CN103429742A - 用于治疗内分泌、胃肠或自体免疫性疾病的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

提供涉及使用分离、改造的重组细胞来直接或间接治疗哺乳动物宿主内疾病或紊乱的重组细胞和方法，所述疾病或紊乱例如内分泌、胃肠或自体免疫性紊乱。提供含有信号序列和启动子的重组细胞，其中：所述信号序列能够调控宿主内靶核酸的信号依赖性表达或能够调控靶核酸响应环境刺激的信号依赖性表达，所述细胞源自肠或共生细菌，所述靶核酸编码促进宿主内正常生理过程功能的哺乳动物因子或有效预防宿主内非感染性疾病的发作、建立或传播。向所述宿主给予所述重组细胞以治疗疾病或紊乱。

Description

用于治疗内分泌、胃肠或自体免疫性疾病的组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求共同待审的2010年10月15日提交的美国临时专利申请系列号61/393,618、2011年9月26日提交的系列号61/539,121的优先权和权益，上述各申请通过引用全文纳入本文。

关于联邦资助研究或开发的声明

不适用

1.技术领域

本发明一般涉及用于治疗内分泌、胃肠或自体免疫性疾病的组合物和方法。

2.技术背景

糖尿病是以以下为表征的疾病：高血糖症；改变脂质、碳水化合物和蛋白的代谢；增加血管疾病并发症的风险。糖尿病由于与年龄增长和肥胖相关，是与日渐增的公众健康问题。

有两种主要类型的糖尿病：1)I型，也称为胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)和2)II型，也称为胰岛素非依赖性或非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)。这两种糖尿病类型都归因于循环胰岛素含量不足和外周组织对胰岛素的响应下降。

I型糖尿病源于身体无法产生胰岛素，胰岛素是“解锁”身体细胞的激素，能使葡萄糖进入并用作燃料。I型糖尿病的并发症包括心脏病和中风、视网膜病(眼部疾病)、肾脏疾病(肾病)、神经病(神经损伤)，以及无法保持良好皮肤、足部和口腔健康。

II型糖尿病源于身体无法生成足够胰岛素或细胞无法使用由身体自然生成的胰岛素。这种身体不能最优使用胰岛素的病症被称为胰岛素抵抗。II型糖尿病通常伴随高血压，而这可能导致心脏病。在患有II型糖尿病、应激、感染的患者中，药物(例如皮质类固醇)也会导致血糖水平的严重提高。伴随脱水，II型糖尿病患者内的严重血糖升高会导致血液渗透压的增加(高渗状态)。这种病症会导致昏迷。

胰岛素通过刺激肌肉和脂肪组织对葡萄糖的摄取和代谢来降低血液中的葡萄糖浓度。胰岛素刺激葡萄糖在肝中以糖原形式储存，在脂肪组织中以甘油三酯形式储存。胰岛素还促进肌肉使用葡萄糖产生能量。因此，血液中胰岛素水平不足，或对胰岛素敏感性的降低，会产生血液中过高水平的葡萄糖和甘油三酯。

未治疗的糖尿病的早期症状与升高的血糖水平和尿液中的葡萄糖损失有关。尿液中高含量的葡萄糖会导致尿液输出增加，并引起脱水。脱水导致口渴和水消耗的增加。无法使用葡萄糖能量最终导致尽管食欲增加却依然减重。一些未经治疗的糖尿病患者还抱怨疲劳、恶心和呕吐。糖尿病患者倾向于发展出膀胱、皮肤和***区域的感染。血液中葡萄糖水平的波动能导致视觉不清。异常升高的葡萄糖水平能导致嗜睡和昏迷(糖尿病昏迷)。

葡萄糖水平在正常水平和糖尿病水平之间的人患有葡萄糖耐量受损(IGT)。这种病症也称为糖尿病前期或胰岛素抵抗综合症。患有IGT的人没有糖尿病，而是有高于正常但尚未高到足以被诊断为糖尿病的血液葡萄糖水平。他们的身体制造越来越多的胰岛素，但由于组织不对其响应，所以他们的身体无法合适地使用糖。近期研究表明，IGT本身对于心脏病的发展而言可能是风险因素。估计患糖尿病前期的人的心血管疾病风险比血糖正常的人高1.5倍。患有糖尿病的人的心血管疾病风险增加2～4倍。

葡萄糖和甘油三酯的高血液水平导致毛细血管基底膜增厚，造成血管腔渐窄。所述血管病变产生多种病症例如糖尿病性视网膜病，其会导致失明、冠心病、毛细血管间肾小球硬化症、神经病以及四肢的溃疡形成和坏疽等。

葡萄糖血浆水平过度的毒性作用包括细胞和组织的糖基化。糖基化产物在组织中积累，并可最终形成交联蛋白，所述交联蛋白被称为晚期糖基化终产物。非酶促糖基化可能直接导致血管基质扩张和糖尿病血管并发症。例如，胶原糖基化导致过度交联，造成血管动脉粥样硬化。并且，巨噬细胞对糖基化蛋白的摄取刺激这些细胞分泌促炎细胞因子。所述细胞因子分别激活或诱导间充质细胞和内皮细胞中的降解和增殖级联反应。

血红蛋白的糖基化提供了用于测定血糖状态的完整指数的便利方法。糖基化蛋白的水平反映一段时间内的葡萄糖水平，并且是被称作血红蛋白Al(HbAlc)实验的基础。

HbAlc反映在前120天过程中的重均血糖水平；前30天中的血浆葡萄糖引起约50%的HbAlc实验终结果。对Alc的测试(也称为HbAlc，糖血红蛋白或糖化血红蛋白)指示在最后数月中糖尿病被控制的程度。Alc越接近6%，对糖尿病的控制越好。Alc血糖每增加30mg/dl，Alc便增加1%，从而增加并发症的风险。

高血糖症的毒性作用的另一个解释包括山梨醇的形成。细胞内葡萄糖通过酶醛糖还原酶还原为其相应的糖醇、山梨醇；山梨醇的生成率由周围葡萄糖浓度决定。因此，组织例如晶状体、视网膜、动脉壁和外周神经的施旺(Schwann)细胞含有高浓度山梨醇。

高血糖症还削弱神经组织的功能，这是由于葡萄糖与肌醇竞争导致细胞浓度降低，并且最终改变神经功能和神经病。

甘油三酯水平增加也是胰岛素缺失的结果。高甘油三酯水平也与血管疾病相关。

因此，控制血糖和甘油三酯水平是所希望的治疗目标。已知许多口服抗高血糖剂。增加胰腺的胰岛素输出的药物包括硫酰脲类(包括氯磺丙脲甲苯磺丁脲

格列本脲

格列甲嗪

和格列美脲

)以及磺酰脲类(包括瑞格列耐

和那格列耐

)。降低肝脏的葡萄糖生成量的药物包括双胍(包括甲福明二甲双胍

)。增加细胞对胰岛素敏感性的药物包括塞唑烷二酮类(包括曲格列酮

吡格列酮

和罗格列酮)。降低肠的碳水化合物吸收的药物包括α葡萄糖苷酶抑制剂(包括阿卡波糖

和米格列醇

)。吡格列酮和罗格列酮能够改变糖尿病患者中的胆固醇模式。HDL(或好胆固醇)为这些药物加码。阿卡波糖作用于肠，其效果为在其它部位作用的药物(例如硫酰脲类)加码。ACE抑制剂可以用来在患有高血压或糖尿病的人中控制高血压、治疗心力衰竭和预防肾损伤。ACE抑制剂或ACE抑制剂和利尿剂(例如氢***)的组合产物市售可得。然而，这些治疗都不理想，因为它们只提供短期治疗，且伴随许多副作用。

控制血压可以使心血管疾病(例如，心肌梗塞和中风)减少约33%～50%，能使微血管疾病(眼部、肾脏和神经疾病)减少约33%。疾病控制中心(Center forDisease Control)已发现收缩血压每降低10毫米汞柱(mm Hg)，与糖尿病相关的任何风险降低12%。增加对胆固醇和脂质(例如HDL、LDL和甘油三酯)的控制能使心血管并发症减少20%～50%。

在健康人内，总胆固醇应少于200mg/dl。高密度脂蛋白(HDL或“好胆固醇”)目标水平是男性高于45mg/dl，女性高于55mg/dl，而低密度脂蛋白(LDL或“坏”胆固醇)应保持低于100mg/dl。女性和男性的目标甘油三酯水平是低于150mg/dl。

大约50%的糖尿病患者在患糖尿病10年后发展出一定程度的糖尿病性视网膜病，而80%的糖尿病患者在15年后患有视网膜病。在美国国立糖尿病、消化和肾脏疾病研究所(NIDDK)实施的研究(DCCT研究)中显示，保持血糖水平尽可能接近正常水平减缓由糖尿病引起的眼部、肾脏和神经疾病的发作和恶化。在糖尿病预防计划(DPP)中，临床实验研究了2型糖尿病。DPP研究发现，超过3年的研究显示，饮食和锻炼显著减少IGT患者发展糖尿病的机会。给予甲福明二甲双胍

也减少风险，尽管不太显著。

DCCT研究显示HbAlc和平均血糖之间的关联。DPP研究显示HbAlc与不良结果风险高度相关。

在来自美国心脏协会第六次预防会议：糖尿病和心血管疾病的一系列报告中，报道了约三分之二糖尿病患者最终死于心脏或血管疾病。研究还显示能通过控制个体风险因子例如肥胖、高胆固醇和高血压来减少与糖尿病相关联的心血管疾病风险增加。

对患有糖尿病的人重要的是减少患并发症例如心血管疾病、视网膜病、肾脏疾病和神经病的风险。对糖尿病重要的还有降低总胆固醇和甘油三酯水平，以减少心血管并发症。减少这些可能的并发症风险对于患IGT(糖尿病前期)的人也是重要的。

因此，如果可以控制血糖水平，则可降低并发症例如心血管疾病、视网膜病、肾脏疾病和神经病的风险，或延迟所述并发症的发作。若能降低总胆固醇和甘油三酯的水平，则能减少心血管并发症。

第2部分或本申请的任何其它部分中的任何参考文献的引用或鉴定，不应视作认可所述参考文献是本发明的在先技术。

3.发明内容

提供重组细胞。在一个实施方式中，所述重组细胞包含信号序列和启动子，其中：

a.所述信号序列调控宿主内靶核酸的信号依赖性表达；

b.所述重组细胞获自肠细菌或共生细菌，和

c.所述信号序列是GLP-2、其片段或其类似物或其组合。在另一个实施方式中，所述重组细胞包含信号序列和启动子，其中：

a.所述信号序列调控靶标核酸在宿主中的信号依赖性表达，

b.所述重组细胞获自肠细菌或共生细菌，和

c.所述靶核酸编码能够使所述宿主的第一种细胞重编程为第二种细胞的哺乳动物因子。

在另一个实施方式中，所述宿主是哺乳动物。

在另一个实施方式中，所述第二个细胞是β样细胞、甲状腺细胞、肝细胞或免疫应答细胞。

在另一个实施方式中，所述宿主的第一个细胞是肠表皮细胞。

在另一个实施方式中，所述第二个细胞是葡萄糖响应性胰岛素分泌细胞。

在另一个实施方式中，所述信号序列响应环境刺激调控靶标核酸的信号依赖性表达。

在另一个实施方式中，所述启动子是葡萄糖响应性启动子。

在另一个实施方式中，所述启动子可以是本领域已知的任何诱导型或组成型启动子。

在另一个实施方式中，所述信号序列选自GLP-1、GIP、PDX-1及其一个或多个片段、其类似物及其组合。

在另一个实施方式中，所述信号序列选自GLP-1、PDX-1、GIP、GLP-2、胰岛素、生长激素、促乳素、降钙素、黄体生成激素、甲状旁腺激素、促生长素抑制素、促甲状腺激素、血管活性肠多肽、三叶因子、细胞和组织修复因子、转化生长因子β、角质细胞生长因子、采用反平行4α螺旋束结构的第1结构组细胞因子、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、GM-CSF、M-CSF、SCF、IFN-γ、EPO、G-CSF、LIF、OSM、CNTF、GH、PRL、IFNα/β，第2结构组细胞因子、TNF-家族细胞因子、TNFα、TNFβ、CD40、CD27、FAS配体、IL-1-家族细胞因子、成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子、转化生长因子p、神经生长因子，包含短链α/β分子的第3结构组细胞因子、表皮生长因子家族细胞因子、C-C或C-X-C趋化因子、胰岛素相关细胞因子，四级结构细胞因子、调蛋白、神经调节蛋白、EGF、免疫球蛋白样结构域、三环结构域、其一个或多个片段、其类似物及其组合。

在另一个实施方式中，所述信号序列和启动子在所述重组细胞内的质粒上编码。

在另一个实施方式中，所述细胞源自益生细菌。

在另一个实施方式中，所述细胞是选自埃希氏菌(Escherichia)、假单胞菌(Pseudomonas)、拟杆菌(Bacteroides)、乳杆菌(Lactobacillus)、乳球菌(Lactococcus)、芽孢杆菌(Bacillus)、变形杆菌(Proteus)、双歧杆菌(Bifidobacterium)、链球菌(Streptococcus)、葡萄球菌(Staphylococcus)和棒状杆菌(Corynebacterium)的细菌。

在另一个实施方式中，所述靶核酸编码哺乳动物因子，该哺乳动物因子能促进宿主内的所需生理过程功能，或能治疗宿主内非感染性疾病。

在另一个实施方式中，所述非感染性疾病选自自体免疫性疾病、癌症、内分泌疾病、胃肠疾病、癌症及其组合。

在另一个实施方式中，所述非感染性疾病是糖尿病。

在另一个实施方式中，所述糖尿病是1型糖尿病、2型糖尿病或代谢综合症。

在另一个实施方式中，所述非感染性疾病选自克罗恩氏(Crohn’s)病、肥胖、苯丙酮尿症、槭树糖浆尿病、组氨酸血症、高血糖症、糖尿病性视网膜病、冠心病、毛细血间肾小球硬化症、肾病、神经病、四肢溃疡或坏疽、动脉粥样硬化、高胆固醇血症、高血压、高蛋白血症、蛋白尿症、骨质疏松、贫血、高脂蛋白血症、酮酸中毒、高甘油三酯血症、乳酸性酸中毒、心肌病、威尔逊(Wilson’s)病、脑白质病、岩藻糖苷病、癌症、化疗诱导的腹泻、炎性肠病、心室和动脉纤颤、手术后器官衰竭、肠易激综合症、间质性膀胱炎/膀胱痛综合症、短肠综合症、溃疡性结肠炎及其组合。

在另一个实施方式中，所述癌症是胃肠癌、胃癌、胆囊癌、胃肠基质肿瘤、肝癌、胰腺癌或结肠癌。

在另一个实施方式中，所述哺乳动物因子在肠损伤或手术后促进所需生理过程功能。

在另一个实施方式中，所述重组细胞能够接触肠绒毛而不吸收进入所述宿主的全身循环。

在另一个实施方式中，所述启动子是诱导型或组成型启动子。

在另一个实施方式中，所述启动子是fliC启动子。

在另一个实施方式中，所述重组细胞还包含分泌标签(secretion tag)。

在另一个实施方式中，所述分泌标签是fliC分泌标签。

在另一个实施方式中，所述分泌标签是α-血溶素(HlyA)分泌标签。

在另一个实施方式中，所述重组细胞还包含细胞穿透肽(CPP)序列。

在另一个实施方式中，所述重组细胞表达信号序列为融合蛋白，其中，所述融合蛋白包含由所述信号序列编码的信号和由所述细胞穿透肽序列编码的细胞穿透肽。

还提供一种用于治疗宿主内糖尿病的方法，所述方法包括向所述宿主给予重组细胞的步骤，其中所述重组细胞包含信号序列和启动子，其中：

a.所述信号序列调控靶标核酸在宿主中的信号依赖性表达，

b.所述重组细胞获自肠细菌或共生细菌，和

c.所述靶标核酸编码能够将所述宿主的第一个细胞重编程为第二个细胞的哺乳动物因子。

在一个实施方式中，所述靶标信号序列刺激疾病预防因子的表达或抑制糖尿病引发因子的表达。

在另一个实施方式中，所述糖尿病是1型糖尿病、2型糖尿病或代谢综合症。

在另一个实施方式中，所述信号序列调控靶标核酸响应环境刺激的信号依赖性表达。

在另一个实施方式中，所述环境刺激物是葡萄糖。

在另一个实施方式中，所述疾病预防因子包括胰岛素。

在另一个实施方式中，所述靶标核酸编码促进宿主内血糖水平降低的哺乳动物因子。

在另一个实施方式中，所述靶标核酸编码促进宿主内血液胰岛素水平增加的哺乳动物因子。

一种在哺乳动物宿主中使肠细胞分化为其它细胞类型的方法，所述方法包括向所述宿主给予重组细胞的步骤，其中，所述重组细胞包含信号序列和启动子，其中：

a.所述信号序列调控靶标核酸在宿主中的信号依赖性表达，

b.所述重组细胞获自肠细菌或共生细菌，和

c.所述靶标核酸编码能够使所述宿主的第一个细胞重编程为第二个细胞的哺乳动物因子。

在另一个实施方式中，所述另一个细胞类型是β样细胞、甲状腺细胞、肝细胞或免疫应答细胞。

在另一个实施方式中，所述β样细胞是葡萄糖响应性细胞。

在另一个实施方式中，给予有效量的所述重组细胞。

在另一个实施方式中，所述重组细胞的有效量是至少约10⁴CFU/kg。

在另一个实施方式中，联合给予所述重组细胞和具有协同作用的化合物。

在另一个实施方式中，所述具有协同作用的化合物选自DPP-4抑制剂、GLP-2、GLP-1激动剂、二甲亚砜、胰岛素、α-葡萄糖苷酶抑制剂、普兰林肽、美格列奈、瑞格列奈、那格列奈、氯磺丙脲、甲福明二甲双胍、磺脲、格列甲嗪、格列本脲、格列美脲、噻唑烷二酮类、其类似物、其片段及其组合物。

在另一个实施方式中，所述信号序列选自GLP-1、PDX-1、GIP、GLP-2、胰岛素、生长激素、促乳素、降钙素、黄体生成激素、甲状旁腺激素、促生长素抑制素、促甲状腺激素、血管活性肠多肽、三叶因子、细胞和组织修复因子、转化生长因子β、角质细胞生长因子、采用反平行4α螺旋束结构的第1结构组细胞因子、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、GM-CSF、M-CSF、SCF、IFN-γ、EPO、G-CSF、LIF、OSM、CNTF、GH、PRL、IFNα/β、第2结构组细胞因子、TNF-家族细胞因子、TNFα、TNFβ、CD40、CD27、FAS配体、IL-1-家族细胞因子、成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子、转化生长因子p、神经生长因子、包含短链α/β分子的第3结构组细胞因子、表皮生长因子家族细胞因子、C-C或C-X-C趋化因子、胰岛素相关细胞因子、第4结构组细胞因子、调蛋白、神经调节蛋白、EGF、免疫球蛋白样结构域、三环结构域、其一个或多个片段、其类似物及其组合。

