KR101068524B1 - 락토바실러스 프란타럼 μ23 균주를 포함하는 발효유 및이의 제조방법 - Google Patents

락토바실러스 프란타럼 μ23 균주를 포함하는 발효유 및이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 락토바실러스 프란타럼 M23 균주(KACC 91329P)를 이용한 발효유 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 발효유 제조에 적합한 젖산균으로서 멜라닌 생성 억제 능력이 있는 신규한 젖산균인 락토바실러스 프란타럼(Lactobacillus plantarum) M23 균주를 포함하는 발효유 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 락토바실러스 프란타럼 M23 균주(KACC 91329P)를 포함하는 발효유는 색깔, 맛, 조직감 등에 있어서 기호성이 우수할 뿐만 아니라 종래에 발견된 젖산 발효균으로 발효시킨 시중 유통 발효유보다 멜라닌 생성 억제 능력이 뛰어난 발효유를 제공할 수 있다.
락토바실러스 프란타럼 M23 균주, 발효유, 멜라닌 생성능

Description

락토바실러스 프란타럼 Μ23 균주를 포함하는 발효유 및 이의 제조방법{Fermented milk Using Lactobacillus plantarum M23 and Preparation method thereof}
본 발명은 락토바실러스 프란타럼 M23 균주를 이용한 발효유 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 발효유 제조에 적합한 젖산균으로서 멜라닌 생성 억제 능력이 있는 신규한 젖산균인 락토바실러스 프란타럼(Lactobacillus plantarum) M23 균주를 포함하는 발효유 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
현재 발효유에 사용하는 젖산균으로는 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 스트렙토코커스 서머필러스(Streptococcus thermophilus) 및 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 등이 주로 사용되어 왔으나, 매년 수입에 의존하고 있는 실정이다.
따라서 전술한 젖산균 외에, 수입하지 않고서도 국내에서 원활한 공급이 이 루어질 수 있는 신규의 젖산균 개발에 대한 필요성이 끊임없이 대두되었다.
이에, 본 발명자들은 원유에 다양한 특성이 있는 젖산균이 존재할 것임에 착안하고, 발효유의 제조에 합당한 멜라닌 생성 억제 능력이 있는 젖산균을 확보하고자 연구 노력한 결과, 원유로부터 신규의 젖산균인 락토바실러스 프란타럼(Lactobacillus plantarum) M23 균주(KACC 91329P)를 분리하고 이를 포함하는 발효유 및 발효유의 제조방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 신규한 젖산균을 포함하는 발효유 및 이의 제조방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 원유에서 분리한 신규의 젖산균인 락토바실러스 프란타럼 M23 균주(KACC 91329P)를 포함하는 발효유 및 이의 제조방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 원유에서 분리한 신규한 젖산균인 락토바실러스 프란타럼 M23 균주(KACC 91329P)를 포함하는 발효유는 종균의 안정적인 공급으로 인해 발효유의 생산단가를 낮출 수 있다.
본 발명의 락토바실러스 프란타럼 M23 균주(KACC 91329P)를 포함하는 발효유는 색깔, 맛, 조직감 등에 있어서 기호성이 우수할 뿐만 아니라 종래에 발견된 젖산 발효균으로 발효시킨 시중 유통 발효유보다 멜라닌 생성 억제 능력이 뛰어난 발효유를 제공할 수 있다.
본 발명은 발효유에 있어서, 신규한 젖산균인 락토바실러스 프란타럼 M23 균 주(KACC 91329P)를 포함하는 발효유를 제공한다.
본 발명은 발효유의 제조에 있어서, 신규한 젖산균인 락토바실러스 프란타럼 M23 균주(KACC 91329P)를 원유에 접종하는 단계를 포함하는 발효유의 제조방법을 제공한다.
이하 본 발명의 내용을 보다 상세히 설명하고자 한다.
본 발명은 발효유에 있어서, 원유에서 분리된 신규한 젖산균인 락토바실러스 프란타럼 M23 균주(KACC 91329P)를 포함유하는 발효유를 제공한다.
상기의 락토바실러스 프란타럼 M23 균주(KACC 91329P)는 멜라신 생성 억제의 효과가 있어, 상기 락토바실러스 프란타럼 M23 균주를 포함하는 발효유의 섭취시 멜라닌 생성을 억제할 수 있다.
