서 p47phox의 PX가 C-Src의 SH3와 상호작용하는데 필요함을 확인하였다(도 3의 D 및 도 4). C-Src의 양이 증가됨에 따라 HEK 293T 세포에서 p47phox와 p67phox 또는 p40phox의 상호작용을 감소시킴을 C-Src 구성체(construct)를 이용한 경쟁 분석법(competition assay)을 통해 확인하였다(도 3의 D 및 도 4).
상기 결과를 종합하면, p47phox의 PX 도메인(domain)과 SH3의 결합을 통해 C-Src가 ROS-매개 염증 반응(ROS-mediated inflammatory responses)에 필수적인 음성 조절자(negative regulator)로 작용하고, TLR4(Toll-like receptor 4) 신호전달(signaling)에 대한 다른 NOXs(NADPH oxidase complex)와 경쟁하는 C-Src의 능력(capacity)을 강화시키는 상기 p47phox의 PX 도메인(domain)과 SH3의 결합은 시조필란(schizophyllan, SPG)에 의해 조절됨을 알 수 있다.
실시예
2-3: 전신성 패혈증(systemic sepsis) 및 대장염(colitis) 마우스 동물 모델에서의 시조필란(schizophyllan, SPG)의 효과
시조필란(schizophyllan, SPG)이 다균성 복막염(polymicrobial peritonitis) 및 패혈증(sepsis)로 인한 패혈성 쇼크(septic shock)로부터 마우스 동물 모델에 대해 보호 효과를 나타내는지 확인하기 위하여, 본 발명자들은 통상적으로 치명적인 인간 다균성 감염-유발 전신성 염증 반응 증후군(human polymicrobial infection-induced systemic inflammatory response syndrome)과 유사한 CLP(cecal ligation and puncture) 마우스 동물 모델을 사용하였다(Yang CS. et.al., Cell host & microbe., 11(3):264-276, 2012). 먼저, in vivo 상에서 시조필란(SPG)의 세포독성을 측정하였다. 28일 동안 시조필란(SPG)과 대조군으로서 비히클(vehicle)을 경구 투여한 그룹 간의 체중(body weight) 감소와 전신성 염증(systemic inflammation)은 유의한 차이를 나타내지 않았다(도 6의 A). 다음으로, 마우스 동물 모델에서 CLP로 인한 사망률(mortality)에 대한 시조필란(SPG)의 보호 효과를 검증하였다. 주목할 만하게, 3주 동안 마우스 당 20 ㎎/㎏의 투여량으로 시조필란(SPG)을 경구 투여로 전처리(pre-treatment)한, CLP(cecal ligation and puncture) 유도 마우스의 경우, 70 %의 마우스가 CLP 유도로 인한 죽음으로부터 보호됨을 확인하였다. 즉, 시조필란(SPG)을 전처리한 CLP 유도 마우스의 사망률이 현저하게 감소함을 확인하였다(도 5의 A). 반면, 비히클(vehicle)을 처리한 대조군의 경우 CLP 유도 마우스의 생존률이 현저하게 감소함을 확인하였다.
또한, 사망률 결과와 일치하게, 대조군으로서 비히클(vehicle)이 처리된 CLP 유도 마우스의 비장(spleen) 및 폐(lung) 조직에 대해 H&E(Hematoxylin and Eosin) 염색을 수행해 본 결과, 폐포 벽(alveolar wall)이 두꺼워진 심각한 폐 염증(pulmonary inflammation) 및 간세포(세포질의 호산구 증가증(eosinophilia) 및 핵농축(pyknosis) 증가)와 비장세포(핵붕괴(karyorrhexis))의 괴사(necrosis)를 나타내었다. 그러나, 시조필란(SPG)을 처리한 CLP 유도 마우스에서는 상기와 같은 변화, 즉 심각한 폐 염증 및 간세포와 비장세포의 괴사를 유의하게 감소시켰다(도 5의 B, 왼쪽). 이러한 조직학적 매개 변수(histologic parameters)의 반정량적 점수(semiquantitative scoring)는 조직 내 염증 세포의 수와 분포 뿐만 아니라, 세(細)기관지(bronchiolar)의 상피 손상 및 회복(repair)의 증거와 같은 비-염증성(non-inflammatory) 변화까지 포함하여 측정되었다. CLP에 의해 유발된 비장 비대증(splenomegaly)에 있어서, 시조필란(SPG)을 처리한 CLP 유도 마우스의 패혈증의 중증도(severity)가 비히클(vehicle) 처리된 대조군 CLP 유도 마우스와 비교하여 현저하게 낮음을 확인하였다(도 5의 B, 오른쪽; 및 도 6). 상기 결과를 통해, CLP-유도 패혈증(CLP-induced sepsis)에서 시조필란(SPG)이 보호하는 역할을 함을 알 수 있었다.
