KR101594552B1 - 알킬화된 반합성 글리코사미노글리코산 에테르 및 이의 제조 및 사용 방법 - Google Patents

알킬화된 반합성 글리코사미노글리코산 에테르 및 이의 제조 및 사용 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101594552B1
KR101594552B1 KR1020107024824A KR20107024824A KR101594552B1 KR 101594552 B1 KR101594552 B1 KR 101594552B1 KR 1020107024824 A KR1020107024824 A KR 1020107024824A KR 20107024824 A KR20107024824 A KR 20107024824A KR 101594552 B1 KR101594552 B1 KR 101594552B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
pharmaceutically acceptable
acceptable salt
hyaluronic acid
sage
modified hyaluronan
Prior art date
Application number
KR1020107024824A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20110004422A (ko
Inventor
글렌 프레스위치
지안싱 장
토마스 피 케네디
나라야남 라오
샤오우 수
Original Assignee
유니버시티 오브 유타 리서치 파운데이션
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 유니버시티 오브 유타 리서치 파운데이션 filed Critical 유니버시티 오브 유타 리서치 파운데이션
Publication of KR20110004422A publication Critical patent/KR20110004422A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101594552B1 publication Critical patent/KR101594552B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/726—Glycosaminoglycans, i.e. mucopolysaccharides
    • A61K31/728—Hyaluronic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/10—Drugs for disorders of the urinary system of the bladder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/08—Antiseborrheics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/10—Anti-acne agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/12—Keratolytics, e.g. wart or anti-corn preparations
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/14—Drugs for dermatological disorders for baldness or alopecia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/04—Artificial tears; Irrigation solutions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C08B37/0072—Hyaluronic acid, i.e. HA or hyaluronan; Derivatives thereof, e.g. crosslinked hyaluronic acid (hylan) or hyaluronates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L5/00—Compositions of polysaccharides or of their derivatives not provided for in groups C08L1/00 or C08L3/00
    • C08L5/08—Chitin; Chondroitin sulfate; Hyaluronic acid; Derivatives thereof
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

본 발명은 "SAGE"라고 본원에서 일컫는 알킬화 및 플루오로알킬화된 반합성 글리코사미노글리코산 에테르의 합성에 관한 것이다. 상기 설페이트화되고 알킬화 및 플루오로알킬화된 SAGE의 합성을 또한 기재하고 있다. 본원에 기재된 화합물은 상처 치료, 약물 전달 및 다양한 염증성 질환과 피부 질환의 치료를 포함하는 다양한 적용 분야에 유용하다.