본 발명의 발효유는 락토바실러스 프란타럼 M23 균주를 함유한 발효유에 과당, 올리고당 등의 식품학적으로 허용 가능한 당류 또는 딸기, 블루베리, 포도 등을 이용한 과일 쨈을 첨가하여 기호성이 우수한 발효유를 제조할 수 있다. 또한, 락토바실러스 프란타럼 M23 균주는 멜라닌 생성 억제능이 우수하여, 본 발명에 의한 발효유는 다른 균주에 의한 발효유보다 멜라닌 생성 억제능이 우수하다.
본 발명의 신규한 젖산균인 락토바실러스 프란타럼 M23 균주는 원유에서 분리되었으며, 후술하는 실험예의 방법에 따라 스크리닝 및 동정하였다. 락토바실러스 프란타럼 M23 균주의 동정은 그의 형태학적, 생리학적, 생화학적 및 유전적 특성을 기초로 하여 이루어졌다. 원유에서 분리한 신규의 젖산균이 내산성, 내담즙 성, 항균력 및 멜라닌 생성 억제 능력이 우수하여 발효유 제조에 적합함을 알아내고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명자들은 원유에서 변형 MRS배지에서 배양한 다음, 각 균락을 순수분리하고 노란색으로 변한 균락을 잠정적 젖산균으로 선발하였다. 선발된 균주는 전기 변형 MRS 배지에 도말한 후, 호기 배양하여 순수분리 하였다. 순수 분리된 균주를 동정한 결과, 균주는 그람양성 간균이며, 산소 유무와 상관없이 잘 생장하고 카탈라아제와 운동성에 대해서 음성으로 밝혀졌다. 또한, 15℃에서 생장하는 반면 45℃에서는 생장하지 않았으며, 글루코오스(glucose)로부터 가스와 알긴산으로부터 암모니아를 생성하지 않아 락토바실러스(Lactobacillus)에 속하는 것으로 확인하였다.
한편, 종명을 확인하기 위하여 49종의 당 발효 시험을 실시한 결과, 락토오스 등 25종으로부터 산을 생성하였고, ATB 동정시스템에 입력하여 조사한 결과와 16S rRNA 유전자 염기서열(Gene Sequence)을 이용하여 얻어진 결과가 일치되어 락토바실러스 프란타럼으로 판명되었다.
따라서 본 발명은 원유에서 분리한 탈지유 응고 균주들 중 탈지유 응고속도와 멜라닌 억제 능력이 우수한 균주를 락토바실러스 프란타럼(Lactobacillus plantarum) M23으로 명명하였다.
생균수와 pH를 측정하여 젖산균의 생장을 시험한 결과, 최적온도는 40℃이며, 발효유의 최적 pH 조건인 pH 4.3-4.4에 도달하는데 17시간 소요된다. 또한, 항생제 내성시험을 통해 생장 여부를 관찰하여 최저억제농도(MIC)값을 측정한 결과, 타계열의 항생제에 비해 페니실린-G(Penicillin-G), 옥사실린(Oxacillin), 노보바이오신(Novobiocin) 및 클로람페니콜(Chloramphenicol)에 대해 항생제 감수성이 높은 반면, 반코마이신(Vancomycin)에 대해 내성이 강하였다. 효소활성시험을 통해 나타난 결과, 류신 아릴아미다아제, 베타갈락토시다아제에서 효소 활성이 높게 나타난다.
또한, 벤조피렌(Benzopyrene)을 발암성 물질로 전환시키는 발암효소인 β -글루크로니다아제(β -glucuronidase)의 경우에는 효소활성이 없는 것으로 나타나 안전성을 확인할 수 있다. 담즙 내성을 MRS배지에서의 젖산균 성장을 시험함으로써 측정하였는바 OD값이 0.3 증가하는데 소요되는 시간은 담즙을 첨가하지 않을 때는 4시간, 담즙을 첨가할 때는 5시간 소요됨에 따라 약간 억제를 받기는 하나 담즙에 대한 내성이 있는 것으로 나타난다.
또한, pH 내성을 시험한 결과, 대조구 pH인 6.4에 비해 강산인 pH 2에서조차도 거의 영향이 없음에 따라 내산성이 있음을 보인다. 항균력 시험에서는 에스케리키아 콜리(Escherichia coli)에 대해 77.77％, 스테피로코커스 오레우스(Staphylococcus aureus)에 대해 83.76％, 살모넬라 타이피머리움(Salmonella typhimurium)에 대해 86.51％의 높은 억제력을 보인다. 상기에서 살펴본 바와 같이 본 발명의 락토바실러스 프란타럼 M23이 발효유 제조에 적합한 젖산균임을 확인할 수 있다.
본 발명의 락토바실러스 프란타럼 M23은 2007년 9월 27일 농업생명공학연구원 한국농업미생물자원센터(KACC)에 기탁번호 KACC 91329P로 기탁하였다.
