JPH07504815A - 乳酸菌における異種遺伝子の発現およびその発現産物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 乳酸菌における異種遺伝子の発現およびその発現産物発明の技術分野 本発明は乳酸菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）における異種タンパク質の発現、お よびそれらのタンパク質の、免疫化した実験動物に免疫反応を産生させるための 使用に関する。本発明はまた、多大な潜在的有用性をもつ、ある特異的な発現産 物を供する。

発明の背景 異種遺伝子によってコードされているタンパク質を産生じ分泌することのできる 細菌は、ヒトおよび動物の成長ホルモン、インシュリン、インターフェロン、サ イトカインなどの付加価値の高い製薬用タンパク質の工業生産に盛んに使用され ている。これまで工業生産用に使用されてきた、または提案された、大腸菌以外 の生物は、哺乳類および昆虫の培養細胞、酵母および藻類、および桿菌属の多く の種を含む。すでに産業用の目的のために広く使用されている細菌の中でもとり わけ乳酸菌は、発酵食品のためのスターター培養物、風味増強材および防腐剤と して用いられている。これらの特性は、これらの生物の、ある種の酵素、乳酸、 およびニシンのような無害な殺菌薬ポリペプチドを産生する能力に依存している 。今日までのところ、これらの生物の遺伝子操作によって得られる外来タンパク 質の収量はわずかにすぎず、いくつかの例では、発現は調節されていない遺伝子 または未定義の調節要素に依存している。食品および牛乳の発酵での使用に関係 する乳酸菌は、動物の消化管内の共生細菌としても見られる。食品および共生細 菌の遺伝子操作には、相当な産業上の関心がもたれている。たとえば、これらの 細菌の組換え株は、発酵の方法を改良するため、および多くの疾病のワクチンの ための新規なベクターとして用いることができる。

大腸菌のようなグラム陰性細菌と対照して、乳酸菌および桿菌属の種は増殖培地 中にタンパク質をより容易に分泌する能力を有する。

し力ごしながら、最もよく知られている桿菌属の種である枯草菌の活発なタンパ ク質分解酵素系は、組換えタンパク質の産生に対するこの菌の有用性を大いに限 定してしまう。グラム陽性細胞におけるタンパク質の分泌はグラム陰性細胞に見 られるものと根本的に異なっており、後者は真の分泌（細胞周辺腔へのタンパク 質の蓄積に対して）には輸送されるタンパク質の細胞膜および外膜の貫通を必要 とする、複雑な二段階の過程である。従って、大量の組換えタンパク質が大腸菌 の中で産生されるにもかかわらず、これらのタンパク質の多くは不溶性および不 活性となり、細胞質中に蓄積するか、またはべりプラズムまで分泌され、そこで それらは沈殿し、その生物活性を失う可能性がある。そのような多くの組換えタ ンパク質にとって、生物活性回復のための再生処置は、下流の工程の経費のかか る難しい局面である。これらの理由から、タンパク質産生のためには、自然に分 泌する生物の使用が非常に有利であろう。

細菌工学の発展の別の局面としては、ある種の病原性細菌（マイコバクテリア属 、サルモネラ属）の組換えワクチン株が、病気の原因となる一連の細菌、ウィル ス、および寄生性の原生および後生動物の防御タンパク質抗原の、　ｉｎ　ｖｉ ｖｏにおける産生および受渡しに関して提案されてきた。しかしながら病原性細 菌の弱毒ワクチン株は、ある程度侵略的であり、これらの生物によって生じる免 疫応答は、免疫病理学的な損傷という結果に終わるかもしれない。免疫系に対す る抗原の効果的な提示に適した形での、非侵略的な細菌の開発は以前には得られ なかったワクチンの安全性のレベルを供するであろう。特に、経口投与した場合 、そのような生物は粘膜の免疫系を優先的に刺激し、従って感染に対して防御す る生きた経口ワクチンの開発の基盤を供する。その代わりとして、またはそれに 加えて、これらのワクチンは注射によって投与されるか、またはマイコバクテリ ア属またはサルモネラ属の組換え体で感作した免疫応答を追加免疫するために、 経口的にまたは注射により投与することができる。

すなわちこの例においては、感作したワクチン担体の抗原成分と、追加抗原投与 のそれとの間の本来の差異が、免疫病理学的損傷を最小限にすることができ、発 現された組換え抗原に対して優先的に免疫応答を追加することができる。さらに 、非侵略的細菌における一連の外来タンパク質を発現する能力は、免疫応答を希 望する方向に推進するために用いることのできる抗原とサイトカインとの、同時 の受け渡しの道を開く。これらの適用のすべてを発展的に成功させるためには、 外来遺伝子の高いレベルの発現のための、調節された系を乳酸菌において使用で きることが必要である。

乳酸菌（Ｌ、　Ｉａｃｔｉｓ）における外来遺伝子発現の報告はいくつかあるに もかかわらず、これらのいずれもが、調節された系についても、実質的な量のタ ンパク質の産生についても記載していない。これらのうち二つの場合においては 、抗生物質耐性遺伝子が、分泌シグナル配列および（または）プロモーター配列 を同定するためのリポータ−遺伝子として使われている１、ｆ０他の五例におい ては、真核生物起源の二つのタンパク質、およびグラム陽性菌起源の三つの原核 生物タンパク質を含む。当該の真核生物タンパク質は、ニワトリ卵白リゾチーム およびウシのプロキモシンである。原核生物タンパク質は枯草菌（Ｂａｃｉｌｌ ｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）の中性プロテアーゼ、クロストリジウム・アセトブチ リクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）　（クロス トリジウム属の一種）のβ−ガラクトシダーゼ、および［ストレプトコッカス・ ミュータンスＣ３ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓ）Ｊ　（連鎖状球菌 ）のｐＡＣタンパク質である。後の三つのタンパク質で得られた結果は、本発明 者らの研究に最も良い比較となるものであるが、それは本発明者らが、モデル系 としてグラム陽性菌起源のタンパク質（破傷風毒素フラグメントＣ）の発現に関 与するものも用いたきたからである。しかしながら、調節された遺伝子の発現お よび産物の分泌系を本発明者らが工夫し、さらに分泌されるされないにかかわら ず、有意な量の発現タンパク質産物を得た点において、本発明者らの結果は独特 である。これまでの研究は、ごくわずかな量の、（一つの例外を除いて）確定し ない量の外来タンパク質が作られるという結果に終っているのに対し、本発明者 らの開発した系では、分泌発現系を用いて、細胞質の可溶性タンパク質の３．４ ％を、希望する産物として確実に産生じ、分泌不能の発現系を用いて細胞質の可 溶性タンパク質の２２％を確実に産生じた。さらに、この分泌系により、産物は 漸進的に上清に分泌され、最終的な生産高の見積りは、（試験管内の条件下で） ５〜ｌｏｍｇ／ｌ、に達する。

前文で引用した研究においては、ニワトリ卵白リゾチーム３は、活性のない融合 タンパク質として発現されるか、または用いた分析法で検出するには少なすぎる 量しか産生されていない。生物活性のある枯草菌の中性プロテアーゼ４は、それ 自身のプロモーターまたは乳酸菌のプロモーターのいずれかを用いて発現され、 乳酸菌から分泌された。産生された中性プロテアーゼの（任意の単位の）量は、 枯草菌の中で同じプラスミド構築物により産生される量の、わずか１〜２％であ ることが報告されている。クロストリジウム・アセトブチリクム５からのβ−ガ ラクトシダーゼがスタータートレインに導入され、その酵素活性が検出された。

しかしながら、得られた酵素活性の最大レベルは、生来のβ−ガラクトシダーゼ 活性を有する乳酸菌の野生型株で測定した値の半分以下であった。これらのすべ ての例において、形質転換体に存在する発現されたタンパク質の正確な量は詳し く与えられていない。乳酸菌におけるウシのプロキモシン６遺伝子の発現も報告 されている。キモシンは、通常若い仔ウシの第四胃で形成される酵素である。そ れはチーズ作りのため牛乳の凝固に用いられる、カゼインに特異的なプロテアー ゼである。キモシンの先駆物質（プロキモシン）をコードしている遺伝子は、Ｓ 。

クレモリス、（連鎖球菌）　５ＫＩＩ株のプロテアーゼ遺伝子のプロモーターお よび分泌シグナル配列を用いて、乳酸菌の中で構成的に発現されており、この研 究は欧州特許第８８２０１２０３．２の主題であり、　１３゜０６、８８にファ イルされている。筆者らは、彼等の用いた発現用の乳酸菌において産生されたプ ロキモシンの量を示さなかったが、本発明者らのウェスタンプロットによる検査 は、得られた発現レベルが低い（上清１７！あたり０．２＋ｎｇと見積られる） ことを暗示している。

全細胞抽出物からは、痕跡程度の量の組換えタンパク質が検出されるにすぎない 。

本発明者らの研究に対して最も良い比較となるもめは、おそらくストレプトコッ カス・ミュータンスのｐＡＣタンパク質（表面抗原）について行われてきたもの である７゜これは、Ｓ、ミュータンス由来の６．２ｋｂのＳｐｈ　Ｉ　−Ｂａｍ ＨＩ　ＤＮＡフラグメント内にあるｐＡＣ遺伝子を運んでいるプラスミド乳酸菌 に導入することにより乳酸菌において発現された。この遺伝子の発現を調節しよ うという試みはなかった。乳酸菌におけるｐＡＣタンパク質の産生量は、Ｓ、ミ ュータンスにおいて１％であるのと比較して、乾燥重量の約０．２％であった。

ｐＡＣタンパク質はＳ、ミュータンスの培養上清に分泌され、約５．５ｍｇ／Ｌ のレベルになる。ｐＡＣタンパク質はり、ラクティス内で産生されると、細胞膜 アンカードメインを欠くため、効率よく分泌されるものと予想された。しかしな がらこのことは起こらず、乳酸菌上清中のｐＡＣタンパク質の最終的な産出量は 検出の限界に近かった。

発明の要約 本発明の一面は、Ｌ、ラクティスにおける異種遺伝子の高レベルの調節された発 現を可能にし、発現の分泌とのカップリングを可能にする方法を供する。

この文章の中の実施例において本発明者らは、大腸菌の用いつる最も強力な発現 系の開発のために使用されたものと同じ１、Ｔ７バクテリオフアージのＲＮＡポ リメラーゼおよびそれと同起源のプロモーターを使用している。大腸菌Ｔ７系は 速いＲＮＡポリメラーゼの調節された発現に依存しており、それは同起源のプロ モーターに特異的に作用して標的の遺伝子を発現させる。Ｔ７　ＲＮＡポリメラ ーゼは大腸菌ポリメラーゼのおよそ４〜５倍の速さでＲＮＡを転写し、最適条件 下では供給した全細胞を外来タンパク質の産生にあてることができる。Ｔ７　Ｒ ＮＡポリメラーゼは実際に効率的であるため、特に、標的である遺伝子産物が宿 主に有害であり得る場合には、大腸菌におけるその発現をしっかり調節すること が必要である。大腸菌においては、ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の発現はｌａｃプ ロモーターの使用により調節することができ、ラクトースまたは無償の化学的誘 導物質であるＩＰＴＧにより誘導することができる。しかしながら、これらのプ ラスミドを、Ｔ７リゾチームを産生する宿主株の中に維持することがしばしば必 要になる。この酵素は誘導体不在下の「漏出」発現によって産生されるＴ７　Ｒ ＮＡポリメラーゼの活性を阻害することができる。

新しいタイプの細菌において高レベルの遺伝子発現を行うことには、多くの困難 との出合いがつきものであるため、Ｔ７ポリメラーゼ系が乳酸菌において、本発 明者らの報告した効率を以って機能するかどうかは明らかではなかった。乳酸菌 で同定される発現のシグナルはグラム陽性細菌９に特徴的な構成を示しており、 グラム陽性細菌からの遺伝子の発現に対する、異質特異的な障害が期待されるこ とを示唆している。さらに、グラム陽性細菌の遺伝子における微量コドン１０が 、乳酸菌において一般に使用されている。これは相対的に低いＧＣ含量１と、乳 酸菌のコドンの特に３番目のヌクレオチドにおけるＡまたはＴへの強い偏向によ り生じる。従ってコドンの組成は強い選択圧の下にあり、グラム陽性細菌とグラ ム陽性細菌の間のコドンの偏向の適合性の少なさも、異質特異的な遺伝子発現の レベルを限定すると考えるのはもつともらしい。ロイシンＣＵＵコドンに対する 強い選択性は乳酸菌において報告されており１２、本発明者らも調べたラクトコ ッカスの遺伝子の中でＧｌｎコドンであるＣＡＡ（５２コドンの５１番目）に対 する強い偏向に注目していた。

しかしながら、これらの考慮すべき問題にもかかわらず、本発明者らは、（１） Ｔ７ポリメラーゼ遺伝子の発現を、乳酸菌由来の誘導可能なプロモーターの支配 下に置き、（２）乳酸菌起源の、異なる分泌シグナル配列により、産物の分泌を 命令することにより、乳酸菌における効果的かつ調節可能な遺伝子発現系を開発 する可能性を見出した。本発明者らの標的ベクターの一つの独特な性質は、タン パク質への翻訳の開始を促進するＤＮＡ配列を修正して、発現した遺伝子産物が 翻訳と同時に分泌され、細胞質中には検出されないようになっていることである 。このことは、細胞に対して毒性であったり、細胞質中で分解を受ける可能性の ある異種遺伝子産物を、増殖培地中に直接分泌することができるという利点をも つ。

ｒＴＴ様ＲＮＡポリメリンゼＪに関する参考文献は、たとえば、Ｔ３ＲＮＡポリ メラーゼのような他のＴ７様ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼについて述べて いるＵＳＰ４９５２４９６（Ｓｔｕｄｉｅｒら）において熟考されているものを 含む（それには限られないカリ。Ｔ７様ＲＮＡポリメラーゼの重要な性質は、ポ リメラーゼに対して非常に特異的な同起源のプロモーターがあり、特異的なポリ メラーゼの存在下において高いレベルで転写されることであり、すなわち転写は 細胞内の他のポリメラーゼによっては実質的に何ら影響されず、特異的なポリメ ラーゼの発現の調節によってのみ調節できるということである。

