ES2871783T3

ES2871783T3 - Compuestos para el tratamiento de trastornos del metabolismo de las lipoproteínas

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Publication number: ES2871783T3
Application number: ES17776978T
Authority: ES
Inventors: Camilla Gustafsen; Søndergaard Madsen; Glerup Pedersen
Original assignee: Aarhus Universitet
Current assignee: Aarhus Universitet
Priority date: 2016-09-20
Filing date: 2017-09-20
Publication date: 2021-11-02
Anticipated expiration: 2037-09-20
Also published as: JP2019529402A; AU2017329799A1; WO2018054959A1; EP3515455A1; DK3515455T3; JP7046381B2; US20220054530A1; CA3035875A1; US20190275074A1; US11173177B2; EP3515455B1; CN110494145A

Abstract

Una composición que comprende un compuesto que tiene la estructura general de la fórmula (I): **(Ver fórmula)** o una sal, solvato, polimorfo o tautómero farmacéuticamente aceptable del mismo, donde: -R1 comprende un grupo con una fórmula seleccionada de entre: a) la fórmula (XI): **(Ver fórmula)** o b) la fórmula (II): **(Ver fórmula)** donde: X es SO2 m es un número entero independientemente igual o mayor que 1; - cada R2 se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste en -OSO3-, -OH, -NH2, -NHSO3-, - NHOCH3 y -OPO3 2-; - cada R3 se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste en -OSO3-, -OH y - OPO32-; - cada R4 se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste en -OSO3- , -OH, -OPO32- y -H; - cada R5 se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste en -CH2OSO3-, -CH2OH, -COO- y - CH2OPO32-; - n es un número entero entre 3 y 10; para su uso en el tratamiento de un trastorno del metabolismo de las lipoproteínas en un sujeto, donde dicho trastorno del metabolismo de las lipoproteínas se selecciona de entre el grupo que consiste en diabetes, obesidad, síndrome metabólico, xantoma, hipercolesterolemia, hipercolesterolemia familiar, dislipidemia, hipertrigliceridemia, hiperlipidemia, sitosterolemia, hipertensión, angina, síndrome coronario agudo, cardiopatía coronaria, aterosclerosis, arteriosclerosis, inflamación vascular y sepsis.

Description

DESCRIPCIÓN

Compuestos para el tratamiento de trastornos del metabolismo de las lipoproteínas

Campo técnico

La presente divulgación se refiere al uso de análogos de heparina como inhibidores de la proproteínaconvertasa subtilisina/kexina de tipo 9 (PCSK9) para tratar trastornos del metabolismo de las lipoproteínas.

Antecedentes

La arteriopatía coronaria provocada por la aterosclerosis es la principal causa de muerte en Europa y Estados Unidos. Un factor de riesgo importante en el desarrollo de la aterosclerosis es la hipercolesterolemia con un nivel elevado de partículas del colesterol transportado por las lipoproteínas de baja densidad (colesterol de las LDL o c-LDL) en la circulación. El metabolismo de las partículas del colesterol de las LDL está altamente regulado para equilibrar la síntesis de colesterol con la ingesta dietética para satisfacer las necesidades de colesterol en el cuerpo. Un regulador clave en la renovación del colesterol de las LDL es el receptor de LDL (rLDL) que media la captación celular de partículas de LDL y disminuye el nivel de colesterol de las LDL en la circulación, como lo ilustran los pacientes con hipercolesterolemia familiar provocada por deficiencia de rLDL o deterioro funcional.

Una estrategia exitosa para reducir los niveles plasmáticos de colesterol de las LDL es aumentar los niveles celulares de rLDL y, en la actualidad, el medicamento más usado para reducir el colesterol de las LDL son las estatinas. Las estatinas inhiben la síntesis de colesterol y regulan al alza la expresión de rLDL, lo que, en general, da lugar a una disminución de las cantidades de colesterol de las LDL circulante. Sin embargo, un número considerable de pacientes no responden o no toleran las estatinas debido a varios efectos secundarios. Además, las estatinas también aumentan la expresión de la proproteínaconvertasa subtilisina/kexina de tipo 9 (PCSK9) que se ha identificado recientemente como un potente regulador negativo del rLDL (Seidah y col., 2014), contrarrestando así el efecto beneficioso sobre el colesterol de las LDL.

Dirigirse a la PCSK9 es una estrategia reciente para reducir el c-LDL plasmático (Lagace y col., 2006). El nivel celular de rLDL se reduce debido a la capacidad de la PCSK9 para unirse al rLDL, lo que perjudica el reciclaje y mejora así la degradación lisosómica del receptor. Las mutaciones de ganancia de función de la PCSK9 llevan a un aumento significativo del c-LDL circulante debido a una degradación aumentada del rLDL. Por el contrario, los individuos con mutaciones de pérdida de función de la PCSK9 exhiben niveles reducidos de c-LDL y exhiben menos incidentes de cardiopatía coronaria. Diversas empresas farmacéuticas líderes han obtenido la autorización para estrategias terapéuticas dirigidas a la PCSK9 para aliviar la hipercolesterolemia. Se ha documentado que la administración de anticuerpos específicos de PCSK9 dirigidos contra el sitio de unión a rLDL de PCSK9 disminuye los niveles plasmáticos de c-LDL en ensayos clínicos en fase III (Mullard (2015) Nat Rev Drug Discov; Sheridan (2015) Nature Biotechnology). Sin embargo, la constante de afinidad de PCSK9:rLDL se encuentra en el intervalo de 120-620 nM (Cunningham y col., 2007; Fisher y col., 2007) mientras que la concentración plasmática de PCSK9 se encuentra aproximadamente en aproximadamente 6 nM (Lakoski y col., 2009), lo que hace muy poco probable que la PCSK9 se una al rLDL directamente en concentraciones fisiológicamente relevantes. Además, la PCSK9 sola se dirige al rLDL en el hígado y no, por ejemplo, en los tejidos productores de hormonas esteroides, que también expresan altos niveles de rLDL, lo que sugiere la necesidad de un correceptor específico para el hígado (Seidah y col., 2014). Por tanto, lo más probable es que el rLDL no sea el receptor principal de PCSK9. En cambio, un receptor desconocido (receptor X) puede capturar PCSK9 circulante y, posteriormente, entregarlo al rLDL. La inhibición de la unión de PCSK9 a este receptor es, por lo tanto, una estrategia superior en comparación con la inhibición de la interacción PCSK9:rLDL. El documento WO 2014/005224 describe la quercetina-3-O-p-D-glucósido para su uso en el aumento de la cantidad del receptor de las lipoproteínas de baja densidad (rLDL) de la superficie celular en los hepatocitos y para reducir la cantidad de PCSK9 secretada por los hepatocitos, y es, por tanto, útil en el tratamiento de diversos trastornos del metabolismo de las lipoproteínas.

El documento US 4.602.003 describe la sapogenina y glucósidos de colesterol para inhibir la absorción del colesterol y tratar la hipercolesterolemia o la aterosclerosis.

El documento WO 93/07167 describe saponinas que contienen 5-C-hidroximetilhexosa y un esterol o triterpeno como agente reductor del colesterol, triglicéridos y c-LDL.

El documento WO 2009/049370 se refiere a inhibidores de proteínas de unión a heparán sulfato y a usos de las mismas. Describe compuestos para su uso en el tratamiento de un trastorno resultante de angiogénesis, metástasis, inflamación, coagulación, trombosis, niveles elevados de triglicéridos en sangre, infección microbiana o enfermedad cardiovascular.

El documento EP 2495242 describe compuestos para su uso en el tratamiento de enfermedades asociadas con fugas vasculares, que incluyen diabetes, arteriosclerosis, aterosclerosis e hiperlipidemia.

Biessen y col. 1994, Biochem. J., 302, 283-289 se refiere a derivados de colesterol de galactósido de complejo triantenario y a su efecto sobre el destino in vivo de lipoproteínas de alta densidad (HDL) y lipoproteínas de baja densidad (LDL).

Chan y col. 2009, PNAS, 106, 24, 9820-9825 se refiere a un anticuerpo anti-PCSK9 neutralizante que se une a un epítopo en PCSK9 adyacente a la región requerida para la interacción con rLDL.

Resumen

Los presentes inventores han descubierto que PCSK9 alberga un motivo de unión para proteoglicanos de heparán sulfato (HSPG). Las mutaciones introducidas en este motivo, así como la inhibición de la unión a HSPG por la heparina, protegen al rLDL contra la degradación inducida por PCSK9. La inhibición de la interacción entre PCSK9 y HSPG tiene un potencial terapéutico superior en comparación con los ensayos clínicos de un anticuerpo inhibidor de PCSK9 (Chan y col., 2009). Es importante destacar que el motivo de unión a HSPG en PCSK9 es diferente al de la superficie de unión a rLDL. Los HSPG consisten en una proteína central sustituida con una o más cadenas de glicosaminoglicanos de heparán sulfato. La heparina es una clase de glicosaminoglicanos que están relacionados estrechamente con la estructura del heparán sulfato (HS). Tanto la heparina como e1HS están compuestos por unidades de disacáridos repetidas que consisten en ácido urónico (ácido glucurónico (GlcA) o ácido iudorónico (IdoA)) y N-acetilglucosamina (GlcN), que puede estar sulfatadas en O y/o en N. La heparina es una variante altamente sulfatada del heparán sulfato. Los HSPG son proteínas altamente glucosiladas, que se unen a ligandos de proteínas que tienen motivos de unión a HSPG, creando depósitos locales de, por ejemplo, factores de crecimiento (Xu y Esko, 2014). Los datos muestran que PCSK9 se une a HSPG y que la interacción se anula mediante mutagénesis dirigida al sitio del motivo de unión a HSPG en PCSK9, lo que da lugar a un mutante de PCSK9 incapaz de unirse a la heparina y que exhibe una capacidad alterada para degradar el rLDL. Además, la incubación de células con heparina o análogos de heparina da lugar a niveles elevados de rLDL, acompañados de una concentración aumentada de PCSK9 en el medio. Tomados en conjunto, los resultados descritos en los presentes ejemplos demuestran que la función de PCSK9 depende de la unión de HSPG, y que el nivel celular de rLDL aumenta cuando se anula la interacción entre PCSK9 y HSPG.

Por lo tanto, los HSPG son esenciales en la degradación del rLDL de la superficie celular mediada por PCSK9. Los presentes hallazgos muestran que los HSPG tienen una función esencial en la regulación a la baja del rLDL inducida por PCSK9.

El sitio de interacción entre PCSK9 y HSPG se puede dirigir para bloquear la función de PCSK9, en particular, para inhibir el efecto de PCSK9 sobre los niveles de rLDL. Por tanto, se describe una nueva estrategia en el tratamiento del trastorno del metabolismo de las lipoproteínas.

En un primer aspecto, la divulgación se refiere a una composición que comprende un compuesto que tiene la estructura general de la fórmula (I):

o una sal, solvato, polimorfo o tautómero farmacéuticamente aceptable del mismo, donde:

- R1 se selecciona de entre el grupo que consiste en alquilo, alquilo sustituido, heteroalquilo, heteroalquilo sustituido, alquilsulfonilo, alquilsulfonilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, éster, amida, acilo, acilo sustituido, amino, amino sustituido, tioalquilo, tioalquilo sustituido, arilo, heteroarilo, arilo sustituido, hidrógeno y halógeno;

- cada R2 se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste en -OSO³-, -OH, -NH², -NHSO³-, -NHOCH³y -OPO³2-;

- cada R3 se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste en -OSO³", -OH y - OPO³2"; - cada R4 se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste en -OSO³' , -OH, -OPO³2' y -H; - cada R5 se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste en -CH²OSO³', -CH²OH, -COO' y -CH²OPO³2-;

- n es un número entero igual o mayor que 1;

para su uso en el tratamiento de un trastorno del metabolismo de las lipoproteínas en un sujeto.

En un aspecto, la divulgación se refiere a un procedimiento para inhibir la degradación de rLDL, dicho procedimiento comprende administrar una composición que comprende un compuesto como se define en esta solicitud.

En otro aspecto, la divulgación se refiere a un procedimiento para reducir los niveles de lipoproteínas plasmáticas en un sujeto que lo necesita, dicho procedimiento comprende la etapa de administrar a dicho sujeto un compuesto o una composición farmacéutica como se define en esta solicitud. En una realización de la presente divulgación, la lipoproteína es c-LDL.

Descripción de los dibujos

Figura 1: Un dibujo del modelo propuesto que representa la captura de PCSK9 por HSPG y su posterior presentación al rLDL en la superficie de los hepatocitos. El rLDL capta partículas de c-LDL de la circulación y las entrega a los lisosomas para su degradación, mientras que el receptor (rLDL) se recicla a la superficie celular después de la liberación de carga en los endosomas. Al unirse a PCSK9, el rLDL se degrada por sí mismo en lisosomas. Se propone que los HSPG en la superficie de los hepatocitos capturen PCSK9 y la presenten al rLDL, lo que garantiza así condiciones óptimas para la formación del complejo PCSK9:rLDL. Por consiguiente, la alta actividad de PCSK9 da lugar a niveles reducidos de rLDL en la superficie celular y a un aumento del colesterol plasmático, mientras que la inhibición de la actividad de PCSK9 reduce los niveles de colesterol plasmático y ralentiza la progresión de una arteriopatía coronaria.

Figura 2: (A) Se muestra un modelo de espacio lleno de PCSK9 con el sitio de unión a rLDL y los sitios de unión a HSPG indicados por las puntas de flecha izquierda y derecha, respectivamente. (B) Un pentasacárido de heparina (SANORG, barras) en la superficie electrostática (rojo negativo; azul positivo) del sitio de unión a HSPG predicho en PCSK9 (ID de PDB: 2PMW) (Piper y col., 2007) con aminoácidos cargados positivamente (R: arginina, H: histidina) indicados. (C) Superposición de SANORG en el sitio de unión a HSPG en PCSK9 (lazo). (D) Células HepG2 no permeabilizadas que expresan PCSK9 (blanco) después del tratamiento con heparinasa I o sin ella. Los núcleos se tiñeron con Hoechst (gris oscuro). (E) La unión de PCSK9 a heparina se analizó mediante cromatografía de afinidad de heparina. Se eluyó PCSK9 de la columna a una concentración de NaCl de 500 mM.

Figura 3: Las variantes de PCSK9, en las que los residuos de aminoácidos indicados se mutaron a alanina, se expresaron transitoriamente en células CHO. (A) La inmunoelectrotransferencia de anti-PCSK9 del lisado celular y el medio mostró la expresión de todas las variantes de PCSK9, así como el procesamiento correcto de la proproteína (proPCSK9) en PCSK9 maduro en el lisado celular, y la secreción de PCSK9 maduro al medio de las células. No se detectó expresión de PCSK9 en células transfectadas simuladas. (B) Los mutantes de PCSK9 secretados al medio de células CHO transfectadas transitoriamente se analizaron para determinar la unión a heparina mediante cromatografía de afinidad seguida de inmunoelectrotransferencia de fracciones con anti-PCSK9. Todos los mutantes tienen sustituciones de alanina en las posiciones indicadas. La PCSK9 natural y el mutante R165R167 se eluyeron en fracciones correspondientes a NaCl 0,3-0,4 M, mientras que los mutantes R96R97 y R104R105 de PCSK9 mostraron una afinidad disminuida para la heparina y se encontraron en el flujo o en la primera fracción. Los mutantes de PCSK9 R93R104R105H139 y R93R96R97R104R105H139 se encontraron exclusivamente en el flujo y no se unieron a la heparina. (C) El dominio de unión a HSPG se sitúa frente al sitio de unión a rLDL como se muestra en un modelo de espacio lleno de PCSK9 en una representación de superficie de PCSK9 en un complejo con un fragmento de rLDL (PDB:3P5B). El fragmento de rLDL contiene el dominio de la hélice beta y los dominios EGF A y B y L7, mientras que el extremo C de PCSK9, dominio catalítico y prodominio se muestran con la hélice básica. El fragmento de heparina modelado se muestra como barras. (D) La PCSK9 endógena y la ApoE del medio de cultivo de células HepG2 mostraron una unión similar a la heparina cuando se analizaron mediante cromatografía de afinidad e inmunoelectrotransferencia.