Description

알킬화된 반합성 글리코사미노글리코산 에테르 및 이의 제조 및 사용 방법{ALKYLATED SEM-SYNTHETIC GLYCOSAMINOGLYCOSAN ETHERS, AND METHODS FOR MAKING AND USING THEREOF}
관련 출원에의 상호 참조
본 출원은 2008년 4월 4일에 출원된 미국 가출원 제61/042,310호에 대한 우선권을 청구한다. 이 출원은 참고를 위해 참고문헌으로 전체가 본원에 통합된다.
건선, 피부염, 여드름, 주사, 광 피부 노화와 같은 염증성 질환 및 RAGE 매개 시그날링(RAGE-mediated signaling)과 연관된 다양한 질환들로 인해 전 세계 사람들이 고통 받고 있다. 상기 질환들의 장래를 예측하기 위해, 미국 건선 재단(the National Psoriasis Foundation)은 건선만으로 전 세계 인구의 2~3% 또는 대략 1억2천5백만명의 사람들이 어려움을 겪고 있다고 말한다. 상기 염증성 이상들은 심미적으로 불쾌함을 주고 치료되지 않을 경우에는 심각한 건강 문제를 발생시킬 수 있다.
상기 이상들의 일반적으로 받아들여지고 있는 치료는 UV 광선 요법, 코르티코스테로이드류(corticosteroids) 및 글루코코르티코이드류(glucocorticoids), 아시트레틴(Acitretin), 사이클로스포린(cyclosporine) 및 메토트렉세이트(methotrexate)를 포함할 수 있다. 하지만, 이러한 치료들은 각각 면역 억제 및 간 질환에서부터 피부 얇아짐 및 선천적 결손증(birth defects)의 유발까지에 이르는 심각한 부작용을 유발할 수 있다. 부분 또는 완전한 무효율성으로 인해, 종종 환자들을 이러한 치료들의 결과에 불만족하게 된다.
상기 치료들과 함께, 헤파린(heparin) 치료가 또한 실험적으로 연구되고 있다. 설페이트화된 다당류인 헤파린은 일반적으로 항응고제로만 사용되어 왔으나, 이의 항염증 특성은 잘 알려져 있다. 헤파린 및 이의 유도체들은 염증성 질환들의 치료에서의 전망이 보여지고 있다. 특히, 헤파린 및 이의 유도체는 염증성 캐스케이드(cascades)에서의 세 개 이상의 중요한 사건을 중단시킨다. 첫 번째, 헤파린이 백혈구 인테그린(leukocyte integrin) P- 및 L-셀렉틴에 부착되고 차단한다. 두 번째, 헤파린 및 이의 유도체가 셀렉틴 저해의 첫 번째 헤파린 배리어를 벗어나게 하는 PMN에 의해 단백질 가수 분해성 조직 손상을 감소시키는 양이온성 PMN 프로테아제 인간 백혈구 엘라스타아제 및 카텝신 G에 결합 및 저해함으로써 염증성 캐스케이드를 감소시킨다. 세 번째, 헤파린 및 이의 유도체는 진행된 당화 반응의 종결 생성물(RAGE)를 위한 수용체와 이의 리간드의 상호 작용을 잠재적으로 저해한다.
헤파린 및 이의 유도체가 상기 염증성 질환의 치료에 유망하게 보임에도 불구하고, 헤파린 및 이의 유도체로의 치료는 몇몇 주요한 결점을 나타낸다. 첫 번째, 헤파린 및 이의 유도체는 돼지에서 유래되므로 바이러스의 이종 전이의 위험이 따른다. 두 번째, 헤파린의 항응고 특성으로 인해 이 화합물로 처리된 당뇨병 환자들은 과도한 출혈의 위험에 처한다. 세 번째, 헤파린은 양이온성 단백질 혈소판 인자-4(PF-4)와 헤파린의 콤플렉스에 항체를 생성하는 특정인들에게 최악의 혈소판 응집 및 일반 역설 동맥 및 정맥 응고를 초래하는 혈소판 감소증(thrombocytopenia)을 유발할 수 있다. 따라서, 충족되지 않은 중요한 요구는 다른 치료들에서 보여진 수많은 부작용을 피하면서 염증성 질환들을 치료하는 데 사용될 수 있는 화합물을 제형화되는 것이다.
본 발명은 "SAGE"라고 본원에서 일컫는 알킬화 및 플루오로알킬화된 반합성 글리코사미노글리코산 에테르의 합성에 관한 것이다. 상기 설페이트화되고 알킬화 및 플루오로알킬화된 SAGE의 합성을 또한 기재하고 있다. 본원에 기재된 화합물은 다양한 치료 및 화장료 적용 및 다양한 염증성 질환과 피부 질환의 치료에 유용하다. 본 발명의 장점은 하기 설명에 기재될 것이며, 이는 설명으로부터 명백하거나 또는 하기 기재의 실행으로 배울 수 있다. 아래에 기재된 장점은 덧붙여진 특허청구범위에 명백하게 지적된 성분 및 조합을 사용하여 실현되고 도달할 수 있다. 상기 일반적인 기재 및 하기 상세한 설명 모두 본 발명을 예시하고 설명하기 위함이며, 이에만 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에 통합되고 일부를 구성하는 첨부된 도면들을 하기에 각각 설명하였다.
도 1은 알킬화 및 플루오로알킬화된 히알루론산 및 이의 설페이트화된 유도체를 제조하기 위한 합성 반응을 나타낸다.
도 2는 몇몇 예시적인 SAGE의 구조를 나타낸다.
도 3은 부분적으로 O-설페이트화 및 메틸화된 HA(P-OSMEHA 또는 GM-131201)에 의한 P-셀릭틴의 저해를 나타낸다.
도 4는 또한 설페이트화되는 알킬화 및 플루오로알킬화된 히알루론산을 포함하는 설페이트화된 히알루론산 유도체에 의한 인간 백혈구 엘라스타아제의 저해를 나타낸다.
도 5는 P-OSMEHA에 의해 고정된 RAGE에 결합하는 고 유동성 그룹 박스 단백질-1(high mobility group box protein-1, HMGB-1)으로 알려진 암포테린(amphoterin)의 저해를 나타낸다.
도 6은 P-OSMEHA (GM-131201)에 의해 고정된 RAGE에 결합하는 S100b 칼그라뉼린(calgranulin)의 저해를 나타낸다.
도 7은 P-OSMEHA (GM-131201)에 의해 고정된 RAGE에 결합하는 카르복시메틸 리신-BSA (CML-BSA)의 저해를 나타낸다.
도 8은 또한 설페이트화되는 알킬화 및 플루오로알킬화된 히알루론산을 포함하는 고 분자량 히알루론산 유도체에 의한 각질 세포(keratinocyte) 증식의 저해를 나타낸다.
도 9는 또한 설페이트화되는 알킬화 및 플루오로알킬화된 히알루론산을 포함하는 저 분자량 히알루론산 유도체에 의한 각질 세포 증식의 저해를 나타낸다.
도 10은 LL-37 주사 모델에서의 SAGE (GM-111101) 동시-주입법(co-injection)을 나타낸다.
(a) LL-37 주입된 피부 영역 및 (b) LL-37와 SAGE의 동시-주입 모델의 육안 사진. (c) LL-37 주입된 피부 시료의 H&E 착색 단면도. (d) SAGE와 LL-37의 혼합물이 주입된 피부 영역의 H&E 착색 단면도. (e) LL-37 단독, LL-37+SAGE 또는 SAGE 단독 주입군의 마우스 피부 생체 조직에서 PMN 효소 미엘로퍼옥시다아제(MPO)의 활성도에 의해 측정되는 다핵형 백혈구(Polymorphonuclear leukocyte, PMN)의 피부 침투. LL-37 단독 또는 LL-37+SAGE을 주입한 마우스에서의 (f) 홍반 범위 및 (g) 홍반 점수.
도 11은 LL-37 주사 모델에서의 SAGE (GM-111101) 국소 치료를 나타낸다.
(a) LL-37 주입된 피부 영역, (b) LL-37 주입 직후 SAGE 처리 및 (c) LL-37 주입 후 12시간 SAGE 처리의 육안 사진. (d) LL-37 주입된 피부 시료의 H&E 착색 단면도. (e) LL-37 주입된 피부 영역에서의 SAGE 즉시 치료의 H&E 착색 단면도. (f) LL-37 주입된 피부 영역에서의 SAGE 12 시간 처리의 H&E 착색 단면도. (g) 다른 SAGE 처리 방법으로의 LL-37 주입 모델의 MPO 활성도 측정. SAGE의 국소 적용으로 처리된 LL-37 주사 모델의 (h) 홍반 범위 및 (i) 홍반 점수 표시.
도 12는 자연광 하에서의 외피(1 mg/ml SAGE으로 처리됨) (패널 a) 및 외피 형광등 이미지(패널 b); 자연광 하에서의 내피(패널 c) 및 형광등 조건 하에서의 내피(패널 d).
도 13은 nHDF 세포 (a)의 증식 및 nHEK (b)의 작용에서의 HA 유도체들의 효과를 나타낸다. 상이한 농도의 GM-111101 및 GM-212101로 처리된 마우스의 육안 사진. 손상되지 않은 영역 (c) 및 포름산 자극 영역 (d)는 0.1 mg/ml GM-111101 (e), 1 mg/ml GM-111101 (f), 10 mg/ml GM-111101 (g), 0.1 mg/ml GM-212101 (h), 1 mg/ml GM-212101 (i) 및 10 mg/ml GM-212101 (j)와 비교된다.
도 14는 찰과상 영역에서의 SAGE의 홍반 점수 (a)를 나타낸다. (b) 찰과상 영역에서의 SAGE 의 부종 점수. (c) 손상되지 않은 영역에서의 SAGE의 홍반 점수. (d) 손상되지 않은 영역에서의 SAGE의 부종 점수.
도 15는 크로톤 오일 염증성 모델(croton oil inflammatory model)을 사용한 SAGE 치료를 나타낸다. 대조군(CTL)에서 크로톤 오일 치료 후 4 시간. CTL 군에서 동일한 마우스의 오른쪽(무처리)(패널 a) 및 왼쪽(크로톤 오일로 칠함)(패널 b) 귀들을 비교. H&E 착색은 PBS 페인팅으로 음성 대조군(패널 c), 크로톤 오일로의 양성 대조군(패널 d) 및 SAGE 후의 크로톤 오일(패널 e)로 이루어졌다. 백혈구 침투 및 부종은 크로톤 오일 양성 대조군에서 확인되었다. 미엘로퍼옥시다아제(Myeloperoxidase) 활성(패널 f)은 다핵형 백혈구 활성화의 표시이며, SAGE 처리 후 귀 조각에서 측정되었다. 패널 g 및 h는 SAGE 처리 후 귀 두께(부종으로부터 발생) 및 귀 붉기(자극으로부터 발생)에서의 변화이다(p<0.05).
도 16은 (a) LL-37 주입된 피부 시료의 H&E 착색 단면도를 나타낸다. (b) LL-37 주입된 피부 영역에서의 HA 치료의 H&E 착색 단면도. (c) LL-37 주입된 피부 영역에서의 SAGE (GM-111101) 처리의 H&E 착색 단면도. (d) HA 및 SAGE 처리한 LL-37 주입 모델의 MPO 활성도 측정. HA 및 SAGE 처리한 LL-37 주사 모델의 (e) 홍반 범위 그림 및 (f) 홍반 점수 표시.
도 17은 ARPE-19 세포에서의 AGE-유도 RAGE 발현이 AGE 생성물 카르복시메틸 리신-소 혈청 알부민(CML-BSA)에서의 성장에 의해 증가되고 변형된 헤파린에 의해 예방됨을 나타낸다.
도 18은 대조군 (a)와 비교하여, AGE 생성물 CML-BSA가 ARPE-19 세포 에서 세포자살을 유발하고(b), 이는 ODSH 에 의해 저해되고(c), SAGE 처리에 의해 거의 제거됨(d)을 나타낸다.
도 19는 인간 내 치료 항응고 플라즈마 헤파린 농도와 급접한 0.4 μg/ml의 농도에서 인자 XII를 활성화시키는 헤파린과는 달리, LMW SAGE는 인자 XII를 활성화하지 않음을 나타낸다.
본 발명의 화합물, 조성물 및/또는 방법은 개시 및 기재하기 전에, 하기 구현예는 특정한 화합물, 합성 방법 또는 용도로 한정되는 것이 아니며, 변형될 수 있음을 명심해야 한다. 또한, 본 명세서에서 사용된 전문 용어는 특정한 구현예를 설명하기 위한 것으로서, 이에 한정함은 아니다.
이하 본 명세서 및 특허청구범위에 있어, 다수의 용어가 언급될 것이며, 아래의 의미를 갖도록 정의된다:
본 발명의 명세서 및 특허청구범위에서 사용된 단수 형태("a", "an" 및 "the")는 명백한 지시가 없는 한 복수 개념을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "약학적 담체"는 둘 이상의 담체의 혼합물 등을 포함하는 것을 의미한다.
"선택적(Optional)" 또는 "선택적으로(optionally)"는 이어서 기재된 사건 또는 상황이 발생하거나 또는 발생하지 않음을 의미하고, 이러한 기재는 사건 또는 상황이 발생한 경우와 발생하지 않은 경우를 포함한다. 예를 들어, 문구 "선택적으로 치환된 저급 알킬"은 저급 알킬기가 치환되거나 치환되지 않음을 의미하고, 이러한 기재는 치환되지 않은 저급 알킬 및 치환기가 있는 저급 알킬을 모두 포함한다.
본 발명의 명세서 및 특허청구범위에서 조성물 또는 조항에서의 특정 요소 또는 성분의 중량부에 대한 언급은 중량부가 표시된 조성물 또는 조항에서의 요소 또는 성분 및 임의의 다른 요소들 또는 성분들 사이의 중량 관계를 말한다. 그러므로, 2중량부의 X 성분 및 5 중량부의 Y성분을 포함하는 화합물에서 X 및 Y는 2:5의 중량비로 존재하고, 이러한 비율은 추가적인 성분이 화합물에 함유되는 것과 관계가 없다.
이와 반대로 특정하게 언급되지 않는 한, 성분의 중량 퍼센트는 성분이 포함된 제형 또는 조성물의 총 중량에 기초한다.
본 명세서 및 특허청구범위에서 사용된 화학종의 잔여물은 특정 반응 계획 또는 이어진 제형 또는 화학 생성물에서의 화학종의 결과 생성물인 부분에 관한 것으로, 상기 부분은 화학종으로부터 실제로 얻어질지는 관계가 없다. 예를 들어, 하나 이상의 -OH기를 포함하는 히알루론산은 화학식 Y-OH에 의해 나타낼 수 있고, 여기서 Y는 히알루론산 분자의 잔여물(즉, 잔기)이다.
본 명세서에 사용된 용어 "치료(treat)"는 기존 병력의 징후의 유지 또는 감소를 의미한다. 본 명세서에 사용된 용어 "예방(prevent)"은 질병 또는 질환의 하나 이상의 증상의 발생 가능성의 제거 또는 감소를 의미한다. 본 명세서에 사용된 용어 "저해(inhibit)"는 화합물의 부재 시 동일한 활성에 비교할 때, 활성을 완전히 제거하거나 또는 활성을 감소시키는 화합물의 능력이다.
본 발명은 알킬화 및 플루오로알킬화된 히알루론산 또는 이의 유도체들에 관한 것이다. 한 구현예에서, 히알루론산의 N-아세틸-글루코사민 잔기의 하나 이상의 일차 C-6 히드록실 양성자가 알킬기로 치환된다. 본원에 사용된 용어 "알킬기"는 1 내지 24개의 탄소 원자의 분지쇄 또는 직쇄 포화 탄화수소기, 예를 들어 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, t-부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 데실, 테트라데실, 헥사데실, 에이코실, 테트라코실 등이다. 한 구현예에서, 상기 알킬기는 C1 내지 C10 분지쇄 또는 직쇄 알킬기이다. 다른 구현예에서, 상기 알킬기는 메틸이다. 상기 알킬기는 비치환 또는 치환될 수 있다. 알킬기가 치환되었을 경우, 알킬기에 존재하는 하나 이상의 수소 원자는 알키닐, 알케닐, 아릴, 할라이드, 니트로, 아미노, 에스테르, 케톤, 알데하이드, 하이드록시, 카르복시산, 아랄킬 또는 알콕시를 포함하는 기 또는 보다 많은 기들로 대체될 수 있으며, 이에 한정되지는 않는다.
또 다른 구현예에서, 히알루론산의 N-아세틸-글루코사민 잔기의 하나 이상의 일차 C-6 히드록실 양성자는 플루오로알킬기로 치환될 수 있다. 본원에 사용되는 용어 "플루오로알킬기"는 1 내지 24개의 탄소 원자의 분지쇄 또는 직쇄 포화 탄화수소기로, 하나 이상의 수소 원자가 불소로 치환된다. 특정 구현예에서, 상기 플루오로알킬기는 하나 이상의 트리플루오로메틸기를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 플루오로알킬기는 화학식 -CH2(CF2)nCF3이며, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10의 정수이다. 한 구현예에서, 상기 플루오로알킬기는 -CH2CF2CF3 또는 -CH2CF2CF2CF3 이다.
본 발명은 SAGE를 알킬화 또는 플루오로알킬화하는 방법에 관한 것이다. 한 구현예에서, 상기 SAGE는 (a) N-아세틸-글루코사민 잔기의 하나 이상의 일차 C-6 히드록실 양성자를 탈양성자화(deprotonate)하기 충분한 양의 염기와 히알루론산 또는 이들의 유도체를 반응시키는 단계; 및 (b) 탈양성자화된 히알루론산 또는 이들의 유도체를 충분한 시간과 농도로 알킬화제 또는 플루오로알킬화제와 반응시켜 하나 이상의 탈양성자화된 일차 C-6 히드록실기를 알킬화 또는 플루오로알킬화시키는 단계;를 통해 제조된다. 상기 염기 조건은 변형 과정 동안 저 분자량의 히알루론산 유도체를 생성시키는 글리코시드 결합의 분열을 초래할 수 있음을 당업자는 이해할 수 있다. 또한, 상기 염기 조건은 산을 카르복실레이트 및 이차 히드록실기로 탈양성자시키고, 이러한 구핵성 부분 각각은 평형에서의 상대적으로 다량 및 음이온종의 친핵성에 비례하여 알킬화에 참여할 수 있다. 예를 들어, 2-O 및/또는 3-O 히드록실 양성자는 탈양성자화 및 알킬화 또는 플루오로알킬화될 수 있다. 이러한 예는 도 1에 표현되어 있으며, 여기서 R은 수소, 알킬기 또는 플루오로알킬기이다.
히알루론산 초기 물질은 유리 산 또는 이의 염으로 존재할 수 있다. 히알루론산 초기 물질의 유도체 또한 본 발명에 사용될 수 있다. 상기 유도체들은 알킬화 또는 플루오로알킬화 단계 전에 히알루론산의 임의의 변형을 포함한다. 광범위한 분자량의 히알루론산이 본 발명에 사용될 수 있다. 한 구현예에서, 상기 히알루론산은 알킬화 또는 플루오로알킬화 전에 10kDa 초과의 분자량을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 상기 히알루론산은 알킬화 또는 플루오로알킬화 전에 25kDa 내지 1,000kDa, 100kDa 내지 1,000kDa, 25kDa 내지 500kDa, 25kDa 내지 250kDa, 또는 25kDa 내지 100kDa의 분자량을 갖는다. 특정 구현예에서, 상기 히알루론산 초기 물질 또는 이의 유도체는 동물 원료로부터 유도되지 않는다. 이러한 구현예에서, 상기 히알루론산은 박테리아와 같은 다른 원료로부터 유도될 수 있다. 예를 들어, 재조합 B. 서브티리스(B. subtilis ) 발현 시스템이 히알루론산 초기 물질을 제조하기 위해 사용될 수 있다.
상기 히알루론산 초기 물질 또는 이의 유도체는 처음에 N-아세틸-글루코사민 잔기의 하나 이상의 일차 C-6 히드록실 양성자를 탈양성자화(deprotonate)하기 충분한 양의 염기와 반응된다. 상기 염기의 선택은 다양할 수 있다. 예를 들어, 수산화나트륨 또는 수산화칼륨과 같은 알칼리 수산화물이 본 발명에 사용될 수 있다. 상기 염기의 농도 또는 양은 알킬화 또는 플루오로알킬화의 원하는 수준에 따라 달라질 수 있다. 한 구현예에서, 상기 염기량은 히알루론산 초기 물질 또는 이의 유도체의 N-아세틸-글루코사민 잔기의 일차 C-6 히드록실 양성자의 0.001% 이상을 탈양성자화시키기 충분하다. 다른 구현예에서, 상기 염기량은 히알루론산 초기 물질 또는 이의 유도체의 N-아세틸-글루코사민 잔기의 일차 C-6 히드록실 양성자의 0.001% 내지 50%, 1% 내지 50%, 5% 내지 45%, 5% 내지 40%, 5% 내지 30%, 5% 내지 20%, 10% 내지 50%, 20% 내지 50%, 또는 30% 내지 50%를 탈양성자화시키기 충분하다. 용액이 보다 염기성일수록, 사슬 분열 반응(chain cleavage reactions)이 일어나기 쉽고, 보다 높은 수준의 알킬화/플루오로알킬화가 얻어질 수 있다. 예를 들어, 다른 히드록실기가 히알루론산에 존재한다(예를 들어, 2-OH 및/또는 3-OH가 알킬화 또는 플루오로알킬화될 수 있다). 한 구현예에서, 히알루론산에 존재하는 모든 히드록실기가 알킬화 또는 플루오로알킬화될 수 있다. 다른 구현예에서, 히알루론산에 존재하는 히드록실 양성자의 0.001%, 0.01%, 0.1%, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% 또는 이들의 임의의 범위가 탈양성자화되고, 이어서 알킬화 또는 플루오로알킬화될 수 있다.
히알루론산 초기 물질 또는 이의 유도체가 염기로 처리된 후, 탈양성자화된 히알루론산은 알킬화제 또는 플루오로알킬화제와 반응하여 SAGE를 제조한다. 알킬화제의 예는 할로겐화 알킬을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 브롬화 알킬 및 요오드화 알킬이 특히 유용하다. 유사하게, 상기 플루오로알킬화제는 할로겐화 플루오로알킬을 포함할 수 있다. 일반적으로 유기 합성에 사용되는 알킬화제 및 플루오로알킬화제가 본 발명에 사용될 수 있다.
알킬화 및 플루오로알킬화된 SAGE를 제조하기 위한 합성 과정의 예는 도 1에 제공된다. 도 1을 참조하면, 히알루론산(HA)는 염기(예를 들어, NaOH) 및 알킬화제(예를 들어, CH3I)로 처리되어 히알루론산의 N-아세틸-글루코사민 잔기의 일차 C-6 히드록실 양성자를 메틸화하고 메틸화된 히알루론산(MHA)을 제조한다. 또한, 도 1은 플루오로알킬화제(예를 들어, CF3(CF2)nCH2Br)를 이용하여 플루오로알킬화된 히알루론산 (FHA)을 제조하기 위한 합성 과정의 예를 제공한다.
특정 구현예에서, 상기 알킬화 또는 플루오로알킬화된 SAGE를 설페이트화하는 것이 바람직하다. 한 구현예에서, 상기 알킬화 또는 플루오로알킬화된 SAGE는 알킬화 또는 플루오로알킬화된 SAGE를 설페이트화제와 반응시킴으로써 설페이트화되어 설페이트화된 생성물을 제조한다. 설페이트화 수준은 부분적 설페이트화에서 전체적 설페이트화까지 다양할 수 있다. 일반적으로 알킬화 또는 플루오로알킬화된 히알루론산 또는 이의 유도체에 존재하는 유리 히드록실기가 설페이트화될 수 있다. 한 구현예에서, 하나 이상의 C-2 히드록실 양성자 및/또는 C-3 히드록실 양성자가 설페이트기로 치환된다. 또 다른 구현예에서, 설페이트화 수준은 알킬화 또는 플루오로알킬화된 SAGE의 이당류 단위당 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5 또는 이들의 임의의 범위이다. 한 구현예에서, 상기 알킬화 또는 플루오로알킬화된 SAGE는 염기로 처리되어 하나 이상의 히드록실 양성자를 탈양성자화하고, 이어서 설페이트화제가 첨가될 수 있다. 상기 설페이트화제는 히드록실기 또는 탈양성화된 히드록실기와 반응하여 설페이트기를 생성하는 임의의 화합물이다. 상기 SAGE의 분자량은 반응 조건에 따라 달라질 수 있다. 한 구현예에서, 상기 SAGE의 분자량은 2 kDa 내지 500 kDa, 2 kDa 내지 250 kDa, 2 kDa 내지 100 kDa, 2 kDa 내지 50 kDa, 2 kDa 내지 25 kDa, 또는 2 kDa 내지 10 kDa이다. 도 1은 설페이트화된 알킬화 또는 플루오로알킬화 SAGE (각각 SMHA 및 SFHA)의 합성 예를 나타낸다.
도 2는 몇몇 예시적인 SAGE의 구조를 제공한다. 각각의 SAGE는GM-XYSTZZ인 코드에 의해 확인되고, 여기서:
X = 알킬기의 종류, 여기서 1 = 메틸, 2 = 펜타플루오로프로필, 3 = 헵타플루오로부틸, 4 = 벤질글리시딜 에테르
Y = HA의 크기, 여기서 1 = 저, 2 = 중, 3 = 고
S = 설페이트화 수준, 여기서 1 = 부분적, 2 = 전체적
T = 알킬화 수준, 여기서 1 = 저, 2 = 고
ZZ = 순차 로트 넘버 01 또는 02, 여기서 02는 만들어지고 01 배치와 모두 동일한 특성을 갖는다.
표 1은 상기 코드 시스템에 의해 정의된 몇몇 SAGE들의 목록을 제공한다.
SAGE # 화학명 MW
(초기)		 MW
(GPC)		 알킬화 알킬화 SD 설페이트화
GM-211101 LMW-P-OSFHA-1(DS 1) 53K 6K 펜타플루오로프로필(Pfp) 1 1.0-1.5
GM-311101 LMW-P-OSFHA-2(DS 1) 53K 5.8K 헵타플루오로부틸(Hfb) 1 1.0-1.5
GM-111101 LMW-P-OSMeHA(DS 1) 53K 5.6k 메틸(Me) 1 1.0-1.5
GM-211201 LMW-P-OSFHA-1(DS 2) 53K 6K 펜타플루오로프로필 2 1.0-1.5
GM-311201 LMW-P-OSFHA-2(DS 2) 53K 5.6k 헵타플루오로부틸 2 1.0-1.5
GM-111201 LMW-P-OSMeHA(DS 2) 53K 5.5K 메틸 2 1.0-1.5
GM-231101 P-OSFHA-1(DS 1) 950K 112k 펜타플루오로프로필 1 1.0-1.5
GM-331101 P-OSFHA-2(DS 1) 950K 110k 헵타플루오로부틸(Hfb) 1 1.0-1.5
GM-131101 P-OSMeHA(DS 1) 950K 123k 메틸 1 1.0-1.5
GM-231201 P-OSFHA-1(DS 2) 950K 108k 펜타플루오로프로필 2 1.0-1.5
GM-331201 P-OSFHA-2(DS 2) 950K 130k 헵타플루오로부틸 2 1.0-1.5
GM-131201 P-OSMeHA(DS 2) 950K 120K 메틸 2 1.0-1.5
GM-212101 LMW-F-OSFHA-1(DS 1) 53K 5k 펜타플루오로프로필 1 1.5-2.0
GM-312101 LMW-F-OSFHA-2(DS 1) 53K 4.8k 헵타플루오로부틸 1 1.5-2.0
GM-112101 LMW-F-OSMeHA(DS 1) 53K 5.6k 메틸 1 1.5-2.0
GM-212201 LMW-F-OSFHA-1(DS 2) 53K 6K 펜타플루오로프로필 2 1.5-2.0
GM-312201 LMW-F-OSFHA-2(DS 2) 53K 6K 헵타플루오로부틸 2 1.5-2.0
GM-112201 LMW-F-OSMeHA(DS 2) 53K 5.4k 메틸 2 1.5-2.0
GM-232101 F-OSFHA-1(DS 1) 950K 110k 펜타플루오로프로필 1 1.5-2.0
GM-332101 F-OSFHA-2(DS 1) 950K 105k 헵타플루오로부틸 1 1.5-2.0
GM-132101 F-OSMeHA(DS 1) 950K 112k 메틸 1 1.5-2.0
GM-232201 F-OSFHA-1(DS 2) 950K 120k 펜타플루오로프로필 2 1.5-2.0
GM-332201 F-OSFHA-2(DS 2) 950K 118k 헵타플루오로부틸 2 1.5-2.0
GM-132201 F-OSMeHA(DS 2) 950K 116K 메틸 2 1.5-2.0
GM-431101 P-OSBGHA 950K 105k 벤질 글리시딜 에테르 (BG) <1
GM-432101 F-OSBGHA 950K 110k 벤질 글리시딜 에테르 <1
GM-411101 P-OSBGHA 53K 6K 벤질 글리시딜 에테르 <1
GM-412101 F-OSBGHA 53K 5.6k 벤질 글리시딜 에테르 <1
GM-XYSTZZ 코드
X = 알킬 Y = MW S= 설페이트화 T= 알킬화
1 = Me 1 = 저 1= 부분적 1= 저 SD
2 = Pfp 2 = 중 2= 전체적 2= 고 SD
3 = Hfb 3 = 고 ZZ = 순차 no.
4 = BG
한 구현예에서, 상기 SAGE의 알킬기는 메틸이고, 히알루론산의 하나 이상의 C-2 히드록실 양성자 및/또는 C-3 히드록실 양성자가 설페이트기로 치환된다. 또 다른 구현예에서, 상기 SAGE의 알킬기는 메틸이고, 히알루론산의 하나 이상의 C-2 히드록실 양성자 및/또는 C-3 히드록실 양성자가 설페이트기로 치환되고, 상기 화합물은 알킬화 후에 2kDa 내지 200kDa의 분자량을 갖는다. 상기 화합물의 예는 도 2에 나타낸 바와 같이 GM-111101이다.
본원에 기재된 임의의 알킬화 및 플루오로알킬화된 SAGE는 약학적으로 허용 가능한 염 또는 이의 에스테르가 될 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 염은 약학적으로 허용 가능한 염기의 적량과 유리산을 처리함으로써 제조된다. 대표적인 약학적으로 허용 가능한 염기는 수산화 암모늄, 수산화 나트륨, 수산화 칼륨, 수산화 리튬, 수산화 칼슘, 수산화 마그네슘, 수산화 제일철(ferrous hydroxide), 수산화 아연, 수산화 구리, 수산화 알루미늄, 수산화 삼가철(ferric hydroxide), 이소프로필아민, 트리메틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 트리프로필아민, 에탄올아민, 2-디메틸아미노에탄올, 2-디에틸아미노에탄올, 리신, 아르기닌, 히스티딘 등이 있다. 한 구현예에서, 반응은 실온과 같은 약 0℃ 내지 약100℃의 온도에서 물 단독 또는 비활성, 수혼화성 유기 용매와의 조합에서 실시된다. 사용된 염기에 대한 구조식 Ⅰ의 화합물의 몰비는 임의의 특정 염에 대하여 원하는 비율로 제공하기 위해 선택된다. 예를 들어, 유리산 초기 물질의 암모늄염의 제조를 위해서 초기 물질을 약학적으로 허용 가능한 염기의 약 일당량으로 처리하여 중성염을 수득할 수 있다.
에스테르 유도체는 일반적으로 하기 실시예에 그려져 있는 화합물의 산 형태에 대한 전구체로서 제조되며, 따라서 프로드러그(prodrugs)로 사용될 수 있다. 일반적으로, 이러한 유도체는 메틸, 에틸 등과 같은 저급 알킬 에스테르일 수 있다. 아미드 유도체들 -(CO)NH2, -(CO)NHR 및 -(CO)NR2(여기서, R은 상기 정의된 알킬기)는 암모니아 또는 치환된 아민과 카르복실산 함유 화합물의 반응에 의해 제조될 수 있다. 또한, 상기 에스테르는 지방산 에스테르일 수 있다. 예를 들어, 상기 팔미트 에스테르(palmitic ester)가 제조되고 대안의 에스테라아제 활성화된 프로드러그로 사용될 수 있다.
본원에 기재된 SAGE는 임의의 부형제에 제형화될 수 있으며 이는 생물학적 시스템 또는 실체는 약학적 조성물을 제조하는 데 내성이 있다. 상기 부형제의 예들은 물, 수용성 히알루론산, 식염수, 링거 용액, 덱스트로오스 용액, 행크 용액 및 기타 수용성 생리적으로 균형된 염 용액을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 고정유와 같은 비수용성 용매, 올리브유 및 참기름과 같은 식물성 기름, 트리글리세리드, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 에틸 올레에이트와 같은 주입 가능한 유기 에스테르를 또한 사용할 수 있다. 다른 유용한 제형들은 소듐 카르복시메틸셀룰로오스, 소르비톨 또는 덱스트란과 같은 점성 강화제를 포함하는 현탁액을 함유한다. 부형제는 등장성 및 화학 안정성을 향상시키는 물질과 같은 소량의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 완충액의 예는 인산염 완충액, 중탄산염 완충액 및 트리스 완충액을 포함하고, 방부제의 예는 티메로솔, 크레솔, 포르말린 및 벤질 알코올을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 pH는 적용 방식에 따라 조절될 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물의 pH가 약 5 내지 약 6이면, 이는 국소 적용에 적합하다. 또한, 상기 약학적 조성물은 담체, 증점제, 희석제, 방부제, 계면활성제 등을 본 발명의 화합물에 추가로 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 또한 본 발명의 화합물과 함께 사용되는 하나 이상의 활성 성분을 포함할 수 있다. 상기 생성된 약학적 조성물은 적용 부위에 근접하거나 또는 멀리 떨어진 조직으로 지속적, 연속의 약물 및 다른 생물학적 활성제를 전달하기 위한 시스템을 제공할 수 있다. 상기 생물학적 활성제는 적용된 생물학적 체계에서 국소 또는 전신 생물학적, 생리학적 또는 치료적 효과를 제공할 수 있다. 예를 들어, 상기 제제는 다른 기능들 중에서 감염 또는 염증을 조절 및/또는 예방, 세포 성장과 조직 재생을 강화, 암 성장을 조절, 진통제로 작용, 항세포 부착을 촉진, 치조골(alveolar bone)과 치아 손실을 감소, 연골 조직과 무게 지탱 관절의 변형을 억제, 골 성장을 촉진하는 작용을 한다. 또한, 본 발명의 임의의 화합물은 둘 이상의 약학적으로 허용 가능한 화합물의 조합을 포함할 수 있다. 상기 화합물의 예들은 항균제, 항염증제, 마취제 등을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 상기 조성물들을 약물 전달 장치로서 사용하는 방법은 아래에 상세하게 기재된다.