아울러, 시조필란(schizophyllan, SPG)이 in vivo 상에서 DSS(dextran sodium sulfate)에 의해 유도되는 위장염증(gastrointestinal inflammation)을 저해할 수 있는지에 대한 추가적인 실험 결과를 확인하기 위해, DSS(dextran sodium sulfate)로 유도된 급성 대장염 마우스 모델을 사용하였다. DSS 모델은 인간의 궤양성 대장염(Ulcerative colitis, UC)과 연관된 많은 임상적 관찰을 재현(recpitulate)하는 것으로 나타났다(Yang CS. et.al., Cell host & microbe., 11(3):277-89, 2012; Deretic V. et.al., Scientific American., 298(5):74-81, 2008; Deretic V. et.al., Cell host & microbe., 5(6):527-549, 2009). 급성 대장염 마우스 모델 구축을 위해, 6일 동안 마우스에 3% 또는 5% DSS를 처리하고 25일 동안 생존율을 평가하였다. 이러한 조건에서, 시조필란(SPG)을 전처리한 DSS 유도 마우스는 대조군으로서 비히클(vehicle)을 처리한 DSS 유도 마우스에 비해 생존율이 현저하게 증가한 것으로 나타났다(도 5의 C 및 도 6의 C). 상기 생존율 결과와 일치하게, 시조필란(SPG)을 전처리한 DSS 유도 마우스는 위장관 질환(gastrointestinal disease)의 증진과 관련된 체중 감소 및 임상적 특징(대변 농도(consistnecy) 및 직장 출혈(rectal bleeding))에 있어, 비히클(vehicle)을 처리한 DSS 유도 대조군 마우스에 비해 유의한 감소를 보였으며, 결장(colon)의 길이 또한 상당히 증가한 것으로 나타났다(도 5의 D, 도 5의 E, 도 6의 C 및 도 6의 D). 이런 임상 평가는 대표적인 결장 절편(section)의 조직학적 검사로 확인하였다(Shibutani ST. et.al., Nature immunology., 16(10):1014-1024, 2015). 이러한 조직학적 매개 변수(histologic parameters)의 반정량적 점수(semiquantitative scoring)는 장세포 손실(enterocyte loss), 담즙(crypt) 염증, 고유판 단핵세포(lamina propria mononuclear cell)와 호중구의 침윤(infiltration), 상피 과증식(epithelial hyperplasia)과 같은 요소 등을 포함하여 측정되었다. 시조필란(SPG)을 처리한 DSS 유도 마우스의 대장염의 중증도(severity)가 비히클(vehicle) 처리된 대조군 DSS 유도 마우스와 비교하여 상당히 낮음을 확인하였다(도 5의 F). DSS 유도 마우스에서의 이러한 상기 표준 병리 검사 결과(standard pathological test)는 대장염(colitis)이 유발된 동안 일어나는 병리학적 변화가 시조필란(SPG)에 의해 크게 개선되었음을 나타내었다.
종합하면 상기 결과를 통해, 다균성 패혈증(polymicrobial sepsis) 및 급성 대장염(acute colitis)에서 시조필란(SPG)이 보호하는 역할을 함을 알 수 있었다. 즉, 시조필란(SPG)이 다균성 패혈증(polymicrobial sepsis) 및 급성 대장염(acute colitis)에 대한 예방 및 치료 효과가 있음을 알 수 있었다.