Figura 4: Las células HepG2 incubadas durante 18 horas con PCSK9 natural (10 nM) muestran niveles significativamente más bajos de rLDL que las células incubadas con PCSK9 mutante (R93R96R97R104R105H139) (mut 4). Se evaluaron los niveles del receptor de LDL mediante inmunoelectrotransferencia (A), los niveles de GAPDH se muestran como control. Los gráficos de barras (B) muestran los valores promedio de rLDL cuantificados por densitometría (n = 3) con error estándar de la media (EEM). Los resultados se evaluaron mediante la prueba de la t de Student. **p < 0,01, ****p < 0,0001.

Figura 5: Las células HepG2 incubadas durante 24 h con heparina (50 U/ml) muestran niveles aumentados de rLDL evaluados por inmunoelectrotransferencia (A). Los niveles de GAPDH se muestran como control. Los gráficos de barras (B) muestran los valores promedio con error estándar de la media (EEM) de rLDL cuantificados por densiometría (n = 4). La incubación con heparina también da lugar a unos niveles de PCSK9 aumentados en el medio medido por ELISA (C). Los gráficos de barras muestran la concentración promedio de PCSK9 con EEM (n = 4). Los resultados se evaluaron mediante la prueba de la t de Student. ***p < 0,001, ****p < 0,0001. (D) = El análisis PLA de células HepG2 no permeabilizadas mostró que la colocalización entre rLDL y PCSK9 se redujo de forma marcada tras la incubación de células con heparina (50 U/ml).

Figura 6: (A) Usando un ensayo de unión de PCSK9/rLDL extracelular (BPS Bioscience) se encontró que la heparina (5 y 50 U/ml) no inhibe la interacción directa de PCSK9 con rLDL en contraste con el anticuerpo anti-PCSK9 inhibidor de control (5 nM), que se dirige a la región de unión a rLDL de PCSK9 (BPS Bioscience 71207). En el ensayo de unión, se cuantifica la señal quimioluminiscente de PCSK9 biotinilada unida a rLDL inmovilizado y los resultados se muestran aquí normalizados con respecto a la señal de muestras sin inhibidor. Los gráficos de barras muestran los valores promedio (n = 3) con barras de error de desviación típica. Los resultados se evaluaron mediante la prueba de la t de Student. *****p < 0,00001. Eje Y: % si no hay inhibidor. (B) Efecto dependiente de la dosis de heparina sobre PCSK9 en el medio medido por ELISA (n = 3). Eje Y: PCSK9 en medio (%). (C) Análisis cuantitativo de los niveles de ARNm en lisados celulares por RT-P^cR.

Figura 7: Las células HepG2 incubadas durante 24 horas con concentración creciente (0-250 pg/ml) del análogo de heparina Arixtra (Fondaparinux, GlaxoSmithKline Pharma) tienen niveles elevados de rLDL. La inmunoelectrotransferencia de GAPDH se muestra como control de carga.

Figura 8: (A) Inmunoelectrotransferencia de rLDL en células HepG2 después de 18 horas de incubación con fragmin (100 U/ml) e Innohep (100 U/ml), lo que demuestra que estas dos preparaciones terapéuticas de heparinas de bajo peso molecular pueden aumentar el nivel celular de rLDL comparable al efecto de la heparina (50 U/ml). La inmunoelectrotransferencia de GAPDH se muestra como control de carga. (B) Inmunoelectrotransferencia que muestra los niveles de rLDL en el hígado de ratones 1 hora después de la administración intravenosa de 10 pg de PCSK9 sola o en combinación con 50 U de heparina. Se cargaron 50 pg de preparaciones de membrana. Como control se muestra la inmunoelectrotransferencia para sortilina, un receptor de PCSK9 que previamente se demostró que no es la diana de la degradación inducida por PCSK9. (C) Cuantificación de B) Las bandas se cuantificaron por densitometría y el gráfico de puntos muestra el nivel individual de cada muestra en porcentaje de controles inyectados con vehículo (NaCl al 0,9 %) con valores medios y EEM. Los ratones coinyectados con PCSK9 y heparina muestran un nivel significativamente más alto de rLDL (60,3 ± 12,3 % de rLDL frente a 24,0 ± 4.04 %, n = 7 ratón/grupo, p = 0,0157, prueba de la t de Student bilateral).

Figura 9: (A) Inmunoelectrotransferencia de rLDL en células HepG2 después de 24 horas de incubación con sulfato de dextrano de miméticos de heparina (200 pg/ml), lo que muestra que este compuesto puede aumentar de forma potente el nivel celular de rLDL. Se muestra heparina (50 U/ml) a modo de comparación. GAPDH se muestra como control de carga. (B) Cuantificación densitométrica de los niveles de rLDL que muestra aumentos dependientes de la concentración de rLDL en células HepG2 después de la incubación con sulfato de dextrano (0-200 pg/ml). Los gráficos de barras muestran el promedio de rLDL en % de células no tratadas con barras de error EEM. (C) Curva de unión de termoforesis a microescala (MST) para PCSK9 y sulfato de dextrano. Eje Y: señal de fluorescencia. Eje X: sulfato de dextrano o concentración de dextrano, K^d= 180 pM. Círculos: sulfato de dextrano. Cuadrados: dextrano. (D) Inmunoelectrotransferencia, cuantificación densitométrica (E) de rLDL en células HepG2 después de 24 horas de incubación con sulfato de pentosano (0-200 pg/ml), lo que muestra un aumento de 4 veces en rLDL en lisado de células tratadas con 50-200 pg/ml de sulfato de pentosano. Los gráficos de barras muestran el promedio de rLDL en % de células no tratadas con barras de error EEM. (F) Curva de unión de MST para PCSK9 y sulfato de pentosano. Eje Y: señal de fluorescencia. Eje X : concentración de sulfato de pentosano. Círculos: sulfato de pentosano, K^d= 381 pM. Cuadrados: control. (G) Cuantificación de rLDL en células HepG2 después de 24 horas de incubación con suramina (0-200 pg/ml). Los gráficos de barras muestran el promedio de rLDL en % de células no tratadas con barras de error EEM. En (A), se muestra una inmunoelectrotransferencia representativa de rLDL en células HepG2 incubadas con suramina. (H): Curva de unión de MST para PCSK9 y suramina. Eje Y: señal de fluorescencia. Eje X: concentración de suramina. Círculos: suramina, K^d= 190 pM. Cuadrados: control. (I) Inmunoelectrotransferencia y cuantificación densitométrica (J) de rLDL en células HepG2 después de incubación durante 24 horas con fosforotioatooligonucleótido S-dC-36 (0-5,0 pM), lo que muestra un aumento dependiente de la concentración en los niveles de receptor celular. Los gráficos de barras muestran el promedio de rLDL en % de células no tratadas con barras de error EEM. Los resultados se evaluaron mediante la prueba de la t de Student. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. (K) Curva de unión de MST para PCSK9 y S-dC-36. Eje Y: señal de fluorescencia. Eje X: concentración de S-dC-36. Círculos: S-dC-36, K^d= 4,8 pM. Cuadrados: control.

Figura 10: La infusión de heparinasa I antes de la inyección de PCSK9 (10 pg) inhibe por completo la degradación de rLDL inducida por PCSK9. Se muestra una inmunoelectrotransferencia de muestras representativas (A) y una cuantificación de gráfico de barras de rLDL (B). Para las inmunoelectrotransferencias, se usa GAPDH como control de carga. e: carril vacío. Control n = 7, PCSK9 n = 6, heparinasa n = 5, heparinasa/PCSK9 n = 5. Los ratones coinyectados con PCSK9 (10 pg) y heparina (50 U) o suramina (300 pg) muestran un nivel significativamente mayor de rLDL en comparación con los ratones inyectados con PCSK9 sola (C). Control n = 15, PCSK9 n = 10, PCSK9/heparina n = 7, PCSK9/suramina n = 3. (D) Niveles plasmáticos de PCSK9 después de inyección intravenosa de heparina (50 U) según lo evaluado por ELISA específico para PCSK9 murina.

Figura 11: Niveles de rLDL en el hígado de ratones 1 hora después de la administración intravenosa de 10 pg de PCSK9 sola o en combinación con 50 pg del anticuerpo inhibidor de PCSK95E11.

Figura 12: Gráficos de barras que muestran la señal de fluorescencia relativa en células HepG2 después de la incubación durante la noche con suramina (200 pg/ml) después de 4 horas de incubación con 10 ng/ml de partículas de LDL marcadas con colorante de fluorescencia Bodipy. La inhibición de PCSK9 con suramina aumenta al doble la captación de LDL.

Figura 13: Gráficos de barras (A) y (B) que muestran los niveles de rLDL, evaluados por inmunoelectrotransferencia, en células HepG2 después de 24 y 48 horas de incubación con 100 pM de suramina o inhibidores de la HMG CoA reductasa mevastatina y simvastatina. Las células incubadas con suramina muestran un nivel más alto de rLDL que las células incubadas con estatinas.

Figura 14: (A) Disección de la interacción entre PCSK9 y glucanos de matriz extracelular utilizando una micromatriz de glucanos sintéticos. Solo se muestra la unión a los diferentes fragmentos de heparina. Se incluye heparina natural como control positivo. (B) Se muestran las subestructuras de heparina usadas en la micromatriz de glucanos. Las estructuras que interactúan con PCSK9 contienen repeticiones de [4)-a-GlcN-6,N-disulfato(1^4)-a-IdoA-2-sulfato-( W

Figura 15: (A) La PCSK9 con sitio de unión a HSPG mutado (R93R96R97R104R105H139, mut 4) (10 pg) es ineficaz para inducir la degradación de rLDL hepático (n = 3 de cada uno) tras la inyección en ratones. Cuantificación de inmunoelectrotransferencia mostrada en (B). (C) La PCSK9 pero no PCSK9 mut 4 aumenta significativamente el colesterol total en ratones alimentados con una dieta de tipo occidental (control n = 25, PCSK9 n = 12, PCSK9 mut 4 n = 9). (D) La PCSK9 mut 4 inyectado permaneció en circulación a concentraciones más altas en comparación con PCSK9 natural en línea con la captura reducida por HSPG y el aclaramiento por rLDL.

Figura 16: (A) Se probó la capacidad del compuesto (X) para inhibir la interacción PCSK9-heparina en un ensayo, en el que se precipitó PCSK9 (1 pg/ml) con microesferas de heparina-sefarosa en presencia de inhibidor. Después de una incubación durante la noche, se sedimentaron las microesferas y se evalúo PCSK9 no precipitada en el sobrenadante. (= PCSK9 libre) mediante ELISA. Los gráficos de barras muestran PCSK9 libre (%) en muestras con concentraciones crecientes de compuesto (X) como se indica, normalizadas a la concentración de PCSK9 en una muestra sin microesferas de heparina-sefarosa (control de entrada). Se incubaron una muestra de control negativo sin inhibidor y una muestra de control positivo con heparina soluble (5 mg/ml). Se muestra el valor medio con EEM (n = 2). (B) Inmunoelectrotransferencia representativa de los niveles de rLDL en células HepG2 incubadas durante la noche con concentraciones de compuesto (X) como se indica. Los gráficos de barras muestran la cuantificación de inmunoelectrotransferencia (valor medio con EEM, n = 2). Las células de control se incubaron sin inhibidor (control negativo) o con 500 pg de heparina/ml (control positivo). (C) Niveles de rLDL en muestras de hígado de ratones (BALB6/cJRj, machos, 10 semanas) inyectados con Compuesto (X) inhibidores de PCSK9 (0,13 mg/kg) o Evolocumab (8 mg/kg) 1 hora antes de la inyección con PCSK9 (0,4 mg/kg). Se recogieron muestras del hígado 1 hora después de la inyección de PCSK9. Los grupos de control se inyectaron con NaCl (0,9 %) antes de la inyección de PCSK9 o NaCl. Los gráficos de barras muestran el valor medio con EEM. Grupo NaCl/NaCl n = 3, grupo NaCl/PCSK9 n = 5, grupo Evolocumab/PCSK9 n = 5, grupo compuesto (X)/PCSK9 n = 8.

Figura 17: (A) Inmunoelectrotransferencia de los niveles de rLDL en células HepG2 incubadas durante la noche con hexámero de heparina o 18-mero en concentraciones como se indica. (B) Los gráficos de barras muestran la cuantificación de inmunoelectrotransferencia (valor medio con EEM, n = 2).

Figura 18: (A) Perfil de elución obtenido por cromatografía de exclusión por tamaño de Innohep. La actividad inhibidora de PCSK9 de las fracciones indicadas se sometió a prueba posteriormente en células HepG2. (B) Inmunoelectrotransferencia que muestra niveles de rLDL en células HepG2 incubadas con fracciones de exclusión por tamaño (20 pM). La incubación durante la noche con la fracción H6 aumentó el rLDL celular 5 veces, y esta fracción se fraccionó adicionalmente usando cromatografía de intercambio aniónico fuerte (SAX) (Figura 19).

Figura 19: (A) Perfil de elución obtenido por cromatografía de intercambio aniónico fuerte (SAX) de la fracción H6 de Innohep. (B) Inmunoelectrotransferencia de rLDL en HepG2 incubada durante la noche con fracciones SAX seleccionadas. Las fracciones SAX I1, I8 y I9 contienen fragmentos de heparina con actividad inhibidora de PCSK9 y aumentan los niveles de rLDL hasta 2 veces a la concentración sometida a prueba (500 nM).

Figura 20: Análisis BIACORE de la unión de PCSK9 a heparina-albúmina. El análisis utilizó chips sensores junto con heparina-albúmina (Sigma H0403) o albúmina (Sigma A4503). (A) Unión de PCSK9 a heparina-albúmina. (B) Unión de PCSK9 a albúmina. PCSK9 se unió a heparina-albúmina con una constante de afinidad de 700 pM, no se observó unión al chip sensor acoplado con albúmina. Se implementó un ensayo de interferencia para evaluar la unión entre PCSK9 y el compuesto (X). (C) PCSK9 preincubada con concentraciones crecientes de compuesto (X) infundido sobre el chip sensor junto con heparina-albúmina. Las curvas de unión revelaron que el compuesto (X) inhibe la unión de PCSK9 al chip sensor de heparina-albúmina con una CI50 estimada de 50 nM.

Figura 21: (A) Estructura del octasulfato de sacarosa (B) Los gráficos de barras muestran la precipitación de PCSK9 por microesferas de heparina-sefarosa en presencia de concentraciones de octasulfato de sacarosa como se indica. Se calculó el porcentaje de PCSK9 no precipitado (PCSK9 libre) con respecto a la concentración de PCSK9 en una muestra sin microesferas de heparina-sefarosa (control de entrada). Se incubó una muestra de control positivo con heparina soluble (5 mg/ml). Se muestra el valor medio con EEM (n = 3-2).

Definiciones

El término "acilo", como se usa en esta solicitud, significa un grupo alquilo como se define a continuación que contiene al menos un resto oxo (-C=O).

El término "alcano" se refiere a hidruros de carbonos saturados lineales, ramificados y/o cíclicos. Dichos alcanos pueden tener la fórmula general CnH²n⁺². En algunas realizaciones de la presente divulgación, dicho alcano comprende estructuras de anillo.

El término "alquenilo", como se usa en esta solicitud, se refiere a un sustituyente derivado de un alqueno mediante la eliminación de un -H. Un alqueno puede ser cualquier hidruro de carbono acíclico que comprenda al menos un doble enlace. Con frecuencia, el alquenilo tendrá la fórmula general -CnH²n^-1.

El término "alquilo" se refiere a un sustituyente derivado de un alcano mediante la eliminación de un -H.

El término "alquinilo", como se usa en esta solicitud, se refiere a un sustituyente derivado de un alquino mediante la eliminación de un -H. Un alquino puede ser cualquier hidruro de carbono acíclico que comprenda al menos un triple enlace. Con frecuencia, el alquinilo tendrá la fórmula general -CnH2n-3.

El término "alquilsulfonilo" se refiere a un grupo -S(O)²-alquilo que puede ser un grupo terminal o un grupo puente. El término "amida" se refiere al grupo funcional RC(O)NR'R".

El término "amino", como se usa en esta solicitud, se refiere a un sustituyente de la fórmula general

La línea ondulada indica el punto de fijación del sustituyente. Amino puede así ser, por ejemplo, -NH²o -NH-. El término "areno", como se usa en esta solicitud, se refiere hidruros de carbono aromáticos mono o policíclicos. El término "arilo", como se usa en esta solicitud, se refiere a un sustituyente derivado de un areno mediante la eliminación de un -H de un C en el anillo. Los ejemplos de arilos útiles para usarlos con la presente divulgación comprenden fenilo, naftilo, antracenilo, fenantrenilo y pirenilo.

El término "éster" se refiere al grupo funcional RCOOR'.