상기 약학적 조성물은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 한 구현예에서, 상기 조성물은 SAGE을 약학적으로 허용 가능한 화합물 및/또는 담체와 혼합하여 제조될 수 있다. 상기 용어 "혼합" 두 성분을 함께 혼합하여 화학 반응 또는 물리적 상호작용이 없는 것으로 정의된다. 상기 용어 "혼합"은 또한 화합물과 약학적으로 허용 가능한 화합물 사이의 화학 반응 또는 물리적 상호 작용을 포함한다. 반응성 치료제, 예를 들어 구핵성 기를 가지는 것과의 공유 결합은 화합물에서 일어날 수 있다. 둘째, 가교 결합된 다당류에서의 약학적 활성제의 비공유 고정(non-covalent entrapment)이 또한 가능하다. 셋째, 정전기적 또는 소수성 상호 작용은 본원에 기재된 화합물 내에서 약학적으로 허용 가능한 화합물의 보유를 촉진할 수 있다.
특정 경우에서 SAGE의 실제 적량은 사용된 특정한 화합물, 제형화된 특정 조성물, 적용 방식 및 특정 상황 및 처리된 피검체에 따라 다양할 수 있다. 주어진 숙주를 위한 투여량은 통상적인 고려 사항, 예를 들어 대상 화합물과 공지된 제제의 상이한 활성도의 통상적인 비교에 의해 적절한 일반 약학적인 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 약학적 화합물의 투여량을 결정하는 분야에 숙련된 의사 및 제조자는 기준 권고에 따라 투여량을 결정하는 데 어려움이 없을 것이다(Physicians Desk Reference, Barnhart Publishing (1999)).
본 명세서에 기재된 약학적 조성물은 국소 또는 전신 치료를 원하는 지와 처리될 부위에 따라 다양한 방법으로 투여될 수 있다. 투여는 국소적(안구, 질, 직장, 비강, 경구 또는 피부에 직접 투여를 포함)일 수 있다. 국소 투여를 위한 제형은 연고, 로션, 크림, 겔, 물약, 좌약, 스프레이, 액체 및 분말을 포함할 수 있다. 통상적인 약학적 담체, 수용성, 분말 또는 유성 베이스, 점증제 등이 필수적이거나 또는 바람직할 수 있다. 또한, 에어로졸 또는 건조 미립화 분말의 흡입을 통해 폐로 직접 투여될 수 있다. 염증 또는 악화되는 관절 부위로의 직접 주입을 통해 투여될 수 있다.
투여용 조제품은 멸균 수용성 또는 비수용성 용액, 현탁액 및 에멀젼을 포함한다. 비수용성 담체는 물, 알코올/수용성 용액, 식염수 및 완충 매질을 포함하는 에멀젼 또는 현탁액을 포함한다. 상기 조성물 및 방법의 보조적인 사용이 필요하다면, 비경구적 부형제는 염화 나트륨 용액, 링거 덱스트로오스, 덱스트로오스 및 염화 나트륨, 락트산화 링거 또는 고정유를 포함한다. 상기 조성물 및 방법의 보조적인 사용이 필요하다면, 정맥 내 부형제는 유체 및 영양 보충제, 전해물 보충제(링거 덱스트로오스에 기초한 것과 같음) 등을 포함한다. 또한, 방부제 및 기타 첨가제들은 예를 들어, 항균제, 항산화제, 킬레이트화제 및 비활성 기체 등으로 존재할 수 있다.
투여량은 치료될 이상의 심각도 및 반응성에 의존하나, 며칠 내지 몇 달 동안 지속되는 치료 과정 시 또는 당업계의 숙련인이 전달을 중지해야 한다고 결정할 때까지 일반적으로 하루당 한번 이상의 투여량일 수 있다. 숙련인은 최적 투여량, 투여 방법 및 반복률을 용이하게 결정할 수 있다.
본원에 기재된 SAGE 및 약학적 조성물은 약물 전달, 소분자 전달, 상처 회복, 염증성 피부 질환의 치료, 염증성 치아 질환의 치료, 염증성 호흡기 질환의 치료, 염증성 안구 질환의 치료, 화상 상처 회복 및 조직 재생/엔지니어링에 연관된 다양한 적용 분야에 사용될 수 있다. 한 구현예에서, 본원에 기재된 SAGE 및 조성물은 개선이 필요한 피검체에서 상처 회복을 개선시킬 수 있다. 본원에 기재된 SAGE 및 약학적 조성물은 생체에 적합한 물질로 구성되어 있기 때문에 생물학적 체계에 정제 없이 직접 내부 또는 표면에 적용될 수 있다. SAGE가 적용될 수 있는 부위의 예는 근육 또는 지방과 같은 연조직; 골 또는 연골과 같은 경조직; 조직 재생 부위; 치주낭(periodontal pocket)과 같은 공간; 수술 절개 또는 다른 형성된 포켓 또는 구멍; 경구, 질, 직장 또는 비강과 같은 선천적 구멍, 관절 공간, 결막낭(cul-de-sac of the eye) 등; 복막강 및 이에 포함된 기관, 및 벤 상처, 긁힌 자국 또는 화상 영역과 같은 피부 표면 손상을 포함하고 상기 화합물이 위치할 수 있는 임의의 부위의 내부 또는 위를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 조직은 부상 또는 퇴행성 이상으로 인해 손상될 수 있으며, 또는 상기 SAGE 및 조성물은 조직에 상해를 예방하기 위해 손상되지 않은 조직에 도포될 수 있다. 상기 SAGE는 생분해성일 수 있고, 자연적으로 생성되는 효소가 작용하여 이들을 시간에 걸쳐서 분해한다. 상기 SAGE의 성분들은 SAGE의 성분이 생물학적 체계 내, 예를 들어 세포, 조직 등에 의해 분해 및 흡수될 수 있는 "생흡수성(bioabsorbable)"일 수 있다. 그 외에, SAGE, 특히 재수화되지 않는 것은 생물학적 체계에 적용되어 관심 부위로부터 유체를 흡수할 수 있다.
상처 치료의 경우, 상기 SAGE는 주입을 통해 투여될 수 있다. 많은 임상적 사용을 위해 SAGE가 히드로겔(hydrogel) 필름의 형태인 경우, 주입 가능한 히드로겔이 세 가지 주요 이유에서 바람직하다. 첫째, 주입 가능한 히드로겔은 상처 부위에서 임의의 원하는 모양으로 형성될 수 있다. 초기 히드로겔은 졸 또는 주형 퍼티(moldable putties)일 수 있기 때문에 상기 체계는 콤플렉스 구조에 위치하고, 이어서 가교 결합하여 원하는 치수로 만들 수 있다. 둘째, 상기 히드로겔은 겔 형성 동안 조직에 부착될 수 있으며, 표면 미세 거칠기로부터 발생되는 결과 기계 연동(mechanical interlocking)은 조직-히드로겔 경계면을 강화시킬 수 있다. 셋째, 인 시츄(in situ-) 가교 결합할 수 있는 히드로겔의 도입은 바늘 또는 복강경(laparoscopic) 방법에 의해 실시될 수 있으며, 이로써 수술 기법의 침투를 최소화할 수 있다.
건선, 여드름, 아토피 피부염, 주사 또는 UV 광 의존성 광 노화와 같은 염증성 피부 질환의 경우, 상기 SAGE가 연화제의 일부로 국소 도포되어 의도된 이상을 예방 또는 치료할 수 있다. 천식, 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease), 급성 폐 손상(acute lung injury) 또는 낭포성 섬유증(cystic fibrosis)과 같은 호흡기 질환의 경우, 상기 SAGE가 에어웨이 라이닝 유체(airway lining fluid)와 융화성인 수용성 등장성 부형제에 용해되고 흡인 에어로솔로서 폐 또는 비강 경로로 전달될 수 있다. 또는, 상기 SAGE는 미립화 분말로 제형화되고 건조 분말로서 폐에 흡입될 수 있다. 안구 질환의 경우, 상기 SAGE는 수용성 부형제에 위치할 수 있고 안약으로 국소 적용되거나 바늘 또는 이식된 불변 약물 전달 장치의 사용에 의해 안구에 직접 주입될 수 있다. 치주 질환과 같은 치아 질환의 경우, 상기 SAGE는 구강 세정제의 구성 성분으로 삽입되거나 치은구(gingival crevice)에 직접 도포될 수 있는 크림 또는 치경 포장 물질로 제형화될 수 있다.
또한, 상기 SAGE는 전신 염증성 질환, 예를 들어 당뇨병성 혈관 또는 신장 질병 또는 염증성 위장 질병을 치료 또는 예방하기 위해 정맥 내, 근육 내 또는 피하로 비경구 주입될 수 있다. 유사하게, 상기 SAGE는 염증성 및 퇴행성 관절염을 치료하기 위해 관절 내 주입될 수 있다. 또한, 상기 SAGE는 캡슐로 경구 투여되거나 또는 염증성 장 질환(inflammatory bowel diseases)의 치료제로서 직장 내로 전달되도록 관장제로 제형화될 수 있다.
상기 SAGE 및 조성물은 상기 하나 이상의 조성물과 약학적으로 허용 가능한 화합물의 수여가 가능한 하나 이상의 조직에 접촉하는 단계를 포함하여 전달이 필요한 환자에게 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 화합물을 전달할 수 있다. 상기 SAGE는 인간 또는 비인간 동물에게 치유적 또는 치료적 가치를 갖는 광범위한 방출 가능 생물학적 활성 물질용 담체로 사용될 수 있다. 상기 SAGE에 의해 전달될 수 있는 많은 물질이 상기되어 있다. 본 발명의 겔에 통합되기 적당한 생물학적 활성 물질은 치료 약물, 예를 들어 항염증제, 해열제, 항염증용 스테로이드성 및 비스테로이드성 약물, 호르몬, 성장 인자, 피임제, 항바이러스제, 항박테리아제, 항균제, 진통제, 수면제, 진정제, 정신 안정제, 항경련제, 근육 안정제, 국소 마취제, 진경제, 항궤양제, 펩티드성 작용제, 심파티오미메틱제(sympathiomimetic agents), 심혈관제, 항종양제, 올리고뉴클레오티드 및 이들의 유사체 등을 포함한다. 생물학적으로 활성 물질이 약학적 유효량으로 첨가될 수 있다.
한 구현예에서, 상기 설페이트화된 알킬화 및 플루오로알킬화된 SAGE는 진전된 최종 당화 산물의 수용체(RAGE), P-셀렉틴 또는 인간 백혈구 엘라스타아제의 활성을 저해시킬 수 있다. RAGE는 인간 피부에서 고도로 발현되며, 이는 섬유아세포(dermal fibroblasts), 수지상 세포, 각질세포, 내피 세포 및 단핵 세포에 존재한다. RAGE는 진전된 최종 당화 산물(AGE) 및 시토킨 종양 사멸 인자-α에 의해 햇빛-노출 피부에서 상향 조절된다. RAGE는 UV 유도 광노화에 중요한 역할을 수행하며, UV 유도 카르복실메틸 리신(CML)과 같은 AGE 생성물에 의한 이의 결찰(ligation)은 섬유 아세포에 의한 세포 외 매트릭스 생성의 자극을 통해 피부 노화를 촉진한다. RAGE의 역할은 건선은 염증 발생에 대한 활성화된 T-림프구에 임계적으로 의존하므로 건선에서 보다 중요해진다. T-림프구는 또한 여드름과 아토피 피부염에서도 기계론적으로 중요할 수 있다. 여드름의 경우, CD3+ 및 CD4+ T 림프구 및 대식세포의 증가된 진피 수준은 여드름 면포(comedone)의 형성의 원인이 되는 막힌 소낭관을 생성하는 소낭관에서의 각질 세포의 과증식을 자극한다. 아토피 피부염의 경우, 진피 항원은 피부로의 에오신 기호성의 점증을 초래하는 인터류킨-4 (IL-4) 및 인터류킨-13 (IL-13)과 같은 시토킨을 분비하는 TH2 림프구를 활성화시킨다. 또한, 에오신 기호성은 알러지 피부 질환을 초래하는 주요 염기성 단백질과 같은 양이온성 독성을 방출한다. 그러므로, 상기 화합물의 효력이 있는 RAGE 저해 활성은 다양한 피부 질환을 치료하는 데 유용하며, 이러한 피부 질환은 여드름, 습진, 아토피 피부염, 건선 또는 광 피부 노화를 포함하지만, 이에만 한정되지 않는다.
성숙된 상태에서, RAGE는 생물에게 항상 완전히 도움이 되지는 않는다. 악성 종양은 암포테린(또는 고 유동성 박스 그룹 단백질-1, HMGB-1)을 오토크린 인자(autocrine factor)로 분비하고, RAGE와 암포테린의 상호 작용을 이용하여 초기 종양 성장 및 전이를 촉진한다. 재조합 디코이(수용성 RAGE 또는 s-RAGE)로의 RAGE 차단은 종양 성장을 감소시키고 전이를 저해한다. 패혈증 동안 단핵 세포 및 대식세포는 혈관 및 다른 염증성 세포에서 RAGE와 상호작용하여 박테리아 충격의 중증도를 증가시키는 암포테린을 분비한다. RAGE에 대한 항체와의 상호작용의 차단은 심한 패혈증에서의 기관 손상을 예방한다. 성숙된 상태에서, RAGE는 또한 염증 부위로의 PMN, 단핵 세포 및 림프구의 점증을 촉진시키는 혈관 흡착 수용체로서 작용한다. RAGE 차단은 염증성 세포 유입을 느리게 만든다. 이는 다발성 경화증의 동물 모델에서 이미 증명되어있고, 여기서 s-RAGE와의 혈관 내피 RAGE의 경쟁적 봉쇄는 활성화된 뇌염 유발 T-림프구의 중심 신경계로의 유입을 예방하고, 신경계 염증 및 변질의 발병 및 진행을 예방한다.
또한, RAGE는 S100 칼그라뉼린이라고 명명되는 칼슘 결합 단백질 족과 상호작용하며, 이는 PMN, 단핵 세포 및 림프구에 의해 효력이 있는 염증 촉진 인자로 분비된다. 증가된 수준의 S100 칼그라뉼린은 급성 폐 손상, 낭포성 섬유증에 걸린 환자의 에어웨이 분비에서의 PMN 염증의 두드러진 표식이다. 안구에서 RAGE와 S100 칼그라뉼린의 상호작용은 연령 관련 황반 변성에서 실명을 초래하는 데 중요한 역할을 수행한다. 또한, RAGE는 알츠하이머 β-아밀로이드 펩티드 및 아밀로이드 단백질의 β 시트에 결합한다. 중성 세포 사멸 및 염증의 RAGE 연관 유발을 통해 RAGE-β 시트 미소 섬유 상호작용은 알츠하이머 치매 및 전신성 유전분증에서의 기관 손상을 가져온다.
또한, RAGE는 당뇨병에서 두드러진다. 혈당이 증가될 경우, 글루코오스의 알데하이드기는 세포 단백질의 아민, 공유 결합의 부가물에 불규칙적으로 부착된다. PMN에 의해 생성되는 산화제인 하이포아염소산(HOCl)과 같은 산화제가 존재할 경우, 이러한 글루코오스 부분은 이후 산화될 수 있다. 상기와 같이 산화된 글루코실화 단백질은 진전된 최종 당화 산물(AGE)로 알려져 있다. AGE는 또한 RAGE 수용체와 열성적으로 결합하고, RAGE 매개 시그날링을 유발한다. AGE-RAGE 시그날링은 혈관 내피 기능 장애, 불충분한 상처 회복 및 불충분하게 제어된 당뇨의 가속된 아테롬성 동맥 경화 특성의 원인이 된다. 안구에서, AGE-RAGE 시그날링은 당뇨병성 망막증 및 실명을 초래하는 망막 미세혈관의 증식을 유발한다. 신장에서, AGE-RAGE 시그날링은 초기 신장 비대 및 이어서 당뇨병성 신부전증(당뇨병성 신장질환)을 유발하는 섬유증을 일으킨다. 마찬가지로 AGE-RAGE 시그날링은 내피 세포 자살을 초래하고, 혈관 성장을 저해하고 당뇨병성 피부 궤양의 치료를 지연시킨다.
RAGE를 차단하는 SAGE의 능력은 이들을 특히 염증의 치료제로 유용하게 한다. RAGE은 자궁 내에서 성장 촉진 핵단백질 암포테린 또는 고 유동성 박스 단백질-1(HMGB-1)에 결합하는 수용체로서 기능한다. 여기서, 상기 암포테린-RAGE 상호 작용은 신경계 발달에 중요한 성장 시그날링을 초래한다. 성숙한 상태에서 RAGE는 혈관벽 세포, 중성 세포, 심근 세포(cardiac myocytes), 단핵 세포 및 대식세포, T-림프구, 신장 혈관간세포 및 피부 섬유아세포, 덴드로사이트(dendrocyte) 및 각질 세포에서 발현된다. 따라서, 한 구현예에서, 상기 SAGE 및 조성물은 RAGE-연관 질환에 기여하는 다양한 다른 질병에 의해 초래되는 피검체에서의 염증을 안전하게 완화 또는 예방하기 위해 사용될 수 있으며, 이러한 질병은 암, 다발성 경화증(multiple sclerosis), 골 관절염(osteoarthritis), 낭포성 섬유증(cystic fibrosis), 겸상 적혈구 빈혈(sickle cell anemia), 염증성 심혈관 질환(cardiovascular inflammatory disorder) 또는 당뇨병 합병증(diabetic complications)을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
다른 구현예에서, 상기 SAGE 및 조성물, 음성적으로 하전된 전체가 또한 카텔리시딘(cathelicidins)으로부터 유도된 양이온성 피부 펩티드에 결합 및 방해하기 위해 투여되어 피부 질환을 치료 또는 예방할 수 있다. 예를 들어, 활성 카텔리시딘 펩티드의 과도한 피부 발현으로부터 발생된다고 알려져 있는 여드름 주사로 공지된 피부 이상은 본 발명의 SAGE를 사용하여 치료 또는 예방될 수 있다. SAGE를 사용하여 치료 또는 예방할 수 있는 피부 이상은 주사(rosacea), 아토피 피부염(atopic dermatitis)(습진), 알레르기성 접촉 피부염(allergic contact dermatitis), 건선(psoriasis), 포진성 피부염(dermatitis herpetiformis), 여드름(acne), 당뇨병성 피부 궤양(diabetic skin ulcers) 및 기타 당뇨병성 상처, 화상(열 화상의 고통 완화를 포함), 햇볕으로 인한 화상(sunburn)(햇볕으로 인한 화상의 고통 완화를 포함), 성형 수술 후의 흉터 예방, 광선 각화증(actinic keratoses), 곤충에 물린 상처로부터의 염증, 덩굴 옻나무(poison ivy), 방사선 유도(radiation-induced) 피부염/화상, 피부 회복 촉진, 켈로이드(keloid) 흉터의 예방 및 치료, 또는 지루성 피부염(seborrheic dermatitis)의 치료를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
RAGE 활성 및 다른 생물학적 매커니즘을 저해시키는 SAGE의 능력으로 인해 상기 SAGE는 피부 질환의 치료 또는 예방과 함께 다양한 치료 분야에 적용된다. 한 구현예에서, 상기 SAGE는 치은염(gingivitis)(치주 질환)과 혓바늘(aphthous ulcer)을 치료하기 위해 치과 및 경구 수술에 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 SAGE는 안과 적용, 예를 들어 연령 관련 황반 변성(age-related macular degeneration), 당뇨망막병증(diabetic retinopathy), 안구 건조증 및 기타 염증성 결막염, 홍채염(iritis), 포도막염(uveitis), 알레르기성 결막염(allergic conjunctivitis), 백내장 시술에서의 항염증 보조제 또는 각막 염증(corneal inflammation) 및 상처(scarring)의 예방을 위해 사용될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 상기 SAGE는 비뇨 생식기 적용 분야(예를 들어, 요로 감염증의 예방, 방광과 요로 상피세포계의 암세포 전이의 치료; 간질성 방광염(interstitial cystitis)의 치료; 및 성행위 감염증의 전달을 예방하기 위한 질 윤활제/보호제로의 용도)에 사용될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 상기 SAGE는 낭포성 섬유증(cystic fibrosis), 기관지 확장증(bronchiectasis), 비염(알레르기성 및 다년성), 부비강염(sinusitis), 폐기종(emphysema) 및 만성 기관지염(chronic bronchitis, COPD), 급성 폐 손상/성인 호흡 장애 증후군(acute lung injury/adult respiratory distress syndrome), 간질성 폐 섬유증(interstitial lung fibrosis), SARS, 천식 및 호흡기 세포 융합 바이러스(respiratory syncytial virus)를 포함하는 다양한 호흡기 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 SAGE는 코골이와 폐쇄성 수면 무호흡증을 예방 및 치료하고, HIA 양성이거나 조혈악성종양을 가진 피검체와 같은 면역 억제된 숙주에서 일반적인 호흡기 병원균(스트렙토코커스 뉴모니아에, 헤모필러스 인플루엔자에, 스타필로코커스, 마이코플라스마 뉴모니아에, 클아밀디알 뉴모니아, 그람 음성 장 감염)에 의한 감염을 예방하거나 또는 중이염(otitis media)을 예방 및 치료할 수 있다.
상기 SAGE는 심혈관 적용 분야(예를 들어, 급성 관동맥 증후군 또는 아테롬성 동맥 경화증의 치료 또는 예방); 혈액/종양학적 적용 분야(예를 들어, 겸상 적혈구 빈혈의 예방 및 치료);
전이성 질환(metastatic disease)의 예방 및 치료; 및 악성 과응고 상태(트루쏘 증후군)의 예방; 전염성 질환의 치료(예를 들어, 열대열 말라리아에서의 뇌혈관 폐색증 및 신장염, 황열병, 뎅기열, 전신성 패혈증 및 바이러스 융합과 표적 세포의 감염을 예방하기 위한 HIV의 보조 치료); 위장 질환(예를 들어, 궤양성 대장염, 장의 크론병, 치질 및 위장과 식도의 스트레스성 궤양의 예방)의 치료; 류머티즘 및 면역 질환의 치료(예를 들어, 골 관절염(osteoarthritis), 류머티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 전신 홍반성 낭창(systemic lupus erythematosis)의 예방 및 치료, 혈관 신경 부종(angioneurotic edema), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 전신성 경화증(systemic sclerosis), 전신성 유전분증(systemic amyloidosis) 및 전신성 비만 세포증(systemic mastocytosis)의 예방 및 치료); 신장 질환(예를 들어, 당뇨병성 신장 질환(diabetic nephropathy) 및 사구체 신염(glomerulonephritis)의 예방 및 치료); 및 신경성 질환(예를 들어, 다발성 경화증(multiple sclerosis) 및 알츠하이머 치매(Alzheimer's dementia)에 사용될 수 있다.
본 발명에 기재된 SAGE 및 조성물은 다른 연관된 치료보다 안전하다. 예를 들어, 헤파린 및 다른 설페이트화된 다당류는 동물 및 임상 연구에서 모두 당뇨병 합병증을 감소시킬 수 있었고, 특히 당뇨병성 신장 질환에 대하여 효과적이다. 하지만, 헤파린은 과도한 출혈 위험이 존재하는 항응고성으로 인해 당뇨병 합병증을 예방하기 위한 일반적인 임상 장치에 사용될 수 없다. 본 발명에 기재된 SAGE 및 조성물은 낮은 항응고 활성을 가지고 있으며, 이는 장기 치료에 중요한 고려 사항이고, 하기 실시예에 나타내었다. 추가적으로, 상기 SAGE는 독성이 거의 없으며, 이를 또한 하기 실시예에 나타내었다.
[실시예]
하기 실시예들은 본 명세서에 개시되고 주장된 화합물, 조성물 및 방법이 어떻게 만들어지고 평가되는지 당업자에게 완벽한 공개 및 기재를 제공하기 위하여 제시된 것이며, 순전히 예시적인 것으로 의도되며 본 발명자가 발명으로 여기는 범위를 제한하는 것이 아니다. 숫자(예를 들어, 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 확실하게 하기 위하여 노력을 기울였으나 일부 실수 및 편차가 있을 수 있다. 별도의 지시가 없다면, 부는 중량부이고, 온도는 ℃이거나 또는 주위 온도이며, 압력은 대기압 또는 대기압 근처이다. 반응 조건, 예를 들어 구성요소의 농도, 원하는 용매, 용매 혼합물, 온도, 압력, 및 원하는 과정으로부터 얻어지는 생산물 순도 및 수율을 최적화하는데 사용될 수 있는 다른 반응 범위 및 조건의 많은 변형 및 조합이 있다. 적당하고 통상적인 실험만이 상기 과정 조건을 최적화하는데 요구될 것이다. 하기 화합물들은 상기된 코드 번호에 의해 확인되며 도 2에 참조된다.
I. 알킬화된 HA 유도체의 합성
A. 메틸 HA ( DS -2)의 제조
히알루론산(HA, 노보자임 바이오폴리머스, 950 kDa) (2.0 g)을 100 mL 비커에서 20 mL의 NaOH (40% w/v)에 용해시키고, 그 혼합물을 실온(rt)에서 2시간 동안 교반하였다. 생성된 점성의 액체를 100 mL의 이소프로판올이 담겨 있는 400 mL 비커로 옮기고, 계속 혼합하였다. 교반된 혼합물에 10 mL의 요오드화메탄을 첨가하고, 그 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 생성된 현탁액을 여과하여 미정제 메틸화된 HA 생성물을 수집하였다. 이 미정제 MeHA를 증류수 250 mL에 녹이고, 그 용액을 pH ~7.0으로 조절하고, 외부 수조를 네 번 바꿔주면서 증류수에 24시간 동안 투석하였다. 투석된 MeHA 생성물을 냉동 건조시켜 솜 그물(cottony mesh)같은1.25g의 메틸 HA을 수득하였다. 1H NMR (D2O, δ): 1.85(s, 3H, NCH3), 3.20-3.80(m, 10H, OCH+OCH3). 치환도(SD)를 1H NMR으로 측정하고, SD = [(δ 3.20-3.8에서의 메틸 HA의 적분) - (δ 3.20-3.8에서의 HA의 적분)]/(1.85에서의 NCH3 의 적분), SD=2 또는 이당류 단위당 평균 2개의 메틸기임을 확인하였다. 이는 일차 히드록실기 및 하나 이상의 이차 히드록실기가 모두 상기 과정에 의해 변형되었음을 의미한다.
B. 메틸 HA ( DS -1)의 제조
히알루론산(HA, 노보자임 바이오폴리머스, 950 kDa) (2.0 g)을 100 mL 비커에서 20 mL의 NaOH (40% w/v)에 용해시키고, 그 혼합물을 실온(rt)에서 2시간 동안 교반하였다. 생성된 점성의 액체를 100 mL의 이소프로판올이 담겨 있는 400 mL 비커로 옮기고, 계속 혼합하였다. 교반된 혼합물에 4 mL의 요오드화메탄을 첨가하고, 그 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 생성된 현탁액을 여과하여 미정제 메틸화된 HA 생성물을 수집하였다. 이 미정제 MeHA를 증류수 250 mL에 녹이고, 그 용액을 pH ~7.0으로 조절하고, 외부 수조를 네 번 바꿔주면서 증류수에 24시간 동안 투석하였다. 투석된 MeHA 생성물을 냉동 건조시켜 솜 그물(cottony mesh)로 1.25g의 메틸 HA을 수득하였다. 1H NMR (D2O, δ): 1.85(s, 3H, NCH3), 3.20-3.80(m, 10H, OCH+OCH3). 치환도(SD)를 1H NMR으로 측정하고, SD = [(δ 3.20-3.8에서의 메틸 HA의 적분) - (δ 3.20-3.8에서의 HA의 적분)]/(1.85에서의 NCH3 의 적분), SD = 1 또는 이당류 단위당 평균 1개의 메틸기임을 확인하였다. 이는 상기 일차 히드록실기 및 하나 이상의 이차 히드록실기 모두 상기 과정에 의해 변형되었음을 의미한다.
C. FHA -2( DS -1)의 제조
1.0 g의 2,2,3,3,4,4-헵타플루오로-1-부탄올 (5 mmol)을 포함하는 25 mL 플라스크에 1.3 mL의 삼브롬화인 (7.5 mmol)을 천천히 첨가하였다. 그 혼합물을 30분 동안 60℃에서 교반하고, 이어서 포화 중탄산나트륨 용액(15 mL)을 서서히 첨가하여 반응을 종결시켰다. 그 수용액을 세 15mL 부분의 디클로로메탄으로 추출하고, 헵타플루오로부틸 브로마이드가 포함된 유기층을 농축하고, 잔여물을 다음 단계에서 정제없이 사용하였다.
HA (2.0 g)을 100 mL 비커에서 20mL의 NaOH (40% w/v)에 용해하고, 그 혼합물을 실온(rt)에서 2시간 동안 교반하였다. 생성된 점성의 액체를 100 mL의 이소프로판올이 담겨 있는 400 mL 비커로 옮기고, 계속 혼합하였다. 교반된 혼합물에 10 mL의 이소프로판올 내의 미정제 헵타플루오로부틸 브로마이드를 첨가하고, 그 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 생성된 현탁액을 여과하여 미정제 FHA-2 생성물을 수집하였다. 이 미정제 FHA-2 를 증류수 250 mL에 녹이고, 그 용액을 pH ~7.0으로 조절하고, 외부 수조를 네 번 바꿔주면서 증류수에 24시간 동안 투석하였다. 투석된 FHA-2 생성물을 냉동 건조시켜 솜 그물(cottony mesh)과 같은 FHA-2 로 고안된 1.5g의 FHA-2를 수득하였다. 1H NMR (D2O, δ): 1.82(s, 3H, NCH3), 3.15-3.80(m, 8H, OCH+OCH2). 19F NMR (D2O, δ): -115.3, -120.8. 치환도(SD)는 1H NMR을 이용하여 1.0으로 측정되었다. SD = [(δ 3.15-3.80에서의 FHA-2 의 적분) - (δ 3.20-3.8에서의 HA 의 적분)]/[(1.82에서의 NCH3 의 적분)x(2/3)].
D. FHA -2( DS -2)의 제조
3.0 g의 2,2,3,3,4,4-헵타플루오로-1-부탄올 (15 mmol)을 포함하는 25 mL 플라스크에 2.5 mL의 삼브롬화인 (16 mmol)을 천천히 첨가하였다. 그 혼합물을 30분 동안 60℃에서 교반하고, 이어서 포화 중탄산나트륨 용액(15 mL)을 서서히 첨가하여 반응을 종결시켰다. 그 수용액을 세 15mL 부분의 디클로로메탄으로 추출하고, 헵타플루오로부틸 브로마이드가 포함된 유기층을 농축하고, 잔여물을 다음 단계에서 정제없이 사용하였다.
HA (2.0 g)을 100 mL 비커에서 20 mL의 NaOH (40% w/v)에 용해하고, 그 혼합물을 실온(rt)에서 2시간 동안 교반하였다. 생성된 점성의 액체를 100 mL의 이소프로판올이 담겨 있는 400 mL 비커로 옮기고, 계속 혼합하였다. 교반된 혼합물에 10 mL의 이소프로판올 내의 미정제 헵타플루오로부틸 브로마이드를 첨가하고, 그 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 생성된 현탁액을 여과하여 미정제 FHA-2 생성물을 수집하였다. 이 미정제 FHA-2 를 증류수 250 mL에 녹이고, 그 용액을 pH ~7.0으로 조절하고, 외부 수조를 네 번 바꿔주면서 증류수에 24시간 동안 투석하였다. 투석된 FHA-2 생성물을 냉동 건조시켜 솜 그물(cottony mesh)과 같은 FHA-2 로 고안된 1.5g의 FHA-2를 수득하였다. 1H NMR (D2O, δ): 1.82(s, 3H, NCH3), 3.15-3.80(m, 8H, OCH+OCH2). 19F NMR (D2O, δ): -115.3, -120.8. 치환도(SD)는 1H NMR을 이용하여 2.0으로 측정되었다. SD = [(δ 3.15-3.80에서의 FHA-2 의 적분) - (δ 3.20-3.8에서의 HA 의 적분)]/[(1.82에서의 NCH3 의 적분)x(2/3)].
E. FHA -1( DS -1)의 제조
1.0 g의 2,2,3,3-펜타플루오로-1-프로판올 (5 mmol)을 포함하는 25 mL 플라스크에 1.3 mL의 삼브롬화인 (7.5 mmol)을 천천히 첨가하였다. 그 혼합물을 30분 동안 60℃에서 교반하고, 이어서 포화 중탄산나트륨 용액(15 mL)을 서서히 첨가하여 반응을 종결시켰다. 그 수용액을 세 15mL 부분의 디클로로메탄으로 추출하고, 헵타플루오로부틸 브로마이드가 포함된 유기층을 농축하고, 잔여물을 다음 단계에서 정제없이 사용하였다.
HA (2.0 g)을 100 mL 비커에서 20 mL의 NaOH (40% w/v)에 용해하고, 그 혼합물을 실온(rt)에서 2시간 동안 교반하였다. 생성된 점성의 액체를 100 mL의 이소프로판올이 담겨 있는 400 mL 비커로 옮기고, 계속 혼합하였다. 교반된 혼합물에 10 mL의 이소프로판올 내의 미정제 헵타플루오로부틸 브로마이드를 첨가하고, 그 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 생성된 현탁액을 여과하여 미정제 FHA-1 생성물을 수집하였다. 이 미정제 FHA-1을 증류수 250 mL에 녹이고, 그 용액을 pH ~7.0으로 조절하고, 외부 수조를 네 번 바꿔주면서 증류수에 24시간 동안 투석하였다. 투석된 FHA-1 생성물을 냉동 건조시켜 솜 그물(cottony mesh)과 같은 FHA-1 로 고안된 1.5g의 FHA-1을 수득하였다. 1H NMR (D2O, δ): 1.80(s, 3H, NCH3), 3.15-3.80(m, 8H, OCH+OCH2). 19F NMR (D2O, δ): -113.6, -118.0. 치환도(SD)는 1H NMR을 이용하여 1.0으로 측정되었다. SD = [(δ 3.15-3.80에서의 FHA-1 의 적분) - (δ 3.20-3.8에서의 HA 의 적분)]/[(1.80에서의 NCH3 의 적분)x(2/3)].
