KR101915951B1

KR101915951B1 - P8 단백질을 발현 및 분비하는 위장관 질환 치료 약물 전달용 미생물 및 그를 포함하는 위장관 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물

Info

Publication number: KR101915951B1
Application number: KR1020180003008A
Authority: KR
Inventors: 정명준
Original assignee: 주식회사 쎌바이오텍
Priority date: 2018-01-09
Filing date: 2018-01-09
Publication date: 2018-11-07
Also published as: US20190328801A1; EP3541943A1; US11298385B2; JP6843997B2; EP3541943A4; WO2019139229A1; JP2020505910A

Abstract

본 발명은 치료 활성 펩티드를 포함하는 유전자 컨스트럭트에 의해 형질전환되어 경구투여를 통해 장내에 안전하게 전달되어 치료 펩티드를 위장관에서 발현 및 분비할 수 있는 약물 전달용 미생물 및 그를 포함하는 위장관 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것으로, 본 발명은 유산균 유래 항암 단백질을 유산균 발현 및 분비 시스템에 도입하여 이를 과발현 및 분비하는 유산균 약물 전달 시스템을 개발한 것으로, 천연 단백질 대장질환 치료제로서 의학 분야에서 크게 활용될 것으로 기대된다.

Description

P8 단백질을 발현 및 분비하는 위장관 질환 치료 약물 전달용 미생물 및 그를 포함하는 위장관 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물{MICROORGANISMS WHICH EXPRESS AND SECRETE P8 PROTEIN FOR DELIVERING DRUG FOR TREATING GASTROINTESTINAL DISEASES AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING GASTROINTESTINAL DISEASES COMPRISING THE SAME}

본 발명은 P8 단백질을 발현 및 분비하는 위장관 질환 치료 약물 전달용 미생물 및 그를 포함하는 위장관 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 경구 경로에 의해 항암 활성 단백질과 같은 위장관 질환 치료용 폴리펩티드를 위장관에 국소 전달하기 위한 미생물 및 이를 포함하는 위장관 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

유산균은 자연계에 널리 분포하는 미생물로 탄수화물을 혐기적으로 이용하여 젖산을 생산하며, 유산균이 비병원성균이라는 장점으로 인해서 최근에는 산업분야는 물론 의학분야에 이르기까지 널리 그 이용의 범위가 증가하고 있다. 이러한 유산균은 위장의 건강을 유지하는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있을 뿐만 아니라, 유산균을 섭취함으로써 건강을 증진시킬 수 있음이 보고되어 있다.

현대에는 잦은 스트레스와 서구화된 식습관, 음주 등의 영향으로 위장관 질환 환자 수가 큰 폭으로 증가하고 있다. 대장암 치료를 위하여 합성화합물로서의 5-플루오로우라실(5-FU, fluorouracil), UFT(tegafur-uracil), 카페시타빈 (capecitabine)과 같은 플루오로피리미딘(flouropyrimidine)계 약물들과 이리노테칸(irinotecan), 옥살리플라틴(oxaliplatin) 등이 개발되어 사용되고 있고, 표적치료제인 베바시주맙(bevacizumab, 상품명 아바스틴) 및 세툭시맙 (cetuximab, 상품명 얼비툭스) 등이 사용되고 있다. 그러나 고농도 투여 및 장기적 사용에 따른 부작용 위험이 높아 천연물 치료제의 개발이 절실하게 요구되고 있다.

대장암 및 대장염을 포함하는 대장질환 환자들에게 유산균을 투여하여 치료 효과를 기대할 수 있다는 것이 공지되어, 유산균을 대장질환 치료제로 사용하고자 하는 기술들이 개발되고 있다. 예를 들어, 국내 특허 공개 제2011-0073897호는 락토바실러스 플란타룸 피엠오 08(KFCC-11028)을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물을 개시하고 있고, 국내 특허 공개 제2009-0114279호는 기탁번호 KCTC 18120P로 기탁된, 암세포주 증식 억제 활성을 갖는 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM0212 균주의 부탄올 추출물을 유효성분으로 하는 항암용 약학적 조성물을 개시하고 있다. 그러나 유산균을 대장 또는 위장관 질환에 이용하고자 하는 종래 기술들은 유산균 자체를 이용하는 것으로, 유산균에 항암 활성 단백질을 코딩하는 유전자를 재조합시켜 유산균 균주 자체를 약물 전달 시스템으로 사용하고자 하는 시도는 거의 없는 실정이다.

본 발명의 목적은 상술한 종래 기술의 한계를 극복하기 위한 것으로, 본 발명의 하나의 목적은 위장관 질환에 유효한 치료 폴리펩티드들을 위장관의 특정 부위에 전달하기 위한, 치료 펩티드를 코딩하는 유전자에 의해 형질전환되어 약물 전달 시스템으로 작용할 수 있는 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 위장관 질환 치료에 유익한 물질을 그 위장관의 특정 부분에 전달하기 위한, 생물학적으로 활성인 폴리펩티드를 위장관의 정해진 위치에서 치료에 효과적인 고레벨로 발현 및 분비할 수 있는 약물전달체로서의 미생물을 포함하는 위장관 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양상은 외인성 프로모터에 작동가능하게 연결된, 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는, P8 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 분비신호펩티드를 코딩하는 유전자를 포함하는 유전자 컨스트럭트로 형질전환되어, 위장관에서 P8 단백질을 발현 및 분비하는 위장관 질환 치료 약물 전달용 미생물에 관한 것이다.

상기 외인성 프로모터는 페디오코커스 펜토사세우스에서 유래된 서열번호 3(ermE 프로모터), 서열번호 4(PK 프로모터), 서열번호 5(GK 프로모터), 서열번호 6(GPFK 프로모터), 서열번호 7(G6Pi 프로모터), 서열번호 8(L-LDH 프로모터), 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상의 프로모터이다.

상기 균주는 락토바실러스(Lactobacillus), 락토코커스(Latococcus), 류코노스토크(Leuconostoc), 페디오코커스 (Pediococcus), 또는 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속에 속하는 균주일 수 있다.

상기 균주의 구체적인 예들은 락토바실러스 람노수스, 락토바실러스 엑시도필러스, 락토바실러스 파라카제이, 락토바실러스 플란타룸, 페디오코커스 펜토사세우스, 또는 락토바실러스 브레비스 균주를 포함하고, 바람직하게 상기 균주는 페디오코커스 펜토사세우스 균주일 수 있다.

상기 분비신호펩티드는 USP45 분비 신호 펩티드, Usp45 N4 또는 락토바실러스 브레비스 S-층 단백질 신호 펩티드이다.

약물 전달체(Drug delivery system)로서의 미생물 균주에 형질전환되는 상기 유전자 컨스트럭트는 상기 프로모터의 하류에 두 번째 프로모터, 두 번째 분비신호 펩티드 및 두 번째 치료 펩티드를 코딩하는 이종 핵산 서열을 추가로 포함하고, 상기 두 번째 프로모터는 첫 번째 프로모터와 서로 동일 또는 상이할 수 있다.

본 발명의 균주는 대장암, 대장용종, 대장염, 허혈성 위장관 질환, 이질, 장내 혈관 이형성, 게실증, 과민성대장증후군, 및 크론병과 같은 위장관 질환의 예방 또는 치료에 이용될 수 있다.

상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 양상은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 P8 단백질을 생산하는 균주를 포함하는 위장관 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 양상은 페디오코커스 펜토사세우스 균주를 포함하는 위장관 질환 치료용 조성물로서, 상기 페디오코커스 펜토사세우스 균주는 적어도 하나의 위장관 질환에 대한 치료 효과를 갖는 치료 펩티드를 코딩하는 이종 핵산을 포함하고, 상기 이종핵산은 이종 핵산에 작동 가능하게 연결된 페디오코커스 펜토사세우스에서 유래하는 서열번호 3 내지 서열번호 8 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상의 프로모터와 분비신호펩티드를 코딩하는 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 위장관 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 유산균의 해당경로에서 분리된 프로모터를 포함하는 약물 전달용 미생물 균주는 장내에 체류하는 동안에 치료 펩티드를 지속적으로 고레벨로 발현 및 분비하여 약물 전달체로서 효과적으로 기능할 수 있다.

또한 본 발명의 미생물은 암세포 증식을 억제하고 전이를 억제하는 것으로 확인된 인간 유래의 천연 단백질을 코딩하는 유전자 컨스트럭트를 유산균에 형질전환시켜, 부작용 없이 치료 효과를 극대화할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물에 의하면 대장암 세포에 있어서 우수한 암세포 증식 억제 효과를 보일 뿐 아니라 정상세포에 대한 독성이 없는 안전한 물질로, 부작용 없이 대장암 예방 및 치료에 매우 유용하게 활용할 수 있다.