El término "halógeno", como se usa en esta solicitud, se refiere a un sustituyente seleccionado de entre el grupo que consiste en -F, -CI, -Br y -I.

El término "análogo de heparina" se refiere a compuestos que son estructuralmente similares a la heparina.

El término "mimético de heparina" se refiere a compuestos que se comportan funcionalmente como, es decir, imitan a la heparina. Por tanto, este término incluye ambos compuestos que son estructuralmente similares, pero también compuestos que tienen una estructura diferente pero la misma funcionalidad que la heparina, en el contexto de la presente divulgación.

El término "heteroalquilo", como se usa en esta solicitud, se refiere a un grupo alquilo en el que uno o más carbonos han sido intercambiados por un heteroátomo seleccionado de entre S, O, P y N.

El término "heteroarilo", como se usa en esta solicitud, se refiere a un sustituyente derivado de un heteroareno mediante la eliminación de un -H de un átomo en la estructura del anillo de dicho heteroareno. Los heteroarenos son compuestos aromáticos mono o policíclicos que comprenden uno o más heteroátomos en la estructura del anillo. Dichos heteroátomos se seleccionan preferiblemente de entre el grupo que consiste en S, N y O. Los ejemplos de heteroarilos útiles para usarlos con la presente divulgación comprenden azolilo, piridinilo, pirimidinilo, furanilo y tiofenilo.

Niveles de colesterol de las LDL (c-LDL): los niveles óptimos de c-LDL para una persona determinada varían según el riesgo subyacente de padecer una cardiopatía. Para las personas sanas, los niveles de c-LDL idealmente deberían ser inferiores a 2,6-3,3 mmol/l (o 100-129 mg/dl). Los niveles entre 3,4 y 4,1 mmol/l o 130 y 159 mg/dl están en el límite de lo alto, los niveles entre 4,1 y 4,9 mmol/l o 160 y 189 mg/dl son altos y los niveles superiores a 4,9 mmol/l o 189 mg/dl son muy altos. Para las personas con riesgo de padecer cardiopatía, se recomiendan niveles por debajo de 2,6 mmol/l o 100 mg/dl, mientras que los niveles por debajo de 1,8 mmol/l o 70 mg/dl son deseables para personas con un riesgo muy alto de padecer cardiopatía.

Niveles del receptor de las lipoproteínas de baja densidad (rLDL): la síntesis del rLDL en la célula la regula el nivel de colesterol intracelular libre; si el colesterol está en exceso para las necesidades de la célula, se inhibirá la transcripción de rLDL. Los niveles de rLDL se pueden estimar mediante procedimientos conocidos en la técnica, tales como, pero sin limitarse a, inmunoelectrotransferencia, RT-PCR y citometría de flujo.

El término "heparina de bajo peso molecular" se refiere a una clase de heparinas de tamaño limitado. La heparina natural consta de cadenas moleculares de diferentes longitudes o pesos moleculares. Por ejemplo, las cadenas de pesos moleculares variables, de 5000 a sobre 40.000 daltons, componen la heparina polidispersa de calidad farmacéutica. Las heparinas de bajo peso molecular, por el contrario, consisten solo en cadenas cortas de polisacáridos. Las heparinas de bajo peso molecular se definen como sales de heparina que tienen un peso molecular promedio inferior a 8000 Da y para las que al menos el 60 % de todas las cadenas tienen un peso molecular inferior a 8000 Da. Estas se obtienen mediante diversos procedimientos conocidos por los expertos en la técnica, tales como fraccionamiento o despolimerización de heparina polimérica.

El término "trastorno del metabolismo de las lipoproteínas" se refiere a trastornos de la homeostasis de los lípidos y a los trastornos asociados con los mismos, que incluyen, a modo de ejemplo, diabetes, obesidad, síndrome metabólico, xantoma, hipercolesterolemia, hipercolesterolemia familiar, dislipidemia, hipertrigliceridemia, hiperlipidemia, sitosterolemia, hipertensión, angina, síndrome coronario agudo, cardiopatía, aterosclerosis, arteriosclerosis, inflamación vascular y sepsis.

Niveles de PCSK9: los niveles plasmáticos de PCSK9 varían de 30 a 3000 ng/ml en la población general, y los niveles medios son en general más altos en mujeres que en hombres. Los niveles de PCSK9 se correlacionan con los niveles de c-LDL.

El término "unidad de monosacárido", como se usa en esta solicitud, se refiere a las unidades más básicas de carbohidratos e incluye aldosas, cetosas y una amplia variedad de derivados. Si se enlaza más de una unidad de monosacárido, los enlaces pueden ser individualmente a o p (1^-2), a o p (1^3) o a o p (1^4). Preferiblemente, el enlace es a o p (1^4). La unidad de monosacárido puede ser una aldosa o una cetosa.

El término "sustituido", como se usa en esta solicitud con respecto a compuestos químicos, se refiere a grupos de hidrógeno que se han sustituido con otro resto. Por tanto, "sustituido con X", como se usa en esta solicitud con respecto a compuestos químicos, se refiere a grupos de hidrógeno que se han sustituido con X. De forma similar, "X sustituido" se refiere a X, donde un grupo de hidrógeno se ha sustituido con otro resto. A modo de ejemplo, "alquilo sustituido" se refiere a alquil-R, donde R es cualquier resto excepto -H.

El término "sustituyente", como se usa en esta solicitud con respecto a compuestos químicos, se refiere a un átomo o grupo de átomos sustituidos en lugar de un átomo de hidrógeno.

El término "tioalquilo", como se usa en esta solicitud, se refiere a un sustituyente de la fórmula general -S-alquilo. El término "tioalrilo", como se usa en esta solicitud, se refiere a un sustituyente de la fórmula general -S-arilo.

Descripción detallada

La invención se define por las reivindicaciones adjuntas. Cualquier realización que no se encuentre dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas no forma parte de la invención.

Análogos de heparina

La presente divulgación se refiere en un primer aspecto a una composición que comprende un compuesto para su uso en el tratamiento de un trastorno del metabolismo de las lipoproteínas en un sujeto. El compuesto es típicamente un análogo de heparina. Se describen ejemplos de análogos de heparina en R. Lever y col. (eds.), Heparin - A Century of Progress, Handbook of Experimental Pharmacology 207, Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2012.

En un aspecto de la presente la divulgación, el análogo de heparina de la presente divulgación tiene la estructura general de la fórmula (I):

- cada R2 se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste en -OSO3-, -OH, -NH², -NHSO3-, -NHOCH³y -OPO³2-;

- cada R3 se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste en -OSO3-, -OH y - OPO32-; - cada R4 se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste en -OSO³' , -OH, -OPO³2' y -H; - cada R5 se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste en -CH²OSO³', -CH²OH, -COO' y -CH2OPO32-;

- n es un número entero igual o mayor que 1;

En una realización de la presente divulgación, n es 1, 2, 3 o 4.

En algunas realizaciones de la presente divulgación, R1 en el compuesto de la fórmula (I) comprende un grupo de la fórmula (II):

_pH-x^ NH2

OI)

donde:

- X es CH²o SO²

- m es un número entero independientemente igual o mayor que 1.

En una realización de la presente divulgación, m es 1, 2, 3, 4, 5 o 6. En una realización de la presente divulgación, R1 comprende un grupo de la fórmula (XI).

En algunas realizaciones de la presente divulgación, R1 es un heteroalquilo sustituido. Dicho heteroalquilo sustituido puede comprender una unidad o unidades de monosacárido. En algunas realizaciones de la presente divulgación, R1 comprende al menos una unidad de monosacárido, tal como al menos dos unidades de monosacárido, tales como al menos tres unidades de monosacárido, tal como al menos cuatro unidades de monosacárido. En una realización preferida de la presente divulgación, n en la fórmula (I) es 1 cuando R1 comprende al menos una unidad de monosacárido.

R1 se selecciona de entre el grupo que consiste en alquilo, alquilo sustituido, heteroalquilo, heteroalquilo sustituido, alquilsulfonilo, alquilsulfonilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, éster, amida, acilo, acilo sustituido, amino, amino sustituido, tioalquilo, tioalquilo sustituido, arilo, heteroarilo, arilo sustituido, hidrógeno y halógeno;

En una realización de la presente divulgación, R1 comprende un grupo seleccionado de entre el grupo que consiste en la fórmula (XVI), la fórmula (XVII), la fórmula (XVIII), la fórmula (XⁱX), la fórmula (XX), la fórmula (XXIX), fórmula (XXX), fórmula (XXXI), -PEG2000-OMe y -PEG5000-OMe:

En otra realización de la presente divulgación, R1 consiste en un grupo seleccionado de entre el grupo que consiste en la fórmula (XVI), fórmula (XVII), fórmula (XVIII), fórmula (XIX), fórmula (XX), fórmula (XXIX), fórmula (^xX^x), fórmula (XXXI), -PEG2000-OMe, y -PEG5000-OMe.

En algunas realizaciones de la presente divulgación, el compuesto es un mimético de heparina. Dicho mimético de heparina puede ser un derivado basado en PI-88. PI-88 (fórmula (XXIII), donde R8 es -PO³2", y R9 es individualmente -SO³" o -H, véase más adelante) es una mezcla de oligosacáridos de manosa monofosforilados altamente sulfatados, y se conoce por ser un inhibidor de la heparanasa.

Por tanto, en algunas realizaciones de la presente divulgación, n en la fórmula (I) es 1 y R1 comprende un grupo de la fórmula (XV), donde s es un número entero, igual o mayor que 1. En una realización de la presente divulgación, s es 1, 2 o 3.

En una realización de la presente divulgación, el compuesto de la fórmula (I) es un compuesto de la fórmula (XXIV), donde p es un número entero, igual o mayor que 1.

En una realización preferida de la presente divulgación, donde el compuesto es:

A. Un compuesto de la fórmula (XXIV) donde p es 2 y R1 es la fórmula (XX);

B. Un compuesto de la fórmula (XXIV) donde p es 2 y R1 es la fórmula (XVII);

C. Un compuesto de la fórmula (XXIV) donde p es 2 y R1 es la fórmula (XVIII);

D. Un compuesto de la fórmula (XXIV) donde p es 3 y R1 es la fórmula (XVII);

E. Un compuesto de la fórmula (XXIV) donde p es 0 y R1 es la fórmula (XVII);

F. Un compuesto de la fórmula (XXIV) donde p es 1 y R1 es la fórmula (XVII);

G. Un compuesto de la fórmula (XXIV) donde p es 1 y R1 es la fórmula (XIX);

H. Un compuesto de la fórmula (XXIV) donde p es 3 y R1 es la fórmula (XX); o

I. Un compuesto de la fórmula (XXIV) donde p es 3 y R1 es la fórmula (XXIX).

En una realización de la presente divulgación, p es 1 y el compuesto de la fórmula (I) es un compuesto de la fórmula (XXV).

En una realización preferida de la presente divulgación, el compuesto es

J. Un compuesto de la fórmula (XXV) donde R1 es la fórmula (XVII); o

K. Un compuesto de la fórmula (XXV) donde R1 es la fórmula (XIX).

En una realización de la presente divulgación, el compuesto de la fórmula (I) tiene la estructura (IX).

En una realización de la presente divulgación, el compuesto de la fórmula (I) es un compuesto de la fórmula (XXVI), donde q es un número entero, igual o mayor que 1. En una realización de la presente divulgación, q es 1,2 o 3.

En una realización de la presente divulgación, R10 es -O-R1. En otra realización de la presente divulgación, R10 comprende un grupo seleccionado de entre el grupo que consiste en la fórmula (XXI), la fórmula (XXII), -O-fórmula (XVI), -O-fórmula (XVII), -O-fórmula ( XVIII), -O-fórmula (XIX) y -O-fórmula (XX). En otra realización de la presente divulgación, R10 consiste en un grupo seleccionado de entre el grupo que consiste en la fórmula (XXI), fórmula (XXII), -O-fórmula (XVI), -O-fórmula (XVII), -O-fórmula ( XVIII), -O-fórmula (XIX), -O-fórmula (XX) y -O-fórmula (XXIX).

En una realización preferida de la presente divulgación, el compuesto es

L. Un compuesto de la fórmula (XXVI), donde q es 2 y R1° es -O-fórmula (XVII);

M. Un compuesto de la fórmula (XXVI), donde q es 2 y R1° es la fórmula (XXI);

N. Un compuesto de la fórmula (XXVI), donde q es 1 y R1° es la fórmula (XVII);

O. Un compuesto de la fórmula (XXVI), donde q es 2 y R1° es -O-fórmula (XXII);

P. Un compuesto de la fórmula (XXVI), donde q es 1 y R1° es -O-fórmula (XVII);

Q. Un compuesto de la fórmula (XXVI), donde q es 2 y R1° es -O-fórmula (XVIII);

R. Un compuesto de la fórmula (XXVI), donde q es 1 y R1° es -O-fórmula (XVII I);

S. Un compuesto de la fórmula (XXVI), donde q es 0 y R1° es -O-fórmula (XVII); o

T. Un compuesto de la fórmula (XXVI), donde q es 0 y R1° es -O-fórmula (XXI).

En una realización de la presente divulgación, el compuesto de la fórmula (I) es un compuesto de la fórmula (XXVII).

En una realización preferida de la presente divulgación, el compuesto es de la fórmula (XXVII) y R1° es de la fórmula (XVII).

En una realización de la presente divulgación, el compuesto de la fórmula (I) es un compuesto de la fórmula (XXVIII).

En una realización preferida de la presente divulgación, el compuesto es

U. Un compuesto de la fórmula (XXVIII), donde R1° es -O-fórmula (XVII), R11 es H y R12 es OR9; o

V. Un compuesto de la fórmula (XXVIII), donde R1° es la fórmula (XXI), R11 es OR9 y R12 es H.

En una realización de la presente divulgación, el compuesto tiene la fórmula estructural general (XII):

En una realización de la presente divulgación, R2 es -OSO³'. En otra realización de la presente divulgación, R3 es -OSO³'. En otra realización de la presente divulgación, R4 es -OSO³'. En otra realización de la presente divulgación, R5 es -CH²OSO³'. En una realización preferida de la presente divulgación, R2, R3 y R4 son -OSO³' y R5 es -CH²OSO³'. En una realización de la presente divulgación, R9 es -OSO³'.

En una realización de la presente divulgación, la sal farmacéuticamente aceptable es la sal de sodio.

En una realización de la presente divulgación, el compuesto tiene la fórmula estructural general (XIII):

En una realización preferida de la presente divulgación, n es 2, 3 o 4.

En una realización de la presente divulgación, el compuesto tiene la fórmula estructural general (XIV):

En una realización preferida de la presente invención, el compuesto de la fórmula (I) es el compuesto (X):

En una realización preferida de la presente invención, el compuesto de la formula (I) es sal de tridecasodio 3pcolestanil 2,3,4,6-tetra-O-sulfo-a-D-glucop¡ranos¡l-(1^4)-2,3,6-tri-O-sulfo-a-D-glucop¡ranos¡l-(1^4)-2,3,6-tr¡-O-sulfoa-Dglucopiranosil-(1^4)-2,3,6-tri-O-sulfo-p-D-glucopiranósido.

En una realización de la presente divulgación, el compuesto de la fórmula (I) tiene la estructura general (III):

donde:

cada R2 y R6 se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste en -OSO³", -OH, -NH², -NHSO³-, -NHOCH³y -OPO³2-;

cada R3 y R7 se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste en -OSO³', -OH y - OPO³2'; cada R5 y 8 se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste en -CH²OSO³', -CH²OH, -COO’ y -CH²OPO³2-;

cada R4 se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste en -OSO3- , -OH, -OPO³²y -H; n es un número entero igual o mayor que 1.

En una realización de la presente divulgación, el compuesto de la fórmula (I) tiene la estructura general (IV):

En una realización de la presente divulgación, el compuesto de la fórmula (I) tiene la estructura general (V):

En una realización de la presente divulgación, el compuesto de la fórmula (I) tiene la estructura general (VI):

La heparina y el heparán sulfato consisten en unidades repetidas de disacárido. En una realización de la presente divulgación, el número de unidades repetidas en los compuestos de las fórmulas (III)-(VI) es 1. En otra realización de la presente divulgación, el número de unidades repetidas en los compuestos de las fórmulas (III)-(VI) es 2. En otra realización de la presente divulgación, el número de unidades repetidas en los compuestos de las fórmulas (III)-(VI) es 3. En otra realización de la presente divulgación, el número de unidades repetidas en los compuestos de las fórmulas (III)-(VI) es 4. En otra realización de la presente divulgación, el número de unidades repetidas en los compuestos de las fórmulas (III)-(VI) es 5. En otra realización de la presente divulgación, el número de unidades repetidas en los compuestos de las fórmulas (III)-(VI) es 6. En otra realización de la presente divulgación, el número de unidades repetidas en los compuestos de las fórmulas (III)-(VI) es 7. En otra realización de la presente divulgación, el número de unidades repetidas en los compuestos de las fórmulas (III)-(VI) es 8. En otra realización de la presente divulgación, el número de unidades repetidas en los compuestos de las fórmulas (III)-(VI) es 9. En otra realización de la presente divulgación, el número de unidades repetidas en los compuestos de las fórmulas (III)-(VI) es 10.

