CN115747111B

CN115747111B - 一株戊糖片球菌及其应用

Info

Publication number: CN115747111B
Application number: CN202211489854.1A
Authority: CN
Inventors: 岳碧松; 尚可
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2022-11-25
Filing date: 2022-11-25
Publication date: 2023-12-12
Anticipated expiration: 2042-11-25
Also published as: CN115747111A

Abstract

本发明公开了一株戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)GZ0620及其应用。该菌株从采自贵州省黎平县果利寨传统发酵食品(酸辣子)中分离得到，在MRS琼脂培养基上生长良好，无溶血现象，对多种常见类型的抗生素敏感，对酸、胆盐、人工胃液、人工肠液有较好的耐受能力，对人结肠癌细胞HT‑29黏附能力强，产乙酸和乳酸能力较强，并具有一定的降低血糖和胆固醇的潜力，对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌、空肠弯曲杆菌和大肠弯曲杆菌具有较强的抑制能力，对DSS诱导的小鼠结肠炎模型有较好的预防和治疗效果，炎症指标明显降低。因此，该菌株可应用于人和动物功能性食品领域。

Description

一株戊糖片球菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株具有较强抑菌和抗炎作用的戊糖片球菌，特别涉及功能性乳酸菌及其制品生产开发领域。

背景技术

肠道微生物被认为是“被忽略的重要器官”。机体为种类繁多的肠道微生物提供了适宜的生存环境，而肠道微生物可调节宿主的代谢和免疫功能，二者成为了协调的整体。益生菌指一类可以调节宿主肠道微环境，产生益生性物质，维持机体健康的活性微生物。乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)是一种被广泛认可的益生菌，其能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸，主要形态包括棒状、球状、链状或栅栏状。自然界中乳酸菌种类繁多，分布广泛。近年来，与乳酸菌相关的研究逐渐丰富，其在人体和动物的疾病防治领域越来越受到重视。炎症性肠炎(inflammatory bowel disease，IBD)是一种威胁现代人类和动物健康的慢性肠道性疾病，其诱因复杂，主要由遗传、环境和菌群等因素导致。该病常见的临床表现包括体重下降、腹泻、腹痛以及血便，同时会增加癌变的潜在风险。由于其发生原因复杂，发展过程难以探寻，往往不能得到彻底的根治。作为传统药物的辅助产品，益生菌制品在炎症性肠炎的防治中越来越受到关注。目前，积极开发新型益生菌菌株已成为全世界的趋势。

发酵食品一直是新型益生菌开发的宝贵来源，食品源乳酸菌不但具有较高的安全性，而且性状较其它样品源而言更加优良，发酵食品是利用微生物附着在蔬菜表面，从而进行自然发酵。在我国，发酵食品有着悠久的食用传统，人类日常食物中的蔬菜、肉和奶制品等都可以利用乳酸菌进行发酵生产出具有特殊风味和益生特性的食品。细菌活性会直接影响发酵食品最终的品质和风味。虽然在食品发酵过程中有多种微生物参与，但已有研究表明，其主要作用的为乳酸菌类。在发酵初期，乳酸菌的数量和种类较少，随着时间的推移，其会处于优势地位。乳酸菌在生长代谢中会产生有机酸调控周围的环境，降低肠道微生态的酸碱度，从而抑制病原菌的生长。此外，其产生的细菌素等抗微生物活性物质也可抑制致腐菌和致病菌的生长。一些乳酸菌可以通过产生功能活性因子、调节肠道菌群、调控脑肠轴，为宿主带来健康功效。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为：如何提供一株抑菌和抗炎作用较强的戊糖片球菌及其应用。

本发明的技术方案为：一株戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)GZ0620，于2022年10月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.25906。

戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)GZ0620在非疾病治疗目的的抑制大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌、空肠弯曲杆菌或大肠弯曲杆菌上的应用。

戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)GZ0620在制备治疗大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌、空肠弯曲杆菌或大肠弯曲杆菌导致疾病的药品中的应用。

戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)GZ0620在制备抗肠炎药物中的应用。

戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)GZ0620在调节人或动物肠道菌群的功能性食品中的应用。

戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)GZ0620在制备降低血糖或胆固醇药物中的应用。

本发明的戊糖片球菌GZ0620是从贵州省黎平县果利寨传统发酵食品(酸辣子)中分离得到。戊糖片球菌GZ0620在MRS琼脂培养基上生长良好，菌落为乳白色，表面光滑，边缘整齐，不透明，对菌体形态进行镜检，革兰氏染色呈紫色，球状。通过采用细菌通用引物16SrRNA的27F/1492R对其基因组总DNA为模板进行PCR扩增，得到由1010个碱基对(bp)组成的目的基因序列，序列如SEQ ID No.1所示。将测序得到的基因序列输入NCBI数据库进行比对，其与GenBank中的标准菌株Pediococcus pentosaceus strain FB181相似率达99.43％，可初步鉴定该菌株为戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)。

本发明的戊糖片球菌GZ0620通过耐酸、耐胆盐和黏附试验表明，其对酸和胆盐有较好的耐受能力，对人结肠癌细胞HT-29黏附能力较强。

本发明的戊糖片球菌GZ0620对多种致病菌具有较强的抑制活性，可抑制大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌、空肠弯曲杆菌和大肠弯曲杆菌生长。

本发明的戊糖片球菌GZ0620通过动物实验表明，对DSS小鼠结肠炎模型有较好的预防和治疗效果，多种炎症因子水平明显降低，并对肠道菌群有较好的调节作用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明提供的戊糖片球菌GZ0620分离筛选自贵州酸辣子，在MRS琼脂培养基上生长良好，对酸和胆盐有一定的耐受能力，对人结肠癌细胞HT-29黏附能力强。

2、戊糖片球菌GZ0620对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌、空肠弯曲杆菌和大肠弯曲杆菌等常见病原细菌抑菌能力较强。

3、本发明提供的戊糖片球菌GZ0620通过动物实验表明，对DSS小鼠结肠炎模型有较好的预防和治疗效果，炎症指标明显降低。因此，应用于功能性食品领域，不仅具有实际生产价值，而且对人和动物健康也具有非常重要的意义。

保藏信息：

戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)GZ0620，于2022年10月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.25906。

附图说明

图1戊糖片球菌GZ0620与其它菌株的***进化关系；

图2戊糖片球菌GZ0620菌株在MRS琼脂培养基上的菌落形态图(A)和革兰氏染色图(B)；

图3戊糖片球菌GZ0620菌株的溶血性实验；

图4戊糖片球菌GZ0620菌株发酵液短链脂肪酸GC-MS测定总离子流色谱图；

图5DSS诱导小鼠结肠炎脾脏指数测定，A为预防期，B为治疗期；

图6DSS诱导结肠炎小鼠肠道菌群多样性(A)和物种组成(B)。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。

本发明中所述的标准菌株LGG是指鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosusATCC53103。

实施例1戊糖片球菌GZ0620的分离、鉴定和安全性评估：

1.1戊糖片球菌GZ0620的分离、鉴定：贵州酸菜样品采自贵州省黎平县果利寨；取少许酸辣子样品于50mL MRS肉汤中，充分振荡混匀，置于37℃恒温摇床培养24h。采用10倍梯度稀释，涂布接种于MRS琼脂培养基，37℃培养24h后挑取单菌落，并连续纯化3次。将纯化后的菌株接种于600μL MRS肉汤培养基中，37℃摇床培养18h，加入400μL浓度50％(V/V)的无菌甘油，于-80℃超低温冰箱中冻存备用。

冻存菌株活化培养后用MRS肉汤培养基进行扩培，用天根细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株DNA，16S rRNA扩增采用菌落PCR技术完成，PCR引物为16S rRNA通用引物27F和1492R，序列如下：

27F：5-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3，1492R：5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3