本発明のもう一つの特色は、たとえば大腸菌に発現させた異種ポリペプチドに非 常にしばしば見られるような、凝集し不溶化した形とは異なり、細胞内に保持さ れた異種の発現産物が可溶性および（または）生物活性のある形になっているこ とを発見したことにある。従って、本発明のこの面は、分泌関係の発現系と同時 に発現されるか否かにかかわらず、乳酸菌の細胞内に蓄積される、可溶性および （または）生物活性のある異種タンパク質を供する。後者の場合においては、産 物は可溶性および（または）生物活性を残したまま、著しく高いレベルに蓄積す ることができる。従って本発明のこの面は、有用なレベルでの、生物学的に活性 のあるタンパク質のための組換えＤＮＡの発現に役立つ、技術および素材のレパ ートリ−に、価値ある追加を供する。

このことは、免疫化した患者における免疫応答の促進のための新規な解決法を供 するという、本発明のもう一つの面に導くものであるが、それは、宿主細胞の防 御の中でも、免疫原としての活性をもつタンパク質を生じることが可能であり、 さらに宿主細胞が非侵略的かつ非病原性であり、実際に食品としての等級のある 細菌であり、ワクチンの粘膜投与、特に経口投与への更なる可能性を開くからで ある。このようにして発現される免疫原としての活性をもっタンパり質は、タン パク質上の一つ以上のエピトープに対する免疫反応をそれ自身の力で増加させる ために用いることができ、あるいはそれに対して重要なエピトープを運んでいる ポリペプチドが融合する、免疫原性キャリアタンパク質として用いることができ る。以下に記した実施例は、ＴＴＦＣに融合したＨＩＶ−Ｖ３ループタンパク質 のフラグメントである。従って一般的には、免疫原性タンパク質を含んでいる、 および（または）発現している乳酸菌細胞を、非経口的（たとえば皮下に）また は粘膜から（たとえば経口的に、鼻から、または直腸から）投与して、全身的な 、または粘膜上の免疫応答を作り出すことができる。

過去３０年間にわたる、バチルス・ツリンジェンシス（Ｂａｃｉ　Ｉｌｕｓｔｈ ｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　Ｂ、Ｔ）の弁組換え体についての農薬学的公式の商業 的使用は、狭い範囲の害虫イモムシに限られてきた。しかしながら、研究者らは 、他の多くの害虫に対する特異性をもつ、毒素を産生ずるＢ、　ｔ、株を発見し てきた。これらの、新たに発見された株には植物および動物に寄生する線虫類に 対して活性のある株が含まれる（Ｅｄｗａｒｄｓら、ＵＳＰ４９４９７３４　（ １９９０））。そのような株は、Ｂ、　ｔ、毒素が天然に存在するものであって 、宿主には何も害を与えずに、広い範囲の外部および内部寄生動物を殺すために 用いることができるという最初の示唆を供する。

細菌における、組換えＤＮＡ由来のＢ、　ｔ、毒素の発現という概念は、すでに 確立されているが目、これは宿主としてグラム陰性のシュードモナス・フルオレ ッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）を用いており、 それは細菌を殺し、安定化させるために、すでに化学的に処理されている。ＧＲ ＡＳの使用、特に食品としての品質のある細菌の使用は、Ｂ、　ｔ、毒素を封じ 込めるためのより安全で環境に受け入れられやすい宿主細胞を供するであろう。

従って本発明は、食品としての品質のある細菌に、有用な量のＢ。

【、毒素を、ヒトまたは動物に安全に投与することができる形で、または農薬と して環境に適応した形で、産生させるとを可能にする。

たとえば、線虫の毒素を発現している乳酸菌の組換え体を、ヒトおよび動物の線 虫感染の治療に使用することができる。

従って本発明は、より簡単な発酵への道を供し、環境におけるさらに安全な使用 のためのＢ、　ｔ、誘導体の産生技術を供すことができるだけでなく、Ｂ、　ｔ 、毒素を産生ずる無害な細菌を、経口摂取または局処に適用することによってコ ントロールすることの可能な、ヒトおよび動物の害虫の治療に適用することもで きる。

本発明による、Ｂ、　ｔ、毒素の乳酸菌における効率のよい発現の束なる面は、 これらの進化学的に異なるタンパク質が、興味の対象であるエピトープのための 免疫原性のあるキャリアーとして働く可能性にある。たとえば、後者のエピトー プを表わすポリペプチドは、免疫原として活性のあるＢ、　ｔ、毒素に融合して 発現されうる（同じ方法で、ＩＩＩＶ・■３ループはＴＴＦＣに融合されている ）。

この文章において、宿主乳酸菌内で発現される異種ポリペプチドに関して用いら れている「生物活性のある」という用語は、適切な構造をとるためには相当な程 度の特異的な変性処置、および再生処置を必要とする。誤ってたたまれ、凝集し た不溶性の形態であるよりもむしろ、ポリペプチドが生物学的な活性を得るため に適した構造に産生されることを表わしている。従ってこの用語は、生物活性の あるタンパク質の先駆ポリペプチド、すなわちそれら自身には生物学的がないが 、容易に変化して生物活性のある形になるものを含む。たとえば、Ｂ、　ｔ、毒 素は、使用時にはｉｎ　ｖｉｔｒｏで毒性のある形に変換される先駆物質として 産生ずることができる。

図の簡単な説明 図１．乳酸菌および大腸菌において使用するためのＴ７発現カセットの構築。大 腸菌におけるＴ７による発現のための要素を含んでいるｐＥＴ−３ａのＥｃｏＲ Ｖ／Ｂｇｌｌｌフラグメントをｐ１８Ｎに移した。これらの要素をｐ１８ＮＴ７ Ｌ１において修正し、バクテリオファージ遺伝子ｌＯ転写開始配列を乳酸菌起源 のもので置換し、さらに分泌シグナル配列（Ｌｌ）を、遺伝子の融合を起こす場 所に加えた。ｐ１８ＮＴ７Ｌ２においては、バクテリオファージ遺伝子１０タン パク質の配列を、別の乳酸菌の分泌シグナル配列（Ｌ２）で置換した。さらに詳 しい説明を図２に記した。ｂｌａ：β−ラクタマーゼ遺伝子；ｔｅｔ：テトラサ イクリン耐性遺伝子；Ｏｒｉ：複製起点；Ｔ７Ｐ：Ｔ７プロモーター；Ｓ１０： 遺伝子ｌＯタンパク質の翻訳開始領域；Ｔ：ターミネーター；Ｌ２：シグナルリ ーダー２　；　ＰｒｔＬ＆ＳＤ：シグナルリーダーおよびＰｒｔ遺伝子のタンパ ク質翻訳開始領域。矢尻は転写の方向を示す。

図２．乳酸菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　１ａｃｔｉｓ）における発現および分 泌のために構築したＴ７カセツトの配列。Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼと同じ起源 のプロモーターに太い下線を施した。予想される転写開始部位および転写終結の 最後のヌクレオチドを各々＋１および＝１で示した。

タンパク質の配列（番号を付し３文字のアミノ酸略号で表わした）をヌクレオチ ド配列の上に示した。ＲＮＡの５′および３′末端に、強力なステムループ構造 を示し、各々の構築物のシャイン・ダルガーノ（ＳＤ）配列を四角形で囲んだ。

シグナルペプチドの開裂部位を矢印で示した。Ｓａｌ　Ｉ融合クローニング部位 および他の関連した部位に下線を施した。平行線は配列が連続していないことを 示している。表示したように、Ｔ７．　Ｔ７ＬＩ、およびＴ７１，２の各々カセ ットは、それぞれｐＬＥＴｌ、　ｐＬＥＴ２、およびｐＬＥＴ３に取り込まれる 。

図３．　（Ａ）乳酸菌／大腸菌のシャトルベクターｐＭＩＧｌおよびｐＭＩ０３ ゜（Ｂ）　Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼによる乳酸菌の発現のためのｐＬＥＴプラ スミドの２つの例。ｐＬＥＴ３およびｐＩ、ＥＴ３２は、それぞれｐＭＩＧｌお よびｐＭＩＧ３に由来し、各々シグナルリーダー配列ＬｌおよびＬ２を含んでい る（詳しくは図２参照）。（Ｃ）ＴＴＦＣの発現のためのｐＬＥＴ２−　ＴＴＦ Ｃプラスミド。同様なＴＴＦＣ発現構築物を他のｐｔ、ＥＴベクターを用いて調 製した。ｋａｎ　：カナマイシン耐性遺伝子；Ｃａｔ：クロラムフェニコール・ アセチルトランスフェラーゼ遺伝子；Ｏｒｉ：複製起点；Ｔ：ターミネータ−。

矢尻は転写の方向を示す。

図４．７７ＲＮＡポリメラーゼの誘導可能な発現のための乳酸菌ベクターの構築 。ｂｌａ　：β−ラクタマーゼ遺伝子；Ｏｒｉ：複製起点：ＭＬＳ　：マクロラ イド系、リンコサマイト系、およびストレプトグラミンＢ型の抗生物質に対する 耐性。矢尻は転写の方向を示す。

図５．　（パネルＡ　）　ｐＬＥＴｌ　−ＴＴＦＣ株（トラック１　、　ＴＴＦ Ｃに矢印を付けた）および対照株（ｐＭＩＧｌをもっている発現宿主細胞、トラ ック２）からの全細胞タンパク質抽出物のゲルをクーマシー染色したもの。ｐＬ ＥＴｌ−ＴＴＦＣ（パネルＢ）、ｐＬＥＴ３−ＴＴＦＣ（パネルＣ）、およびｐ ＬＥＴ２−ＴＴＦＣ（パネルＤ）をもっている乳酸菌の発現株からの、全細胞抽 出物および上清タンパク質のイムノプロットを示した。誘導していない細胞（Ｕ ）および誘導した細胞（１）からの、はぼ等しい量の全細胞タンパク質、または 培養上清２００μｍから沈殿させたタンパク質を各トラックに充填した。ｐＭＩ ０１対照株からの全細胞抽出物または上清タンパク質を買ＦＣと表示した。トラ ックに充填した（パネルＡでは２μｇ、パネルＢ−Ｄでは５００ｎｇ）。染色前 の標識タンパク質の大きさを右に示した。ｐＬＥＴ２−　ＴＴＦＣ株の細胞抽出 物中に存在するプロセスを受けていない形（Ｕ）およびプロセスを受けた形（Ｐ ）のＴＴＦＣを矢印で示した（パネルＤ）。

図ｅ　、（Ａ　）　ｐＬＥＴ２−　ＴＴＦＣおよび（Ｂ　）　ｐＬＥＴ３２−　 ＴＴＦＣをもっている乳酸菌のＴＴＦＣ産生株からの、全細胞抽出物および上清 タンパク質のイムノプロット。誘導していない細胞（Ｕ）および誘導した細胞（ １）からの全細胞抽出物におけるタンパク質のほぼ等量を、各々のトラックに充 填した。ｐＭＩＧｌまたはｐＭＩＧ３をもっている宿主株からの全細胞抽出物ま たは上清タンパク質を対照として用い、Ｃと表示したトラックに充填した。大腸 菌からの精製した組換えＴＴＦＣ（１２０ｎｇ）をＴＴＦＣと表示したトラック に充填した。Ｍと表示したトラックに充填した、染色前の標識タンパク質の大き さを右に示した。プロセスを受けていない形（Ｕ）およびプロセスを受けた形（ Ｐ）のＴＴＦＣを矢印で示した。

図７　（Ａ）、　ｐＬＥＴ２−ＴＴＦＣ（トラック１）または対照ベクターｐＭ Ｉ０１（トラック２）をもっている、乳酸菌の発現株からの可溶性タンパク質抽 出物のタンパク質ゲルをクマーシー染色したもの。Ｍ；標識タンパク質のトラッ ク。染色前の標識タンパク質の大きさを右に示した。プロセスされていない形（ Ｕ）およびプロセスされた形（Ｐ）のＴＴＦＣを矢印で示した。

図７　（Ｂ）、　ｐＬＥＴ２−ＴＴＦＣまたは対照ベクターｐＭＩＧ１をもって いる乳酸菌の発現株からの、可溶性および不溶性抽出物の相対量のイムノプロッ ト。トラックｌおよび３　：　ｐＬＥＴ２−ＴＴＦＣのそれぞれ可溶性および不 溶性抽出物。トラック２および４　：　ｐＭＩＧｌのそれぞれ可溶性および不溶 性抽出物。Ｍ；標識タンパク質のトラック。染色前の標識タンパク質の大きさを 右に示した。プロセスされていない形（Ｕ）およびプロセスされている形（Ｐ） のＴＴＦＣを矢印で示した。

図８　（Ａ）、対数増殖期におけるＴＴＦＣ発現の誘導後の、異なる株の増殖曲 線、および（Ｂ）これらの株により培養上清に分泌されたＴＴＦＣの量を示すグ ラフ。（Ｃ）低い細胞密度からラクトースの存在下に増殖させた場合の増殖曲線 および、ｐＬＥＴ３−　ＴＴＦＣおよびｐＭＩＧｌ対照株により培養上清に分泌 されたＴＴＦＣの量を示すグラフ。

図９．　ＰＣＲ産物であるＶ３ａおよびＶ３ｂの予想される場所を旧Ｖ−ＭＮプ ロウィルスゲノムとの関係においてまとめた図解。産物の末端に示した制限酵素 部位は、プライマーのオリゴヌクレオチドの企画を経て取り込まれる。コードさ れているペプチドを括弧の中に示した（Ｖ３ループを強調しである）。ヌクレオ チドの番号付けは「ヒトのレトロウィルスおよびエイズ、１９８９、核酸および アミノ酸配列の編集と分析Ｊ　（ｆｌｕｍａｎ　Ｒｅけ０ＶｉｒｕＳｅＳ　ａｎ ｄ　ＡＩＤＳ　１９８９−ａ　Ｃ０Ｉｌ＋ｐｉｌａｔｉＯｎａｎｄ　ａｎａｌｙ ｓｉｓ　ｏｆ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　ａｎｄ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　５ ｅｑｕｅｎｃｅｓ）の中で使用されているものである。