F. FHA -1( DS -2)의 제조
3.0 g의 2,2,3,3-펜타플루오로-1-프로판올 (15 mmol)을 포함하는 25 mL 플라스크에 3 mL의 삼브롬화인 (18 mmol)을 천천히 첨가하였다. 그 혼합물을 30분 동안 60℃에서 교반하고, 이어서 포화 중탄산나트륨 용액(15 mL)을 서서히 첨가하여 반응을 종결시켰다. 그 수용액을 세 15mL 부분의 디클로로메탄으로 추출하고, 헵타플루오로부틸 브로마이드가 포함된 유기층을 농축하고, 잔여물을 다음 단계에서 정제없이 사용하였다.
HA (2.0 g)을 100 mL 비커에서 20 mL의 NaOH (40% w/v)에 용해하고, 그 혼합물을 실온(rt)에서 2시간 동안 교반하였다. 생성된 점성의 액체를 100 mL의 이소프로판올이 담겨 있는 400 mL 비커로 옮기고, 계속 혼합하였다. 교반된 혼합물에 10 mL의 이소프로판올 내의 미정제 헵타플루오로부틸 브로마이드를 첨가하고, 그 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 생성된 현탁액을 여과하여 미정제 FHA-1 생성물을 수집하였다. 이 미정제 FHA-1을 증류수 250 mL에 녹이고, 그 용액을 pH ~7.0으로 조절하고, 외부 수조를 네 번 바꿔주면서 증류수에 24시간 동안 투석하였다. 투석된 FHA-1 생성물을 냉동 건조시켜 솜 그물(cottony mesh)과 같은 FHA-1 로 고안된 1.5g의 FHA-1을 수득하였다. 1H NMR (D2O, δ): 1.80(s, 3H, NCH3), 3.15-3.80(m, 8H, OCH+OCH2). 19F NMR (D2O, δ): -113.6, -118.0. 치환도(SD)는 1H NMR을 이용하여 2.0으로 측정되었다. SD = [(δ 3.15-3.80에서의 FHA-1 의 적분) - (δ 3.20-3.8에서의 HA 의 적분)]/[(1.80에서의 NCH3 의 적분)x(2/3)].
G. BGHA 의 제조
히알루론산(HA, 노보자임 바이오폴리머스, 950 kDa) (2.0 g)을 100 mL 비커에서 20 mL의 NaOH (40% w/v)에 용해시키고, 그 혼합물을 실온(rt)에서 2시간 동안 교반하였다. 생성된 점성의 액체를 100 mL의 이소프로판올이 담겨 있는 400 mL 비커로 옮기고, 계속 혼합하였다. 교반된 혼합물에 10 mL의 벤질 글리시딜 에테르를 첨가하고, 그 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 생성된 현탁액을 여과하여 미정제 BGHA 생성물을 수집하였다. 이 미정제 BGHA를 증류수 250 mL에 녹이고, 그 용액을 pH ~7.0으로 조절하고, 외부 수조를 네 번 바꿔주면서 증류수에 24시간 동안 투석하였다. 투석된 BGHA 생성물을 냉동 건조시켜 솜 그물(cottony mesh)같은 1.25g의 BGHA을 수득하였다. 1H NMR (D2O, δ): 1.85(s, 3H, NCH3), 3.20-3.80 (m, 10H, OCH+OCH3). 치환도(SD)를 1H NMR으로 측정하였고, SD = 1 미만이다.
H. 저 분자량 메틸 HA ( DS -2)의 제조
히알루론산(HA, 노보자임 바이오폴리머스, 53 kDa) (2.0 g)을 100 mL 비커에서 20 mL의 NaOH (40% w/v)에 용해시키고, 그 혼합물을 실온(rt)에서 2시간 동안 교반하였다. 생성된 점성의 액체를 100 mL의 이소프로판올이 담겨 있는 400 mL 비커로 옮기고, 계속 혼합하였다. 교반된 혼합물에 10 mL의 요오드화메탄을 첨가하고, 그 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 생성된 현탁액을 여과하여 저분자 메틸화된 HA 생성물을 수집하였다. 이 미정제 LMW MeHA를 증류수 250 mL에 녹이고, 그 용액을 pH ~7.0으로 조절하고, 외부 수조를 네 번 바꿔주면서 증류수에 24시간 동안 투석하였다. 투석된 LMW MeHA생성물을 냉동 건조시켜 솜 그물(cottony mesh)같은 1.2g의 메틸 HA을 수득하였다. 1H NMR (D2O, δ): 1.85(s, 3H, NCH3), 3.20-3.80(m, 10H, OCH+OCH3). 치환도(SD)는 1H NMR을 이용하여 2로 측정되었다.
I. 저 분자량 메틸 HA ( DS -1)의 제조
히알루론산(HA, 노보자임 바이오폴리머스, 53 kDa) (2.0 g)을 100 mL 비커에서 20 mL의 NaOH (40% w/v)에 용해시키고, 그 혼합물을 실온(rt)에서 2시간 동안 교반하였다. 생성된 점성의 액체를 100 mL의 이소프로판올이 담겨 있는 400 mL 비커로 옮기고, 계속 혼합하였다. 교반된 혼합물에 4 mL의 요오드화메탄을 첨가하고, 그 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 생성된 현탁액을 여과하여 저분자 메틸화된 HA 생성물을 수집하였다. 이 미정제 LMW MeHA를 증류수 250 mL에 녹이고, 그 용액을 pH ~7.0으로 조절하고, 외부 수조를 네 번 바꿔주면서 증류수에 24시간 동안 투석하였다. 투석된 LMW MeHA생성물을 냉동 건조시켜 솜 그물(cottony mesh)같은 1.2g의 LMW MeHA을 수득하였다. 1H NMR (D2O, δ): 1.85(s, 3H, NCH3), 3.20-3.80(m, 10H, OCH+OCH3). 치환도(SD)는 1H NMR을 이용하여 1로 측정되었다.
J. 저 분자량 FHA -2( DS -1)의 제조
1.0 g의 2,2,3,3,4,4-헵타플루오로-1-부탄올 (5 mmol)을 포함하는 25 mL 플라스크에 1.3 mL의 삼브롬화인 (7.5 mmol)을 천천히 첨가하였다. 그 혼합물을 30분 동안 60℃에서 교반하고, 이어서 포화 중탄산나트륨 용액(15 mL)을 서서히 첨가하여 반응을 종결시켰다. 그 수용액을 세 15mL 부분의 디클로로메탄으로 추출하고, 헵타플루오로부틸 브로마이드가 포함된 유기층을 농축하고, 잔여물을 다음 단계에서 정제없이 사용하였다.
HA (2.0 g, 53 kDa)을 100 mL 비커에서 20 mL의 NaOH (40% w/v)에 용해하고, 그 혼합물을 실온(rt)에서 2시간 동안 교반하였다. 생성된 점성의 액체를 100 mL의 이소프로판올이 담겨 있는 400 mL 비커로 옮기고, 계속 혼합하였다. 교반된 혼합물에 10 mL의 이소프로판올 내의 미정제 헵타플루오로부틸 브로마이드를 첨가하고, 그 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 생성된 현탁액을 여과하여 미정제 LMW FHA-2 생성물을 수집하였다. 이 미정제 LMW FHA-2 를 증류수 250 mL에 녹이고, 그 용액을 pH ~7.0으로 조절하고, 외부 수조를 네 번 바꿔주면서 증류수에 24시간 동안 투석하였다. 투석된 LMW FHA-2 생성물을 냉동 건조시켜 솜 그물(cottony mesh)과 같은 LMW FHA-2 로 고안된 1.5g의 LMW FHA-2을 수득하였다. 1H NMR (D2O, δ): 1.82(s, 3H, NCH3), 3.15-3.80(m, 8H, OCH+OCH2). 19F NMR (D2O, δ): -115.3, -120.8. 치환도(SD)는 1H NMR을 이용하여 1.0으로 측정되었다.
K. 저분자량 FHA -2( DS -2)의 제조
3.0 g의 2,2,3,3,4,4-헵타플루오로-1-부탄올 (15 mmol)을 포함하는 25 mL 플라스크에 2.5 mL의 삼브롬화인 (16 mmol)을 천천히 첨가하였다. 그 혼합물을 30분 동안 60℃에서 교반하고, 이어서 포화 중탄산나트륨 용액(15 mL)을 서서히 첨가하여 반응을 종결시켰다. 그 수용액을 세 15mL 부분의 디클로로메탄으로 추출하고, 헵타플루오로부틸 브로마이드가 포함된 유기층을 농축하고, 잔여물을 다음 단계에서 정제없이 사용하였다.
HA (2.0 g, 53 kDa)을 100 mL 비커에서 20 mL의 NaOH (40% w/v)에 용해하고, 그 혼합물을 실온(rt)에서 2시간 동안 교반하였다. 생성된 점성의 액체를 100 mL의 이소프로판올이 담겨 있는 400 mL 비커로 옮기고, 계속 혼합하였다. 교반된 혼합물에 10 mL의 이소프로판올 내의 미정제 헵타플루오로부틸 브로마이드를 첨가하고, 그 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 생성된 현탁액을 여과하여 미정제 LMW FHA-2 생성물을 수집하였다. 이 미정제 LMW FHA-2 를 증류수 250 mL에 녹이고, 그 용액을 pH ~7.0으로 조절하고, 외부 수조를 네 번 바꿔주면서 증류수에 24시간 동안 투석하였다. 투석된 LMW FHA-2 생성물을 냉동 건조시켜 솜 그물(cottony mesh)과 같은 LMW FHA-2 로 고안된 1.5g의 LMW FHA-2을 수득하였다. 1H NMR (D2O, δ): 1.82(s, 3H, NCH3), 3.15-3.80(m, 8H, OCH+OCH2). 19F NMR (D2O, δ): -115.3, -120.8. 치환도(SD)는 1H NMR을 이용하여 2.0으로 측정되었다.
L. 저분자량 FHA -1( DS -1)의 제조
1.0 g의 2,2,3,3-펜타플루오로-1-프로판올 (5 mmol)을 포함하는 25 mL 플라스크에 1.3 mL의 삼브롬화인 (7.5 mmol)을 천천히 첨가하였다. 그 혼합물을 30분 동안 60℃에서 교반하고, 이어서 포화 중탄산나트륨 용액(15 mL)을 서서히 첨가하여 반응을 종결시켰다. 그 수용액을 세 15mL 부분의 디클로로메탄으로 추출하고, 헵타플루오로부틸 브로마이드가 포함된 유기층을 농축하고, 잔여물을 다음 단계에서 정제없이 사용하였다.
HA (2.0 g, 53 kDa)을 100 mL 비커에서 20 mL의 NaOH (40% w/v)에 용해하고, 그 혼합물을 실온(rt)에서 2시간 동안 교반하였다. 생성된 점성의 액체를 100 mL의 이소프로판올이 담겨 있는 400 mL 비커로 옮기고, 계속 혼합하였다. 교반된 혼합물에 10 mL의 이소프로판올 내의 미정제 헵타플루오로부틸 브로마이드를 첨가하고, 그 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 생성된 현탁액을 여과하여 미정제 LMW FHA-1 생성물을 수집하였다. 이 미정제 LMW FHA-1을 증류수 250 mL에 녹이고, 그 용액을 pH ~7.0으로 조절하고, 외부 수조를 네 번 바꿔주면서 증류수에 24시간 동안 투석하였다. 투석된 LMW FHA-1 생성물을 냉동 건조시켜 솜 그물(cottony mesh)과 같은 LMW FHA-1 로 고안된 1.5g의 LMW FHA-1을 수득하였다. 1H NMR (D2O, δ): 1.80(s, 3H, NCH3), 3.15-3.80(m, 8H, OCH+OCH2). 19F NMR (D2O, δ): -113.6, -118.0. 치환도(SD)는 1H NMR을 이용하여 1.0으로 측정되었다.
M. LMW FHA -1( DS -2)의 제조
3.0 g의 2,2,3,3-펜타플루오로-1-프로판올 (15 mmol)을 포함하는 25 mL 플라스크에 3 mL의 삼브롬화인 (18 mmol)을 천천히 첨가하였다. 그 혼합물을 30분 동안 60℃에서 교반하고, 이어서 포화 중탄산나트륨 용액(15 mL)을 서서히 첨가하여 반응을 종결시켰다. 그 수용액을 세 15mL 부분의 디클로로메탄으로 추출하고, 헵타플루오로부틸 브로마이드가 포함된 유기층을 농축하고, 잔여물을 다음 단계에서 정제없이 사용하였다.
HA (2.0 g, 53 kDa)을 100 mL 비커에서 20 mL의 NaOH (40% w/v)에 용해하고, 그 혼합물을 실온(rt)에서 2시간 동안 교반하였다. 생성된 점성의 액체를 100 mL의 이소프로판올이 담겨 있는 400 mL 비커로 옮기고, 계속 혼합하였다. 교반된 혼합물에 10 mL의 이소프로판올 내의 미정제 헵타플루오로부틸 브로마이드를 첨가하고, 그 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 생성된 현탁액을 여과하여 미정제 LMW FHA-1 생성물을 수집하였다. 이 미정제 LMW FHA-1을 증류수 250 mL에 녹이고, 그 용액을 pH ~7.0으로 조절하고, 외부 수조를 네 번 바꿔주면서 증류수에 24시간 동안 투석하였다. 투석된 LMW FHA-1 생성물을 냉동 건조시켜 솜 그물(cottony mesh)과 같은 LMW FHA-1 로 고안된 1.5g의 LMW FHA-1을 수득하였다1H NMR (D2O, δ): 1.80(s, 3H, NCH3), 3.15-3.80(m, 8H, OCH+OCH2). 19F NMR (D2O, δ): -113.6, -118.0. 치환도(SD)는 1H NMR을 이용하여 2.0으로 측정되었다.
N. 저분자량 BGHA 의 제조
히알루론산(HA, 노보자임 바이오폴리머스, 53 kDa) (2.0 g)을 100 mL 비커에서 20 mL의 NaOH (40% w/v)에 용해시키고, 그 혼합물을 실온(rt)에서 2시간 동안 교반하였다. 생성된 점성의 액체를 100 mL의 이소프로판올이 담겨 있는 400 mL 비커로 옮기고, 계속 혼합하였다. 교반된 혼합물에 10 mL의 벤질 글리시딜 에테르를 첨가하고, 그 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 생성된 현탁액을 여과하여 미정제 LMW BGHA 생성물을 수집하였다. 이 미정제 LMW BGHA를 증류수 250 mL에 녹이고, 그 용액을 pH ~7.0으로 조절하고, 외부 수조를 네 번 바꿔주면서 증류수에 24시간 동안 투석하였다. 투석된 LMW BGHA 생성물을 냉동 건조시켜 솜 그물(cottony mesh)같은 1.25g의 LMW BGHA을 수득하였다. 1H NMR (D2O, δ): 1.85(s, 3H, NCH3), 3.20-3.80(m, 10H, OCH+OCH3). 치환도(SD)를 1H NMR으로 측정하였고, SD = 1 미만이다.
II . 알킬화된 HA 유도체들의 설페이트화
1. LMW -P- OSFHA -1 ( DS -1) ( GM -211101)의 제조
우선, 1N HCl으로 pH를 3.0으로 조절한 100 mL의 탈이온화수 내의 LMW FHA-1 (1.0g)에 1 mL의 트리부틸아민을 첨가함으로써 상기 LMW FHA-1(DS-1)의 트리부틸암모늄(TBA) 염을 제조하였다. 그 혼합물을 강하게 혼합하고, 냉동 건조를 통해 건조시켰다. 생성된 염(FHA-1-TBA)을 25 mL의 DMF에 용해하고, 여기에 필요한 과잉(HA에서 이용 가능한 히드록실기의 6몰/당량)의 피리딘-황 트리옥사이드 콤플렉스(0.4 g)을 첨가하였다. 3시간 동안 40℃에서 교반한 후, 50 mL 물을 첨가하여 반응을 종결시키고, 그 미정제 물질을 무수 아세테이트 나트륨으로 포화된 75 mL의 냉 에탄올로 침전시킨 후, 여과를 통해 수집하였다. 생성된 미정제 부분적으로 O-설페이트화된 HA를 증류수에 녹이고 이틀 동안 하루에 네 번씩 용액을 바꾸면서100 mM의 NaCl 용액에 투석시키고, 냉동 건조하여 생성물 (330 mg)을 75% 수율로 얻었으며, 1H NMR에 의해 특성화하고, 설페이트화 SD=1.0이었다. 상기 치환도를 OCH의 NMR 시프트와 문헌에 있는 것들을 비교하여 결정하였다(Carbohydrate Research, 1998, 306, 35-43).
2. LMW -P- OSFHA -2 ( DS -1) ( GM -311101)의 제조
증류수 50 mL내의 FHA-2 (0.25 g)에 0.5 mL의 트리부틸아민을 첨가함으로써 상기 LMW FHA-2 (MW 53 kDa HA으로부터의 FHA-2)의 TBA 염을 제조하고, 상기 1에 기재된 바와 같이 처리하였다. 생성된 염(LMW FHA-2-TBA)을 25 mL의 DMF에 용해하고, 여기에 필요한 과잉(HA에서 이용 가능한 히드록실기의 6 몰/당량)의 피리딘-황 트리옥사이드 콤플렉스(0.4 g)을 첨가하였다. 3시간 동안 40℃에서 교반한 후, 50 mL 물을 첨가하여 반응을 종결시키고, 그 미정제 물질을 무수 아세테이트 나트륨으로 포화된 냉 에탄올 75 mL의 첨가로 침전시킨 후, 여과를 통해 수집하였다. 생성된 미정제 부분적으로 O-설페이트화된 LMW FHA-2 를 상기 1에 기재된 바와 같이 물에 녹이고, 투석시키고, 냉동 건조하였다. 생성물 (300 mg)을 68% 수율로 얻었으며, 1H NMR에 의해 특성화하고, 설페이트화 SD=1.0이었다.
3. LMW -P- OSMeHA ( DS -1) ( GM -111101)의 제조
상기 1에서와 같이 0.5 mL의 TBA 및 증류수 50 mL내 LMW MeHA (0.5 g)으로부터 상기 LMW MeHA (DS-1) (MW 53 kDa HA에서 유래)의 TBA 염을 제조하였다. 생성된 염(LMW MeHA-TBA)을 50 mL의 DMF에 용해하고, 여기에 필요한 과잉(MeHA에서 이용 가능한 히드록실기의 6 몰/당량)의 피리딘-황 트리옥사이드 콤플렉스(0.8 g)을 첨가하였다. 3시간 동안 40℃에서 교반한 후, 100 mL 물을 첨가하여 반응을 종결시키고, 그 미정제 물질을 무수 아세테이트 나트륨으로 포화된 냉 에탄올 150 mL의 첨가로 침전시킨 후, 여과를 통해 수집하였다. 생성된 미정제 부분적으로 O-설페이트화된 MeHA를 상기 1에 기재된 바와 같이 물에 녹이고, 투석시키고, 냉동 건조하여 생성물 (540 mg)을 62% 수율로 얻었으며, 이는 1H NMR에 의해 설페이트화 SD=1.0~1.5임을 확인하였다.
4. LMW -P- OSFHA -1 ( DS -2) ( GM -211201)의 제조
증류수 50 mL내의 FHA-1 (0.25 g)에 0.5 mL의 트리부틸아민을 첨가함으로써 상기 LMW FHA-1 (MW 53 kDa HA에서 유래한 FHA-1)의 TBA 염을 제조하고, 상기 1에 기재된 바와 같이 처리하였다. 생성된 염(FHA-1-TBA)을 25 mL의 DMF에 용해하고, 여기에 필요한 과잉(HA에서 이용 가능한 히드록실기의 6 몰/당량)의 피리딘-황 트리옥사이드 콤플렉스(0.4 g)을 첨가하였다. 3시간 동안 40℃에서 교반한 후, 50 mL 물을 첨가하여 반응을 종결시키고, 그 미정제 물질을 무수 아세테이트 나트륨으로 포화된 냉 에탄올 75 mL의 첨가로 침전시킨 후, 여과를 통해 수집하였다. 생성된 미정제 부분적으로 O-설페이트화된 HA를 증류수에 녹이고 이틀 동안 하루에 네 번씩 용액을 바꾸면서100 mM의 NaCl 용액에 투석시키고, 냉동 건조하여 생성물 (300 mg)을 70% 수율로 얻었으며, 1H NMR에 의해 특성화하고, 설페이트화 SD=1.0이었다.
5. LMW -P- OSFHA -2 ( DS -2) ( GM -311201)의 제조
증류수 50 mL내의 FHA-2 (0.25 g)에 0.5 mL의 트리부틸아민을 첨가함으로써 상기 LMW FHA-1 (MW 53 kDa HA에서 유래한 FHA-2)의 TBA 염을 제조하고, 상기 1에 기재된 바와 같이 처리하였다. 생성된 염(LMW FHA-2-TBA)을 25 mL의 DMF에 용해하고, 여기에 필요한 과잉(HA에서 이용 가능한 히드록실기의 6 몰/당량)의 피리딘-황 트리옥사이드 콤플렉스(0.4 g)을 첨가하였다. 3시간 동안 40℃에서 교반한 후, 50 mL 물을 첨가하여 반응을 종결시키고, 그 미정제 물질을 무수 아세테이트 나트륨으로 포화된 냉 에탄올 75 mL의 첨가로 침전시킨 후, 여과를 통해 수집하였다. 생성된 미정제 부분적으로 O-설페이트화된 LMW FHA-2를 상기 1에 기재된 바와 같이 물에 녹이고, 투석시키고, 냉동 건조하여 생성물 (310 mg)을 70% 수율로 얻었으며, 이는 1H NMR에 의해 설페이트화 SD=1.0임을 확인하였다.
6. LMW -P- OSMeHA ( DS -2) ( GM -111201)의 제조
상기 1에서와 같이 0.5 mL의 TBA 및 증류수 50 mL내 LMW MeHA (0.5 g)으로부터 상기 LMW MeHA (DS-1) (MW 53 kDa HA에서 유래)의 TBA 염을 제조하였다. 생성된 염(LMW MeHA-TBA)을 50 mL의 DMF에 용해하고, 여기에 필요한 과잉 (MeHA에서 이용 가능한 히드록실기의 6 몰/당량)의 피리딘-황 트리옥사이드 콤플렉스(0.8 g)을 첨가하였다. 3시간 동안 40℃에서 교반한 후, 100 mL 물을 첨가하여 반응을 종결시키고, 미정제 물질을 무수 아세테이트 나트륨으로 포화된 냉 에탄올 150 mL의 첨가로 침전시킨 후, 여과를 통해 수집하였다. 생성된 미정제 부분적으로 O-설페이트화된 MeHA를 상기 1에 기재된 바와 같이 물에 녹이고, 투석시키고, 냉동 건조하여 생성물 (560 mg)을 64% 수율로 얻었으며, 이는 1H NMR에 의해 설페이트화 SD=1.0~1.5임을 확인하였다.
7. P- OSFHA -1 ( DS -1) ( GM -231101)의 제조
증류수 50 mL내의 FHA-1 (0.25 g)에 0.5 mL의 트리부틸아민을 첨가함으로써 상기 FHA-1 (MW 950 kDa HA에서 유래한 FHA-1)의 TBA 염을 제조하고, 상기 1에 기재된 바와 같이 처리하였다. 생성된 염(FHA-1-TBA)을 25 mL의 DMF에 용해하고, 여기에 필요한 과잉(HA에서 이용 가능한 히드록실기의 6 몰/당량)의 피리딘-황 트리옥사이드 콤플렉스(0.4 g)을 첨가하였다. 3시간 동안 40℃에서 교반한 후, 50 mL 물을 첨가하여 반응을 종결시키고, 그 미정제 물질을 무수 아세테이트 나트륨으로 포화된 냉 에탄올 75 mL의 첨가로 침전시킨 후, 여과를 통해 수집하였다. 생성된 미정제 부분적으로 O-설페이트화된 HA를 증류수에 녹이고 이틀 동안 하루에 네 번씩 용액을 바꾸면서100 mM의 NaCl 용액에 투석시키고, 냉동 건조하여 생성물 (300 mg)을 68% 수율로 얻었으며, 1H NMR에 의해 특성화하고, 설페이트화 SD=1.0~1.5이었다.
8. P- OSFHA -2 ( DS -1) ( GM -331101)의 제조
증류수 50 mL내의 FHA-2 (0.25 g)에 0.5 mL의 트리부틸아민을 첨가함으로써 상기 FHA-2 (MW 950 kDa HA에서 유래한 FHA-2)의 TBA 염을 제조하고, 상기 1에 기재된 바와 같이 처리하였다. 생성된 염(FHA-2-TBA)을 25 mL의 DMF에 용해하고, 여기에 필요한 과잉(HA에서 이용 가능한 히드록실기의 6 몰/당량)의 피리딘-황 트리옥사이드 콤플렉스(0.4 g)을 첨가하였다. 3시간 동안 40℃에서 교반한 후, 50 mL 물을 첨가하여 반응을 종결시키고, 그 미정제 물질을 무수 아세테이트 나트륨으로 포화된 냉 에탄올 75 mL의 첨가로 침전시킨 후, 여과를 통해 수집하였다. 생성된 미정제 부분적으로 O-설페이트화된 FHA-2 를 상기 1에 기재된 바와 같이 물에 녹이고, 투석시키고, 냉동 건조하여 생성물 (320 mg)을 70% 수율로 얻었으며, 이는 1H NMR에 의해 설페이트화 SD=1.0~1.5임을 확인하였다.
9. P- OSMeHA ( DS -1) ( GM -131101)의 제조
상기 1에서와 같이 0.5 mL의 TBA 및 증류수 50 mL내 MeHA (0.5 g)으로부터 상기 MeHA (DS-1) (MW 950 kDa HA에서 유래)의 TBA 염을 제조하였다. 생성된 염(MeHA-TBA)을 50 mL의 DMF에 용해하고, 여기에 필요한 과잉(MeHA에서 이용 가능한 히드록실기의 6 몰/당량)의 피리딘-황 트리옥사이드 콤플렉스(0.8 g)을 첨가하였다. 3시간 동안 40℃에서 교반한 후, 100 mL 물을 첨가하여 반응을 종결시키고, 미정제 물질을 무수 아세테이트 나트륨으로 포화된 냉 에탄올 150 mL의 첨가로 침전시킨 후, 여과를 통해 수집하였다. 생성된 미정제 부분적으로 O-설페이트화된 MeHA를 상기 1에 기재된 바와 같이 물에 녹이고, 투석시키고, 냉동 건조하여 생성물 (510 mg)을 60% 수율로 얻었으며, 이는 1H NMR에 의해 설페이트화 SD=1.0~1.5임을 확인하였다.
10. P- OSFHA -1 ( DS -2) ( GM -231201)의 제조
증류수 50 mL내의 FHA-1 (0.25 g)에 0.5 mL의 트리부틸아민을 첨가함으로써 상기 FHA-1 (MW 950 kDa HA에서 유래한 FHA-1)의 TBA 염을 제조하고, 상기 1에 기재된 바와 같이 처리하였다. 생성된 염(FHA-1-TBA)을 25 mL의 DMF에 용해하고, 여기에 필요한 과잉(HA에서 이용 가능한 히드록실기의 6 몰/당량)의 피리딘-황 트리옥사이드 콤플렉스(0.4 g)을 첨가하였다. 3시간 동안 40℃에서 교반한 후, 50 mL 물을 첨가하여 반응을 종결시키고, 그 미정제 물질을 무수 아세테이트 나트륨으로 포화된 냉 에탄올 75 mL의 첨가로 침전시킨 후, 여과를 통해 수집하였다. 생성된 미정제 부분적으로 O-설페이트화된 HA 를 증류수에 녹이고 이틀 동안 하루에 네 번씩 용액을 바꾸면서100 mM의 NaCl 용액에 투석시키고, 냉동 건조하여 생성물 (280 mg)을 68% 수율로 얻었으며, 1H NMR에 의해 특성화하고, 설페이트화 SD=1.0~1.5이었다.
11. P- OSFHA -2 ( DS -2) ( GM -331201)의 제조
증류수 50 mL내의 FHA-2 (0.25 g)에 0.5 mL의 트리부틸아민을 첨가함으로써 상기 FHA-2 (MW 950 kDa HA에서 유래한 FHA-2)의 TBA 염을 제조하고, 상기 1에 기재된 바와 같이 처리하였다. 생성된 염(FHA-2-TBA)을 25 mL의 DMF에 용해하고, 여기에 필요한 과잉(HA에서 이용 가능한 히드록실기의 6 몰/당량)의 피리딘-황 트리옥사이드 콤플렉스(0.4 g)을 첨가하였다. 3시간 동안 40℃에서 교반한 후, 50 mL 물을 첨가하여 반응을 종결시키고, 그 미정제 물질을 무수 아세테이트 나트륨으로 포화된 냉 에탄올 75 mL의 첨가로 침전시킨 후, 여과를 통해 수집하였다. 생성된 미정제 부분적으로 O-설페이트화된 FHA-2 를 상기 1에서와 같이 증류수에 녹이고, 투석시키고, 냉동 건조하여 생성물 (300 mg)을 69% 수율로 얻었으며, 1H NMR에 의해 특성화하고, 설페이트화 SD=1.0~1.5이었다.
12. P- OSMeHA ( DS -2) ( GM -131201)의 제조
상기 1에서와 같이 0.5 mL의 TBA 및 증류수 50 mL내 MeHA (0.5 g)으로부터 상기 MeHA (DS-1) (MW 950 kDa HA에서 유래)의 TBA 염을 제조하였다. 생성된 염(MeHA-TBA)을 50 mL의 DMF에 용해하고, 여기에 필요한 과잉(MeHA에서 이용 가능한 히드록실기의 6 몰/당량)의 피리딘-황 트리옥사이드 콤플렉스(0.8 g)을 첨가하였다. 3시간 동안 40℃에서 교반한 후, 100 mL 물을 첨가하여 반응을 종결시키고, 미정제 물질을 무수 아세테이트 나트륨으로 포화된 냉 에탄올 150 mL의 첨가로 침전시킨 후, 여과를 통해 수집하였다. 생성된 미정제 부분적으로 O-설페이트화된 MeHA를 상기 1에 기재된 바와 같이 물에 녹이고, 투석시키고, 냉동 건조하여 생성물 (560 mg)을 64% 수율로 얻었으며, 이는 1H NMR에 의해 설페이트화 SD=1.0~1.5임을 확인하였다.
13. LMW -F- OSFHA -1 ( DS -1) ( GM -212101)의 제조
증류수 50 mL내의 FHA-1 (0.25 g)에 0.5 mL의 트리부틸아민을 첨가함으로써 상기 LMW FHA-1 (MW 53 kDa HA에서 유래한 FHA-1)의 TBA 염을 제조하고, 상기 1에 기재된 바와 같이 처리하였다. 생성된 염(FHA-1-TBA)을 25 mL의 DMF에 용해하고, 여기에 필요한 과잉(HA에서 이용 가능한 히드록실기의 12 몰/당량)의 피리딘-황 트리옥사이드 콤플렉스(0.8 g)을 첨가하였다. 3시간 동안 40℃에서 교반한 후, 50 mL 물을 첨가하여 반응을 종결시키고, 그 미정제 물질을 무수 아세테이트 나트륨으로 포화된 냉 에탄올 75 mL의 첨가로 침전시킨 후, 여과를 통해 수집하였다. 생성된 미정제 부분적으로 O-설페이트화된 HA 를 증류수에 녹이고 이틀 동안 하루에 네 번씩 용액을 바꾸면서100 mM의 NaCl 용액에 투석시키고, 냉동 건조하여 생성물 (300 mg)을 71% 수율로 얻었으며, 1H NMR에 의해 특성화하고, 설페이트화 SD=1.5~2.0이었다.
14. LMW -F- OSFHA -2 ( DS -1) ( GM -312101)의 제조
증류수 50 mL내의 FHA-2 (0.25 g)에 0.5 mL의 트리부틸아민을 첨가함으로써 상기 LMW FHA-2 (MW 53 kDa HA에서 유래한 FHA-2)의 TBA 염을 제조하고, 상기 1에 기재된 바와 같이 처리하였다. 생성된 염(LMW FHA-2-TBA)을 25 mL의 DMF에 용해하고, 여기에 필요한 과잉(HA에서 이용 가능한 히드록실기의 12 몰/당량)의 피리딘-황 트리옥사이드 콤플렉스(0.8 g)을 첨가하였다. 3시간 동안 40℃에서 교반한 후, 50 mL 물을 첨가하여 반응을 종결시키고, 그 미정제 물질을 무수 아세테이트 나트륨으로 포화된 냉 에탄올 75 mL의 첨가로 침전시킨 후, 여과를 통해 수집하였다. 생성된 미정제 부분적으로 O-설페이트화된 LMW FHA-2 를 상기 1에 기재된 바와 같이 증류수에 녹이고, 투석시키고, 냉동 건조하여 생성물 (260 mg)을 65% 수율로 얻었으며, 1H NMR에 의해 특성화하고, 설페이트화 SD=1.5~2.0이었다.
15. LMW -F- OSMeHA ( DS -1) ( GM -112101)의 제조
상기 1에서와 같이 0.5 mL의 TBA 및 증류수 50 mL내 LMW MeHA (0.5 g)으로부터 상기 LMW MeHA (DS-1) (MW 53 kDa HA에서 유래)의 TBA 염을 제조하였다. 생성된 염(LMW MeHA-TBA)을 50 mL의 DMF에 용해하고, 여기에 필요한 과잉(MeHA에서 이용 가능한 히드록실기의 12 몰/당량)의 피리딘-황 트리옥사이드 콤플렉스(1.8 g)을 첨가하였다. 3시간 동안 40℃에서 교반한 후, 100 mL 물을 첨가하여 반응을 종결시키고, 미정제 물질을 무수 아세테이트 나트륨으로 포화된 냉 에탄올 150 mL의 첨가로 침전시킨 후, 여과를 통해 수집하였다. 생성된 미정제 부분적으로 O-설페이트화된 MeHA를 상기 1에 기재된 바와 같이 물에 녹이고, 투석시키고, 냉동 건조하여 생성물 (480 mg)을 60% 수율로 얻었으며, 이는 1H NMR에 의해 설페이트화 SD=1.5~2.0임을 확인하였다.
16. LMW -F- OSFHA -1 ( DS -2) ( GM -212201)의 제조