En una realización de la presente divulgación, el compuesto de la fórmula (I) tiene la estructura general (VII):

En una realización de la presente divulgación, el compuesto tiene la estructura general (VIII):

En una realización específica de la presente invención, el compuesto de la fórmula (I) es heparina I y tiene la siguiente estructura:

En una realización específica de la presente invención, el compuesto de la fórmula (I) es heparina VII y tiene la siguiente estructura:

En algunas realizaciones de la presente divulgación, el compuesto comprende además un resto de unión a albúmina conjugado con dicho compuesto. En una realización de la presente divulgación, el resto de unión a albúmina es un ácido graso, que se puede seleccionar de entre el grupo que consiste en ácido caprílico, ácido cáprico, ácido láurico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido araquídico, ácido behénico, ácido lignocérico, ácido cerótico, ácido miristoleico, ácido palmitoleico, ácido sapienico, ácido oleico, ácido elaídico, ácido vaccénico, ácido linoleico, ácido linoelaídico, ácido a-linolénico, ácido araquidónico, ácido eicosapentaenoico, ácido erúcico y ácido docosahexaenoico.

En algunas realizaciones de la presente divulgación, el ácido biliar se conjuga con el compuesto de la fórmula (I). En una realización de la presente divulgación, el ácido biliar conjugado se selecciona de entre el grupo que consiste en ácido cólico, ácido taurocólico, ácido glicocólico, ácido tauroquenodesoxicólico, ácido glicoquenodesoxicólico, ácido quenodesoxicólico, ácido desoxicólico y ácido litocólico.

En una realización de la presente divulgación, el compuesto de la fórmula (I) se fija covalentemente a través del grupo aminoterminal (como R) a una estructura dendrítica de la fórmula:

Unión de análogos de heparina a PCSK9

En algunas realizaciones de la presente divulgación, el análogo de heparina es capaz de inhibir la unión de HSPG a PCSK9. En algunas realizaciones de la presente divulgación, el análogo de heparina se une a cualquiera de los residuos de aminoácidos de PCSK9 como se describe a continuación en esta solicitud. Se entenderá a lo largo de esta divulgación que los compuestos capaces de inhibir la unión de HSPG a variantes de PCSK9 también se encuentran dentro del alcance de la divulgación. Por variante de PCSK9 se entiende un polipéptido que tiene esencialmente la misma secuencia que SEQ ID NO: 1, por ejemplo variantes que tienen sustituciones conservadoras de algunos residuos de SEQ ID NO: 1.

En algunas realizaciones de la presente divulgación, dicho compuesto reconoce específicamente y se une a una región dentro del sitio de unión a HSPG de PCSK9 (SEQ ID NO: 1) que comprende al menos uno de los residuos de aminoácidos 78 a 167 de PCSK9 (SEQ ID NO: 1), tal como al menos uno de los residuos de aminoácidos 78 a 92, tal como al menos uno de los residuos de aminoácidos 93 a 97, tal como al menos uno de los residuos de aminoácidos 98 a 103, tal como al menos uno de los residuos de aminoácidos 104 a 105, tal como al menos uno de los residuos de aminoácidos 106 a 135, tal como al menos uno de los residuos de aminoácidos 136 a 139, tal como al menos uno de los residuos de aminoácidos 140 a 164, tal como al menos uno de los aminoácidos residuos ácidos 165 a 167 de PCSK9 (SEQ ID NO: 1).

En esta solicitud, se proporciona un compuesto que reconoce específicamente y se une a una región dentro del sitio de unión a HSPG de PCSK9 (SEQ ID NO: 1) que comprende al menos uno de los residuos de aminoácidos 78 a 167 de PCSK9 (SEQ ID NO: 1), tal como al menos 2, tal como al menos 5, tal como al menos 10, tal como al menos 15, tal como al menos 20, tal como al menos 25, tal como al menos 30, tal como al menos 35, tal como al menos 40, tal como al menos 45, tal como al menos 50, tal como al menos 55, tal como al menos 60, tal como al menos 65, tal como al menos 70, tal como al menos 75, tal como al menos 80, tal como al menos 85, tal como todos los residuos de aminoácidos 78 a 167 de PCSK9 (SEQ ID NO: 1).

En algunas realizaciones de la presente divulgación, el compuesto reconoce específicamente y se une a una región que comprende al menos uno de los residuos de aminoácidos 78 a 92, tal como al menos uno de los residuos de aminoácidos 93 a 97, tal como al menos uno de los residuos de aminoácidos 98 a 103, tal como al menos uno de los residuos de aminoácidos 104 a 105, tal como al menos uno de los residuos de aminoácidos 106 a 135, tal como al menos uno de los residuos de aminoácidos 136 a 139, tal como al menos uno de los residuos de aminoácidos 140 a 164, tal como al menos uno de los aminoácidos residuos ácidos 165 a 167 de PCSK9 (SEQ ID NO: 1).

En algunas realizaciones de la presente divulgación, el compuesto reconoce específicamente y se une a una región que comprende al menos uno de los residuos de aminoácidos 78 a 92, tal como los residuos de aminoácidos 93 a 97, tal como los residuos de aminoácidos 98 a 103, tal como los residuos de aminoácidos 104 a 105, tal como los residuos de aminoácidos 106 a 135, tal como los residuos de aminoácidos 136 a 139, tal como los residuos de aminoácidos 140 a 164, tal como los aminoácidos residuos ácidos 165 a 167 de PCSK9 (SEQ ID NO: 1).

Por tanto, en una realización de la presente divulgación, el compuesto reconoce y se une específicamente a una región dentro del sitio de unión a HSPG de PCSK9 que comprende los residuos de aminoácidos 78 a 167. En otra realización de la presente divulgación, el compuesto reconoce y se une específicamente a una región dentro del sitio de unión a HSPG de PCSK9 que comprende los residuos de aminoácidos 78 a 95. En otra realización de la presente divulgación, el compuesto reconoce y se une específicamente a una región dentro del sitio de unión a HSPG de PCSK9 que comprende los residuos de aminoácidos 96 a 100. En otra realización de la presente divulgación, el compuesto reconoce y se une específicamente a una región dentro del sitio de unión a HSPG de PCSK9 que comprende los residuos de aminoácidos 101 a 105. En otra realización de la presente divulgación, el compuesto reconoce y se une específicamente a una región dentro del sitio de unión a HSPG de PCSK9 que comprende los residuos de aminoácidos 106 a 110. En otra realización de la presente divulgación, el compuesto reconoce y se une específicamente a una región dentro del sitio de unión a HSPG de PCSK9 que comprende los residuos de aminoácidos 111 a 115. En otra realización de la presente divulgación, el compuesto reconoce y se une específicamente a una región dentro del sitio de unión a HSPG de PCSK9 que comprende los residuos de aminoácidos 116 a 120. En otra realización de la presente divulgación, el compuesto reconoce y se une específicamente a una región dentro del sitio de unión a HSPG de PCSK9 que comprende los residuos de aminoácidos 121 a 125. En otra realización de la presente divulgación, el compuesto reconoce y se une específicamente a una región dentro del sitio de unión a HSPG de PCSK9 que comprende los residuos de aminoácidos 126 a 130. En otra realización de la presente divulgación, el compuesto reconoce y se une específicamente a una región dentro del sitio de unión a HSPG de PCSK9 que comprende los residuos de aminoácidos 131 a 135. En otra realización de la presente divulgación, el compuesto reconoce y se une específicamente a una región dentro del sitio de unión a HSPG de PCSK9 que comprende los residuos de aminoácidos 136 a 140. En otra realización de la presente divulgación, el compuesto reconoce y se une específicamente a una región dentro del sitio de unión a HSPG de PCSK9 que comprende los residuos de aminoácidos 141 a 145. En otra realización de la presente divulgación, el compuesto reconoce y se une específicamente a una región dentro del sitio de unión a HSPg de PCSK9 que comprende los residuos de aminoácidos 146 a 150. En otra realización de la presente divulgación, el compuesto reconoce y se une específicamente a una región dentro del sitio de unión a HSPG de PCSK9 que comprende los residuos de aminoácidos 151 a 155. En otra realización de la presente divulgación, el compuesto reconoce y se une específicamente a una región dentro del sitio de unión a HSPG de PCSK9 que comprende los residuos de aminoácidos 156 a 160. En otra realización de la presente divulgación, el compuesto reconoce y se une específicamente a una región dentro del sitio de unión a HSPG de PCSK9 que comprende los residuos de aminoácidos 161 a 167.

Por tanto, se proporciona un compuesto que se une a uno o más aminoácidos seleccionados de entre el grupo que consiste en R93, R96, R97, R104, R105, K136, H139, R165 y R167 de PCSK9 (SEQ ID NO: 1), tal como un aminoácido, tal como dos aminoácidos, tal como tres aminoácidos, tal como cuatro aminoácidos, tal como cinco aminoácidos, tal como seis aminoácidos, tal como siete aminoácidos, tal como ocho aminoácidos, tal como todos los aminoácidos seleccionados de entre el grupo que consiste en R93, R96, R97, R104, R105, K136, H139, R165 y R167 de PCSK9.

Por tanto, en una realización de la presente divulgación, el compuesto se une a R93 de PCSK9. En otra realización de la presente divulgación, el compuesto se une a R96 de PCSK9. En otra realización de la presente divulgación, el compuesto se une a R97 de PCSK9. En otra realización de la presente divulgación, el compuesto se une a R104 de PCSK9. En otra realización de la presente divulgación, el compuesto se une a R105 de PCSK9. En otra realización de la presente divulgación, el compuesto se une a K136 de PCSK9. En otra realización de la presente divulgación, el compuesto se une a H139 de PCSK9. En otra realización de la presente divulgación, el compuesto se une a R165 de PCSK9. En otra realización de la presente divulgación, el compuesto se une a R167 de PCSK9.

En una realización de la presente divulgación, el compuesto se une a R96 y a R97 de PCSK9. En otra realización de la presente divulgación, el compuesto se une a R104 y R105 de PCSK9. En otra realización de la presente divulgación, el compuesto se une a K136 y H139 de PCSK9. En otra realización de la presente divulgación, el compuesto se une a R93 y H139 de PCSK9. En otra realización de la presente divulgación, el compuesto se une a R93, R104, R105 y H139 de PCSK9. En otra realización de la presente divulgación, el compuesto se une a R165 y R167 de PCSK9. En otra realización de la presente divulgación, el compuesto se une a R93, R96, R97, R104, R105 y H139 de PCSK9.

Niveles de rLDL y c-LDL

La unión del compuesto descrito en esta solicitud PCSK9 da lugar a una unión reducida de PCSK9 a rLDL en comparación con la unión en ausencia de dicho compuesto. Esto a su vez da lugar a niveles aumentados de rLDL de células derivadas de una línea celular que expresa rLDL, tal como una línea celular derivada de hepatocitos, por ejemplo, en su superficie, en comparación con los niveles en ausencia de dicho compuesto.

En algunas realizaciones de la presente divulgación, el compuesto es un análogo de heparina como se definió anteriormente y su unión a PCSK9 da lugar a una unión reducida de PCSK9 a rLDL en comparación con la unión en ausencia de dicho análogo de heparina. Esto a su vez da lugar a niveles aumentados de rLDL de células derivadas de una línea celular que expresa rLDL, tal como una línea celular derivada de hepatocitos, en comparación con los niveles en ausencia de dicho análogo de heparina.

En algunas realizaciones de la presente divulgación, la unión del compuesto a PCSK9 da lugar a una degradación lisosomal disminuida de rLDL en comparación con la degradación en ausencia de dicho compuesto. En realizaciones específicas de la presente divulgación, el compuesto es un análogo de heparina como se definió anteriormente y la unión del análogo de heparina a PCSK9 da lugar a una degradación lisosomal disminuida de rLDL en comparación con la degradación en ausencia de dicho análogo de heparina.

En algunas realizaciones de la presente divulgación, la unión del compuesto a PCSK9 da lugar a niveles plasmáticos disminuidos de c-LDL en comparación con los niveles en ausencia de dicho compuesto. Se entenderá que el término "niveles plasmáticos de c-LDL-C" se refiere a los niveles de c-LDL en el plasma, es decir, la cantidad de proteína de c-LDL. En realizaciones específicas de la presente divulgación, el compuesto es un análogo de heparina como se definió anteriormente y la unión del análogo de heparina a PCSK9 da lugar a unos niveles plasmáticos disminuidos de c-LDL en comparación con los niveles en ausencia de dicho análogo de heparina.

Los niveles plasmáticos de c-LDL se pueden determinar in vivo o in vitro. Los procedimientos para determinar los niveles plasmáticos de c-LDL son conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, inmunoelectrotransferencia, inmunotinción, ELISA, ultracentrifugación, cromatografía líquida de proteínas rápida (FPLC) y determinación calorimétrica enzimática.

Trastornos del metabolismo de las lipoproteínas

En esta solicitud, se proporciona una composición que comprende un compuesto para su uso en el tratamiento de un trastorno del metabolismo de las lipoproteínas. Por consiguiente, también se proporciona en esta solicitud un uso del compuesto como se define en esta solicitud para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno del metabolismo de las lipoproteínas. También se describe el compuesto como se define anteriormente para su uso en un procedimiento de tratamiento de un trastorno del metabolismo de las lipoproteínas en un sujeto que lo necesite. La secuencia de PCSK9 puede variar de un sujeto a otro, por ejemplo, en algunos individuos se pueden encontrar SNP específicos de un individuo que pueden llevar a sustituciones conservadoras. Se entenderá que los compuestos que inhiben la unión de HSPG a tales variantes de PCSK9 también se encuentran dentro del alcance de la divulgación. En algunas realizaciones de la presente divulgación, el trastorno del metabolismo de las lipoproteínas está relacionado con niveles plasmáticos anormales de PCSK9. En otras realizaciones de la presente divulgación, el trastorno del metabolismo de las lipoproteínas está relacionado con niveles anormales de rLDL en la superficie de células que expresan rLDL tales como hepatocitos. El trastorno del metabolismo de las lipoproteínas también puede estar relacionado con niveles plasmáticos anormales de PCSK9 y niveles anormales de rLDL en la superficie de las células que expresan rLDL, tales como hepatocitos. Los niveles plasmáticos de PCSK9 varían en humanos de 30 a 3000 ng/ml. Los niveles plasmáticos anormales de PCSK9 se refieren a niveles plasmáticos de PCSK9 que son significativamente diferentes de los niveles promedio en un individuo sano. En algunas realizaciones de la presente divulgación, el nivel plasmático anormal de PCSK9 es significativamente más alto que el nivel promedio en un individuo sano. Asimismo, los niveles anormales de rLDL en la superficie de, por ejemplo, los hepatocitos se refieren a niveles de rLDL que son significativamente diferentes de los niveles promedio en un individuo sano. En algunas realizaciones de la presente divulgación, el nivel de rLDL anormal en la superficie de las células que expresan rLDL, tales como hepatocitos, es significativamente más bajo que el nivel promedio en un individuo sano.

En algunas realizaciones de la presente divulgación, el trastorno se caracteriza por niveles anormales de c-LDL, en particular, por niveles elevados de c-LDL.

Los trastornos del metabolismo de las lipoproteínas son trastornos de la homeostasis lipídica y trastornos asociados con la misma e incluyen, a modo de ejemplo, hipercolesterolemia, hipercolesterolemia familiar, dislipidemia, hiperlipidemia, hipertrigliceridemia, sitosterolemia, aterosclerosis, arteriosclerosis, cardiopatía coronaria, síndrome metabólico, síndrome coronario agudo, xantoma, hipertensión, angina, obesidad, diabetes, inflamación vascular y sepsis. Dichos trastornos los pueden provocar, por ejemplo, defectos en las proteínas estructurales de las partículas de lipoproteínas, en los receptores celulares que reconocen los varios tipos de lipoproteínas o en las enzimas que descomponen las grasas. Como resultado de tales defectos, los lípidos se pueden depositar en las paredes de los vasos sanguíneos.