실시예
2-4:
SPG
/C-
Src
-SH3
펩타이드
복합체(
SPG
/C-
Src
-SH3 peptide complex)의 합성
베타-1,3-글루칸(β-1,3-glucan)인 시조필란(schizophyllan, SPG) 기반의 약물 전달 시스템(SPG-based drug delivery system)은 기능성 ODNs(oligodeoxynucleotides) 또는 siRNA(small interfering RNA)를 표적화된(targeted) 세포에 전달하도록 디자인되었다(Padkin A. et.al., Critical care medicine., 31(9):2332-2338, 2003; Vincent JL. et.al., Jama ., 274(8):639-644, 1995; Janeway CA. et.al., Annual review of immunology., 20:197-216, 2002). 따라서 본 발명자들은 시조필란(schizophyllan, SPG)을 포함하는 복합체(complex)의 형성물(formation)로서, p47phox와 C-Src의 상호작용을 억제하기 위해 p67phox와 p47phox의 보존된 잔기(conserved residue)를 포함하는 C-Src 서열의 SH3를 사용하였다(도 7의 A 및 표 1). SPG/C-Src-SH3 펩타이드 복합체는 상기 실시예 1-5 내지 실시예 1-10에서 기술한 대로 준비하였다(도 8). SPG와 펩타이드를 결합(conjugation)시키기 위해서는 일련의 교차결합(crosslinking) 과정이 필요하다. 숙신산 무수물(succinic anhydride, SA; DMSO에 용해되어 있는 형태)은 SPG 표면의 히드록시기(hydroxyl group)를 카복실산 그룹(carboxylic acid groups)으로 전환시켰다. 이후, FT-IR 분광법(Fourier Transform Infrared Spectroscopy)을 사용하여, 말단에 카복실산을 갖는 SPG(carboxylic acid terminated SPG)가 기존 SPG(naive SPG)에서는 존재하지 않는 ~1723 ㎝-1 에서 C=O 결합을 보임으로 확인하였다(도 7의 B). 또한, 1H-NMR(300 MHz, DMSOD6) 결과를 통해 SPG 표면의 카복실산의 존재를 검증하였는데, SPG에서 숙신산 무수물의 양성자(proton)에 대한 2.9 ppm에 해당되는 중요한 공명 신호를 증명하였다. 아울러, SPG/C-Src-SH3의 1H-NMR 스펙트럼은 SPG/c-Src-SH3 내 트립토판(Tryptophan, Trp; W)의 양성자에 대한 3.6 ppm과 6.9~7.5 ppm으로의 특징적인 이동을 보여주었다. 한편, 카복실산에 의해 기능화된(functionalized) SPG와 가교제(crosslinker)인 EDC/NHC의 교차결합(crosslinking)은 아미드 결합(amide bonds)을 형성시켰다(도 7의 C). 이후, FT-IR 분광법을 사용하여 분석한 결과, 1550 ㎝-1 에서 아미드 그룹(amide group)이 관찰되었다. 따라서, 펩타이드에 대한 결합 모티프(coupling motif)가 가교제(crosslinker)와 성공적 결합(conjugation)을 하였음을 입증하였다. 최종 산물, 즉, SPG/C-Src-SH3(SPG/SA/NHS/SH3)에 대해 FT-IR 분광법을 사용하여 분석한 결과, 최종 산물은 C=O, N-C=O 피크(peak) 뿐만 아니라, 결합된 펩타이드의 타이로신(Tyrosin, Try; Y) 및/또는 트립토판(Tryptophan, Trp; W)에서 방향족(aromatic) C=C 신축(stretch)에 관여하는 다른 피크의 존재 또한 확인하였다(도 7의 B). 또한, 자외-가시광 분광법(UV-Vis Spectroscopy) 분석을 통해서도 상기 최종 산물에 대한 혼합물(mixture)에서 펩타이드의 존재를 확인하였다(도 7의 D). 한편, 4~15%의 농도 구배 젤 전기영동(gradient native gel electrophoresis)을 수행하여 SPG가 결합된 펩타이드(SPG conjugated peptide)가 성공적인 결합(conjugation)을 하였음을 간접적으로 확인하였다. 더 나아가, SPG-SH3 펩타이드 복합체(SPG-SH3 peptide complexes)가 대식세포(macrophage)에 의해 섭식(intake) 되는지 확인하기 위해 면역형광(immunofluorescence)을 수행하였다. 그 결과, 도 7의 E에 나타난 바와 같이, Raw267.4 세포가 TAMRA-C-Src-SH3 펩타이드 단독에 비해 SPG/TAMRA-C-Src-SH3 펩타이드 복합체를 더 효과적으로 섭식(intake)함을 확인하였다. 따라서 상기 결과를 통해, 시조필란(schizophyllan, SPG)이 대식세포에 C-Src-SH3 펩타이드의 세포 내 전달에 중요한 역할을 함을 알 수 있었다.