증류수 50 mL내의 FHA-1 (0.25 g)에 0.5 mL의 트리부틸아민을 첨가함으로써 상기 LMW FHA-1 (MW 53 kDa HA에서 유래한 FHA-1)의 TBA 염을 제조하고, 상기 1에 기재된 바와 같이 처리하였다. 생성된 염(FHA-1-TBA)을 25 mL의 DMF에 용해하고, 여기에 필요한 과잉(HA에서 이용 가능한 히드록실기의 12 몰/당량)의 피리딘-황 트리옥사이드 콤플렉스(0.8 g)을 첨가하였다. 3시간 동안 40℃에서 교반한 후, 50 mL 물을 첨가하여 반응을 종결시키고, 그 미정제 물질을 무수 아세테이트 나트륨으로 포화된 냉 에탄올 75 mL의 첨가로 침전시킨 후, 여과를 통해 수집하였다. 생성된 미정제 부분적으로 O-설페이트화된 HA 를 증류수에 녹이고 이틀 동안 하루에 네 번씩 용액을 바꾸면서100 mM의 NaCl 용액에 투석시키고, 냉동 건조하여 생성물 (300 mg)을 70% 수율로 얻었으며, 1H NMR에 의해 특성화하고, 설페이트화 SD=1.5~2.0이었다.
17. LMW -F- OSFHA -2 ( DS -2) ( GM -312201)의 제조
증류수 50 mL내의 FHA-2 (0.25 g)에 0.5 mL의 트리부틸아민을 첨가함으로써 상기 LMW FHA-2 (MW 53 kDa HA에서 유래한 FHA-2)의 TBA 염을 제조하고, 상기 1에 기재된 바와 같이 처리하였다. 생성된 염(LMW FHA-2-TBA)을 25 mL의 DMF에 용해하고, 여기에 필요한 과잉(HA에서 이용 가능한 히드록실기의 12 몰/당량)의 피리딘-황 트리옥사이드 콤플렉스(0.8 g)을 첨가하였다. 3시간 동안 40℃에서 교반한 후, 50 mL 물을 첨가하여 반응을 종결시키고, 그 미정제 물질을 무수 아세테이트 나트륨으로 포화된 냉 에탄올 75 mL의 첨가로 침전시킨 후, 여과를 통해 수집하였다. 생성된 미정제 부분적으로 O-설페이트화된 LMW FHA-2 를 상기 1에 기재된 바와 같이 증류수에 녹이고, 투석시키고, 냉동 건조하여 생성물 (300 mg)을 68% 수율로 얻었으며, 1H NMR에 의해 특성화하고, 설페이트화 SD=1.5~2.0이었다.
18. LMW -F- OSMeHA ( DS -2) ( GM -112201)의 제조
상기 1에서와 같이 0.5 mL의 TBA 및 증류수 50 mL내 LMW MeHA (0.5 g)으로부터 상기 LMW MeHA (DS-1) (MW 53 kDa HA에서 유래)의 TBA 염을 제조하였다. 생성된 염(LMW MeHA-TBA)을 50 mL의 DMF에 용해하고, 여기에 필요한 과잉(MeHA에서 이용 가능한 히드록실기의 12 몰/당량)의 피리딘-황 트리옥사이드 콤플렉스(1.6 g)을 첨가하였다. 3시간 동안 40℃에서 교반한 후, 100 mL 물을 첨가하여 반응을 종결시키고, 미정제 물질을 무수 아세테이트 나트륨으로 포화된 냉 에탄올 150 mL의 첨가로 침전시킨 후, 여과를 통해 수집하였다. 생성된 미정제 부분적으로 O-설페이트화된 MeHA를 상기 1에 기재된 바와 같이 물에 녹이고, 투석시키고, 냉동 건조하여 생성물 (550 mg)을 63% 수율로 얻었으며, 이는 1H NMR에 의해 설페이트화 SD=1.5임을 확인하였다.
19. F- OSFHA -1 ( DS -1) ( GM -232101)의 제조
증류수 50 mL내의 FHA-1 (0.25 g)에 0.5 mL의 트리부틸아민을 첨가함으로써 상기 FHA-1 (MW 950 kDa HA에서 유래한 FHA-1)의 TBA 염을 제조하고, 상기 1에 기재된 바와 같이 처리하였다. 생성된 염(FHA-1-TBA)을 25 mL의 DMF에 용해하고, 여기에 필요한 과잉(HA에서 이용 가능한 히드록실기의 12 몰/당량)의 피리딘-황 트리옥사이드 콤플렉스(0.8 g)을 첨가하였다. 3시간 동안 40℃에서 교반한 후, 50 mL 물을 첨가하여 반응을 종결시키고, 그 미정제 물질을 무수 아세테이트 나트륨으로 포화된 냉 에탄올 75 mL의 첨가로 침전시킨 후, 여과를 통해 수집하였다. 생성된 미정제 부분적으로 O-설페이트화된 HA를 증류수에 녹이고 이틀 동안 하루에 네 번씩 용액을 바꾸면서100 mM의 NaCl 용액에 투석시키고, 냉동 건조하여 생성물 (300 mg)을 68% 수율로 얻었으며, 1H NMR에 의해 특성화하고, 설페이트화 SD=1.5이었다.
20. F- OSFHA -2 ( DS -1) ( GM -332101)의 제조
증류수 50 mL내의 FHA-2 (0.25 g)에 0.5 mL의 트리부틸아민을 첨가함으로써 상기 FHA-2 (MW 950 kDa HA에서 유래한 FHA-2)의 TBA 염을 제조하고, 상기 1에 기재된 바와 같이 처리하였다. 생성된 염(FHA-2-TBA)을 25 mL의 DMF에 용해하고, 여기에 필요한 과잉(HA에서 이용 가능한 히드록실기의 12 몰/당량)의 피리딘-황 트리옥사이드 콤플렉스(0.8 g)을 첨가하였다. 3시간 동안 40℃에서 교반한 후, 50 mL 물을 첨가하여 반응을 종결시키고, 그 미정제 물질을 무수 아세테이트 나트륨으로 포화된 냉 에탄올 75 mL의 첨가로 침전시킨 후, 여과를 통해 수집하였다. 생성된 미정제 부분적으로 O-설페이트화된 FHA-2 를 상기 1에 기재된 바와 같이 증류수에 녹이고, 투석시키고, 냉동 건조하여 생성물 (310 mg)을 70% 수율로 얻었으며, 1H NMR에 의해 특성화하고, 설페이트화 SD=1.5~2.0이었다.
21. F- OSMeHA ( DS -1) ( GM -132101)의 제조
상기 1에서와 같이 0.5 mL의 TBA 및 증류수 50 mL내 MeHA (0.5 g)으로부터 상기 MeHA (DS-1) (MW 950 kDa HA에서 유래)의 TBA 염을 제조하였다. 생성된 염(MeHA-TBA)을 50 mL의 DMF에 용해하고, 여기에 필요한 과잉(MeHA에서 이용 가능한 히드록실기의 12 몰/당량)의 피리딘-황 트리옥사이드 콤플렉스(1.6 g)을 첨가하였다. 3시간 동안 40℃에서 교반한 후, 100 mL 물을 첨가하여 반응을 종결시키고, 미정제 물질을 무수 아세테이트 나트륨으로 포화된 냉 에탄올 150 mL의 첨가로 침전시킨 후, 여과를 통해 수집하였다. 생성된 미정제 부분적으로 O-설페이트화된 MeHA를 상기 1에 기재된 바와 같이 물에 녹이고, 투석시키고, 냉동 건조하여 생성물 (500 mg)을 60% 수율로 얻었으며, 이는 1H NMR에 의해 설페이트화 SD=1.5~2.0임을 확인하였다.
22. F- OSFHA -1 ( DS -2) ( GM -232201)의 제조
증류수 50 mL내의 FHA-1 (0.25 g)에 0.5 mL의 트리부틸아민을 첨가함으로써 상기 FHA-1 (MW 950 kDa HA에서 유래한 FHA-1)의 TBA 염을 제조하고, 상기 1에 기재된 바와 같이 처리하였다. 생성된 염(FHA-1-TBA)을 25 mL의 DMF에 용해하고, 여기에 필요한 과잉(HA에서 이용 가능한 히드록실기의 12 몰/당량)의 피리딘-황 트리옥사이드 콤플렉스(0.8 g)을 첨가하였다. 3시간 동안 40℃에서 교반한 후, 50 mL 물을 첨가하여 반응을 종결시키고, 그 미정제 물질을 무수 아세테이트 나트륨으로 포화된 냉 에탄올 75 mL의 첨가로 침전시킨 후, 여과를 통해 수집하였다. 생성된 미정제 부분적으로 O-설페이트화된 HA를 증류수에 녹이고 이틀 동안 하루에 네 번씩 용액을 바꾸면서100 mM의 NaCl 용액에 투석시키고, 냉동 건조하여 생성물 (300 mg)을 69% 수율로 얻었으며, 1H NMR에 의해 특성화하고, 설페이트화 SD=1.5~2.0 이었다.
23. F- OSFHA -2 ( DS -2) ( GM -332201)의 제조
증류수 50 mL내의 FHA-2 (0.25 g)에 0.5 mL의 트리부틸아민을 첨가함으로써 상기 FHA-2 (MW 950 kDa HA에서 유래한 FHA-2)의 TBA 염을 제조하고, 상기 1에 기재된 바와 같이 처리하였다. 생성된 염(FHA-2-TBA)을 25 mL의 DMF에 용해하고, 여기에 필요한 과잉(HA에서 이용 가능한 히드록실기의 12 몰/당량)의 피리딘-황 트리옥사이드 콤플렉스(0.8 g)을 첨가하였다. 3시간 동안 40℃에서 교반한 후, 50 mL 물을 첨가하여 반응을 종결시키고, 그 미정제 물질을 무수 아세테이트 나트륨으로 포화된 냉 에탄올 75 mL의 첨가로 침전시킨 후, 여과를 통해 수집하였다. 생성된 미정제 부분적으로 O-설페이트화된 FHA-2를 상기 1에 기재된 바와 같이 물에 녹이고, 투석시키고, 냉동 건조하여 생성물 (300 mg)을 69% 수율로 얻었으며, 1H NMR에 의해 특성화하고, 설페이트화 SD=1.5~2.0 이었다.
24. F- OSMeHA ( DS -2) ( GM -132201)의 제조
상기 1에서와 같이 0.5 mL의 TBA 및 증류수 50 mL내 MeHA (0.5 g)으로부터 상기 MeHA (DS-1) (MW 950 kDa HA에서 유래)의 TBA 염을 제조하였다. 생성된 염(MeHA-TBA)을 50 mL의 DMF에 용해하고, 여기에 필요한 과잉(MeHA에서 이용 가능한 히드록실기의 12 몰/당량)의 피리딘-황 트리옥사이드 콤플렉스(1.6 g)을 첨가하였다. 3시간 동안 40℃에서 교반한 후, 100 mL 물을 첨가하여 반응을 종결시키고, 미정제 물질을 무수 아세테이트 나트륨으로 포화된 냉 에탄올 150 mL의 첨가로 침전시킨 후, 여과를 통해 수집하였다. 생성된 미정제 부분적으로 O-설페이트화된 MeHA를 상기 1에 기재된 바와 같이 물에 녹이고, 투석시키고, 냉동 건조하여 생성물 (550 mg)을 63% 수율로 얻었으며, 이는 1H NMR에 의해 설페이트화 SD=1.5~2.0임을 확인하였다.
25. P- OSBGHA ( GM -431101)의 제조
상기 1에서와 같이 0.5 mL의 TBA 및 증류수 50 mL내 BGHA (0.5 g)으로부터 상기 BGHA (MW 950 kDa HA에서 유래)의 TBA 염을 제조하였다. 생성된 염(BGHA-TBA)을 50 mL의 DMF에 용해하고, 여기에 필요한 과잉(BGHA 에서 이용 가능한 히드록실기의 6 몰/당량)의 피리딘-황 트리옥사이드 콤플렉스(0.8 g)을 첨가하였다. 3시간 동안 40℃에서 교반한 후, 100 mL 물을 첨가하여 반응을 종결시키고, 미정제 물질을 무수 아세테이트 나트륨으로 포화된 냉 에탄올 150 mL의 첨가로 침전시킨 후, 여과를 통해 수집하였다. 생성된 미정제 부분적으로 O-설페이트화된 BGHA 를 상기 1에 기재된 바와 같이 물에 녹이고, 투석시키고, 냉동 건조하여 생성물 (500 mg)을 60% 수율로 얻었으며, 이는 1H NMR에 의해 설페이트화 SD<1임을 확인하였다.
26. F- OSBGHA ( GM -432101)의 제조
상기 1에서와 같이 0.5 mL의 TBA 및 증류수 50 mL내 BGHA (0.5 g)으로부터 상기 BGHA (MW 950 kDa HA에서 유래)의 TBA 염을 제조하였다. 생성된 염(BGHA-TBA)을 50 mL의 DMF에 용해하고, 여기에 필요한 과잉(BGHA 에서 이용 가능한 히드록실기의 12 몰/당량)의 피리딘-황 트리옥사이드 콤플렉스(1.6 g)을 첨가하였다. 3시간 동안 40℃에서 교반한 후, 100 mL 물을 첨가하여 반응을 종결시키고, 미정제 물질을 무수 아세테이트 나트륨으로 포화된 냉 에탄올 150 mL의 첨가로 침전시킨 후, 여과를 통해 수집하였다. 생성된 미정제 O-설페이트화된 BGHA 를 상기 1에 기재된 바와 같이 물에 녹이고, 투석시키고, 냉동 건조하여 생성물 (520 mg)을 61% 수율로 얻었으며, 이는 1H NMR에 의해 설페이트화 SD<1임을 확인하였다.
27. P- OSBGHA ( GM -411101)의 제조
상기 1에서와 같이 0.5 mL의 TBA 및 증류수 50 mL내 BGHA (0.5 g)으로부터 상기 BGHA (MW 53 kDa HA에서 유래)의 TBA 염을 제조하였다. 생성된 염(BGHA-TBA)을 50 mL의 DMF에 용해하고, 여기에 필요한 과잉(BGHA 에서 이용 가능한 히드록실기의 6 몰/당량)의 피리딘-황 트리옥사이드 콤플렉스(0.8 g)을 첨가하였다. 3시간 동안 40℃에서 교반한 후, 100 mL 물을 첨가하여 반응을 종결시키고, 미정제 물질을 무수 아세테이트 나트륨으로 포화된 냉 에탄올 150 mL의 첨가로 침전시킨 후, 여과를 통해 수집하였다. 생성된 미정제 O-설페이트화된 BGHA 를 상기 1에 기재된 바와 같이 물에 녹이고, 투석시키고, 냉동 건조하여 생성물 (500 mg)을 60% 수율로 얻었으며, 이는 1H NMR에 의해 설페이트화 SD<1임을 확인하였다.
28. P- OSBGHA ( GM -412101)의 제조
상기 1에서와 같이 0.5 mL의 TBA 및 증류수 50 mL내 BGHA (0.5 g)으로부터 상기 BGHA (MW 53 kDa HA에서 유래)의 TBA 염을 제조하였다. 생성된 염(BGHA-TBA)을 50 mL의 DMF에 용해하고, 여기에 필요한 과잉(BGHA 에서 이용 가능한 히드록실기의 12 몰/당량)의 피리딘-황 트리옥사이드 콤플렉스(1.6 g)을 첨가하였다. 3시간 동안 40℃에서 교반한 후, 100 mL 물을 첨가하여 반응을 종결시키고, 미정제 물질을 무수 아세테이트 나트륨으로 포화된 냉 에탄올 150 mL의 첨가로 침전시킨 후, 여과를 통해 수집하였다. 생성된 미정제 O-설페이트화된 BGHA 를 상기 1에 기재된 바와 같이 물에 녹이고, 투석시키고, 냉동 건조하여 생성물 (500 mg)을 60% 수율로 얻었으며, 이는 1H NMR에 의해 설페이트화 SD<1임을 확인하였다.
III . 형광성 SAGE 및 팔미토일화된 ( palmitoylated ) SAGE 의 제조
a. LMW -F- OSFHA -1( DS -2) 형광성 컨쥬게이트(fluorescent conjugate)의 제조
LMW-F-OSFHA-1(50 mg) 및 NHS (40 mg)을 10 mL 물에 용해시키고, 이어서 4 mL DMF 내의 알렉사 플루오 (Alaxa fluo)@488 (1 mg)을 첨가하였다. 그 후, pH를 4.75로 조절하고, 100 mg EDCI을 고체 형태로 첨가하였다. pH는 NaOH 용액을 첨가하여 4.75로 유지시켰다. 그 용액을 알루미늄박 덮개를 씌워 실온에서 밤새 교반하였다. 이어서 생성물을 증류수(컷-오프 MW 3500) 및 연속하는 메탄올/물 용액(50/50, v/v)으로 투석하여 정제하고, 겔 여과 컬럼(세파덱스 G-25)에 의해 추가로 정제하였다. PD-10 컬럼에 의해 더 정제하고 냉동 건조하여 40mg을 얻었다.
b. LMW -P- OSMeHA ( DS -1) 형광성 컨쥬게이트의 제조
LMW-P-OSMeHA (50 mg) 및 NHS (40 mg)을 10 mL 물에 용해하고, 이어서 4 mL DMF 내의 알렉사 플루오 (Alaxa fluo)@488 (1 mg)을 첨가하였다. 그 후, pH를 4.75로 조절하고, 100 mg EDCI을 고체 형태로 첨가하였다. pH는 NaOH 용액을 첨가하여 4.75로 유지시켰다. 그 용액을 알루미늄박 덮개를 씌워 실온에서 밤새 교반하였다. 이어서 생성물을 증류수(컷-오프 MW 3500) 및 연속하는 메탄올/물 용액(50/50, v/v)으로 투석하여 정제하고, 겔 여과 컬럼(세파덱스 G-25)에 의해 추가로 정제하였다. PD-10 컬럼에 의해 더 정제하고 냉동 건조하여 43mg을 얻었다.
c. 팔미토일화된 SAGE 의 제조
LMW-P-OSMeHA (50 mg)을 50 mL의 DMF에 용해시키고, 트리에틸아민 (0.3 mL)을 교반하면서 상기 DMF 용액에 첨가하였다. 5 분 후, 염화 팔미토일 (0.5 mL)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 밤새 교반하였다. 그 용액을 증발시키고, 잔여물을 증류수에 녹이고, 하루 동안 투석시키고(네번 물을 교체), 냉동 건조하여 35mg을 수득하였다.
IV . SAGE 는 P- 셀렉틴 , 인간 백혈구 엘라스타아제 및 RAGE 와 이의 모든 리간드의 상호작용의 강력한 저해제이다
재료. 다클론성 염소 항인간(anti-human) RAGE, 재조합 인간 고 유동성 박스 단백질-1(recombinant human high mobility box protein-1, HMGB-1), 재조합 인간 P-셀렉틴/Fc 키메라, 재조합 인간 RAGE/Fc 키메라, 인간 아주로시딘(human azurocidin) 및 다클론성 염소 항인간 아주로시딘을 R&D 시스템(미니애폴리스, MN)으로부터 구입하였다. 인간 S100b 칼그라뉼린은 칼바이오켐(샌디에고, CA)으로부터 얻었다. 진전된 최종 당화 산물 카르복시메틸 리신-우혈청 알부민 (CML-BSA)은 MBL 인터내쇼널 (워번, MA)으로부터 얻었다. U937 인간 단핵세포는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (머내서스, VA)으로부터 얻었다. 단백질 A, 겨자무 과산화효소(horse radish peroxidase)-결합 토끼 항염소 IgG, 탄산염 중탄산염 완충액 및 우혈청 알부민 차단제 (10x)는 피에르세네트 (록퍼드, IL)로부터 얻었다. 칼세인 AM, 둘베코 개질 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM), 에틸렌디아민 테트라아세트산(ethylenediamine tetraacetic acid, EDTA), 소 태아 혈청 (FBS), HEPES, 비필수 아미노산, 페니실린/스트렙토마이신/L-글루타민 용액, L-글루타민이 없는 RPMI-1640 및 중탄산나트륨은 인비트로겐 (칼스배드, CA)로부터 얻었다. 고 결합 96 웰 마이크로플레이트는 코닝 라이프 사이언스(코닝, NY)로부터 얻었다. 언급되지 않은 다른 모든 화학물질들은 시그마-알드리치(세인트 루이스, MO)로부터 구입하였다.
세포 배양. U937 단핵 세포들을 10% 열 비활성화 FBS, 2 mM L-글루타민, 1 mM 피루빈 나트륨(sodium pyruvate), 0.1 mM MEM 비필수 아미노산, 100 단위/ml 페니실린 및 100 mg/ml 스트렙토마이신이 보충된 RPMI-1640내에 가습화된 5% CO2-95% 공기 중에서 37℃로 현탁 배지에서 성장시켰다. 실험은 계대 1~5로부터의 세포에서 실시하였다.
세포 결합 분석법( Cell Binding Assays ). P-셀렉틴 또는 RAGE에 대한 U937 단핵 세포들의 결합에서의 SAGE의 작용을 0.2 M 탄산염 중탄산염 완충액 (pH 9.4) 내 8 μg/ml 단백질 A (50 μg/웰)로 도포한 고결합 마이크로플레이트에서 연구하였다. 플레이트를 1 % BSA를 포함하는 인산염 완충화된 식염수(PBS-BSA)로 세척하고, P-셀렉틴-Fc 또는 RAGE-Fc 키메라 (1 μg 을 포함하는 50 μl)를 각 웰에 첨가하고 실온에서 2 시간 또는 4℃에서 밤새 각각 배양하였다. 배양 후, 웰을 PBS-BSA으로 두번 세척하였다. 20 mM HEPES 완충액(125 mM NaCl, 2 mM 칼슘 및 2 mM 마그네슘을 포함)으로 연속적으로 희석된 50 μL의 SAGE (0 내지 1,000 μg/ml)를 각 웰에 첨가하고 15분 동안 실온에서 배양하였다. 음성 대조군으로, 50 μL의 10 mM EDTA를 선택된 웰에 첨가하여 칼슘 이온 봉쇄를 통해 세포 결합을 막았다. 배양 기간의 끝에 50 μL의 U937 세포 (105 세포수/웰, 제조자의 지시에 따라서 칼세인 표지됨)를 각 웰에 첨가하고 플레이트를 실온에서 추가 30분간 배양하였다. 이어서 웰을 PBS로 세번 세척하고, 결합 세포를 100 μL의 트리스-트리톤X-100 함유 완충액의 첨가로 분리시켰다. 형광도를 494 nm의 여기(excitation) 및 517 nm의 방출(emission)을 사용하여 마이크로플레이트 리더기로 측정하였다.
고체상 결합 분석법( Solid phase binding assays ). 고체상 결합 분석법을 RAGE와 이의 리간드의 결합을 억제하는 SAGE의 능력을 연구하기 위하여 사용하였다. RAGE와 이의 리간드의 결합에서의 SAGE의 작용을 연구하기 위해서, 폴리비닐 96 웰 플레이트를 5 μg/웰의 특정한 리간드 (CML-BSA, HMGB-1 또는 S100b 칼그라뉼린)으로 도포하였다. 플레이트를 4 ℃에서 밤새 배양하고 PBS-0.05% 트윈-20 (PBST)으로 세번 세척하였다. 별도로, RAGE-Fc 키메라 (PBST-0.1% BSA에 0.5 μg/ml을 포함하는 100 μL)를 연속적으로 배양된 SAGE의 동일 부피(PBST-BSA에 0.001 내지 1,000 μg/ml)로 4℃에서 밤새 배양하였다. 다음날, 50 μL의 RAGE-SAGE 혼합물을 각각의 리간드가 도포된 웰에 전달하고 2시간 동안 37℃로 배양하였다. 그 후에 웰을 PBST로 네번 세척하였다. 결합 RAGE를 검출하기 위하여, 50 μL의 항RAGE 항체 (0.5 μg/ml)를 각 웰에 첨가하고, 그 혼합물을 실온에서 1시간 동안 배양하고, 웰을 다시 PBST로 네번 세척하였다. 겨자무 과산화효소 결합 이차 항체(PBST에서의 1:10,000 항체 희석액; 웰당 50 μL)를 첨가하고, 웰을 실온에서 1시간 동안 배양한 후, PBST로 한번 세척하였다. 비색 반응(colorimetric reaction)을 50 μL의 테트라메틸 벤지딘 색원체(TMB 단일 용액 색원체)를 첨가하여 시작하고, 50 μL의 1 N HCl을 첨가하여 15분 후에 종결시켰다. 450 nm에서의 흡광도를 자동화된 마이크로플레이트 리더기를 사용하여 읽었다.
효소 분석법( Enzymatic assays ). 양이온성 PMN 프로테아제 HLE 의 SAGE 억제를 확인하기 위하여, 활성도 분석법(Fryer A, Huang Y-C, Rao G, Jacoby D, Mancilla E, Whorton R, Piantadosi CA, Kennedy T, Hoidal J. Selective O-desulfation produces nonanticoagulant heparin that retains pharmacologic activity in the lung. J Pharmacol Exp Ther 282:208-219, 1997)을 사용하였고, 이는 색원체 기질을 절단시키는 정제된 HLE의 능력을 측정하였다. HLE (100nM) 을 15분 동안 0.5 M HEPES 완충액에서 SAGE (1~100 nM)와 배양하였다. 이어진 배양에서 상기 엘라스타아제 기질 Suc-Ala-Ala-Val-p-니트로아날린 (p-NA)을 반응 혼합물에 첨가하여 최종 농도를 0.3 mM로 하였다. 방출된 p-NA의 가수분해를 405 nm에서의 흡광도 측정에 의해 이어서 15분 동안 실시하였다. 인자 XII 또는 보체를 활성화시키는 SAGE의 능력을 확인하기 위하여, 불량 시판 헤파린의 독성을 분류하기 위해 최근 사용되는 것과 유사한 활성도 분석법을 사용하였다(Kishimoto TK, Viswanathan K, Ganguly T, Elankumaran S, Smith S, Pelzer K, Lansing JC, Sriranganathan N, Zhao G, Galcheva-Gargova Z, Al-Hakim A, Bailey GS, Fraser B, Roy S, Rogers-Cotrone T, Buhse L, Whary M, Fox J, Nasr M, Dal Pan GJ, Shriver Z, Langer RS, Venkataranam G, Austen KF, Woodcock J, Sasisekharan R. Contaminated heparin associated with adverse clinical events and activation of the contact system. N Engl J Med 358:2457-2467, 2008; Guerrini M, Beccati D, Shriver Z, Naggi A, Viswanathan K, Bisio A, Capila I, Lansing JC, Guglieri S, Fraser B, Al-Hakim A, Gunay NS, Zhang Z, Robinson L, Buhse L, Nasr M, Woodcock J, Langer R, Venkataraman G, Linhardt RJ, Casu B, Torri G, Sasisekharan R. Oversulfated chondroitin sulfate is a contaminant in heparin associated with adverse clinical events. Nat Biotech 26:669-675, 2008).
합동 인간 혈장(pooled human plasma) (5 μl)을 트리톤 X-100을 함유하는 0.05 M HEPES에서 100 μl의 SAHA (0.1 to 1000 μg/ml)와 5℃로 5분 동안 배양하였다. 하게만 인자에 특정한 발색 활성도를 0.5 mM D-사이클로히드로티로실-Glyc-L-Arg-p-NA의 첨가 및 이어진 405 nm에서의 흡광도 변화로부터 측정하였다(Silverberg M, Dunn JT, Garen L, Kaplan AP. Autoactivation of human Hageman factor. Demonstration using a synthetic substrate. J Biol Chem 255:7281-7286, 1980). 활성 칼리크레인(kallikrein)에 대한 특정한 발색 활성도는 D-Pro-Phe-Arg-p-NA의 첨가 및 이어진 450 nm에서의 흡광도 변화로부터 측정하였다.
결과: 상기 분석법들의 결과들을 하기 표 2에 나타내었다. SAGE는 P-셀렉틴의 강력한 저해제이다. P-셀렉틴 당단백질 리간드-1 (PSGL-1)을 통해 P-셀렉틴에 단단하게 부착하는 U937 인간 단핵세포의 경쟁자 매개 변위를 형광 표지된 세포를 사용하여 연구하였다. 도 3은 SAGE가 P-셀렉틴으로의 U937 결합을 0.5 μg/ml의 50% 저해 농도(IC50)로 억제함을 보여준다.
50% 저해 농도(IC50) μg/ml
SAGE p-셀렉틴/PSGL RAGE/Mac-1 RAGE/CML-BSA RAGE/S100B RAGE/HMGB1 백혈구 엘라스타아제 하게만 인자
GM-211101
GM-311101
GM-111101 0.017 0.033 0.082 0.12 0.58 0.4
GM-211201 NR NR NR NR 0.54 NR
GM-311201 NR NR NR NR 0.52 NR
GM-111201 0.14 0.042 2.27 1.56 0.22 na
GM-231101 NR 14.6
GM-331101 NR 4.557 NR
GM-131101
GM-231201 8.82
GM-331201 2.28
GM-131201 0.5 0.3 0.044 0.06 1.66 0.42 0.4
GM-212101
GM-312101 0.56
GM-112101 0.002 0.042
GM-212201
GM-312201 0.036 0.009 0.059 0.075 0.47 0.4
GM-112201
GM-232101 0.041 0.02 0.408
GM-332101 0.015 0.021 0.371
GM-132101
GM-232201
GM-332201 0.22
GM-132201 0.22 0.004 0.1 0.04 0.24 0.4
GM-431101 89.5
GM-432101 0.85
GM-411101
GM-412101
둘째, 고도로 설페이트화된 폴리음이온로서 알킬화 및 설페이트화된 SAGE는 다핵형 백혈구 프로테아제의 강력한 저해제이다. 도 4는 알킬화 및/또는 플루오로알킬화 및 설페이트화된 SAGE가 인상적으로 강력한 IC50 값으로 인간 백혈구 엘라스타아제(HLE)을 저해함을 보여준다. 특히, 상기 비알킬화, 전체적으로 O-설페이트화된 HA (F-OSHA)는 HLE에 대하여 0.66 nM IC50임을 나타낸다. 변형 및 설페이트화된 HA 유도체에서, 부분적으로 O-설페이트화된 카르복시메틸화된 HA (P-OSCHMHA)의 IC50 값은 1.89 nM; 부분적으로 O-설페이트화된 HA (P-OSHA)은 1.97 nM; 및 부분적으로 O-설페이트화된 HA (P-OSMEHA; GM-131101)은 3.46 nM이었다.
셋째, SAGE는 RAGE의 극도로 강력한 저해제이다. SAGE는 RAGE 및 암포테린 (HMGB-1)의 상호작용을 1.1 μg/ml의 IC50 (도 5), RAGE 및 S100 칼그라뉼린의 상호작용을 60 ng/ml의 IC50(도 6), AGE 생성물 카르복시메틸-리신 BSA로의 RAGE 결합을 44 ng/ml 의 IC50 (도 7) 로 저해하였다. 이러한 값들은 헤파린 및 2-O, 3-O 탈설페이트화된 헤파린으로 측정한 대응하는 수준의 RAGE-리간드 저해보다 5 내지 10배 효력이 있었다.
넷째, SAGE는 인간 각질세포의 증식의 강력한 저해제이다. 이러한 분석법에서 인간 신생아 표피 각질 세포를 SAGE 또는 기타 저해제의 유무 상태로 배양하고, 존재하는 살아있는 세포의 수에 정비례하여 감소하는 염료를 첨가함으로써 증식을 측정하였다. 상기 나타낸 도면에서, 흡광도 값을 1.0의 상대 흡광도로 지정한 대조군에 대하여 정규화시켰다. 도 8은 고 분자량 부분적으로 O-설페이트화된 HA (P-OSHA) 및 전체적으로 O-설페이트화된 HA (F-OSHA)가 100 μg/ml의 농도로 첨가했을 경우 각질 세포 증식을 예방하는 데 헤파린 유도체 2-O, 3-O 탈설페이트화된 헤파린 (ODSH)보다 효과적임을 보여준다. 부분적으로 설페이트화된 카르복시메틸화된 HA (P-OSCMHA) 및 메틸화된 HA (P-OSMEHA; GM-131101)는 각질 세포 증식의 저해에 활성이 더 낮기 때문에 보다 높은 설페이트화가 유리하다. 도 9는 전체 저분자량(LMW) 유도체가 이 분석법에서 각질 세포 증식의 감소에 고분자량 유도체보다 더욱 효과적임을 나타낸다. 특히, 상기 LMW 부분적으로 O-설페이트화된 MeHA (LMW-P-OMEHA; GM-111201), 부분적으로 O-설페이트화된 CMHA (LMW-P-OSCMHA) 및 부분적으로 O-설페이트화된 53 kDa HA 자체 (LMW-P-OSHA)는 모두 1 μg/ml의 저농도에서 대조군에 대하여 상대적으로 증식이 감소되었다.
Ⅴ. 주사 및 염증 치료를 위한 생체 내( In Vivo ) 연구
재료 및 방법
화학 물질. GM-111101, GM-131101, GM-312101 및 GM-212101을 평가하였다. 배지는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)에서 구입하였다. 에피라이프 배지는 인비트로겐 (매디슨, WI)에서 구입하였다.
세포. 인간 진피 섬유아세포(nHDF)를 ATCC로부터 구입하였다. 인간 신생아 표피 각질 세포 (HEKn)를 인비트로겐 (매디슨, WI)에서 수득하였다.
세포독성. 4,000 nHDF 세포를 96 웰 바닥이 평평한 마이크로플레이트의 각 웰에 100 μl 배지에 심고, 12시간 동안 5% CO2에서 37℃로 배양하였다. 모든 배지를 다양한 설페이트화된 히알루론산(HA) 유도체를 10, 100, 1000, 10000, 100000, 1000000 ng/ml의 최종 농도로 각 컬럼에 포함하는 완전 배지로 교환하였다. 48시간에서, 20μl MTS (프로메가, 매디슨, WI)을 각각의 웰로 피펫팅하고, 세포들을 2 시간 동안 더 배양하였다. 시료의 흡광도를 96 웰 플레이트 리더기를 사용하여 490 nm에서 측정하였다.