La hipercolesterolemia (o dislipidemia) es la presencia de niveles altos de colesterol en la sangre. Es una forma de hiperlipidemia (niveles elevados de lípidos en la sangre) e hiperlipoproteinemia (niveles elevados de lipoproteínas en la sangre). La dislipidemia mixta son elevaciones en los niveles de colesterol de las LDL y triglicéridos que, a menudo, van acompañadas de niveles bajos de colesterol de las HDL. La hipercolesterolemia familiar es un trastorno genético provocado por mutaciones en el gen de rLDL y se caracteriza por niveles altos de colesterol, especialmente colesterol de las LDL, en la sangre.

La hipertrigliceridemia denota niveles altos de triglicéridos en sangre. Los niveles elevados de triglicéridos se asocian con aterosclerosis, incluso en ausencia de hipercolesterolemia, y predisponen a enfermedades cardiovasculares. Los niveles muy altos de triglicéridos también aumentan el riesgo de padecer pancreatitis aguda.

La sitosterolemia o fitosterolemia es un trastorno metabólico de lípidos hereditario autosómico recesivo raro que se caracteriza por hiperabsorción y excreción biliar disminuida de esteroles de la dieta que lleva, por ejemplo, a hipercolesterolemia, xantomas tendinosos y tuberosos, desarrollo prematuro de aterosclerosis.

La aterosclerosis (también conocida como enfermedad vascular arteriosclerótica o EVA) es una forma específica de arteriosclerosis en la que la pared de una arteria se engrosa como resultado de la invasión y acumulación de glóbulos blancos, que contiene tanto glóbulos blancos activos y vivos (que producen inflamación) como residuos de células muertas, que incluyen colesterol y triglicéridos. La aterosclerosis es, por lo tanto, un síndrome que afecta a los vasos sanguíneos arteriales debido a una respuesta inflamatoria crónica de los glóbulos blancos en las paredes de las arterias.

La arteriesclerosis es una afección que implica el engrosamiento, endurecimiento y pérdida de elasticidad de las paredes de las arterias.

La cardiopatía coronaria, también conocida como enfermedad arterial aterosclerótica, enfermedad cardiovascular aterosclerótica, cardiopatía coronaria o cardiopatía isquémica, es el tipo más común de cardiopatía y causa de infartos de miocardio. La enfermedad la provoca la acumulación de placa a lo largo de las paredes internas de las arterias del corazón, lo que estrecha la luz de las arterias y reduce la circulación sanguínea al corazón.

El síndrome metabólico es un trastorno de la utilización y el almacenamiento de energía, diagnosticado por la coexistencia de tres de cada cinco de las siguientes afecciones médicas: obesidad abdominal (central), presión arterial elevada, glucosa plasmática en ayunas elevada, triglicéridos séricos elevados y niveles bajos de colesterol de alta densidad. El síndrome metabólico aumenta el riesgo de desarrollar enfermedades cardiovasculares, en particular, insuficiencia cardíaca y diabetes. El síndrome metabólico se conoce también como síndrome metabólico X, síndrome cardiometabólico, síndrome de resistencia a la insulina, síndrome de Reaven o el síndrome obstructivo congénito de las vías respiratorias (CHAOS) (en Australia). El síndrome metabólico y la prediabetes parecen ser el mismo trastorno, solo diagnosticado por un conjunto diferente de biomarcadores.

El síndrome coronario agudo se refiere a un grupo de afecciones debido a la disminución de la circulación sanguínea en las arterias coronarias, de modo que parte del músculo cardíaco no puede funcionar correctamente o muere. Un xantoma es una manifestación cutánea de lipidosis en la que los lípidos se acumulan en grandes células espumosas dentro de la piel. Los xantomas se asocian con hiperlipidemias.

La hipertensión o presión arterial alta, a veces denominada hipertensión arterial, es una afección médica crónica en la que se eleva la presión arterial en las arterias.

La angina de pecho (o angina) se refiere a una sensación de dolor, presión u opresión en el pecho, a menudo debido a la isquemia del músculo cardíaco por obstrucción o espasmo de las arterias coronarias. Aunque la angina de pecho puede derivar de anemia, arritmias cardíacas e insuficiencia cardíaca, su principal causa es la arteriopatía coronaria. La obesidad es una afección médica en la que se ha acumulado un exceso de grasa corporal en la medida en que puede tener un efecto negativo en la salud, lo que lleva a una reducción de la esperanza de vida y/o a un aumento en los problemas de salud, tal como mayor riesgo de padecer cardiopatía, diabetes de tipo 2, apnea obstructiva del sueño, ciertos tipos de cáncer y osteoartritis.

La diabetes mellitus, comúnmente conocida como diabetes, es un grupo de enfermedades metabólicas en las que hay niveles altos de azúcar en sangre durante un periodo prolongado. Existen diversos tipos de diabetes, que incluyen diabetes de tipo 1, diabetes de tipo 2 y diabetes gestacional. La diabetes de tipo 1 se caracteriza por la pérdida de las células p productoras de insulina de los islotes de Langerhans en el páncreas, lo que da lugar a una deficiencia de insulina. La diabetes de tipo 2 se caracteriza por resistencia a la insulina, que se puede combinar con una secreción de insulina relativamente reducida. Se cree que la respuesta defectuosa de los tejidos corporales a la insulina implica al receptor de la insulina. La diabetes gestacional, que se asemeja a la diabetes de tipo 2, se produce en aproximadamente el 2-10 % de todos los embarazos.

La sepsis es una complicación potencialmente mortal de una infección que surge cuando la respuesta del cuerpo a la infección daña sus propios tejidos y órganos. Durante la infección, los receptores de LDL también participan en la eliminación de lípidos bacterianos, tales como lipopolisacáridos, de la circulación. La inhibición de PCSK9 puede ser una estrategia útil para aumentar el aclaramiento de lípidos patógenos en el tratamiento de pacientes con sepsis (Walley y col., 2016).

Tratamiento de un trastorno metabólico de las lipoproteínas

Un individuo o un sujeto que necesita tratamiento de un trastorno del metabolismo de las lipoproteínas es un individuo que padece, se sospecha que padece o corre el riesgo de padecer un trastorno del metabolismo de las lipoproteínas. En algunas realizaciones de la presente divulgación, el individuo que necesita tratamiento es un mamífero, preferiblemente un ser humano.

En realizaciones preferidas de la presente divulgación, el trastorno del metabolismo de las lipoproteínas se selecciona de entre el grupo que consiste en dislipidemia, hipercolesterolemia y cardiopatías coronarias. En una realización preferida de la presente divulgación, el trastorno del metabolismo de las lipoproteínas son cardiopatías coronarias. En algunas realizaciones de la presente divulgación, el tratamiento es profiláctico.

En algunas realizaciones de la presente divulgación, el tratamiento comprende una etapa de administrar a dicho sujeto un compuesto como se describe en esta solicitud. El compuesto se puede administrar en una dosis diaria de entre 0,1 mg y 1000 mg por kg de peso corporal. Por tanto, en algunas realizaciones de la presente divulgación, el compuesto se administra a una dosis diaria de entre 0,1 mg y 1000 mg por kg de peso corporal, tal como entre 0,2 y 900 mg por kg de peso corporal, tal como entre 0,3 y 800 mg por kg de peso corporal, tal como entre 0,5 y 700 mg por kg de peso corporal, tal como entre 1,0 y 500 mg por kg de peso corporal, tal como entre 5 y 400 mg por kg de peso corporal, tal como entre 10 y 300 mg por kg de peso corporal, tal como entre 25 y 250 mg por kg de peso corporal, tal como entre 50 y 200 mg por kg de peso corporal, tal como entre 75 y 150 mg por kg de peso corporal, tal como entre 100 y 125 mg por kg de peso corporal. Por tanto, en algunas realizaciones de la presente divulgación, el compuesto se administra a una dosis diaria de entre 0,1 mg y 1000 mg por kg de peso corporal, tal como entre 0,1 y 10 mg por kg de peso corporal, tal como entre 10 y 25 mg por kg de peso corporal, tal como entre 25 y 50 mg por kg de peso corporal, tal como entre 50 y 100 mg por kg de peso corporal, tal como entre 100 y 250 mg por kg de peso corporal, tal como entre 250 y 500 mg por kg de peso corporal, tal como entre 500 y 750 mg por kg de peso corporal, tal como entre 750 y 1000 mg por kg de peso corporal.

El origen subyacente a las indicaciones que se van a tratar según la presente divulgación es un aumento de los niveles de c-LDL en la sangre del paciente. Por tanto, en un aspecto, la presente divulgación se refiere a un procedimiento para inhibir la degradación de rLDL, que da lugar a un aumento de la unión de c-LDL a dicho rLDL. Por tanto, el paciente se trata mediante la administración de un compuesto como se define en la fórmula general (I).

Por consiguiente, en esta solicitud, se proporciona un procedimiento para reducir los niveles plasmáticos de c-LDL de un sujeto que lo necesita, dicho procedimiento comprende la etapa de administrar a dicho sujeto un compuesto o una composición farmacéutica como se define en esta solicitud. Los niveles plasmáticos de c-LDL se pueden determinar in vivo o in vitro mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica, como se describe anteriormente.

En un aspecto, la divulgación se refiere a un procedimiento para reducir los niveles de lipoproteínas plasmáticas en un sujeto que lo necesita, dicho procedimiento comprende la etapa de administrar a dicho sujeto un compuesto o una composición farmacéutica como se define en esta solicitud.

Composición farmacéutica

En esta solicitud, también se describe una composición farmacéutica que comprende al menos un compuesto como se define en esta solicitud. En algunas realizaciones de la presente divulgación, la composición comprende un compuesto como se describe en esta solicitud. En otras realizaciones de la presente divulgación, la composición comprende dos compuestos o más, tal como tres compuestos o más, tal como cuatro compuestos o más, tal como cinco compuestos o más.

En algunas realizaciones de la presente divulgación, la composición comprende al menos uno de:

- un anticuerpo que inhibe la unión de PCSK9 a rLDL;

- una estatina;

- colestiramina;

- un inhibidor de la absorción de colesterol, por ejemplo, ezetimiba.

En algunas realizaciones de la presente divulgación, el compuesto se administra en combinación con otro compuesto, tal como un anticuerpo anti-PCSK9, tal como un anticuerpo que se une al sitio de unión a rLDL de PCSK9, o una estatina. En algunas realizaciones de la presente divulgación, el compuesto se administra junto con un anticuerpo seleccionado de entre el grupo que consiste en: lodelcizumab, ralpancizumab, alirocumab, evolocumab y bococizumab.

Por tanto, en algunas realizaciones de la presente divulgación, la composición farmacéutica comprende al menos un compuesto como se define en esta solicitud y al menos un compuesto adicional seleccionado de entre el grupo que consiste en un anticuerpo que inhibe la unión de PCSK9 a rLDL, una estatina o colestiramina. En una realización de la presente divulgación, la composición farmacéutica comprende un compuesto como se define en esta solicitud y un anticuerpo que inhibe la unión de PCSK9 a rLDL. En una realización de la presente divulgación, la composición farmacéutica comprende un compuesto como se define en esta solicitud y una estatina. En una realización de la presente divulgación, la composición farmacéutica comprende un compuesto como se define en esta solicitud y colestiramina. En una realización de la presente divulgación, la composición farmacéutica comprende un compuesto como se define en esta solicitud, un anticuerpo que inhibe la unión de PCSK9 a rLDL y una estatina. En una realización de la presente divulgación, la composición farmacéutica comprende un compuesto como se define en esta solicitud, un anticuerpo que inhibe la unión de PCSK9 a rLDL y colestiramina. En una realización de la presente divulgación, la composición farmacéutica comprende un compuesto como se define en esta solicitud, colestiramina y una estatina. En una realización de la presente divulgación, la composición farmacéutica comprende un compuesto como se define en esta solicitud, un anticuerpo que inhibe la unión de PCSK9 a rLDL, una estatina y colestiramina.

La composición farmacéutica comprende opcionalmente uno o más excipientes vehículo farmacéuticamente aceptables y se prepara mediante técnicas convencionales, por ejemplo, como se describe en Remington: The Science and Practice of Pharmacy 1995, editado por E. W. Martin, Mack Publishing Company, 19.a edición, Easton, Pa. Las composiciones pueden aparecer en formas convencionales, por ejemplo cápsulas, comprimidos, aerosoles, soluciones, suspensiones o aplicaciones tópicas. Típicamente, las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación se formulan para administración parenteral, por ejemplo, inyección intravenosa o subcutánea, y se pueden presentar en forma de dosis unitaria en ampollas, jeringas precargadas, infusión de pequeño volumen o en envases multidosis, opcionalmente con un conservante añadido. Las composiciones pueden tomar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, por ejemplo, soluciones en polietilenglicol acuoso. Las composiciones pueden ser adecuadas para la ingesta oral. Esto es particularmente relevante para las composiciones de moléculas pequeñas. Los ejemplos de vehículos, diluyentes, disolventes o excipientes líquidos aceitosos o no acuosos incluyen propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales (por ejemplo, aceite de oliva) y ésteres orgánicos inyectables (por ejemplo, oleato de etilo), y pueden contener agentes de fórmula tales como agentes conservantes, humectantes, emulsionantes o de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes. De forma alternativa, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo, obtenido por aislamiento aséptico de sólido estéril o por liofilización de una solución, para constituir antes de su uso con un excipiente líquido adecuado, por ejemplo, agua estéril, libre de pirógenos. Los aceites útiles en formulaciones parenterales incluyen aceites de petróleo, animales, vegetales o sintéticos. Los ejemplos específicos de aceites útiles en tales formulaciones incluyen cacahuete, soja, sésamo, semillas de algodón, maíz, oliva, vaselina y minerales. Los ácidos grasos adecuados para su uso en formulaciones parenterales incluyen ácido oleico, ácido esteárico y ácido isoesteárico. El oleato de etilo y el miristato de isopropilo son ejemplos de ésteres de ácidos grasos adecuados. Las formulaciones parenterales típicamente contendrán de aproximadamente un 0,0001 a aproximadamente un 25 %, tal como de aproximadamente un 0,5 a aproximadamente un 25 %, en peso del ingrediente activo en solución. Se pueden usar conservantes y tampones. Para minimizar o eliminar la irritación en el lugar de la inyección, tales composiciones pueden contener uno o más tensioactivos no iónicos que tengan un equilibrio hidrófilo-lipófilo (EHL) de aproximadamente 12 a aproximadamente 17. La cantidad de tensioactivo en tales formulaciones oscilará típicamente de aproximadamente un 0,000001 a aproximadamente un 15 % en peso, tal como de aproximadamente un 0,000001 a aproximadamente un 5 % en peso o de aproximadamente un 5 a aproximadamente un 15 % en peso. Los tensioactivos adecuados incluyen ésteres de ácidos grasos de polietilensorbitán, tales como monooleato de sorbitán y los aductos de óxido de etileno de alto peso molecular con una base hidrófoba, formados por condensación de óxido de propileno con propilenglicol. Las formulaciones parenterales se pueden presentar en envases sellados de dosis unitarias o multidosis, tales como ampollas y viales, y se pueden almacenar en un estado liofilizado (criodesecadas) que requiere solamente la adición del excipiente líquido estéril, por ejemplo, agua, para inyecciones, inmediatamente antes de su uso.

Sin embargo, la vía principal de administración del fármaco según esta divulgación es parenteral para introducir el agente en el torrente sanguíneo para dirigirse en última instancia al tejido relevante.

En una realización de la presente divulgación, el agente se administra para atravesar cualquier membrana mucosa de un animal al que se va a administrar la sustancia biológicamente activa, por ejemplo, en la nariz, vagina, ojos, boca, aparato genital, pulmones, tubo gastrointestinal, o recto, preferiblemente la mucosa de la nariz o la boca.

En una realización preferida de la presente divulgación, el agente de la divulgación se administra por vía parenteral, es decir, por administración intravenosa, intramuscular, intraespinal, subcutánea, intranasal, intrarrectal, intravaginal o intraperitoneal. En general, se prefieren las formas subcutánea e intramuscular de administración parenteral. Las formas galénicas apropiadas para tal administración se pueden preparar mediante técnicas convencionales. Los compuestos también se pueden administrar por inhalación, que es por administración por inhalación intranasal y oral. Las formas galénicas apropiadas para tal administración, tales como una formulación en aerosol o un inhalador dosificador, se pueden preparar mediante técnicas convencionales.