실시예
2-5:
SPG
/C-
Src
-SH3
펩타이드
복합체는
NOX
(
NADPH
oxidase
)-매개 신호전달(NOX-mediated signaling)에 부정적인 영향(negative effect)을 미친다.
시조필란(schizophyllan, SPG)-SH3 펩타이드(peptide)가 약리학적 및 생물학적 프로파일(profile)에 미치는 영향을 더 구체적으로 규명하고자 하였다. 이에, 먼저 세포의 생장 저해에서 오는 저해 효과의 가능성을 배제하기 위해 펩타이드의 세포독성을 측정하였다. 다양한 농도(1, 5, 10 ㎍/㎖)의 펩타이드를 처리하고 배양한 Raw 264.7 세포와 THP-1 세포의 세포독성을 측정한 결과, 펩타이드에 의한 세포 생장에 있어 유의한 차이를 보이지 않았으며, 이에 펩타이드에 의한 세포독성을 나타내지 않음을 확인하였다(도 10의 A). 다음으로, SH3-펩타이드가 NOX(NADPH oxidase) 조립(assembly)에 있어 영향을 미치는지 그 가능성을 실험을 통해 확인하였다. HEK 293T 세포에 SPG-SH3-1 펩타이드 복합체, SPG-SH3-2 펩타이드 복합체, SPG-SH3-1 및 SH3-2 펩타이드 복합체를 처리하고 6시간 동안 배양하는 동안 p47phox-p67phox 또는 p40phox 간의 상호작용이 효과적으로 차단됨을 확인하였다. 반면, 대조군으로서 사용한 SPG-SC(Scramble) 펩타이드 복합체와 SPG 단독 처리에 의해서는 p47phox-p67phox 또는 p40phox 간의 상호작용이 차단되지 않았다(도 9의 A). 특히, SPG와 결합되지 않은, SH3 펩타이드 단독 처리에 의해서도 p47phox-p67phox 또는 p40phox 간의 상호작용이 차단되지 않음을 확인하였으며, 이에, SPG 결합 없이는 C-Src-SH3 펩타이드의 세포 내 전달이 비효율적임을 알 수 있었다(도 10의 B).
미생물 감염(microbial infection) 또는 TLR(Toll-like receptor) 활성화(activation)에 따라, NOX(NADPH oxidase) 서브유닛(subunit)은 주기적으로 면역세포(예컨대, 대식세포와 단핵구) 및 비-면역세포(예컨대, 내피세포와 상피세포)와 상호작용하고 상기 세포들을 활성화 시켜 이들로부터 활성산소(Reactive oxygen species, ROS) 및 염증성 사이토카인(inflammatory cytokines)의 생성을 촉진시킨다(van der Vliet A. et.al., Free radical biology & medicine., 44(6):938-955, 2008). 이에, 본 발명의 SPG-SH3 펩타이드 복합체가 TLR4-ROS 신호전달(signaling)을 차단하는지 확인하고자, 먼저 THP-1-Flag-p47phox 세포와 Raw264.7-Flag-p47phox 세포에 대조군인 SPG-SC(Scramble) 펩타이드 복합체와, SPG-SH3-1 펩타이드 복합체, SPG-SH3-2 펩타이드 복합체, 또는 SPG-SH3-1 및 SH3-2 펩타이드 복합체를 1시간 동안 다양한 농도(1, 5, 10 ㎍/㎖)로 전처리하고, 30분 동안 LPS/TLR4로 자극을 주었다. 이후, 플래그(Flag)-p47phox 복합체에 대한 면역침강법(immunoprecipitation; IP)을 수행하고, p67phox, p40phox, p22phox, gp91phox에 대한 다양한 항체로 면역 블롯(IB)을 수행하였다. 그 결과, SPG-SH3 펩타이드를 처리한 경우에는 p47phox-매개-NOX(p47phox-mediated NADPH oxidase) 상호작용 및 NOX 조립(assembly)이 현저하게 억제되었다. 이에 반해, 대조군으로서 사용한 SPG-SC(Scramble) 펩타이드 복합체에 의해서는 p47phox-매개-NOX 상호작용 및 NOX 조립(assembly)억제되지 않았다(도 9의 B 및 도 10의 C). 