図１０．乳酸菌におけるＴＴＦＣ／Ｖ３ａ融合タンパク質融合タンパクジ発現ミ ドｐＬＥＴ２−　ＴＴＦＣ／　Ｖ３ａの図式的な説明。

図１１．乳酸菌の発現系の概観。

図１２．　ＴＴＦＣおよび旧ｖＭＮのＶ３ループのそれぞれに特異的な抗体を用 いての、乳酸菌のタンパク抽出部のイムノブロッティングの結果。表示のプラス ミドで形質転換した１８２０　（ｐｌＬｐｏりクローンを、ラクトースを含む培 地中で増殖させ、外来タンパク質の発現を誘導した。誘導後の様々な時間に、培 養物より全細胞抽出物および上清抽出物を得た。タンパク質をＳＤＳポリアクリ ルアミドゲル電気泳動により分離し、ニトロセルロース上にプロットし、以下の ものでプローブした： ａ）組換えＴＴＦＣに対するウサギのポリクローナル抗体、ｂ）旧ＶＭＮのｖ３ ループに特異的なヒトのモノクローナル抗体、図１２ａ）抗ＴＴＦＣポリクロー ナル血清でプローブした抽出物。

凡例　ｒＴＴＦＣ：組換えＴＴＦＣ（シグナルリーダーなし）ｐＭＩＧｌ　ニブ ラスミドｐＭＩＧ１（Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼに特異的なプロモーターのない ｐＬＥＴｌ）を含んでいる１８２０（ｐｌＬＰｏｌ）クローン。

ｐＬＥＴｌｌ、、：表示のプラスミドを含んでいる１８２０（ｐｌＬＰｏｌ）ク ローン。

Ｃ／Ｅ　：細胞抽出物 Ｓ／Ｎ　：上清抽出物 ｈｉ：　外来遺伝子の発現を誘導するために細菌をラクトースを含む培地に再浮 遊させてからの時間。

図１３．　ＣｒｙｌＡ発現プラスミドの構築。

（ａ、　）　ＣｒｙｌＡ遺伝子およびそれに関連した制限酵素部位を図式的に示 した。（ｂおよびＣ）この遺伝子のＰＣＨによるフラグメントを、ｐＵｃ由来の 一般的なりローニングベクターｐＷＷに組み込んだ。矢印は、ＣｒｙｌＡ遺伝子 の配列に関するＰＣＲプライマーの位置を示す。

（ｄ　）　ｐＷＷ　−ＰＣＲＣｒｙ　ＩＡの、Ｓｐｅ　Ｉ部位とＥｃｏＮ　１部 位との間にある、ＰＣＲ由来のＣｒｙｌＡ遺伝子フラグメントを、クローン化し たバシルス・スリンギエンシスＤＮＡから単離した同等のフラグメントで置換し た。

（ｅ　）　ＣｒｙｌＡ遺伝子のＮｄｃ　Ｉ　−Ｂａｍ１ｌ　Ｉフラグメントをｐ １９ＮＴ７の中のＴ７カセツトにクローン化した。（ｆ　）　ＣｒｙｌＡ発現カ セットをｐＭＩＧｌシャトルベクターに導入し、　ｐＬＥＴｌ　−Ｃｒｙ　ＩＡ を作った。ＣｒｙｌＡ遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｔ）　、 およびカナマイシン耐性遺伝子（ｋａｎ）をコードしている配列を矢印で描き、 その上に、転写の方向を示した。

図１４１図２（パネルＡ）、　ｐＬＥＴｌ　−ＣｒｙＩ発現株からの全タンパク 質抽出物のゲルをクマーシー染色したもの。（パネルＢ）上記のように充填した ゲルの、クリスタルタンパク質に対する抗血清を用いたイムノプロット。誘導し ていない細胞（Ｕ）および誘導後３０分、６０分、および１．２０分の細胞から の、はぼ等量の全細胞タンパク質を表示のように充填した。精製したクリスタル タンパク質ｌμｇを、ＣＰと表示したトラックに充填した。誘導の１２０分後に 集めたｐＭＩＧ１対照株からの抽出物をＣと表示したトラックに充填した。（パ ネルＣ）　ＣｒｙｌＡ発現細胞の細胞分画を用いたイムノブロッティングの結果 。全抽出物（ＴＥ）　、不溶性細胞壁（Ｗ）、膜（Ｍ）、および可溶性タンパク 質（Ｓ）の各分画の相対量を表示のように充填した。精製したクリスタルタンパ ク質（１μｇ）をＣＰと表示したトラックに流した。各パネルにおいてクリスタ ルタンパク質の移動度に矢印をつけた。

図１５．（パネルＡ）誘導の２時間後のｐＬＥＴ４−　ＴＴＦＣの発現株および 対照株（Ｃ）からの全細胞抽出物のイムノプロット。（パネルＢ）発現している 細胞の細胞分画を用いたイムノブロッティングの結果。

不溶性細胞壁（Ｗ）、膜（Ｍ）、および可溶性タンパク質（Ｓ）の各分画の相対 量を表示のように充填した。ＴＴＦＣ抗血清を用いて検出したＴＴＦＣ融合タン パク質に矢印をつけた。

実施例 以下の実施例はもっばら説明として入れたものであって、この発明の範囲を限定 しようとするものではない。

実施例１ １、細菌株、プラスミド、および培地 本研究に用いた細菌株およびプラスミドを表１に示す。乳酸菌を、０．５％ｗ／ ｖグルコース（ＧＭ１７）又は０．５％ｗ／ｖラクトース（ＬＭ１７）のいずれ かを含んでいるＭ１７ブロス中、またはＭ１７寒天平板上（ディフコ社　英国、 ロンドン）で培養した。大腸菌株はＬＢジブロス中たはＬＢ寒天平板上で培養し た。大腸菌ｒ　５ＵＲＥＪ株は、大腸菌１ａｃリプレツサータンパク質を過剰に 生産するため、ｐＵＣに基づくベクターの宿主として使用した。大腸菌ＲｅｃＡ ”株ＭＣ１０２２を、９ＭｌＧ１シャトルベクターおよびその誘導体のための宿 主として用い、Ｄ）１５ａ株を９ＭＩＯ３シャトルベクターおよびその誘導体の ための宿主として用いた。クロラムフェニコールを乳酸菌および大腸菌の培地お よびプレートに加え、最終濃度をそれぞれ５μｇ／＋ｎｌおよび１５μｇ／ｍｌ とした。アンピシリンは濃度１００μｇ／ｍｌで使用した。

表１　細菌株およびプラスミド Ｌ、Ｉａｃｔｉｓ 大腸菌 ＳＵＲＥＴＭ１６ ＭＣＩ０２２　Ｍ、　Ｇａ５５ｏｎ ＤＨ５ａ　１７ ｐ１８ＮＴ７　Ａｍｐ’、ｐＥＴ−３ａのＴ７配列を含む。　本発明ｐ１８ＮＴ ７Ｌ２ＶＦ　Ａｎｐ’、、　Ｔ７ノ要素と、乳酸菌（７）　ＵＳＰ４５遺伝　本 発明子のシグナルリーダーを含む。

ｐＡＲ１１７３Ａ＋ｎｐ’、プロモーターのないＴ７ＲＮＡｐｏｌ遺伝　１８子 を含む。

ｐｌＬ２７７　８ｍ’　、乳酸菌のコピー数の低いベクター　１９ｐｓｓＩ２８ １　ＴＴＦＣ配列を含んでいる、大腸菌の発現べ　２゜フタ−ｐＴＴＱ８ ２、ＤＮＡの単離および操作 プラスミドＤＮＡの大量の標品を、トリトン溶菌法Ｈの変法により、乳酸菌から 単離した。プラスミドＤＮＡの微量の標品は、細胞をまず、各々最終濃度が５μ ｇ／ｌ１１１および１００単位／ｍｌとなるように新たに加えたリゾチームおよ びムタノリシンを含んでいるＴＥ　（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、　１ｍＭ　 ＥＤＴＡ、　ｐＨ８，０）１００ｍｌの中でインキュベートする点を除き、Ｂｉ ｒｎｂｏｉｍおよびＤｏｌｙの方法２２によって調製した。同様に、回収したプ ラスミドＤＮＡをＲＮアーゼで処理しく１００ｍｇ／　＋ｎｌのＤＮアーゼを含 まない酵素で３７℃で１０分間）、プロテイナーゼにで処理しく２００μｇ／ｍ ｌ。

３７℃で３０分間）、最後にフェノール／クロロフォルム混合物で抽出した。次 いでＤＮＡを沈殿し、ＴＨに再浮遊させた。大腸菌からのプラスミドＤＮＡの単 離は先に記した通り行ない、プラスミドＤＮＡの微量の標品は、旧ｒｎｂｏｉｍ およびＤｏｌｙのアルカリ溶解法１により調製した。

ＤＮＡの消化は制限ニドヌクレアーゼを用い、標準的な条件下で、製造業者の勧 める緩衝液の中で行なった。仔ウシ小腸ホスファターゼ、Ｔ４　ＤＮＡポリメラ ーゼ、およびＴ４　ＤＮＡリガーゼのようなりＮＡを修飾する他の酵素は、供給 者の勧告に従って使用した。一般的な分子クローニング技術および、アガロース ゲル中でのＤＮＡの電気泳動は、基本的にはＭａｎｉａｔｉｓら２３によって記 載されている方法で行なった。

ＤＮＡフラグメントは、ガラスウールのカラムで栓をし、細い針で底に穴をあけ た０、　５ｍｌのマイクロヒュージ管を用いたスピンカラム法により、アガロー スゲルから精製した。ＤＮＡフラグメントを含んでいるアガロースゲルのスライ スを、ガラスウールの上に置き、管全体を２ｍｌのマイクロヒュージ管の上に置 いた。マイクロ遠心機の最高速度で１５分間遠心し、ゲルスライスからの緩衝液 およびＤＮＡを管の底から回収した。ＤＮＡを再沈殿し、ただちに連結に使用し た。

３、ＰＣＲ ＤＮＡのＰＣＲによる増幅は、忠実度の高い反応条件２４とサーマルサイクラ− （カンビオ社　英国、ケンブリッジ）を用いて行なった。

反応液は全体積１００μｌの中に、１倍のＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ− ＨＣＩ。

ｐＨ７，５（７０℃で）、　５０ｍＭ　ＫＣＩ）、各デオキシヌクレオチド二リ ン酸２５０μＭ１各プライマー０．５μＭ、　ＭｇＣｌ２１ｍＭ　、鋳型ＤＮＡ （典型的には５０〜ｌｏＯｎｇ）、およびＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（カンビ オ社）２．５単位を含む。鋳型ＤＮＡを９５℃で５分間加熱した後酵素を加え、 以下の条件下で３０サイクルのＰＣＢ増幅を行なった。すなわち、９３℃で１分 間変性させ、４５℃で１分間プライマーをアニールさせ、７２℃で１分間伸長さ せ、７２°Ｃ５分間で最終的な伸長を行なう。合成オリゴヌクレオチドブライマ ーは、報告されている配列５に基づき、ｐｒ【遺伝子のタンパク質翻訳開始配列 およびそのシグナルリーダーを増幅するように設計した。

プライマーＬｌ−センス：５′ ＧＡＴＣＧＧＣＣＡＡＧＣＴＴＣＴ　Ｔ　Ａ　’プライマーＬ２−アンチセンス ：５′ ＣＣＧＡＣＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＣＧＣＧ　ＣＧ（、Ａ　ＧＡ　Ｔ　３’乳 酸菌のｌａｃプロモーターおよびＩａｃＲ遺伝子の増幅には同じ条件を用いた。

プライマーの配列は以下の通りである。

プライマー１　：　ＣＧＧＧＡＴＣＣ弱成Ｍに艶コ艶■橋め）５　イ、２　、　 ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＡＡＴＧＣＴ　ＣＴ　ＧＡＡすべての場合において、下線を 施した配列はそれらの鋳型と同等である。

４、形質転換 乳酸菌は、細胞壁を弱めるためのグリシンの存在下に生育した細胞を電気穿孔法 により形質転換させた。次のように方法を最適化するために、いくつかの異なる パラメーターを研究したが、その方法では、単一コロニーから一晩増殖させた培 養物を、３％グリシンを含むＧ１７で約１００倍に希釈し、ＯＤ６．。１．が０ ．５〜０．６になるまで増殖させた（約６時間かかる）。培養物を氷上で１０分 間冷却し、遠心（３０００ｘ　ｇ、　１０分間）して細胞をペレット化し、１０ ％グリセロールを含む水冷した０、５Ｍショ糖液０．２容量に再浮遊させた。こ の洗浄処置をもう一度くり返し、細胞の４０μｌのアリコートを液体窒素中で凍 結し、−７０℃に保存した。電気穿孔の直前に氷上で細胞を解かし、１〜２μｌ のＤＮＡ溶液（脱イオン水中に１０〜１０１００ｎを加えた。

次いで細胞を水冷した電気穿孔用セル（０，２ｃｍ＋ギャップ）に移し、１２、 ５ＫＶ／　ｃ＋ｎ、抵抗４００Ω、および容量２５μＦで電気穿孔した。電気穿 孔の直後に９５０μＩの水冷したＳＧＭ１７ＭＣ培地（０Ｍ１７に０．５Ｍショ 糖、２０ｍＭ　ＭｇＣＩｚ、および２　ｍＭ　ＣａＣ＋２を加えたもの）をキュ ベツトに加え、細胞をマイクロ遠心管に移し、氷上で１０分間置く。次いで細胞 を０Ｍ１７中で３７℃で２時間インキュベートして、抗生物質を加えたＧ＋１１ １７培地に播く前に細胞を回復させる。１．Ｏｎ　Ｈの超コイルプラスミドＤＮ Ａを用いて得られる形質転換の効率は、典型的には、３０℃で一晩インキユベー トした後では、　１０″コロニ一／μｇのオーダーにある。