En una realización de la presente divulgación, la composición farmacéutica según la presente divulgación se formula para administración parenteral tal como por inyección.

En una realización adicional de la presente divulgación, la composición farmacéutica según la presente divulgación se formula para administración intravenosa, intramuscular, intraespinal, intraperitoneal, subcutánea, en bolo o continua. El médico puede determinar la velocidad y la frecuencia de la administración de un caso a otro. En una realización de la presente divulgación, la administración se produce a intervalos de 30 minutos a 24 horas, tal como a intervalos de 1 a 6 horas, tal como una vez al día.

La duración del tratamiento puede variar según la gravedad del trastorno. En una realización de la presente divulgación, la duración del tratamiento es de 1 día a 28 días, tal como de 2 días a 25 días, tal como de 5 días a 20 días, tal como de 7 días a 15 días. En casos crónicos, la duración del tratamiento puede ser de por vida.

La dosis la puede determinar el médico responsable en función de las características del paciente y del medio y modo de administración. En una realización de la presente divulgación, la dosis del compuesto activo de la composición farmacéutica, como se define en esta solicitud anteriormente, se encuentra entre 0,1 mg y 1000 mg por kg de peso corporal.

La dosis se puede administrar como una administración en bolo o como una administración continua. En relación con la administración en bolo, la composición farmacéutica se puede administrar a intervalos de 30 minutos a 24 horas, tal como una vez al día.

En algunas realizaciones de la presente divulgación, el pH de la composición se encuentra entre pH 4 y pH 10. En otras realizaciones de la presente divulgación, la composición se formula para la administración oral.

En otras realizaciones de la presente divulgación, la composición se formula para la administración parenteral. En realizaciones específicas de la presente divulgación, la administración parenteral es mediante inyección. Tal administración parenteral puede ser intravenosa, intramuscular, intraespinal, intraperitoneal, subcutánea, un bolo o una administración continua.

En una realización de la presente divulgación, el compuesto descrito en esta solicitud es un análogo de heparina estable en suero.

En esta solicitud, también se proporciona un compuesto como se define anteriormente que no es tóxico, en particular después de la administración. En algunas realizaciones de la presente divulgación, el compuesto es un análogo de heparina que no es tóxico después de la administración.

Ejemplos

Ejemplo 1: cartografía del sitio de unión a HSPG en PCSK9

Examinamos la superficie electrostática de PCSK9 (PDB: 2PMW) (Fig. 2B), e identificamos un sitio de unión a heparina putativo compuesto por seis residuos básicos expuestos en la superficie ubicados en el prodominio de PCSK9. El sitio de unión está formado por residuos de arginina (R) en la posición 93, 96, 97, 104 y 105 e histidina (H) en la posición 139, que muestran un pareamiento perfecto con grupos sulfato de un pentasacárido de heparina (SANORG) (Herbert y col., 1996) (Herbert y col., 1996) (Fig. 2B y 2C). El sitio se encuentra opuesto a la superficie de unión a rLDL ubicada en el dominio catalítico inactivo de PCSK9 (Fig. 2A). El acoplamiento del fragmento de heparina a una estructura cocristalina de PCSK9 en complejo con rLDL (PDB:3P5B) sugirió que la unión del heparán sulfato permite la formación del complejo PCSK9:rLDL posterior (Fig. 3C).

Ejemplo 2: el tratamiento con heparinasa inhibe la asociación de la superficie celular de PCSK9 in vitro y protege al receptor de LDL contra la degradación inducida por PCSK9 in vivo

Especulamos que HSPG podría estar involucrado en la captura de PCSK9. Por tanto, tratamos células HepG2 derivadas de hepatocitos humanos que expresan de forma estable PCSK9 con heparinasa I. La enzima heparinasa I escinde las cadenas de GAG de heparán sulfato en el enlace 1,4 O entre el ácido urónico y la N-acetil-D-glucosamina, eliminando así las cadenas de heparán sulfato de la superficie celular.

Se sembraron células HepG2 transfectadas de forma estable con PCSK9 a 50.000 células por cubreobjetos y se incubaron durante la noche antes de añadir heparinasa I (Sigma Aldrich/H2519) en PBS (0,0002 UN/ml) o PBS solo. Las células se incubaron durante 1 h a 37 °C, antes de la fijación en paraformaldehído al 4 % e inmunotinción de células no permeabilizadas con anticuerpos primarios y secundarios. Los núcleos se visualizaron con colorante Hoechst (Sigma Aldrich). Las imágenes se adquirieron en un Zeiss LSM780.

De hecho, el tratamiento dio lugar a una disminución marcada en la intensidad de la tinción de la superficie de PCSK9, lo que sugiere que los HSPG son esenciales para la unión de las células de PCSK9 (Fig. 2D).

Para someter a prueba el efecto de la eliminación enzimática de los GAG de heparán sulfato sobre la actividad de PCSK9 in vivo, se infundió heparinasa I (30 U) a ratones BALB6/cJRj macho de 10-12 semanas de edad administrada a través de un catéter en la vena de la cola 5 minutos antes de la inyección de PCSK9 (10 pg). En los ratones de control, la inyección de heparinasa y/o la inyección de PCSK9 se sustituyó por una inyección de solución salina al 0,9 %. Durante la infusión de heparinasa, los ratones se anestesiaron ligeramente con isoflurano administrado continuamente a través de una máscara. Una hora después de la inyección, se sacrificaron los ratones y se recogieron muestras de tejido hepático y se ultracongelaron antes de la extracción de proteínas y la evaluación de los niveles de rLDL mediante inmunoelectrotransferencia (Fig.10 A). La inyección de heparinasa I protegió completamente al rLDL de la degradación inducida por PCSK9, lo que muestra que los HSPG son fundamentales en la degradación inducida por PCSK9 de rLDL in vivo (Fig. 10 A y B).

Para verificar la interacción directa entre PCSK9 y las cadenas de GAG de heparán sulfato, empleamos cromatografía de afinidad usando microesferas de sefarosa acopladas covalentemente con heparina.

Se cargó PCSK9 purificada en una columna HiTrap Heparin HP de 5 ml (GE Healthcare) en PBS. La columna se conectó a un Ákta Prime y se lavó con 5 volúmenes de columna de NaH2PO410 mM (pH 7,4). Se eluyó PCSK9 usando un gradiente lineal de NaH2PO410 mM (pH 7,4) y NaCl 2 M y las fracciones se analizaron mediante SDS-PAGE. En función de la conductividad medida, el perfil de elución se transformó en función de la concentración de NaCl usando el coeficiente de transformación 0,065 mS/mM de NaCl. La PCSK9 purificada se retuvo en la columna de heparina y se eluyó a una concentración de NaCl de aproximadamente 500 mM (Fig. 2E), lo que indicó una interacción fuerte y altamente específica con la heparina.

En un experimento diferente, se incubó medio acondicionado de células HepG2 o células CHO transfectadas con variantes de PCSK9 de interés con microesferas de Heparin Sepharose CL-6B (GE Healthcare) en NaH2PO410 mM (tampón de unión). Después de la incubación durante la noche en un rotor a 4 °C, las microesferas se lavaron en tampón de unión antes de la elución discontinua de proteínas ligadas a heparina en una concentración creciente de NaCl. Se evaluó la PCSK9 en las fracciones de entrada, flujo y elución mediante inmunoelectrotransferencia.

Descubrimos que la PCSK9 endógena del medio acondicionado de células HepG2 también se ligaba a la heparina y mostraba un perfil de elución similar al de ApoE, una proteína de unión a HSPG bien establecida (Fig. 3D).

Ejemplo 3: identificación de residuos importantes para la interacción PCSK9IHSPG

Para delimitar aún más los residuos esenciales implicados en la interacción PCSK9/HSPG, se clonaron y expresaron variantes de PCSK9 con mutaciones puntuales en el motivo de unión a HSPG. Las mutaciones se introdujeron mediante PCR para reemplazar el aminoácido cargado arginina (Arg/R), lisina (Lys/K) e histidina (His/H) identificado por acoplamiento de modelo de estructura 3D por residuos neutros como alaninas (Ala/A).

Se analizaron el tipo natural humano y las siguientes variantes de sustitución de alanina: PCSK9 natural (SEQ ID NO: 1)

Mutante R93

Mutante R96R97

Mutante R104R105

Mutante R165R167

Mutante R93R104R105H139A

Mutante R93R96R97R104R105H139

Dado que la PCSK9 plegada inadecuadamente en general no se escinde en el propéptido y, por lo tanto, se retiene en el retículo endoplásmico, se puede evaluar el plegado correcto de las variantes mutantes de PCSK9 controlando su procesamiento y secreción. El procesamiento de proPCSK9 en proteína madura y la secreción de variantes de PCSK9 maduras se evaluaron mediante transfección transitoria de células de ovario de hámster chino (CHO) seguido de análisis por inmunoelectrotransferencia de PCSK9 en lisados celulares y en el medio circundante (figura 3A). La capacidad de las proteínas mutantes de PCSK9 para unirse a la heparina se evaluó mediante cromatografía de afinidad seguida de inmunoelectrotransferencia con anticuerpo anti-PCSK9.

Se incubó medio acondicionado de células CHO transfectadas con variantes de PCSK9 de interés con microesferas de Heparin Sepharose CL-6B (GE Healthcare) en NaH2PO4 10 mM (tampón de unión). Después de la incubación durante la noche en un rotor a 4 °C, las microesferas se lavaron en tampón de unión antes de la elución discontinua de proteínas ligadas a heparina en una concentración creciente de NaCl. Se evaluó la PCSK9 en las fracciones de entrada, flujo y elución mediante inmunoelectrotransferencia.

Los mutantes R93, R96R97 y R104R105 muestran menos afinidad por la heparina en comparación con la PCSK9 natural o el mutante R165R167, y los mutantes R93R104R105H139 y R93R96R97R104R105H139 no se unen a la heparina y se encuentran exclusivamente en el flujo (figura 3B).

Ejemplo 4: la variante de PCSK9 con dominio de unión a HSPG mutado no induce la degradación del receptor de LDL

Las variantes de PCSK9 purificadas se sometieron a prueba en un ensayo en células aisladas para someter a prueba su capacidad para inducir la degradación de rLDL en comparación con PCSK9 natural. La inducción de la degradación de rLDL se analizó mediante la incubación de células HepG2 con PCSK9 natural o los mutantes de PCSK9 anteriores y los niveles de rLDL se evaluaron mediante inmunoelectrotransferencia. Se sembraron células HepG2 a una densidad de 250.000 células por pocillo en placas de 12 pocillos. Después de la incubación durante la noche, el medio se reemplazó con medio fresco que contenía PCSK9 natural o R93R96R97R104R105H139 mutante. Las células se recogieron y lisaron después de 18 horas de incubación y se evaluaron los niveles de rLDL mediante inmunoelectrotransferencia y cuantificación mediante densitometría.

Los niveles de rLDL en células incubadas con R93R96R97R104R105H139 mutante fueron más altos de forma marcada (aproximadamente dos veces) en comparación con los niveles medidos en células incubadas con PCSK9 natural (figura 4A y B), lo que muestra que las mutaciones dentro del dominio de unión a HSPG dieron lugar a una degradación de rLDL reducida inducida por PCSK9.

Ejemplo 5: la heparina y los análogos de heparina impiden que se forme el complejo PCSK9:rLDL Usando el ensayo de ligadura de proximidad (PLA), sometimos a prueba si la heparina añadida exógenamente compite con la HSPG de la superficie celular por la unión a PCSK9 endógena y, por lo tanto, impide la formación del complejo PCSK9:rLDL (Soderberg y col., 2006).

El PLA (Duolink®II, Olink Bioscience) se realizó según el protocolo del fabricante usando anti-PCSK9 (R&D systems/AF3888) y anti-rDL (Abcam/ab52818) como anticuerpos primarios. PCSK9 y rLDL ubicados a 30 nm entre sí se visualizan mediante anticuerpos secundarios conjugados con oligonucleótidos que se hibridan con oligonucleótidos formadores de círculos cebando así la amplificación del círculo rodador. El ADN amplificado se visualiza mediante la adición de oligonucleótidos complementarios marcados con fluorescencia (Soderberg y col., 2006).

Usando este ensayo con PCSK9 y rLDL de la superficie celular endógena en células HepG2 no permeabilizadas, se observaron abundantes grupos de complejos PCSK9:rLDL (Fig. 5D). Estos se redujeron de forma marcada tanto en número como en intensidad tras la incubación con heparina, lo que sugiere que la unión de PCSK9 a HSPG es fundamental en la formación posterior del complejo con rLDL de la superficie celular.

Descubrimos que la incubación de células HepG2 con heparina (50 U/ml durante 18 horas) dio lugar a un nivel dos o tres veces mayor de proteína de rLDL (Fig. 5A-5B), y se observó un efecto similar con otras dos preparaciones terapéuticas de heparinas de bajo peso molecular (Fig. 8A).

El aumento de rLDL celular en las células HepG2 tratadas con heparina fue dependiente de la dosis y vino acompañado de un marcado aumento de PCSK9 en el medio (Fig. 6B). La concentración de PCSK9 se midió usando el kit ELISA Quantikine Human (DPC900) de R&D Systems según el protocolo del fabricante.

El aumento de rLDL celular y PCSK9 extracelular inducido por heparina se produjo en el nivel postraduccional, ya que no se observó ningún cambio en el ARNm, excepto para PCSK9 a la concentración de heparina más alta (Fig. 6C). La extracción de ARN de células HepG2 se realizó usando el kit de preparación de ARN NucleoSpin (Macherey-Nagel), después de la síntesis de ADNc a partir de 0,5 pg de plantilla de ARN mediante el kit de síntesis de cDNA iScript™ (BIORAD). La PCR en tiempo real se realizó con la supermezcla iQ SYBR® Green y la polimerasa iTaq™ usando los siguientes cebadores para detectar transcripciones de rLDL (cebador directo 5'ACGGCGTCTCTTCCTATGACA3', cebador inverso

5'CCCTTGGTATCCGCAACAGA3'), PCSK9 (cebador directo

5'CCTGGAGCGGATTAC-CCCT3', cebador inverso

5'CTGTATGCTGGTGTCTAGGAGA3'), AND GAPDH (cebador directo

5'ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG3', cebador inverso 5'GCCATCACGCCACA-GTTTC3').

Descubrimos que 25 U/ml de heparina antagonizaron eficazmente la actividad de PCSK9 como resulta evidente a partir de un aumento de aproximadamente 2,5 veces en rLDL (Fig. 8B) a pesar del aumento de dos veces en el ARNm de PCSK9.

Las células HepG2 incubadas durante 24 h con heparina (50 U/ml) mostraron niveles aumentados de rLDL según se evalúo por inmunoelectrotransferencia (Figura 5^a). Los niveles de rLDL también se cuantificaron mediante densitometría. (n = 4) (Figura 5B). La incubación con heparina también dio lugar a un aumento de los niveles de PCSK9 en el medio medido por ^eLⁱSA (Figura 5C).

La heparina no interfiere con la interacción directa entre PCSK9 y rLDL según lo analizado por un ensayo de unión de PCSK9/rLDL (Figura 6 A) (BPS Bioscience) según el protocolo del fabricante. En resumen, los pocillos de la placa de microvaloración recubiertos con el dominio extracelular de rLDL se incubaron con PCSK9 biotinilada en presencia de heparina (5 o 50 U/ml) o anticuerpo anti-PCSK9 generado contra el dominio de unión a rLDL de PCSK9 (BPS Bioscience n.° 71207). Después del lavado, los pocillos se incubaron con estreptavidina marcada con peroxidasa de rábano picante (PRP) y se evaluó la unión de PCSK9 al dominio extracelular de rLDL mediante la adición de sustrato de PRP y la evaluación de la señal usando un lector de microplacas de quimioluminiscencia.

La interacción entre PCSK9 y rLDL no se vio afectada por la adición de heparina, lo que indica que la unión de heparina a PCSK9 da lugar a una degradación de rLDL reducida al evitar la interacción de PCSK9 con los HSPG de la superficie celular.

Las células HepG2 incubadas durante 24 h con Fondaparinux (Arixtra) (25, 100 o 250 pg/ml) mostraron niveles aumentados de rLDL según se evalúo por inmunoelectrotransferencia (Figura 7). Estos resultados indican que la unión de un análogo de heparina como Fondaparinux a PCSK9 da lugar a una degradación de rLDL reducida al impedir la interacción de PCSK9 con HSPG de la superficie celular.