또한, SPG-SH3 펩타이드를 처리한 경우, 벡터(vector) 또는 p47phox를 발현하는 세포에서 LPS에 의해 유도된 초과산화물 음이온(superoxide anion) 생성, NOX 활성 및 NF-κ 루시퍼라아제(NF-κB-luciferase) 프로모터 활성이 농도 의존적으로 현저히 억제됨을 확인하였다(도 9의 C, 9의 D 및 도 10의 D). NOX 신호전달(NADPH oxidase signaling)은 전-염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)의 발현을 조절하는 것으로 알려져 있다(Gay NJ. et.al., Annual review of biochemistry., 76:141-165, 2007; van der Vliet A. et.al., Free radical biology & medicine., 44(6):938-955, 2008). 이에, 본 발명의 SPG-SH3 펩타이드 복합체가 전-염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)의 발현을 조절하는지 확인하고자, Raw 264.7 세포 또는 J744A.1 세포에 대조군인 SPG-SC(Scramble) 펩타이드 복합체와, SPG-SH3-1 펩타이드 복합체, SPG-SH3-2 펩타이드 복합체, 또는 SPG-SH3-1 및 SH3-2 펩타이드 복합체를 다양한 농도(1, 5, 10 ㎍/㎖)로 처리하고, LPS/TLR4 또는 NLRP3 염증조절복합체(nucleotide-binding domain, leucine-rich repeats containing family, pyrin domain-containing-3 inflammasome) 유도제(inducer)를 처리하여 자극을 주었다. 이후, 상층액(supernatant)을 수집하여 사이토카인의 발현량을 분석하였다. 그 결과, 대조군으로 사용한 SPG-SC(Scramble) 펩타이드를 처리한 경우와 비교하여 SPG-SH3 펩타이드를 처리한 경우, TNF-α, IL-6, IL-1β, IL-18과 같은 전-염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)의 생성이 상당히 저해됨을 확인하였다(도 9의 E 및 도 10의 E). 상기 결과를 통해, SPG/C-Src-SH3 펩타이드 복합체가 TLR4 및 NLRP3 염증조절복합체(NLRP3 inflammasome)에 의해 유도되는 ROS-매개 전-염증성 신호(ROS mediated pro-inflammatory signaling)를 특이적으로 조절하는데 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
실시예
2-6: 전신성 패혈증(systemic sepsis) 마우스 동물 모델에서의 SPG/C-Src-SH3 펩타이드 복합체의 치료 효과
본 발명의 SPG/C-Src-SH3 펩타이드 복합체가 CLP(cecal ligation and puncture)-유도 다균성 패혈증(polymicrobial sepsis) 마우스 동물 모델에 대해 보호 효과를 나타내는지 확인하기 위하여, 먼저, 마우스 동물 모델에서 CLP로 인한 사망률(mortality)에 대한 SPG/C-Src-SH3 펩타이드 복합체의 치료 효과를 검증하였다. 구체적으로, CLP-유도 마우스에 마우스 당 10 ㎎/㎏의 투여량으로 SPG/C-Src-SH3-1 펩타이드, SPG/C-Src-SH3-2 펩타이드, 또는 SPG/C-Src-SH3-1 및 SH3-2 펩타이드를 3, 6, 12시간에 3번 복강 내 주사(intraperitoneal injection) 한 후, CLP-유도 마우스의 생존율을 확인하였다. 그 결과, SPG-SH3-1 펩타이드 또는 SPG-SH3-2 펩타이드를 복강 투여한 CLP-유도 마우스의 경우, 40 %의 마우스가 CLP 유도로 인한 죽음으로부터 보호됨을 확인하였다. 특히, 마우스 당 10 ㎎/㎏의 투여량으로 SPG/C-Src-SH3-1 및 SH3-2 펩타이드를 복강 투여한 CLP-유도 마우스의 경우, 80 %의 마우스가 CLP 유도로 인한 죽음으로부터 보호됨을 확인하였다. 즉, SPG/C-Src-SH3 펩타이드 복합체를 처리한 CLP 유도 마우스의 사망률이 현저하게 감소함을 확인하였다(도 11의 A). 