PCR产物测序由生工生物工程(上海)有限公司完成，其16S rRNA序列如SEQIDNo.1所示。将此序列与NCBI中BLAST进行比对，与标准菌株Pediococcus pentosaceusstrain FB181相似率达99.43％，可初步鉴定该菌株为戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)，并命名为GZ0620。该菌株与其它菌株的***发育关系如附图1。将该菌株于2022年10月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.25906。

将戊糖片球菌GZ0620接种于MRS琼脂培养基上，37℃培养24h后，观察并记录单菌落的形态。采用试剂盒法对戊糖片球菌GZ0620进行革兰氏染色，在显微镜下观察并记录染色后的细菌形态。戊糖片球菌GZ0620在MRS琼脂培养基上生长良好，菌落形态乳白色、圆形凸起、边缘平整、表面光滑，如图2中A所示。革兰氏染色后，在光学显微镜下可见菌体呈球状、紫色，符合革兰氏阳性菌的染色特征(图2中B)。

1.2溶血性和抗生素抗性

采用纸片琼脂扩散法测试该菌株对常见抗生素的敏感性。将副干酪乳杆菌GZ0613菌株活化培养，菌液浓度调整至1×10⁶CFU/mL，用无菌棉签将菌液均匀地涂抹于MRS培养基平板表面，室温10min后放入药敏纸片，37℃培养24h后，用游标卡尺测量各药敏纸片周围的抑菌圈直径，每种抗生素重复3次，试验结果参照美国临床实验室标准委员会(NCCLS)标准判断菌株的药物敏感性，结果以敏感(S)、中介(I)和耐药(R)表示。

溶血性实验结果表明，在菌落周围没有出现溶血现象(图3)；对测试的四环素、氨苄西林、头孢曲松、克林霉素、克拉霉素和氯霉素6种抗生素均表现为敏感(S)或中介(I)，说明戊糖片球菌GZ0620菌株的安全性(表1)。

表1戊糖片球菌GZ0620菌株对6种抗生素的敏感性

编号

四环素

氨苄西林

头孢曲松

克林霉素

克拉霉素

氯霉素

GZ0620

I

S

实施例2戊糖片球菌GZ0620的主要发酵特征检测

2.1、耐酸性和耐胆盐性评估：将待测菌株戊糖片球菌GZ0620在MRS琼脂平板上进行复苏并活化3代，并调节菌液初始浓度达到1×10⁶CFU/mL。使用盐酸和猪胆盐分别配制酸度(pH＝3.0)及胆盐浓度(0.3％)的MRS肉汤培养基。将1mL待测菌株戊糖片球菌GZ0620菌液接种于pH＝3.0的肉汤培养基中，37℃培养18h。培养完毕，适当摇晃离心管，吸取20μL菌液涂布于MRS琼脂平板培养基，设置3个重复，于37℃培养24h。观察培养后MRS平板表面是否有菌落生长。同样，将1mL待测菌株戊糖片球菌GZ0620菌液接种于胆盐浓度为0.3％的MRS肉汤培养基，37℃培养18h后，涂平板，37℃培养24h，查看菌落生长情况。

耐酸性试验结果表明，戊糖片球菌GZ0620在pH＝3.0的MRS肉汤培养基中处理18h后仍可在MRS琼脂平板上长出正常菌落；耐盐性试验结果表明，戊糖片球菌GZ0620在胆盐浓度为0.3％ MRS肉汤培养基中耐受18h后仍可在MRS琼脂平板上长出正常菌落；说明戊糖片球菌GZ0620具有较强的耐酸和耐胆盐特性。