본 발명은 상기에서 언급한 신규한 젖산균인 락토바실러스 프란타럼 M23 균주(KACC 91329P)를 포함하는 발효유의 제조방법을 나타낸다.
본 발명은 발효유의 제조에 있어서, 상기에서 언급한 신규한 젖산균인 락토바실러스 프란타럼 M23 균주(KACC 91329P)를 원유에 접종하는 단계를 포함하는 발효유의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 락토바실러스 프란타럼 M23 균주를 원유에 접종하여 발효유를 제조하는 방법을 공정별로 상세히 설명하면 다음과 같다.
[제1공정] 종균 및 벌크 접종균(bulk starter) 제조
원유에서 분리된 종균인 락토바실러스 프란타럼(Lactobacillus plantarum) M23 균주(KACC 91329P)를 탈지유 또는 환원탈지유에 0.5∼1％(v/v)로 접종하고, 37∼42℃에서 12∼24시간 동안 배양한다. 그런 다음, 락토바실러스 프란타럼(Lactobacillus plantarum) M23 균주(KACC 91329P)가 배양된 상기의 배양액 종균을 80∼90℃에서 30분∼60분간 열처리된 탈지유 또는 환원탈지유에 0.5∼1％(v/v)로 접종하고, 37∼42℃에서 12∼24시간 동안 배양하여, 이 배양액을 벌크 접종균으로 사용한다.
[제2공정] 발효액 제조
원유 0중량부 초과 100중량부 이하, 탈지분유 0중량부 초과 100중량부 이하와 효모 추출물 0중량부 초과 100중량부 이하를 첨가하고 55∼65℃에서 배합하여 완전히 녹인 후 180∼250kgf/㎠의 압력으로 균질한 다음 85∼95℃에서 5∼30분간 살균시킨다.
상기 과정을 통해 균질화 시킨 우유를 35∼45℃ 정도로 냉각시킨 후 상기의 균질화시킨 우유 100중량부에 대하여 상기 제1공정에서 얻은 락토바실러스 프란타럼(Lactobacillus plantarum) M23(KACC 91329P) 벌크 접종균을 상기의 0.5∼1.0중량부를 접종하여 최종 pH가 4.3∼4.6이 될때까지 배양시킨 다음 교반기로 교반하면서 배양액을 15∼20℃로 냉각하여 락토바실러스 프란타럼(Lactobacillus plantarum) M23 균주(KACC 91329P)를 포함하는 발효액을 얻는다.
상기 과정은 본 발명에 사용가능 한 발효유 제조의 바람직한 일 실시 배양으로서 반드시 이에 한정될 필요는 없다.
[제3공정] 발효유 제조
상기에서 얻은 발효액에 부재료를 첨가하여 관능성을 향상시킬 수 있다.
상기 제2공정에서 얻은 발효액 70∼90중량％와 부재료 10∼30중량％를 혼합하고 교반하여 발효유를 제조한다.
상기에서 부재료는 당시럽, 과일 및 정제수의 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.
상기에서 당시럽은 올리고당, 과당, 설탕, 포도당, 덱스트린의 군으로부터 선택된 어느 하나 이상, 바람직하게는 올리고당과 과당을 사용할 수 있다.
상기에서 과일은 포도농축액, 포도쨈, 딸기농축액, 딸기쨈의 군으로부터 선 택된 어느 하나 이상, 바람직하게는 포도농축액과 딸기쨈을 사용할 수 있다.
상기에서 부재료는 올리고당 3.0∼7.0중량％, 액상과당 1.0∼5.0중량％, 포도농축액 또는 딸기쨈 1∼10중량％ 및 정제수 1.0∼10중량％를 사용할 수 있다.
상기에서 발효유를 제조한 후 용기에 충전한 다음 포장하여 저장할 수 있다.
상기에서 포도농축액은 포도씨를 제거한 포도를 착즙한 후 농축하여 당도가 60∼65Brix인 것을 사용할 수 있다.
상기에서 딸기쨈은 당도 55∼65Brix, 딸기 함량 40∼50％인 딸기쨈을 사용할 수 있다.
상기에서 딸기쨈은 당도 61.2Bx, 딸기 함량 45％인 딸기잼을 사용할 수 있다.
상기에서 저장은 0∼10℃, 바람직하게는 0∼5℃의 온도에서 실시할 수 있다.
이하 본 발명의 내용을 실험예, 실시예에 의해 보다 상세하게 설명하기로 한다. 다만 이들은 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들에 한정되어지는 것으로 해석되어져서는 아니 된다.