Ejemplo 6: los miméticos de heparina impiden la interacción PCSK9:rLDL.

En los últimos 100 años, se han desarrollado diversas moléculas que imitan la estructura de la heparina para un número de aplicaciones terapéuticas, siete de las cuales se encuentran en uso clínico en la actualidad. Estas se denominan miméticos de heparina y pertenecen a diversas clases químicas, que incluyen varios oligosacáridos, oligonucleótidos y derivados de naftaleno. Sometimos a prueba un subconjunto de miméticos de heparina para determinar su capacidad para unirse a PCSK9 y aumentar el rLDL en las células HepG2 (Fig. 9).

Las afinidades de unión de equilibrio entre PCSK9 y ligandos (suramina, sulfato de dextrano 5000, dextrano 5000, pentosano sulfato y S-dC-36) se evaluaron mediante termoforesis a microescala (MST) (Jerabek-Willemsen y col., 2011). PCSK9 se marcó con el kit de marcado MO-L003 Monolith Blue-NHS (NanoTemper Technologies) y se logró una eficacia de marcado de una relación molar 1:1 de proteína a colorante. Se aplicó PCSK9 a una concentración final de 100 nM. El compañero de unión no marcado se valoró en diluciones 1:1 (en PBS Tween-20 al 0,05 %), donde las concentraciones más altas fueron 15,4 mM para suramina, 2,3 mM para sulfato de dextrano 5000, 2,3 mM para dextrano 5000, 16,3 mM para pentosano sulfato y 250 pM para S-dC-36. Las mediciones de MST se realizaron en capilares tratados con estándar (NanoTemper Technologies) en un instrumento Monolith NT.115 (NanoTemper Technologies) usando LED al 20 % y potencia de MST al 80 %. Los tiempos de encendido y apagado del láser fueron de 5 s y 35 s, respectivamente. Los controles negativos se realizaron usando 100 nM de PCSK9 marcado en tampón de MST en los 16 capilares en las mismas condiciones que las mencionadas anteriormente. Se obtuvieron las curvas de unión a partir de la fase de salto de temperatura a una potencia de MST del 80 % para suramina, dextrano sulfato 5000 y S-dC-36; y de termoferesis fase de salto de temperatura a una potencia MST del 80 % para pentosano sulfato. Para cada compañero de unión, las curvas de dosis-respuesta sigmoideas se ajustaron con GraphPad Prism 6 para producir un valor de KD promedio. Como se observó desactivación de la fluorescencia de PCSK9 en presencia de altas concentraciones de suramina, se realizó una prueba de desnaturalización pretratando PCSK9 con SDS al 10 % y, a continuación, calentando las muestras durante 15 min a 90 °C antes del análisis en el aparato de MST. Esto eliminó el efecto de desactivación, lo que indica que la desactivación de la fluorescencia de PCSK9 en condiciones no desnaturalizantes se debió a un acontecimiento real de unión al ligando.

Los oligosacáridos sulfatados sulfato de dextrano (Fig. 9C) y pentosano sulfato (Fig. 9F) se unieron directamente a PCSK9 según se determinó usando MST con una afinidad de 179,5 pM y 381,3 pM, respectivamente, y dieron lugar a un aumento dependiente de la dosis en la concentración rLDL celular (Fig. 9A-B y Fig. 9D-E), alcanzando una meseta de aproximadamente un 400 % en comparación con el control, y superior de forma marcada al efecto máximo de las estatinas en este ensayo. La interacción dependía de la presencia de grupos sulfato ya que el dextrano no sulfatado no mostró afinidad por PCSK9. El derivado de naftaleno sulfatado suramina, un fármaco antiparasitario en la tripanosomiasis africana, se une a PCSK9 con una afinidad de 190 pM (Fig. 9H), lo que dio lugar a un aumento de hasta quince veces del rLDL (Fig. 9A, 9G), acompañado de una captación celular aumentada de partículas de LDL marcadas con fluorescencia (Fig. 12). Además, sometimos a prueba una molécula de ADN monocatenario 36-mero (fosforotioato oligodesoxicitidina, S-dC-36) y descubrimos que se unía a PCSK9 con una KD de 4,8 pM (Fig. 9K) y mostraba potentes efectos inhibidores en este intervalo de concentración (Fig. 9I-J).

Ejemplo 7: PCSK9 muestra selectividad para una composición de azúcar específica y un patrón de sulfatación

Para diseccionar la especificidad y selectividad de la interacción de PCSK9 con azúcares cargados negativamente, analizamos la unión de PCSK9 a una micromatriz de glucanos que consta de glucanos de matriz extracelular sintéticos inmovilizados que incluyen una longitud de cadena definida y patrones de sulfatación de heparina (figura 14 A) y los glucosaminoglicanos relacionados queratán sulfato y dermatán sulfato.

Se preparó la micromatriz de glucanos de matriz extracelular que incluye oligosacáridos sintéticos de heparán sulfato/heparina, queratán sulfato, dermatán sulfato y heparina natural de 5 kDa (Santa Cruz) como se describe anteriormente usando una solución de manchado 250 pM (Hecht y col., 2009; de Paz y col., 2006). Después del manchado, los portaobjetos de las micromatrices se incubaron durante la noche en una cámara húmeda, seguido de tres etapas de lavado con agua y desactivación con solución de etanolamina 50 mM, pH 9, durante 1 hora a 50 °C para eliminar los grupos reactivos restantes. Los portaobjetos se lavaron tres veces con agua, se bloquearon a temperatura ambiente durante 1 h con de BSA en PBS al 1 % (p/v), pH 7,4 y se secaron por centrifugación (5 min, 300 x g). Se incubó PCSK9 (25 pg/ml) durante la noche a 4 °C diluida en BSA-PBS al 1 % (p/v) en una cámara húmeda. Después de tres etapas de lavado con Tween-PBS al 0,1 % (v/v), una incubación con 0,1 pg/ml del AcM anti-PCSK9 humanizado preincubado y 5 pg/ml de Alexa Fluor 647 (Life Technologies) de IgG anti-humano de cabra diluido en BSA-PBS al 1 % durante 1 h a temperatura ambiente. Los portaobjetos se lavaron tres veces con Tween-PBS al 0,1 % (v/v), se enjuagaron una vez con agua y se secaron por centrifugación. Para la adquisición de datos, los portaobjetos se escanearon con el escáner de micromatrices GenePix 4300 (Molecular Devices, Sunnyvale, Ca, EE. UU.) excitanto Alexa Fluor 647 a 635 nm. Se fijaron los valores del valor fotomultiplicador (PMT) para revelar los escaneos libres de saturación. Los valores medios de fluorescencia se determinaron con el software GenePix Pro 7 (Molecular Devices).

La PCSK9 mostró selectividad para repeticiones de disacáridos de heparina que consisten en [4)-a-GlcN-6,N-disulfato(1^4)-a-IdoA-2-sulfato-(i^] como resulta evidente por la unión de las subestructuras I y VII de heparán sulfato/heparina que abarcan tres y dos repeticiones, respectivamente (figura 14 B). Se requirió un mínimo de dos repeticiones para una unión eficiente, ya que no se observó unión para la subestructura de heparán sulfato/heparina que consta de una única repetición. La necesidad de grupos sulfato en el grupo amino de GlcN y de grupos sulfato enlazados al éster en el carbono 6 de GlcN y en el carbono 2 de IdoA también resultó evidente al comparar la unión a las subestructuras de heparán sulfato/heparina Heparina I, Heparina II y Heparina III.

Estos resultados demostraron la preferencia de PCSK9 por una composición de azúcar y un patrón de sulfatación específicos (Figura 14 B).

Ejemplo 8: las preparaciones terapéuticas de heparinas de bajo peso molecular protegen al rLDL contra la degradación inducida por PCSK9

Las células HepG2 incubadas durante la noche con la preparación de heparina de bajo peso molecular fragmin (1 100 U/ml) o Innohep (1-100 U/ml) mostraron niveles aumentados de rLDL según lo evaluado por inmunoelectrotransferencia (figura 8A). El efecto de fragmin e Innohep fue comparable al efecto de la heparina (Figura 5A) y el pentasacárido Arixtra (Figura 7).

Estos resultados muestran que el diseño de fármacos basado en la estructura usando el complejo heparina:PCKS9 como plantilla es una estrategia factible en el desarrollo de un inhibidor de PCSK9 de moléculas pequeñas.

Ejemplo 9: la heparina protege al rLDL contra la degradación inducida por PCSK9 in vivo

Se sometieron ratones (BALB6/cJRj) a una única administración intravenosa (vena de la cola) de 10 pg de PCSK9 recombinante humana sola o en combinación con heparina (50 U). Una hora después de la inyección, se sacrificaron los ratones y se recogieron los tejidos del hígado. El análisis por inmunoelectrotransferencia de rLDL en preparaciones de proteínas de membrana mostró un nivel significativamente más alto de rLDL hepático en ratones coinyectados con heparina en comparación con ratones inyectados con PCSK9 sola (Figura 8B, cuantificado en la Figura 8C).

Estos resultados muestran que la interacción PCSK9:heparina puede proporcionar un marco para el desarrollo de inhibidores de PCSK9 de moléculas pequeñas.

Ejemplo 10: reducción del colesterol de las LDL en un paciente que no responde al tratamiento con estatinas Se le receta a un paciente con colesterol de las LDL elevado un tratamiento con estatinas. El paciente no responde al tratamiento con estatinas. A continuación, se receta al paciente un tratamiento con inyecciones subcutáneas de 25 500 mg de una composición que comprende un análogo de heparina que se ha diseñado para bloquear el sitio de unión a HSPG en PCSK9 humana. Las inyecciones se realizan a intervalos de 1 a 28 días. Se observan reducciones marcadas en los niveles de c-LDL, lo que muestra que la administración parenteral de un análogo de heparina puede llevar a una reducción en los niveles de c-LDL en un paciente que no responde al tratamiento con estatinas.

Ejemplo 11: reducción del colesterol de las LDL usando un análogo de heparina dirigido contra el sitio de unión a HSPG de PCSK9

Se le receta a un paciente con niveles elevados de colesterol de las LDL la administración de un análogo de heparina que se ha diseñado para bloquear el sitio de unión a HSPG en PCSK9 humana. El compuesto se administra por vía oral a una dosis de 0,1-30 mg/kg. Se observan reducciones marcadas en los niveles de c-LDL, lo que muestra que la administración oral de un análogo de heparina diseñado para bloquear el sitio de unión a HSPG en PCSK9 humana puede llevar a una reducción en los niveles de c-LDL en un paciente.

Ejemplo 12: reducción del colesterol de las LDL en un paciente que no responde al tratamiento con estatinas Un paciente recibe tratamiento con estatinas para niveles elevados de c-LDL. Sin embargo, después de un descenso inicial en los niveles de c-LDL, y debido al aumento de la expresión de PCSK9 inducida por las estatinas, el tratamiento no logra reducir significativamente los niveles de c-LDL.

Además de la estatina, al paciente se le administra un compuesto que inhibe la unión de HSPG a PCSK9. La administración se produce semanalmente y con una dosis baja (25-150 mg) del compuesto en combinación con estatinas. Se observan reducciones marcadas en los niveles de c-LDL y se alcanza el nivel deseado de c-LDL. Este ejemplo muestra que complementar un tratamiento a base de estatinas con la administración de un análogo de heparina puede reducir con éxito los niveles de c-LDL.

Ejemplo 13: una PCSK9 con sitio de unión a HSPG mutado no logra aumentar los niveles de colesterol de las LDL

Los mutantes de unión a HSPG y PCSK9 natural se sobreexpresan en hígados de ratón mediante inyección hidrodinámica en la cola de plásmidos de expresión libres de dinucleótidos CG (Invivogen); estos plásmidos exhiben expresión a largo plazo en comparación con los plásmidos convencionales que son propensos a la inactivación por metilación de pares de bases CG. La sobreexpresión de PCSK9 natural induce una mayor degradación de rLDL, lo que da lugar a un colesterol de las LDL sérico elevado y, por lo tanto, se comporta como una variante de "ganancia de función". Los mutantes de HSPG de PCSK9 se comportan como variantes de "pérdida de función" que dan lugar a niveles séricos de colesterol de las LDL menos elevados debido a una degradación reducida del receptor de LDL. Los resultados demuestran el papel fundamental del dominio de unión a HSPG de PCSK9 para la degradación del receptor de LDL en animales.

Ejemplo 14: diseño de fármaco basado en la estructura de inhibidores de PCSK9 de moléculas pequeñas basado en la interacción de PCSK9 con heparina y miméticos de heparina

Los compuestos candidatos seleccionados entre heparinas de bajo peso molecular y análogos de heparina se someten a prueba para determinar su capacidad de inhibir la función de PCSK9 y aumentar los niveles de rLDL en un ensayo de cultivo de células HepG2. El análogo de heparina fondaparinux (nombre comercial Arixtra) se usa como compuesto de referencia. La información estructural obtenida se usa para derivar 3-5 modelos de farmacóforos, que se usan para cribar una base de datos existente de 3 millones de compuestos adquiribles. Se selecciona una colección basada en la diversidad de 50 compuestos para pruebas funcionales en células HepG2. Los inhibidores eficaces facilitan la calibración del modelo de acoplamiento molecular y un segundo cribado de compuestos adquiribles. Se seleccionan cincuenta compuestos para su compra y pruebas in vitro. Los tres candidatos más prometedores se someten a prueba posteriormente en un modelo de ratón para evaluar el efecto in vivo sobre los niveles de rLDL en el hígado y el colesterol en plasma.

Ejemplo 15: prueba de candidatos a inhibidor de PCSK9

Las pruebas preclínicas de los candidatos a inhibidor de PCSK9 se realizan usando un modelo de ratón heterocigótico para arteriopatía coronaria para rLDL (rLDL+/-) con expresión de PCSK9 humana bajo el control del promotor de PCSK9 murina endógena. Los animales alimentados con dieta de tipo occidental se tratan con inhibidores de PCSK9 durante un periodo de tiempo de 6-8 meses, antes de la evaluación de la zona de la placa aterosclerótica por microscopía después de la tinción con oil red O de los depósitos de grasa en la aorta diseccionada. La concentración plasmática de colesterol se evalúa mediante ELISA cada dos meses durante el experimento.

Estos estudios permitirán la evaluación de la capacidad de los candidatos a inhibidores de PCSK9 para reducir el colesterol sérico.

Ejemplo 16: el sulfato de dextrano y el pentosano protegen al rLDL de la degradación inducida por PCSK9 (ejemplo de referencia)

En la clase de miméticos de heparina de polisacáridos modificados, los compuestos de sulfato de dextrano (Figura 9 A-B) y pentosano (figura 9 D-E) se sometieron a prueba en un ensayo en células aisladas in vitro basado en HepG2. Después de la incubación durante la noche, los niveles de rLDL se evaluaron mediante inmunoelectrotransferencia, lo que mostró un aumento de rLDL dependiente de la concentración tras el tratamiento con sulfato de dextrano (0-200 pg/ml) con una regulación al alza de 3 veces de rLDL. La incubación de pentosano (0-200 pg/ml) dio lugar a un aumento de 4 veces de rLDL a concentraciones de 50 pg/ml.

Ejemplo 17: efecto del pentosano en los niveles hepáticos de rLDL (ejemplo de referencia)

Se inyecta pentosano-polisulfato en ratones que expresan PCSK9 humana para evaluar la capacidad de la sustancia para proteger al rLDL contra la degradación inducida por PCSK9. Estos estudios confirmarán que la administración de pentosano lleva a un aumento de los niveles de rLDL in vivo.

Ejemplo 18: efecto del pentosano sobre los niveles de colesterol sérico (ejemplo de referencia)

Los pacientes con colesterol sérico elevado se tratan con una inyección oral o subcutánea de pentosano polisulfato para evaluar la capacidad de la sustancia para reducir el colesterol sérico. El pentosano polisulfato se absorbe en el aparato digestivo con una mediana de 2 horas después de la ingestión de una dosis oral según el fabricante. A continuación, se miden los niveles de colesterol.

Estos estudios confirmarán que el pentosano lleva a una disminución de los niveles de colesterol sérico.