在另一个实施方式中，所述信号序列是GIP、GLP-1、GLP-2、PDX-1、其片段、其类似物及其组合。

提供用于使宿主内肠细胞重编程为葡萄糖响应性胰岛素分泌细胞的方法，所述方法包括给予包含信号序列和启动子的重组细胞的步骤，其中，所述信号序列选自GLP-1、GIP、PDX-1、其片段、其类似物及其组合。

在一个实施方式中，所述宿主是高血糖症患者，且向所述高血糖症宿主给予所述重组细胞会减少或消除对所述宿主治疗性给予外源胰岛素的需求。

4.附图简要说明

本文通过参考附图说明本发明，在所述附图中，类似的参考特征表示若干视图中类似的部分。应理解，在一些例子中可能夸张地或放大地显示本发明的不同方面以便于理解本发明。

图1显示就研究构建的质粒。为研究来自大肠杆菌（E.coli）DH5α的P0/P1启动子，制备两种质粒(pFDl和pFD2)。pFD1编码完整P0/P1区域以驱动增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达。pFD2仅编码EGFP上游启动子的P0区域。为就刺激Caco-2细胞内胰岛素分泌测试重组细菌中促胰岛素(insulinotropic)蛋白的分泌功效，构建质粒pFD-PDX、pFD-GLP和pFD-20。

图2显示P0和P0/P1对葡萄糖的响应。利用EGFP表达来测量P0和/或PI启动子对不同介质条件的响应。Po=仅P0;P0+P1=P0加P1侧接区域；DH5α=lac操纵子对照。

图3显示大肠杆菌Nissle的重组促胰岛素蛋白分泌。

图4A显示Caco-2细胞的反转录-PCR，所述Caco-2细胞用来自大肠杆菌Nissle的过夜培养物的无细胞培养基(CFM)孵育，所述大肠杆菌Nissle表达GLP-1(G)、PDX-1-CPP(P)、GLP-1和PDX-1-CPP(GP)、或对照质粒(样品表示为“20”)，或用合成的GLP-1(氨基酸1～37；样品表示为“37”)孵育，并后续用葡萄糖(“g”)或甘油刺激。

图4B显示受刺激Caco-2细胞的胰岛素分泌的酶联免疫吸附实验。误差棒代表至少三次实验的一个标准偏差。P值来自斯氏T检验(n=3)。

图5显示改造成分泌GLP-1、含有fliC启动子和分泌标签的Nissle的GLP-1分泌，与含有相同序列但不含pKD3染色体***盒的携带质粒菌株的GLP-1分泌的比较。

图6显示用改造成分泌GLP-1、含有fliC启动子和GLP-1分泌标签的Nissle处理的小鼠与用包含相同序列但不含pKD3染色体***盒的携带质粒菌株处理的小鼠间的葡萄糖水平体内测试。

图7显示1型糖尿病鼠模型中血糖水平的降低。

图8A-B描述显示胰岛素的小鼠肠切片的免疫组化。在实施例5的章节6.5所述实验末尾处死用表达GLP-1(A)的大肠杆菌Nissle1917和表达随机肽(B)的大肠杆菌Nissle1917喂食的糖尿病小鼠。就胰岛素存在染色(红色)肠切片。在A中以箭头指示高浓度的胰岛素。

图9A-E显示在用Nissle-GLP-1、Nissle处理或不予处理之后对小鼠的检测。检测了β细胞量(A)。监测超过80天的小鼠随机葡萄糖水平(B)和重量(C)。就葡萄糖注射后1.5小时而言每30分钟检测血液胰岛素(D)，就葡萄糖注射后1.5小时而言每30分钟检测血糖(E)。

图10A-F显示小鼠肠中包含胰岛素的细胞口袋的相对频率。小鼠肠的免疫染色显示喂食Nissle-GLP-1的小鼠(A)内有包含胰岛素的细胞，而喂食Nissle的小鼠或对照小鼠(B)内没有。细胞用针对代表性蛋白质的抗体共染蓝色，所述代表性蛋白质来自以下4种细胞类型中每一种：潘纳斯(paneth)细胞的NOD-2(C)、杯状细胞的黏液素-2(MUC-2)(D)、吸收细胞的蔗糖异麦芽糖酶(SI)(E)，以及肠内分泌细胞的嗜铬素A(Chr-A)(F)。用针对来自所述四种类型肠细胞中每一种的代表性蛋白的抗体共染表明，这些细胞系与肠内分泌细胞相关联。

图11A显示也喂食Nissle和Nissle GLP-1的健康小鼠(未经STZ处理)中随着时间的血糖水平。

图11B显示也喂食Nissle和Nissle GLP-1的健康小鼠(未经STZ处理)中随着时间的重量变化。

图12显示在喂食Nissle、表达来自质粒的GLP-1或Nissle-GLP-1的小鼠品系粪便中的Nissle存活性检测。

图13显示在使用含假质粒Nissle、含来自相同质粒的GLP-1(1-37)的Nissle或不予处理或无STZ(对照)进行Nissle处理后的随机血糖水平。

图14显示非肥胖糖尿病(NOD)小鼠在对NOD小鼠一天两次喂食Nissle、染色体表达GLP-1(1-37)的Nissle或不予处理之后的空腹血糖水平。小鼠在临检测血糖之前禁食4小时。时间表示处理开始后的天数。

图15显示操作所述重组细胞的可能方法。左：腔B中在黏膜M内侧和上侧含有细菌的正常肠隐窝。肠内分泌细胞(E)分泌激素进入固有层(LP)和脉管***V。右：本文实施方式的重组细胞(EB)分泌GLP-1(从EB出现的点)进入所述肠腺以使早期肠内分泌细胞重编程为胰岛素分泌细胞(RE)。然后在响应葡萄糖时分泌胰岛素(Ins，标星)进入血流。

图16A-D显示在小鼠肠上部中的细菌分泌GLP-1。在60天的过程中，每天两次对小鼠喂食分泌自大肠杆菌Nissle1917(Nissle-GLP-1)的GLP-1(1-37)。a，小鼠肠上部切片的免疫荧光显示GLP-1结合肠黏膜。白色箭头指示来自肠内分泌细胞的GLP-1表达。灰色箭头指示细菌分泌的GLP-1结合上皮细胞。b，喂食表达假肽(Nissle)的大肠杆菌Nissle1917的小鼠不显示黏膜GLP-1染色。白色箭头指示肠内分泌细胞。c，GLP-1结合(%覆盖)通过图像分析定量。值是取自至少3只小鼠图像的平均值，而误差棒代表1个标准偏差。GLP-1=Nissle-GLP-1；Nissle=表达假肽的EcN。p值来自斯氏t检验(n=3)。d，来自小鼠全肠的细菌计数：高位肠道(未清洗)、大肠(较低GI，用PBS温和清洗)或粪便计数。*粪便以每克粪便计数。值是三只小鼠的平均值，而误差棒代表一个标准偏差。

图17A-D显示STZ处理的小鼠内1型糖尿病(T1DM)有所减少，a，在研究末期收集小鼠胰腺，并测定就胰岛素染色的IHC切片的β细胞量。分析来自每组3只小鼠的图像，显示各组的平均β细胞量。误差棒代表标准偏差，p值来自斯氏t检验(n=3)。如教材所述处理喂食Nissle的小鼠(Nissle)、喂食Nissle-GLP-1的小鼠(GLP-1)、不喂食细菌的小鼠(STZ)、未用STZ处理或喂食细菌的小鼠(对照)。b，在60天后检测小鼠血糖水平。显示在处理开始(第0天)和60天后的平均值。显示的值是至少4只小鼠的平均值。误差棒代表一个标准偏差。p值来自斯氏t检验(n=4)。c，在92天的过程中，对未用STZ处理的健康小鼠一天两次喂食Nissle(Nissle)和Nissle-GLP-1(GLP-1)。在相同时间段使用不喂食细菌的对照小鼠作为比较(对照)。显示三个时间点(第0、57和92天)。p值来自斯氏t检验(n=4)。d，在STZ消耗其β细胞团块之后用细菌处理60天后，小鼠接受葡萄糖耐受测试，其中，它们被禁食10小时，然后注射葡萄糖(25mg/kg体重)。每30分钟检测血液胰岛素(上图)和葡萄糖(下图)水平，持续1.5小时。▲=STZ-处理的未喂食细菌的小鼠；■=STZ-处理的喂食Nissle的小鼠；□=STZ-处理的喂食Nissle-GLP-1的小鼠；Δ=不给予STZ也不喂食细菌的对照小鼠。值是各处理的平均值。误差棒代表标准偏差(n=4)。星号表示在斯氏t检验(n=4)中，仅STZ处理的小鼠(▲)和喂食Nissle-GLP-1的小鼠(□)之间在p<.05(*)、p<.01(**)和p<.001(***)水平的显著性。

图18A-H显示喂食Nissle和Nissle-GLP-1的小鼠内的β细胞和上皮细胞标志物。将来自STZ处理小鼠(a、b、e-f)和喂食Nissle(a、c)或Nissle-GLP-1(b、d、e-f)的健康小鼠(c,d)的肠切片免疫染色为绿色，用于显示胰岛素(a-h)存在，共染蓝色的是核酸(DAPI，a-h)，红色的是PDX-1(a-d)、ChiA(e、f)、溶菌酶(Lys，g)或蔗糖异麦芽糖酶(SI，h)。图e-f中，向右的箭头指示表达胰岛素的重编程细胞。图b中向左的箭头和图d中的所有箭头指示表达胰岛素的细胞。图e和f中向左和向下的箭头指示表达ChrA而不是胰岛素的细胞。图g中向上的箭头指示表达Lys的潘纳斯(paneth)细胞。图h中向左和向上的箭头指示SI。图b、e和f中插图是其所出现图像内生成胰岛素的细胞的较高放大倍数图。图a、e和h的比例尺=25μm；所有其它图中的比例尺=100μm。A=自荧光。

图19显示改造的共生细菌的GLP-1分泌。上图，显示用于通过染色体***将大肠杆菌Nissle1917转化入GLP-1分泌细胞系的盒示意图。所述盒包括fliC的5'未翻译区域，然后是6个组氨酸标签、肠激酶位点(EK)、融合细胞穿透肽(CPP)的GLP-1(1-37)和用于染色体***的pKD3区域。下图，Western印迹显示来自染色体修饰的Nissle(染色体)或来自携带质粒上所述盒的Nissle(质粒)的分泌(M)或细胞团(C)内的GLP-1量。

图20A-B显示T1DM实验的小鼠重量水平。a，在喂食Nissle(Nissle)、Nissle-GLP-1(GLP-1)或不用细菌喂食(STZ)60天后检测STZ处理的小鼠重量。未用STZ处理且未喂食细菌的小鼠作为对照(对照)。显示在处理开始(第0天)和60天后的平均值。显示的值是至少4只小鼠的平均值。误差棒代表一个标准偏差。b，C57BL/6雌鼠(6～8周龄)一天两次喂食Nissle、Nissle-GLP-1或不喂食细菌。重量按指示测量。值是5只小鼠的平均值。误差棒代表标准偏差(n=5)。

图21显示NOD小鼠血糖水平。NOD小鼠一天两次用Nissle(Nissle)、Nissle-GLP-1(GLP-1)喂食或不用细菌喂食(对照)，持续46天。开始每天喂食后，在第11、21、30和46天检测空腹血糖。值是每组小鼠在特定天的的平均值。误差棒代表一个标准偏差，p值来自第46天数据的斯氏t检验(n=2)。

图22显示NOD小鼠重量。NOD小鼠一天两次用Nissle(Nissle)、Nissle-GLP-1(GLP-1)喂食或不用细菌喂食(对照)，持续46天。开始每天喂食后，在第11、21、30和46天喂食后检测小鼠重量。值是每组小鼠在特定天的平均值。误差棒代表1个标准差。

5.发明详述

提供具有经改造信号转导能力的遗传工程改造微生物(例如，细菌)。提供使用经改造微生物(或源自其的重组细胞)以表达生物信号转导分子或改善疾病或紊乱的生物复合物的方法。还提供改造成分泌胰高血糖素样肽1(GLP-1)、PDX、GIF或胰高血糖素样肽2(GLP-2)或其片段、类似物或组合的共生细菌菌株。还提供使用所述改造细菌菌株来改善高血糖症和/或糖尿病(DM)以及其它疾病的方法。

还提供使用改造成分泌胰高血糖素样肽1(GLP-1)、PDX、GIF、其片段、其类似物或其组合的共生细菌菌株来使肠细胞重编程为葡萄糖响应性胰岛素分泌细胞的方法。提供使用改造成分泌胰高血糖素样肽2(GLP-2)的共生细菌菌株来增强肠功能、肠上皮表面损伤例如炎性发作、外科手术等后再生，并促进所述肠道内膜痊愈的方法。

为了清楚说明而非限制本公开，将本发明分为以下小章节详细描述。

5.1.术语

在描述本组合物和方法之前，应理解，本发明不限于所述的具体方法、组合物、或方法论，因为它们可变化。还应理解，本说明中所用的术语仅用于描述具体形式或实施方式，且不意在限定本发明的范围，本发明的范围仅由所附权利要求书限定。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员通常所理解的同样含义。虽然与本文所述类似或等同的任何方法和材料也能用于实施或测试本发明的实施方式，但描述了优选的方法、装置和材料。所有本文中提到的出版物通过引用全文纳入本文。本文中所有内容均不应解释为承认本发明不能凭借在先发明而先于这些公开内容。

还必须注意到，本文和所附权利要求书所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数含义，除非文中另有明确说明。因此，例如，提及“重组细胞”指本领域技术人员已知的一种或多种重组细胞和其等同物，等等。

本文所用的术语“约”指与所用数字相比在数值上增加或减少10%。因此，约50%指在45%～55%范围内。

“给予”在与治疗剂联用时，指将治疗剂直接给予靶组织之内或之上，或将治疗剂给予患者，由此所述治疗剂正面影响其靶向组织。因此，本文所用的术语“给予”在与重组细胞联用时，可以包括但不限于口服给予，将重组细胞提供至靶标组织之内或之上；通过例如静脉内注射将重组细胞***性提供给患者，由此所述治疗剂到达所述靶组织；将重组细胞以其编码序列形式给予所述靶组织(例如，通过所谓基因治疗技术)。

“给予”组合物可以通过口服、注射、局部给予或与其它已知技术联用的任何方法来完成。

本文所用的术语“动物”或“患者”或“宿主”或“对象”包括但不限于人类和非人类脊椎动物，例如野生、家养和农场动物。优选地，所述术语“动物”或“患者”或“宿主”或“对象”指哺乳动物，更优选指人。

使用术语“改善”以表达本发明改变所提供、应用或给予的组织的外观、形式、特性和/或物理属性。所述形式上的改变可以通过任何以下形式单独或联合来证明：肠上皮细胞转变成胰岛素分泌细胞、治疗信号的分泌、靶标核酸的表达、或靶标疾病症状的缓解、预防或减少，所述目标疾病例如癌症、自体免疫、内分泌或心血管疾病。

所述术语“抑制”包括给予本发明的重组细胞以防止所述症状的发作、减轻所述综合症或消除所述疾病、病症或紊乱。

“药学上可接受的”指必须与制剂中其它成分相容的运载体、稀释剂或者赋形剂，且对接受者没有毒害作用。

本文所用的术语“治疗剂”指用于治疗、对抗、缓解、预防或改善患者不需要的病症或疾病的试剂。本发明的实施方式部分涉及治疗糖尿病，或增加胰岛素生成，或治疗癌症或自体免疫、内分泌或心血管疾病。

组合物的“治疗有效量”或“有效量”是计算成达到所需效果的预定量，所需效果即是预防、缓解或减少癌症或自体免疫、内分泌或心血管疾病的症状。通过本方法的预期活性包括合适的医学治疗和/或预防性治疗。如本发明所述给予以获得治疗和/或预防效果的重组细胞特定剂量当然视情况的具体情形而定，所述具体环境包括例如，给予的编码蛋白、给药途径和治疗病症。所述重组细胞可以在广泛剂量范围内有效。然而，应理解，所给予的有效量将由医师视相关情形而定，所述相关情形包括待治疗病症、待给予的编码蛋白选择以及给药途径的选择，从而上述剂量范围不意在以任何方式限制本发明的范围。本发明重组细胞的治疗有效量通常是，在以生理上可耐受的赋形剂组合物形式给予时，足够达到有效全身浓度或组织局部浓度的量。

本文所用的术语“治疗”、“治疗的”、或“处理”指治疗性处理和预防性或防止措施，其中所述目的是防止或减缓(缓解)不良生理病症、紊乱或疾病，或获得有益或所需的临床结果。本文所用的术语“治疗”还包括预防不希望的生理病症、紊乱或疾病的发作、建立和传播。为了本公开的目的，有益或所需临床结果包括但不限于，缓解症状；减少所述病症、紊乱或疾病的程度；使所述病症、紊乱或疾病的状态稳定(即，不恶化)；使所述病症、紊乱或疾病的发作延迟或减缓进展；减轻所述病症、紊乱或疾病状态；和缓和(部分或总体)，不论是否可检测，或提高或改善所述病症、紊乱或疾病。治疗包括引发临床显著反应而不引起过高水平的副作用。治疗也包括与不接受治疗的预期生存相比延长生存。

一般而言，所述术语“组织”指类似专门细胞的任何聚集，其联合行使某一特定功能。

5.2.GLP-1、PDX-1、GIP和GLP-2

三种蛋白即GLP-1(胰高血糖素样肽1)、PDX-1(胰腺和十二指肠同源框基因1)和胃抑制性多肽(GIP)能刺激肠上皮细胞响应葡萄糖(GIP和GLP-1)或无关葡萄糖水平地(PDX-1)合成胰岛素。本领域已知第四种蛋白GLP-2在胃肠(GI)道内有许多作用。

GLP-1

胰高血糖素样肽1(GLP-1)源自高血糖素原基因的转录产物。GLP-1的体内主要来源是分泌GLP-1作为肠激素的肠L细胞。GLP-1(1-37)是GLP-1的细胞内前体，剪切自高血糖素原，且最前的六个氨基酸后续从N末端脱去，以形成生物活性肽。GLP-1的主要生物活性形式有：GLP-1(7-37)和优势循环活性形式GLP-1(7-36)酰胺。GLP-1由远端小肠的肠上皮响应葡萄糖和其它营养物而分泌。其半衰期很短，并且其在引流所述肠黏膜的血管中被二肽酰肽酶IV(DPP-4)降解。GLP-1通过结合膜受体GLP-1R而激活胰腺β细胞合成胰岛素，从而可以成为治疗1型和2型糖尿病的治疗剂。令人吃惊地发现，注射了GLP-1的肠上皮细胞可成为葡萄糖响应性胰岛素分泌细胞，并且后续外科移植GLP-1体外刺激的上皮细胞进入宿主会导致所述宿主内糖尿病的逆转。如本文公开的，认为生物失活形式GLP-1(1-37)能使肠细胞重编程成为葡萄糖响应性胰岛素分泌细胞。