[실험예 1] 미생물의 분리
시료로 사용된 원유는 국내 각 지역의 목장에서 수거하여 브롬크레졸 퍼플(Bromcresol purple)과 소듐아자이드(sodium azide)를 첨가한 변형 MRS배지(표 1)에 0.3㎖씩 평면도말법으로 접종한 후 37℃에서 48시간 배양하였다. 그런 다음, 각각의 균락을 전기 변형 MRS 배지에서 순수분리하고, 노란색으로 변한 균락을 잠정적 젖산균으로 선발하였다. 선발된 균주는 전기 변형 MRS 배지에 3회 백금이로 도말한 후 호기배양 하여 순수분리 하였다. 순수분리 균주를 10％ 환원 탈지유(Difco Laboratories, USA)에 접종하고 37℃에서 24시간 동안 배양하여 응고 여부를 확인하였다.
<표 1> 본 발명에서 미생물 분리에 사용된 변형 MRS 배지의 조성
성분 성분비(g/ℓ)
프로테오스 펩톤 10
쇠고치 추출물 10
효모 추출물 5
락토오스 20
트윈 80(tween 80) 1
암모늄 시트레이트 2
소디움 아세테이트 5
마그네슘 설페이트 0.1
망간 설페이트 0.05
디포타시움 포스페이트 2
소듐 아자이드 0.25
브롬크레졸 퍼플 0.04
[실험예 2] 멜라닌 억제 활성 젖산 균주 선발
상기에서 분리된 젖산균과 상업용 젖산균 1％를 10％ 환원탈지유에 37℃에서 pH 4.4에 도달할 때까지 배양한 다음 각각에서 얻어진 배양액을 4℃, 15,000rpm에서 10분간 원심 분리하였다. 얻어진 상등액을 0.45μm PVDF syringe filter(whatman Co.)로 여과한 후 67mM phosphate buffer (pH 6.8)에 녹인 8.0mM L-Dopa 120㎕와 시료 40㎕를 96-well microplate에 넣고 490nm에서 흡광도(A)를 측정한 후 tyrosinase mushroom(125unit/mL)용액을 40㎕ 첨가하였다. 실온에서 10분간 반응시킨 후 생성된 dopachrome의 양을 ELISA reader(UV-Visible Spectrophotomater)를 사용하여 흡광도(B)를 측정하였다. 반응 전·후의 시료흡광도 수치와 대조군의 흡광도수치(C)를 다음 식으로 계산하여 tyrosinase 활성 저해율(％)을 측정하였으며, 그 결과는 다음 표 2와 같다. 이 때 멜라닌 생성세포 유래 tyrosinase 활성 저해율 측정 시에는 Mouse 유래의 멜라닌 생성세포주인 Melanoma B16이 생성하는 tyrosinase를 직접 추출하여 사용하였다.
저해율(％) =
Figure 112008048924728-pat00001
×100
<표 2> 상업 균주, 한국식품연구원에서 보관 젖산 균주 및 분리 균주의 탈지유 응 고 여부와 배양 후의 Tyrosinase 활성 저해율
Figure 112008048924728-pat00002
상기 표 2에서 보는 바와 같이 분리된 젖산균 M23 균주는 타이로신아제(Tyrosinase) 활성 저해율이 다른 균주에 비해 높게 나타남에 따라 멜라닌 생성 억제 능력이 우수한 균주로 선발되었다.
[실험예 3] 미생물의 동정
미생물의 분류학적 동정은 Hammes 등[The prokaryotes, 1563-1578, 2nd Edition, Springer-Verlag Co.(1992)]의 방법에 따라 수행하였으며, 그 결과는 표 3에서 보는 바와 같다. 이들 균주는 공히 그람 양성, 간균이며, 산소유무와 상관없이 잘 생장하였고, 카탈라아제와 운동성에 대해서 음성이었다. 또한, 15℃에서 생장하는 반면 45℃에서는 생장하지 않았으며, 글루코오스(glucose)로부터 가스와 알긴산으로부터 암모니아를 생성하지 않아 Lactobacillus 속(genus)에 속하였다. 종(species)을 정하기 위하여 API 50CHL kit(API bioMerieux, France)를 이용하여 49종의 당발효 시험을 실시하였을 때 락토스 등 25종으로부터 산을 생성하였고, ATB 동정시스템(API bioMerieux, France)에 입력하여 조사한 결과와 16S rRNA Gene Sequence를 이용하여 얻어진 결과가 일치되어 락토바실러스 프란타럼으로 판명되었다. 원유에서 분리한 탈지유 응고균주들 중 탈지유 응고속도와 멜라닌 생성 억제 능력이 우수한 균주를 Lactobacillus plantarum M23으로 명명하고, 2007년 9월 27일 농업생명공학연구원 한국농업미생물자원센터(KACC)에 기탁번호 KACC 91329P로 기탁하였다.