또한, 사망률 결과와 일치하게, 대조군으로 비히클(vehicle)을 처리한 CLP 유도 마우스와 비교하여 SPG/C-Src-SH3 펩타이드 복합체를 처리한 CLP 유도 마우스의 비장(spleen)에서 NOX 활성과, 혈청(serum)에서의 TNF-α, IL-6, IL-1β, IL-18과 같은 전-염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokines)의 농도가 현저히 감소함을 확인하였다. 그러나, IL-10과 IL-4의 농도는 SPG/C-Src-SH3 펩타이드 복합체를 처리한 CLP 유도 마우스 그룹과 대조군으로서 비히클(vehicle)을 처리한 CLP 유도 마우스 그룹 간에 유의한 차이를 나타내지는 않았다(도 11의 B및 도 11의 C). SPG/C-Src-SH3 펩타이드 복합체를 처리한 CLP 유도 마우스와 대조군으로서 비히클(vehicle)을 처리한 CLP 유도 마우스의 비장(spleen) 및 폐(lung) 조직에 대해 H&E(Hematoxylin and Eosin) 염색을 수행하고, 이를 기반으로 조직학적 매개 변수(histologic parameters)의 반정량적 점수(semiquantitative scoring)를 측정하였다. 그 결과, 비히클(vehicle)을 처리한 대조군 CLP 유도 마우스와 비교하여 SPG/C-Src-SH3 펩타이드 복합체를 처리한 CLP 유도 마우스의 경우, 면역세포(immune cells)의 침투(infiltration)가 감소하고, 비장 및 폐 조직의 손상이 감소하였으며, 비장에서 iNOS 및 COX-2 단백질이 낮은 수준으로 발현함을 확인하였다(도 11의 D 및 도 11의 E).
다음으로, 본 발명자들은 SPG/C-Src-SH3 펩타이드 복합체가 in vivo 상에서 약리학적 활성을 가지는지 그 여부를 실험을 통해 확인하였다. 치명적인 염증성 질환을 치료하기 위한 치료제를 탐색하는 데 있어, 신규 펩타이드를 평가할 때 NOX 단백질 결합 프로파일(NOX protein binding profile)과 활성을 in vivo 상에서 탐지하는 것이 중요하다. 도 9의 B, 도 10의 C 및 도 11의 B에 나타낸 in vitro 및 in vivo 결과와 일치하게, SPG/C-Src-SH3 펩타이드 복합체를 처리한 CLP 유도 마우스의 비장에서 NOX 단백질 결합 프로파일(NOX protein binding profile) 및 활성을 확인해 본 결과, 비장세포(splenocytes)에서 단백질의 발현 정도에는 영향을 미치지 않았으나, SPG/C-Src-SH3 펩타이드 처리에 의해 p47phox와 p67phox 또는 p40phox의 결합이 현저히 감소됨을 확인하였다(도 11의 F). 한편, CLP에 의해 유발된 치사율은 말초 혈액(peripheral blood) 및 복막액(peritoneal fluid)에서 세균 콜로니 형성 수(bacterial colony forming units(CFU))와 양성적으로 관련되어 있기 때문에(Matsunaga K. et.al., Nature cell biology., 11(4):385-96, 2009), 본 발명의 SPG/C-Src-SH3 펩타이드가 세균 제거 또한 향상시키는지 확인하였다. CLP-유도 마우스에 SPG/C-Src-SH3 펩타이드를 처리한 결과, 말초 혈액(peripheral blood) 및 복막액(peritoneal fluid)에서 세균 콜로니 형성 수(bacterial colony forming units(CFU))가 현저히 감소함을 확인하였다. 특히, 대조군인 SPG-SC(Scramble) 펩타이드를 처리한 경우에는 세균(bacteria)에 대한 사멸 효과가 관찰되지 않았으나, SPG/C-Src-SH3 펩타이드를 처리한 경우에는 직접적인 세균 사멸효과가 관찰되었다(도 11의 G).
따라서, 상기 결과를 통해, SPG/C-Src-SH3 펩타이드 복합체가 CLP에 의해 유발된 패혈증을 완화시키는 치료 효과가 있음을 확인하였으며, 이에, 본 발명의 SPG/C-Src-SH3 펩타이드 복합체를 패혈증과 같은 난치성 염증 질환 치료제로 유용하게 이용할 수 있음을 유추할 수 있다.