2.2、细胞粘附性试验：将戊糖片球菌GZ0620复苏后接种于MRS肉汤培养基中，37℃恒温培养24h。培养完毕后置于-4℃、5000r/min条件下离心10min，并用无菌PBS缓冲液多次洗涤。调整菌悬液浓度至1×10⁶CFU/mL后备用。复苏人结肠癌细胞HT-29，将其接种至细胞培养板，添加DMEM完全培养基并置于37℃、CO₂浓度为5％的二氧化碳培养箱中培养，每隔一天更换一次培养液。当细胞贴壁状态达80％时，使用0.25％胰酶-EDTA进行消化，并传代培养。培养完毕后用细胞血球计数板对其进行计数，并将细胞浓度调整至5×10⁶个/mL。将1mL细胞悬浮液加至六孔细胞培养皿的其中一培养孔中，置于培养箱中培养。待培养板中的细胞长至单层，弃掉DMEM培养液，用无菌PBS将每孔冲洗3次。将1mL已制备好的菌悬液加入细胞孔，轻微晃动细胞培养板，吸取孔中少量菌液用于平板计数，其结果作为菌悬液中的初始活菌数。将细胞板置于37℃孵育2h，弃去培养基并用无菌PBS缓冲液洗涤3次。使用0.7mL0.25％胰蛋白酶-EDTA消化细胞10min，待细胞完全脱落后加入0.3mLDMEM培养液终止消化，收集黏附实验结束后的培养液进行平板计数，其结果作为黏附活菌数。并用标准菌株LGG作为对照。

粘附率(％)＝结束期乳酸菌数目/初始乳酸菌接种数目×100％

结果见表2。戊糖片球菌GZ0620对人结肠癌细胞HT-29的粘附率为18.55％，高于LGG标准菌株的细胞粘附性。

表2戊糖片球菌GZ0620对人结肠癌细胞HT-29的粘附率(％)

菌株	重复1	重复2	重复3	均值
					戊糖片球菌GZ0620	17.79	19.46	18.41	18.55
标准菌株LGG	15.13	16.42	15.14	15.56

2.3、模拟胃液、肠液耐受实验：模拟胃液和肠液购自上海源叶生物科技有限公司。人工胃液模拟液成分为稀盐酸、胃蛋白酶和氯化钠，最终pH 2.5；人工肠液模拟液成分为磷酸二氢钾和胰蛋白酶，最终pH 6.8。将戊糖片球菌GZ0620菌株复苏并活化，将菌液浓度调整至1×10⁸CFU/mL，取1mL菌液加人9mL模拟人工胃液液中，并进行10倍梯度稀释，吸取20μL涂平板计活菌数，作为耐受人工胃液的初始活菌值；接菌的模拟胃液于37℃培养3h后，再次涂平板计活菌数，作为耐受人工胃液的结束活菌值。同理，将1mL浓度为1×10⁸CFU/mL戊糖片球菌GZ0620发酵液加入9mL模拟肠液中，并进行活菌计数，37℃培养6h后再次计活菌数，计算存活率。存活率＝结束时活菌数/初始活菌数*100％。

结果表明，戊糖片球菌GZ0620菌株对于人工模拟胃、肠液有很好的耐受能力，人工胃液中3h后存活率为90.91％，人工肠液6h后存活率为76.27％(表2)。

表2戊糖片球菌GZ0620菌株对于人工模拟胃、肠液的耐受能力(％)

实施例3：戊糖片球菌GZ0620产酸性能测定

3.1、戊糖片球菌GZ0620发酵液短链脂肪酸含量GC-MS测定

发酵液的制备：将戊糖片球菌GZ0620保存菌株活化培养24h后，吸取4ul菌液加入到4mL肉汤培养基中，37℃培养24h备用。

短链脂肪酸的检测：检测仪器为日本岛津公司气质联用仪(GCMS-QP2010 Plus)，色谱柱为美国RESTEK(瑞斯泰克)公司Rtx-5熔融石英毛细管柱(30m×0.25mm×0.25um)。GC升温程序为初始温度40℃保持5min，每分钟5℃升至150℃，以每分钟10℃升到280℃，并维持2min。载气为高纯氦气(纯度＞99.999％)，流速：1.0mL/min。MS条件：电离方式为EI；温度为200℃，接口温度220℃，质量扫描范围m/z 33-500。取发酵液4mL,加入浓度为200ug/mL2-乙基丁酸内标液10ul，样品以分流模式1:3的方式进样1μL，溶剂延迟时间设定为0.1min，进样口温度270℃。5种短链脂肪酸(乙酸、正丁酸、异丁酸、异戊酸、异己酸)的浓度采用内标法计算。