<표 3> 본 발명의 신규 미생물 L. plantarum M23의 생리적 및 생화학적 특성
그램 반응
세포 형태
포자 형성
운동성
호기적 성장
혐기적 성장
카탈라제 반응
15℃에서 성장
45℃에서 성장
포도당으로 부터 가스생성
알기닌으로 부터 암모니아 생성 		+
rod
-
-
+
+
-
+
-
-
-
당이용 능력
글리세롤
에리티톨
D-아라비노스
L-아라비노스
리보스
글루코스
프락토스
만노스
소르보스
람노스
둘시톨
이노시톨
만니톨
솔비톨
α-메칠-D-만노사이드
α-메칠-D-글루코사이드
N 아세칠 글루코스아민
아미그달린
아르부틴
에스쿨린
살리신
셀로비오스
말토스
락토스
멜리비오스 		-
-
-
-
+
+
+
+
+
-
-
-
+
+
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+		 D-사이로스
L-사이로스
아도니톨
β -메칠-D-사이로사이드
갈락토스
수크로스
트레할로스
이눌린
멜레지토스
라피노스
스타치
글리코겐
실리톨
겐티오비오스
D-투라노스
D-라이소스
D-타가토스
D-후코스
L-후코스
D-아라비톨
L-아라비톨
글루코네이트
2-케토-글루코네이트
5-케토-글루코네이트
-
-
-
-
+
+
+
-
-
+
-
-
-
+
+
-
-
-
-
+
-
+
+
-
[실험예 4] 미생물의 생장시험
젖산균의 생장은 생균수, pH를 측정하여 시험하였다. 생균수는 10％ 탈지유 150㎖에 젖산균을 1㎖용 피펫으로 1방울 접종한 후 34℃, 37℃, 40℃에서 3시간 간격으로 24시간까지 배양한 각 시료를 0.1％ 펩톤용액에 희석하여 BCP(bromocresol purple) 첨가 평판측정용 한천배지(BCP plate count agar)에 부어 굳힌 후 35℃에서 48시간 배양하여 계수하였고, 온도 및 시간별로 pH 변화를 측정한바, 최적온도는 40℃이며, 발효유의 최적 pH 조건인 pH 4.3-4.4에 도달하는데 17시간 소요되었다.
[실험예 5] 항생제 내성시험
항생제 내성시험은 트립틱 소이 브로스(tryptic soy broth, Difco, USA)를 사용하여 2배 희석방법에 의해 생장 여부를 관찰하여 최저억제농도(MIC) 값을 정하였으며, 측정한 결과는 표 4에 나타내었다.
<표 4> L. plantarum M23의 항생제 감수성
항생제 최저억제농도(㎍/㎖)
아미노글리코사이드계
아미카신 40
켄타마이신 10
가나마이신 50
네오마이신 25
스트렙토마이신* 25
β -락탐계
페닐실린-G* 0.313
메치실린 5
옥사실린 1.875
암피실린 5
그램-양성 스펙트럼
바시트라신* 3.75
리팜피신 3.75
노보바이오신 0.11
린코마이신 3.125
그램-음성 스펙트럼
폴리마이신B* 37.5
광범위 스펙트럼
클로람페니콜 1.25
반코마이신* 1600
* : units/㎖
상기 표 4에서 볼 수 있는 바와 같이 L. plantarum M23은 타 계열의 항생제에 비해 페니실린-G(Penicillin-G), 옥사실린(Oxacillin), 노보바이오신(Novobiocin) 및 클로람페니콜(Chloramphenicol)에 대해 항생제 감수성이 높은 반면, 반코마이신(Vancomycin)에 대해 내성이 강하였다.
[실험예 6] 효소활성 시험
효소활성 시험은 MRS 액체배지에서 37℃, 18시간 동안 배양한 균주를 생리식염수로 희석하여 105∼106cfu/㎖ 수준의 시료를 조제한 후, API ZYM kit(API bioMerieux, France)를 이용하여 37℃에서 5시간 동안 배양한 다음 효소반응을 시켰다. 효소활성은 표준색상표를 비교하여 0-5의 수치로 표시한 결과는 표 5에 나타내었다.