大腸菌は標準的な方法２′を用いて電気穿孔により形質転換させた。

５、標的遺伝子の誘導および分析 標的となる遺伝子のベクターを含んでいる宿主の乳酸菌株は、選択的な抗生物質 を含んでいる０Ｍ１７において型どおりに増殖した。対数増殖期の細胞を、０Ｍ １７をＬＭ１７に置換することにより誘導した。標的ＤＮＡを発現させるために は細胞を３７°Ｃで増殖させた。

全細胞タンパク抽出物は、約ｌＸｌ０”細胞のサンプルから調製した。遠心によ り細胞を集め、最終濃度がそれぞれ５＋ｎｇ／ｎｌおよび１００単位／ｍｌにな るように新たに加えたリゾチームおよびムタノリシンを含んでいる、ＴＥ　（１ ０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１１Ｃ１，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ８，０）１００μｍに 再浮遊させ、３７℃で５〜ＩＯ分間インキュベートした。次いでＴＥｏ、　５ｍ ｌで細胞を２回洗浄し、ＴＥ　７５μｌに再浮遊させた。２倍のＳＯ５ＰＡＧＥ サンプル緩衝液２′を加えて細胞を溶解した後、１０分間沸騰させてタンパク質 を変性させ可溶性させた。

ＴＴＦＣはＥＬＩＳＡおよびイムノブロッティング法を用いて、培養した細菌の 上清から分析した。遠心により細胞をペレット化した後、上清の５ｍｌアリコー トを０．２μｍのミリポアフィルタ−に通し、ＴＥ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ ｌ、　１ｍＭ　ＥＤＴＡ、　ｐｔ１８．０）に透析した。プロテアーゼの活性を 阻害するため、ＥＤＴＡおよびＰＭＳＦを透析バッグに加えて、各々最終濃度を １−および０．１ｍＭとした。０℃でトリクロロ酢酸を加えて最終濃度を１０％ とすることにより、タンパク質をＳＤＳ　ＰＡＧＦ！用に沈殿させた。遠心後、 タンパク質のベレットをＩ　Ｍ　Ｔｒｉｓ塩基に浮遊させ、同量の２倍濃度のポ リアクリルアミドゲル電気泳動用のＳＤＳサンプル緩衝液と混合した。

６、乳酸菌の分画 乳酸菌は、培地にＮａＣｌを加えて最終濃度をＩＭとした後、遠心により培地か ら回収した。洗浄緩衝液（Ｗａｓｈ　Ｂｕｆｆｅｒ）（ＷＢ　：　ｌＯｈ＋Ｍ　 Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ７，５，５ｍＭ　ＭｇＣｌ２．２ｍＭ　ＥＤＴＡ、　Ｉ ｎＩＭ　ＰＭＳＦ）で細胞を２回洗浄し、Ｉｇ（湿重量）ずつの細胞を、プロテ アーゼ阻害剤を含んでいる水冷したＷＢ約３〜４ｍｌに再浮遊させた。細胞を、 ４０〜５０ｇのガラスピーズ（直径０．１０〜Ｏ，１１ｍｍ）と共に、ブラウン ・セルホモジナイザー（モデルＭＳＫ）で、操作中は二酸化炭素冷却システムを 用いて、３０秒間ずつ２回ホモジナイズした。粗く焼結したガラスフィルターを 通してろ過することによりガラスピーズを除き、ホモジエネートを１０、０ＯＯ Ｘ　ｇで１５分間遠心して細胞壁をペレット化した。可溶性タンパク質分画から 、１４４，０ＯＯＸ　ｇで４℃で７５分間遠心することにより膜分画を除去した 。タンパク質濃度は、ビシンコニン酸分析（ピアスコーロツブ社）により、　Ｂ ＳＡを標準として用いて算定した。

７、イムノブロッティングおよびＥＬＩＳＡ全細胞抽出物および培養上清からの タンパク質をＳＤＳ　ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロース上に電気的にプ ロットした２＠。タンパク質の転移は、ポンソーＳでフィルターを可逆的に染色 することによりチェックし、その後ウサギ抗ＴＴＦＣ血清および、アルカリ性ホ スファターゼを結合しているヤギの抗ウサギ免疫グロブリン（ノルディック　イ ムノロジカル研究所、英国）を用いてＴＴＦＣを検出した。

ＴＴＦＣＥＬＩＳＡには、マイクロタイタープレートを対照株および発現株から の可溶性タンパク抽出物および上清と同様に、標準的な量の精製したＴＴＦＣと （１００μｌ中）、３７℃で３時間、さらに４°Ｃで一晩インキユベートするこ とによりコートした。次いでブロッキング緩衝液（０，０５％ツイーン２０およ び０．５％ＢＳＡを含んでいるＰＢＳ）　１５０μｌを加えてプレートをブロッ クし、ＰＢＳｌｏ、　０５％ツイーンで１回洗浄し、ウサギ抗フラグメントＣ抗 血清（ブロッキング緩衝液で希釈した）と共に３７℃で２時間インキュベートし た。プレートをＰＢＳ／ツイーンて４回洗浄し、次にアルカリ性ホスファターゼ を結合したヤギ抗ウサギ免疫グロブリン（ノルディック）と共に３７℃で１〜２ 時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／ツイーンで４回洗浄し、最後にＰ ＢＳで洗浄してＯＰＤで現像した。

８、乳酸菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　１ａｃｔｉｓ）において使用するための Ｔ７発現シャトルベクターの構築 バタテリオファージＴ７の遺伝子ｌＯのプロモーター、その翻訳開始領域、およ び転写終結シグナル８を含んでいる、ｐＥＴ−３ａからのＥｃｏＲＶ／Ｂｇｌｌ ｌフラグメントを精製し、ｐ１８Ｎ　（表１参照）に連結し、ＢａｍＨＩおよび 旧ｎｃｆｌで切断する（図１　ｐ１８ＮＴ７参照）。コンピテントな大腸菌ｒ　 ５ＩＪＲＥＪ細胞を連結したＤＮＡで形質転換し、個々のクローンをひろい、材 料および方法に記載したように組換えプラスミドについて検査した。

乳酸菌における発現および分泌のため、Ｔ７バクテリオフアージ遺伝子１０の翻 訳開始領域を、乳酸菌のセリンプロテイナーゼのリポソーム結合部位およびシグ ナルリーダー配列で置換することにより、プラスミドｐ１８ＮＴ７を修飾した。

関連するプロテアーゼ（ｐｒｔ）遺伝子のＤＮＡフラグメントは、ｔｌｉｎｄｌ ｌｌまたはＢａｍＨＩのいずれかに対する制限エンドヌクレアーゼ部位を含んで いる５′付加部分をもつプライマーを用い、ＰＣＲ増幅により得た。Ｓａｌ　Ｉ 制限部位もアンチセンスプライマーの５′の突き出し部分に入れ、ｐｒｔリーダ ーに遺伝子の融合ができるようにした。Ｓａｌ　Ｉ制限エンドヌクレアーゼ部位 はＡｃｃ　Ｉまたは削口Ｃｌ＋によっても切断されるため、それにより遺伝子の 融合を３つの読み枠のどれにおいても作ることができる（プライマーの配列は前 文に記した。）ＰＣＲ増幅したＤＮＡをｌ１ｉｎｄｌｌ＋で切断し、次に７４　 ＤＮＡポリメラーゼで平滑化し、さらにＢａｍｔｌ　Ｉで切断した。

消化したフラグメントをゲルで精製し、Ｘｂａ　Ｉで切断して平滑化したｐ１８ ＮＴ７に連結し、次いでＢａｍＨＩで切断してｐ１８ＮＴ７１．ＶＦを生成した 。

コンピテントな大腸菌ｒ　５ＵＲＥＪ細胞を、連結したＤＮＡで形質転換し、個 々のコロニーを採り、制限酵素による消化およびアガロースゲル電気泳動により 正しい挿入部分の存在を検査した。クローンｐ１８ＮＴ７ＬＩＶＦ　（ＬＩＶＦ −シグナルリーダーｌ；可変フレーム）のプラスミドマツプおよび構築物の配列 の詳細は、それぞれ図１および図２に示した。

乳酸菌の４５ｋＤの未知の分泌タンパク質（ＵＳＰ４５）”の、第二の乳酸菌シ グナルリーダーを、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼを用い、アニールされ伸長された 長い重複するオリゴヌクレオチドを用いて合成した。二本鎖の産物をＮｄｅ　Ｉ およびＢａｍＨＩで切断し、ゲルで精製し、Ｎｄｅ　１およびＢａｍｔｌ　Ｉで 切断したｐ１８ＮＴ７に連結してｐ１８ＮＴ７Ｌ２ＶＦ　（図１参照、Ｌ２ＶＦ −シグナルリーダー２；可変フレーム）を生成した。このシグナルリーダーは、 ｐ１８ＮＴ７内の、Ｔ７バクテリオフアージ遺伝子ｌＯをコードしている配列を 、図２に示したように、開始コドンＡＴＧとシャイダルガーノ配列との間のヌク レオチドの間隔を変えることなく置換した。リーダー１に関しては、シグナルペ プチドの最後のアミノ酸はＳａ目制限部位に先立っており、３つの読み枠のどれ においても遺伝子を融合させることができる。

上記のように、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼにより、発現のための修飾された配列 を用いて、外来タンパク質を乳酸菌に発現させるためには、ｐ１８ＮＴ７ＬＶＦ およびｐ１８ＮＴ７Ｌ２ＶＦのＥｃｏＲＩおよび旧ｎｄｌｌｌフラグメントを、 乳酸菌における複製が可能なシャトルベクターに移す必要がある。大腸菌および 乳酸菌におけるクローニングのための２つのシャトルベクター、ｐＭＩＧｌおよ びｐＭＩＧ３が最近構築され、それらは乳酸菌において異なるコピー数を有する （図３）。ｐＭＩＧｌは乳酸菌のｐｓＨ７ルブリコンを含んでおり３０、乳酸菌 ＭＧ１３６３株においては高いコピー数で複製しく静置培養で、細菌あたり数百 コピー）　、ＲｅｃＡ”大腸菌および枯草菌における複製が可能である。プラス ミドｐＭＩＧ３は、乳酸菌においては低いコピー数のベクターである（静置培養 で、細菌あたり数コピー）が、しかし一般に研究室で使われているすべての大腸 菌株においては、高いコピー数で複製する。プラスミドｐＭＩＧ１およびｐＭＩ Ｇ３をＥｃｏＲＩおよび１ｌｉｎｄｌｌ＋で切断し、ＥｃｏＲＩ　−Ｈｌｎｄｌ ｌｌ　テ切断したｐ１８ＮＴ７ＬＩＶＦおよびｐ１８ＮＴ７Ｌ２ＶＦ（７）　７ 　ラグメントニ連結した。結果として得られる、乳酸菌における、Ｔ７プロモー ターの支配下での標的ＤＮＡのクローン化および発現のためのプラスミドをｐＬ ＥＴベクター（Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼによる乳酸菌の発現のためのプラスミ ド）と呼ぶ。プラスミドｐＬＥＴ３およびｐＬＥＴ２は、各々ｐｉ８ＮＴ７ＬＩ ＶＦおよびｐ１８ＮＴ７Ｌ２ＶＦから７７）７７発発現カセット含ンテイルｐＭ ＩＧｌベクターであり、ｐＬＥＴ３３およびｐＬＥＴ３２は、それぞれｐ１８Ｎ Ｔ７ＬＩＶＦおよびｐ１８ＮＴ７Ｌ２ＶＦからのＴ７発現カセットを含んでいる ｐＭＩ０３ベクターである（実例は図３参照）。

ｐ１８ＮＴ７におけるＴ７発現カセットもまたプラスミドｐ１８ＮからＥｃｏＲ １−Ｈｉｎｄｌｌ＋フラグメントとして除去し、ＥｃｏＲＩおよび旧ｎｄｌｌ！ で切断したシャトルベクターｐＭＩＧｌに連結して、シグナル分泌配列を欠（ｐ ＬＥＴｌベクターを生成することができる。この発現カセットの配列も図２に示 した。

９、　Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼの誘導可能な発現のための乳酸菌ベクターの構 築 細菌において外来遺伝子を過剰に発現させるためには、誘導可能な系を持つこと が必要であり、さもなければ産物は、十分に有害となり、組換え株の単離を妨げ 得る。さらに、調節された発現系はもし調節がなければ、自然発生する突然変異 や組換えプラスミドの損失により発現を免れる生物のための、最も弱い選択であ る条件下において、発現株の増殖および維持を可能にする。これらの可能性のた め、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を、最近報告された、ラクトースオペロン 遺伝子の発現を調節するラクトースによる誘導が可能な乳酸菌プロモーターの支 配下に置いた。３１２！プラスミドｐＡＲ１１７３（表１）におけるＴ７　ＲＮ Ａポリメラーゼ遺伝子は、全遺伝子と、翻訳に必要なシャインダルガーノ（ＳＤ ）モチーフを含む翻訳開始コドンの上流の２４ヌクレオチドとを含んでいる２、 　７ｋｂのＢａｍＨＩフラグメント上に局在している。その先のクローニング処 置を容易にするために、ｐＡＲ１１７３からのＢａｍＨＩフラグメントをｐＵｃ １８のＢａｍ旧部位にクローン化してｐＵｃＰｏ　ｌを生成した（図４）。遺伝 子の５′末のＢａｗｌ（１部位は、ｌａｃプロモーターおよびリプレッサーが挿 入されるＢｇｌ１１部位に先行している。ｌａｃプロモーターおよびそのリプレ ッサーは、５′末にＢａｍＨ１部位をもつプライマーを用いたＰＣＲ増幅により 単離し、それ故Ｂｇｌ１１で切断したｐＵｃＰｏｌに連結した後は、Ｔ７　ＲＮ ＡポリメラーゼのＳＤがＩａｃオペロンプロモーター配列のＳＤを置換しティる （図４．　ｐＵｃＬａｃＰｏ＋参照）。