본 발명에서 경구 투여 경로를 통해서 재조합 미생물에 의한 in situ 합성에 의한 치료 펩티드의 국부적 전달에 의해서, 치료에 필요한 투여량 및 타이밍을 정확하게 조절할 수 있어, 전신 투여의 필요성을 제거한다.

본 발명은 불안정하거나 대량으로 생산하는 것이 어려운 물질의 국소적 전달에 유용하게 이용될 수 있고, 본 발명에 의하면 부작용의 문제 없이 전신 전달에 의해서 수득되는 것보다 높은 농도의 치료 펩티드를 지속적으로 국소적으로 전달할 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예에서 페디오코커스 펜토사세우스 균주를 형질전환시키는데 사용된 단독 및 이중 프로모터를 포함하는 발현벡터의 구성도이다.
도 2는 본 발명의 실시예에서 페디오코커스 펜토사세우스 균주를 형질전환시키는데 사용된 발현벡터의 개열지도이다.
도 3은 본 발명의 P8 단백질을 코딩하는 유전자를 클로닝한 재조합 균주에 의한 P8 단백질의 발현량을 웨스턴 블로팅에 의해 정성 분석한 결과를 나타낸 사진이다.
도 4는 본 발명의 P8 단백질를 코딩하는 유전자를 클로닝한 재조합 균주에서의 P8 단백질의 발현/분비량의 변화를 ELISA법을 이용하여 정량적으로 분석한 결과를 나타낸 사진이다.
도 5는 PK-PK 이중 프로모터의 조합에 의한 P8 단백질의 발현/분비량의 변화를 웨스턴 블로팅법을 이용하여 정성적으로 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 PK-PK 이중프로모터 조합에 의한 P8 단백질의 발현/분비량의 변화를 ELISA법을 이용하여 정량적으로 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 다양한 프로모터 조합에 의한 P8 단백질의 발현/분비량의 변화를 ELISA법을 이용하여 정량적으로 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 재조합 균주의 경구 투여 후 항암 활성을 비교하여 나타낸 사진이다.
도 9는 본 발명의 약제학적 조성물을 투여한 누드 마우스의 소장에서 분리한 본 발명의 P8 단백질을 발현 및 분비하는 페디오코커스 펜토사세우스 균주로부터 검출한 P8 단백질 검출 결과를 나타낸 사진이다.

이하에서 도면을 참조하여 본 발명에 대해서 더욱 상세하게 설명한다.

다르게 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 용어 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 숙련가에 의해 통상 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.

"핵산"이란 용어는 단일-가닥 또는 이중-가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 중합체를 지칭하고, 별도의 제한이 없는 한 천연적으로 발생하는 뉴클레오타이드와 유사한 방식으로 핵산에 혼성화되는 천연 뉴클레오타이드의 공지된 유사체를 포함한다. 별도의 언급이 없는 한, 특정 핵산 서열은 그의 상보적 서열을 포함한다.

본 명세서에서 용어 "프로모터"는 코딩 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 조절할 수 있는 DNA 서열을 의미한다. 프로모터는 인접 및 원거리의 상류 엘리먼트 (element)들로 구성되어 있다. 인접 엘리먼트로서는 통상적으로 RNA 중합효소 II가 적합한 전사 개시 위치에서 RNA의 합성을 개시할 수 있게 하는 TATA 박스를 포함한다.

"생물학적으로 활성인 물질(biologically active molecule)"이란 용어는 유전자 치료에 관여하거나 또는 면역반응을 조절할 수 있는 물질로서, 세포내 신호 전달 기작(signal transduction mechanism) 또는 다른 특정 유전자의 발현을 조절할 수 있는 물질을 포함한다. 이와 같은 물질로는 성장 인자, 암 치료용 물질, 종양 억제 물질, 사이토카인, 인터페론 등을 포함할 수 있다.

본원에서 "이종 서열" 또는 "이종 핵산"이란 외래 공급원(또는 종)으로부터 기원되거나, 또는 동일한 공급원으로부터 기원될 경우 그의 고유 형태로부터 개질된 것을 의미한다. 따라서 프로모터에 작동가능하게 연결된 이종 핵산은 프로모터가 유도되는 공급원과는 상이한 공급원으로부터 유도되거나, 또는 동일한 공급원일 경우 그의 고유의 형태로부터 개질된다.

"작동가능하게 연결된"이란 용어는 핵산 발현 조절 서열(예컨대, 프로모터, 신호 서열 또는 일련의 전사 인자 결합 부위)과 이종 핵산 서열 사이의 기능적 연결을 지칭하고, 이때 발현 조절 서열은 이종 핵산 서열에 상응하는 핵산의 전사 및/또는 번역에 영향을 준다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “단백질”과 “폴리펩티드”는 서로 호환적인 의미로 사용된다. “폴리펩티드”는 아미노산의 폴리머를 의미하고, 특정 길이의 분자를 의미하지는 않는다. 이러한 용어는 폴리펩티드의 해독 후 변형, 예를 들면 글리코실화, 인산화 및 아세틸화된 것도 포함하는 의미이다.

명세서에서 용어 “예방”은 질환의 치료 또는 치유보다는 예방을 목적으로 하는 의학적 또는 공중위생 절차를 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 “치료”라는 용어는 질환의 치료 또는 치유를 목적으로 하는 의학적 또는 공중위생 절차를 의미한다.

본 명세서에서 “치료 유효량”이라는 용어는, 피험체, 예를 들면 사람 또는 동물에 있어서 질환 또는 장애를 치료하기 위한, 즉 원하는 국소 또는 전신의 효과 및 성능을 얻기 위해 유효한 치료용 물질 또는 조성물의 양을 가리킨다.

본 명세서에서, “제약학적으로 허용가능한”이라는 용어는 약제학적 조성물의 다른 성분과 적합성이며 그 수용체에게 유해하지 않은 것을 의미한다.

본 발명의 하나의 양상은 외인성 프로모터에 작동가능하게 연결된, 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는, P8 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 분비신호펩티드를 코딩하는 유전자를 포함하는 유전자 컨스트럭트로 형질전환되어, 위장관에서 P8 단백질을 발현 및 분비하는 위장관 질환 치료 약물 전달용 미생물에 관한 것이다.

본 발명의 일 구체예에서 “P8 단백질”이란, 유산균인 락토바실러스 람노수 스로부터 추출된 분자량 8 kDa 크기의 단백질 단편으로서, 락토바실러스 람노수스 균체 파쇄액으로부터 유래된 항암 단백질이다. 본 발명에 따른 위장관에서 P8 단백질을 발현 및 분비하는 위장관 질환 치료 약물 전달용 미생물은 P8 단백질의 항암 효과에 더하여 유산균 자체의 항암 작용에 의해 상승효과를 제공할 수 있다. 유산균 균주는 장내 미생물총의 개선에 의한 발암물질의 생성억제와 장내면역 기능의 활성화에 의한 암세포 증식억제 효과를 제공할 수 있다.

서열번호	정의	서열
서열번호1	P8 단백질 염기서열	gcaacagtagatcctgaaaagacattgtttctcgatgaaccaatgaacaaggtatttgactggagcaacagcgaagcacctgtacgtgatgcgctgtgggattattacatggaaaagaacagccgtgataccatcaagactgaagaagaaatgaaaccagtcctagacatgtccgacgatgaggtcaaagccctagcagaaaaggttctcaagaagtaa
서열번호2	P8 단백질 아미노산 서열	ATVDPEKTLFLDEPMNKVFDWSNSEAPVRDALWDYYMEKNSRDTIKTEEEMKPVLDMSDDEVKALAEKVLKK

본 발명에서는 표적 단백질의 유산균에서의 발현을 위한 강력한 프로모터 5종을 선별하였다. 상기 외인성 프로모터는 페디오코커스 펜토사세우스에서 유래된 서열번호 3 (ermE, erythromycin resistance gene), 서열번호 4 (PK 프로모터, pyruvate kinase), 서열번호 5 (GK 프로모터, glucokinase), 서열번호 6 (GPFK 프로모터, 6-phosphofructokinase), 서열번호 7 (G6Pi 프로모터, glucose 6-phosphate isomerase), 서열번호 8 (L-LDH 프로모터, L-lactate dehydrogenase) 및 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다.