<표 5> L. plantarum M23의 효소활성 비교
효 소 효소활성
알칼라인 포스파타아제
에스테라아제(C4)
에스테라아제 리파아제(C8)
리파아제(C14)
류신 아릴아미다아제
발린 아릴아미다아제
시스틴 아릴아미다아제
트립신
카이모트립신
산 포스파타아제
나프톨-AS-BI-포스포하이드로라아제
α-갈락토시다아제
β-갈락토시다아제
β-글루크로니다아제
α-글루코시다아제
β-글루코시다아제
N-아세칠-β -글루코스아민니다아제
α-만노시다아제
β-푸코시다아제 		1
1
1
0
5
4
2
0
0
3
3
2
5
0
4
4
5
0
0
*: 0에서 5까지 단계별로 표준색이 명시되어 있으며, 0은 음성이고 5는 최대의 강도를 나타낸다. 1은 5나노몰(nanomoles), 2는 10나노몰, 3은 20나노몰, 4는 30나노몰, 5는 40나노몰 이상의 효소활성을 나타낸다.
상기 표 5에서 볼 수 있는 바와 같이 L. plantarum M23은 류신 아릴아미다아제와 β -갈락토시다아제에서 효소 활성이 높게 나타났다. 벤조피렌(Benzopyrene)을 발암성 물질로 전환시키는 발암효소인 β -글루크로니다아제(β -glucuronidase)의 경우에는 효소활성이 없는 것으로 나타나 안전성을 확인할 수 있었다.
[실험예 7] 담즙 내성시험
담즙 내성시험은 길리랜드와 월커의 방법(Gilliland & Walker, J. Dairy Sci., 73, 905, 1990)에 따라 측정하였다. 이때 OD값이 0.3 증가하는데 소요되는 시간은 담즙을 첨가하지 않을 때는 4시간, 담즙을 첨가할 때는 5시간 소요됨에 따라 약간 억제를 받기는 하나 담즙에 대한 내성이 있는 것으로 나타났다.
[실험예 8] pH 내성시험
pH 내성시험은 클라크 등의 방법(Clark et al., Cultured Dairy Products J., 28(4), 11, 1993)에 따라 측정한 결과는 표 6에 나타내었다.
<표 6> 염산용액에서 3시간 후의 L. plantarum M23 내성(단위 : CFU per ㎖(Log number))
배양시간(hr) pH 2 pH 3 pH 4 pH 6.4
0 7.72 7.78 7.72 7.73
1 7.68 7.75 7.74 7.73
2 7.61 7.64 7.74 7.85
3 7.52 7.61 7.81 7.88
상기 표 6에서 볼 수 있는 바와 같이 대조구 pH인 6.4에 비해 강산인 pH 2에서조차도 거의 영향이 없음에 따라 내산성이 있음을 보였다.
[실험예 9] 항균력 시험
항균력 시험은 길리랜드와 스펙(Gilliland & Speck, J. Food Prot., 40(12), 820, 1977)에 따라 측정한 결과는 표 7에 나타내었다.
<표 7> MRS 배지에서 L. plantarum M23 식중독균 억제(*)
식중독균

 생장 억제율(％)
식중독균a L. plantarum M23a
CFU/㎖ pH CFU/㎖ pH
Escherichia coli 1.15×108 6.46 2.55×107 5.02 77.77
Salmonella
typhimurium 		1.25×108 5.63 1.68×107 4.96 86.51
Saphyloccous aureus 6.59×108 5.78 1.07×108 4.99 83.76
* L. plantarum M23의 초기 수 : 1.09×107CFU/㎖
a 37℃에서 6시간 배양 후 측정
상기 표 7에서 볼 수 있는 바와 같이, L. plantarum M23이 에스케리키아 콜리(Escherichia coli)에 대해 77.77％, 스테피로코커스 오레우스(Staphylococcus aureus)에 대해 83.76％, 살모넬라 타이피머리움(Salmonella typhimurium)에 대해 86.51％의 높은 억제력을 보였다.
[실시예 1]
원유 96.02중량부, 탈지분유 3.85중량부와 효모 추출물 0.13중량부를 첨가하고 65℃에서 배합하여 완전히 녹인 후 215±35kgf/㎠의 압력으로 균질화하였다. 상기 균질화물을 90℃에서 5분간 살균하고, 37℃로 냉각시킨 다음 상기 균질화물 100중량부에 대하여 락토바실러스 프란타럼(Lactobacillus plantarum) M23(KACC 91329P) 벌크 접종균 1.0중량부를 접종하여 최종 pH가 4.4로 감소할 때까지 배양시킨 다음 교반기로 서서히 교반하면서 배양액을 17±2.5℃로 냉각하여 락토바실러스 프란타럼(Lactobacillus plantarum) M23(KACC 91329P)를 포함하는 발효액을 얻었다.