Ｉａｃリプレッサー（ＬａｃＲ）　、および乳酸菌の調節されたｌａｃプロモー ターの支配下にあるＴ７　ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子をＢａｍ）ｌ　１で切断し たＩ）ＵＣＬａＣＰＯｌから単離・精製し、Ｂａｍｔｌ　Ｉで切断したｐｌＬ２ ７７に連結た（図４）。結果として得られたプラスミド（ｐｌＬＰｏｌ）は、乳 酸菌においては低いコピー数を有しく数コピー／細胞）、エリストマイシンに対 する耐性を与える。最後に、ｐｌＬＰｏｌでＭ０１８２０部を形質転換すること により、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼによる発現のための宿主株が確立された。Ｍ Ｇ１８２０株は、ラクトース上で増殖するために必要な遺伝子を含んでいる、２ ３．７ｋｂの大きなプラスミドを運ぶ（表１）。

１０、乳酸菌の発現ベクターにおける破傷風毒素Ｃフラグメントのクローニング 非毒性であり、動物の神経細胞に対するホロ毒素のガングリオシド結合に関与す る、破傷風毒素遺伝子フラグメントＣ（ＴＴＦＣ）は、大腸菌においてクローン 化され産生されてきた。本発明者らはこの遺伝子フラグメントを、乳酸菌におけ る発現の検査タンノくり質として用いたが、その理由は、それがグラム陽性細菌 に由来するものであり、ウェスタンブロッティングおよびＥＬＩＳＡにより容易 に検出し得るからである。

ＴＴＦＣの遺伝子は、大腸菌のＴＴＦＣ発現ベクターであるｐｓ３１２６１（表 １）から、Ｓａｌ　ＩおよびＰｓｔｌによる消化によってはずすことができる。

このプラスミドを次にＰｓｔｌで切断し、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼでＤＮＡ末 端を平滑化し、次いで５ａｌＩで切断した。この遺伝子フラグメントをアガロー スゲルで精製し、ＢａｍＨＩで切断し、平滑化してＳａｌ　Ｉで切断したｐＬＥ Ｔ３とＬ２、およびｐＬＥＴ３３とＬ２に連結した（図３に一例を示す）。

ＴＴＦＣをコードしているＤＮＡフラグメントはまた、ｐＬ［！ＴＩのＢａｍ８ １部位にクローン化して発現プラスミドｐＬＥＴｌ　−ＴＴＦＣを生成すること もでき、それにおいて、読み枠はＴ７バクテリオフアージ遺伝子１０の最初の３ ３ヌクレオチドについては保持されており、従ってＴ７バクテリオフアージ遺伝 子ｌＯタンパク質の最初の１１個のアミノ酸は枠内にある。これを行なうため、 ＴＴＦＣをコードしているＤＮＡフラグメントを、５′末端にＢｇｌｌｌに対す る制限部位にあるセンスプライマーと、５′末端にＢａｍ８１部位のあるアンチ センスプライマーとを用いたＰＣＨにより増幅した。ＴＴＦＣをコードしている ＰＣＲフラグメントをＢｇｌｌｌおよびＢａｍＨＩで切断することによって生じ る付着末端は、いわゆるコンパチブルであっていずれもｐＬＥＴｌにおけるＢａ ｍＨＩ部位へ連結することができる。しかしながら、Ｂｇｌｌｌ−Ｂａｍ）１１ で連結した末端はどちらの酵素によっても再切断することはできない。このクロ ーニング作戦はｐＬＥＴｌ　−ＴＴＦＣ構築物に、ＴＴＦＣ遺伝子の３′末端で のみＢａｍＨＩによる再切断を許すため、それによりＴＴＦＣに対し遺伝子を融 合させるために用いることができる独特のクローニング部位を供する。枠内にＴ ７バクテリオフアージ遺伝子ｌＯタンパク質の最初の１１アミノ酸と共に、ＴＴ ＦＣを含んでいるＴ７発現ベクター（ｐＬ［！Ｔｌ−ＴＴＦＣ）又は、シグナル リーダー１または２のいずれかと共にＴＴＦＣを含んでいるＴ７発現ベクターを 、電気穿孔法により、１７発現用の乳酸菌宿主株（ＭＧ１８２０．　ｐｌＬＰｏ ｌ、表１）に移した。宿主株はまた、実験を確実にするための対照を供するため 、ｐＭＩＧｌおよびｐＭＩＧ３ベクターでも形質転換させた。

１１、乳酸菌における破傷風毒素フラグメントＣの発現破傷風毒素フラグメント Ｃ発現のための組換えクローン、および対照株を、グルコース培地（０Ｍ１７） 中で６００ｎｍにおける光学密度（ＯＤ＠ｅｏ、１．）が約０．５になるまで増 殖させた。ＴＴＦＣ遺伝子の発現は、次に細胞をペレット化し、ラクトース培地 （ＬＭ１７）中にＯＤ、。。。、が約０．３となるよう再浮遊させることにより 誘導した。全細胞タンパク質および培養上清からのＴＣＡで沈殿させたタンパク 質資料を、誘導後の異なる時間ごとに調製した。

誘導の２時間後に調製したｐＬＥＴｌ　−ＴＴＦＣからの全タンパク抽出物のク ーマシー染色したゲルにおいては、ＴＴＦＣは検出される最も豊富なタンパク質 であった（図５ａ）。このタンパク質は、誘導２時間後の対照株から調製した抽 出物中には検出されなかった。ｐＬＥＴｌ　−ＴＴＦＣ株から調製した、全細胞 タンパク質抽出物を用いたウェスタンブロッティングの結果は、誘導された細胞 の中でＴＴＦＣが発現したことを確証した（図５ｂ）。

発現・分泌株（ｐＬＥＴ３−　ＴＴＦＣおよびｐＬＥ２−　ＴＴＦＣ）の全細胞 抽出物および培養上清から沈殿させたタンパク質の、ＴＴＦＣ抗血清を用いたイ ムノブロッティングの結果もまた、ラクトースによるＴＴＦＣ遺伝子発現の誘導 がＴＴＦＣの形成を導いたことを示した（図５０およびｄ）。

さらに、両シグナルリーダーともにＴＴＦＣの培地への分泌を仲介することがで きた。しかしながら、二つの株は全細胞抽出物中に検出されるＴＴＦＣの量につ いては異なっており、すなわちｐＬＥＴ３−　ＴＴＦＣにおいては検出されるＴ ＴＦＣはごく少量であり、誘導の２時間後においてのみ検出されるのに対し、Ｉ ）ＬＥＴ２−　ＴＴＦＣ株の細胞抽出物においては、実質的により多量のＴＴＦ Ｃが検出された。すべてのイムノプロットの著しい特徴は、これらの細胞の全細 胞抽出物中にある、高分子の種類のＴＴＦＣの検出であった。この産物は、プロ セスされていない形（シグナル配列＋ＴＴＦＣ）のタンパク質である可能性が最 も高い（図５ｄに矢印で示した）。これに対し、シグナルリーダー１を融合した 構築物（ｐＬＥＴ３−　ＴＴＦＣ）で得た結果は、ＴＴＦＣはこれらの細胞の細 胞質中には蓄積せず、翻訳と同時に増殖培地中に分泌されることを示した（図５ ｃ）。対照株であるｐＭＩＧｌの全細胞抽出物および培養上清には、ＴＴＦＣは 全く検出されなかった。

Ｔ７Ｌ２発現カセットを運んでいる低いコピー数および高いコピー数の発現分泌 ベクター（ｐＬＥＴ２−　ＴＴＦＣおよびｐＬＥＴ３２−　ＴＴＦＣ）によって 産生されるＴＴＦＣの量を、イムノブロッティングにより比較した。これらの株 の全細胞抽出物タンパク質および培養上清から沈殿させたタンパク質に対する、 抗フラグメントＣ血清を用いたウェスタンプロットの結果を、それぞれ図６ａお よび６ｂに示した。その結果は、前述のように、ラクトースによる誘導に続き、 この株の細胞抽出物および培養上清中にＴＴＦＣが検出されることを示した。グ ルコース中で増殖させたこれらの細胞の抽出物中、または対照株中にはＴＴＦＣ は検出されなかった。著しいことには、標的遺伝子を運んでいるコピー数の高い ベクターと低いベクターとの間に、見かけの発現量の差はなかった。

１２、乳酸菌の培養上清および可溶性タンパク質抽出物におけるＴＴＦＣの分析 発現株ｐＬＥＴ１−ＴＴＦＣ（分泌シグナルリーダーを欠＜）、およびｐＬＥＴ ２−ＴＴＦＣ（分泌リーダー２）からの細胞を誘導し、１．５〜２時間後に機械 的なホモジナイゼイションにより破砕した。いくつかの希釈度のタンパク質抽出 物（デュブリケートに）および大腸菌からの精製したｒＴＴＦＣ（デュブリケー トに）を用いてＥＬＴＳＡのためのマイクロタイタープレートをコートした。こ れらの株の可溶性抽出物におけるＴＴＦＣの量を、標準曲線から測定し、ｐＬＥ Ｔｌ−ＴＴＦＣおよびｐＬＥＴ２−ＴＴＦＣの抽出物における可溶性タンパク質 としてのＴＴＦＣの割合を、それぞれ２２％および３．４％と算出した。対照株 （７７発現配列およびＴＴＦＣ遺伝子を欠（ｐＭＩＧｌベクターをもっている） からの可溶性抽出物にはＴＴＦＣは検出されなかった。

各株からの、可溶性タンパク質５ｎ＋ｇおよび洗浄した不溶性分画の相当量を、 ＳＤＳ　−ＰＡＧＥ、および、抗ＴＴＦＣを用いたウェスタンブロッティングに より分析した。結果（図７）は、ＴＴＦＣがｐＬＥＴ２−　ＴＴＦＣにのみ検出 され、対照株には検出されないことを示している。面白いことに、ＴＴＦＣは発 現株からの不溶性分画中にも認められ、このタンパク質が細胞内において凝集し 、不溶性の封入体様の小体を形成することが示唆される。

乳酸菌ノｐＬＥＴ３−ＴＴＦＣ株およびｐＬＥ２−ＴＴＦＣ株から分泌されるＴ ＴＦＣの量を測定するため、培養物を誘導し、培養上清（誘導後人なる時間に採 る）をＥＬＩＳＡによりＴＴＦＣについて分析した。図８ａはこれらの株が誘導 の約４時間後に増殖の定常期に達すること、およびｐＬＥＴ２−　ＴＴＦＣ株が 、ｐＬＥＴ３−　ＴＴＦＣを運んでいる細胞またはｐＭＩ０１対照細胞よりゆっ くり増殖し、等しい細胞の最終濃度に達しないことを示している。分泌されるＴ ＴＦＣを、誘導後６時間のタイムコースをとって分析すると（図８ｂ）、ｐＬＥ Ｔ３−　ＴＴＦＣをのせている株によって増殖培地中に分泌されるＴＴＦＣの量 は、細胞が定常期に入る時にプラトー（約１μｇ／ｍｌ）に達した。ｐＬＥＴ２ −　ＴＴＦＣによって増殖培地中に分泌されたＴＴＦＣの量はさらに高い（６時 間後に約２μｇ／＋ｎｌ）。ｐＭＩＧｌ対照株の上清にはＴＴＦＣは検出されな かった。ｐＬＥＴ３−　ＴＴＦＣ株と比べたｐＬＥＴ２−　ＴＴＦＣ株の増殖速 度の低さを考え、誘導後の異なる時間に存在する死細胞の数を、培養物をＰＢＳ で希釈したものに対してプロビジラムヨウ化物（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ　ｔｏｄｉ ｄｅ）（ＰＩ、　１０ｍｇ／岨）を加え、位相差および蛍光顕微鏡により細胞を 調べることにより測定した。その結果は、ｐＬＥＴ３−　ＴＴＦＣおよび対照株 では０．５％より少ない細菌が誘導の６時間後にＰｌに対し透過性であることを 示した。ｐＬＥＴ２−ＴＴＦＣでは、２時間後に約５％の細菌がＰｌに対し透過 性になり、この割合は増加していき、６時間後には約１０％となる。このことは 、この株の増殖培地中に検出されるＴＴＦＣのいくらかは、死んだ細胞から漏れ た可能性があることを示した。

ｐＬＥＴ３−　ＴＴＦＣ株の増殖および生存度は、ＴＴＦＣ産土の産生後影響を 受けないため、この株を低い細胞濃度において誘導し、その増殖速度およびＴＴ ＦＣ分泌を６時間にわたって検査した。これらの結果は、増殖培地中に分泌され るＴＴＦＣの量が、細胞密度に比例していることを示した（図８ｃ）。対数増殖 期の間に増殖培地中に分泌されるＴＴＦＣの量は、約２μｇ／ｍｌ／ｈと算定さ れた。

＋３．発現結果についての議論 これらの結果は、乳酸菌において、実質的価値のある鳳の異種遺伝子産物の、調 節された発現のため、および任意に分泌のための系の構築が可能であることを、 初めて証明した。

本発明者らの系においては、遺伝子の発現は、増殖培地へのラクトースの添加に よって誘導することができるが、誘導物質が作られる機構は大腸菌における周知 のｌａｃオペロンに見られるものとは異なっており、それはラクトースの代謝系 路がこれらの二つの生物では非常に異なっていることが知られているからである 。誘導物質であるラクトースの代謝物を作るため、本発明者らは乳酸菌のｌａｃ オペロンをコードしている、コピー数の低い２３．７ｋｂのプラスミドをもつ乳 酸菌（ＭＧ１８２０）株を使用した。乳酸菌の発現株もまた、乳酸菌のＩａｃプ ロモーターの支配下にあるＴ７　ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を運ぶ、低いコピー 数の組換えプラスミド（ｐｒ［、ｐｏｌ）で形質転換した。