프라이머	서열(5' -> 3')
ermE	GGATCCTTTTTAGTATTTTTAATTAATTGTAATCAGCACAGTTCATTATCAACCAAACAAAAAATAAGTGGTTATAATGAATCGTTAATAAGCAAAATTCATATAACCAAATTAAAGAGGGTTATAATGAAAAAAAAGATTATCTCAGCTATTTTAATGTCTACAGTGATACTTTCTGCTGCAG
PK	GGATCCCTAAAGATCGCGTTTTAGCAAGTAAGATGGGTGCTTACGCTGTTGAGCTACTCCTTGAAGGTAAGGGTGGTTTAGCAGTTGGAATCTTAGAAAATAAGGTTCAAGCTCATAACATGCTTGACTTGTTTGATGCAAAACATCAAGCAGATGATTCACTTTACCAATTAAGTGAAGATTTATCATTCTAGAGTTCTATTAATATTTGGATAAAATGACTTAAGAAGTCTTTTATAATTTAAAATCAAGGGAGAGATTCTGTAATGAAAAAAAAGATTATCTCAGCTATTTTAATGTCTACAGTGATACTTTCTGCTGCAG
GK	GGATCCATAATCTGGTAAATTAGTTGAGATGGTATTATGAAAACACTTTATGATGTGCAACAACTTTTAAAGCAATTCGGAATATTTGTTTACGTTGGAAAACGTAAATGGGATATTGAATTGATGAGTATTGAATTGAAAAATTTGTACAAAGCAGGAGTCGTCGATAAACCGACTTATGTTAAAGCTCAGTTGGTTTTACGACATGAGCATCATATTGAAGAGGTTAGAGATAACCAACAAAAATAATGGAGGGTTTCGAAGTAATGAAAAAAAAGATTATCTCAGCTATTTTAATGTCTACAGTGATACTTTCTGCTGCAG
GPFK	GGATCCCCAGTTATTTTAGTTTATGAGGATACTAATGAACATAATGAGTTGTCTGAAAAATTTTATTTAAATGACAGTTCTGAAGTAAAAGAACAATTAGCAGAATTGCTAGGAAGTCAACATATTTCGTTAATTAAAAAATAAATTTTGAATAAAGCACTTACATTCGATTAATTAAGAAAATGGTACAGACAACTGTTTTCAAAAGTGATAAAATCAACAATGAAGTTTTGAAAAAACTCAATATTTCTGTTTGAGGTGAAAAGATGAAAAAAAAGATTATCTCAGCTATTTTAATGTCTACAGTGATACTTTCTGCTGCAG
G6Pi	GGATCCATGCCGGCTAAAGTGGTGGATAAATTGAATCATCCCCAAGAACTGGAATAAGATAAAATTGTAGTGCTTTCAGGCTTTACCAGCCATCTTTTGAAAAAATTAATTTCTTTCAAAAGTGCGTGTGACAGGTGATCAACTAGATTAAATGGGGAGGGTATCCCAGTAAATATTAGGTTAAATCGGATAGGCTTAACCAAATTAAGTAATTTTATTGTATAATGGTACAGATAAAGAATTTTAAACAAAAGGGGTAGTTATTAATGAAAAAAAAGATTATCTCAGCTATTTTAATGTCTACAGTGATACTTTCTGCTGCAG
L-LDH	GGATCCTCATTTTCATGTTATTTTTCCACCCTCAACACGCAAAAACGGCTGAAAGAGCAAAAACCCCTCAGCTGTCCACGTTTATTTTCATGTAATATTACCATATTATTGACCCCAAGCGGGTCTTTTAACCTCTAACTTATCAATCACTTTACTAACTATACCCGAACTTCATAAAATTTTTACTCAACTTTCTTTTATGAAAATGCTATACTTAGTATTGTTTGATAAATTCAAATATTATATGAAAAAAGGGGATTGATCTTATGAAAAAAAAGATTATCTCAGCTATTTTAATGTCTACAGTGATACTTTCTGCTGCAG

상기 프로모터들은 미생물 세포에 도입될 경우 생물학적으로 활성인 외래 단백질을 코딩하는 이종 핵산의 발현을 촉진한다. 서열번호 3 내지 서열번호 8의 프로모터 가운데 5종 (ermE 프로모터, PK 프로모터, GK 프로모터, GPFK 프로모터, G6Pi 프로모터)은 페디오코커스 펜토사세우스의 해당작용 대사경로로부터 선별되었고, 1종 (L-LDH 프로모터)은 이차 대사산물인 락테이트 생산경로로부터 선별된 것으로, 유산균 (예를 들어, 페디오코커스 펜토사세우스) 내에서 이종 핵산을 고농도로 발현하게 하는 강력한 프로모터들이다. 이러한 프로모터에 의해서 본 발명의 미생물은 약물 전달체로서 기능하여 위장관의 특정 부위에서 충분한 양의 P8 단백질을 생산하고 분비할 수 있다.

상기 유전자 컨스트럭트는 이종 핵산의 발현량을 증가시킬 뿐만 아니라 분비도 향상시킬 수 있다. 본 명세서에서, 단백질이 "분비된다"는 표현은 단백질이 미생물 세포로부터 세포외로 전달되는 것을 의미하는 것으로, 단백질의 전체 분자가 완전히 유리된 형태로 배지에 실제로 존재하는 경우를 포함하며, 또한 단백질의 모든 분자가 세포 표면층에 존재하는 경우, 및 단백질 분자의 일부가 배지에 존재하고, 분자의 나머지 부분은 세포 표면층에 존재하는 경우를 포함한다.

상기 유전자 컨스트럭트는 미생물 세포 내에서 복제 가능한 복제 기점을 포함할 수도 있다. 이는 벡터의 조작이 유산균 균주 내에서 좀 더 효율적이기 때문인데, 바람직한 복제 기점으로는 예들은 ColE1, Ori, oriT 등이 있다.

상기 유전자 컨스트럭트는 치료 폴리펩티드가 미생물 약물 전달 시스템(예를 들어, 페디오코커스 펜토사세우스)으로부터 분비 또는 방출되도록 하기에 적합한 분비 신호 펩티드 서열을 포함할 수 있다. 치료 펩티드의 분비를 가능하게 하기 위해, 페디오코커스 펜토사세우스에서의 사용에 적합한 분비 신호 펩티드를 코딩하는 단편을 이종 핵산 서열의 5‘ 말단 또는 3' 말단에 첨가할 수 있다.

상기 분비 신호 펩티드는 USP45 분비 신호, 야생형 Usp45 분비 신호의 위치 4에 있는 리신이 아스파라긴으로 치환된 Usp45 N4 또는, 락토바실러스 브레비스 S-층 단백질 신호 펩티드 등 강한 단백질 분비를 지시하는 분비 신호 펩티드를 포함할 수 있다. 이러한 분비 신호 펩티드는 목적으로 하는 외래 단백질의 분비를 제공할 수 있다. 이러한 분비 신호 펩티드 서열은 목적으로 하는 치료 폴리펩티드의 생산 및 분비를 추가로 제어할 수 있게 한다.

본 발명의 다른 실시예의 유전자 컨스트럭트는 상기 프로모터의 하류에 상술한 서열번호 3 내지 서열번호 8 중의 어느 하나의 프로모터 이외에 두 번째 프로모터, 두 번째 분비신호 펩티드 및 치료 폴리펩티드를 코딩하는 두 번째 핵산 서열을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 실시예의 유전자 컨스트럭트는 발현시키고자 하는 이종 핵산의 상류에 반드시 제1 프로모터를 지니고, 또한 발현시키고자 하는 이종 핵산의 하류에 제2 프로모터를 포함할 수 있다. 이들 제1 프로모터와 제2 프로모터는 동일하거나 서로 상이할 수 있다. 대부분의 세포나 조직에서 외래 유전자를 발현을 촉진시킬 수 있는 비특이적 프로모터도 조직 혹은 기관 특이적 프로모터, 종양 특이적 프로모터, 발생 혹은 분화 특이적 프로모터 등의 특이적 혹은 선택적 프로모터도 이용할 수 있다. 예컨대, 제1프로모터로서 특이적 프로모터를 이용하고, 제2 프로모터로서 비특이적인 프로모터를 이용할 수 있다. 이와 같이 이중 프로모터를 포함하는 유전자 컨스트럭트에 의해 형질전환된 미생물은 매우 높은 수율로 원하는 이종 폴리펩티드 또는 단백질을 발현할 수 있다.