GC-MS检测结果表明，戊糖片球菌GZ0620发酵液中乙酸含量最高，为10.287ug/mL，与LGG标准菌株接近。此外还含有正丁酸、异丁酸、2-甲基丁酸三种丁酸和异戊酸。最新研究发现乙酸不仅增加了结肠中IgA(免疫球蛋白A是哺乳动物中最丰富的免疫球蛋白，维持粘膜表面稳态的一种成分)产生，而且还改变了IgA与特定微生物(包括肠杆菌)结合的能力。因此，认为肠道微生物产生的乙酸具有调节IgA产生以维持粘膜稳态的作用。

表3戊糖片球菌GZ0620发酵液短链脂肪酸含量(ug/mL)

菌株号	菌种名	乙酸	正丁酸	异丁酸	异戊酸	2-甲基丁酸
							GZ0620	戊糖片球菌	10.287	0.107	0.12	0.259	0.111
LGG	鼠李糖乳杆菌	13.08	--	0.18	0.41	0.23

3.2、戊糖片球菌GZ0620发酵液乳酸含量测定：

乳酸与糖代谢、酯类代谢、蛋白质代谢以及细胞内能量的代谢密切相关，乳酸含量是评估糖元代谢的和有氧代谢的重要指标。乳酸含量测定严格按照乳酸测定试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)说明书进行。将戊糖片球菌GZ0620菌种活化培养后，接种于MRS肉汤培养基，37℃培养24h,取100ul培养液加入1mL提取液一，4℃12000g离心10min，取0.8mL上清液，再加入0.15mL提取液二，12000g离心10min后取上清液，在酶标仪570nm处测定OD值。

测定结果表明，戊糖片球菌GZ0620菌株具有较强的产乳酸能力，发酵液中乳酸浓度达到76.91umol/mL。乳酸与糖代谢、酯类代谢、蛋白质代谢以及细胞内能量的代谢密切相关，乳酸含量是评估糖元代谢的和有氧代谢的重要指标。

表4戊糖片球菌GZ0620发酵液乳酸含量(umol/mL)

菌株号	菌种名	重复1	重复2	重复3	平均
						GZ0620	戊糖片球菌	73.37	77.44	79.92	76.91

实施例4戊糖片球菌GZ0620菌株的抑菌活性评估

将大肠埃希氏菌(Escherichia coli CMCCB 44102)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus CMCCB 50094)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimuriumATCC14028)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa CMCCB 10104)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni ATCC 33291)和大肠弯曲杆菌(Campylobacter coli ATCC43478)分别接种于营养琼脂培养基，复苏并活化3次。吸取适量胰酪大豆胨液体培养基至离心管，将活化好的致病菌接种于肉汤培养基中，并调节菌液浓度达到1×10⁸CFU/mL。吸取上述致病菌和肉汤的混合液1mL加至500mL灭菌后暂未凝固的营养琼脂培养基内(温度冷却至40℃左右)，充分混匀后按每皿20mL的量分装至培养皿中。待培养基冷却凝固后，使用直径6mm的打孔器在平板上打孔，制成致病菌琼脂板，每板对应一株菌，并设置三孔作为重复。将待测菌株进行复苏并活化，调节培养后的菌液浓度达到1×10⁸CFU/mL。吸取50μL的待测菌菌液加至上述致病菌琼脂板孔内，于37℃培养24h。培养后，使用游标卡尺测量打孔点周围的抑菌圈直径大小并记录。将标准菌株LGG作为对照菌株，与待测菌株同时进行以上实验操作。