誘導物質は、このプロモーターにおいて、リプレッサーが転写をブロックするこ とを妨げ、その結果Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼが細胞内に作られる。Ｔ７　ＲＮ Ａポリメラーゼは、それと同起源のプロモーター配列（この場合には、標的遺伝 子のプラスミドのＤＮＡ上にある；　ｐＬＩｌｌＴベクターファミリー、図２お よび３ｃ参照）に、このような厳格な特異性があるため、それは転写を開始し、 標的遺伝子のＲＮＡを転写する。次いで宿主細胞のタンパク質翻訳および分泌装 置が異種タンパク質を産生じ、もしそのタンパク質が分泌シグナル配列をもって ぃればそれを分泌する。本発明者らの標的遺伝子ベクターは、全種類の乳酸菌、 多数のバシラス属、ストレプトコツカス属のいくつかの種、クロストリジウム属 、リステリア属、および大腸菌を含めた多数のグラム陽性細菌において複製する ことのできるレプリコンを組み込む。従ってここに記したベクターは、これらの 他の生物におけるＴ７に基づく発現系の開発にとって有用であろう。

ＴＴＦＣ遺伝子は、発現ベクターｐＬＥＴ１および、２つの異なる分泌リーダー 配列のうちの一つがすでにクローン化されている（ＬｌおよびＬ２）、高いコピ ー数および低いコピー数のｐＬＥＴベクターにクローン化した。続いて、乳酸菌 発現宿主（その時までにラクトースオペロンプラスミド１８２０およびｐｌＬｐ ｏｌを運んでいる）を、標的遺伝子プラスミドを用いてさらに形質転換させた。

これらの細胞を誘導すると、Ｔ７　ＲＮ＾ポリメラーゼの調節された産生を介し た遺伝子の発現が見られた。ｐＭＩ０１対照株の上清または細胞質分画にはＴＴ ＦＣは検出されなかった。ｐＬＥＴｌ　−ＴＴＦＣ株は、誘導後わずか２時間で 、可溶性タンパク質の約２２％をＴＴＦＣとして産生じた。用いた分泌シグナル 配列は、どちらもＴＴＦＣの増殖培地への分泌を指示したが、実質的な量（可溶 性タンパク質の３．４％）のＴＴＦＣは、ｐＬＥＴ２−　ＴＴＦＣ株からの細胞 抽出物にのみ見られ、この株においては、乳酸菌のＵＳＰ４５シグナルリーダー （Ｌ２）を用いて分泌を指示した。同じような量のＴＴＦＣが、２つのシグナル リーダーの片方ずつを運んでいる細胞によって分泌されることから、ｐＬＥＴ２ −　ＴＴＦＣ株における細胞内へのＴＴＦＣの蓄積は、おそらく、より高いレベ ルの発現の結果であろう。この結果は意外であった。ｐＬＥＴ３−　ＴＴＦＣ株 はｐＬＩ！Ｔ２−ＴＴＦＣ株より多くのタンパク質を産生ずると予想されていた が、それはＴ７Ｌ１発現カセットにおいては、リポソーム結合部位を含めて、Ｔ ７プロモーターおよびＲＮＡ安定化配列の下流の配列はすべて乳酸菌起源のもの だからである。ｐＬＥＴ３−　ＴＴＦＣ構築物で見られた低いレベルの遺伝子発 現の理由はわかっていない。一つの可能性は、二つのｍＲＮＡの５′の二次構造 配列およびシャイン・ダルガーノ配列が、タンパク質の翻訳開始を異なる速度で 促進するということである。これらの因子はまた、発現分泌ベク９−　ｐＬＥＴ ３−ＴＴＦＣおよびｐＬＥＴ２−　ＴＴＦＣ＋、：比しテｐＬＥＴ１ヘクターで 得たＴＴＦＣ発現のより高いレベルを説明するであろう。

誘導の２時間後に調製したｐＬＥＴ２−　ＴＴＦＣをもつ発現株の可溶性および 不溶性タンパク質抽出物のイムノブロッティングは、可溶性タンパク分画中に回 収されたＴＴＦＣのほとんどが、不溶性分画に関連しているＴＴＦＣより分子量 の低いものであることを示した。分子量におけるこの差は、細胞内の可溶性タン パク質は、分泌される形にプロセスされており、一方細胞内の不溶性タンパク質 はプロセスさせずに残っていることを暗示している。このことは、細胞内で可溶 性の形で回収されるＴＴＦＣのほとんどすべてが膜に移動しており、おそらく細 胞膜と細胞壁との間に存在することを示唆している。もしこれが真実なら、細胞 壁を通してのＴＴＦＣの拡散速度は、少なくとも本発明者らによりここに用いた 増殖条件下では、タンパク質分泌における律速段階であるはずである。ＳＤＳ　 −ＰＡＧＥおよびイムノブロッティングにより不溶性分画中に検出されるＴＴＦ Ｃは、大腸菌において過剰に発現された他の組換えタンパク質に共通して見られ るように、細胞内におけるタンパク質の凝集から生じるものであろう。そのかわ りとして、このプロセスを受けていないＴＴＦＣは細胞膜から生じ、細胞分画の 間細胞壁に付随して残っていたのであろう。

機械的にホモジナイズした細胞の、可溶性分画および不溶性分画中に検出される ＴＴＦＣは、細胞のりゾチームおよびムタノリシンとの３７℃におけるインキュ ベーションを含む、ゆっくりした抽出方法により調製した全細胞抽出物中にはい くらかの分解が認められるのに対し、明らかに分解されてないかった。細胞壁の 酵素による消化、およびそれに続く、プロテアーゼインヒビター不在下での洗浄 段階は、死んだ細胞における分解過程を活性化するらしい。本発明者らの発現・ 分泌株により培養細胞の増殖培地中に分泌されたＴＴＦＣは、２２時間インキュ ベートした後でも分解せずに残った。これらの結果は、プロテアーゼ分解が乳酸 菌の異種タンパク質産生への使用を妨げないであろうという信念に自信をもたせ た。

本発明者らの実験では、対数増殖期の中頃に細胞を誘導し、誘導後３〜４時間で 細胞は定常期に達した。細胞内のタンパク質の蓄積は、誘導の６〜２２時間後に おける全細胞抽出物中には検出されなかったが、増殖培地中に分泌されるＴＴＦ Ｃの量はこの時間を通して約１０〜２０倍に増加した。上記の結果に照らすと、 Ｔ７ボリメラーゼによる発現は、細胞が増殖の定常期に入ると限定されるかまた は阻害されること、および増殖培地中に分泌されるＴＴＦＣの量は、細胞壁を通 してタンパク質が拡散するため、時間と共に増加することがもっともらしい。

本発明者らの発現・分泌の一つ（ｐＬＥＴ３−ＴＴＦＣ）の増殖および生存度は 、誘導物質の存在下に低い細胞密度から増殖させた場合でも、ｐＭＩＧｌ対照株 の対照色同じであった。対数増殖期には、この株は１時間あたり約２μｇのＴＴ ＦＣを増殖培地中に分泌した。

本発明者らの発現系にとって更なる進歩は、プラスミド生まれのｌａｃプロモー ターおよびＴ７　ＲＮＡポリメラーゼ配列のための、抗生物質を介した選択の必 要性を、それらを乳酸菌宿主株の染色体に組込むことによって排除したことから くる。標的遺伝子を取り込んだ発現カセットも、同じ理由で宿主ゲノムに組込ま れることができる。

本発明者らの結果は、そのような組込みが産物の量を減少させることはなさそう であることを示している。本発明者らは、低いコピー数および高いコピー数のＴ ＴＦＣ発現ベクターにより、同じような量のＴＴＦＣが産生されることを発見し たが、そのことは、標的遺伝子の高いコピー数の維持が、この系にとって実質的 な量の標的遺伝子産物を生じるために必要ではないことを暗示している。これら の結果も　′また、ワクチン抗原伝達のための使用の可能性に加えて、乳酸菌が 、組換えタンパク質の可溶性な形での産生および分泌のために使用することので きる微生物群に対し、安全で有用な追加物としてさらに開発され得ると信じる理 由を与える。

１４、ｉｎ　ｖｉｖｏのデータ、免疫反応一般 ＴＴＦＣを発現している乳酸菌組換え体の細胞の、皮下投与または経口投与によ り、マウスを免疫した。細胞をラクトースで２時間誘導し、次いで洗浄し、ＢＦ ２１００μｌに再浮遊させて皮下投与するかまたは０．２Ｍ重炭酸ナトリウムを 加えて経口投与した。

実験１．皮下投与（ｐＬＥＴ２−ＴＴＦＣ）実験開始時に５〜６週令の、Ｂａ１ ｂ／ｃ雄マウスを各群６匹から成る４群に分けた。

１群：０８目および１８目に、ｌＸｌ０’より多い、ｐＬｆ！Ｔ２−　ＴＴＦＣ からのＴＴＦＣを発現している、乳酸菌の組換え細胞を皮下に接種した。

２群＝θ日目および１８目に、ｌＸｌ０”より多い、ＴＴＦＣを発現していない 乳酸菌を皮下に接種した（すなわち、乳酸菌の投与自体による影響を識別するた めのネガティブコントロール）。

３群：０，１５、および５８日目に、ＰＢＳ中の、商業的に得られるＴＴＦＣフ ラグメントＣＩＯμｇを皮下接種した（すなわち一般的に免疫化に使われた、入 手しやすい精製したＴＴＦＣを用いての、ＴＴＦＣのポジティブコントロールと しての対照）。

４群：何も接種しない（直接のネガティブコントロール）。

全４群を６５日目に、単回の皮下接種用量の破傷風毒素、約２〜４１，０．。で 感作し、感作の２４時間後に検査した。

２つのネガティブコントロール群（２および４）では、６匹の動物はすべて明ら かな麻痺症候を示した（法の要求により動物愛護的に処理した）。ポジティブコ ントロール群（３）、および乳酸菌ＴＴＦＣ群（１）では、感作の２４時間後に すべての動物に麻痺症候がなかったが、（１）群のうち１匹は７２時間後に軽度 の麻痺症候を示した。

これらの結果は、乳酸菌において発現され細胞内に含有されたＴＴＦＣが、皮下 投与された場合、病原菌に対して一般的に用いられる精製したＴＴＦＣによって 得られるものと同じ種類の防御効果を与えることのできる、生物活性のある構造 をとっていることを示した。また、乳酸菌において発現される抗原の免疫原性は 、ストレプトコツカス属（ｉｗａｋｉら）のような密接に関連した細菌種に起源 する抗原には限らないことも示している。

実験２．皮下投与（ｐＬＥＴＩ−ＴＴＦＣ対ｐＬＥＴ２−ＴＴＦＣ）本実験は、 ｐＬＥＴ２−　ＴＴＦＣ発現産物（実験１参照）の防御効果を、ｐＬＥＴＩ　− ＴＴＦＣ発現産物と比較する。前文に示したようにｐ［、ＥＴ２は分泌性の構築 物であるにもかかわらず細胞内に、可溶性タンパク質の約４，３％のＴＴＦＣを 保持しているのに対し、ｐＬＥＴｌは非分泌性構築物であり、可溶性タンパク質 の約２２％のＴＴＦＣを細胞内に蓄積する。

ＣＢＡマウスを２週間ごとに３回、皮下接種した。血清中の抗体に有意な増加を 示すマウスを、最後の接種から１４〜２０日後に、精製した破傷風毒素で感作し た。

それぞれのＴＴＦＣ構築物に対し、マウスをそれぞれ５Ｘ１０’、５Ｘ１０７、 および５Ｘ１０’個の組換え乳酸菌細胞を受ける、３群に分けた。感作には、こ れらの群を各々２０ＸＬＤ、。および５ＸＬＤ＋ｏの破傷風毒素を受ける２つの 小群に分けた。結果を以下に示す。

これらの結果は、細胞内のレベルが高い乳酸菌発現株ｐＬＥＴ１−ＴＴＦＣが、 細胞内のレベルが低い発現株ｐＬＥＴ２−　ＴＴＦＣより防御の供与において、 約１０倍効果的であることを示している。言い換えれば、乳酸菌において、非常 に高いレベルで細胞内に発現されているにもかかわらず、ＴＴＦＣタンパク質は 、防御効果を供するためにほぼ完全に、構造的に活性のある状態（Ｂ細胞は構造 上のエピトープに反応するため）をとっているらしい：この結果は、たとえば大 腸菌において異種タンパク質が高いレベルで発現される時に共通して見られるも のと著しく異なっている。

他の実験では（データは示さず）、異なる株（Ｂａｌｂ／ｃおよびＣ５７ＢＬ／ 　６　）において、完全に防御できる量の抗体を得るために必要とされる、ＴＴ ＦＣ乳酸閑乳酸柱用量を比較することにより、ｐＬＥＴｌ−ＴＴＦＣ株がｐＬＥ Ｔ２−ＴＴＦＣ株より効果的であることがわかったが、その程度は、ある一定の 用量レベル（細胞数）に関して、防御できる抗体レベルに達するために、ｌ少な い用量が必要とされるか、またはある与えられた用量に対して、防御できる抗体 レベルの達成が１０倍少ない用１１（細胞数）でてきるという程度であった。つ まり、これらのデータは、前文のＣＢＡのデータから引き出した推論を確証する 傾向がある。

実験３．経口投与 Ｃ５７［ＩＬ／　６マウスに、乳酸菌株ｐＬＥＴ２−　ＴＴＦＣおよびｐＬＥＴ ｌ　−ＴＴＦＣを経口的に投与した。各群あたり３匹のマウスを用いた。０．２ Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液に再浮遊させた乳酸菌株の以下の用量を、マウスの群 に経口的に投与した（エーテル麻酔下に）。

１群：　５　Ｘ　１０”　ｐＬＥＴ２−ＴＴＦＣ２群：　５　ｘｌＯ’　ｐＬＥ Ｔ２−ＴＴＦＣ３群＋　５　Ｘ　１０’　ｐＬＥＴｌ、−ＴＴＦＣ４群・５　ｘ 　１０’　ｐＬＥＴＩ−ＴＴＦＣ５群：重炭酸ナトリウム］００ｍ１のみ６群： 　５　Ｘ　１０’　ｐＭＩＧＩ（ＴＴＦＣを発現しない株）免疫化の方法は以下 の通りである２ １日目　尾静脈より試採血 ３日目　マウスに経口接種 １１日目　尾静脈より試採血 ２５日目　尾静脈より試採血 ３２日目　経口接種 ３９日目　尾静脈より試採血 ８３日目　尾静脈より試採血 ９０日目　尾静脈より試採血 ９７日目　尾静脈より試採血 血液を４０℃で一晩貯蔵し、室温で５分間遠心し、血清を無菌の管に移した。ア ジ化ナトリウムを加えて濃度を０．０２Ｍとし、試料を必要な時まで一２０°Ｃ に保存した。接種にはアジュバントを何も加えなかった。