상기 미생물 균주는 락토바실러스(Lactobacillus), 락토코커스(Latococcus), 류코노스토크(Leuconostoc), 또는 페디오코커스(페디오코커스), 비피도박테리움 (Bifidobacterium) 속에 속하는 균주일 수 있다. 상기 균주의 구체적인 예들은 락토바실러스 람노수스, 락토바실러스 엑시도필러스, 락토바실러스 파라카제이, 락토 바실러스 플란타룸, 페디오코커스 펜토사세우스, 또는 락토바실러스 브레비스 속에 속하는 균주를 포함할 수 있다.

바람직하게 상기 균주는 페디오코커스 펜토사세우스 균주(예컨대, KCCM12181P)일 수 있다. 페디오코커스 펜토사세우스는 내산성 및 내답증성이 우수하여 위장관을 통과하는 과정에서 생존하여 살아 있는 형태로 장점막에 도달하고 잘 정착하여, 약물 전달체로서의 기능을 지속적으로 수행할 수 있다.

상기 약물 전달체로 사용되는 균주는 수탁번호 KCCM12181P로 기탁된 페디오 코커스속 PP P8인 것이 바람직하나, 본 발명의 P8 단백질을 발현 및 분비하는 위장관 질환 치료 약물 전달용 균주라면 모두 본 발명의 범위에 포함된다.

본 발명의 미생물은 유전자 컨스트럭트를 삽입한 발현 벡터로 미생물 균주를 트랜스펙션함으로써, 위장관의 소정 위치에서 미생물 균주에 의해 목적으로 하는 치료 펩티드를 코딩하는 이종 핵산을 발현시키고 치료 펩티드를 생산할 수 있다.

본 발명의 다른 양상은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 P8 단백질을 생산 및 분비하는 상술한 미생물 균주를 포함하는 위장관 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 양상은 페디오코커스 펜토사세우스 균주를 포함하는 위장관 질환 치료용 조성물로서, 상기 페디오코커스 펜토사세우스 균주는 적어도 하나의 위장관 질환에 대한 치료 효과를 갖는 치료 펩티드를 코딩하는 이종 핵산을 포함하고, 상기 이종핵산은 이종 핵산에 작동 가능하게 연결된 페디오코커스 펜토사세우스에서 유래하는 서열번호 3 내지 서열번호 8 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상의 프로모터와 분비 신호 펩티드를 코딩하는 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 위장관 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

상기 이종 핵산은 바람직하게는 치료용 또는 질병과 관련된 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 또한, 이종 핵산은 백신 용도의 항원성 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 본 발명에서 상기 이종 핵산은 호르몬, 사이토카인, 효소, 응고인자, 수송 단백질, 수용체, 조절 단백질, 구조 단백질, 전사 인자, 항원, 항체 등을 암호화하는 유전자일 수 있다. 그 구체적인 예로는, 트롬보포이에틴, 성장 호르몬, 성장 호르몬 방출 호르몬, 성장 호르몬 방출펩티드, 인터페론, 인터페론 수용체, 콜로니 자극인자, 글루카곤-유사 펩티드, G-단백질 관련 수용체, 인터루킨, 인터루킨 수용체, 효소, 인터루킨 결합 단백질, 사이토카인 결합단백질, 마크로파지 활성인자, 마크로파지 펩티드, B 세포인자, T 세포인자, 단백질A, 알러지 억제인자, 세포괴사 당 단백질, 면역독소, 림포독소, 종양 괴사인자, 종양 억제인자, 전이 성장인자, α-1 안티트립신, 알부민, α-락트알부민, 아포리포단백질-E, 적혈구 생성인자, 고 당쇄화 적혈구 생성인자, 안지오포에이틴, 헤모글로빈, 트롬빈, 트롬빈 수용체 활성 펩티드, 트롬보모듈린, 혈액인자Ⅶ, Ⅶa, Ⅷ, Ⅸ 및 XⅢ, 플라즈미노젠활성인자, 피브린-결합 펩티드, 유로키나제, 스트렙토키나제, 히루딘, 단백질C, C-반응성 단백질, 레닌억제제, 콜라게나제 억제제, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 렙틴, 혈소판 유래 성장인자, 상피세포 성장인자, 표피 세포성장인자, 안지오스타틴, 안지오텐신, 골 형성 성장인자, 골 형성 촉진 단백질, 칼시토닌, 인슐린, 아트리 오펩틴, 연골 유도인자, 엘카토닌, 결합조직 활성인자, 조직인자 경로 억제제, 여포 자극 호르몬, 황체 형성호르몬, 황체 형성 호르몬 방출 호르몬, 신경 성장인자, 부갑상선 호르몬, 릴랙신, 씨크레틴, 소마토메딘, 인슐린유사 성장인자, 부신피질 호르몬, 글루카곤, 콜레시스토키닌, 췌장 폴리펩티드, 가스트린 방출 펩티드, 코티코트로핀 방출인자, 갑상선 자극호르몬, 오토탁신, 락토페린, 미오스타틴, 수용체, 수용체 길항물질, 세포표면항원, 바이러스 유래 항원, 단일클론 항체, 다중클론 항체 및 항체 단편 등을 암호화하는 유전자일 수 있으며, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 약제학적 조성물로서 치료하기 적합한 위장관 질환에는 구강, 식도, 위, 소장, 대장, 직장, 및 췌장, 간 및 담낭과 같은 장기에 영향을 미치는 질환 또는 장애가 포함된다. 예를 들어 구내 건조, 구강궤양, 치은 질환, 식도 역류성 질환, 위궤양, 염증성 장질환, 염증성 대장염, 크론병, 미코스티스(mycositis), 위암, 대장암을 포함한다. 특히 본 발명의 균주는 대장암, 대장용종, 대장염, 허혈성 위장관 질환, 이질, 장내 혈관 이형성, 게실증, 과민성대장증후군, 또는 크론병의 치료에 유리하게 이용될 수 있다.

페디오코커스 펜토사세우스 균주는 내산성 및 내답증성이 유수하여 위장관을 통과하는 과정에서 살아 있는 상태로 장점막에 도달하고 잘 정착하여, 약물 전달체로서의 기능을 지속적으로 수행할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양상은 본 발명의 균주, 즉, 외인성 프로모터에 작동가능하게 연결된 P8 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 분비신호펩티드를 코딩하는 유전자를 포함하는 유전자 컨스트럭트로 형질전환되어, 위장관에서 P8 단백질을 발현 및 분비하는 위장관 질환 치료 약물 전달용 미생물을 포함하는 위장관 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

상기 분비신호펩티드는 USP45 분비 신호 펩티드, Usp45 N4 또는 락토바실러스 브레비스 S-층 단백질 신호 펩티드와 같은 분비 신호 펩티드일 수 있다.

상기 균주는 상기 프로모터의 하류에 두 번째 프로모터, 두 번째 분비신호 펩티드 및 두 번째 치료 펩티드를 코딩하는 이종 핵산 서열을 추가로 포함하고, 상기 두 번째 프로모터는 첫 번째 프로모터와 서로 동일 또는 상이할 수 있다. 첫 번째 치료 펩티드를 코딩하는 이종 핵산 서열과 두 번째 치료 펩티드를 코딩하는 이종 핵산 서열은 동일하거나 상이할 수 있다. 또 다른 예에서 첫 번째 치료 펩티드를 코딩하는 이종 핵산의 염기 서열과 두 번째 치료 펩티드를 코딩하는 이종 핵산의 염기 서열은 동일한 아미노산 서열을 갖는 동일한 치료 펩티드를 코딩하면서도 염기 서열은 서로 상이할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 약학적으로 허용 가능한 염을 추가로 포함할 수 있다. 한편, 상기 약제학적 조성물은 5-플루오로우라실(5-FU, fluorouracil), UFT(tegafur-uracil), 카페시타빈 (capecitabine), 이리노테칸(irinotecan), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 베바시주맙 (bevacizumab, 상품명 아바스틴) 및 세툭시맙(cetuximab, 상품명 얼비툭스)과 같은 화학 요법 치료제를 추가로 포함할 수도 있다.

본 발명의 조성물의 투여 경로는 치료 시 가장 효과적인 것을 사용하는 것이 바람직하고, 경구 투여, 또는 구강 내, 기도내, 직장내, 피하, 근육내 및 정맥 내 등의 비경구 투여를 통해서도 투여될 수 있다.

경구 투여를 위해 위내성 경구제형을 제제화 해도 좋고, 이 제형은 숙주 세포의 제어 방출을 제공하는 화합물을 포함하여 거기에 코딩되는 목적 치료 펩티드의 제어 방출을 제공할 수 있다. 예를 들면 경구제형(정제, 펠릿, 과립, 분말 포함)을 위중에서의 용해 또는 파괴에 내성이지만 장중에서는 내성이 아니고 이것에 의해 장중에서의 붕괴, 용해 및 흡수에 유리한 위를 통한 이행을 가능하게 하는 부형제(일반적으로 폴리머, 셀룰로오스 유도체 및/또는 친유성 물질)의 얇은층으로 코팅해도 좋다.