GIP

GIP(也称作葡萄糖依赖性促胰岛素肽)，诱导胰岛素分泌，且主要可由十二指肠中葡萄糖的血清高渗透压刺激。GIP也被认为在通过刺激脂肪细胞中的脂蛋白酯酶活性对脂肪酸代谢具有显著作用。GIP源自由所述GIP基因编码的153个氨基酸的前蛋白，并作为有生物活性的42个氨基酸的肽循环。其由在十二指肠黏膜内和胃肠道空肠内发现的K细胞合成。与所有内分泌激素相似，其由血液运输。胃抑制性多肽受体是在胰腺内的β细胞上发现的七次跨膜蛋白。

PDX-1

此外，转录活化剂PDX-1刺激β细胞和肠上皮的胰岛素***。补充的肠细菌作为“益生菌”可广泛获得，并一般被食品和药品管理局视作安全的。使用共生菌株体内表达重组基因的潜在优势包括其与所述宿主的相容性(特别是所述宿主的免疫***)、其在肠内可控的持续性及其口服给药的能力。已报道各种重组细胞因子和抗原在动物模型内的共生细菌表达。

过去十年中，使干细胞重编程为β细胞或具有分泌胰岛素潜力的细胞已成为若干研究的主题。人们主要致力于体外生成用于移植的干细胞以及使胰腺或其它组织特异性干细胞在体内转换为β细胞。不希望受理论约束，相信失活形式的胰高血糖素样肽1(GLP-1(1-37))可激活发育并通过Notch信号通路使成人肠干细胞成为葡萄糖响应性胰岛素分泌细胞。体外孵育胚胎空肠(E14.5)和GLP-1并通过手术移植进入成年糖尿病大鼠能够逆转STZ诱导的1型糖尿病(T1DM)；但成年上皮细胞分化(从肠隐窝发生)并不产生显著数量的胰岛素生成细胞，从而大量分化为具有β样功能的细胞看来需要发育中胎儿(前E17)的增殖和假复层细胞。

GLP-2

全长胰高血糖素样肽2(GLP-2)是33个氨基酸的肽，与GLP-1共分泌自小肠和大肠中的肠内分泌细胞。类似于GLP-1，活性形式的GLP-2(1-33)由蛋白酶DPPIV剪切成失活形式的GLP-2(3-33)。本领域已知GLP-2在胃肠(GI)道内有许多作用，包括刺激小肠和大肠内的黏膜生长，抑制肠上皮细胞和隐窝细胞凋亡，刺激肠上皮细胞葡萄糖转运和GLUT-2表达，增加营养吸收，抑制胃排空和胃酸分泌，减少肠穿透性，刺激肠血流通，以及使肠平滑肌放松(10/3/2011访问的www.glucagon.com)。GLP-2在GI道外部也起作用，包括刺激大鼠星形细胞培养物中的细胞增殖(胰高血糖素样肽2刺激培养的大鼠星形细胞增殖，Eur JBiochem.2003Jul;270(14):3001-9；引用自10/3/2011访问的www.glucagon.com)。尽管血浆蛋白在给予啮齿动物或人GLP-2后不变化，但是GLP-2的药理学水平(比常规水平高约10倍)与正常人宿主的禁食和餐后状态的胰高血糖素循环水平增加相关(胰高血糖素样肽2刺激胰高血糖素分泌，增强脂质吸收，抑制人胃酸分泌；Gastroenterology.2006Jan;130(l):44-54；引用自10/3/2011访问的www.glucagon.com)。不希望受理论限制，相信GLP-2刺激肠内肠上皮细胞的细胞增殖。

5.3.重组细胞

本文描述的实施方式一般涉及分离的、改造的重组细胞在直接或间接治疗内分泌、心血管或自体免疫性疾病中的应用。

实施方式可涉及包含信号序列和启动子的重组细胞。在一些实施方式中，所述信号序列能够被所述重组细胞表达。在一些实施方式中，所述信号序列可导致治疗性蛋白质分泌至所述重组细胞的胞质外。在一些实施方式中，所述信号序列能够调控靶核酸的信号依赖性表达。在一些实施方式中，所述信号序列能够响应环境刺激而调控靶核酸的信号依赖性表达。在一些实施方式中，所述信号序列和启动子在所述重组细胞内的质粒上编码。在一些实施方式中，所述信号序列和启动子在所述重组细胞的核酸上编码。

在另一些实施方式中，所述信号序列可调控靶核酸的表达。在一些实施方式中，所述信号序列可响应环境刺激调控靶核酸的表达。在一些实施方式中，所述信号序列可以是GIP、GLP-1、PDX-1、其片段、其类似物或其组合。在一些实施方式中，所述靶标信号序列能够刺激疾病预防因子表达或抑制疾病引发因子的表达。在一些实施方式中，所述环境刺激可以是葡萄糖。在一些实施方式中，所述疾病预防因子可以包括胰岛素。在一些实施方式中，所述重组细胞的给予不会导致健康对象内的血液胰岛素水平增高。

在一些实施方式中，所述信号序列可包括胰高血糖素样肽1(GLP-1)或其片段或类似物。在一些实施方式中，GLP-1可包括GLP-1(1-37)、GLP-1(7-37)、GLP-1(7-36)酰胺或其组合。GLP-1的类似物是本领域已知的，将在下文中描述。如上所述，GLP-1源自高血糖素原基因的转录产物。GLP-1的体内主要来源是分泌GLP-1作为肠激素的肠L细胞。GLP-1的生物活性形式有：GLP-1-(6-37)、GLP-1-(7-37)和GLP-1-(7-36)NH2。这些肽由高血糖素原分子的选择性剪切造成。在某些实施方式中，还可使用长度为4-7、7-10、10-13、13-16、16-19、19-22、22-25、25-28、28-31、31-34或34-37个氨基酸的GLP-1片段。

在一些实施方式中，所述信号序列可包括胰高血糖素样肽2(GLP-2)或其片段或类似物。在一些实施方式中GLP-2可包括GLP-2(1-33)、GLP-2(3-33)或能够刺激疾病预防因子表达或抑制疾病引发因子表达的任何其它片段或类似物。GLP-2的类似物是本领域已知的，将在下文中描述。在循环中，GLP-2以两种分子形式GLP-2(1-33)和GLP-2(3-33)存在。类似于GLP-1，活性形式GLP-2(1-33)由蛋白酶DPPIV剪切成失活形式GLP-2(3-33)。已显示GLP-2在胃肠功能(消化、吸收、蠕动、上皮生长和血液流动)和骨再吸收的调节中起重要作用。因此，GLP-2或其类似物也许具有治疗疾病(例如克罗恩氏病和骨质疏松症)的治疗潜力。在某些实施方式中，还可使用长度为4-7、7-10、10-13、13-16、16-19、19-22、22-25、25-28、28-31或31-33个氨基酸的GLP-2片段。

在一些实施方式中，所述重组细胞可以是任何可转化的细菌细胞。在一些实施方式中，所述重组细胞可源自肠细菌或共生细菌。在一些实施方式中，所述重组细胞可源自益生细菌。在一些实施方式中，所述重组细胞可以是选自各种革兰氏阳性和革兰氏阴性家族的细菌，包括但不限于，埃希氏菌(Escherichia)、假单胞菌(Pseudomonas)、拟杆菌(Bacteroides)、乳杆菌(Lactobacillus)、乳球菌(Lactococcus)、芽孢杆菌(Bacillus)、变形杆菌(Proteus)、双歧杆菌(Bifidobacterium)、链球菌(Streptococcus)、葡萄球菌(Staphylococcus)和棒状杆菌(Corynebacterium)。在一些实施方式中，所述重组细胞可以是大肠杆菌菌株。在特定的实施方式中，所述重组细胞可以是大肠杆菌Nissle或乳杆菌。

在一些实施方式中，所述靶标核酸编码可促进宿主中正常生理过程功能的哺乳动物因子，或者对预防非感染性疾病在所述宿主内发作、建立或传播方面有效。在一些实施方式中，所述宿主内的非感染性疾病包括自体免疫性疾病、内分泌疾病、癌症、心血管疾病或其组合。在一些实施方式中，所述非感染性疾病可包括糖尿病。在一些实施方式中，所述非感染性疾病可包括1型糖尿病。在一些实施方式中，所述非感染性疾病可包括2型糖尿病。

提供用于递送生物活性化合物至肠上部腔(绒毛)侧的方法。所述方法可包括提供生存于肠道且分泌生物活性化合物的共生细菌。所述方法避免手术的潜在缺陷或血流中的降解是来自肠中繁殖的共生细菌的分泌信号。

该方法允许信号连续表达或响应局部刺激表达，随后转运通过肠黏膜而不是血液。实施方式可涉及包含信号序列和启动子的重组细胞。在一些实施方式中，所述信号序列能够被所述重组细胞表达。在一些实施方式中，所述信号序列可导致治疗性蛋白质分泌至所述重组细胞的胞质外。在一些实施方式中，所述信号序列能够调控靶核酸的信号依赖性表达。在一些实施方式中，所述信号序列能够响应环境刺激而调控靶核酸的信号依赖性表达。在一些实施方式中，所述信号序列和启动子在所述重组细胞内的质粒上编码。在一些实施方式中，所述信号序列和启动子在所述重组细胞的核酸上编码。

在一些实施方式中，所述重组细胞可以是任何可转化的细菌细胞。在一些实施方式中，所述重组细胞可以是肠细菌或共生细菌。在一些实施方式中，所述重组细胞可以是益生细菌。在一些实施方式中，所述重组细胞可以是选自埃希氏菌(Escherichia)、假单胞菌(Pseudomonas)、拟杆菌(Bacteroides)、乳杆菌(Lactobacillus)、乳球菌(Lactococcus)、芽孢杆菌(Bacillus)、变形杆菌(Proteus)、双歧杆菌(Bifidobacterium)、链球菌(Streptococcus)、葡萄球菌(Staphylococcus)和棒状杆菌(Corynebacterium)的细菌。在一些实施方式中，所述重组细胞可以是大肠杆菌菌株。在一些实施方式中，所述重组细胞可以是大肠杆菌Nissle。在一些实施方式中，所述目标核酸编码促进宿主中正常生理过程功能的哺乳动物因子，或者对预防非感染性疾病在所述宿主内发作、建立或传播方面有效。在一些实施方式中，所述宿主内的非感染性疾病包括癌症、或自体免疫性疾病、内分泌疾病、心血管疾病或其组合。在一些实施方式中，所述非感染性疾病可包括糖尿病。在一些实施方式中，所述非感染性疾病可包括1型糖尿病。在一些实施方式中，所述非感染性疾病可包括2型糖尿病。

在一些实施方式中，重组细胞包含启动子和信号序列。可以使用本领域已知的任何合适启动子。所述启动子可以是诱导型或组成型启动子。在一个特定实施方式中，所述启动子是葡萄糖响应性启动子。

在一个实施方式中，所述信号序列可包括GLP-1或其片段或类似物。在一些实施方式中，GLP-1的类似物可以选自他司鲁泰(taspoglutide)、艾塞那肽(exenatide)、醋酸艾塞那肽(exendin-4)、利拉鲁肽(liraglutide)、阿必鲁泰(albiglutide)、(Val8)GLP-1、NN9924、CJC-1131、AVE010、LY548806、美国专利号5,545,618描述的类似物等。

在其它实施方式中，所述信号序列可包括胰高血糖素样肽2(GLP-2)或其类似物。GLP-2是33个氨基酸的肽，与GLP-1共分泌自小肠和大肠中的肠内分泌细胞。尽管血浆葡萄糖在给予啮齿类动物或人GLP-2后不变化，GLP-2的药理学水平(比常规水平高约10倍)与胰高血糖素在正常人对象内的禁食和餐后状态中胰高血糖素的循环水平增加相关。GLP-2还以小肠和结肠的生长因子形式起作用。所述信号序列是GLP-2的本文所公开方法可用于治疗疾病例如1型和2型糖尿病、肥胖相关糖尿病、化疗诱导的腹泻；炎性肠病、心室和心房纤颤、手术后器官衰竭、肠易激综合症、间质性膀胱炎/膀胱痛综合症、短肠综合症、溃疡性结肠炎、代谢综合症、克罗恩氏病、骨质疏松症，或可用于在任何类型的肠手术之后治疗宿主。

GLP-2的类似物是本领域熟知的。在一些实施方式中，GLP-2的类似物选自脊椎动物中天然出现的GLP-2和GLP-2的自然出现形式的类似物，GLP-2类似物引起促肠生长效果且相对于给定脊椎动物GLP-2在结构上有变化，这是通过添加、删除、替代至少一个氨基酸，或通过纳入带有保护基团的一个或多个氨基酸。GLP-2的其它类似物描述于美国专利号5,834,428、5,994,500，其通过引用全文纳入本文。

所述GLP-2的多种脊椎动物形式包括例如大鼠GLP-2及其同源物，包括公牛GLP-2、猪GLP-2、八齿鼠GLP-2、牛GLP-2、豚鼠GLP-2、仓鼠GLP-2、人GLP-2、虹鳟鱼GLP-2和鸡GLP-2，所述多种GLP-2的序列已被许多作者报道，包括Buhl等，J.Biol.Chem.,1988,263(18):8621；Nishi和Steiner,Mol.Endocrinol.,1990,4:1192-8；以及Irwin和Wong,Mol.Endocrinol.,1995,9(3):267-77。脊椎动物GLP-2的类似物可以使用肽化学的标准技术生成，并按照本文提供的指南评价其促肠生长活性。本发明特别优选的类似物是基于人GLP-2序列的那些类似物，所述人GLP-2序列如下：

His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp(SEQ ID NO:1)

其中，一个或多个氨基酸残基可由其它氨基酸残基保守性取代，只要所述类似物仍保持促肠生长活性，例如小肠生长、胰岛生长和/或在脊椎动物内增加隐窝/绒毛高度。任何天然出现的GLP-2中保守取代优选人GLP-2序列，定义为与以下五组内的任意组交换：

I.Ala、Ser、Thr、Pro、Gly

II.Asn、Asp、Glu、Gln

III.His、Arg、Lys

IV.Met、Leu、He、Val、Cys

V.Phe、Tyr、Trp。

包括任何脊椎动物GLP-2序列中氨基酸的非保守取代，前提是所述非保守取代出现在分离自不同物种的GLP-2中已知不同的氨基酸位置。非保守残基位置通过比对所有已知脊椎动物GLP-2序列即可简单测定(参见例如Buhl等,J.Biol.Chem.,1988,263(18):8621；Nishi和Steiner,Mol.Endocrinol.,1990,4:1192-8)。在一些实施方式中，哺乳动物中变化且可被非保守残基取代的氨基酸位置可以是13、16、19、20、27和28位。脊椎动物中变化且还可被非保守残基取代的其它氨基酸残基出现于2、5、7、8、9、10、12、17、21、22、23、24、26、29、30、31、32和33位。或者，非保守取代可以在任何位置进行，其中丙氨酸扫描突变显示对于用丙氨酸取代氨基酸残基的突变有一些耐受性并不破坏所有促肠生长活性。丙氨酸扫描突变技术由Cunningham和Wells,Science,1989,244:1081描述，其通过引用全文纳入本文。由于大多数GLP-2序列仅由约33个氨基酸构成(人GLP-2中已在四个位置出现)，本领域技术人员可以容易地按照下文实施例指导在各个剩余位置检测丙氨酸类似物的促肠生长作用。

通过比对脊椎动物GLP-2的已知序列，已构建出一个通式，所述通式考虑了这些GLP-2种类间显著的序列同源性，以及已知种间不同的残基。该式可用于指导选择用于取代、添加、删除或通过添加氨基酸保护基团修饰的特定优选非保守残基。因此，与本发明的其中一个方面一致，本发明所包括脊椎动物GLP-2的具体类似物是符合下面所示通式(SEQ ID NO:2)的那些脊椎动物GLP-2和GLP-2类似物：

Rl-[Y]m-His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-AsnThr-aa1-Leu-Asp-aa2-Leu-Ala-aa3-aa4-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-aa5-aa6-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-[X]n-R2(SEQ ID NO:2)

其中，aa代表任何氨基酸残基，aa1至aa6是已知在获自不同物种的多种GLP-2序列间不同的那些残基位置，并且：

X是选自组III的一个或两个氨基酸残基，例如Arg、Lys或Arg-Arg

Y是选自组III的一个或两个氨基酸残基，例如Arg、Lys或Arg-Arg

m是0或1；

n是0或1；

R1是H或N末端保护基团；和

R2是OH或C末端保护基团。

在本发明的若干实施方式中，aa1至aa6定义如下：

Aa1选自组IV：

aa2选自组I或组II；

aa3选自组I；

aa4选自组III；

aa5选自组IV；

aa6选自组II或组III。

在本发明特别优选的实施方式中，aa1至aa6选自已知在分离自不同物种的GLP-2中位置上出现的残基，如下：

aa1是Ile或Val；

aa2是Asn或Ser；

aa3是Ala或Thr；

aa4是Lys或Arg；

aa5是Ile或Leu；和

aa6是Gln或His。

人或大鼠的GLP-2仅在第19位氨基酸残基上彼此不同。人序列中，该残基是丙氨酸；在大鼠GLP-2中，第19位是苏氨酸。因此，本发明包括的特定GLP-2或GLP-2类似物在第19位有可变残基。在本发明的这些实施方式中，GLP-2肽符合下面所示的SEQ ID NO:3：

R1-[Y]m-His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-AsnThr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-aa3-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-[X]n-R2(SEQ ID NO:3)

其中，aa3、Y、m、X、n、R1和R2如上定义。

在其它实施方式中，所述信号序列可包含分泌肽或其类似物、片段或部分，包括但不限于GLP-1、PDX-1、GIP、GLP-2、胰岛素、生长激素、促乳素、降钙素、黄体生成激素、甲状旁腺激素、促生长素抑制素、促甲状腺激素、血管活性肠多肽、三叶因子、细胞和组织修复因子、转化生长因子β、角质细胞生长因子，采用反平行4α螺旋束结构的第1结构组细胞因子例如IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、GM-CSF、M-CSF、SCF、IFN-γ、EPO、G-CSF、LIF、OSM、CNTF、GH、PRL或IFNα/β，通常与细胞表面相关的形成对称同源三聚体且其亚基采用就某些病毒包被蛋白所述β胶状辊构型的第2结构组细胞因子，例如TNF细胞因子家族，例如TNFα、TNFβ、CD40、CD27或FAS配体，IL-1细胞因子家族、成纤维生长因子家族、血小板衍生生长因子、转化生长因子p和神经生长因子，第3结构组细胞因子，包括作为大型跨膜前体分子生成的各在胞外区域含有至少一个EGF结构域的短链α/β分子，例如上皮生长因子家族细胞因子、以其所含氨基酸序列围绕保守半胱氨酸残基分组为特征的趋化因子(C-C或C-X-C趋化因子亚组)或胰岛素相关细胞因子，显示嵌合体结构的第4结构组细胞因子，例如由不同结构域构成的调蛋白或神经调节蛋白，所述结构域例如EGF、免疫球蛋白样和三环结构域。这些分泌肽的生物活性类似物、片段和部分是本领域已知的。