Ejemplo 19: efecto inhibidor de PCSK9 de fracciones de Innohep (ejemplo de referencia)

Innohep (heparina de bajo peso molecular) contiene fragmentos de heparina que oscilan en tamaño de 5000 a 8000 Da, y es un potente inhibidor de la actividad de PCSK9. Para identificar además los fragmentos inhibidores de PCSK9, Innohep se fraccionó mediante cromatografía de exclusión por tamaño (Figura 18 A). Las fracciones obtenidas se sometieron a prueba en un ensayo en células HepG2 aisladas para determinar su capacidad para inhibir PCSK9 y aumentar el nivel celular de rLDL (Figura 18 B). En este ensayo, se encontró que un número de fracciones aumentaba el nivel de rLDL (2-5 veces) después de una incubación durante la noche con una concentración de sacárido de 20 pM. El nivel más alto de rLDL se obtuvo con la fracción H6 mediante exclusión por tamaño, que, posteriormente, se sometió a cromatografía de intercambio aniónico fuerte (SAX) (Figura 19 A). Las células HepG2 se incubaron con las fracciones SAX obtenidas (500 nM) y se evaluaron los niveles de rLDL (Figura 19 B). Las fracciones SAX I1, I8 y I9 contienen fragmentos de heparina con actividad inhibidora de PCSK9 y aumentan los niveles de rLDL hasta 2 veces a la concentración sometida a prueba (500 nM).

Ejemplo 20: el Compuesto (X) inhibe la unión de PCSK9 a heparina en el ensayo Biacore

Se usó el análisis BIACORE usando chips sensores acoplados a albúmina (Sigma A4503) o heparina-albúmina (Sigma H0403) para evaluar la interacción entre PCSK9 y heparina. El análisis reveló que PCSK9 se unía a albúmina-heparina con una constante de afinidad de 700 pM (Figura 20 A), no se observó unión al chip sensor de control acoplado a albúmina (Figura 20 B). Se implementó un ensayo de interferencia usando análisis BIACORE para evaluar la unión entre el compuesto (X) y PCSK9. Se incubaron soluciones de PCSK9 100 nM con concentraciones crecientes de compuesto (X) (0 nM, 10 nM, 100 nM, 1 pM y 10 pM), a continuación, se infundieron las soluciones sobre el chip sensor acoplado a heparina-albúmina. Las curvas de unión revelaron que el compuesto (X) inhibe la unión de PCSK9 al chip sensor de heparina-albúmina con una CI50 estimada de 50 nM (Figura 20 C).

Ejemplo 21: el Compuesto (X) inhibe la unión de PCSK9 a microesferas de heparina-sefarosa

La inhibición del Compuesto (X) de la unión de PCSK9 a heparina/heparán sulfato se sometió a prueba en un ensayo de unión de heparina-sefarosa. Se incubaron microesferas de heparina-sefarosa (2 pl) con PCSK9 (1 pg/ml) con concentraciones crecientes de Compuesto (X) (0-500 pg/ml) en un volumen total de 150 pl de NaH2PO410 mM. Después de una rotación nocturna a 4 °C, se sedimentaron las microesferas y se evaluó mediante ELISA la concentración de PCSK9 no precipitada (PCSK9 libre) en el sobrenadante. La concentración de PCSK9 libre en cada muestra se normalizó al nivel de PCSK9 en una muestra sin microesferas de heparina-sefarosa (control de entrada). Como control positivo se incluyó una muestra con heparina soluble (5 mg/ml) (Figura 16 A). El Compuesto (X) (500 200 pg/ml) inhibió por completo la interacción de PCSK9 con heparina-sefarosa en este ensayo. A modo de comparación, la adición de heparina soluble dio lugar a una inhibición del 50 %. Estos resultados muestran que el Compuesto (X) inhibe eficazmente la unión de PCSK9 a heparina in vitro.

Ejemplo 22: el Compuesto (X) protege al rLDL contra PCSK9 in vitro

Las células HepG2 incubadas durante 24 h con Compuesto (X) (0-200 pg/ml) mostraron niveles aumentados de rLDL dependientes de la concentración evaluados por inmunoelectrotransferencia de lisados celulares y cuantificados por densitometría (Figura 16 B). Las células de control se incubaron sin aditivos (control negativo) o 500 pg/ml de heparina (control positivo). Se calcularon los niveles de rLDL con respecto al nivel encontrado en el lisado de células HepG2 incubadas sin aditivos. La incubación del compuesto (X) dio lugar a niveles de rLDL hasta 12 veces más altos. A modo de comparación, las células incubadas con heparina (500 pg/ml), mostraron un rLDL aproximadamente elevado en 3 veces.

Estos experimentos muestran que el compuesto (X) protege a rLDL contra la degradación inducida por PCSK9 en células HepG2.

Ejemplo 23: el Compuesto (X) inhibe la degradación inducida por PCSK9 del rLDL in vivo

Se sometieron ratones (BALB6/cJRj) a una única administración intravenosa (vena de la cola) de 3,2 pg de Compuesto (X) 60 minutos antes de la inyección con PCSK9 (10 pg). La degradación inducida por PCSK9 del rLDL hepático se evaluó 60 minutos después de la inyección de PCSK9 mediante inmunoelectrotransferencia y se cuantificó mediante densitometría (Figura 16 C). A los ratones de control se les inyectó NaCl o el inhibidor de control Evolocumab (200 pg), un anticuerpo monoclonal inhibidor de PCSK9 disponible comercialmente (Amgen). Los niveles de rLDL se calcularon con respecto al nivel de rLDL en ratones inyectados con NaCl solo. El nivel de rLDL disminuyó en un 50 % en los ratones inyectados con PCSK9 sin una inyección previa del inhibidor, mientras que no se observó disminución en los ratones inyectados con el Compuesto (X) (0,13 mg/kg) o Evolocumab (8 mg/kg).

Estos estudios muestran que la administración del Compuesto (X) antes de la inyección de PCSK9 protege al rLDL tan eficazmente como Evolocumab en dosis mucho más bajas.

Ejemplo 24: efecto del Compuesto (X) sobre el aclaramiento de colesterol de las LDL en células HepG2 Las células HepG2 sembradas en 96 pocillos se incuban durante la noche con el Compuesto (X) (200 pg/ml). Al día siguiente, se añaden partículas de LDL (5 pg/ml) marcadas con colorante de fluorescencia Dil (Thermo Fisher Scientific) y se incuban durante 4 h a 37 °C. Después del lavado de las células con PBS, se evalúa la absorción celular de las partículas de LDL en una excitación/emisión de 552/573 nm. Después de una incubación durante la noche a -80 °C, el número de células/pocillo se cuantifica usando un ensayo de proliferación celular CyQuant (Thermo Fisher Scientific).

Estos estudios confirmarán que la inhibición del Compuesto (X) de la actividad de PCSK9 aumenta la captación de colesterol de las LDL in vitro.

Ejemplo 25: efecto del Compuesto (X) en niveles de colesterol sérico de las LDL en humanos

Los pacientes con niveles elevados de colesterol de las LDL sérico se tratan con una inyección intravenosa semanal del Compuesto (X) (dosis) durante 6 semanas para evaluar la capacidad del Compuesto (X) como tratamiento para reducir el colesterol de las LDL. El colesterol de las LDL (HPLC) se mide en muestras de sangre obtenidas antes del tratamiento y una vez a la semana durante el mismo.

Estos estudios confirmarán que el Compuesto (X) reduce el colesterol de las LDL sérico en humanos que padecen hipercolesterolemia.

Ejemplo 26: el hexámero sulfatado y las heparinas 18-mero inhiben la función de PCSK9 in vitro (ejemplo de referencia)

Las células HepG2 se incubaron con 0-200 pg/ml de hexámero sulfatado heterogéneamente u oligosacáridos 18-mero que contienen en promedio 1,3 sulfatos por disacárido. Después de una incubación durante la noche, se recogieron las células y se analizó el nivel celular de rLDL mediante inmunoelectrotransferencia (Figura 17 A) y se cuantificó mediante densitometría (Figura 17 B). Las células incubadas con cualquiera de estas heparinas mostraron un nivel de rLDL celular 6-8 veces mayor en comparación con las células de control a la concentración más alta probada (200 pg/ml). Además, el hexámero tiene un potente efecto inhibidor de PCSK9 a concentraciones tan bajas como 10 pg/ml.

Ejemplo 27: el octasulfato de sacarosa inhibe la unión de PCSK9 a microesferas de heparina-sefarosa (ejemplo de referencia)

La inhibición de octasulfato de sacarosa (Figura 21A) de la unión de PCSK9 a heparina/heparán sulfato se sometió a prueba en un ensayo de unión de heparina-sefarosa. Se incubaron microesferas de heparina-sefarosa (2 pl) y PCSK9 (1 pg/ml) con concentraciones crecientes de octasulfato de sacarosa (0-500 pg/ml) en un volumen total de 150 pl de NaH2PÜ410 mM. Después de una rotación nocturna a 4 °C, se sedimentaron las microesferas y se evaluó mediante ELISA la concentración de PCSK9 no precipitada (PCSK9 libre) en el sobrenadante. Se calculó el porcentaje de PCSK9 libre con respecto a la concentración de PCSK9 en una muestra sin microesferas de heparina-sefarosa (control de entrada) (Figura 21B). El octasulfato de sacarosa en concentraciones de 500-250 pg/ml inhibió la precipitación de PCSK9 con heparina-sefarosa, así como 5 mg/ml de heparina soluble (control positivo) en este ensayo. Estos resultados muestran que el octasulfato de sacarosa inhibe eficazmente la unión de PCSK9 a heparina in vitro.

Secuencias

SEQ ID NO: 1: proteína PCSK9 - número de acceso de NCBI: NG_009061.1

MGTVSSRRSWWPLPLLLLLLLLLGPAGARAQEDEDGDYEELVLALRSEEDGLAEAPE

HGTTATFHRCAKDPWRLPGTYVVVLKEETHLSQSERTARRLQAQAARRGYLTKILHV

FHGLLPGFLVKMSGDLLELALKLPHVDYIEEDSSVFAQSIPWNLERITPPRYRADEYQP

PDGGSLVEVYLLDTSIQSDHREIEGRVMVTDFENVPEEDGTRFHRQASKCDSHGTHL

AGVVSGRDAGVAKGASMRSLRVLNCQGKGTVSGTLIGLEFIRKSQLVQPVGPLVVLL

PLAGGYSRVLNAACQRLARAGVVLVTAAGNFRDDACLYSPASAPEVITVGATNAQDQ

PVTLGTLGTNFGRCVDLFAPGEDIIGASSDCSTCFVSQSGTSQAAAHVAGIAAMMLSA

EPELTLAELRQRLIHFSAKDVINEAWFPEDQRVLTPNLVAALPPSTHGAGWQLFCRTV

WSAHSGPTRMATAVARCAPDEELLSCSSFSRSGKRRGERMEAQGGKLVCRAHNAF

GGEGVYAIARCCLLPQANCSVHTAPPAEASMGTRVHCHQQGHVLTGCSSHWEVEDL

GTHKPPVLRPRGQPNQCVGHREASIHASCCHAPGLECKVKEHGIPAPQEQVTVACE

EGWTLTGCSALPGTSHVLGAYAVDNTCVVRSRDVSTTGSTSEGAVTAVAICCRSRHL

AQASQELQ*

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Claims

REIVINDICACIONES

i. Una composición que comprende un compuesto que tiene la estructura general de la fórmula (I):

o una sal, solvato, polimorfo o tautómero farmacéuticamente aceptable del mismo, donde:

-R1 comprende un grupo con una fórmula seleccionada de entre:

a) la fórmula (XI):

o

b) la fórmula (II):

( I I )

donde:

X es SO²

m es un número entero independientemente igual o mayor que 1;

- cada R2 se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste en -OSO³", -OH, -NH², -NHSO³", -NHOCH³y -OPO³2-;

- cada R3 se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste en -OSO3-, -OH y - OPO32-;

- cada R4 se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste en -OSO³' , -OH, -OPO³2' y -H; - cada R5 se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste en -CH²OSO³', -CH²OH, -COO’ y -CH2OPO32-;

- n es un número entero entre 3 y 10;

para su uso en el tratamiento de un trastorno del metabolismo de las lipoproteínas en un sujeto, donde dicho trastorno del metabolismo de las lipoproteínas se selecciona de entre el grupo que consiste en diabetes, obesidad, síndrome metabólico, xantoma, hipercolesterolemia, hipercolesterolemia familiar, dislipidemia, hipertrigliceridemia, hiperlipidemia, sitosterolemia, hipertensión, angina, síndrome coronario agudo, cardiopatía coronaria, aterosclerosis, arteriosclerosis, inflamación vascular y sepsis.
2. La composición para su uso según la reivindicación 1, donde R2 es -OSO3-, R3 es -OSO3-, R4 es -OSO3-, y/o R5 es -CH2OSO3-.
3. La composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el compuesto tiene la fórmula estructural general (XII):

donde Rr es -OR1 y n es un número entero entre 2 y 9.
4. La composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el compuesto de la fórmula (I) es un compuesto de la fórmula (XXVI):

donde q es un número entero entre 1 y 8, R9 es individualmente -SO³- o -H, y Rr es -OR1.
5. La composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el compuesto tiene la fórmula estructural general (XIV):

donde Rr es -OR1.
6. La composición para su uso según la reivindicación 1, donde dicho compuesto tiene la estructura general (III):

donde:

-R1 comprende un grupo con una fórmula seleccionada de entre:

a) la fórmula (XI):

o

b) la fórmula (II):

donde:

X es SO²

m es un número entero independientemente igual o mayor que 1;

- cada R2 y R6 se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste en -OSO³-, -OH, -NH², -NHSO³-, -NHOCH³y -OPO³2-;

- cada R3 y R7 se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste en -OSO³', -OH y - OPO³2'; - cada R5 y 8 se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste en -CH²OSO³', -CH²OH, -COO' y -CH2OPO32-;

- cada R4 se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste en -OSO3- , -OH, -OPO³²y -H; - n es un número entero entre 2 y 5.
7. La composición para su uso según la reivindicación 6, donde dicho compuesto tiene la estructura general (IV):
8. La composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 6, donde dicho compuesto tiene la estructura general (V):
9. La composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 6 a 8, donde dicho compuesto tiene la estructura general (VII) o (VIII):
10. La composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde R1 comprende además un resto seleccionado de entre el grupo que consiste en alquilo, alquilo sustituido, heteroalquilo, heteroalquilo sustituido, alquilsulfonilo, alquilsulfonilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, éster, amida, acilo, acilo sustituido, amino, amino sustituido, tioalquilo, tioalquilo sustituido, arilo, heteroarilo, arilo sustituido, hidrógeno y halógeno.
11. La composición para su uso según la reivindicación 1, donde R1 comprende o consiste en un grupo de la fórmula (XVII):
12. La composición para su uso según la reivindicación 1, donde el compuesto se selecciona de entre el grupo que consiste en:

i. Compuesto (X),

ii. Heparina I,

iii. Heparina VII,

iv. Un compuesto de la fórmula (XXVI), donde q es 2 y Rr es -O-fórmula (XVII); y

v. Un compuesto de la fórmula (XXVI), donde q es 1 y Rr es -O-fórmula (XVII).
13. La composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicho compuesto comprende además un resto de unión a albúmina, tal como un ácido graso, o un ácido biliar conjugado con dicho compuesto, o el compuesto está fijado covalentemente a través del grupo aminoterminal (como R) a una estructura dendrítica de la fórmula:
14. La composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicho compuesto reconoce y se une específicamente a al menos uno de los residuos de aminoácidos 78 a 167 de PCSK9 (SEQ ID NO: 1), tal como al menos uno de los residuos de aminoácidos 78 a 92, tal como al menos uno de los residuos de aminoácidos 93 a 97, tal como al menos uno de los residuos de aminoácidos 98 a 103, tal como al menos uno de los residuos de aminoácidos 104 a 105, tal como al menos uno de residuos de aminoácidos 106 a 135, tal como al menos uno de los residuos de aminoácidos 136 a 139, tal como al menos uno de los residuos de aminoácidos 140 a 164, tal como al menos uno de los residuos de aminoácidos 165 a 167 de PCSK9 (SEQ ID NO: 1), por ejemplo, uno o más aminoácidos seleccionados de entre el grupo que consiste en R93, R96, R97, R104, R105, K136, H139, R165 y R167 de PCSK9 (SEQ ID NO: 1).
15. La composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la composición es una composición farmacéutica que comprende además al menos uno de:

- un anticuerpo anti-PCSK9, tal como un anticuerpo que inhibe la unión de PCSK9 a rLDL, por ejemplo, seleccionado de entre el grupo que consiste en lodelcizumab, ralpancizumab, alirocumab, evolocumab y bococizumab;

- una estatina;

- colestiramina;

- ezetimiba.