경구제형을 예를 들면 제어 방출, 지속 방출, 연장 방출, 지속 작용 정제 또는 캡슐로서 숙주 세포 및 그 재조합 단백질의 서방을 가능하게 하도록 설계해도 좋다. 이들의 제형에는 일반적으로 친유성, 폴리머성, 셀룰로오스성, 불용성, 팽윤성 부형제 등의 종래의 주지의 부형제가 함유된다. 제어 방출 제제는 장, 결장, 생체 접착 또는 설하 전달(즉 치아 점막 전달) 및 기관지 전달을 포함한 다른 임의의 전달 부위를 위해도 사용할 수 있다.

경구 투여에 적당한 제제로서는 유제, 시럽제, 캡슐제, 정제, 산제, 과립제 등을 들 수 있다. 유제 및 시럽제와 같은 액체 조제물은 물 , 자당, 소르비톨, 과당 등의 당류, 폴리에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 등의 글리콜류, 참기름, 올리브유, 콩기름 등의 유류, p-하이드록시안식향산 에스테르류 등의 방부제, 딸기 플레이버, 페퍼민트 등의 플레이버류 등을 첨가제로서 이용하여 제조할 수 있다. 캡슐제, 정제, 산제, 과립제 등은 유당, 포도당, 자당, 만니톨 등 부형제, 전분, 알긴산나트륨 등 붕괴제, 스테아린산 마그네슘, 탈크 등의 활택제, 폴리비닐 알코올, 하이드록시 프로필 셀룰로오스, 젤라틴 등의 결합제, 지방산 에스테르 등의 계면활성제, 글리세린 등의 가소제 등을 첨가제로서 이용하여 제조할 수 있다.

비경구 투여에 적당한 제제로서는 주사제, 자리제, 분무제 등을 들 수 있다. 주사제는 염용액, 포도당 용액, 혹은 양자의 혼합물로 구성되는 담체 등을 이용하여 조제 된다. 또는 균주를 상법에 따라 동결건조하고 이것에 염화나트륨을 더함으로써 분말 주사제를 조제할 수도 있다. 자리제는 카카오지, 수소화 지방 또는 카르복실산 등의 담체를 이용하여 조제된다. 또한 분무제는 상기 화합물 그 것, 내지는 수용자의 구강 및 기도 점막을 자극하지 않고, 또한 상기 화합물을 미세한 입자로서 분산시켜 흡수를 용이하게 하는 담체 등을 이용하여 조제된다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물의 유효성분인 치료 펩티드를 생산하는 균주의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중, 질환에 따라 달라질 수 있으나, 0.001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.01 내지 10 mg/kg을 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다.　

또한, 본 발명에 따른 균주의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다.　따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

이하에서 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1. 유산균 유래 단백질 과발현 및 분비를 위한 시스템 구축

실시예 1-1. 과발현 유도를 위한 프로모터의 선별

표적 단백질(P8 단백질)의 유산균에서의 발현을 위한 강력한 프로모터 6종(ermE, erythromycin resistance gen의 프로모터; PK, 피루베이트 키나아제; GK, 글루코키나아제; GPFK 6-포스포프럭토키나아제, G6Pi, 글루코스 6-포스페이트 아이소머라제; L-LDH, L-락테이트 디하이드로게나아제)을 페디오코커스 펜토사세우스의 해당작용 대사경로로부터 선별하였다. 표적 단백질의 발현 호스트는 페디오코커스 펜토사세우스 SL4 (수탁번호: KCTC 10297BP)로, 당의 소비 속도가 매우 빠른 것을 실험을 통해 확인하였고, 또한 소비된 당의 거의 100%가 이차대사산물인 L-락테이트로 전환되는 것을 HPLC 분석을 통해 확인하였다. 따라서 프로모터 중 5종은 해당작용 대사경로로부터, 그리고 1종은 이차 대사산물인 락테이트 생산경로로부터 선별하였다.

실시예 1-2. 표적 단백질의 과발현 및 분비 시스템 구축

플라스미드 pCBT24-2 (서열번호 9)(KCCM12182P)를 P8 단백질의 클로닝에 사용하였다.

실시예 1-1에서 선별된 6종의 프로모터를 usp45 신호펩티드와 연결하여 DNA 절편을 합성하였다. 프로모터와 신호펩티드에 BamHI/PstI 제한효소부분을 삽입하였다. 합성 완료된 프로모터와 신호펩티드 일부를 BamHI/PstI 제한효소로 절제 후 DNA 겔 추출법으로 DNA 절편을 분리/정제하였으며, 동일한 제한효소로 절제된pCBT24-2-P8/BamHI/PstI 벡터에 삽입하였다. 완성된 pCBT24-2-PK-P8, pCBT24-2-GK-P8, pCBT24-2-6PFK-P8, pCBT24-2-FK-P8, pCBT24-2-G6Pi-P8, pCBT24-2-L-LDH-P8, pCBT24-2-D-LDH-P8를 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) SL4 균주에 형질전환하였다.

전 단계에서 높은 활성을 보인 프로모터끼리의 조합을 통하여 pCBT24-2-GK-P8-L-LDH-oriP8, pCBT24-2-PK-P8-PK-oriP8, pCBT24-2-GK-P8-GK-oriP8을 제작하였다. 제작된 DNA를 페디오코커스 펜토사세우스 SL4 균주에 형질전환시켰다.

본 발명의 상기 균주들 가운데 pCBT24-2-PK-P8-PK-oriP8에 의해 형질전환된 균주를 PP P8로 명명하였고, 대한민국 서울특별시 서대문구 홍제네-2가-길 45 유림빌딩 소재의 한국미생물보존센터(KCCM)에 2017년 11월 30일 기탁번호 KCCM12181P로 기탁하였다.

상기 형질전환체를 LB 액체 배지에 혼합한 후, 37℃에서 1시간 배양시켰다. 상기 1시간 동안 배양한 배양액을 에리쓰로마이신 (최종농도 10 μg/㎖)을 함유한 LB 한천 배지에 평판 도말하여 상기 항생제에 대하여 내성을 보이는 균주를, 본 발명에서 약물전달시스템으로 사용할 균주(PP DDS)로 선별하였다.

실시예 1-3. 페디오코커스 펜토사세우스 SL4 형질전환체의 배양

MRS 고체 배지(agar plate)에서 배양된 형질전환체를 10 ㎖ MRS 액체배지(에리쓰로마이신, 10 mg/㎖)에 접종하여 37℃에서 15시간 정치 배양(overnight incubation)하였다. 이 배양액 1 ㎖을 10 ㎖ M9 최소 배지(에리쓰로마이신, 10 mg/L)에 접종 후 37℃에서 48시간 정치 배양하였으며, 배양액 5 ㎖을 원심 분리하여 상등액을 얻었다. 상등액 5 ㎖은 TCA 침전법을 이용하여 총 단백질을 농축하였다. 이를 웨스턴 블로팅 방법으로 P8 단백질의 발현 및 분비량을 비교 분석하였다. 균체의 경우 완충용액으로 희석하여 초음파분쇄기를 이용한 균체 파쇄 후, 세포추출물을 웨스턴 블로팅 방법으로 발현 후 분비되지 못한 P8 단백질의 양을 분석하였다.

실시예 1-4. P8 단백질의 분리 및 검출

유산균 형질전환체를 배양 후, 배양상등액 5 ㎖에 100% TCA (Trichloro Acetic Acid)를 첨가하여 최종 농도가 20% 되도록 한다. 혼합 후 얼음에서 30분간 반응하였으며, 4℃, 15,000 rpm에서 30분간 원심분리하여 모든 단백질의 침전을 유도하였다. 원심분리 후 상등액을 제거하였으며, 아세톤 200 ㎕를 첨가하고 다시 4℃, 15,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 침전된 단백질을 세척하였다. 상온에서 건조를 통해 남아있는 아세톤을 완전히 제거 후 배양 상등액에 존재하는 목적 단백질 분비량을 측정하였다. 이때 분비량의 측정은 웨스턴 블로팅을 사용하여 측정하였고, 측정 결과를 도 4 내지 도 7에 나타내었다.

도 4 내지 도 7을 참조하면, 본 발명의 프로모터들 사용시 P8 단백질의

발현 및 분비량이 현저히 증가하는 것을 확인하였다. 특히 도 7을 참조하면, 이중 프로모터(PK-PK, GK-PK, GK-GK)를 사용하는 경우에는 P8 단백질의

발현 및 분비량이 가장 높게 나타났다.