상기에서 얻은 발효액 84중량％, 올리고당 5.0중량％, 액상과당 4.0중량％, 포도농축액 1.0중량％, 정제수 6.0중량％를 첨가하여 혼합한 다음 교반하여 락토바실러스 프란타럼(Lactobacillus plantarum) M23(KACC 91329P)를 포함하는 발효유를 제조하였다.
하기의 표 8에 상기 발효유의 성분을 나타내었다.
상기 락토바실러스 프란타럼(Lactobacillus plantarum) M23(KACC 91329P) 벌크 접종균은 원유에서 분리된 종균인 락토바실러스 프란타럼(Lactobacillus plantarum) M23 균주(KACC 91329P)를 환원탈지유에 1％(v/v)로 접종하고, 39.5±2.5℃에서 18±6시간 동안 배양한 다음, 락토바실러스 프란타럼(Lactobacillus plantarum) M23 균주(KACC 91329P)가 배양된 상기의 배양액 종균을 85±5℃에서 45±15분간 열처리된 환원탈지유에 1％(v/v)로 접종하고, 39.5±2.5℃에서 18±6시간 동안 배양한 것을 사용하였다.
[실시예 2]
포도농축액 1.0중량％ 대신에 3.0중량％, 정제수 6.0중량％ 대신에 4.0중량％ 사용하는 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 같은 방법으로 발효유를 제조하였다.
[실시예 3]
포도농축액 1.0중량％ 대신에 5.0중량％, 정제수 6.0중량％ 대신에 2중량％ 사용하는 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 같은 방법으로 발효유를 제조하였다.
[실시예 4]
액상과당 4.0중량％ 대신에 2.0중량％, 포도농축액 1.0중량％ 대신에 딸기쨈 4.0중량％, 정제수 6.0중량％ 첨가 대신에 5.0중량％ 사용하는 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 같은 방법으로 발효유를 제조 및 저장하였다.
[실시예 5]
액상과당 4.0중량％ 대신에 2.0중량％, 포도농축액 1.0중량％ 대신에 딸기 쨈 6.0중량％, 정제수 6.0중량％ 대신에 3.0중량％ 사용하는 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 같은 방법으로 발효유를 제조 및 저장하였다.
[실시예 6]
액상과당 4.0중량％ 대신에 2.0중량％, 포도농축액 1.0중량％ 대신에 딸기쨈 8.0중량％, 정제수 6.0중량％ 대신에 1.0중량％ 사용하는 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 같은 방법으로 발효유를 제조 및 저장하였다.
표 8. 실시예 1 내지 실시예 6의 발효유 성분(단위 : 중량％)
항목(중량％) 실시예1 실시예2 실시예3 실시예4 실시예5 실시예6
발
효
액		 원유 80.66 80.66 80.66 80.66 80.66 80.66
탈지분유 3.23 3.23 3.23 3.23 3.23 3.23
효모추출물 0.11 0.11 0.11 0.11 0.11 0.11
부
재
료		 올리고당 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
액상과당 4.0 4.0 4.0 2.0 2.0 2.0
포도농축액 1.0 3.0 5.0 - - -
딸기쨈 - - - 4.0 6.0 8.0
정제수 6.0 4.0 2.0 5.0 3.0 1.0
합계 100 100 100 100 100 100
<시험예 1> 관능검사
유제품 관련분야에서 2년 이상 근무한 13명의 인원을 관능검사요원으로 하여 상기 실시예 1 내지 실시예 6에서 제조한 발효유의 색깔, 맛, 조직감 및 종합적 기호도와 같은 관능검사를 9점 평점법으로 실시하여 그 결과를 아래의 표 9에 정리하여 나타내었다.
표 9. 실시예 1 내지 실시예 6 및 대조군의 발효유 관능검사
항목 관능검사*
색깔 맛 조직감 종합적 기호도
실시예 1 6.70±1.63 6.82±1.62 6.76±1.83 6.84±1.51
실시예 2 6.92±1.11 7.37±1.38 6.86±1.07 7.34±1.43
실시예 3 6.84±1.57 7.12±1.26 6.93±0.86 7.10±0.94
실시예 4 6.82±1.54 5.64±1.43 6.82±1.08 5.82±1.08
실시예 5 7.00±1.34 7.20±0.71 7.00±1.00 7.16±0.92
실시예 6 6.55±1.63 7.24±1.17 6.91±1.04 7.12±1.25
대조구** 6.33±1.72 6.42±1.44 6.42±1.38 6.35±1.42
* 1 : 매우 좋지 않음, 5 : 보통, 9: 매우 좋음
** 대조구는 서울우유사의 퓨오레 제품
상기 표 9에서처럼 락토바실러스 프란타럼 M23 균주를 함유한 본 발명의 실시예 1 내지 실시예 6의 발효유는 기호성이 우수한 발효유를 제조할 수 있었다.