在一些实施方式中，所述重组细胞可包含诱导型启动子。在一些实施方式中，所述启动子可以是葡萄糖响应性启动子。在一些实施方式中，所述启动子可以是fliC启动子。在一些实施方式中，所述重组细胞还可包含分泌标签。在一些实施方式中，所述分泌标签可以是fliC分泌标签。在一些实施方式中，所述分泌标签可以是α-血溶素(HlyA)分泌标签。在一些实施方式中，所述重组细胞还可包含细胞穿透肽(CPP)序列。在一些实施方式中，所述重组细胞能够表达所述信号序列为融合蛋白，所述融合蛋白包含由所述信号序列编码的信号和由所述细胞穿透肽序列编码的细胞穿透肽。

5.4.治疗方法

提供治疗疾病或紊乱的方法。在一个实施方式中，所述方法可包括向有病症的宿主给予所述细胞，所述细胞有效刺激疾病预防因子表达或抑制疾病引发因子表达。在一些实施方式中，所述疾病可以是自体免疫性疾病、癌症、内分泌疾病、代谢疾病、心血管疾病或其组合。

在一些实施方式中，所述疾病或紊乱可以是(或包括)糖尿病(包括但不限于1型和2型糖尿病以及肥胖相关的糖尿病)、肥胖、代谢综合症、克罗恩氏病、苯丙酮尿症、槭树糖浆尿病、组氨酸血症、高血糖症、糖尿病性视网膜病、冠心病、毛细管间肾小球硬化症、肾病、神经病、四肢溃疡或坏疽、动脉粥样硬化、高端固醇血症、高血压、高蛋白血症、蛋白尿症、骨质疏松、贫血、高脂蛋白血症、酮酸中毒、高甘油三酯血症、乳酸性酸中毒、心肌病、威尔逊病、脑白质病、岩藻糖苷病以及癌症，例如胃肠癌、胃癌、胆囊癌、胃肠基质肿瘤、肝癌、胰腺癌、结肠癌、化疗诱导的腹泻；炎性肠病、心室和心房纤颤、手术后器官衰竭、肠易激综合症、膀胱炎/膀胱痛综合症、短肠综合症、溃疡性结肠炎或骨质疏松症。

本文公开的方法还可用于在任何类型的肠手术后治疗宿主。

如本文公开方法所述待给予细胞的有效(或“治疗上有效的”)量可以利用本领域已知的方法确定。所述有效量可以取决于所述不希望的生理状况或疾病的程度、给药途径和/或本领域技术人员已知的其它因素。例如，在不同的实施方式中，所述细胞的有效量可以是至少约10⁴CFU/kg，至少约10⁵CFU/kg，至少约10⁶CFU/kg或至少约10⁷CFU/kg。在其它实施方式中，所述细胞的有效量是约10⁴～10¹⁴CFU/kg、10⁹～10¹²CFU/kg或10¹⁰～10¹¹CFU/kg宿主体重。在另一个实施方式中，所述细胞的有效量是约1×10¹⁰、2×10¹⁰、3×10¹⁰、4×10¹⁰、5×10¹⁰、6×10¹⁰、7×10¹⁰、8×10¹⁰、9×10¹⁰或10×10¹⁰CFU/kg宿主体重。

例如，在一个实施方式中，所述有效量可以如下计算。假设希望以约4.0×10¹¹CFU/g的益生补充形式(若市售可得)给予8×10¹⁰CFU/kg的量，并假设人体重范围是儿童25kg～成人75kg，这意味着每日剂量是5～15g/d。然而，如果定殖效率比Rao.S等人报道的高2个数量级(参见Rao,S.等.Toward a livemicrobial microbicide for HIV:Commensal bacteria secreting an HIV fusioninhibitor peptide(用于HIV的活微生物杀微生物剂：分泌HIV融合抑制剂肽的共生细菌);Proc Natl Acad Sci USA102,11993-11998(2005))，那么所述剂量为50～150mg/d。在其它实施方式中，所述剂量是10～100、100～200、200～300、300～400、400～500、500～600、600～700、700～800、800～900、900～1000或1000～2000mg/d。

还提供用于将肠上皮细胞重编程为葡萄糖响应性胰岛素分泌细胞的方法。在一个实施方式中，所述方法可包括给予包含启动子和信号序列的重组细胞的步骤。实施方式可以涉及通过给予包含启动子和信号序列的重组细胞来治疗糖尿病的方法。在另一些实施方式中，所述信号序列可调控靶核酸的表达。在一些实施方式中，所述信号序列可响应环境刺激调控靶核酸的表达。在一些实施方式中，所述信号序列可以是GIP、GLP-1、GLP-2、PDX-1、其片段、其类似物或其组合。在一些实施方式中，所述靶标信号序列能够刺激疾病预防因子表达或抑制疾病引发因子的表达。在一些实施方式中，所述环境刺激可以是葡萄糖。在一些实施方式中，所述疾病预防因子可以包括胰岛素。在一些实施方式中，所述重组细胞的给予不会导致健康宿主内的血液胰岛素水平增高。

还提供用于降低血糖水平的方法。在一个实施方式中，所述方法可包括向需要的宿主给予有效量的重组细胞。在一些实施方式中，所述方法降低血糖水平使宿主具有血糖量正常的血糖水平。在一些实施方式中，所述方法在治疗30天后使血糖水平降低约20%～约80%，约30%～约70%，或约40%～约60%。在所述宿主是高血糖症患者的一些实施方式中，给予所述重组细胞减少或消除所述宿主对治疗性给予外源胰岛素的需求。在一些实施方式中，所述重组细胞响应所述宿主内的葡萄糖水平。例如，在所述宿主葡萄糖水平仅略微升高的一些实施方式中，所述重组细胞发挥作用以仅降低葡萄糖水平，从而其达到血糖正常水平且不导致血糖不足。

还提供用于提高血液胰岛素水平的方法。在一个实施方式中，所述方法包括向需要的宿主给予有效量的重组细胞。在些些实施方式中，所述提高血液胰岛素水平的方法使所述宿主拥有血糖正常水平。在一些实施方式中，所述方法响应葡萄糖提高血液胰岛素水平。在一些实施方式中，所述方法在治疗30天后使血液胰岛素水平增加约20%～约80%，约30%～约70%，或约40%～约60%。

还提供用于重编程(或分化)肠细胞的方法。在一个实施方式中，所述肠细胞是肠上皮细胞，例如，肠内分泌细胞、潘纳斯(paneth)细胞、吸收型肠上皮细胞或杯状细胞。在一个实施方式中，所述方法包括向肠细胞给予或定位有效量的重组细胞。所述方法可以在体外或体内进行。所述方法还可包括向需要的宿主或患者给予所述重编程、分化或预处理的肠细胞。所述方法还可包括向需要的宿主或患者内移植所述重编程、分化或预处理的肠细胞。

还提供用于重编程肠上皮细胞的方法。所述方法可相对更传统的病毒介导方法有若干益处。不希望受理论限制，通过使用共生细菌来递送GLP-1，举例而言，可以避免GLP-1在引流肠黏膜的血管***中被酶降解。GLP-1可从腔侧直接穿透至肠隐窝而不暴露于血液。在所述肠隐窝中，肠干细胞发育成为4种肠上皮细胞。一种类型的肠上皮细胞即肠内分泌细胞，分泌激素进入脉管***。不希望受理论限制，认为肠内分泌细胞在细菌分泌的GLP-1存在下成为胰岛素分泌细胞。可以开发所述细菌系使肠干细胞分化成为若干不同类型的细胞，基本替代可能在身体其它部位缺失的功能。示例包括β细胞外部(例如，a细胞)的其它胰腺功能，并甚至可能是甲状腺、肝细胞或免疫响应性功能。

在某些实施方式中，本文公开的重编程细胞的方法可以在体外使用以重编程细胞并使所述细胞增殖。随后可以利用本领域已知的方法收获所述重编程的细胞并将其给予(或植入)所述宿主。

5.5.诊断方法和应用

在一些实施方式中，所述重组细胞可与其它治疗性化合物联合给予。在具体的实施方式中，所述重组细胞可与具有协同作用的化合物联合给予。在其它实施方式中，所述重组细胞可与以下物质共同给予：DPP-4抑制剂、GLP-2、GLP-1激动剂、二甲亚砜、胰岛素、α-葡萄糖苷酶抑制剂、普兰林肽、美格列奈、瑞格列奈、那格列奈、氯磺丙脲、甲福明二甲双胍、磺脲、格列甲嗪、格列本脲、格列美脲、噻唑烷二酮类、其片段、其类似物或其组合。DPP-4抑制剂的例子包括西他列汀、维格列汀、沙格列汀、利拉利汀、度格列汀、吉格列汀、阿格列汀、黄连素等。

例如，在一些方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物含有如上定义的重组细胞以及药学上可接受的运载体或稀释剂，或有效量的含有如上所定义重组细胞的药物组合物。在一些实施方式中，所述药物组合物还可包含一种或多种稳定剂。

在使用共生细菌的本文所公开方法的实施方式中，额外的优势是，所述共生细菌作为益生菌通过至少100年的应用已建立了安全性，这是病毒介导方法中所缺乏的。此外，如果需要，通过普通抗生素可容易地损毁共生细菌。使用共生细菌的另一个优势是，它们能配备反馈环，使其准确控制GLP-1分泌与特定腔信号(例如葡萄糖或IL-8)一致。此外，已显示应用GLP-1使肠上皮细胞响应葡萄糖，其对肠上皮细胞的胰岛素剂量的控制大体上与健康个体中β细胞介导的胰岛素控制方式相同。最后，使用共生细胞重编程肠上皮细胞可最终产生对1型、2型糖尿病和代谢综合症的简单、口服给药且有效的治疗。

5.6.给药途径和配制

本发明的重组细胞可以传统方式通过使其保持活性的任何途径给予。使所述重组细胞保持活性的有效途径可以利用本领域已知的方法确定。所述重组细胞可以通过全身、局部或口服给予。例如，给药途径可以是但不限于胃肠外、皮下、静脉内、肌肉内、腹膜内、透皮、口服、含服或经眼途径或***内，通过吸入、积存注射或移植给药。因此，本文所公开用于所述重组细胞的给药模型(单独使用或与其它药物联用)可以是但不限于，舌下、可注射(包括短效的、长效的、植入的、珠或团粒形式经皮下或肌肉内注射)，或通过使用***乳膏、栓剂、***栓剂、***环、直肠栓剂、子宫内装置和经皮形式例如贴片或乳膏。

给药的特定模型将取决于所给指示。特定给药途径和剂量方案的选择由临床医师根据临床临床已知方法来调整或滴定测量，以获得最优临床响应。待给予的重组细胞量是治疗有效的量。用于给药的剂量取决于接受治疗的宿主的特征，例如，治疗的具体动物、年龄、体重、健康状况、并行治疗的类型（若有），以及治疗的频率，这些可以由本领域技术人员(例如，由临床医师)简单地确定。包含所述重组细胞和合适运载体的药学制剂可以是含有有效量所述重组细胞的以下剂型：固体剂型，包括但不限于，片剂、胶囊、扁囊剂、粒料、丸剂、粉剂和粒剂；局部剂型，包括但不限于溶液、粉剂、流体乳液、流体混悬液、半固体、软膏、糊剂、乳膏、凝胶和胶冻，以及泡沫剂；胃肠外剂型，包括但不限于溶液、混悬液、乳剂、干粉。本领域也已知，所述活性成分可含在有药学上可接受的稀释剂、填充剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、表面活性剂、疏水载剂、水溶性载剂、乳化剂、缓冲剂、润湿剂、保湿剂、增溶剂、防腐剂等的制剂中。本领域已知给药方式和方法，并且技术人员可参考各种药学参考文献寻求指导。例如，可以查阅Modern Pharmaceutics(《现代药剂学》)，Banker和Rhodes编，马塞尔·德克尔公司(Marcel Dekker,Inc.)(1979)；以及Goodman&Gilman’s The Pharmaceutical Basis of Therapeutics(《古德曼吉尔曼治疗学的药理学基础》)，第6版，纽约的麦克米兰出版有限公司(MacMillan PublishingCo.)(1980)，以及Remington’s:The Science and Practice of Pharmacy(《雷明顿：药物科学和实践》)，第21版，马里兰州巴尔的摩市的利平科特.威廉姆斯.威尔金斯（Lippincott Williams&Wilkins）公司。

所述重组细胞可以配制用于通过注射的胃肠外给药，例如，通过推注注射或连续输注。所述重组细胞可以通过皮下连续输注约15分钟～约24小时给药。用于注射的制剂可以是单位剂型，例如，装在安瓿或多剂量容器中，添加有防腐剂。该组合物可以是诸如油性或水性载剂中的悬浮液、溶液或乳剂的形式，可含有配方试剂，如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。

对于口服给药，所述重组细胞可以通过组合这些重组细胞和本领域熟知的药学上可接受运载体而容易地配制。

所述载剂能使本发明重组细胞配制为例如片剂、丸剂、糖衣剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、混悬液等，所述制剂由待治疗的患者口服咽下。可通过以下方法获得口服用途的药物制剂：加入固体赋形剂，任选地研磨所得混合物，并在加入合适的辅助剂(如果需要)后加工该颗粒混合物，以获得片剂或糖衣丸芯体。合适的赋形剂包括但不限于填充剂如糖(包括但不限于乳糖，蔗糖，甘露醇和山梨醇)；纤维素制剂(包括但不限于玉米淀粉、小麦淀粉、水稻淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和聚乙烯吡咯烷酮(PVP))。需要的话，可加入崩解剂，例如但不限于交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、藻酸或其盐如藻酸钠。

糖衣剂芯体能具有合适包衣。出于这种目的，可使用浓缩糖溶液，其可任选地含有***胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可将染料或颜料加入片剂或糖衣剂包衣中，用于鉴别或表征活性重组细胞剂量的不同组合。

可口服使用的药物制剂包括但不限于明胶制成的推入适配(push-fit)胶囊，以及明胶和增塑剂如甘油或山梨醇制成的密封软胶囊。推入适配胶囊可含有活性成分，该活性成分可与填充剂如乳糖、粘合剂如淀粉和/或润滑剂如滑石粉或硬脂酸镁以及任选的稳定剂混合。在软胶囊中，活性重组细胞可溶解或悬浮于合适液体如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇中。此外，可加入稳定剂。所有的口服给予制剂的剂量应该适合该给药方式。

就含服给药而言，该组合物可采用例如常规方式配制的片剂或锭剂形式。

在一个实施方式中，所述制剂是控释制剂。美国专利8,007,777(Borek等，2011年8月30日)公开了益生菌的控释制剂的本领域已知示例。所述制剂可包含亲水剂、电解剂和多糖，并且可以是用于口服递送至肠***的单层芯片剂形式。

在一个具体实施方式中，喷雾干燥所述重组细胞并将所述干燥细胞用本领域已知的标准方法包封。优选使所述细胞在包封前完全干燥。

其它优选的给药途径和制剂可由技术人员通过参考标准药学参考文献的指导来确定。例如，Remington’s:The Science and Practice of Pharmacy(《雷明顿：药物科学与实践》)，第21版，马里兰州巴尔的摩市的利平科特.威廉姆斯.威尔金斯公司(2006)，第45～47章，,Chapters45-47，公开了可以用于本文所公开重组细胞和方法的合适口服固体剂型，药学剂型的包衣以及延长释放和靶向药物递送***。

就吸入给药而言，使用合适推进剂(如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体)以加压包装或喷雾器中气溶胶喷雾的形式常规递送本发明使用的重组细胞。在加压气溶胶的情况下，可通过提供阀门递送计量用量来以确定剂量单位。用于吸入器或吹入器的胶囊和药筒(例如，由明胶组成)可配制成含有所述重组细胞和合适粉末基料如乳糖或淀粉的粉末混合物。

本发明的重组细胞也可配制成直肠组合物，例如栓剂或滞留灌肠剂，例如含有常规栓剂基料，如可可油或其他甘油酯。

除前述制剂外，所述重组细胞也可配制成长效制剂。这种长效制剂可通过植入(例如皮下或肌肉内植入)或肌肉内注射给药。积存注射可以给药约1～约6个月或更长时间。因此，例如，所述重组细胞也可用合适的聚合物材料或疏水材料(例如，溶于可接受油的乳剂)或离子交换树脂配制，或者配制成微溶性衍生物(例如，微溶性盐)。

在经皮给药中，例如可将本发明的重组细胞施加至膏药或可通过提供给生物体的经皮治疗***应用。

所述重组细胞的药物组合物也能包括合适的固体或凝胶体相运载体或赋形剂。所述运载体或赋形剂的例子包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖、淀粉、纤维素、衍生物、明胶和聚合物(例如，聚乙二醇)。

所述重组细胞还能与其它活性成分联合给药，所述活性成分例如佐剂、蛋白酶抑制剂或其它相容的药物或重组细胞，其中观察到所述联合是所希望的或有利于达到本文所述方法的所需效果。

在一些实施方式中，所述崩解剂成分包括交联羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钙、交聚维酮、褐藻酸、海藻酸钠、海藻酸钾、海藻酸钙、离子交换树脂、基于食物酸和碱性碳酸盐成分的泡腾***、粘土、滑石、淀粉、预胶化淀粉、羟乙酸淀粉钠、纤维素絮体、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、硅酸钙、金属碳酸盐、碳酸氢钠、柠檬酸钙、或磷酸钙中的一种或多种。

在一些实施方式中，所述稀释成分包括甘露醇、乳糖、蔗糖、麦芽糊精、山梨糖醇、木糖醇、粉末状纤维素、微晶纤维素、羧甲基纤维素、羧乙基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、甲基羟乙基纤维素、淀粉、羧甲基淀粉钠、预胶化淀粉、磷酸钙、金属碳酸盐、金属氧化物或金属铝硅酸盐中的一种或多种。

在一些实施方式中，可选润滑剂成分（存在时）包括硬脂酸、金属硬脂酸盐、硬脂酰醇富马酸钠、脂肪酸、脂肪醇、脂肪酸酯、甘油二十二烷酸酯、矿物油、植物油、石蜡、亮氨酸、硅石、硅酸、滑石、丙二醇脂肪酸酯、聚乙氧基化蓖麻油、聚乙二醇、聚丙二醇、聚亚烷基二醇、聚氧乙烯甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯脂肪醇醚、聚乙氧基化固醇、聚乙氧基化蓖麻油、聚乙氧基化植物油或氯化钠中的一种或多种。