마우스에서의 피부 자극 시험. 마우스의 피부에서 진피 자극 가능성을 확인하기 위하여 GM-111101 및 GM-212101을 생체 조건 내에서 시험하였다. 두 가지 시험 제제를 두 개의 상이한 농도 0.1 mg/ml 및 1 mg/ml로 각각 제조하였다. 10% 포름산 및 PBS를 각각 양성 및 음성 대조군으로 사용하였다(n=6). 이전 실험에서 사용되지 않았으며 자극 연구 전 임의의 피부 자극, 외상 또는 해로운 임상적 신호가 없음이 관찰된 Balb/c 마우스를 고안된 시험 조건에 무작위로 선택하고 그룹화하였다. 시료의 도포 적어도 4시간 전 상기 동물들의 등을 전기 클리퍼(electric clipper)로 털을 잘라내었다. 시료 물질의 도포 직전, 시험 부위의 상부는 손상하지 않으면서 시험 부위의 하부에 멸균 주사기로 각 마우스에 4개의 평형 상피 찰과상을 내었다. 마취 하에, 약 2.5 cm 정사각형 피부 부위에 이중 거즈층 하의 도입에 의해 시험 용액의 두 0.5 ml 시료를 전체 시험 부위에 도포하였다. 패치를 플라스틱으로 대고, 비반응성 테이프로 덮고 전체 시험 부위를 붕대로 감았다. 동물들을 그들의 우리로 돌려보냈다. 상기 제제로의 24시간 노출 후, 붕대와 젖은 시험 거즈를 제거하였다. 시험 부위를 수돗물로 씻어 모든 남아있는 시험 화합물을 제거하였다. 화합물의 도포 24 시간 및 72시간 후, 시험 부위를 FHSA 권장 드레이즈 상처 기준에 따라 진피 반응을 조사하였다. 시험 물질의 일차 자극 지수 (P.I.I.)를 시험 종료 후에 계산하였다. 5.00 또는 그 이상의 P.I.I. 점수를 나타내는 물질은 양성으로 간주될 수 있으며; 이러한 물질은 피부에 일차 자극이 된다고 간주될 수 있다.
동물. Balb/c마우스는 유타대학교 수의학과에 의해 공인된 판매자 및 동물 사육장으로부터 상업적으로 구매하였다. 동물들을 수령 후 규정된 기간동안 격리하였고, 이들은 사용되기 적합하다.
LL37 펩티드 및 SAGE 주입 주사 모델. 피부의 만성 질환이 얼굴에 나타날 경우, 특히 주사의 경우와 같이 환자의 삶에 지울 수 없는 자국을 남긴다. 종류에 따라 우리는 상대방의 외모에 긍정적 또는 부정적으로 반응하며, 비정상적이고 우리와 다른 사람에게 본능적으로 주춤거린다. 피부 질환이 종종 생명을 위협하지 않을 경우에도 이는 정상인들이 추측할 수 없는 방향으로 생활을 바꾼다. 주사는 생활을 바꾸는 질병 중 하나이다. 주사는 통상 30 내지 50세에 발병되며 미국 인구 3% 또는 14백만명 미국인이 고통받고 있는 일반적인 얼굴의 미관을 훼손시키는 피부 질환이다. 이는 켈트 혈통의 카프카스 사람들에게 가장 치명적이고 문제가 크게 나타나며 남자보다 여자에게 흔하다. 3분의 1이 넘는 환자들은 질병이 유전되었다고 강하게 추측되는 가족사를 가지고 있다. 주사의 얼굴 붉음와 울퉁불퉁한 코가 과도한 알코올 소비의 결과라는 일반적인 오해로 인해 상기 이상은 특히 비난받는다. 주사는 몇몇 임상적인 표현형으로 존재한다. 가장 일반적인 표현형은 뺨과 코에 팽창한 모세혈관이 있는 일시적 또는 영구적 얼굴 중심의 홍조 및 홍반으로 특성화할 수 있다. 이러한 표현형은 "불그스름한 피부색"에서부터 영구적으로 즉시 눈에 띄는 팽창된 혈관까지의 범위를 갖는다. 이러한 특수형(subtype)은 효과적인 국소 치료법이 없다. 두번째 일반적인 표현형에서, 부스럼(papules) 및 농포(pustules)가 주로 홍반의 바탕 위에 겹쳐지면서 얼굴의 중심 볼록면에 나타난다. 생검 시, 상기 피부를 PMN으로 풍부하게 침윤시킨다. 구진농포성(papulopustular) 주사는 국소 또는 전신성 항생물질로 경험적으로 치료될 수 있으나, 문서화된 피부 감염과 명백하게 연관되지 않는다. 국소 또는 전신성 마크로라이드계(Macrolides)가 치료제로 가장 일반적으로 사용되고 있고, 염증 부위로의 PMN 주화성을 지연시키는 능력만큼 이들의 항박테리아 활성때문에 개선을 야기할 수 없다. 세번째 그리고 다행히 보다 드문 표현형에서, 주사는 전형적인 "W.C. 필즈(Fields)" 코 또는 "위스키코(whiskey nose)"를 초래하는 코의 피지선 및 결합 조직 모두의 과형성으로부터 딸기코를 유발한다. 이러한 이상의 치료는 지나치게 발달한 조직을 제거하기 위한 조직의 외과적 절개 또는 레이저 시술을 필요로 한다. 네번째 표현형에서 주사는 눈꺼풀의 자극(안검염), 감광성, 흐려진 시야 및 결막염에 걸린 건조하고 가려운 눈을 초래할 수 있다. 장기(prolonged) 질환은 각막염과 심하게는 각막 상처를 유발할 수 있다. 눈꺼풀 및 아래 눈꺼풀 표면 위 눈꺼풀판샘의 염증으로부터 생기는 이러한 표현형이 일반적이고, 안과 의사에 의해 빈번하게 관측되는 "안구 건조" 증상이 임상적으로 중복된다. 주사의 발생은 이상을 유발하는 태양 광선에 병원성 역할의 증거가 되는 흰 피부와 밝은 눈과의 것들에서 햇빛에 노출된 피부 부위에 배타적이다.
주사의 병인(pathogenesis)이 최근 밝혀졌다(Yamasaki K, Di Nardo A, Bardan A, Murakami M, Ohtake T, Coda A, Dorschner RA, Bonnart C, Descargues P, Hovnanian A, Morhenn VB, Gallop RL. Increased serine protease activity and cathelicidin promotes skin inflammation in rosacea. Nat Med 13:975-980, 2007; Bevins CL, Liu F-T. Rosacea: skin innate immunity gone awry? Nat Med 13:904-906, 2007). 훌륭한 연구에서 야마자키 등은 주사와 연관된 피부는 높은 수준의 카텔리시딘(cathelicidins)과 이들의 프로세싱 프로테아제 SCTE를 포함하는 것을 증명하였다. 포유 동물에서 항균성 펩티드의 주요한 군(major family)인 카텔리시딘은 박테리아에 선천적 면역 반응을 매개하는 백혈구 및 많은 기관의 상피 세포에서 발현한다(Nizet V, Ohtake T, Lauth X, Trowbridge Jk, Rudisill J, Dorschner RA, Prestonjamasp V, Piraino J, Huttner K, Gallop RL. Innate antimicrobial peptide protects the skin from invasive bacterial infection. Nature 414:454-457, 2001). 카텔리시딘은 또한 혈관 성장, PMN 이동 및 상처 회복의 신호이다(Bevins, ibid). 인간 카텔리시딘은 각질세포에 의해 18 kDa hCAP18 프로펩티드로 분비되고 SCTE에 의해 37 아미노산 길이 및 두 개의 N-종결 류신 후에 고안된 C-종결 활성 항균성 펩티드 LL-37로 분열된다. 주사와 연관된 피부는 자극과 같은 미생물 침입을 분명하게 선동하지 않으면서 부적당하게 높은 수준의 카텔리시딘 및 SCTE을 나타낸다. 일차 인간 각질세포 LL-37를 덮은 배양 배지에 위치할 경우 IL-8과 같은 화학 주화성 사이토킨의 생성을 크게 증대시킨다. 주사 연관 피부에서 발견된 것과 비슷한 수준으로 마우스에 피부 내로 주입될 경우, LL-37은 홍반을 초래하고 PMN에 의한 현저한 진피 침입을 자극한다. SCTE의 피부 내 주입은 또한 야생형에서 피부 홍반 및 진피의 PMN 침입을 초래하지만, 카텔리시딘 -/- 마우스에서는 초래하지 않는다. 따라서, 주사는 염증전의 국소 과발현, 염증을 발생시키는 양이온성 피부 펩티드, 과도한 신생혈관생성 및 질병의 피지 과형성 특성에 의해 매개된다는 개념을 지지하는 성장하는 주요 증거이다. 주사에 걸린 거의 대부분의 환자는 그들의 부모가 반응성 얼굴 홍조 및 붉어짐의 패턴을 가지고 있다고 말할 수 있기 때문에 주사는 유전적으로 유도됨이 임상의들에게 명백하다.
주사의 모델을 만들기 위하여 LL-37을 매일 12 시간씩 48시간 동안 피부 내로 주입하였다. 이 모델은 야마자키 등에 의해 연구된 바와 같이, 피부의 홍반 및 다핵형 백혈구들(PMNs)의 현저한 피부 내 침입을 초래하였다. Balb/c 마우스는 연구 전 등에 있는 피부 부위가 노출되도록 털을 깎았다. 24시간 후, 40 μl의 부형제(인산염 완충된 식염수, PBS), 양이온성 펩티드(PBS에 320 μM의 농도), SAGE (PBS에 320 내지 1,280 μM) 또는 양이온성 펩티드 + SAGE 혼합물 (펩티드 + 1x 내지 4x 몰 농도의 SAGE)을 손상되지 않은 표피 수포를 증가시키기 위해 고안된 방식으로 면도된 피부에 31 게이지 바늘을 사용하여 피부 내로 주입하고, 그로인해 더 낮은 표피 또는 진피의 수준으로 투여됨을 확인하였다. 주입을 위해 선택된 SAGE는 12개 초과의 새로이 합성된 SAGE으로부터 선택하였고, 이는 네 개의 일반적인 리간드에 의해 생화학 분석에서 인간 백혈구 엘라스타아제의 저해제(다른 양이온성 단백질로) 및 진전된 당화 반응의 종결 생성물의 수용체(RAGE)의 활성을 위한 길항제로 극도로 활성임을 검사하였다.
SAGE 및 펩티드를 주입 전에 PBS에 함께 혼합하고, 주입되기 전에 실온에서 15분 동안 배양하였다. 이로부터 12시간 마다 주입을 반복하였다. 초기 주입 후 48 시간 후(총 4회 주입), 동물들을 복막 내 25 mg/kg 펜토바르비탈로 가볍게 마취시켰다. 상기 마우스들이 잠들었을 때, 주입된 피부 영역을 촬영하여 홍반 및 부종의 심각도를 시각적으로 기록하였다. 홍반의 강도는 붉기 점수(1 내지 5)로 평가하고, 홍반의 영역은 캘리퍼스로 측정하였다. 이어서, 헤마톡실린 에오신 염색을 위해 주입된 피부의 영역을 6 mm 구멍 펀치를 사용하여 절제 생검하여 병리조직학적 변화를 검사하고 미엘로퍼옥시다아제 (MPO) 활성도 측정을 통해 PMN 침입을 평가하였다. 피부 표면의 하나의 대표적인 도면 및 각 피부로부터의 조직 구조는 현미경 하에 고배율 보기로 관찰하였다.
SAGE 국소 치료 주사 모델. Balb/c 마우스를 LL37 노출로부터 알맞은 시기에 등에 있는 피부 영역의 털을 잘라내었다. 이어서 5% SAGE를 포함하는 히알루론산계 연화제(활성 연화제) 또는 히알루론산계 연화제 단독의 국소 도포를 12시간 마다 상기 피부 영역에 시작하였다. 이로부터 주입과 국소 연화제 도포를 12시간 마다 반복하였다. 24시간 후, 40 μL의 부형제(PBS) 또는 양이온성 펩티드 (320 μM의 농도로)를 상기 방법으로 면도된 피부에 피하 주입하였다. 초기 주입 후 48 시간(총 4회 주입)에 동물을 상기와 같이 가볍게 마취시켰다. 주입된 피부 영역을 촬영하여 홍반 및 부종의 심각도를 시각적으로 기록하였다. 홍반의 강도는 붉기 점수(1 내지 5)로 평가하고, 홍반의 영역은 캘리퍼스로 측정하였다. 이어서, H&E 염색을 위해 주입된 피부의 영역을 6 mm 구멍 펀치를 사용하여 절제 생검하여 병리조직학적 변화를 검사하고 미엘로퍼옥시다아제 (MPO) 활성도 측정을 통해 PMN 침입을 평가하였다.
SAGE 진피 침투. Balb/c 마우스를 연구 전에 등에 있는 피부 영역을 노출시키기 위해 털을 잘라내었다. SAGE의 국소 적용을 12시간 마다 피부에 실시하였다. 48 시간 후 동물을 안락사시키고 피부를 생검하였다. 그 후, 피부의 조각을 형광성 현미경 검사로 연구하여 SAGE가 피부로 침투하는 깊이를 측정하였다.
크로톤 오일 염증 모델. PMN 매개 피부 염증의 또 다른 모델로 크로톤 오일을 사용하였다. 크로톤 오일은 피부 세포에서 단백질 키나제 C를 활성화시키는 포볼 에스테르(phorbol esters)를 포함한다. 결과적으로, 피부 세포는 순환으로부터 PMN 유입의 신호인 풍부한 케모킨 및 케모탁신을 생성한다. 활성화된 PMN은 피부 조직의 홍반 및 부종을 초래한다. 크로톤 오일 유도 염증은 피부 병학(dermatologic) 용도를 위한 항 염증성 화합물의 분류에 일반적으로 사용되는 PMN 매개 피부 염증의 모델이다.
이러한 모델을 만들기 위해, 크로톤 오일(시그마 알드리치, 세인트 루이스, MO)를 아세톤에 0.8% 용액으로 혼합하였다. 피펫을 사용하여 10 μl를 마우스의 한쪽 귀의 각 면에 색칠하고, 대조군으로 다른 쪽 귀는 남겨두었다. 4, 8 및 24시간 후, 귀 두께를 연골질 융기 말단의 귀 상층부 근처에서 측정하였다. 대조군으로부터의 귀 두께 변화는 부종의 표시로 간주되었다. 홍반의 강도는 붉기 점수(1 내지 5)로 평가하고, 홍반의 영역은 캘리퍼스로 측정하였다. 24시간 측정에 이어, H&E 염색을 위해 마우스를 안락사시키고 귀 펀치 생검(6 mm 구멍 펀치)를 즉시 실시하고, 중량을 측정하고, 냉동시키고, -80℃로 보관하여 병리조직학적 변화를 검사하고 미엘로퍼옥시다아제 (MPO) 활성도 측정을 통해 PMN 침투를 평가하였다. 과정을 표준화하고 실수를 줄이기 위하여 단독 연구자가 모든 귀 측정 및 생검을 수행하였다. 면역 세포 화학을 위해 귀의 나머지를 제거, 엠베딩, 및 냉동시켰다.
미엘로퍼옥시다아제 ( MPO ) 분석. 각각의 마우스에서 조직 생검 (6 mm 직경 구멍 펀치)를 즉시 수득하고, 중량을 측정하고, 냉동하여 -80℃로 저장하였다. 조직 MPO 활성도를 영 등(Young JM, Spires DA, Bedord CJ, Wagner B, Ballaron SJ, De oung LM. The mouse ear inflammatory response to tpical arachidonic acid. J Invest Dermatol 82:367-371, 1984)에 의해 변형된 스주키 등에 의한 방법(Suzuki K, Ota H, Sasagawa S, Sakatani T, Fujikura T. Assay method for myeloperoxidase in human polymorphonuclear leukocytes. Anal Biochem 132:345-352, 1983)을 사용하여 측정하였다. 각각의 마우스 조직 생검을 0.5% 헥사데실트리메틸 암모늄 브로마이드(HTAB)를 포함하는 0.75 mL의 80 mM 인산염 완충된 식염수(PBS, pH 5.4)에 위치시켰다. 각 시료를 작은 실험실 조직 테아로르 호모게나이저(Tissue Tearor Homogenizer) 모델985-370 (바이오스펙 프로덕츠, 바틀즈빌, OK)로 45초 동안 4℃에서 균질화하였다. 호모제네이트(homogenate)를 PBS에 추가적인 0.75 mL HTAB과 마이크로원심분리기 튜브에 정량적으로 옮겼다. 4℃로 유지하면서 1.5 mL 시료를 15분 동안 12,000 x g에서 원심분리시켰다. 생성된 상층액의 세 개의 30 uL 시료를 96 웰 마이크로티터 플레이트 웰에 추가하였다. MPO 분석을 위해 100 uL의 80 mM PBS (pH 5.4), 85 uL의 0.22 M PBS (pH 5.4) 및 15 uL의 0.017% 과산화수소를 포함하는 200 uL의 혼합물을 각 웰에 첨가하였다. 8% 수용성 디메틸포름아미드 내 20 uL의18.4 mM 테트라메틸벤지딘 HCl을 첨가하여 반응을 시작하였다. 마이크로티터 플레이트를 3분 동안 37℃에서 배양하고, 그 후 얼음에 놓아두었다. 30 uL의 1.46 M 아세테이트 나트륨의 첨가로 반응을 종결시켰다. MPO 효소 활성도를 630nm의 흡광도 파장에서 평가하였다. MPO 활성도는 광학 밀도(OD)/생검으로 표현하였다.
통계학적 분석. 모든 실험은 시험관 내 실험에서 세번 실시하였다. 아스핀-웰치 검정을 사용한 평균 비교에 의해 시료들 간에 유의한 차이를 계산하였다. 유의 수준은 p < 0.05임을 밝힌다.
결과
LL37 펩티드 및 SAGE 주입 주사 모델. 양이온성 카텔리시딘의 직접 중화가 피부에서 이들의 염증 활성을 방해하는 지 확인하기 위해, LL37 단독, SAGE (GM-111101) 단독, 부형제 (PBS) 단독 또는 LL37과 SAGE의 혼합물을 12시간 마다 마우스의 면도된 등 부위에 피하 주입하였다. 48시간 후, 마우스를 안락사시키고 각각의 치료군에서 육안 사진을 촬영하였다(도 10a 및 10b). 헤마톡실린 및 에오신을 사용한 조직학적 연구는 증가된 수의 백혈구 침입 및 두드러진 진피 부종을 나타내고, 반면에 침입 직후 SAGE 투여는 피부 팽창 반응의 저해를 초래하였다(도 10c 및 10d).
각각의 진피 점수 결과들은 홍반 범위(도 10f) 및 홍반 붉기 점수(도 10g)로 나타내었다. 48시간 후, SAGE 처리군은 홍반 범위의 극적인 감소 및 홍반 점수의 중대한 감소를 나타내었다. 미엘로퍼옥시다아제 활성도는 PMN 침투의 표식으로서 주입 후 48 시간 후 수득한 조직 펀치 생검에서 측정하였다. LL-37 펩티드와 SAGE의 동시 투여는 MPO 활성도를 50%까지 유의하게 감소시켰다(도 10e). 따라서, LL-37 펩티드와 SAGE의 동시 주입은 LL-37 카텔리시딘 펩티드의 염증 활성을 실질적으로 유도하였다. 이는 SAGE가 LL-37 매개 염증을 저해하고 주사의 치료에 유용할 수 있음을 가리킨다.
SAGE 국소 주사 치료 모델. LL-37 노출로부터 시간이 오래 경과된 치료가 펩티드 유도 피부 염증을 예방할 수 있는지 확인하기 위하여 SAGE (GM-111101)의 국소 치료를 사용하였다. 따라서, 마우스 등 피부 부위로의 LL-37 주입 후, SAGE를 직후에 도포하였다. 육안 사진은 LL-37 도포 48시간 후에 강한 부종과 홍반을 보여주었으나(도 11a, 11h 및 11i), 반면 SAGE와의 국소 치료는 즉각적인 치료(도 11b) 및 12시간 경과된 치료(도 11c)에서 모두 붉음과 이에 영향받은 부위를 유의하게 감소시켰다. H&E 염색은 두 SAGE 치료군보다 많은 백혈구 침투 및 진피 부종이 있음을 가리키고, 이는 피부 팽창 반응 및 MPO 활성의 저해제로서의 SAGE의 결과와 일치하였다(도 11g). 이러한 결과는 SAGE가 통상적 및 약학적으로 허용 가능한 연화제 내에서 주사의 카텔리시딘 매개 염증을 치료하기 위해 국소적으로 도포될 수 있음을 나타낸다.
SAGE 진피 침투. SAGE가 진피에 침투되는 수준을 결정하기 위하여 실시하였다. SAGE 화합물 형광성-GM-212101 및 형광성-GM-111101를 실험 물질로 사용하였으며, Balb/c 마우스의 찰과상 영역 및 손상되지 않은 영역에 0.1 mg/ml, 1 mg/ml 및 10 mg/ml 형광성 화합물을 도포하였다. 24시간 후, 마우스를 안락사시키고 전체 시험된 피부 영역을 잘라내어 자연광 및 장파장 UV광 조건 하에서 촬영하였다(도 12). 치료 영역 피부의 내부 및 외부에서 모두 형광성 층이 자연광과 UV 광 조건 하에서 관찰되었다. SAGE의 유의한 침투가 마이크로 미터 길이 척도까지 분포되었다.
생체 내 시험에서의 세포 독성 및 피부 자극. SAGE 유도체들(SAGEs) GM-131101, GM-312101 및 GM-212101의 세포독성을 nHDF 세포에서 평가하였고, 그 결과를 도 13a에 나타내었다. 모든 화합물은 또한 10 mg/ml 농도까지 nHEK 세포에 비독성임을 확인하였다(도 13b). 생체 조건 내 피부 자극 시험을 위해, 상이한 처리군의 마우스의 육안 사진을 도 13c 내지 13j에 나타내었다. 시험 물질들의 일차 자극 지수를 GM-111101 및 GM-212101에서 모두 0.00으로 계산되었다; 마우스의 피부에서 자극이 관찰되지 않았다(도 14). GM-111101 및 GM-212101은 모두 세포 독성이 발견되지 않았다. 모든 SAGE의 농도 한계(concentration threshold)는 이 실험에서 측정될 수 있다. 이 실험의 조건 하에서, 상기 실험 물질들을 일차 피부 자극제로 간주하지 않는다; FHSA규정의 가이드라인에 정의된 바와 같이, 16 CFR 1500, 5.00 미만의 경험적 점수를 가진 물질은 피부에 일차 자극이 아니다. 이러한 결과는 SAGE가 피부에 이들 스스로 자극을 발생하지 않고 염증성 피부 질환을 위한 안전한 치료제로서 사용될 수 있음을 나타낸다.
크로톤 오일 염증 모델. 마우스 피부에의 크로톤 오일의 도포는 PMN 매개 피부 염증의 통상적이고 매우 재현성있는 모델로 사용된다. 이 모델을 SAGE의 항 염증 활성을 시험하기 위해 사용하였다. 처리 및 비처리된 귀 모두의 측정된 귀 두께뿐만 아니라, 상이한 처리군의 마우스의 육안 사진을 도15a 및 15b에 나타내고, 모든 다섯 군에서 비교하였다. 진피 손상의 각 결과들을 찰과상 영역 및 손상되지 않은 영역의 홍반으로 표현하였다. 상기 결과는 비처리 군과 비교하여 SAGE (GM-111101) 처리군에서의 붉기 및 두께의 유의한 감소를 나타내었다(도 15g 및 15h). 병리조직학적 검사는 크로톤 오일 채색된 귀에서 증가된 수의 백혈구 침투 및 현저한 진피 부종이 있었던 반면, 부형체 처리 마우스의 것과 비교하여 침입 직후 SAGE 투여는 귀 팽창 반응의 억제를 초래함을 밝혔다. 이러한 병리조직학적 발견을 더 나아가 측정 데이터의 것들을 확인하였다. 또한, 크로톤 오일 도포 후 수득한 귀 펀치 생검에서 MPO 활성도를 측정하였다. 크로톤 오일 도포 직후 시작하여 4시간 마다의 SAGE 치료는 MPO 활성을 유의하게 감소시켰다(도 15f). 이러한 결과들은 SAGE가 주사 이외의 염증성 피부 질환의 국소 치료를 위해 사용될 수 있음을 나타낸다.
주사 모델에서의 히알루론산 ( HA ) 국소 치료. 상기한 LL-37 주사 모델의 국소 치료를 SAGE (GM-111101) 대 HA를 비교하기 위하여 사용하였다. 상기 결과는 국소 적용에서 HA가 염증(도 16b, 16e 및 7f) 및 MPO 활성도(도 16d)를 완화시키지 않음 명백히 보여주었다. 거꾸로 말하면, SAGE는 고도로 향상된 항 염증 특성(도 16c 내지 f)을 가지고 염증 및 주사의 저해제로서 여겨질 수 있다. 이러한 데이터는 SAGE의 약학적 활성이 히알루론산에 고유한 것이 아니고, 반면 히알루론산의 신규한 화학적 변형이 필요함을 나타낸다.
생체 조건 내 랫트에서의 급성 정맥 독성 연구. 본 연구의 목적은 랫트에 단일 투여량으로 투여될 경우의 SAGE인 GM-111101 및 GM-212101의 급성 정맥 독성을 평가하고, 또한 단일 투여 수준으로 7일 기간 동안 매일 1회 투여될 경우의 GM-111101의 독성을 평가하는 것이다.
세 마리 수컷 및 세 마리 암컷 스프레이그 둘레이(Sprague-Dawley) 랫트로 이루어진 하나의 투여군을 3 mg/kg GM-111101의 단일 투여량, 이어서 일주일 동안 10 mg/kg GM-111101의 단일 투여량, 10 mg/kg GM-111101의 마지막 한번 일일 투여량으로 최종 단일 투여 후 일 주일에 착수하여 총 7일 동안 노출시켰다. 세마리 수컷 및 세마리 암컷의 스프레이그 둘레이 랫트의 두 군들을 30 또는 100 mg/kg 투여량으로 GM-111101에 노출시켰다. 추가적으로, 세마리 수컷과 세마리 암컷 스프레이그 둘레이 랫트의 두 군을 30 또는 100 mg/kg의 투여량으로 GM-212101에 노출시켰다. 세마리 수컷과 세마리 암컷 스프레이그 둘레이 랫트의 두 군을 주입용 0.9% 염화나트륨에 노출시키고 음성 대조군으로 사용하였다. 모든 투여량을 1 mL/kg 의 투여 부피로 뒤쪽 꼬리 정맥을 통한 정맥 주입으로 투여하였다. 투여량 계산은 가장 최근에 문서화된 체중에 기초하여 계산하였다.
급성(단일 투여량)으로 노출된 모든 동물은 주입 직후, 임상적인 독성의 명백한 표시를 위해 0일 투여량 투여 후 2시간 및 4시간에 다시 관찰하였다. 또한, 모든 생존 동물들은 임상적 독성의 명백한 표시를 1일 내지 14일에 매일 한번씩 나타내었다. 7일 동안 하루에 한번씩 노출된 모든 동물은 임상적인 독성의 명백한 표시를 1일 내지 14일동안 매일 한번씩 나타내었다. 체중을 투여 전 0일(급성 투여량) 또는 1일(반복 투여량), 종결 전 6일 또는 7일 및 14일에 측정하였다. 육안 검시 평가를 연구의 14일에 각각 생존한 동물에서 수행하였다. 연구에서 죽은 동물들은 죽음의 관측 직후 전체 부검을 수행하였다.
이어진 투여량 투여 후 초기 2시간 안에 30 mg/kg GM-212101투여군으로부터 한 암컷 동물에서 중간 비정상적 걸음걸이, 중간 운동 실조 및 불그스름한 오렌지 변색 소변의 임상적 표시가 관측되었다. 가벼운 운동 실조를 제외하고 이러한 관측은 4 시간 관측 기간부터 더 이상 존재하지 않고, 나머지 연구 내내 그러한 방식을 유지하였다. 운동 실조의 관측은 투여량 투여 후의 날에는 더 이상 존재하지 않았다. 또한, 100 mg/kg GM-212101 투여군으로부터의 한 마리 수컷 랫트가 투여량 투여 후 첫번째 4분 안에 죽는 것을 발견하였다. 모든 동물들은 연구 기간 내내 체중이 증가되었다. 연구에서 죽은 100 mg/kg GM-212101 투여군으로부터의 한 동물에서 흉반 전반에 1 내지 2 mm 직경으로 측정된 암적색 병소들(foci)을 제외하고는 부검에서 가시적인 병변이 관측되지 않았다.
상기 연구의 결과에 기초하여, GM-111101는 3, 10, 30 및 100 mg/kg의 단일 급성 용량 및 10 mg/kg의 7일 반복 투여량을 포함하는 임의의 평가된 투여량 수준에서 독성의 표시를 만들지 않았다. 그러므로, 랫트에서의 GM-111101 에 대한 정맥 내 노출을 위한 무 관찰 효과 수준(no observable effect level, NOEL)은 적어도 100 mg/kg으로 간주된다. GM-212101은 30 및 100 mg/kg의 투여량에서 독성 또는 사망의 표시를 나타내었다. 그러므로, 랫트에서의 GM-212101 에 대한 정맥 내 노출을 위한 NOEL은 10 mg/kg으로 간주된다. GM-111101의 모든 투여량에서 사망이 없었고 100 mg/kg GM-212101의 투여량에서 17% 동물의 사망만이 관찰되었기 때문에, GM-111101 및 GM-212101를 위한 랫트에서의 정맥 내 LD50은 100 mg/kg 이상으로 간주된다. 이러한 결과는 SAGE가 질병의 전신 또는 주입 치료로 사용되기 안전함을 가리킨다.
Ⅴ. 연령 관련 황반 변성의 치료를 위한 SAGE 의 연구
활성화된 보체 ( complement ) 및 RAGE 는 배양된 RPE 세포에서 신생혈관생성 및 전염증성 시그날링을 유도한다. 배양된 RPE 세포에서 RAGE의 생물학을 연구하는 실험을 ARPE-19 인간 RPE 세포주(cell line)를 사용하여 실시하였다. 이뮤노블로트(도 17)에 나타낸 바와 같이, ARPE-19 세포는 세포 용해물에서 적어도 4개의 45 내지 50 kDa 범위의 RAGE 이소폼(isoform)을 발현하고, 이러한 이소폼들을 조절된 배지로 분비한다. 세포들을 AGE 생성물 CML-BSA로 도포된 플레이트에서 성장시킬 경우, 모든 네 개의 RAGE 이소폼들의 발현이 눈에 띄게 상향조절되었다(도 17의 오른쪽 이뮤노블로트를 왼쪽 것과 비교). RAGE 결찰(ligation)은 전사 인자(transcription factor) NF-κB을 활성화시키기 때문에, RAGE의 향상된 발현은 전 염증성 시그날링을 크게 촉진시켰다. 이러한 시스템으로의 비항응고성 헤파린 2-O, 3-O 디설페이트화된 헤파린(ODSH)의 첨가는 ARPE-19 세포에서의 RAGE와 CML-BSA의 상호작용을 차단함으로써 RAGE 발현의 상향 조절을 예방하였다. 이는 RAGE 결찰에 의해 RAGE 발현 자체에서 "피드 포워드(feed-forward)" 전염증성 증가를 예방할 수 있다.
RPE 세포 자살을 유발하는 AGE 생성물의 능력을 연구하였다. ARPE-19 세포를 원형 커버슬립에 일치하도록 성장시키고, 이어서 40시간 동안 25 μM AGE-BSA에 노출시키기 위해 새로운 디쉬로 이동시켰다. 그 후, 몰레큘러 프로브스 픽서블 생존/사멸 세포 염색 키트(Molecular Probes Fixable Live/Dead Cell Stain Kit) (L11101, 유진, OR)로 세포 자살을 분석하였다. 각 패널은 전체 커버슬립 및 생존/사멸 경계면의 확대도를 나타낸다. 핵을 DAPI로 붉게 염색하였다; 사멸 세포는 초록색으로 염색하였다. A. BSA 대조군. 일부 사멸 세포들은 커버슬립의 가장자리에 보이나, 생존 및 죽은 세포들은 경계면에 흩뿌려져 있다. B. AGE-BSA (25 μM ). 의미있는 세포 사멸이 가장자리 주위에서 나타나고, 생존 및 사멸 세포들 사이의 경계가 뚜렷하다. C. AGE-BSA (25 μM ) + ODSH (200 μM ). ODSH가 일부 보호를 제공하지만, 유의한 세포 자살이 아직 발생하는 것을 나타낸다. D. AGE-BSA (25 μM ) + P-OSMeHA (200 μM ) (GM-111101).
도 18에 나타낸 바와 같이, 배양된 ARPE-19 세포에서의 AGE 처리는 생존/사멸 세포 염색 키트(몰레큘러 프로브스)로 초록색 염색에 의해 측정한 두드러진 세포 자살을 유발하였다(도 18B). 세포 자살은 ODSH와 세포의 수반한 배양에 의해 감소되었으나(도 18C), SAGA P-OSMeHA (GM-111101)의 동일 농도에 의해 거의 완전히 예방되었다(도 18D). 세포 자살은 원형 커버 슬립에서 배양된 세포의 가장 자리로부터 내부로 진전되는 것처럼 보였다. RAGE는 다른 인간 상피 세포에서와 같이 기저막에서 선택적으로 발현될 수 있는 RPE 세포에서 현저하게 발현되었다. 그러므로, 배양물에서 AGE는 내부로의 진전이 예상된 세포 사멸의 파도를 만들면서 단층의 가장 자리에서 단독으로 기저 위치한 RAGE에 초기 접근하여 결찰할 수 있다. 대조적으로, 망막 색소 상피와 브루크막(Bruch's membrane) 사이에 축적되는 결정체(drusen)에서의 AGE는 기저 위치한 RAGE에 신속히 접근할 수 있고, 최적으로 위치한 AGE/RAGE 시그날링이 연령 관련 황반 변성에서 일명 "지도형위축(geographic atrophy)"을 야기하는 국소화된 RPE 세포 자살을 매개한다. 따라서, SAGE GM-111101은 AGE 유도 RPE 세포 자살을 거의 완전히 예방한다. 이러한 결과는 SAGE가 연령 관련 황반 변성과 같이 실명을 유발하는 중요한 안구 질환의 치료에 효과적일 수 있음을 가리킨다.
SAGE 는 비독성 및 비항응고성이다. O-설페이트화 및 메틸화된 HA (P-OSMeHA), 전체적으로 O-설페이트화 및 펜타플루오로프로필화된 HA (F-OSFHA-1) 및 전체적으로 O-설페이트화 및 메틸화된 HA (F-OSMeHA)를 세포 독성 분석(셀티터96® 애퀴어스 원 에세이, 프로메가)에서 연구된 배양 인간 피부 상피 세포 또는 섬유아세포에 도포하고, SAGE는 1 mg/ml 의 농도에서 조차 증식을 억제하거나 또는 세포 독성을 초래하지 않았다. 상기 SAGE는 또한 항응고성이다. 저분자량 설페이트화 및 플루오로알킬화된 HA는 비정제된 헤파린 각각의 150 U/mg와 비교하여 비 항-XA(no anti-Xa) 및 < 0.2 U/mg 항- IIa 항응고 활성을 나타낸다.
헤파린과 달리, 높이 하전된 폴리음이온성 폴리머는 보조적으로 키닌을 활성화시키고, 하게만 인자(인자 XIIa)의 활성화를 통한 내인성 또는 접촉 응고 캐스케이드의 강력한 유발제이다. SAGE는 내인성 응고를 자극(하게만 인자의 활성화)하는 그들의 능력을 스크리닝하였다. 합동 인간 혈장(Pooled human plasma)을 헤파린 또는 저분자량(Lmw) 설페이트화 및 플루오로알킬화 HA (Lmw-OSFHA-1, Lmw-OSFHA-2)와 배양하고 기질 D-사이클로히드로티로실-Gly-Arg-p-NA을 사용하여 발색 활성을 측정하였다. 도 19에 나타낸 바와 같이, 인자 XII을 활성화시키는 능력을 시험한 경우, 저분자량 (50 kDa) SAGE는 염증의 약학적 저해를 얻을 수 있는 것보다 10 내지 100배 높은 SAGE 농도에서 조차 시판된 약품 헤파린 보다 훨씬 안전함을 나타내었다.
본 출원 전반에 걸쳐 다양한 출판물들을 참고하였다. 본원에 기재된 화합물, 조성물 및 방법을 보다 충분히 설명하기 위해서 이러한 출판물들 전체의 설명서가 본 출원에 참고문헌으로 통합되었다.
본원에 기재된 화합물, 조성물 및 방법에 대하여 다양한 변경과 변형이 가능하다. 본원에 기재된 화합물, 조성물 및 방법의 다른 해석들이 본원에 기재된 화합물, 조성물 및 방법의 설명과 실시예를 고려하여 명백할 것이다. 상기 설명과 실시예는 예로 간주되고자 의도된다.