실시예 2. 생체 내(in vivo ) 유산균 발현/분비 시스템을 이용한 P8 단백질의 항암효과 확인

실시예 2-1. 종양 세포 이식과 종양 증식

한국세포주은행(Seoul, Korea)으로부터 분양 받은 대장암 세포주 DLD-1은 10% 우태아혈정 (FBS; Invitrogen, NY, USA), 페니실린 (0.02 UI/㎖; Sigma, MO, USA), 스트렙토마이신 (0.02 ㎍/㎖; Sigma, MO, USA), 글루타민 (2 mM: Sigma, MO, USA), 비필수 아미노산 (1%; Sigma, MO, USA)이 첨가된 RPMI 1640 배지(Sigma, MO, USA)를 사용하여, 37℃, 5% CO₂인큐베이터에서 계대 배양하여 유지하였다. 배양된 DLD-1 세포를 부유하여 획득한 종양세포 부유액을 수컷 누드 마우스 (BALB/cAnN.Cg-Foxn1nu/CrlNarl; 5 주령)의 등쪽 피하에 0.2 ㎖ 2×10⁶ cell/mouse) 씩 이식하여, 고형 종양을 형성하였다. 계대군에서 형성된 종양조직을 동물을 희생하여 종양괴(tumor lump)를 적출하고 표면에 분포한 혈관과 지방층을 제거한 뒤, 신선한 종양조직만을 선별하여 투관침을 이용 무처치 동물의 피하에 이식하였다.

실시예 2-2. 실험군 분리 및 물질 투여

종양괴 이식 후 개별 종양 체적이 100-150 ㎣에 이르면 체중과 종양 크기를 측정하고 무작위법으로 그루핑하였다. 실험동물은 그룹당 10마리씩 하기 표 3과 같이 음성 대조군(종양 이식 대조군: G1), 양성대조군(항암제 투여군, 40 mg/Kg 5-Fu ; 5-플루오로우라실, Sigma, MO, USA : G2), 시험군{종양 세포 이식 후 1x10¹⁰ CFU/Head, 페디오코커스 펜토사세우스 약물전달시스템(PP-DDS) (Empty vector) 투여군: G3, 1x10⁹ CFU/Head PP-DDS (PK-P8-ChoS-oriP8): 2-프로모터 시스템: G4, 1x10¹⁰ CFU/Head PP-DDS (PK-P8-ChoS-oriP8): 2-프로모터 시스템: G5, 1x10⁹ CFU/Head PP-DDS (PK-P8-PK-oriP8 : 2-프로모터 시스템): G6, 1x10¹⁰ CFU/Head PP-DDS (PK-P8-PK-oriP8 : 2-프로모터 시스템: G7}으로 총7개 그룹으로 구분하여 일1회 7 주간 경구투여하여 시험하였다. 형질전환체는 MRS 배지에서 배양하여 이를 10¹⁰/200 ㎕가 되도록 현탁해서 경구로 투여하였다. 하루에 한번 씩 총 6주간 투여하였다.

Groups	처 리		개체 수
G1(NC1)	PBS 처리	100 ml/Head	10
G2(PC1)	5-플루오로우라실(5-Fu)	400 mg/Head	10
G3 (T1)	Empty vector	1x10¹⁰ CFU/Head	10
G4 (T2)	PP-DDS (PK-P8-ChoS-oriP8)	1x10⁹ CFU/Head	10
G5 (T3)	PP-DDS (PK-P8-ChoS-oriP8)	1x10¹⁰ CFU/Head	10
G6 (T4)	PP-DDS (PK-P8-PK-oriP8)	1x10⁹ CFU/Head	10
G7 (T5)	PP-DDS (PK-P8-PK-oriP8)	1x10¹⁰ CFU/Head	10
총 대상 개체수			70

실시예 2-3. 고형암의 부피 변화 측정

대장암 세포주 DLD-1을 이식한 누드 마우스 (BALB/cAnN.Cg-Foxn1nu/CrlNarl; 5 주령) 7개 그룹 (10마리/그룹)에서 종양의 증식을 확인하였고, 우측 옆구리 피하에 이식된 종양 부피는 이식 후 5일 경과 시 피하결절로 만져졌다.

종양 조직을 누드 마우스에 이식한 후에, 상기 표 3과 그룹핑하여 투여 계획에 따라 종투여 전 0일부터 투여후 49일까지 주1회 종양 조직의 크기를 베르니어 캘리퍼(vernier caliper)를 이용하여 측정하였다. 시험 제49일에 Xenograft 모델(고형암 모델)을 희생하여 조직 샘플을 얻고, 종양 전이를 확인하였다. 종양용적(tumor volume) 계산은 넓이2 x 길이/2 (mm³)의 공식을 사용하였다. 측정된 종양의 크기를 도 8에 나타내었다.

도 8을 참조하면, 페디오코커스 펜토사세우스 약물전달시스템 (PP-DDS) (PK-P8-ChoS-oriP8) 2-프로모터 시스템과 PP-DDS (PK-P8-PK-oriP8): 2-프로모터 시스템에 장착된 P8 단백질의 함암 효능을 비교하였다. 동일 조건(1x10¹ ⁰CFU/Head)으로 경구투여 시, 페디오코커스 펜토사세우스 약물전달시스템(PP-DDS) (PK-P8-ChoS-oriP8) 보다 페디오코커스 펜토사세우스 약물전달시스템(PK-P8-PK-oriP8) 투여 시 항암활성이 44.6%에서 49.4%로 5% 정도 더 증가하는 것으로 확인되었다.

본 발명의 P8 단백질을 분비/발현하는 약물전달시스템인 페디오코커스 펜토 사세우스 균주 (KCCM12181P)를 투여한 경우(G4, G5)에 음성대조군(G1), 양성대조군(G3)에 비하여 종양의 크기가 현저하게 감소하여 종양의 크기가 5-플루오로우라실(5-Fu)을 투여한 그룹(G2)과 유사한 크기로 감소되었다. 한편, 특히 이중 프로모터를 사용하여 고농도 투여군(G6 및 G7)의 경우에는 종양의 크기가 5-플루오로우라실(5-Fu)을 투여한 그룹(G2)보다 더 대폭 감소되어, 매우 우수한 항암 활성을 확인하였다.

실시예 2-4. 마우스 장내 PP DDS의 생존 및 플라스미드 DNA의 안정성 확인

마우스에게 투여된 P8 단백질을 분비/발현하는 약물전달시스템인 페디오코커 스 펜토사세우스 균주(KCCM12181P)가 마우스의 장내까지 살아 도달할 수 있는지를 확인하기 위해서, 쥐에 페디오코커스 펜토사세우스 균주를 투여하고 6주 후 쥐의 장내 물질을 회수하여 이를 MRS (erythromycin, 10ug/ml) 플레이트에서 배양하여 얼마나 페디오코커스 펜토사세우스 균주가 존재하는지를 확인하였다. 살아남은 페디오코커스 펜토사세우스 균주에서 P8 단백질의 분비/발현량을 측정하였다.

6주간 실험이 종료된 마우스의 소장내 물질을 회수하여, 이를 PBD 완충액과 원심분리기를 이용하여 2회 세척 후, 남은 상등액을 20% TCA로 농축하여 웨스턴 블로팅으로 P8 단백질을 검출하고, 그 결과를 도 9에 나타내었다. 도 9에서, pC, pCBT24-2-ChoS-COSP8을 가진 페디오코커스 펜토사세우스 균주의 배양 상등액으로 웨스턴 블롯을 수행하였다. C는 분리정제한 P8 단백질로 웨스턴 블롯을 수행한 결과이고, 1은, 장내에서 회수한 물질에서 자란 페디오코커스 펜토사세우스 균주를 배양하여 웨스턴 블롯을 수행한 결과이며, 2는 장내에서 회수한 물질에서 자란 페디오코커스 펜토사세우스 균주를 배양하여 웨스턴 블롯을 수행한 결과를 나타낸 것이다.

도 9를 참조하면, 검출된 P8 단백질의 양은 정량적인 분석이 불가능하여 실제 양을 확인할 수 없었으나, P8 단백질이 검출되는 것으로 볼 때, P8 단백질을 분비/발현하는 페디오코커스 펜토사세우스 균주가 마우스의 장내에 정착 후 P8 단백질을 지속적으로 발현 및 분비함을 간접적으로 확인할 수 있었다.