通过说明的方式，而非限制性方式提供以下实施例。

6.实施例

6.1.实施例1:大肠杆菌Nissle中的GLP-1组成型表达

该实施例显示大肠杆菌Nissle中的GLP-1组成型表达。

质粒构建：所有克隆使用前述技术进行(Sambrook,J.和Russell.D.W.Molecular cloning:a laboratory manual(《分子克隆：实验室手册》).第三版，纽约冷泉港的冷泉港实验实出版社（Cold Spring Harbor Laboraory Press）；2001年)。图1显示该研究中所用质粒的示意图。为研究来自大肠杆菌DH5α的P0/P1启动子，制备两种质粒(pFDl和pFD2)。pFD1编码完整P0/P1区域以驱动增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达。pFD2仅编码EGFP上游启动子的P0区域。为就刺激Caco-2细胞内胰岛素分泌测试重组细菌的促胰岛素蛋白的分泌功效，如本文所述构建质粒pFD-PDX、pFD-GLP和pFD-20。图2显示P0和P0/P1对葡萄糖的响应。利用EGFP表达来测量P0和/或P1启动子对不同介质条件的响应。Po=仅P0；P0+P1=P0加P1侧接区域；DH5α=lac操纵子对照。为了测试所述葡萄糖响应性启动子***响应葡萄糖生成重组蛋白的功效，将来自大肠杆菌DH5α的两种长度的葡萄糖响应性启动子区TA克隆进入pGlow-GFP下游，并与GFP同框(结果示于图2)。所述由P0启动子或覆盖P0和P1启动子的区域组成的2个构建体(Ryu,S.和Garges,S.Promoter Switch in the Escherichia coli Pts Operon(大肠杆菌Pts操纵子中的启动子开关).Journal of Biological Chemistry269,4767-4772(1994))与所述GFP起始区域同框且在其上游。简而言之，将来自大肠杆菌DH5α基因组DNA的P0区克隆至pGLOW-GFP(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen))，以制备(pFD2)。将P0/P1区克隆至pGLOW-GFP，以制备pFD1。为了在Nissle中表达哺乳动物PDX-1基因。如下所述构建质粒pFD-PDX。使用两轮高保真PCR(加利福尼亚州拉霍亚的司查塔基公司(Stratagene))获得表达盒6XHis-Xpress-EK-PDX-l-CPP。通过高保真PCR从DH5α获得全长FLIC。将这两个片段克隆进入pBluescript-KS以生成6XHiS-Xpress-EK-PDX-l-CPP-FLIC。然后，将所述6XHiS-Xpress-EK-PDX-1-CPP-FLIC片段克隆到pGLOW-P0-GFP内以生成载体(pFD-PDX)，所述载体使用大肠杆菌的P0启动子以驱动6XHiS-Xpress-EK-PDX-l-CPP-FLIC表达。

为在大肠杆菌Nissle中组成型表达蛋白GLP-I，如下所述构建质粒pFD-GLP。合成制备(IDT，爱荷华州科拉尔维尔市)序列6XHiS-Xpress-EK-GLP-1(1-37)。通过高保真PCR将该片段***pBluescript-KS，以制备pBluescript-GLP。

使用高保真PCR将pKS104的5’UTR-FLIC20序列克隆至pBluescript-GLP内，生成pBluescipt-20-GLP。该所得载体包含以下序列5'UTR-FLIC20-6XHis-Xpress-EK-GLP-1(1-37)。通过高保真PCR将该序列克隆至pKS121内(含有FLIC的3'UTR)以获得构建体：5'UTR-FLIC20-6XHis-Xprcss-EK-GLP-1(1-37)-3'UTR。

为获得pFD-20，使用高保真PCR克隆来自pFD-GLP的5'UTR-FLIC20-6XHis-Xpress-EK序列。将所述PCR片段克隆至pKS121内以获得构建体：5’UTR-FLIC20-6XHis-Xpress-EK。从芬兰赫尔辛基大学的Benita

实验室获得pKS104和pKS121。然而，pKS104和pKS121的序列也可以从市售来源获得，或使用常规方法直接从基因组获得(例如，从GenBank下载的序列，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)并使用本领域已知的标准方法构建。

6.2.实施例2：改造大肠杆菌以分泌GLP-1或PDX-1-CPP

大肠杆菌Nissle1917(非处方益生菌，在下文中称作Nissle)改造成在fliC启动子控制下分泌GLP-1(氨基酸1～37)或在葡萄糖响应性元件控制下分泌PDX-1-CPP。PDX-1作为与细胞穿透肽(CPP)的融合体分泌，以促进快速进入所述分泌后的上皮细胞。PDX-1在葡萄糖响应性启动子元件的控制下分泌，几乎没有观察到所述启动子元件的泄露表达。细胞生长6～8h，标准化至600nm的光密度（1），并离心。图3显示Nissle上清和Nissle细胞团中分泌蛋白GLP-1(上方印迹)和PDX-1-CPP(下方印迹)的Western印迹。参考图3，裂解所述团块，并测定各个蛋白的量(“C”部分)。保存上清并对其作类似分析(“M”部分)。对于表达PDX-1-CPP的细胞，比较生长于含葡萄糖(0.4%)或甘油三酯(0.4%)的培养基中的细胞。使用表达空质粒(20)的细胞作为阴性对照。从这些数据明显可见，两种蛋白都有分泌。

6.3.实施例3：改造成分泌GLP-1或PDX-1-CPP的大肠杆菌Nissle的胰岛素分泌诱导

该实施例显示改造成分泌GLP-1或PDX-1-CPP的大肠杆菌Nissle的胰岛素分泌诱导

为测试改造的Nissle菌株是否能诱导人上皮细胞分泌胰岛素，用来自表达PDX-1-CPP、GLP-1或20个氨基酸序列标签(作为阴性对照)的Nissle菌株过夜培养物的无细胞培养基(CFM)培养Caco-2细胞。所述过夜培养物在无葡萄糖的F-12K培养基（弗吉尼亚州马纳萨斯的Mediatech）(除了PDX-1菌株，该菌株需要葡萄糖来生成PDX-1)中生长。在无葡萄糖的新鲜F-12K培养基和来自Nissle过夜培养物的CFM的1:1混合物中培养所述Caco-2细胞16小时(所述Nissle分泌PDX-1-CPP(“P”)、GLP-1(“G”)、20个氨基酸序列标签(“20”)或PDX-1-CPPCFM和GLP-1CFM的1:1组合物(“GP”))，然后移去培养基，所述Caco-2细胞在含葡萄糖(0.4%)或甘油三酯(0.4%)的培养基中培养2小时。在葡萄糖负荷试验后，分析各样品的胰岛素分泌和转录。作为阳性对照，Caco-2细胞在新鲜F-12K培养基(无葡萄糖)中孵育相同16小时的时间段从而取得GLP-1(氨基酸1-37)，然后用葡萄糖(0.4%)或甘油三酯(0.4%)培养2小时。

转录实验数据和酶联免疫吸附实验数据都指示，用GLP-1和PDX-1-CPP共同或单独来源的CFM孵育的人上皮细胞经刺激生成胰岛素(图4A-B)。采用GLP-1(氨基酸1-37)CFM孵育一直观察到最大胰岛素生成。不论PDX-1-CPPCFM是单独添加还是与GLP-1一起添加，PDX-1-CPP CFM都刺激葡萄糖响应性胰岛素分泌。GLP-1-和PDX-1-介导的胰岛素分泌都响应葡萄糖而发生。用来自20个氨基酸序列标签的CFM过夜培养的阴性对照上皮细胞不显示葡萄糖响应性胰岛素生成(图4A-B)。PDX-1-CPP处理导致的Caco-2细胞中葡萄糖响应性胰岛素分泌(图4A-B)是意料之外的。

就10⁶～10⁹CFU mL范围的Nissle存活力水平而言，估计血液中的胰岛素水平为164fmol/L～164pmol/L。成人非糖尿病患者得到的餐后血清胰岛素浓度高达400pmol/L，未优化的改造细菌能够刺激与正常代谢所需至少相同数量级的胰岛素释放。

6.4.实施例4：使肠细胞重编程为葡萄糖响应性胰岛素分泌细胞

该实施例显示使肠细胞重编程为葡萄糖响应性胰岛素分泌细胞。

使用前述fliC启动子和分泌标签改造Nissle使其分泌GLP-1(1-37)。

图5中显示***Nissle的盒。

在该菌株培养中验证GLP-1的分泌，并与携带含有相同序列但不带pKD3染色体***盒(图5)的质粒的菌株分泌作比较。Nissle-GLP-1的分泌量是携带质粒菌株的约一半，而体内测试显示在用任一菌株处理的小鼠之间的葡萄糖水平没有显著差异(图6)。因此，在这些研究中使用Nissle-GLP-1替代携带质粒上GLP-1的菌株。喂食Nissle-GLP-1的小鼠显示重组蛋白的显著体内表达(由组氨酸标签染色测定)(图5)。

为研究简单口服给药改造成分泌GLP-1的人共生细菌菌株是否能够通过使肠细胞重编程成为葡萄糖响应性胰岛素分泌型细胞来改善1型糖尿病小鼠模型中的高血糖症，每天用改造成分泌GLP-1(1-37)的共生细菌(Nissle-GLP-1)喂食经链脲霉素(链佐星，

)(STZ)处理的小鼠。Nissle-GLP-1在葡萄糖耐量测试中显著降低小鼠血糖水平，并显著增加了胰岛素水平。用Nissle-GLP-1喂食的健康(非糖尿病)小鼠的血糖水平或重量没有变化。用Nissle-GLP-1处理的小鼠的肠上部绒毛中发展出了胰岛素分泌细胞。胰岛素分泌细胞与嗜铬粒蛋白A(Chr-A)的免疫共染色显示细菌介导肠内分泌细胞重编程为“β-样”细胞。这些结果证明，用于治疗或改善1型糖尿病的方法(所述方法包括给予改造成分泌GLP-1的人共生细菌菌株)能够以花费很低的口服方式实行。

6.5.实施例5：用表达GLP-1的大肠杆菌Nissle1917细菌处理链脲霉素(STZ)诱导的糖尿病小鼠

该实施例描述用表达GLP-1的大肠杆菌Nissle1917细菌处理链脲霉素(STZ)诱导的糖尿病小鼠的示范性方法。

对链脲霉素(STZ)诱导患糖尿病的6～8周龄雄性小鼠(C57B6)喂食表达带有细胞穿透肽的GLP-1(STZ+GLP)或表达20个氨基酸序列(STZ-载体)的大肠杆菌Nissle1917细菌。“对照”小鼠不用STZ处理。根据图7，在STZ处理之后且在用Nissle细菌喂食STZ处理的小鼠之前，“Nissle前”检测显示血糖水平显著升高。所有细菌喂食在30天后停止。在细菌喂食起始的60天后再次检测血糖(“60天”)。值代表4只小鼠的平均值。误差棒代表1个标准偏差，p值来自斯氏t检验(n=4)。结果显示喂食GLP-1分泌型细菌的糖尿病小鼠在处理30天后恢复至血糖正常水平。令人意外的是，这些小鼠在未受任何处理的额外三十天中保持血糖正常水平。

这些小鼠的解剖和免疫组化指示，它们的肠组织中有高胰岛素水平(相比于仅喂食分泌随机肽序列的共生细菌的对照)(图8A-B)。参见图8A，高浓度胰岛素以箭头表示。

6.6.实施例6：用表达GLP-1的大肠杆菌Nissle1917细菌处理1型糖尿病小鼠

该实施例描述用表达GLP-1的大肠杆菌Nissle1917细菌处理1型糖尿病小鼠的示范性方法。

为测定Nissle-GLP-1对1型糖尿病(T1DM)的作用，建立T1DM的STZ小鼠模型。用高剂量的STZ处理C57BL/6J(B6)雄性小鼠，然后，高血糖症发作(随机葡萄糖水平>350mg/dL)的小鼠用Nissle-GLP-1、Nissle喂食或不予处理。共生细菌的喂食一天实行两次，间隔约8h。作为正常血糖量对照，一组小鼠不接受STZ处理也不喂食共生细菌(对照)。监控超过80天的小鼠随机葡萄糖水平(图9B)和重量(图9C)。检测β细胞量(图9A)。单独Nissle喂食相较于不给予共生细菌的STZ处理小鼠对随机血糖水平无显著影响(图9B)。然而，喂食Nissle-GLP-1的小鼠在开始喂食16天内显示显著较低的随机血糖水平。

本研究中任何小鼠的体重间没有显著差异，在所述80天时间段间的任何小鼠都无显著增重。

在共生细菌处理89天后，对小鼠实行葡萄糖耐量测试。使它们禁食10h，然后用葡萄糖i.p注射。葡萄糖注射后的1.5h每30分钟检测血液胰岛素和葡萄糖水平(分别示于图9D和9E)。在0.5和1.5h，显示Nissle-GLP-1喂食小鼠和仅STZ处理小鼠之间胰岛素水平的显著差异。在任何时间点，Nissle GlP-1喂食小鼠和未接受任何处理的对照小鼠之间的胰岛素水平无显著差异(图9D)。整个实验中，所有4组小鼠间的血糖水平有显著差异。在所述葡萄糖耐量测试中，显示Nissle-GLP-1喂食小鼠的血糖水平低于仅STZ处理小鼠血糖水平的50%；但其血糖水平为不予STZ处理的对照小鼠的两倍(图E)。有趣的是，尽管在葡萄糖注射之前(时间＝0)Nissle处理小鼠与STZ处理小鼠在血糖水平方面无显著差异，葡萄糖注射后1h，显示Nissle处理小鼠的血糖水平比STZ处理小鼠低约33%。

就胰岛素是否存在对小鼠的肠进行免疫染色(图10A-F)。在用Nissle-GLP-1处理的小鼠内发现含胰岛素的细胞口袋，但本研究中所用的任何其它小鼠皆无此发现。显示这些口袋的相对频率(图10A-B)。就总上皮细胞量的百分比而言，估计所述口袋所含的量低于1%(图10B)。STZ能有效引起期望的T1DM反应，STZ处理小鼠的β细胞量显著较低(图9A)，而其血液葡萄糖和胰岛素水平也与T1DM一致(图9B、D、E)。所有STZ处理小鼠的β细胞量等量减少指示，Nissle-GLP-1喂食小鼠中胰岛素增加或较低血糖的机制不是胰腺β细胞再生。

为测定哪种类型的肠上皮细胞(潘纳斯(paneth)细胞、吸收细胞、杯状细胞或肠内分泌细胞)可能已被重编程而成为含胰岛素的细胞，用针对来自所述4种细胞类型中每一种的代表性蛋白的抗体将细胞共染蓝色，所述代表性蛋白分别是：潘纳斯(paneth)细胞的NOD-2、杯状细胞的黏液素-2(MUC-2)、吸收细胞的蔗糖异麦芽糖酶(SI)以及肠内分泌细胞的嗜铬素A(Chr-A)。NOD-2、MUC-2或SI未见重叠染色(分别示于图10C、D和E)。然而，Chr-A出现了胰岛素的重叠染色(图10F)。小鼠肠的免疫染色显示喂食Nissle-GLP-1的小鼠(图10A)内有包含胰岛素的细胞，而喂食Nissle的小鼠或对照小鼠(图10B)内无包含胰岛素的细胞。用针对来自所述四种类型肠细胞中每一种的代表性蛋白的抗体共染提示，这些细胞系与肠内分泌细胞相关联(图10F)。预期该结果,因为向血液分泌激素是肠内分泌细胞而非其它三种细胞类型的正常功能。也给健康小鼠(未经STZ处理)喂食Nissle和Nissle-GLP-1，然而它们的血糖水平与没有喂食共生细菌的那些健康小鼠无显著差异(图11A-B)。这些结果指示，在处理和未处理的健康小鼠(对照)之间94天时间过程中的随机小鼠血糖水平没有显著变化(图11A)。在这段时间中，小鼠重量也没有差异(图11B)。考虑指示喂食Nissle-GLP-1的健康小鼠血糖或体重无变化的数据(图11)和指示Nissle-GLP-1能显著减低血糖水平的数据，总体情况便是针对糖尿病的有效且安全的潜在治疗之一：其是葡萄糖响应,胰岛素动力学与非糖尿病***相似(图9D)。即，Nissle-GLP-1喂食小鼠内胰岛素水平变化发生的时间与健康小鼠相同，尽管程度较小。

这些数据表明，给糖尿病小鼠喂食Nissle-GLP-1可导致葡萄糖响应性胰岛素生成，使血糖水平显著降低。不希望受理论限制，胰岛素分泌的机制似乎来自重编程的肠细胞口袋。这些口袋除了胰岛素外还表达Chr-A，表明它们来自肠内分泌细胞。当结合来自喂食Nissle-GLP-1的健康小鼠的结果来考虑时，所述证据表明即使向非糖尿病给予该处理也是安全的。

6.7.实施例7：GLP-1在染色体修饰的大肠杆菌Nissle与含质粒的大肠杆菌Nissle中的表达

该实施例描述GLP-1在经染色体修饰与含质粒的大肠杆菌Nissle中表达的比较

改造细菌从而维持GLP-1表达无需选择压力。在菌株比较中，发现来自染色体修饰的Nissle的分泌进入培养基中的GLP-1相对浓度少于分泌自质粒中表达GLP-1的Nissle。然而明显地，在体内，染色体中表达GLP-1的Nissle和质粒中表达GLP-1的Nissle同样有效（图5）。细菌培养物中GLP-1的分泌量和体内降低的血糖水平间缺乏相关性的原因可能有几种。在喂食Nissle、质粒中表达GLP-1的Nissle或Nissle-GLP-1的各菌株的小鼠肠内Nissle存活力检测显示没有差异(图12)。GLP-1在肠黏膜内的稳定性可能已经受到黏膜蛋白酶的影响，导致有效转运远低于分泌速率。也有可能是小鼠肠内不太理想的生长条件(pH、营养物等)(Nissle是人益生菌)导致任一菌株的基因表达不太理想。

葡萄糖响应测试中的胰岛素分泌动力学显示Nissle-GLP-1喂食小鼠与对照小鼠类似(图9D)；尽管所有用STZ处理的小鼠中的血糖降低有所延迟(图9E)。然而，喂食Nissle的小鼠显示与对照小鼠相同的动力学。该结果是意料之外的，并可通过其它机制解释。同样意料之外的是，在葡萄糖响应测试中喂食Nissle的小鼠与仅STZ处理的小鼠相比血糖降低更快(图9E)。这提示单一Nissle的保护水平。虽然该保护作用在随机葡萄糖水平中不明显，其似乎使血糖峰作用减少。由于葡萄糖是i.p.注射的，可以排除肠葡萄糖的细菌消耗是可能机制。

6.8.实施例8：喂食Nissle对血糖水平的影响

该实施例证明喂食Nissle对小鼠内血糖水平的影响。

在实验起始，用STZ喂食小鼠5天(40mg/kg体重)(STZ处理于“STZ终止”处结束)。在随机血糖水平持续高于300mg/dL发生后，对小鼠开始Nissle处理，包括用自表达假质粒的Nissle(STZ+载体)、从相同质粒表达GLP-1(1-37)的Nissle(STZ+GLP)处理或不处理也不采用STZ(对照)。喂食在时间线上标记为“Nissle开始”。Nissle每天喂食两次，直至区分“Nissle停止”标记的时间。小鼠在这一点基本上被搁置(在常规照料之外)直至区分“Nissle一次”的时间。在那个点上，检测血糖水平并给小鼠喂食一次Nissle。然后，搁置小鼠，直至检测血糖的最后一个时间点。参见图13。显示平均值(n=3)，误差棒代表1个标准偏差。

给非肥胖糖尿病(NOD)小鼠每天喂食两次单独Nissle、染色体表达GLP-1(1-37)的Nissle或不予处理。小鼠在刚要检测血糖之前禁食4小时。参考图14，时间表示处理开始后的天数。显示平均值(n至少=3)，误差棒代表一个标准偏差。p值来自斯氏t检验。