Claims (47)

  1. 하나 이상의 일차 C-6 히드록실 양성자가 알킬기 또는 플루오로알킬기로 치환된 N-아세틸-글루코사민 잔기를 포함하는, 변형된 히알루론산(hyaluronan) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로서, 상기 히알루론산의 하나 이상의 히드록실 양성자가 설페이트기로 치환된, 변형된 히알루론산(hyaluronan) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 알킬기가 C1~C10의 분지쇄 또는 직쇄 알킬기를 포함하는, 변형된 히알루론산(hyaluronan) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 알킬기가 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 펜틸 또는 헥실을 포함하는, 변형된 히알루론산(hyaluronan) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 알킬기가 메틸인, 변형된 히알루론산(hyaluronan) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 플루오로알킬기가 하나 이상의 트리플루오로메틸기를 포함하는, 변형된 히알루론산(hyaluronan) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 플루오로알킬기가 화학식 -CH2(CF2)nCF3 (여기서, n은 0 내지 10의 정수)을 포함하는, 변형된 히알루론산(hyaluronan) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 n은 1, 2, 3, 4 또는 5인, 변형된 히알루론산(hyaluronan) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  8. 삭제
  9. 제 1항에 있어서, 상기 N-아세틸-글루코사민 잔기의 일차 C-6 히드록실 양성자의 1% 이상이 알킬기 또는 플루오로알킬기로 치환된, 변형된 히알루론산(hyaluronan) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  10. 제 1항에 있어서, 상기 N-아세틸-글루코사민 잔기의 일차 C-6 히드록실 양성자의 1% 내지 50%가 알킬기 또는 플루오로알킬기로 치환된, 변형된 히알루론산(hyaluronan) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  11. 제 1항에 있어서, 하나 이상의 C-2 히드록실 양성자 또는 C-3 히드록실 양성자가 알킬기 또는 플루오로알킬기로 치환된, 변형된 히알루론산(hyaluronan) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  12. 제 1항에 있어서, 상기 히알루론산이 알킬화 또는 플루오로알킬화 전에 10kDa 초과의 분자량을 갖는, 변형된 히알루론산(hyaluronan) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  13. 제 1항에 있어서, 상기 히알루론산이 알킬화 또는 플루오로알킬화 전에 40kDa 내지 2,000kDa의 분자량을 갖는, 변형된 히알루론산(hyaluronan) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  14. 제 1항에 있어서, 하나 이상의 C-2 히드록실 양성자 또는 C-3 히드록실 양성자가 설페이트기로 치환된, 변형된 히알루론산(hyaluronan) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  15. 제 1항에 있어서, 하나 이상의 C-2 히드록실 양성자 및 C-3 히드록실 양성자가 설페이트기로 치환된, 변형된 히알루론산(hyaluronan) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  16. 제 14항에 있어서, 상기 히알루론산의 글루쿠론산 고리(glucuronic ring)에 존재하는 C-2 히드록실 양성자 및/또는 C-3 히드록실 양성자가 설페이트기로 치환된, 변형된 히알루론산(hyaluronan) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  17. 제 1항에 있어서, 이당류 단위당 0.5 내지 3.5의 설페이트화 수준을 갖는, 변형된 히알루론산(hyaluronan) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  18. 제 1항에 있어서, 상기 알킬기가 메틸이고, 히알루론산의 글루쿠론산 고리에 존재하는 하나 이상의 C-2 히드록실 양성자 및/또는 C-3 히드록실 양성자가 설페이트기로 치환된, 변형된 히알루론산(hyaluronan) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  19. 제 1항에 있어서, 상기 알킬기가 메틸이고, 히알루론산의 글루쿠론산 고리에 존재하는 하나 이상의 C-2 히드록실 양성자 및/또는 C-3 히드록실 양성자가 설페이트기로 치환되고, 상기 변형된 히알루론산(hyaluronan) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 2kDa 내지 10kDa의 분자량을 갖는, 변형된 히알루론산(hyaluronan) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  20. 제 1항에 있어서, 상기 플루오로알킬기가 -CH2CF2CF3또는 -CH2CF2CF2CF3이고, 히알루론산의 글루쿠론산 고리에 존재하는 하나 이상의 C-2 히드록실 양성자 및/또는 C-3 히드록실 양성자가 설페이트기로 치환된, 변형된 히알루론산(hyaluronan) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  21. 제 1항에 있어서, 상기 히알루론산이 동물 원료로부터 유도되지 않은, 변형된 히알루론산(hyaluronan) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  22. 약학적으로 허용 가능한 화합물과, 제 1항 내지 제 7항, 및 제 9항 내지 제 21항 중 어느 한 항의 변형된 히알루론산(hyaluronan) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 함유하는, 안과적 질환, 비뇨생식기 질환, 호흡기 질환, 심혈관 질환, 위장 질환, 류머티즘 및 면역 질환, 신장 질환, 퇴행성 관절 질환, 치과 또는 경구 질환, 또는 신경성 질환의 치료 또는 예방용 약학 조성물.
  23. 제 22항에 있어서, 상기 조성물이 정맥 내, 근육 내, 피하, 관절 내, 안구, 질, 직장, 비강 내 또는 국소 투여될 수 있는 조성물.
  24. 제 22항에 있어서, 상기 조성물이 항염증제, 해열제, 항염증용 스테로이드성 및 비스테로이드성 약물, 호르몬, 성장 인자, 피임제, 항바이러스제, 항박테리아제, 항균제, 진통제, 수면제, 진정제, 정신 안정제, 항경련제, 근육 안정제, 국소 마취제, 진경제, 항궤양제, 펩티드성 작용제, 심파티오미메틱제(sympathiomimetic agents), 심혈관제, 항종양제 또는 올리고뉴클레오티드를 더 포함하는 조성물.
  25. 제 22항에 있어서, 상기 조성물이 5 내지 6의 pH를 갖는 조성물.
  26. 제 1항 내지 제 7항, 및 제 9항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 상처 치료 개선이 필요한 피검체에서의 상처 치료 개선용인, 변형된 히알루론산(hyaluronan) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  27. 제 1항 내지 제 7항, 및 제 9항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 화합물의 전달이 필요한 피검체에게 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 화합물의 전달용인, 변형된 히알루론산(hyaluronan) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  28. 삭제
  29. 제 1항 내지 제 7항, 및 제 9항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 치과 및 경구 수술용인, 변형된 히알루론산(hyaluronan) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  30. 제 1항 내지 제 7항, 및 제 9항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 피부 질환의 치료 또는 예방용인, 변형된 히알루론산(hyaluronan) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  31. 제 30항에 있어서, 상기 피부 질환이 주사(rosacea), 아토피 피부염(atopic dermatitis)(습진), 알레르기성 접촉 피부염(allergic contact dermatitis), 건선(psoriasis), 포진성 피부염(dermatitis herpetiformis), 여드름(acne), 당뇨병성 피부 궤양(diabetic skin ulcers) 및 기타 당뇨병성 상처, 화상, 햇볕으로 인한 화상(sunburn), 흉터 예방, 광선 각화증(actinic keratoses), 곤충에 물린 상처로부터의 염증, 덩굴 옻나무(poison ivy)로부터의 염증, 방사선 유도(radiation-induced) 피부염/화상 또는 지루성 피부염(seborrheic dermatitis)을 포함하는, 변형된 히알루론산(hyaluronan) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  32. 제 1항 내지 제 7항, 및 제 9항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 피검체에서의 염증 완화 또는 예방용인, 변형된 히알루론산(hyaluronan) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  33. 제 32항에 있어서, 상기 염증이 암, 다발성 경화증(multiple sclerosis), 골 관절염(osteoarthritis), 류머티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 알츠하이머의 베타 아밀로이드(Alzheimer's beta amyloid), 치주 질환, 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease), 천식, 비염, 비부비동염(rhinosinusitis), 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease), 급성 폐 손상(acute lung injury), 낭포성 섬유증(cystic fibrosis), 겸상 적혈구 빈혈(sickle cell anemia), 염증성 심혈관 질환(cardiovascular inflammatory disorder), 염증성 폐 질환(pulmonary inflammatory disorder), 염증성 안구 질환, 간질성 방광염(interstitial cystitis), 염증성 뇌 질환 또는 염증성 장 질환으로 인해 발생되는, 변형된 히알루론산(hyaluronan) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  34. 제 1항 내지 제 7항, 및 제 9항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 안구 질환의 치료 또는 예방용인, 변형된 히알루론산(hyaluronan) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  35. 제 33항에 있어서, 상기 안구 질환이 연령 관련 황반 변성(age-related macular degeneration), 당뇨망막병증(diabetic retinopathy), 안구 건조증, 결막염, 홍채염(iritis), 포도막염(uveitis), 알레르기성 결막염(allergic conjunctivitis), 또는 각막 염증(corneal inflammation) 및 상처(scarring)를 포함하는, 변형된 히알루론산(hyaluronan) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  36. 제 35항에 있어서, 안구 내로 투여되는, 변형된 히알루론산(hyaluronan) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  37. 제 1항 내지 제 7항, 및 제 9항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, P-셀렉틴(selectin)의 활성의 감소 또는 저해용인, 변형된 히알루론산(hyaluronan) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  38. 제 1항 내지 제 7항, 및 제 9항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, RAGE의 활성화의 감소 또는 저해용인, 변형된 히알루론산(hyaluronan) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  39. 제 1항 내지 제 7항, 및 제 9항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 양이온성 단백질의 활성의 감소 또는 저해용인, 변형된 히알루론산(hyaluronan) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  40. 제 1항 내지 제 7항, 및 제 9항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 백혈구 엘라스타아제(human leukocyte elastase)의 활성의 감소 또는 저해용인, 변형된 히알루론산(hyaluronan) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  41. (a) N-아세틸-글루코사민 잔기의 하나 이상의 일차 C-6 히드록실 양성자를 탈양성자화(deprotonate)하기 충분한 양의 염기와 히알루론산(hyaluronan) 또는 이들의 유도체를 반응시키는 단계;
    (b) 탈양성자화된 히알루론산 또는 이들의 유도체를 충분한 시간과 농도로 알킬화제 또는 플루오로알킬화제와 반응시켜 하나 이상의 탈양성자화된 일차 C-6 히드록실기를 알킬화 또는 플루오로알킬화시키는 단계; 및
    (c) 알킬화 또는 플루오로알킬화된 히알루론산 또는 이들의 유도체를 설페이트화제와 반응시켜 변형된 히알루론산을 제조하는 단계;를 포함하는 변형된 히알루론산의 제조 방법.
  42. 제 41항에 있어서, 상기 염기가 알칼리 수산화물을 포함하는 방법.
  43. 제 41항에 있어서, 상기 알킬화제가 할로겐화 알킬을 포함하는 방법.
  44. 제 41항에 있어서, 상기 플루오로알킬화제가 할로겐화 플루오로알킬을 포함하는 방법.
  45. 제 41항에 있어서, 상기 변형된 히알루론산은 부분적으로 설페이트화된 방법.
  46. 제 41항에 있어서, 상기 변형된 히알루론산은 전체적으로 설페이트화된 방법.
  47. 제 1항에 있어서, 상기 변형된 히알루론산의 약학적으로 허용 가능한 염은, NH4+, Na+, Li+, K+, Ca2+, Mg2+, Fe2+, Fe3+, Cu2+, Al3+ 및 Zn2+으로 이루어진 군에서 선택된 약학적으로 허용 가능한 양이온과의 염; 또는 이소프로필아민, 트리메틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 트리프로필아민, 에탄올아민, 2-디메틸아미노에탄올, 2-디에틸아미노에탄올, 리신, 아르기닌 및 히스티딘으로 이루어진 군에서 선택된 약학적으로 허용 가능한 화합물과의 사차염;인 것을 특징으로 하는, 변형된 히알루론산(hyaluronan) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
KR1020107024824A 2008-04-04 2009-04-03 알킬화된 반합성 글리코사미노글리코산 에테르 및 이의 제조 및 사용 방법 KR101594552B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US4231008P 2008-04-04 2008-04-04
US61/042,310 2008-04-04