结果表明，戊糖片球菌GZ0620菌株的发酵液对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌、空肠弯曲杆菌、大肠弯曲杆菌等致病菌的生长具有较强的抑制活性，与LGG标准菌株的效果基本相当(表4)。

表4戊糖片球菌GZ0620菌株的抑菌活性评估(直径：mm)

实施例5戊糖片球菌GZ0620对小鼠结肠炎模型的预防和治疗作用试验

5.1、动物实验

动物分组及处理：共27只小鼠，随机分成9笼，每笼3只。随机分为3组，每组3笼，分组包括空白对照组(CK)、自然恢复组(DSS组)和GZ0620处理组。实验处理如表5所示。

表5DSS诱导小鼠结肠炎动物实验处理

葡聚糖硫酸钠盐溶液(DSS)：用葡聚糖硫酸钠盐配制浓度4％(w/v)的DSS水溶液。菌悬液的制备：将标准菌株LGG和戊糖片球菌GZ0620复苏并活化3代。将菌液于-4℃、6000r/min条件下离心5min，弃掉上清液。使用无菌PBS缓冲液重悬菌体，调节菌液浓度为5×10⁹CFU/mL，低温保存备用。实验期间，每天观察其活动状况、粪便状态、血便现象。

在预防期(14天)和治疗期(7天)结束时称体重，各组分别随机处死3只小鼠，取血进行血清炎症因子检测。新鲜血样用无菌离心管收集，3000r/min离心10min，获得血清。使用ELISA试剂盒(江苏晶美生物科技有限公司)测定血清的炎症因子(IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α)，操作步骤按照试剂盒说明书进行。脾脏指数测定是在处死小鼠后，立即解剖取出脾脏，用生理盐水冲洗、滤纸吸干后称重。脾脏指数＝脾脏质量(g)/小鼠体重(g)*100％。在预防期结束时，收集新鲜粪便样品，送测序公司进行16S rRNA基因V3-V4高变区测序，序列在QIIME2平台进行分析。

5.2结果分析：

体重变化表明，DSS处理组在预防期和治疗期体重分别下降9.7％和28.8％，显著高于戊糖片球菌GZ0620饲喂组(表6)；DSS处理组的脾脏指数也明显高于对照组和戊糖片球菌GZ0620饲喂组(图5A-B)，说明DSS处理组炎症严重；血清炎症因子测定结果如表7所示。从表7可知，在预防期和治疗期，GZ0620处理组IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α四个炎症因子指标都明显低于DSS组，说明饲喂戊糖片球菌GZ0620菌株对DSS诱导的小鼠结肠炎有明显的缓解作用。

表6小鼠体重变化(单位：g)

表7小鼠血清炎症因子测定结果(pg/ml)

肠道菌群16S rRNA测序结果表明，戊糖片球菌GZ0620饲喂组具有更高的菌群丰富度和均匀度(表8，图6中A)，而且特有菌群数量高于对照组和DSS处理组(图6中B)。进一步分析发现，与对照组和DSS组相比，GZ0620组肠道菌群中含有非常丰富的乳杆菌(12.60％)和双歧杆菌(6.23％)，它们是全球公认的动物肠道益生菌。

表8DSS诱导小鼠结肠炎实验肠道菌群Alpha多样性分析

综上所述，饲喂戊糖片球菌GZ0620能够有效调节DSS引起的肠道菌群失调，能够明显减缓DSS诱导的结肠炎症状，将其应用于功能性食品领域，不仅具有广阔的前景，而且对人体健康十分有益。