图15显示操作所述重组细胞的可能方法。左：腔B中在黏膜M内侧和上侧含有细菌的正常肠隐窝。肠内分泌细胞(E)分泌激素进入固有层(LP)和脉管***V。右：本文实施方式的重组细胞(EB)分泌GLP-1(从EB出现的点)进入所述肠腺以使早期肠内分泌细胞重编程为胰岛素分泌细胞(RE)。然后在响应葡萄糖时分泌胰岛素(Ins，标星)进入血流。

不希望受理论限制，认为使用重组共生菌株以及简单的口服剂量给药、无显著背景表达和葡萄糖响应性，可通过替代宿主胰岛合成来显著减少或甚至消除对胰岛素注射的需求，并能协助减少由糖尿病显示的长期并发症。

6.9.实施例9：用于GLP-1研究的原始及新构建体序列

根据本文公开的方法可以使用以下构建体。

用于实施例1-11的原始Nissle-GLP-1构建体

(FliC启动子)—Flic20-6xhis-xpress-EK位-glp-1(1-37)-cpp

atggcacaagtcattaataccaacagcctctcgctgatcactcaaaataatatcaacaagATGCATCATCATCATCATCACGGATCCGATCTGTACGACGATGACGATAAGCACGATGAATTTGAGAGACATGCTGAAGGGACCTTTACCAGTGATGTAAGTTCTTATTTGGAAGGCCAAGCTGCCAAGGAATTCATTGCTTGGCTGGTGAAAGGCCGAGGAtgcggtggcggttacggccgtaaaaaacgtcgtcagcgccgtcgcTAA(SEQ ID NO:4)

其中：FliC20：

ATGGCACAAGTCATTAATACCAACAGCCTCTCGCTGATCACTCAAAATAATA TCAACAAG(SEQ ID NO:5)

6XHis：ATGCATCATCATCATCATCACGGArCC(SEQ ID NO:6)

Xpress：GATCTGTAC

EK位：GACGATGACGATAAG(SEQ ID NO:7)

GLP1(1-37)：

CACGATGAATTTGAGAGACATGCTGAAGGGACCTTTACCAGTGATGTAAGTTCTTATTTGGAAGGCCAAGCTGCCAAGGAATTCATTGCTTGGCTGGTGAAAGG CCGAGGA(SEQ ID NO:8)

CPP:TGCGGTGGCGGTTACGGCCGTAAAAAACGTCGTCAGCGCCGTCGCTAA(SEQ ID NO:9)

可用的另一个启动子Nissle-GLP-1构建体

LPP启动子---5’UTR-Flic20-6xhis-xpress-EK位-GLP-1(1-37)-CPP—3’UTR

TGCATGCATccatcaaaaaaataTTCTCAacataaaaaactttgtgtAATACTCAGGGTTGACGGCGATTGAGCCGACGGGTGGAAACCCAATACGTAATCAACGACTTGCAATATAGGATAACGAATCatggcacaagtcattaataccaacagcctctcgctgatcactcaaaataatatcaacaagctcgagCATCATCATCATCATCACGGATCCGATCTGTACGACGATGACGATAAGCACGATGAATTTGAGAGACATGCTGAAGGGACCTTTACCAGTGATGTAAGTTCTTATTTGGAAGGCCAAGCTGCCAAGGAATTCATTGCTTGGCTGGTGAAAGGCCGAGGAtgcggtggcggttacggccgtaaaaaacgtcgtcagcgccgtcgcTAATCGTCGTAAACTGATTAACTGAGACTGACGGCAACGCCAAATTGCCTGATGCGCTGCGCTTATCAGGCCTACAAGGTGAATTGCAATTTATTGAATTTGCACATTTTTGTAGGCCGGATAAGGCGTTTACGCCGCATCCGGCAACATGAATGGTAATTTGTCAGCAACGTGCTTCCCCGCCAACGGCGGGGTTTTTTCTGCCCGCAATTTACCGATAACCCCCAAATAACCCCTCATTTCACCCACTAATCGTCCGATTAAAAACCCTGCAGAAACGGATAATCATGCCGATAACTCATATAACGC(SEQ ID NO:10)

其中：

LPP启动子：

TGCATGCATCCATCAAAAAAATATTCTCAACATAAAAAACTTTGTGTAATAC T(SEQ ID NO:11)

5’UTR：

CAGGGTTGACGGCGATTGAGCCGACGGGTGGAAACCCAATACGTAATCAAC GACTTGCAATATAGGATAACGAATC(SEQ ID NO:12)

FliC20：

ATGGCACAAGTCATTAATACCAACAGCCTCTCGCTGATCACTCAAAATAATA TCAACAAG(SEQ ID NO:13)

6XHis：ATGCATCATCATCATCATCACGGArCC(SEQ ID NO:14)

Xpress：GATCTGTAC

EK位：GACGATGACGATAAG(SEQ ID NO:15)

GLP1(1-37)：

CACGATGAATTTGAGAGACATGCTGAAGGGACCTTTACCAGTGATGTAAGTTCTTATTTGGAAGGCCAAGCTGCCAAGGAATTCATTGCTTGGCTGGTGAAAGG CCGAGGA(SEQ ID NO:16)

CPP:TGCGGTGGCGGTTACGGCCGTAAAAAACGTCGTCAGCGCCGTCGCTAA(SEQ ID NO:17)

3’UTR:TCGTCGTAAACTGATTAACTGAGACTGACGGCAACGCCAAATTGCCTGATGCGCTGCGCTTATCAGGCCTACAAGGTGAATTGCAATTTATTGAATTTGCACATTTTTGTAGGCCGGATAAGGCGTTTACGCCGCATCCGGCAACATGAATGGTAATTTGTCAGCAACGTGCTTCCCCGCCAACGGCGGGGTTTTTTCTGCCCGCAATTTACCGATAACCCCCAAATAACCCCTCATTTCACCCACTAATCGTCCGATTAAAAACCCTGCAGAAACGGATAATCATGCCGATAACTCATATAACGC(SEQ ID NO:18)

乳杆菌构建体

TAA-SLPAP-RBS-ATG-USP45-LEISS-6XHIS-EK-GLP(1-37)-CPP-TAA-TA A-TERM667

TAACCCGGGGGGAGTATAACAGAAACCTTAAGGCCCGACCGCTTGACAAGGGCGCGTGAGGTTTTTACGATAGCGCCGGATGCGGGGAAAAAGGGCTCCTTTTGGGGGGTTTTCCCCGCACCGGGCGGACCTGGGCGGAGagGAAACGcgGCAACTCGCCCGTCTCGGGTTCCCGCCCACGACCCTTAAGGAGGTGTGAGGCATATGAAAAAAAAGATTATCTCAGCTATTTTAATGTCTACAGTGATACTTTCTGCTGCAGCCCCGTTGTCAGGTGTTTACGCTGATACTAATTCTGATTTGGAAATATCGTCGACTTGTGATGCTCATCATCATCATCATCACGACGATGACGATAAGCACGATGAATTTGAGAGACATGCTGAAGGGACCTTTACCAGTGATGTAAGTTCTTATTTGGAAGGCCAAGCTGCCAAGGAATTCATTGCTTGGCTGGTGAAAGGCCGAGGAtgcggtggcggttacggccgtaaaaaacgtcgtcagcgccgtcgcTAAtaaAAATAACAAAAAGAGTATGAGTTTTTGCTCATACTCTTTTTGTTATTT(SEQ ID NO:19)

其中：

TAA-SLPAP-RBS：

TAACCCGGGGGGAGTATAACAGAAACCTTAAGGCCCGACCGCTTGACAAGGGCGCGTGAGGTTTTTACGATAGCGCCGGATGCGGGGAAAAAGGGCTCCTTTTGGGGGGTTTTCCCCGCACCGGGCGGACCTGGGCGGAGAGGAAACGCGGCAACTCGCCCGTCTCGGGTTCCCGCCCACGACCCTTAAGGAGGTGTGAGGCAT(SEQ ID NO:20)

ATG-USP45:ATGAAAAAAAAGATTATCTCAGCTATTTTAATGTCTACAGTGATACTTTCTGCTGCAGCCCCGTTGTCAGGTGTTTACGCTGATACTAATTCTGAT(SEQ ID NO:21)

LEISS：TTGGAAATATCGTCGACTTGTGATGCT(SEQ ID NO:22)

6XHIS：CATCATCATCATCATCAC(SEQIDNO:23)

EK位：GACGATGACGATAAG(SEQ ID NO:24)

GLP-1(1-37)：

CACGATGAATTTGAGAGACATGCTGAAGGGACCTTTACCAGTGATGTAAGTTCTTATTTGGAAGGCCAAGCTGCCAAGGAATTCATTGCTTGGCTGGTGAAAGG CCGAGGA(SEQ ID NO:25)

CPP：

TGCGGTGGCGGTTACGGCCGTAAAAAACGTCGTCAGCGCCGTCGCTAATAAT AA(SEQ ID NO:26)

TERM667：

AAATAACAAAAAGAGTATGAGTTTTTGCTCATACTCTTTTTGTTATTT(SEQ ID NO:27)

6.10.实施例10：共生细菌分泌型GLP-1重编程肠细胞以降低糖尿病小鼠的高血糖

给糖尿病小鼠经肠喂食细菌分泌型GLP-1能导致葡萄糖响应性胰岛素生成，显著降低血糖水平。胰岛素分泌的机制似乎来自重编程的肠细胞。这些细胞与大多数胰腺β细胞的差异在于所述细胞除表达胰岛素外几乎不表达PDX-1且仅有一些表达ChrA。

引言

胰高血糖素样肽1(GLP-1)刺激小鼠肠上皮细胞转换为胰岛素分泌型细胞。我们研究用改造成分泌GLP-1的人共生细菌菌株简单口服给药是否能通过使肠细胞重编程为葡萄糖响应性胰岛素分泌细胞来改善1型糖尿病(T1DM)小鼠模型内的高血糖症。每天给糖尿病小鼠喂食改造成分泌GLP-1的共生细菌(Nissle-GLP-1)。Nissle-GLP-1喂食的小鼠显示胰岛素水平显著增加，且明显更具葡萄糖耐受性。这些小鼠在肠上部内发展出胰岛素生成型细胞，其在数量上足够替代82%的健康小鼠内所发现胰腺β细胞。令人吃惊的是，重编程细胞内的PDX-1表达低于周围上皮细胞。而且，所述重编程细胞的亚组对嗜铬粒蛋白A(ChrA，肠内分泌细胞和β细胞标志物)共同染色。喂食Nissle-GLP-1的健康(非糖尿病)小鼠相较于对照小鼠显示相似的重编程细胞，但在血糖水平和体重增长上(甚至处理超过90天)没有可区别的变化。这些结果指示对T1DM的潜在口服治疗并引入细菌信号转导以介导肠细胞命运的概念。

使非β细胞重编程为β细胞或具有胰岛素分泌潜力的细胞已成为过去十年中若干研究的主题。研究集中于许多领域，包括由胰细胞(腺泡细胞等)和肝细胞系体外生成β细胞以用于移植，以及使胰或其它组织特异性细胞转体内换成β细胞。发现先前认为不具活性的胰高血糖素样肽1的一种形式(GLP-1(1-37))能通过Notch信号转导通路刺激大鼠肠上皮细胞成为葡萄糖响应性胰岛素分泌细胞(Suzuki,A.,Nakauchi,H.和Taniguchi,H.Glucagon-like peptide1(1-37)convertsintestinal epithelial cells into insulin-producing cells(胰高血糖素样肽1(1-37)使肠上皮细胞转换成为胰岛素生成型细胞).Proc Natl Acad Sci USA100,5034-5039(2003))，证明所述后一种方式的潜力。Suzuki报道，其母亲大鼠经腹膜内(i.p.)注射GLP-1的大鼠胚胎在胚胎期10.5(E10.5)发育会在其肠上部中显示一些胰岛素生成型细胞。成年大鼠(10周龄)在每日注射GLP-1九天时具有一些(尽管少得多)肠胰岛素生成型细胞。这表明具有未分化肠上皮的大鼠(大鼠中的分化于E15后出现)能够使肠细胞分化成为“β样”细胞。该研究还证明用GLP-1体外孵育并手术植入成年糖尿病大鼠的胚胎空肠(E14.5)能使STZ诱导的T1DM逆转。该作者总结，成年肠上皮细胞分化(发生自肠隐窝)可能不会产生显著数量的胰岛素生成型细胞，从而大量分化成具有β样功能的细胞可能需要发育中胎儿(前E17)的增殖和假复层细胞。

所述Suzuki的工作证明介导肠细胞重编程的生物活性化合物在不采用手术的递送中的困难。GLP-1本身在血液中的半衰期仅有数分钟。该短暂半衰期可能已成为成年大鼠中较低重编程率的原因，其中GLP-1必须在循环中存活足够长的时间以到达肠腺。一种递送生物活性化合物至肠上部腔(绒毛)侧从而避免手术潜在缺陷或在血流中降解的方法是从肠居共生细菌分泌信号。该方法允许信号连续表达或响应局部刺激表达，随后转运通过肠黏膜而不是血液。

改造的共生细菌能递送GLP-1(1-37)至人肠细胞并刺激葡萄糖响应性胰岛素体外分泌(Duan,F.,Curtis,K.L.和March,J.C.Secretion of insulinotropicproteins by commensal bacteria:rewiring the gut to treat diabetes(由共生细菌分泌促胰岛素蛋白质：使肠重新排布以治疗糖尿病).Appl Environ Microbiol74,7437-7438(2008))。在所述工作中，转化大肠杆菌Nissle1917(EcN)以响应外源诱导子而从质粒分泌GLP-1(1-37)。在该研究中，我们测试了染色体修饰成组成性分泌GLP-1(1-37)的EcN(Nissle-GLP-1)是否能使T1DM小鼠模型内的血糖正常恢复。我们的目的是通过每天喂食Nissle-GLP-1使小鼠肠细胞重编程为葡萄糖响应性胰岛素分泌细胞。我们还检测了β细胞和肠内分泌细胞标志物的共表达以测定重编程的程度以及重编程细胞谱系。

使用fliC启动子、细胞穿透肽(CPP)和分泌标签改造EcN以分泌GLP-1(1-37)(图19，上图)。在该菌株培养中验证GLP-1的分泌，并与携带含有相同序列但不带pKD3染色体***盒(图19，下图)的质粒的菌株分泌作比较。Nissle-GLP-1的分泌量是含质粒菌株的大约50%。因此，我们在体内研究中使用Nissle-GLP-1而不是含质粒菌株，因为该产量差异不视作显著，而且我们不想在这些实验中包括用于质粒维持的选择压力。免疫荧光(IF)显示喂食Nissle-GLP-1的小鼠的肠上部对GLP-1染色呈阳性，而喂食表达“假”肽的EcN(Nissle)的小鼠不显示相似染色(图16a、b)。为了保护黏膜层，冷冻而不是在多聚甲醛中固定肠切片。图像分析指示喂食Nissle-GLP-1的小鼠中的GLP-1染色显著高于喂食Nissle的小鼠(图16c)。

我们检测了喂食Nissle-GLP-1或Nissle的小鼠的肠和粪便内的细菌计数。喂食Nissle-GLP-1和Nissle的小鼠的肠和粪便细菌计数相同(图16d)，指示观察到的Nissle-GLP-1喂食小鼠部分的GLP-1增加可能来自重组GLP-1表达而不是由EcN源性菌株的存在所带来的内源性GLP-1生成。为测定大肠而非粪便中的菌落，小心地刮擦胃肠(GI)道下部切片并冲洗以去除粪便。对剩余细菌计数。我们得到的小肠和粪便内细菌计数没有其它报道的高，然而这可能归因于不同的小鼠饲养方式和交替的抗生素预处理。

我们测试了Nissle-GLP-1是否能使药物诱导T1DM小鼠模型和基因型非肥胖糖尿病(NOD)小鼠模型内的正常血糖恢复(来自NOD模型的结果总结于章节6.11(实施例11))。对于药物诱导的T1DM模型，连续5天用高剂量（40或50mg/kg体重）链脲霉素(STZ)注射C57BL/6J(B6)雄性小鼠。随着高血糖症(禁食葡萄糖水平>250mg/dL)发生，给小鼠喂食Nissle-GLP-1、Nissle或不予处理。共生细菌的喂食一天实行两次，间隔约8h。作为血糖正常对照，一组小鼠不接受STZ处理也不喂食共生细菌(对照)。在超过60天过程中监测血糖水平和体重。

胰腺形态测定分析显示，STZ处理的小鼠相较于对照小鼠具有显著减少的β细胞量(图17a)。单独Nissle喂食相较于不给予共生细菌的STZ处理小鼠对血糖水平无显著影响(图17b)。然而，喂食Nissle-GLP-1的小鼠在喂食开始60天后显示显著较低(p=.000017)的血糖水平(图17b)。喂食Nissle-GLP-1的小鼠的血糖水平与血糖正常对照无显著差异(p=.46)。此外，在本研究的60天时间段中任何小鼠的体重都没有显著变化(图20A-B)。所有喂食STZ的小鼠中β细胞量等同减少，排除了喂食Nissle-GLP-1的小鼠的血糖水平降低是β细胞再生的结果的可能性。

也给健康的未经STZ处理的小鼠喂食Nissle和Nissle-GLP-1，然而它们的血糖水平与没有喂食共生细菌的那些健康小鼠无显著差异(图17c)。在处理和未处理的健康小鼠(对照)之间92天时间段中的小鼠血糖水平没有显著变化(图17c)。在相同时间段中，小鼠体重变化也没有差异(图20A-B)。

在共生细菌处理60天后，对所有小鼠组实行葡萄糖耐量测试。所述小鼠在用葡萄糖i.p.注射(25g/kg体重)之前被禁食10小时。在葡萄糖注射后1.5小时内每30分钟检测血液胰岛素和葡萄糖水平(图17d)。尽管在0.5和1.5小时，显示Nissle-GLP-1喂食小鼠和仅STZ处理组间胰岛素水平的显著差异，在任何时间点都没有检测到Nissle GLP-1喂食小鼠和没有接受处理的对照小鼠间胰岛素水平的显著差异(图17d)。整个葡萄糖耐量测试中，所有4组小鼠间的血糖水平有显著差异。整个葡萄糖耐量测试中，显示Nissle-GLP-1喂食小鼠的血糖水平低于仅STZ处理小鼠的血糖水平的50%；但其血糖水平为不给予STZ处理的对照小鼠的两倍(图17d)。Nissle-GLP-1喂食小鼠的血糖水平尽管高于血糖正常对照，但其在整个葡萄糖耐量测试中没有超过275mg/dL(相比于仅STZ处理小鼠的600mg/dL)。有趣的是，尽管Nissle处理小鼠与STZ处理小鼠在在基底水平的(时间=0)血糖水平方面没有显示显著的差异，在葡萄糖注射后1小时，显示Nissle处理小鼠的血糖水平比STZ处理小鼠低约33%。虽然该保护作用在未注射高水平葡萄糖的小鼠中不明显，但是Nissle似乎能在某种程度上改善血糖峰的作用。鉴于葡萄糖是i.p.注射的，可以排除腔内葡萄糖的细菌消耗是可能机制。为解释该观察，需要进一步研究。