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20110004422A KR20110004422A (ko) 2011-01-13
KR101594552B1 true KR101594552B1 (ko) 2016-02-17

Family

ID=41055226

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020107024824A KR101594552B1 (ko) 2008-04-04 2009-04-03 알킬화된 반합성 글리코사미노글리코산 에테르 및 이의 제조 및 사용 방법

Country Status (10)

Country Link
US (5) US8399430B2 (ko)
EP (1) EP2281008B1 (ko)
JP (1) JP5758797B2 (ko)
KR (1) KR101594552B1 (ko)
CN (1) CN102177180A (ko)
AU (1) AU2009231634B2 (ko)
BR (1) BRPI0909849A2 (ko)
CA (1) CA2719666C (ko)
MX (1) MX2010010904A (ko)
WO (1) WO2009124266A2 (ko)

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8846003B2 (en) 2008-03-27 2014-09-30 Symic Biomedical, Inc. Collagen-binding synthetic peptidoglycans, preparation, and methods of use
US8343942B2 (en) 2008-04-04 2013-01-01 University Of Utah Research Foundation Methods for treating interstitial cystitis
EP2281008B1 (en) 2008-04-04 2017-01-04 University of Utah Research Foundation Alkylated and sulfated hyaluronan compounds, methods for their preparation and use thereof
WO2011094149A1 (en) * 2010-01-26 2011-08-04 University Of Utah Research Foundation Methods for treating or preventing the spread of cancer using semi-synthetic glycosaminoglycosan ethers
JP2013521300A (ja) * 2010-03-03 2013-06-10 ネオキュティス エスアー 抗菌ペプチド隔離化合物を用いた皮膚疾患および皮膚障害の処置のための組成物および方法
US20130209531A1 (en) 2010-06-08 2013-08-15 University Of Utah Research Foundation Applications of partially and fully sulfated hyaluronan
KR20140042795A (ko) * 2011-03-23 2014-04-07 유니버시티 오브 유타 리서치 파운데이션 비뇨기 염증을 치료 또는 예방하는 방법
EP2688402B1 (en) 2011-03-23 2018-10-24 University of Utah Research Foundation Means for treating or preventing urological inflammation
ES2708076T3 (es) 2011-05-24 2019-04-08 Symic Ip Llc Peptidoglicanos sintéticos que se unen al ácido hialurónico, preparación y métodos de uso
JP5873319B2 (ja) * 2011-12-16 2016-03-01 株式会社コーセー メイラード反応阻害剤
WO2013095215A1 (en) * 2011-12-19 2013-06-27 Dilaforette Ab Low anticoagulant heparins
ME02994B (me) 2011-12-19 2018-10-20 Dilafor Ab Glikozaminoglikani koji nisu anтikoagulanтi koji sadrže ponavljajuću jedinicu disaharida i njihova medicinska upotreba
SG10201603059YA (en) 2012-05-09 2016-05-30 Cantex Pharmaceuticals Inc Treatment Of Myelosuppression
US9688724B2 (en) 2012-05-14 2017-06-27 University Of Southern California Methods for limiting development of a skin wound
CA2872569C (en) 2012-05-15 2019-10-08 Duke University Uses of antagonists of hyaluronan signaling
CN104854134B (zh) * 2012-12-12 2018-01-02 索尔维特殊聚合物意大利有限公司 氟化壳聚糖衍生物
KR20150130419A (ko) 2013-03-15 2015-11-23 시믹 바이오메디칼, 인크. 세포외 기질 결합성 합성 펩티도글리칸
EP2807925A1 (en) * 2013-05-26 2014-12-03 Symrise AG Antimicrobial compositions
PT3019177T (pt) 2013-07-10 2020-12-30 Matrix Biology Inst Composições de hialuronano de elevada elasticidade e suas utilizações
SG11201603081WA (en) * 2013-10-22 2016-05-30 Cantex Pharmaceuticals Inc Methods of treating and preventing radiation damage
US9187576B2 (en) 2013-11-25 2015-11-17 Deuteria Biomaterials, Llc Deuterium-enriched hyaluronan
US9637712B2 (en) 2014-01-10 2017-05-02 Lost Spirits Distillery, Llc Method for rapid maturation of distilled spirits using light and heat processes
US10508259B2 (en) 2014-01-10 2019-12-17 Lost Spirits Technology Llc Method for rapid maturation of distilled spirits using light, heat, and negative pressure processes
US9637713B2 (en) 2014-01-10 2017-05-02 Lost Spirits Distillery, Llc Method for rapid maturation of distilled spirits using light and heat processes
US10947488B2 (en) 2014-01-10 2021-03-16 Lost Spirits Technology Llc Method for rapid maturation of distilled spirits using light and heat processes
US10772931B2 (en) 2014-04-25 2020-09-15 Purdue Research Foundation Collagen binding synthetic peptidoglycans for treatment of endothelial dysfunction
WO2016133910A1 (en) 2015-02-17 2016-08-25 Cantex Pharmaceuticals, Inc. Treatment of cancers and hematopoietic stem cell disorders privileged by cxcl12-cxcr4 interaction
CN108135926A (zh) 2015-09-24 2018-06-08 基质生物研究所 高弹性透明质酸组合物及其使用方法
ITUB20155623A1 (it) * 2015-11-16 2017-05-16 Fidia Farm Spa Processo migliorato per la produzione di HA solfatato di elevata purezza
WO2018053111A1 (en) * 2016-09-15 2018-03-22 University Of Utah Research Foundation In situ gelling compositions for the treatment or prevention of inflammation and tissue damage
US10849914B2 (en) 2017-06-12 2020-12-01 University Of Utah Research Foundation Methods for producing chemoembolic agents for the delivery of anti-cancer agents
CN110809478A (zh) 2017-07-07 2020-02-18 斯米克Ip有限公司 合成的生物缀合物
US20200237804A1 (en) * 2017-10-18 2020-07-30 Glycomira Therapeutics, Inc. Methods and compositions for treating chronic rhinosinusitis
CN108586574B (zh) * 2018-04-26 2019-11-12 国家***第三海洋研究所 氨基葡萄糖肽类化合物及其制备方法与应用
CN111228653A (zh) * 2018-11-13 2020-06-05 格莱科米拉治疗公司 用电离辐射加强癌症治疗的方法
KR20210121147A (ko) 2019-01-30 2021-10-07 보오슈 앤드 롬 인코포레이팃드 가교화 중합체 망상구조물 및 이의 용도
WO2022157314A1 (en) * 2021-01-22 2022-07-28 Dsm Ip Assets B.V. Hyaluronic acid for use on the skin
WO2022157307A1 (en) * 2021-01-22 2022-07-28 Dsm Ip Assets B.V. Hyaluronic acid as antimicrobial agent for use on the skin

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030199687A1 (en) 2002-04-11 2003-10-23 Manssur Yalpani Biocompatible materials and probes
WO2007006403A2 (en) 2005-07-07 2007-01-18 Fidia Advanced Biopolymers S.R.L. Biomaterials in the form of fibres for use as medical devices in the treatment of wounds, and their production process

Family Cites Families (73)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2599172A (en) 1948-11-29 1952-06-03 Searle & Co Sulfuric acid esters of hyaluronic acid and processes for the production thereof
US4240163A (en) * 1979-01-31 1980-12-23 Galin Miles A Medicament coated intraocular lens
US5166331A (en) 1983-10-10 1992-11-24 Fidia, S.P.A. Hyaluronics acid fractions, methods for the preparation thereof, and pharmaceutical compositions containing same
US4851521A (en) 1985-07-08 1989-07-25 Fidia, S.P.A. Esters of hyaluronic acid
FR2584728B1 (fr) 1985-07-12 1987-11-20 Choay Sa Procede de sulfatation de glycosaminoglycanes et de leurs fragments
EP0244178A3 (en) 1986-04-28 1989-02-08 Iolab, Inc Intraocular dosage compositions and method of use
SE453394B (sv) 1986-07-07 1988-02-01 Pharmacia Ab Forfarande for framstellning av sulfaterade polysackarider genom anvendning av ett reducerande medel for sulfateringsreaktionen
EP0285357A3 (en) 1987-03-31 1989-10-25 Kabushiki Kaisha Ueno Seiyaku Oyo Kenkyujo Control of retroviruses
DK505588D0 (da) 1988-02-26 1988-09-09 Jesper Hamburger Middel og anvendelse af samme
IT1217458B (it) 1988-05-02 1990-03-22 Crinos Ind Farmacoriologica S Sulfoamino derivati di condroitin solfati,del dermatan solfato e dell' acido ialuronico e loro proprieta' farmacologiche
JP2769584B2 (ja) * 1990-06-04 1998-06-25 参天製薬株式会社 局所投与用抗アレルギー剤
IT1247175B (it) 1991-04-19 1994-12-12 Fidia Spa Procedimento per la purificazione di acido ialuronico e frazione di acido ialuronico puro per uso oftalmico.
US5652014A (en) 1991-08-16 1997-07-29 Galin; Miles A. Medicament coated refractive anterior chamber ocular implant
ITPD940054A1 (it) 1994-03-23 1995-09-23 Fidia Advanced Biopolymers Srl Polisaccaridi solfatati
US5872109A (en) 1995-02-07 1999-02-16 Shiseido Company, Ltd. Anti-inflammatory agent
GB2317182B (en) 1996-09-11 2000-11-01 Johnson & Johnson Medical Sulfated polysaccharides and uses thereof in medical treatment
JPH10195107A (ja) 1997-01-10 1998-07-28 Shiseido Co Ltd オリゴ硫酸化ヒアルロン酸
DE69809892T2 (de) * 1997-04-04 2003-08-28 Fidia Advanced Biopolymers Srl N-sulfatierte hyaluronsäureverbindungen, ihre derivate und verfahren zu ihrer herstellung
US5981509A (en) 1997-05-20 1999-11-09 Shiseido Company, Ltd. Preparation for prophylaxis or treatment of renal diseases containing sulfated polysaccharide
IT1293484B1 (it) 1997-06-11 1999-03-01 Fidia Advanced Biopolymers Srl Materiale biologico comprendente una efficiente coltura di cellule e una matrice tridimensionale biocompatibile e biodegradabile
IT1294797B1 (it) 1997-07-28 1999-04-15 Fidia Advanced Biopolymers Srl Uso dei derivati dell'acido ialuronico nella preparazione di biomateriali aventi attivita' emostatica fisica e tamponante
ITPD980037A1 (it) 1998-02-25 1999-08-25 Fidia Advanced Biopolymers Srl Acido ialuronico solfatato e i suoi derivati legati covalentemente a polimeri sintetici pe la preparazione di biomateriali e per il rivesti
DE19813234A1 (de) 1998-03-26 1999-09-30 Knoell Hans Forschung Ev Verfahren zur Herstellung hochsulfatierter Hyaluronsäuren
JPH11279042A (ja) 1998-03-30 1999-10-12 Shiseido Co Ltd 皮膚外用剤
US6984667B2 (en) 1998-04-08 2006-01-10 Theta Biomedical Consulting And Development Co. Synergistic proteoglycan compositions for inflammatory conditions
ITPD980149A1 (it) 1998-06-17 1999-12-17 Fidia Advanced Biopolymers Srl Protesi tridimensionali comprendenti derivati dell'acido ialuronico per riparare o ricostruire i tessuti danneggiati e processo per la
KR20010030803A (ko) 1998-07-31 2001-04-16 야마야 와따루 신규 글리코사미노글리칸 및 이를 함유하는 의약 조성물
IT1303735B1 (it) 1998-11-11 2001-02-23 Falorni Italia Farmaceutici S Acidi ialuronici reticolati e loro usi medici.
IT1306644B1 (it) 1999-04-08 2001-10-02 Fidia Advanced Biopolymers Srl Strutture tridimensionali comprendenti derivati dell'acido ialuronicoottenibili mediante la tecnica antisolvente supercritico.
US6288043B1 (en) * 1999-06-18 2001-09-11 Orquest, Inc. Injectable hyaluronate-sulfated polysaccharide conjugates
JP2001097997A (ja) 1999-10-01 2001-04-10 Shiseido Co Ltd 硫酸化ヒアルロン酸を用いたアフィニティー吸着担体及びその使用
JP4139029B2 (ja) * 1999-12-10 2008-08-27 大阪瓦斯株式会社 電源装置
JP2001163789A (ja) 1999-12-13 2001-06-19 Maruho Co Ltd マトリックスメタロプロテアーゼ阻害用医薬組成物
CA2397016C (en) 2000-01-10 2011-03-29 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Use of lipid conjugates in the treatment of disease
US6828308B2 (en) * 2000-07-28 2004-12-07 Sinclair Pharmaceuticals, Ltd. Compositions and methods for the treatment or prevention of inflammation
IT1317359B1 (it) * 2000-08-31 2003-06-16 Fidia Advanced Biopolymers Srl Polisaccaridi percarbossilati, quali l'acido ialuronico, processo perla loro preparazione e loro impiego in campo farmaceutico e
DE10053053A1 (de) 2000-10-19 2002-05-16 Knoell Hans Forschung Ev Pharmazeutische Formulierungen zur Hemmung von entzündlichen Arthritiden
ITPD20020064A1 (it) 2002-03-12 2003-09-12 Fidia Advanced Biopolymers Srl Derivati esterei dell'acido ialuronico per la preparazione di idrogelda utilizzare in campo biomedico, sanitario e chirurgico e come sistem
WO2003086474A2 (en) 2002-04-11 2003-10-23 Carbomer, Inc Fluorinated or paramagnetic alginate polymer, annexin paramagnetic conjugate, and their use as contrasting agent in mri
CN1671400A (zh) 2002-07-03 2005-09-21 派瑞克科学公司 透明质酸组合物以及使用方法
JP2004262777A (ja) * 2003-02-27 2004-09-24 Shiseido Co Ltd アセチル化ヒアルロン酸含有眼用医薬組成物
DE10352137A1 (de) 2003-11-04 2005-06-16 Beschorner, Katharina, Dr. Verwendung sulfatierter Hyaluronsäure
AU2004297231B2 (en) 2003-12-04 2012-02-02 University Of Utah Research Foundation Modified macromolecules and associated methods of synthesis and use
US20050203056A1 (en) * 2003-12-19 2005-09-15 Aventis Pharma S.A. Carboxyl-reduced derivatives of hyaluronic acid, preparation thereof, use thereof as a medicinal product and the pharmaceutical compositions containing them
FR2864090B1 (fr) * 2003-12-19 2006-01-27 Aventis Pharma Sa Derives carboxy-reduits de l'acide hyaluronique, leur preparation, leur application comme medicament et les compositions pharmaceutiques les renfermant
ITPD20040245A1 (it) * 2004-10-08 2005-01-08 Fidia Advanced Biopolymers Srl Biomateriali costituiti da acido ialuronico solfatato e gellano utilizzabili nella prevenzione delle adesioni spinali
DE102005004643B4 (de) 2005-01-28 2010-04-08 Innovent E.V. Technologieentwicklung Antivirale Kombinationen sowie ihre Verwendung
JP2006206849A (ja) 2005-01-31 2006-08-10 Seikagaku Kogyo Co Ltd アルキルエステル化されたグリコサミノグリカンの製造方法
WO2006105313A2 (en) * 2005-03-29 2006-10-05 Massachusetts Institute Of Technology Compositions of and methods of using oversulfated glycosaminoglycans
US20060223781A1 (en) 2005-04-04 2006-10-05 Neoparin, Inc. Process for induction of intramolecular migration of sulfates, phosphates, and other oxyanions
US7993678B2 (en) 2005-09-26 2011-08-09 Novozymes Biopolymer A/S Hyaluronic acid derivatives
US7517856B2 (en) 2005-10-11 2009-04-14 Ben-Gurion University Of The Negev Research And Development Authority Bioconjugates comprising sulfated polysaccharides and their uses
ES2616295T3 (es) 2005-10-12 2017-06-12 Seikagaku Corporation Agente para aplicar a mucosa y procedimiento para la producción del mismo
DE602006019474D1 (de) * 2005-11-22 2011-02-17 Ard Sa Hren dafür und verwendungen davon
US20070166266A1 (en) 2006-01-19 2007-07-19 Solazyme, Inc. Methods and compositions for improving the health and appearance of skin
US8071757B2 (en) 2006-03-02 2011-12-06 Novozymes Biopharma Dk A/S Aryl/alkyl vinyl sulfone hyaluronic acid derivatives
ITPD20060219A1 (it) 2006-05-31 2007-12-01 Fidia Farmaceutici Composizioni farmaceutiche contenenti acido ialuronico solfatato nel trattamento dell'osteoartrosi
US20080032920A1 (en) 2006-07-11 2008-02-07 Prestwich Glenn D Macromolecules modified with electrophilic groups and methods of making and using thereof
AR062046A1 (es) 2006-07-25 2008-08-10 Osmotica Pharmaceutical Argentina S A Soluciones oftalmicas
TW200838552A (en) * 2007-01-25 2008-10-01 Novozymes Biopolymer As Methyl esters of hyaluronic acid
JP5088864B2 (ja) 2007-03-16 2012-12-05 オリンパス株式会社 生体組織補填材とその製造方法
EP2025687A1 (en) 2007-07-23 2009-02-18 Istituto Scientifico di Chimica E Biochimica "G Ronzoni Process for the preparation of heparanase-inhibiting sulfated hyaluronates and products obtained thereby
US20100249064A1 (en) * 2007-09-07 2010-09-30 University Of Chicago Methods and compositions for treating diseases and conditions involving higher molecular weight hyaluronan
EP2057983A1 (en) 2007-11-07 2009-05-13 Bruschettini S.r.l. Compositions for the topical protection of the ocular tissues from the damaging effects of ultraviolet radiations
WO2009111159A2 (en) 2008-03-03 2009-09-11 New York University Biocompatible materials containing stable complexes of tsg-6 and hyaluronan and method of using same
US8343942B2 (en) 2008-04-04 2013-01-01 University Of Utah Research Foundation Methods for treating interstitial cystitis
EP2281008B1 (en) 2008-04-04 2017-01-04 University of Utah Research Foundation Alkylated and sulfated hyaluronan compounds, methods for their preparation and use thereof
JP4884559B2 (ja) 2009-02-02 2012-02-29 大塚化学株式会社 低分子量多硫酸化ヒアルロン酸誘導体及びこれを含有する医薬
US20100204325A1 (en) 2009-02-11 2010-08-12 Allergan, Inc. Valproic acid drug delivery systems and intraocular therapeutic uses thereof
IT1393945B1 (it) 2009-04-21 2012-05-17 Fidia Farmaceutici Composizioni comprendenti acido ialuronico, acido ialuronico solfatato, calcio e vitamina d3 nel trattamento delle malattie osteoarticolari e muscoloscheletriche
IT1397246B1 (it) 2009-05-14 2013-01-04 Fidia Farmaceutici Nuovi medicamenti ad uso topico a base di acido ialuronico solfatato come agente attivante o inibente l'attivita' citochinica
IT1397247B1 (it) 2009-05-14 2013-01-04 Fidia Farmaceutici Nuovi agenti regolatori dell'attivita' citochinica
EP2688402B1 (en) 2011-03-23 2018-10-24 University of Utah Research Foundation Means for treating or preventing urological inflammation

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030199687A1 (en) 2002-04-11 2003-10-23 Manssur Yalpani Biocompatible materials and probes
WO2007006403A2 (en) 2005-07-07 2007-01-18 Fidia Advanced Biopolymers S.R.L. Biomaterials in the form of fibres for use as medical devices in the treatment of wounds, and their production process

Also Published As

Publication number Publication date
US20110082104A1 (en) 2011-04-07
MX2010010904A (es) 2010-11-04
US20120058161A1 (en) 2012-03-08
BRPI0909849A2 (pt) 2015-10-06
WO2009124266A3 (en) 2009-12-17
EP2281008B1 (en) 2017-01-04
KR20110004422A (ko) 2011-01-13
JP5758797B2 (ja) 2015-08-05
CA2719666A1 (en) 2009-10-08
WO2009124266A2 (en) 2009-10-08
JP2011516672A (ja) 2011-05-26
US7855187B1 (en) 2010-12-21
US20150209385A1 (en) 2015-07-30
US20130190234A1 (en) 2013-07-25
US8329673B2 (en) 2012-12-11
AU2009231634B2 (en) 2014-05-15
EP2281008A2 (en) 2011-02-09
US9549945B2 (en) 2017-01-24
AU2009231634A1 (en) 2009-10-08
CA2719666C (en) 2016-08-16
CN102177180A (zh) 2011-09-07
AU2009231634A2 (en) 2012-04-12
US8399430B2 (en) 2013-03-19
US20100317616A1 (en) 2010-12-16
US8951990B2 (en) 2015-02-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101594552B1 (ko) 알킬화된 반합성 글리코사미노글리코산 에테르 및 이의 제조 및 사용 방법
Girish et al. The magic glue hyaluronan and its eraser hyaluronidase: a biological overview
JP6334506B2 (ja) 部分的および完全硫酸化ヒアルロナンの用途
US20170095501A1 (en) Pharmaceutical compositions composed of low molecular weight sulfated hyaluronan
KR20210040359A (ko) 섬유성 유착 치료를 위한 고황산화 푸칸
EP3142749B1 (en) Viscosupplement composition comprising ulvan for treating arthritis
KR20140042795A (ko) 비뇨기 염증을 치료 또는 예방하는 방법
CN108524948A (zh) 一种透明质酸衍生化的非甾体抗炎抗癌药物及其制备方法和应用
WO2021128253A1 (zh) 一种糖胺聚糖衍生物及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190208

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20200206

Year of fee payment: 5