실시예
2-7:
대장염(colitis) 마우스 동물 모델에서의
SPG
/C-
Src
-SH3
펩타이
드 복합체의 치료 효과
본 발명의 SPG/C-Src-SH3 펩타이드 복합체가 DSS(dextran sodium sulfate)-유도 급성 대장염(acute colitis) 마우스 동물 모델에 대해 보호 효과를 나타내는지 확인하기 위하여, 먼저, 마우스 동물 모델에서 DSS에 급성 대장염으로 인한 사망률(mortality)에 대한 SPG/C-Src-SH3 펩타이드 복합체의 치료 효과를 검증하였다. 구체적으로, DSS-유도 마우스에 마우스 당 10 ㎎/㎏의 투여량으로 SPG/C-Src-SH3-1 펩타이드, SPG/C-Src-SH3-2 펩타이드, 또는 SPG/C-Src-SH3-1 및 SH3-2 펩타이드를 5번 복강 내 주사(intraperitoneal injection) 한 후, DSS-유도 마우스의 생존율을 확인하였다. 그 결과, SPG/C-Src-SH3-1 및 SH3-2 펩타이드 복합체를 복강 투여한 CLP-유도 마우스의 경우, 65 %의 마우스가 CLP 유도로 인한 죽음으로부터 보호됨을 확인하였다. 즉, SPG/C-Src-SH3 펩타이드 복합체를 처리한 DSS 유도 마우스의 사망률이 현저하게 감소함을 확인하였다(도 12의 A). 또한, 사망률 결과와 일치하게, 대조군으로 사용한 SPG-SC(Scramble) 펩타이드를 처리한 경우와 비교하여SPG/C-Src-SH3-1 및 SH3-2 펩타이드 복합체를 처리한 DSS 유도 마우스는 위장관 질환(gastrointestinal disease)의 증진과 관련된 체중 감소 및 임상적 특징(대변 농도(consistnecy) 및 직장 출혈(rectal bleeding))과, NOX 활성, 결장 파쇄액(colon homogenates)에서 TNF-α, IL-6, IL-1β, IL-18과 같은 전-염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokines)의 농도, 및 MPO(myeloperoxidase) 활성이 두드러지게 감소함을 확인하였다(도 12의 B 내지 도 12의 F). SPG/C-Src-SH3 펩타이드 복합체를 처리한 CLP 유도 마우스와 대조군으로서 SPG-SC(Scramble) 펩타이드를 처리한 DSS 유도 마우스의 결장(colon) 조직에 대해 H&E(Hematoxylin and Eosin) 염색을 수행하고, 이를 기반으로 조직학적 매개 변수(histologic parameters)의 반정량적 점수(semiquantitative scoring)를 측정하였다. 그 결과, SPG-SC(Scramble) 펩타이드를 처리한 대조군 DSS 유도 마우스와 비교하여 SPG/C-Src-SH3 펩타이드 복합체를 처리한 DSS 유도 마우스의 경우, 대장염의 중증도(severity)가 감소하였으며, 결장에서 IL-1β, IL-18 및 카스파제-1(Caspase-1) 단백질이 낮은 수준으로 발현함을 확인하였다(도 12의 G 및 도 12의 H).
다음으로, 본 발명자들은 SPG/C-Src-SH3 펩타이드 복합체가 in vivo 상에서 약리학적 활성을 가지는지 그 여부를 실험을 통해 확인하였다. 신규 펩타이드를 평가할 때 NOX 단백질 결합 프로파일(NOX protein binding profile)과 활성을 in vivo 상에서 탐지하는 것은 치명적인 염증성 질환을 치료하기 위한 치료제를 탐색하는 데 있어 중요하다. 도 12의 D에 나타낸 in vivo 결과와 일치하게, SPG/C-Src-SH3 펩타이드 복합체를 처리한 DSS 유도 마우스의 결장(colon)에서 NOX 단백질 결합 프로파일(NOX protein binding profile) 및 활성을 확인해 본 결과, 결장에서 단백질의 발현 정도에는 영향을 미치지 않았으나, SPG/C-Src-SH3 펩타이드 처리에 의해 p47phox와 p67phox 또는 p40phox의 결합이 현저히 감소됨을 확인하였다(도 12의 I).