处理60天后(随后进行葡萄糖耐量测试)，固定小鼠小肠切片并对其进行不同标志物的免疫荧光探测。在用Nissle-GLP-1处理小鼠的小肠中发现含胰岛素的细胞口袋，但没有在本研究所用的任何其它组内发现该现象(图18a-d)。从图像分析估计胰岛素生成细胞的相对频率是总体小肠细胞量的约0.013%(±0.002%)(或1个/10,000个上皮细胞)。如对本研究中所有小鼠所预期，在肠上部显示PDX-1生成(图18a-d中的红色染色)。然而，用Nissle-GLP-1处理的小鼠内的胰岛素生成细胞对PDX-1没有高水平染色，甚至似乎具有比周围细胞(图18b和d)或来自对照的胰腺β细胞(数据未显示)少的PDX-1表达。虽然这是一个有趣的结果，其仍为这些细胞具有β细胞样功能的提供可能性，因为已知存在β细胞群中PDX-1/胰岛素分泌的异质性。

在更加长期的对照实验中，其中给健康(非糖尿病)小鼠喂食Nissle和Nissle-GLP-1，同样对肠实行染色以检测重编程细胞的存在。在喂食Nissle-GLP-1的健康小鼠中观察胰岛素染色，而胰岛素生成细胞内的PDX-1表达仍低于周围细胞(图18d)。喂食Nissle的健康小鼠不显示重编程细胞(图18c)。

为了更好理解所述重编程细胞的生理学，我们对小鼠肠切片中的嗜铬粒蛋白A(ChrA)和胰岛素共同染色。ChrA由神经内分泌细胞、肠内分泌细胞和分泌颗粒中的胰岛β细胞常规表达。在一些情况中，胰岛素染色与ChrA染色(红色)重叠(图18e)，而在约80%观察到的胰岛素生成细胞中，ChrA并不定位于同一细胞(图18f)。图18e和f显示正常肠内分泌细胞(ChrA阳性，无胰岛素染色)、胰岛素生成(胰岛素染色)细胞。胰岛素生成细胞附近存在普通肠内分泌细胞表明，除了一些肠内分泌细胞转换为胰岛素生成细胞以外，整体动物内保留了肠内分泌功能。我们没有观察到就溶菌酶而言的胰岛素共定位(图18g)，表明所述重编程细胞不是潘纳斯(Paneth)细胞。胰岛素和蔗糖酶异麦芽糖酶(SI)的共表达(图18h)指示重编程细胞保持其吸收能力。

所述指示喂食Nissle-GLP-1的健康小鼠的血糖(图17c)或体重(图20A-B)无变化的数据，以及指示Nissle-GLP-1能显著降低两种啮齿类T1DM模型血糖水平(图17b和21)的数据表明该方法能是有效且安全的糖尿病疗法：其是葡萄糖响应性，具有与非糖尿病***相似的胰岛素动力学(图17d)，即，Nissle-GLP-1喂食小鼠的胰岛素水平变化发生时间与健康小鼠相同，尽管其血清胰岛素水平较低。对本研究中达到的重编程效率的评估(细节示于下文的“对重编程细胞数量的计算和估计”)指示重编程细胞的数量约为健康小鼠胰腺中β细胞数量的82%。该数字可能解释了小鼠为何能够在日常状态下显示标准化血糖水平，但在更有挑战性的葡萄糖耐量测试条件下稍低于健康小鼠血糖对照。人患者需要日常消耗以达到本文关于小鼠所得相同结果的细菌量估计是以市场现有的非处方益生菌制剂形式每天给予5～15g所述细菌量。然而，若定殖数较高，日常摄入应低至50mg。

使用该方法的考量可能会引起针对肠内新生β样细胞的免疫应答。该情况很有可能发生，正如其在其它再生方法中那样。然而，这些细胞的生理学(几乎不表达ChrA，且PDX-1表达相对较低)与β细胞不同，因此这些细胞可能不被免疫***检测到。此外，如果患者待采用分泌GLP-1的细菌如本研究中的小鼠那样基于每天治疗，胰岛素分泌细胞的永久性再生可能会使血糖持续地减少，尽管新形成β样细胞会被免疫破坏。考虑到人上皮细胞大约每两天更新一次以及指示甚至在46天之后NOD小鼠中具有保护作用的数据(NOD小鼠显示对胰腺β细胞的免疫破坏)，仍可能没有免疫***针对肠上部内重编程细胞的显著响应。然而，若有这样的攻击，可能造成黏膜表面的永久炎症。需要更多的研究来确定该方法的免疫学效应。

我们从本文所示的这些数据得出结论，给糖尿病小鼠喂食Nissle-GLP-1可导致葡萄糖响应性胰岛素生成，使血糖水平显著降低。尽管需要更多的表征，但是胰岛素分泌的机制似乎来自重编程的肠细胞。这些细胞与大多数胰腺β细胞的差异在于所述细胞除表达胰岛素外几乎不表达PDX-1且它们中仅有一些表达ChrA。鉴于喂食不刺激β细胞分泌胰岛素的无活性形式GLP-1的小鼠和喂食Nissle-GLP-1的小鼠与仅喂食Nissle或不喂食细菌的小鼠的胰腺胰岛素生成水平相同，该方法不太可能引起来自剩余β细胞的胰岛素生成增加。当结合来自喂食Nissle-GLP-1的健康小鼠的结果来考虑时，所述证据表明即使向非糖尿病给予该处理也是安全的。进一步工作将更加严密地检测所述胰岛素生成细胞的生理学，以及所述治疗的详细的长期药物代谢动力学。

材料和方法

质粒构建

除非另有说明，所述有化学品和试剂都购自VWR国际有限公司(VWRInternational)(宾夕法尼亚州西切斯特)。所有克隆使用标准技术进行(Sambrook,J.和Russell.D.W.Molecular cloning:a laboratory manual(《分子克隆：实验室手册》).第三版，冷泉港的冷泉港实验实出版社；2001年)。构建用于在fliC启动子控制下表达融合细胞穿透肽(CPP)的glp-1(1-37)的质粒以生成前述的pFD-GLP(Duan,F.和March,J.C.Interrupting Vibrio cholerae infection of humanepithelial cells with engineered commensal bacterial signaling(用改造的共生细菌信号转导阻断人上皮细胞的霍乱弧菌感染).Biotechnol Bioeng101(1):128-34.(2008))。合成制备(IDT，爱荷华州科拉尔维尔市)序列6XHis-EK-glp-1(1-37)-CPP。通过高保真PCR(司查塔基公司(Strategene))将该片段***pBluescript-KS以生成pBluescript-GLP。该所得载体包含以下序列5’UTR-Flic20-6XHis-EK-glp-l(l-37)-CPP。通过高保真PCR将该序列克隆至pKS121内(含有fliC的3'UTR)以获得构建体：5’UTR-Flic20-6XHis-EK-glp-1(1-37)-CPP-3’UTR。为获得pFD-载体，使用高保真PCR克隆来自pFD-GLP的5'UTR-FLIC20-6XHis-EK序列。将所述PCR片段克隆至pKS121内以获得构建体：5’UTR-Flic20-6XHis-EK-3’UTR。pKS104和pKS121由芬兰赫尔辛基大学的Benita 

实验室友情馈赠。

使用已建立方法制备pFD-GLPC构建体以用于在天然fliC启动子控制下染色体***glp-1(1-37)-CPP(Datsenko,K.A.和Wanner,B.L.One-step inactivationof chromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCR products(使用PCR产物使大肠杆菌K-12染色体基因一步法失活).Proc Natl Acad Sci USA97,6640-6645(2000))。所述构建体的示意图以及克隆步骤和所用引物的详细解释如下。简言之，使用一步失活法在Nissle染色体中***Flic20-6XHis-EK-glp-1(1-37)-CPP基因以替代fliC启动子区下游的fliC。敲除Nissle染色体中的fliD基因。该技术使用三种质粒，pKD3(赋予氯霉素抗性)、pKD4(赋予卡那霉素抗性)和pKD46(赋予氨苄青霉素抗性)(Datsenko,K.A.和Wanner,B.L.One-stepinactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCR products(使用PCR产物使大肠杆菌K-12中的染色体基因一步失活).Proc Natl Acad Sci USA97,6640-6645(2000))。染色体***之后的所得菌株称作Nissle-GLP-1。

Western印迹

大肠杆菌Nissle1917(EcN)获自如上所述的目前市售可得益生菌Mutaflor^TM(Duan,F.和March,J.C.Interrupting Vibrio cholerae infection of humanepithelial cells with engineered commensal bacterial signaling(改造的共生细菌信号转导阻断人上皮细胞的霍乱弧菌感染).Biotechnol Bioeng101(1):128-34.(2008))。含pFD-载体、pFD-GLP的EcN和具有来自pFD-GLPC的染色体***的Nissle在LB中于37°C以225rpm振荡24小时。24小时后，离心所有细菌。过滤上清(0.2μm，PALL生命科学公司(PALL Life Science))。将无细胞培养基稀释至与LB相同的OD600，然后添加10ng/mL亮抑肽酶、0.04mMPMSF和5ng/mL抑肽酶以抑制蛋白酶。用10%三氯乙酸(TCA，VWR)使澄清上清(14mL)在冰上沉淀30分钟，然后将所述团课在冰冷乙醇/***(1:1)中洗涤两次。使所得上清团块在真空下干燥，溶解于50μL样品缓冲液(2%SDS、50mM Tris(pH6.8)、20%甘油、10%巯基乙醇、溴酚蓝)并在95°C沸煮5分钟。使用含蛋白酶抑制剂的500μLBugBuster Master Mix(10ng/mL亮抑肽酶、200μMPMSF和5ng/mL抑肽酶)，所得细胞团(来自14mL培养物)通过温和涡旋重悬于室温BugBuster Master Mix。细胞悬液在振荡平台(康涅狄格州布里斯托市的VWR)以慢速设定于室温下孵育10～20分钟。向各样品添加125μL5×样品缓冲液，然后在95°C沸煮10分钟。为了估测GLP-1表达和分泌的量，使用western印迹的标准技术。简言之，将50μL样品加样至聚丙烯酰胺胶上，并印迹至Immobilon-P^SQ转移膜上(密理博公司(Millipore)，马塞诸塞州比尔瑞卡)。膜用1:1,000的小鼠抗His(GE医疗保健公司(GE health)，新泽西州皮斯卡特维)检测。所述膜用HRP偶联的抗小鼠IgG(阿莫山生物科学公司(Amersham Biosciences)，宾夕法尼亚州匹兹堡)孵育，用增强的化学发光(皮尔斯公司(Pierce)，伊利诺斯州洛克福德)显影，并曝光至X射线胶片上(菲尼克斯公司(Phoenix)，北卡罗来纳州坎德勒)。

小鼠定殖实验

本研究使用的所有小鼠购自杰克逊实验室(缅因州巴港)，并于康奈尔大学兽医学院的东校区研究机构(ECRF)中饲养。研究按照康奈尔大学IACUC批准的方法实施。

STZ模型

在使用之前，链脲霉素(STZ)(西格玛公司(Sigma)，密苏里州圣路易斯)直接溶解于冰上冷却的0.1M柠檬酸钠缓冲液(pH4.2)。连续5天每天对四组6～8周龄的C57BL/6J(B6)雄性小鼠腹膜内注射40或50mg/kg体重的STZ，以诱导β细胞凋亡。使用接受柠檬酸钠的另一组小鼠作为对照。在最后一次注射之后三天，通过

2血糖监测***(拜尔健康护理有限责任公司(Bayer Healthcare LLC)，印第安纳州米沙沃卡)使用Bayer Breeze血糖测试条(拜尔健康护理有限责任公司(Bayer Healthcare LLC)，印第安纳州米沙沃卡)测定动物的血糖水平。每3天监测血糖水平直至达到糖尿病葡萄糖水平(>250mg/dL)。本研究中不使用没有达到糖尿病血糖水平的STZ处理小鼠。

在建立高血糖症之后，向小鼠提供氯霉素处理的(1g/L)饮用水18小时，以除去兼性存留的细菌。采用pFD-GLPC修饰染色体的Nissle菌株(Nissle-GLP-1)在氯霉素存在下从LB培养基中1:500稀释的过夜培养物生长至OD₆₀₀=1。通过以1000×g离心3分钟收集细菌。所得沉淀重新溶解于200μL含1%蔗糖的无菌LB。经氯霉素处理后，以50μL/25g体重给小鼠喂食含1%蔗糖的LB，所述LB含10⁹CFU/mL(OD₆₀₀=20)的卢里亚(Luria)肉汤所培养单独Nissle菌株(Nissle或Nissle-GLP-1)。喂食的细菌体积根据小鼠体重标准化。所有喂食Nissle菌株的小鼠在整个实验中喂食两次Nissle/天。每7～10天检测小鼠的体重和葡萄糖水平。在大多数情况中，测试禁食葡萄糖水平。隔开这些检测彼此，以使小鼠压力水平最低化。

葡萄糖耐量测试和ELISA

使小鼠禁食10小时，称重，并使用肝素化的微量血细胞压积毛细管(Micro-Hematocrit Capillary Tube)(费舍尔公司(Fisher)，宾夕法尼亚州)从尾静脉收集血液样品。然后，以25mg/kg体重腹膜内注射葡萄糖，并在0.5、1、1.5小时取血样。使用

2血糖监测***测量血浆葡萄糖。使用大鼠/小鼠胰岛素ELISA试剂盒(密理博公司(Millipore)，马萨诸塞州)，按照生产商说明书测量血浆胰岛素。

细菌计数

给6～8周龄的C57BL/6J(B6)雄性小鼠提供含氯霉素(1g/L)的饮用水18小时，以去除兼性留存的细菌。Nissle菌株(Nissle和Nissle-GLP-1)的过夜培养物以1:500在LB培养基中稀释，并生长至OD600=1。通过以1000×g离心3分钟收集细菌。所得团块在含1%蔗糖的无菌LB中重悬至OD600=20。在氯霉素处理之后，通过口服管饲法以50μL/25g体重给小鼠喂食含浓缩重悬物的带1%蔗糖LB(每天两次，所得剂量为10⁹CFU/动物)。在喂食20天后，将小鼠转移至新笼3天。从所述新笼中收集粪便，并对小鼠实施安乐死。解剖来自各处理的至少三只小鼠，并移出其胃肠(GI)道。将胃肠(GI)道切成两端(GI小肠上部和GI大肠下部)。沿一侧打开所述GI下部，温和刮擦移除粪便并用1×PBS冲洗。所述GI上部在称重前不冲洗或刮擦。分别称重所述上部和下部GI道，然后在4mL新鲜LB培养基中均质化。将均质化的组织置于MacConkey琼脂板上，所述板含有连续稀释的相应抗生素。板在37°C过夜孵育，计数其菌落。

免疫组化

本研究中使用的所有经处理小鼠都按照标准操作程序使用CO2实施安乐死。将在葡萄糖耐量测试后处死的小鼠肠和胰腺组织在4%多聚甲醛中固定过夜，然后用1×PBS冲洗三次，并浸泡在70%乙醇中。然后解剖固定的组织。

在脱石蜡后，固定的组织切片在IHC-Tek^TM表位修复溶液(IHC World公司，马里兰州伍德斯托克)中汽蒸，然后在含0.5%过氧化氢(费舍尔公司(Fisher)，宾夕法尼亚州匹兹堡)的甲醇中浸泡10分钟，以封阻内源性过氧化物酶。在0.01MPBS(pH7.2)中洗涤后，于湿度箱中室温施加10%常规封闭山羊血清(英杰公司(Invitrogen)，加利福尼亚州卡尔斯巴德)30分钟。将在PBS+1×酪蛋白(维克多公司(Vector)，加利福尼亚州柏林格姆)中1:50稀释的兔抗胰岛素(H-86，圣克鲁斯生物技术公司(Santa Cruz Biotechnology))施加至封闭的样品，然后在湿度箱内37°C孵育1.5小时。在PBS中洗涤4次后，将在PBS中1:200稀释的生物素化第二抗体山羊抗兔(维克多公司(Vector))施加至样品，在湿度箱内室温孵育20分钟。样品与链霉素过氧化物酶(英杰公司(Invitrogen))在湿度箱内室温孵育20分钟，然后用PBS洗涤3次。样品与AEC色原/底物溶液(chromogen/substrate solution)(英杰公司(Invitrogen))在室温孵育。显色在普通光学显微镜下监测约5～15分钟。使用蒸馏水冲洗来终止反应。

一些肠组织和胰腺用苏木精(费舍尔公司(Fisher))复染30秒，然后在自来水中冲洗5分钟。使用水性荧光封片剂(费舍尔公司(Fisher))封固样品。用彩色相机在普通光学显微镜(莱卡公司(Leica)，伊利诺斯州班诺克本)下拍照。通过ImageJ软件(NIH-NCBI)分析染色的胰腺组织图片，以依照红色显色估计β细胞覆盖率。

免疫荧光

石蜡免疫荧光法——胰岛素、PDX-1、ChrA、溶菌酶和SI

使喂食Nissle菌株(Nissle和Nissle-GLP-1)60天后处死的小鼠肠和胰腺组织在4%多聚甲醛中固定过夜，然后用1×PBS洗涤三次，并浸泡在70%乙醇中。然后解剖固定的组织。脱石蜡后，在0.01M柠檬酸盐缓冲液中汽蒸固定的组织切片。在0.01M PBS(pH7.2)中洗涤后，于湿度箱中室温施加10%常规封闭驴血清(加利福尼亚州圣克鲁斯生物技术公司(Santa Cruz Biotechnology))1小时。将以1:50稀释的兔抗胰岛素(加利福尼亚州圣克鲁斯生物技术公司(Santa CruzBiotechnology)，加利福尼亚州)和在PBS+l×酪蛋白(维克多公司(Vector)，加利福尼亚州柏林格姆)中1:500稀释的山羊抗PDX-1(阿柏堪穆公司(Abeam)，马萨诸塞州剑桥)、1:50稀释的抗山羊ChrA、抗山羊溶菌酶或抗山羊蔗糖酶异麦芽糖酶(SI)(加利福尼亚州圣克鲁斯生物技术公司(Santa Cruz Biotechnology))施加至封闭的样品，然后在湿度箱中4°C孵育过夜。在PBS中洗涤4次后，将在PBS中1:200稀释的荧光色素偶联第二抗体Alexa

488驴抗兔IgG和Alexa

555驴抗山羊IgG(英杰公司(Invitrogen))施加至样品并在湿度箱中室温孵育1.5小时。

在PBS中洗涤3次后，使样品与300nM DAPI染色溶液(英杰公司(Invitrogen))孵育3分钟。然后，使用glod抗衰减试剂(英杰公司(Invitrogen))封固样品。使用就各荧光团合适的激发波长直接检测样品。用Zeiss710共聚焦显微镜(蔡司公司(Zeiss)，德国耶拿)拍照。