破傷風毒素に対する全身（血清）の抗体（ＩｇＭおよびＩｇＧ）を、破傷風毒素 を抗原として用いたＥＬＩＳＡ分析で、血液試料から検出した。

粘膜抗体（ＩｇＡ）については、抗体ＴＴＦＣ抗体価を測定する前に、試料を全 １ｇＡにつきＩｍｇ／ｍｌとなるようにした。

結果は、５ＸｌＯ’のｐＬＥＴｌ　−ＴＴＦＣ乳酸菌細胞（高レベル・非分泌株 ）を受けた第４群のマウスが、３回目の接種の後、抗ＴＴＦＣ可溶性ＩｇＡの有 意に増加したレベルを生ずることを示した。他の群ではいずれも有意に増加した ＩｇＡレベルは検出されなかった。

ＩｇＧおよびＩｇＭに関しては、予備的な結果は、第２群からは有意に増加した 抗ＴＴＦＣ１ｇＭレベルを、第４群からは、より弱い反応を示した。一方、測定 されたＩｇＧレベルは低いままであったが、やはり第２群では有意の可能性のあ る増加を示した。

これらの結果は明らかに、乳酸菌の細胞内に含まれているＴＴＦＣの経口投与か らの、ポジティブな粘膜反応を示唆している。このことは、有意な免疫反応を起 こすことが知られていない、ＴＴＦＣの直接的な経口投与（アジュバントがあっ てもなくても）と対比され、粘膜における免疫反応を誘導するための適切な場所 へＴＴＦＣ発現産物を位置づけることにおける、さらに当然のことながら免疫学 的に活性のある形態における、細胞に包みこむことからの重要な効果を示唆して いる。

全身的な免疫反応に関する限り、もし予備的なデータのみが確証され最大限に利 用されるとしたら、その結果は、免疫源のより低いレベル（たとえば、高い発現 レベルのｐＬＥＴｌ株よりも、低い発現レベルのｐＬＥ７２株の方）と結びつい ているか、または細胞（分泌性ｐＬＥ７２対非分泌性ｐＬＥＴ１）からの、　ｉ ｎ　ｖｉｖｏにおけるＴＴＦＣの分泌と結びついていることが示唆される。

ｉｎ　ｖｉｖｏのデータに基づく一般的な観察これらの結果は、乳酸菌における 非ストレプトコツカス属（非ラクトコツカス属）の抗原の発現を初めて示し、そ れを経口投与した場合、免疫反応を引き起こすことを示した。

それらはまた、異種タンパク質が乳酸菌において発現され、可溶性タンパク質と して生物学的に活性のある形態で、細胞質に高いレベルで蓄積され得ることを示 している。特に、このことは、免疫原性のあるタンパク質を、発現細胞の防御的 な環境の中において、免疫されるべき動物へ受渡すことを可能にし、それにより ワクチン産生および送達系のための新しい可能性を開く。

実施例２ ３、乳酸菌における、膜に固定されたタンパク質の発現乳酸菌における、膜に固 定した抗原およびその他のタンパク質のための発現ベクターの構築 いくつかの抗原は、もしそれらのエピトープが、細菌のような、食作用を受けや すい粒子の表面にさらされていれば、最も効力があることが知られているため、 本発明者らは、ＴＴＦＣのような抗原を乳酸菌の細胞膜に固定することができる 方法を開発した。

このことは、乳酸菌の細胞壁に結合しているプロテイナーゼの、膜に固定してい るドメインを取りこんでいる融合タンパク質を、ＴＴＦＣのＣ末端への融合体と して、乳酸菌から作り出すことにより成された。

発現ベクターは以下の方法で構築した １、乳酸菌株ＮＣＤ０７６３　（ｎｔ　６５１８〜６９１３）のプロテイナーゼ （Ｐｒｔ）遺伝子の、細胞壁および細胞膜に結合しているドメインをコードして いるＤＮＡフラグメントを、公開されている配列′４に基づき、適切なプライマ ーを用いてＰＣＲ増幅により得た。クローニングを容易にするため、プライマー はその遺伝子の５′および３′末端に、それぞれＢａｍＨＩおよびＢｇｌｌ＋制 限部位を取りこむよう設計した。

２、そのようにして得た精製したＰＣＲフラグメントを、修正したｐＬＥＴ２ベ クターのＢａｍ８１部位にクローン化してｐＬＥＴ４を生成した。

プラスミドｐＬＥＴ４においては、一つしかないＢａｍＨＩ制限酵素部位は、シ グナルリーダーと壁におよぶ膜固定ドメインとの間に存在する。

標的遺伝子を挿入できるのはこの部位である。

このような構築物の一例として、本発明者らはここに、細胞膜に固定したＴＴＦ Ｃの変形体を誘導することができることを示す。同様のＰＣＲに由来する、ｐＬ ＥＴｌにクローン化されたＴＴＦＣをコードしているＤＮＡフラグメントもまた 、プラスミドｐＬＥＴ４のＢａｍＨ１部位に連結し、ｐＬＥＴ４−　ＴＴＦＣを 得た。ｐＬ［！Ｔ４−　ＴＴＦＣを運んでいる発現株を誘導すると、正しい大き さの融合タンパク質がみられ、抗ＴＴＦＣ抗体で認識された（図１５ａ）。誘導 した細胞の細胞分画を用いたイムノブロッティング実験の結果は、融合タンパク 質が可溶性の細胞質分画には存在せず、膜および不溶性分画に存在することを示 した（図１５ｂ）。

これらの結果は、産生された融合タンパク質のすべてがただちに細胞膜に結合す ることを証明する。

実施例３ ■、乳酸菌における旧ＶＩＶ３ループ抗原の発現序 ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶＩ）が人から人へ移る際は、一般に雄性および雌 性の生殖器の粘膜を介して宿主に感染する。これらの粘膜表面は、身体の他の粘 膜と同様、腺分泌によりうるおされており、それは分泌１ｇＡ　（ｓｌｇＡ）と して知られる種類の、局所的に産生される免疫グロブリンを含んでいる。これら の免疫グロブリンは、感染に対する重要な第一の防衛ラインを構成するものと信 じられている。

多くの疾病に関して、感染に対する防御は、全身的な抗体形成よりも、分泌性抗 体の形成により密接に関係していることが観察されている。この理由から、十分 に防御的かつ引き延ばされたｓ１ｇＡ反応を刺激する方法は、かなり実用的な重 要性をもつが、その理由は、それが疾病に対する防御よりむしろ感染に対する防 御を供給するワクチンを開発することを可能にしたからである。現在入手できる ほとんどの通常のワクチンは、全身の免疫系を活性化して、それ以降、対応する ワクチンをさしむけた感染性要因の複製および拡散を制限することを目指してい る。はとんどの疾病に関して、感染に対する防御と疾病に対する防御の間の区別 は実用的な意味をもたない。しかしながら、８ｍ感染の場合には、ひとたびウィ ルスＤＮＡが宿主細胞のＤＮＡに挿入されると、その感染過程はあと戻りするこ とができない、または治癒されないため、そのような区別は明らかに重要である 。旧Ｖｌに対する防御に成功するためのワクチンとしては、それ故、粘膜の免疫 性の十分な状態（および全身の免疫性も）を引き出すことが重要であり、それは 、発生する遊離のウィルスを初期に中和して、ウィルスの細胞内への侵入を阻止 するためである。感染を防ぐべく設計された、活性の高いＨＩＶワクチンの鍵と なる特徴は、中和するｓｌｇＡの十分な量の形成を引き出すことができることで ある。

他の研究者らの研究は、旧■ｌの中和は、第一にウィルスのエンベロープタンパ ク質、特にｇｐ１２０として知られている、さらにこのタンパク質内の■３ルー プとして知られている領域に対して引き起こされた抗体を介する反応の作用であ ることを示してきた。このループは主要な中和用の決定基であるとされてきた。

適当な親和性をもつ抗体がＶ３ループに結合すると、ウィルスは細胞内への侵入 および感染を妨げられる。ウィルスの中和は、適切な特異性と親和性をもつ十分 な量のｓ１ｇＡ抗体が、分泌粘膜に存在する場合にのみ起こるため、これらの抗 体の形成を刺激するための方法を工夫することが必要である。粘膜免疫は、適当 な量の抗原タンパク質を摂取することによっても刺激されるが、このような方法 は、摂取されたいかなるタンパク質も、その大半が胃酸および（または）腸に存 在するタンパク質分解酵素により分解されるため、通常はほとんど効果がない。

ｇｐ１２０タンパク質全体の免疫化への使用は、このタンパク質の、ある領域が ヒトの自己抗体を誘導すると考えられているため好ましくないであろう。しかし ながら、単離されたＶ３ループをコードしている小さなタンパク質は、抗原とし て作用するには十分な分子サイズではないらしい。

ＨＩＶＩに対する粘膜免疫の刺激のための実用的なワクチンは、それ故、（ａ） 手ごろな経費で防御できる免疫原を産生ずる手段、（ｂ）その免疫原を粘膜の免 疫系に送達する手段を含まねばならない。本発明者らは、ＨＩＶＩＶ３ループタ ンパク質を、食品品質の乳酸菌（ラクトコッカス・ラクティスの亜種ラクティス ）内で発現させる方法を発明した。本方法においてこのことは以下のように行な った。

実験 １、ＨＩＶｌタイプＭＮウィルスのＶ３ループをコードしているＤＮＡ配列を、 実施例のようにして取り、ポリメラーゼ連鎖反応での使用に適したオリゴヌクレ オチドプライマーを設計してウィルスＤＮＡを増幅し、各々Ｖ３ループを含む、 長さの異なるＤＮＡ配列を得た。プライマーは、５′および３′末にそれぞれＢ ｇ１１１部位およびＢａｍ）ｌ　１部位を含むように設計し、少量の核酸の置換 物を取りこんで、高い発現レベルの乳酸菌遺伝子にみられるコドンに、より合致 するものを作った（図９）。ＤＮＡのＰＣＲ増幅は、忠実度の高い反応条件およ び、サーマルサイクラ−（カンビオ社、英国、ロンドン）を用いて行った。反応 液は、全体積１００μｍの中に、１倍のＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ ｌ、　ｐＨ７，５（７０℃で）、　５０ｍＭ　ＫＣＩ）、各デオキシヌクレオチ ド三リン酸２５０μＭ、各ブライｖ　−０，５μＭ、１ｍＭＭｇＣＩ２．　Ｈｍ タイプＭＮで感染した細胞のＤＮＡ（１ｘ　１０’感染単位／ｍｌで１　ｍｇ） およびＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（シータス　アンプリタフ）２．５単位を含む 。鋳型ＤＮＡを９５℃で５分間加熱した後、酵素を加えた。ついで３０サイクル のＰＣＲ増幅を、以下の条件下で行なった。すなわち、９４℃で１分間変性させ 、５０℃で１分間アニールさせ、７２℃で１分間伸長させ、最終的な伸長を７２ ℃で５分間行なった。

２、タイプＭＮのｖ３ループをコードしている増幅したＤＮＡフラグメントＶ３ ａおよびＶ３ｂ（図９参照）をＢｇｌｌｌおよびＢａｍＨＩで切断し、ゲルで精 製して、乳酸菌におけるＴＴＦＣの発現および分泌のために構築したベクターの ＢａｍＨＩ部位に連結しくｐＬＥＴ２−ＴＴＦＣ−ＢａｍＨＩ　）　、Ｖ　３ル ープがＴＴＦＣ遺伝子の３′末への融合物として翻訳されるようにした。結果と して得られた、ＴＴＦＣ／Ｖ３ａ融合タンパク質の発現のための標的遺伝子ベク ターを、例として図１０に示す。

３、プラスミドｐＬＥＴ２−　ＴＴＦＣ／　Ｖ３ａおよびｐｌ、ＥＴ２−　ＴＴ ＦＣ／Ｖ３ｂを次いで異質遺伝子の発現用の系の、他の要素を運んでいる乳酸菌 発現株に導入した。この系の基本的な要素を図１１に描いた。

４、標的遺伝子発現プラスミド、およびその発現系に必要な調節要素を運んでい る細菌細胞を、グルコース上の増殖からラクトース上の増殖へ切りかえることに より誘導し、ＴＴＦＣ／Ｖ３融合タンパク質を得た。誘導の２時間後に、全細胞 抽出物からのタンパク質をＳＤＳ・ＰＡＧ　ｌｌ′で分離し、ニトロセルロース 上に電気的にプロットした。タンパク質の転移をボンソーＳで可逆的に染色する ことによりチェックし、その後ＴＴＦＣおよびＩＩＩＶの■３ループを、ウサギ ＴＴＦＣ抗血涜および旧ＶｌタイプＭＮのＶ３ループに特異的なモノクローナル 抗体を用いて別々に検出した。その結果は抗原として完全なＴＴＦＣおよびｖ３ ループが、誘導後の発現株において検出された（それぞれ図１２ａおよびｂ）。

この方法の使用は、経口投与ワクチンとして用いるために、乳酸菌のような食品 品質の生物において、１ｌＩｎウイルスのフラグメントを発現することが可能で あることを、初めて我々に証明することを可能にした。