따라서, 상기 결과를 통해, SPG/C-Src-SH3 펩타이드 복합체가 DSS에 의해 유도된 대장염을 완화시키는 치료 효과가 있음을 확인하였으며, 이에, 본 발명의 SPG/C-Src-SH3 펩타이드 복합체를 대장염과 같은 염증 질환 치료제로 유용하게 이용할 수 있음을 유추할 수 있다.
<110> Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University ERICA Campus
<120> Betaglucan-peptide complexes, preparation method thereof, and
pharmaceutical composition for use in preventing or treating
inflammatory diseases containing the same as an active ingredient
<130> P16U22D0509
<150> KR 10-2016-0009128
<151> 2016-01-26
<160> 4
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Src-SH3-1 (aa 91-108)
<400> 1
Ala Leu Tyr Asp Tyr Glu Ser Arg Thr Glu Thr Asp Leu Ser Phe Lys
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 2
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Src-SH3-2 (aa 121-140)
<400> 2
Trp Trp Leu Ala His Ser Leu Ser Thr Gly Gln Thr Gly Tyr Ile Pro
1 5 10 15
Ser Asn Tyr Val
20
<210> 3
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 3
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1 5 10 15
Asp Leu
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Src-SH3-2-Scramble
<400> 4
Asn Gly Thr His Ser Ser Gly Val Leu Gln Ser Leu Ile Thr Tyr Pro
1 5 10 15
Trp Ala Trp Tyr
20
Claims (13)
- (ⅰ) 시조필란(schizophyllan, SPG) 및
(ⅱ) 상기 시조필란의 말단에 도입된 카르복실기(-COOH기)와 아미드 결합(amide bond)되어 있는 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 포함하는,
염증성 질환 예방 또는 치료용 베타글루칸-펩타이드 복합체.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항의 따른 베타글루칸-펩타이드 복합체를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제5항에 있어서, 상기 베타글루칸-펩타이드 복합체는 p47phox를 표적으로 하여, 활성산소(ROS) 생성 및 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-6, IL-1β 또는 IL-18의 생성을 억제하는 것인 약학적 조성물.
- 제5항에 있어서, 상기 염증성 질환은 패혈증(sepsis), 패혈성 쇼크, 염증성 장질환(Inflammatory bowel disease, IBD), 복막염, 신장염, 급성 기관지염, 만성 기관지염, 골관절염, 장질환 척추염, 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 급성 폐손상(acute lung injury) 및 기관지 폐 형성장애(broncho-pulmonary dysplasia)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것인 약학적 조성물.
- 제7항에 있어서, 상기 염증성 장질환(IBD)은 궤양성 대장염(Ulcerative colitis, UC) 또는 크론씨병(Crohns disease)인 약학적 조성물.
- (a) 시조필란(schizophyllan, SPG)을 용해시키고, 고리형 무수물(cyclic anhydride)을 첨가하여 시조필란의 히드록시기를 카르복실기로 변환시켜, 시조필란 말단에 카르복실기(-COOH기)를 도입하는 단계; 및
(b) 단계 (a)의 시조필란의 카르복실기(-COOH기)와 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드의 아민기를 결합시켜, 베타글루칸-펩타이드 복합체를 형성하는 단계;를 포함하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 베타글루칸-펩타이드 복합체의 제조방법.
- 삭제
- 제9항에 있어서, 단계 (a)의 시조필란은 다이메틸설폭사이드(DMSO), 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 다이클로로메탄, 피리딘, N,N-다이메틸포름아미드(DMF), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 및 이들의 혼합용매로 구성된 군으로부터 선택되는 유기용매에 용해되는 것을 특징으로 하는, 베타글루칸-펩타이드 복합체의 제조방법.
- 제9항에 있어서, 단계 (a)의 고리형 무수물은 숙신산 무수물, 말레산 무수물 또는 글루타르산 무수물인, 베타글루칸-펩타이드 복합체의 제조방법.
- 제9항에 있어서, 상기 단계 (b)는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(EDC; 1-Ethyl-3-(3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide) 및 N-하이드록시숙신이미드(NHS; N-Hydroxy succinimide) 사이의 반응에 의해 수행되는 것인, 베타글루칸-펩타이드 복합체의 제조방법.
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