대장암, 대장염, 과민성대장증후군, 크론병 등을 포함하는 대장질환에 대하여 유산균을 치료제로 사용하는 것은 공지된 기술이지만, 유산균 내에서 표적단백질을 과발현 및 분비 시스템을 개발하고, 이를 약물 전달 시스템으로 이용하는 것에 대한 기술의 개발은 거의 없는 실정이었다. 본 발명은 유산균 유래 단백질을 유산균 발현/분비 시스템에 도입하여 이를 과발현 및 분비하는 유산균 약물 전달 시스템을 개발하고 이를 동물모델에 적용하여 그 효과를 입증하였다. 따라서 본 발명은 천연 단백질 대장질환 치료제로서 의학 분야에서 크게 활용될 것으로 기대된다.

이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 기술하였으나, 본 발명은 상술한 실시예로 한정되는 것은 아니다. 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자들은 상술한 실시예에 기초하여 다양한 변형과 변경을 용이하게 할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 보호범위는 후술하는 특허청구범위 및 그와 균등한 범위로 정해져야 할 것이다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM12181P

20171130

한국미생물보존센터(국외)

KCCM12182P

20171130

<110> CELLBIOTECH CO., LTD. <120> MICROORGANISMS WHICH EXPRESS AND SECRETE P8 PROTEIN FOR DELIVERING DRUG FOR TREATING GASTROINTESTINAL DISEASES AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING GASTROINTESTINAL DISEASES COMPRISING THE SAME <130> P17-CBT-03 <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 219 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein P8 <400> 1 gcaacagtag atcctgaaaa gacattgttt ctcgatgaac caatgaacaa ggtatttgac 60 tggagcaaca gcgaagcacc tgtacgtgat gcgctgtggg attattacat ggaaaagaac 120 agccgtgata ccatcaagac tgaagaagaa atgaaaccag tcctagacat gtccgacgat 180 gaggtcaaag ccctagcaga aaaggttctc aagaagtaa 219 <210> 2 <211> 72 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein P8 <400> 2 Ala Thr Val Asp Pro Glu Lys Thr Leu Phe Leu Asp Glu Pro Met Asn 1 5 10 15 Lys Val Phe Asp Trp Ser Asn Ser Glu Ala Pro Val Arg Asp Ala Leu 20 25 30 Trp Asp Tyr Tyr Met Glu Lys Asn Ser Arg Asp Thr Ile Lys Thr Glu 35 40 45 Glu Glu Met Lys Pro Val Leu Asp Met Ser Asp Asp Glu Val Lys Ala 50 55 60 Leu Ala Glu Lys Val Leu Lys Lys 65 70 <210> 3 <211> 184 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Promotor ermE <400> 3 ggatcctttt tagtattttt aattaattgt aatcagcaca gttcattatc aaccaaacaa 60 aaaataagtg gttataatga atcgttaata agcaaaattc atataaccaa attaaagagg 120 gttataatga aaaaaaagat tatctcagct attttaatgt ctacagtgat actttctgct 180 gcag 184 <210> 4 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Promotor PK <400> 4 ggatccctaa agatcgcgtt ttagcaagta agatgggtgc ttacgctgtt gagctactcc 60 ttgaaggtaa gggtggttta gcagttggaa tcttagaaaa taaggttcaa gctcataaca 120 tgcttgactt gtttgatgca aaacatcaag cagatgattc actttaccaa ttaagtgaag 180 atttatcatt ctagagttct attaatattt ggataaaatg acttaagaag tcttttataa 240 tttaaaatca agggagagat tctgtaatga aaaaaaagat tatctcagct attttaatgt 300 ctacagtgat actttctgct gcag 324 <210> 5 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Promotor GK <400> 5 ggatccataa tctggtaaat tagttgagat ggtattatga aaacacttta tgatgtgcaa 60 caacttttaa agcaattcgg aatatttgtt tacgttggaa aacgtaaatg ggatattgaa 120 ttgatgagta ttgaattgaa aaatttgtac aaagcaggag tcgtcgataa accgacttat 180 gttaaagctc agttggtttt acgacatgag catcatattg aagaggttag agataaccaa 240 caaaaataat ggagggtttc gaagtaatga aaaaaaagat tatctcagct attttaatgt 300 ctacagtgat actttctgct gcag 324 <210> 6 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Promotor GPFK <400> 6 ggatccccag ttattttagt ttatgaggat actaatgaac ataatgagtt gtctgaaaaa 60 ttttatttaa atgacagttc tgaagtaaaa gaacaattag cagaattgct aggaagtcaa 120 catatttcgt taattaaaaa ataaattttg aataaagcac ttacattcga ttaattaaga 180 aaatggtaca gacaactgtt ttcaaaagtg ataaaatcaa caatgaagtt ttgaaaaaac 240 tcaatatttc tgtttgaggt gaaaagatga aaaaaaagat tatctcagct attttaatgt 300 ctacagtgat actttctgct gcag 324 <210> 7 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Promotor G6Pi <400> 7 ggatccatgc cggctaaagt ggtggataaa ttgaatcatc cccaagaact ggaataagat 60 aaaattgtag tgctttcagg ctttaccagc catcttttga aaaaattaat ttctttcaaa 120 agtgcgtgtg acaggtgatc aactagatta aatggggagg gtatcccagt aaatattagg 180 ttaaatcgga taggcttaac caaattaagt aattttattg tataatggta cagataaaga 240 attttaaaca aaaggggtag ttattaatga aaaaaaagat tatctcagct attttaatgt 300 ctacagtgat actttctgct gcag 324 <210> 8 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L-LDH <400> 8 ggatcctcat tttcatgtta tttttccacc ctcaacacgc aaaaacggct gaaagagcaa 60 aaacccctca gctgtccacg tttattttca tgtaatatta ccatattatt gaccccaagc 120 gggtctttta acctctaact tatcaatcac tttactaact atacccgaac ttcataaaat 180 ttttactcaa ctttctttta tgaaaatgct atacttagta ttgtttgata aattcaaata 240 ttatatgaaa aaaggggatt gatcttatga aaaaaaagat tatctcagct attttaatgt 300 ctacagtgat actttctgct gcag 324 <210> 9 <211> 4757 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pCBT24-2 <400> 9 aagttaatgt aagccttaag gtttcaacta aagcaattac ggtcaaccat aaccatagta 60 ttggattgtc attttattgg ctataaaata gtaaatcagt gaatttcatt ggatccgcta 120 aagatcgcgt tttagcaagt aagatgggtg cttacgctgt tgagctactc cttgaaggta 180 agggtggttt agcagttgga atcttagaaa ataaggttca agctcataac atgcttgact 240 tgtttgatgc aaaacatcaa gcagatgatt cactttacca attaagtgaa gatttatcat 300 tctagagttc tattaatatt tggataaaat gacttaagaa gtcttttata atttaaaatc 360 aagggagaga ttctgtaatg aaaaaaaaga ttatctcagc tattttaatg tctacagtga 420 tactttctgc tgcagccccg ttgtcaggtg tttacgctga agtaattatt atggctaccg 480 ttgatccaga aaagactcta ttccttgatg aaccaatgaa taaagttttt gattggtcta 540 acagtgaggc tccggtgcga gatgccttat gggattacta tatggaaaag aatagccgtg 600 acacgatcaa aacagaagaa gaaatgaaac ctgtattaga tatgtcagat gacgaagtta 660 aagcattagc ggagaaagtc ttgaaaaagt aacctgacaa gaaccagtct gctattgata 720 gactattttt gtccgtgaaa tcctcgcgta tttccgtgag gagcatagta tatttagcga 780 tcttcaaatt ttaagtatat tgattcatat gtttatcctc ctaagtttga ggacaaatcg 840 gattccacgg cctcaatgac tgagctccgc ctatttttat aggttaatgt catgataata 900 atggtttctt agcgattcac aaaaaatagg cacacgaaaa acaagttaag ggatgcagtt 960 tatgcatccc ttaacttact tattaaataa tttatagcta ttgaaaagag ataagaattg 1020 ttcaaagcta atattgttta aatcgtcaat tcctgcatgt tttaaggaat tgttaaattg 1080 attttttgta aatattttct tgtattcttt gttaacccat ttcataacga aataattata 1140 cttttgttta tctttgtgtg atattcttga tttttttcta cttaatctga taagtgagct 1200 attcacttta ggtttaggat gaaaatattc tcttggaacc atacttaata tagaaatatc 1260 aacttctgcc attaaaagta atgccaatga gcgttttgta tttaataatc ttttagcaaa 1320 cccgtattcc acgattaaat aaatctcatt agctatacta tcaaaaacaa ttttgcgtat 1380 tatatccgta cttatgttat aaggtatatt accatatatt ttataggatt ggtttttagg 1440 aaatttaaac tgcaatatat ccttgtttaa aacttggaaa ttatcgtgat caacaagttt 1500 attttctgta gttttgcata atttatggtc tatttcaatg gcagttacga aattacacct 1560 ctttactaat tcaagggtaa aatggccttt tcctgagccg atttcaaaga tattatcatg 1620 ttcatttaat cttatatttg tcattatttt atctatatta tgttttgaag taataaagtt 1680 ttgactgtgt tttatatttt tctcgttcat tataaccctc tttaatttgg ttatatgaat 1740 tttgcttatt aacgattcat tataaccact tattttttgt ttggttgata atgaactgtg 1800 ctgattacaa ttaattaaaa atactaaaaa tgcccatatt ttttcctcct tataaaatta 1860 gtataattat agcacgaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa 1920 aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg 1980 atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc 2040 gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac 2100 tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgttcttcta gtgtagccgt agttaggcca 2160 ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt 2220 ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc 2280 ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg 2340 aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc 2400 cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac 2460 gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct 2520 ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc 2580 cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt 2640 tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac 2700 cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaaa tcgatactga 2760 attggcgaaa gccaaagttt ctataaaacc ttgctttcct gcttaacggc gagtgaaaaa 2820 gcggttaagc tggctcagct tggacggggt tcggggcgtt agcgtccgta ttaaatgtgg 2880 cttaccataa ccaacgaaca gagtgaggtg caaggagctg tgcgactgga gtttaatgtg 2940 agccggtttt tggctcactc ctttgtgttt tttgtttcta gattttaatc tcgtacagcg 3000 gtgcctcttt tatacctctt ttataaacct cttttaaacc tcttttagac ccctcttgag 3060 ccttactctc ccaaggctca cagaaggtta tcaagtacct tttgtctgtt tatcaagtac 3120 cttttgtctg tttatcaagt accttttgtc tgtttatcaa gtaccttttg tctgtttatc 3180 aagtaccttt ataagttctg tacttgataa aaaggtactt ttattttaat atgtgtttga 3240 ggtgataatc atggctaatg agttagttaa gtatgatcct gagttgaata ctattccctt 3300 gagaaaattt accccaattg agatgaattt atttttttca attatttccc gcatgcggga 3360 tcaagggaat aaaactgttc gtttctcttt tgaccagtta aaagagctta gtaactataa 3420 accaaccgca aataaacgtt ttattgatga tattgaaaat acataccaaa agatcctcag 3480 ccttaggttt ggccgtagaa gtaagagtgg cttaaatcgt gaattttttg ttatgtttac 3540 tgaatttgaa attaaaggtg aagctgaaga accttatgtt gatattcaga tttatcccaa 3600 agcattgcac ttgctaaacg atttagaaag ttgggttcgt tatgccctaa cagaatttag 3660 aaatttaaaa agcagttacg ctaaaacaat gtttcgtcta attaagcaat ttcgaactac 3720 tggctattct tatttctcta aagaagattt ttttgaattg cttgatatac ctaaaagtta 3780 ttggaatagt ccttcaaagg ttgacaaaaa ggttattaag ccaattagag aagaattaac 3840 cccgcttttt agagggctaa cgattagaaa aaaatatggt aaaggcagag gaaaaccagt 3900 tatcggttat tcttttactt ggaaacctga aagcaaggac gcaaatgatt tttctcaagg 3960 caaatttcaa gatgagcgtc aaaaactctt taacattcag cacaatgatg aattatcaga 4020 taaagaaaag tggcgtgcaa ttgacaaagt taaatgcttg cctttaggaa caactgaaaa 4080 acaggtactg gctgaaaaac aagctgaaca tgatcaaaaa atcagagatc aagcaagaca 4140 agaatttctc gctgatctcc gaaaggggtt ttaaaatcat gtctaaaact attagagaac 4200 ttgctgatga attgaatgtc tccaaacaga ctattcaata tcactaccaa agactaccag 4260 caaagaacca acaaaagaat agtcagggca caaaccttat tagtcctaca gcagaaagaa 4320 ttataagaag caaggtagca aagcctttgc tagcaaaaaa acagcaaaga ggtagcaaag 4380 aattgccaaa gactagcaaa gaaaataatg atctggttgc tactctgaga agagaagtag 4440 aagatttaaa ggctcaacgt gacaaacagc ttgctaccaa agaccgacaa atagaccatc 4500 taacaaaatt ggtggatcag cagcaacaat tacaattagc aacagtagca gataaccgtc 4560 gattaaaaga tcatgtacaa aagctaagtg ggcaactaac tcaaaaaact aacgacaact 4620 tgtcgaccgg aaatgatctt tttaacatcc aagataaaga aagcaaaata gctaaacaga 4680 agattgttaa atctggtagt aataaagatg gcatacacac aaatagagct attaaacgtt 4740 ggtggaaatt ctggtaa 4757