实施例6戊糖片球菌GZ0620降糖、降胆固醇活性体外检测

6.1、戊糖片球菌YJ0202对α-葡萄糖苷酶的抑制作用：

α-葡萄糖苷酶参与碳水化合物的分解利用，研究表明抑制α-葡萄糖苷酶的活性可以降低人体血液中的血糖水平。将戊糖片球菌GZ0620保存菌种复苏培养24h后，按2％接种量接种于MRS液体培养基中，在37℃条件下培养24h，菌液在4℃4000r/min条件下离心15min，上清液经0.22μm滤膜过滤得到发酵上清液(CFS)备用；取上清液25μL，加入PBS缓冲液(pH＝6.8)50μL、20mmol/L的PNPG溶液50μL，37℃水浴10min；加入20U/mlα-葡萄糖苷酶溶液30μL，37℃继续反应10min；加入50μL 1mol/L Na₂CO₃溶液终止反应；在96孔板(365μL)中进行，每组设定3个重复；在酶标仪405nm处测定吸光值，计算得到α-葡萄糖苷酶抑制率(％)。计算公式为：

其中A组为α-葡萄糖苷酶；B组为PBS缓冲液；C为待测样品组，含α-葡萄糖苷酶和待测样品；D组仅含待测样品。

检测结果表明，戊糖片球菌GZ0620发酵上清液具有抑制α-葡萄糖苷酶活性，抑制率为16.44％，高于标准菌株鼠李糖乳杆菌LGG的抑制活性，表明戊糖片球菌GZ0620制剂可能具有降低动物和人血液血糖水平的潜力(表9)。

表9戊糖片球菌GZ0620发酵液对α-葡萄糖苷酶的抑制率(％)

6.2、戊糖片球菌GZ0620对胆固醇的降解作用

研究表明，一些乳酸菌能够吸附或吸收胆固醇，通过排出体外达到降低动物体内胆固醇的目的。因此，在胆固醇-MRS培养基(MRS-CHOL培养基)中加入一定量的胆盐和胆固醇，培养后测定胆固醇浓度变化即可计算对胆固醇的降解能力。具体操作方法如下：

胆固醇溶液的制备：胆固醇0.06g、牛胆盐0.12g、蔗糖脂肪酸脂0.06g、冰乙酸5ml、吐温0.6ml，超声震荡至完全溶解，无菌条件下用0.22μm滤膜过滤后备用；

胆固醇-MRS培养基(MRS-CHOL培养基)制备：在300ml MRS液体培养基中加入胆固醇溶液5mL、6mol/L NaOH溶液12mL；

接种培养：将戊糖片球菌GZ0620菌种活化培养24h,以2％的接种量接种于MRS-CHOL液体培养基中，37℃培养48h，另一份不接菌的为空白对照。

标准胆固醇工作液：0.05g胆固醇，使用冰乙酸定容至50mL，配置成质量浓度为1mg/mL的胆固醇标准溶液；使用冰乙酸稀释10倍，制成标准胆固醇工作液；

胆固醇含量测定：分别取菌悬液和空白对照500μL于5mL试管中,缓缓加入4.5ml无水乙醇，静置10min，3000r/min离心15min；取上清0.5ml于试管中加入1mg/ml邻苯二甲醛0.2ml、混合酸4.3ml，震荡摇匀，静置30min；在550nm波长下测定吸光值；由标准曲线计算样品中胆固醇含量：

其中C0为空白对照组的OD值；C1为实验组OD值；

实验结果表明，戊糖片球菌GZ0620对胆固醇的降解能力不强，平均降解率为6.98％，说明戊糖片球菌GZ0620在动物和人体内具有一定的降低胆固醇的潜力(表10)。

表10戊糖片球菌GZ0620对胆固醇的降解能力

Claims

1.一株戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）GZ0620，于2022年 10月 13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.25906。

2. 权利要求1所述的戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）GZ0620在非疾病治疗目的的抑制大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌、空肠弯曲杆菌或大肠弯曲杆菌上的应用。

3. 权利要求1所述的戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）GZ0620在制备治疗大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌、空肠弯曲杆菌或大肠弯曲杆菌导致疾病的药品中的应用。

4. 权利要求1所述的戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）GZ0620在制备抗肠炎药物中的应用。

5. 权利要求1所述的戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）GZ0620在制备调节人或动物肠道菌群的功能性食品中的应用。

6. 权利要求1所述的戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）GZ0620在制备降低血糖或胆固醇药物中的应用。