冷冻切片免疫荧光——Glp-1

收获喂食Nissle菌株10天的小鼠的肠和胰腺，在OCT化合物中速冻，并实施冷冻切片(8μM)。使切片空气干燥1小时，然后在冰冷丙酮中固定5分钟。空气干燥过夜后，切片在PBST(0.05%吐温(Tween))中清洗3次。下列操作方案修改自M.O.M^TM试剂盒染色方法(维克多公司(Vector))。用0.1%曲通(Triton)X-100透化细胞15分钟，然后在PBS中清洗两次。含有10%常规驴血清(加利福尼亚州圣克鲁斯生物技术公司(Santa Cruz Biotechnology))的M.O.M.^TMIg封闭试剂工作溶液在湿度箱中室温应用1小时。切片在PBS中清洗2次，每次2分钟。组织切片在M.O.M.^TM稀释剂工作溶液中孵育5分钟。然后，样品与M.O.M.^TM稀释剂1:100中稀释的兔抗GLP-1(1-19)(阿柏堪穆公司(Abcam))在37°C孵育30分钟，然后室温孵育30分钟。在PBST中清洗2次，然后在PBS中清洗4次后，将PBS中1:200稀释的荧光色素偶联第二抗体Alexa

488驴抗兔IgG和Alexa

555驴抗山羊IgG(英杰公司(Invitrogen))在湿度箱中室温应用于样品1小时。后续在PBST中清洗3次之后，样品在300nM DAPI染色溶液(英杰公司(Invitrogen))中孵育3分钟。样品在PBS中冲洗3次，并使用

glod抗衰减试剂(英杰公司(Invitrogen))封固。使用就各荧光团合适的激发波长直接检测样品。使用Zeiss710共聚焦显微镜拍照。

计算并估测重编程细胞数

用于测定喂食Nissle-GLP-1的小鼠内的重编程细胞数量的计算

假定每只小鼠1×10⁶个β细胞(Bock,T.,Svenstrup,K.,Pakkenberg,B.和Buschard,K.Unbiased estimation of total beta-cell number and mean beta-cellvolume in rodent pancreas(啮齿类动物胰腺中的总β细胞数量和平均β细胞量的无偏估测).Apmis107,791-799(1999))和肠上部中1.9×10⁷个细胞/cm²(Cheng,H.和Bjerknes,M.Cell production in mouse intestinal epithelium measured bystathmokinetic flow cytometry and Coulter particle counting(通过***静止流式细胞术和库尔特颗粒计数检测小鼠肠上皮内的细胞生成).Anat Rec207,427-434,doi:10.1002/ar.1092070305(1983))，我们用估测的小鼠肠上部表面积(十二指肠+空肠，332.4cm²，参见Casteleyn,C,Rekecki,A.,Van der Aa,A.,Simoens,P.和Van den Broeck,W.Surface area assessment of the murine intestinal tract as aprerequisite for oral dose translation from mouse to man(鼠肠道表面积估测作为从小鼠到人的口服剂量转换的先决条件).Lab Anim44,176-183,doi:10.1258/la.2009.009112(2010))乘以估计的重编程细胞百分数(0.00013)，单位为细胞/cm²，得出在健康小鼠中，估测重组细胞约为β细胞数的82%。

基于小鼠实验的估测剂量的计算

在该实施例报道的实验中，我们以10⁹cfu/mL每天对小鼠喂食两次。这等同于8×10¹⁰CFU/kg小鼠体重。鉴于4.0×10¹¹CFU/g的益生菌补充形式市售可得，且假定人体重范围是儿童25kg～成人75kg，这意味着每日剂量是5～15g/d。然而，如果定殖效率比Rao.S等人报道的高出2个数量级(参见Rao,S.等.Toward alive microbial microbicide for HIV:Commensal bacteria secreting an HIV fusioninhibitor peptide(用于HIV的活微生物杀微生物剂：分泌HIV融合抑制剂肽的共生细菌);Proc Natl Acad Sci USA102,11993-11998(2005))，那么所述剂量为50～150mg/d。

6.11.实施例11：向非肥胖糖尿病(NOD)小鼠喂食分泌GLP-1的共生细菌的效果

该实施例证明向遗传所致糖尿病小鼠(非肥胖糖尿病，NOD)喂食分泌GLP-1(1-37)的共生细菌的效果。我们给NOD小鼠喂食表达假肽的大肠杆菌Nissle1917(Nissle)、分泌GLP-1(1-37)的Nissle(Nissle-GLP-1)或不含细菌的培养基46天。结果显示，相比于仅喂食培养基(p=0.0003)或喂食Nissle的的对照NOD小鼠(p=.0008)，喂食Nissle-GLP-1的小鼠内血糖水平显著降低。此外，观察到Nissle-GLP-1小鼠的尿液输出低很多。Nissle喂食小鼠相较于仅喂食培养基的小鼠也显示显著较低的血糖水平(p=0.01)。

本研究中，Nissle喂食小鼠和对照小鼠明显不健康，且其常规血糖水平高于400mg/dL，而Nissle-GLP-1喂食小鼠(也显示不健康)的血糖水平在46天期间处于160～250mg/dL范围内。

引言

鉴于本研究的标准模式生物之一是1型糖尿病(T1DM)，所述NOD小鼠带有遗传缺陷，所述遗传缺陷导致胰腺β细胞以及全身的其它内分泌***的破坏。该脱靶作用使得将其对于研究T1DM不太理想，因为其除T1DM样病理学之外还带有其它全身性病理学。尽管有此限制，其在本领域中仍被认为是早期证明概念工作的充分模型。

就该实施例而言，研究使用共生细菌递送肽GLP-1(1-37)至肠上皮细胞对NOD小鼠内血糖水平的影响。

实验方法

依照康奈尔大学IACUC批准的方法处理用于这些实验的NOD雌性小鼠(NOD/ShiLtJ小鼠)。所有小鼠饲养在康奈尔大学兽医学院的东校区研究机构(ECRF)。所有小鼠购自杰克逊实验室(缅因州巴港)。通过

2血糖监测***(印第安纳州米沙沃尔的拜尔健康护理有限责任公司(Bayer Healthcare LLC))使用Bayer

血糖测试条(拜尔健康护理公司(Bayer Healthcare))监测三组6周龄NOD/ShiLtJ雌性小鼠(n=5)的血糖水平。每5～7天检测血糖水平直至达到糖尿病葡萄糖水平(>250mg/dL)。到达糖尿病血糖水平需要12～14周。未能达到高血糖症血糖水平的小鼠被处以安乐死。

在建立高血糖症之后，向所有小鼠提供氯霉素(1g/L)饮用水18小时，以除去共生存留的细菌。使来自过夜培养物并在LB培养基中1:500稀释的Nissle菌株(Nissle、Nissle-GLP-1)生长至OD600=1。通过以1000×g离心3分钟收集细菌。将所得团块重新溶解于200μL含1%蔗糖的无菌LB。氯霉素处理后，小鼠通过口服管饲法以50μL/25g体重喂食含10⁹CFU(OD600=20)的Nissle、Nissle-GLP-1或无细菌(仅有蔗糖的无菌培养基)的带1%蔗糖LB。向小鼠喂食不含添加剂的单一菌株。一旦管饲法开始，从小鼠笼中移去氯霉素处理的水。通过管饲法一天两次喂食Nissle菌株或含蔗糖的无菌培养基46天。在细菌喂食开始后的第11、21、30和46天检测小鼠体重和血糖。

结果

一天两次用Nissle-GLP-1、Nissle喂食或不用细菌口服喂食NOD小鼠46天。表1显示实验中小鼠的存活和糖尿病发作数据。所有处理各由5只小鼠开始。除了喂食Nissle-GLP-1的小鼠，整个实验中观察到所有小鼠分泌高水平尿液。喂食Nissle-GLP-1的小鼠确实显示尿液输出水平提高，但没有达到其它小鼠的程度。

在开始喂食Nissle菌株之前，被认为是高血糖症阳性的所有小鼠显示血糖水平高于500mg/dL。每次实验中的平均小鼠禁食(6h)血糖水平示于图21。喂食Nissle和Nissle-GLP-1的小鼠的血糖水平相较于对照小鼠都显著降低。46天后，Nissle喂食相较于对照显示出显著效果(p=.01)，并且Nissle-GLP-1具有更显著的效果(p=.0003)。Nissle-GLP-1和Nissle间也有显著差异(p=.0008)。所有对比采用斯氏双尾t检验(n=4、3或2，参见表1)进行(假定等方差)。

在不同处理间或实验过程的处理中，在小鼠体重方面没有显著差异。所有小鼠的重量普遍随着时间减少(图22)。

结论

这些数据指示，Nissle和Nissle-GLP-1都能显著降低NOD小鼠内的血糖水平。然而，这些数据来自非常小的小鼠组。到46天时，各组仅存2只小鼠。也就是说，Nissle-GLP-1组中小鼠的血糖水平还远低于其它两组，指示NOD小鼠针对任何重编程细胞可能激发的任何免疫应答在该时间范围内没有效果。

表1：该实施例的小鼠存活情况

表1：小鼠存活

本发明的范围不受本文所述具体实施方式的限制。事实上，除本文描述的那些以外，本领域技术人员由前述说明清楚了解可以在不偏离本发明精神和范围的情况下对本发明作各种修改和变化。因此，本发明应涵盖对本发明的这些修改和变化，只要这些修改和变化在所附权利要求及其等同物的范围之内。

本文引用的所有参考文献通过引用全文纳入本文以用于所有目的，就好像将各篇单独的出版物、专利或专利申请特定和单独地通过引用全文纳入本文用于所有目的一样。

任何出版物的引用针对提交日之前的公开而不应解释为承认本发明不具有通过在先发明先于这些出版物的权利。

Claims (47)

1.一种含有信号序列和启动子的重组细胞，其中：

a.所述信号序列调控宿主内靶核酸的信号依赖性表达；

b.所述重组细胞获自肠细菌或共生细菌，和

c.所述信号序列是GLP-2、其片段或其类似物或其组合。

2.一种含有信号序列和启动子的重组细胞，其中：

a.所述信号序列调控宿主中靶核酸的信号依赖性表达；

b.所述重组细胞获自肠细菌或共生细菌，和

c.所述靶标核酸编码能够使所述宿主的第一种细胞重编程为第二种细胞的哺乳动物因子。

3.如权利要求1或2所述的重组细胞，其特征在于，所述宿主是哺乳动物。

4.如权利要求2所述的重组细胞，其特征在于，所述第二种细胞是β样细胞、甲状腺细胞、肝细胞或免疫响应性细胞。

5.如权利要求2所述的重组细胞，其特征在于，所述宿主的第一种细胞是肠上皮细胞。

6.如权利要求2所述的重组细胞，其特征在于，所述第二种细胞是葡萄糖响应性胰岛素分泌细胞。

7.如权利要求1或2所述的重组细胞，其特征在于，所述信号序列调控靶核酸响应环境刺激的信号依赖性表达。

8.如权利要求7所述的重组细胞，其特征在于，所述启动子是葡萄糖响应性启动子。

9.如权利要求2所述的重组细胞，其特征在于，所述信号序列选自GLP-1、GIP、PDX-1、其一种或多种片段、其类似物或其组合。

10.如权利要求2所述的重组细胞，其特征在于，所述信号序列选自GLP-1、PDX-1、GIP、GLP-2、胰岛素、生长激素、促乳素、降钙素、黄体生成激素、甲状旁腺激素、促生长素抑制素、促甲状腺激素、血管活性肠多肽、三叶因子、细胞和组织修复因子、转化生长因子β、角质细胞生长因子、采用反平行4α螺旋束结构的第1结构组细胞因子、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、GM-CSF、M-CSF、SCF、IFN-γ、EPO、G-CSF、LIF、OSM、CNTF、GH、PRL、IFNα/β、第2结构组细胞因子、TNF-家族细胞因子、TNFα、TNFβ、CD40、CD27、FAS配体、IL-1-家族细胞因子、成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子、转化生长因子p、神经生长因子、包含短链α/β分子的第3结构组细胞因子、表皮生长因子家族细胞因子、C-C或C-X-C趋化因子、胰岛素相关细胞因子、第4结构组细胞因子、调蛋白、神经调节蛋白、EGF、免疫球蛋白样结构域、三环结构域、其一个或多个片段、其类似物及其组合。

11.如权利要求1或2所述的重组细胞，其特征在于，所述信号序列和所述启动子在所述重组细胞内的质粒上编码。

12.如权利要求1或2所述的重组细胞，其特征在于，所述细胞源自益生菌。

13.如权利要求1或2所述的重组细胞，其特征在于，所述细胞是选自埃希氏菌(Escherichia)、假单胞菌(Pseudomonas)、拟杆菌(Bacteroides)、乳杆菌(Lactobacillus)、乳球菌(Lactococcus)、芽孢杆菌(Bacillus)、变形杆菌(Proteus)、双歧杆菌(Bifidobacterium)、链球菌(Streptococcus)、葡萄球菌(Staphylococcus)和棒状杆菌(Corynebacterium)的细菌。

14.如权利要求1或2所述的重组细胞，其特征在于，所述靶核酸编码哺乳动物因子，所述哺乳动物因子能促进宿主内所需生理过程功能，或能治疗宿主内非感染性疾病。

15.如权利要求14所述的重组细胞，其特征在于，所述非感染性疾病选自自体免疫性疾病、癌症、内分泌疾病、胃肠疾病、癌症及其组合。

16.如权利要求14所述的重组细胞，其特征在于，所述非感染性疾病是糖尿病。

17.如权利要求16所述的重组细胞，其特征在于，所述糖尿病是1型糖尿病、2型糖尿病或代谢综合症。

18.如权利要求14所述的重组细胞，其特征在于，所述非感染性疾病选自克罗恩氏病、肥胖、苯丙酮尿症、槭树糖浆尿病、组氨酸血症、高血糖症、糖尿病性视网膜病、冠心病、毛细血间肾小球硬化症、肾病、神经病、四肢溃疡或坏疽、动脉粥样硬化、高胆固醇血症、高血压、高蛋白血症、蛋白尿症、骨质疏松、贫血、高脂蛋白血症、酮酸中毒、高甘油三酯血症、乳酸性酸中毒、心肌病、威尔逊病、脑白质病、岩藻糖苷病、癌症、化疗诱导的腹泻、炎性肠病、心室和心房纤颤、手术后器官衰竭、肠易激综合症、间质性膀胱炎/膀胱痛综合症、短肠综合症、溃疡性结肠炎及其组合。

19.如权利要求18所述的重组细胞，其特征在于，所述癌症是胃肠癌、胃癌、胆囊癌、胃肠基质肿瘤、肝癌、胰腺癌或结肠癌。

20.如权利要求14所述的重组细胞，其特征在于，所述哺乳动物因子在肠损伤或手术后促进所需生理过程功能。

21.如权利要求2所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞能够到达肠绒毛但不被吸收进入宿主全身循环。

22.如权利要求1或2所述的重组细胞，其特征在于，所述启动子是诱导型或组成型启动子。

23.如权利要求1或2所述的重组细胞，其特征在于，所述启动子是fliC启动子。

24.如权利要求1或2所述的重组细胞，所述重组细胞还包括分泌标签。

25.如权利要求1或2所述的重组细胞，其特征在于，所述分泌标签是fliC分泌标签。

26.如权利要求1或2所述的重组细胞，其特征在于，所述分泌标签是α-溶血素(HlyA)分泌标签。

27.如权利要求1所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞还包含细胞穿透肽(CPP)序列。

28.如权利要求26所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞表达信号序列为融合蛋白，其中，所述融合蛋白包含由所述信号序列编码的信号和由所述细胞穿透肽序列编码的细胞穿透肽。

29.一种治疗宿主内糖尿病的方法，所述方法包括对所述宿主给予如权利要求2所述的重组细胞的步骤。

30.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述靶信号序列刺激疾病预防因子表达或抑制糖尿病引发因子的表达。

31.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述糖尿病是1型糖尿病、2型糖尿病或代谢综合症。

32.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述信号序列调控靶核酸响应环境刺激的信号依赖性表达。

33.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述环境刺激是葡萄糖。

34.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述疾病预防因子包括胰岛素。

35.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述靶核酸编码促进宿主内血糖水平降低的哺乳动物因子。

36.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述靶核酸编码促进宿主内血液胰岛素水平增加的哺乳动物因子。

37.一种使哺乳动物宿主内肠细胞分化成为另一种细胞类型的方法，所述方法包括对所述宿主给予如权利要求2所述的重组细胞的步骤。

38.如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述另一种细胞类型是β样细胞、甲状腺细胞、肝细胞或免疫响应性细胞。

39.如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述β样细胞是葡萄糖响应性细胞。

40.如权利要求29或37中任一项所述的方法，其特征在于，给予有效量的所述重组细胞。

41.如权利要求29或37中任一项所述的方法，其特征在于，所述重组细胞的有效量是至少约10⁴CFU/kg。

42.如权利要求29或37中任一项所述的方法，其特征在于，所述重组细胞与具有协同作用的化合物联合给予。

43.如权利要求29或37中任一项所述的方法，其特征在于，所述具有协同作用的化合物选自DPP-4抑制剂、GLP-2、GLP-1激动剂、二甲亚砜、胰岛素、α-葡萄糖苷酶抑制剂、普兰林肽、美格列奈、瑞格列奈、那格列奈、氯磺丙脲、甲福明二甲双胍、磺脲、格列甲嗪、格列本脲、格列美脲、噻唑烷二酮类、其类似物、其片段及其组合。

44.如权利要求29或37中任一项所述的方法，其特征在于，所述信号序列选自GLP-1、PDX-1、GIP、GLP-2、胰岛素、生长激素、促乳素、降钙素、黄体生成激素、甲状旁腺激素、促生长素抑制素、促甲状腺激素、血管活性肠多肽、三叶因子、细胞和组织修复因子、转化生长因子β、角质细胞生长因子、采用反平行4α螺旋束结构的第1结构组细胞因子、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、GM-CSF、M-CSF、SCF、IFN-γ、EPO、G-CSF、LIF、OSM、CNTF、GH、PRL、IFNα/β、第2结构组细胞因子、TNF-家族细胞因子、TNFα、TNFβ、CD40、CD27、FAS配体、IL-1-家族细胞因子、成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子、转化生长因子p、神经生长因子、包含短链α/β分子的第3结构组细胞因子、表皮生长因子家族细胞因子、C-C或C-X-C趋化因子、胰岛素相关细胞因子、第4结构组细胞因子、调蛋白、神经调节蛋白、EGF、免疫球蛋白样结构域、三环结构域、其一个或多个片段、其类似物及其组合。

45.如权利要求29或37中任一项所述的方法，其特征在于，所述信号序列是GIP、GLP-1、GLP-2、PDX-1、其片段、其类似物及其组合。

46.一种使宿主内肠细胞重编程为葡萄糖响应性胰岛素分泌细胞的方法，所述方法包括给予包含信号序列和启动子的重组细胞的步骤，其中，所述信号序列选自GLP-1、GIP、PDX-1、其片段、其类似物及其组合。

47.如权利要求46所述的方法，其特征在于，所述宿主是高血糖症患者，从而向所述高血糖症宿主给予所述重组细胞减少或消除对所述宿主治疗性给予外源胰岛素的需求。

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