Claims

서열번호 3 내지 서열번호 8로 구성되는 군에서 선택되는 외인성 프로모터에 작동가능하게 연결된, 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 P8 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 분비 신호 펩티드를 코딩하는 유전자를 포함하는 유전자 컨스트럭트로 형질전환되어, 위장관에서 P8 단백질을 발현 및 분비하는 위장관 질환 치료 약물 전달용 페디오코커스 펜토사세우스 균주.
삭제
삭제
삭제
제1항에 있어서, 상기 분비신호펩티드는 USP45 분비 신호 펩티드, Usp45 N4 또는 락토바실러스 브레비스 S-층 단백질 신호 펩티드인 것을 특징으로 하는 P8 단백질을 발현 및 분비하는 위장관 질환 치료 약물 전달용 페디오코커스 펜토사세우스 균주.
제5항에 있어서, 상기 페디오코커스 펜토사세우스 균주는 페디오코커스 펜토사세우스 PP P8 균주(수탁번호: KCCM12181P)이고, 상기 분비신호펩티드는 USP45 분비 신호 펩티드인 것을 특징으로 하는 P8 단백질을 발현 및 분비하는 위장관 질환 치료 약물 전달용 페디오코커스 펜토사세우스 균주.
제1항에 있어서, 상기 유전자 컨스트럭트는 상기 프로모터의 하류에 두 번째 프로모터, 두 번째 분비신호 펩티드 및 두 번째 치료 폴리펩티드를 코딩하는 이종 핵산 서열을 추가로 포함하고, 상기 두 번째 프로모터는 상기 외인성 프로모터와 서로 동일 또는 상이한 것을 특징으로 하는 P8 단백질을 발현 및 분비하는 위장관 질환 치료 약물 전달용 페디오코커스 펜토사세우스 균주.
제1항에 있어서, 상기 위장관 질환은 대장암, 대장용종, 대장염, 허혈성 위장관 질환, 이질, 장내 혈관 이형성, 게실증, 과민성대장증후군, 또는 크론병인 것을 특징으로 하는 P8 단백질을 발현 및 분비하는 위장관 질환 치료 약물 전달용 페디오코커스 펜토사세우스 균주.
페디오코커스 펜토사세우스 균주를 포함하는 위장관 질환 치료용 조성물로서, 상기 페디오코커스 펜토사세우스 균주는 적어도 하나의 위장관 질환에 대한 치료 효과를 갖는 치료 펩티드를 코딩하는 이종 핵산을 포함하고, 상기 이종핵산은 이종 핵산에 작동 가능하게 연결된 서열번호 3 내지 서열번호 8로 구성되는 군에서 선택되는 외인성 프로모터와 분비신호펩티드를 코딩하는 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 위장관 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제9항에 있어서, 상기 페디오코커스 펜토사세우스 균주는 페디오코커스 펜토사세우스 PP P8 균주(수탁번호: KCCM12181P)인 것을 특징으로 하는 위장관 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제9항에 있어서, 상기 분비신호펩티드는 USP45 분비 신호 펩티드, Usp45 N4 또는 락토바실러스 브레비스 S-층 단백질 신호 펩티드인 것을 특징으로 하는 위장관 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제9항에 있어서, 상기 균주는 상기 프로모터의 하류에 두 번째 프로모터, 두 번째 분비신호 펩티드 및 두 번째 치료 펩티드를 코딩하는 이종 핵산 서열을 추가로 포함하고, 상기 두 번째 프로모터는 상기 외인성 프로모터와 서로 동일 또는 상이한 것을 특징으로 하는 위장관 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제9항에 있어서, 상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 약학적으로 허용 가능한 염을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 위장관 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제9항에 있어서, 상기 조성물이 화학 요법 화합물을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 위장관 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.