<시험예 2> 동물실험 결과
멜라닌 생성 억제능이 우수한 Lactobacillus plantarum M23 균주를 이용한 발효유의 미백효과를 알아보기 위하여 500g 내외의 Brown guinea pig(암컷, 5마리)를 사용하여 동물실험을 실시하였다(표 10 참조). 등의 털을 제거하고 세척 후, 고정시켜 500mJ의 자외선을 일정한 부위에 일주일 간격으로 4회 조사하였으며, 3주째 UV조사한 다음날 도포를 시작하였다. 도포방법은 제모, 세척하고 30분 후 각각의 부위에 각각의 처리군별로 50㎕ 씩 도포(1일 2회)하며, 2주에서 4주간 도포하였고 색차계로 명도 값을 측정하였다.
<표 10> Brown guinea pig를 대상으로 발효유의 미백효과(n=5)
항목 주(week) 미백효과2 )
0 2 4
대조군 1 50.27±2.041 51.65±1.01 52.29±2.73 4.02％
대조군 2 50.29±2.40 52.06±1.47 52.94±2.45 5.27％
S1 9.96±2.20 52.26±1.19 53.77±1.55 7.63％
S2 50.01±2.20 52.62±1.22 53.77±2.64 7.52％
S3 49.82±1.38 52.88±0.67 53.46±1.75 7.31％
1) L : 명도
2) 미백효과 : (4주 경과시 명도 값 - 초기 명도 값) / 초기 명도 값 x 100
대조군 1 : 매일유업사의 도마슈노플레인 호상발효유
대조군 2 : 증류수
S1 : L. plantarum M23 균주로 발효시킨 포도첨가 발효유
S2 : L. plantarum M23 균주로 발효시킨 플레인 발효유
S3 : 시중 미백용 크림 화장품
상술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만 해당 기술 분야의 숙련된 당업자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

Claims (2)

  1. 삭제
  2. (1)원유에서 분리된 종균인 락토바실러스 프란타럼(Lactobacillus plantarum) M23 균주(KACC 91329P)를 탈지유 또는 환원탈지유에 0.5∼1％(v/v)로 접종하고, 37∼42℃에서 12∼24시간 동안 배양한 다음 락토바실러스 프란타럼 M23 균주(KACC 91329P)가 배양된 상기의 배양액 종균을 80∼90℃에서 30분∼60분간 열처리된 탈지유 또는 환원탈지유에 0.5∼1％(v/v)로 접종하고, 37∼42℃에서 12∼24시간 동안 배양하여 벌크 접종균의 배양액을 얻는 단계;
    (2)원유 0중량부 초과 100중량부 이하, 탈지분유 0중량부 초과 100중량부 이하와 효모 추출물 0중량부 초과 100중량부 이하를 첨가하고 55∼65℃에서 배합하여 완전히 녹인 후 180∼250kgf/㎠의 압력으로 균질한 다음 85∼95℃에서 5∼30분간 살균시켜 얻은 우유를 35∼45℃ 정도로 냉각시킨 후 상기의 균질화 후 살균시킨 우유 100중량부에 대하여 상기 (1)단계에서 얻은 락토바실러스 프란타럼 M23(KACC 91329P) 벌크 접종균의 배양액 0.5∼1.0중량부를 접종하여 최종 pH가 4.3∼4.6이 될때까지 배양시킨 다음 교반기로 교반하면서 배양액을 15∼20℃로 냉각하여 락토바실러스 프란타럼 M23 균주(KACC 91329P)를 포함하는 발효액을 얻는 단계;
    (3)상기의 (2)단계에서 얻은 발효액 70∼90중량％와 올리고당, 과당, 설탕, 포도당, 덱스트린, 포도농축액, 포도쨈, 딸기농축액, 딸기쨈, 정제수 중에서 선택된 어느 하나 이상의 부재료 10∼30중량％를 혼합하고 교반하여 발효유를 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 프란타럼 M23 균주(KACC 91329P)를 포함하는 발효유의 제조방법.
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