実施例４ 乳酸菌における、殺虫性結晶タンパク質の産生序 異なる宿主昆虫のスペクトルをもつ、いくつかの種類の殺虫性結晶タンパク質（ δ−エンドトキシンとして知られる）は、バチルス・ツリンジエンシスの株で天 然に産生される。これらのタンパク質のほとんどはプロトトキシンであり、胞子 形成の間、細菌内で封入体を形成する。結晶状のプロトトキシンはアルカリ性の 情況により、昆虫の中腸内で溶解し、次いでタンパク質分解によりプロセスされ て、より小さな、活性のあるポリペプチド毒素を生じる。この毒素は感受性のあ る昆虫の牛腸上皮細胞に穴をあけてその膨張および分離を引き起こすと考えられ ている３５゜結果として、昆虫の幼生は食物摂取を止めて死ぬ。

これらの毒素の特異的な性質は、作物を昆虫の害から守るためノくチルス・スリ ンジエンシスの異なる方式を用いて、過去２０年間にわたり利用されてきた。結 晶タンパク質毒素の遺伝子のクローン化は、現在ある方法の改良に関して多大な 可能性を供した。たとえば、殺虫性結晶タンパク質はトランスジェニックな植物 、３″−３８および植物に関連している微生物の中で発現させることができたＩ Ｉ０乳酸菌における高いレベルの調節された発現の開発は、作物に対する殺虫性 結晶タンパク質の、より低いコストでの産生および送達のための代わりの戦術を 供した。乳酸菌を使用することの利点は、それが産業において、受諾したＧＲＡ Ｓ　（一般的に安全と認められる）の状態にあることと、乳酸菌の発現系におい てこれを誘導する際の迅速な毒素形成と結びついた、確立された低コストの発酵 技術にある。Ｂ。

ツリンジエンシスの野生型の分離株における毒素の形成は、胞子形成および毒素 形成が完了するために長い時間（たとえば１７〜２４時間）を必要とし得るのに 対し、乳酸菌においては、遺伝子の発現を誘導してから２時間以内に、生物活性 のある毒素が形成される。さらに、乳酸菌のような、丈夫なグラム陰性生物の中 での結晶タンパク質の送達は、結晶タンパク質とバチルス・ツリンジエンシスの 胞子との混合物とは対照的に、環境におけるこのタンパク質の安定性を一層増進 するものであろう。

この方法における乳酸菌の組換え体の使用の可能性を証明するため、本発明者ら はここにバチルス・ツリンジエンシス・クルスタキ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕ ｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　ｋｕｒｓｔａｋｉ））１０−１株４ｏからのＣｒｙｌＡ 　（ａ）結晶タンパク質のクローニングおよび発現について述べる。

１、、ＣｒｙｌＡ発現プラスミドの構築ＣｒｙｌＡのための結晶タンパク質遺伝 子を、Ｔ７発現カセットにクローニングし、それ自身の開始コドンが翻訳に使わ れるようにするためには、その遺伝子の末端に、適切な制限部位を導入すること が必要である。これを行なうために、まず遺伝子を一般的なりローニングベクタ ーに集めた。ＣｒｙｌＡ遺伝子の二つの、ＰＣＲ由来の遺伝子フラグメントを図 １３に詳説したように、プラスミドｐＷＷにクローン化した。プライマーは、遺 伝子の５′末にＡＴＧ　（翻訳開始）コドンを組み込んだＮｄｅ　１部位を含み 、停止コドンの直後の３′末にＢａｍ１ｌ　Ｉ部位を含むように設計した。フラ グメントは遺伝子内に存在する単一のＫｐｎ　１部位で連結した（図１３）。Ｐ ＣＲに用いた熱安定性ポリメラーゼは、増幅したＤＮ八に突然変異を誘導し得る ため、ＣｒｙＩＡ遺伝子の単独なＳｐｅ　１部位およびＥｃｏＮ　１部位の間の 、主要な部分（９５％）をプラスミドｐＷＷ−ＣｒｙｌＡから切り取り、同様に 制限消化した、ｐＥｓｌ”でクローン化したバチルス・フリンジエンシスＤＮＡ 由来のＤＮＡ断片と置き換えた。結果として得られたプラスミドｐＷＷ−Ｃｒｙ Ａを、ＮｄｅｌおよびＢａｍ）Ｉ　Ｉで切断し、ＣｒｙｌＡフラグメントをコー ドしている３、　５ｋｂのＤＮＡフラグメントを、ｐＵｃＩ９ＮＴ７におけるＴ ７発現カセットのＮｄｅ　１部位とＢａｍ１１１部位との間にクローン化した（ ｐｌＪｃ１９ＮＴ７は、Ｔ７カセツトおよび複数のクローニング部位が逆方向に クローン化されている点を除けば、図１に示したように基本的にはｐ１８ＮＴ７ と同しである。カセットの詳しい配列を図２に示す）。最後に、ＣｒｙｌＡ遺伝 子（Ｓｍａ　−Ｐｓｊ１断片）を取り込んでいるＴ７発現カセットを、乳酸菌／ 大腸菌シャトルベクターｐＭＩＧ１のＳｍａ　Ｉ部位とＰｓｔ部位との間にクロ ーン化して、発現プラスミドｐＬＥＴ　−ＣｒｙｌＡ（図１３）を生成した。こ のプラスミドを発現宿主株であるＭＧ１８２０．　ｐｌＬＰｏｌに転移した。ｐ ＬＥＴｌ　−ＣｒｙｌＡをもつ発現株を、材料および方法に記したように増殖さ せ、 誘導した。

２、乳酸菌におけるＣｒｙｌＡの発現 誘導後のｐＬＥＴｌ　−Ｃｒｙ　ＩＡ株から調製した全細胞抽出物のクーマシー 染色したゲルは、２時間後に正しい大きさのタンパク質がはっきり見えることを 示した（図１４ａ）。結晶タンパク質に対するポリクローナル抗血清を用いたウ ェスタンブロッティングの結果は、Ｃｒｙ　ＩＡＡ伝子産物が誘導の後に高いレ ベルで細胞内に蓄積していることを確証した（図１４ｂ）。誘導していない細胞 においても少量が発現されている。誘導した非発現性の対照株から調製した全細 胞抽出物中には、そのようなタンパク質は検出されなかった。

ｐＬＥＴｌ　−Ｃｒｙ　ＩＡ発発現跡らの細胞を、材料および方法に概要を述べ たように、誘導の２時間後に機械的なホモジナイゼーションにより粉砕した。対 応する量の不活性分画（壁）、膜分画（Ｍ）、および可溶性タンパク質分画を、 　ＳＯ５−ＰＡＧＥおよびイムノブロッティングにより分析した。これらの結果 は、乳酸菌において産生される結晶タンパク質のほとんどが、バチルス・スリン ジエンシスに存在するものと同様、不溶性であることを示した（図１４ｃ）。

発現細胞中に産生されるＣｒｙｌＡの量を測定するために、不溶性分画の中のＣ ｒｙｌＡタンパク質を、ブロモフェノールブルーを欠＜　ＳＤＳ・ＰＡＧＥ試料 緩衝液中で沸湯させることにより可溶化した。残っている不溶性物質をベレット 化した後、上清を連続的に希釈して、同体積の三つの異なる希釈度のものを「ス ロット・プロット」装置を用いてニトロセルロースフィルターに移した。標準量 の精製したＣｒｙｌＡ結晶タンパク質を対照として用いた。イムノブロッティン グの後、細胞抽出物中に存在するＣｒｙ　ＩＡタンパク質の量を、試料および標 準のスロットに検出されるバンドから肉眼的に比較した。可溶性分画およびアル カリとＳＤＳで抽出した不溶性分画から回収した全タンパク質量に基づき、本発 明者らは、Ｃｒｙ　［Ａタンパク質が誘導した細胞において、全タンパク質の３ ０％のレベルに蓄積されていると算定した。

３、誘導した株の生物活性および不溶性細胞抽出物ＣｒｙｌＡタンパク質が形成 された乳酸菌の細胞および（または）ＣｒｙＡ自体が生物活性をもつかどうかを （定性的な基準においてのみ）測定するためにマンジュ力・セクスタ（Ｍａｎｄ ｕｃａ　５ｅｘｔａＸスズメガ）の第−令の幼虫を用いて毒性分析を行なった。

約ｌＸｌ０”の誘導したＣｒｙＡ発現株発現び非発現性株の細菌を５０μｌの培 地に再浮遊し、ｌｃ＋ｎ角の人工飼料の表面に塗布した。発現法および対照株の 約１×１０°細胞から調製した不溶性の細胞抽出物も（５０μｌ）、別々の飼料 ブロックに塗布した。バチルス・スリンジエンシスから精製したＣｒｙｌＡ結晶 タンパク質をポジティブコントロールとして用いた。各バイアルに６匹の幼虫を 入れ、成長および死亡率を４日間にわたり追跡した。異なる形のＣｒｙｌＡタン パク質の入ったバイアル間の差を特表千７−５０４８１５　（１５） 次の表に示した。

３　１ＸＩＯ”発現細菌　４　死亡；２　成長せず４　１ＸＩＯ”非発現細菌　 ６　生育良好、健康・活発な幼生 これらの結果は最終的に、乳酸菌の不溶性抽出物と同様、Ｃｒｙ　ＩＡを発現し ている乳酸菌もスズメガの幼虫に対して毒性があることを示すＯ １、Ｂｏｊｏｖｉｃ、　ロ、、Ｇ、ＤＪｏｒｄＪｅｖｉｃ、ａｎｄ　Ｌ　Ｔｏｐ ｉｓｉｒｏｖｉｃ、１９９１．　Ｉｍｐｒｏｖｅｄｖｅｃｔｏｒ　ｆｏｒ　ｐｒ ｏｍｏｔｅｒ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｉｎ　１ａｃｔｏｃｏｃｃｉ、Ａｐｐｌ、 Ｅｎｖｉｒｏｎ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、５７　：　３８５−３８８゜２、　５ｉｂａｋｏｖ、Ｍ、 、Ｔ、Ｋｏｉｖｕｌａ、Ａ、ｖｏｎ　Ｗｒｉｇｈｔ、ａｎｄ　１．Ｐａ１ｖａ、 １９９１゜５ｅｃｒｅｔｉｏｎ　ｏｆ　ＴＥＭ　Ｂ−１ａｃｔａｍａｓｅ　ｗｉ ｔｈ　ｓｉｇｎａｌ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍ　ｔｈｅ 　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　ｏｆ　Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　１ａｃｔｉｓ　５ｕ ｂｓｐ、１ａｃｔｉｓ、Ａｐｐｌ。

Ｅｎｖｉｒｏｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、５７　：　３４１−３４８゜３、ｖａｎ 　ｄｅ　Ｇｕｃｈｔｅ、Ｍ、、Ｊ、Ｍ、Ｂ、Ｍ、ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｖａｓｓｅｎ 、Ｊ、Ｋｏｋ、ａｎｄ　Ｇ。

Ｖｅｎｅｍａ、１９８９．　Ｃｏｎ５ｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　１ａｃｔｏ ｃｏｃｃａｌ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ：ｅｘｐｒｅｓｓｔｏｎ　 ｏｆ　ｈｅｎ　ｅｇｇ　ｗｈｉｔｅ　ｌｙｓｏｚｙｍｅ　ｉｎ　Ｌａｃｔｏｃｏ ｃｃｕｓ　１ａｃｔｉｓｓｕｂｓｐ、　Ｉａｃｔｉｓ、Ａｐｐｌ、　Ｅｎｖｉｒ ｏｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　５５　：　２２４−２２８゜４、ｖａｎ　ｄｅ　Ｇ ｕｃｈｔａ、Ｍ、、Ｊ、Ｋｏｄｄｅ、Ｊ、Ｍ、Ｂ、Ｍ、ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｖｏｓ ｓｅｎ、Ｊ、Ｋｏｋ。

ａｎｄ　Ｇ、Ｖｅｎｅｍａ、１９９０．　ｌｌｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ　ｇｅｎ ｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓ　５ｕ ｂｓｐ、　１ａｃｔｉｓ、５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、５ｅｃｒｅｔｉｏｎ　ａｎｄ　 ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅＢａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　ｎ ｅｕｔｒａｌ　ｐｒｏｔｅａｓｅ、Ａｐｐｌ、Ｅｎｖｉｒｏｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉ ｏ１５６　：　２６０６−２６１１゜ ５、Ｐｉｌｌｉｄｇｅ、Ｃ，Ｊ、、ａｎｄ　Ｌ、Ｅ、Ｐｅａｒｃｅ、１９９１． 　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ａ　Ｂ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ　ｇｅｎ ｅ　ｆｒｏｍ　Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ　ｉｎ 　Ｌａｃｔｏ−ｃｏｃｃｕｓ　１ａｃｔｉｓ　５ｕｂｓｐ、Ｉａｃｔｉｓ、Ｊ、 Ａｐｐｌ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、７１　：　７８−８５゜６、Ｓｉｍｏｎｓ　Ａ 、Ｆ、！Ｊ、、ａｎｄ　Ｗ、Ｍ、ｄｅ　Ｖｏｓ、１９８８　ＤＮＡ　ｆｒａｇｍ ｅｎｔｓ、ｃｏｎｔａｉ−ｎｉｎｇ　ａ　１ａｃｔｉｓ　ａｃｉｄ　ｂａｃｔｅ ｒｉｕｍ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒ　ｒｅｇｉｏｎ　ｆｏｒｔｈ ｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｇｅｎｅｓ　ｆｏｒ　ｎｏｒｍａｌｌｙ　ｈ ｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ。

Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｐａｔｅｎｔ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｎｏ、８８２０１ ２０３．２７、　１ｗａｋｉ、Ｍ、、Ｎ、０ｋａｈａｓｈｉ、１．Ｔａｋａｈａ ｓｈｉ、Ｔ、Ｋａｎａｍｏｔｏ、Ｙ、Ｓｕｇｉｔａ＝Ｋｏｎｉｓｈｉ、Ｋ、Ａｉ ｂａｒａ　ａｎｄ　Ｔ、Ｋｏｇａ、１９９０．　０ｒａｉ　ｉｍｍｕｎｉｚａｔ ｉｏｎ　ｗｉｔｈｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　Ｉａ ｃｔｉｓ　ｃａｒｒｙｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎ ｓ　５ｕｒｆａｃｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｇｅｎｅ、Ｉｎｆｅｃ ｔ、　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ　５８　：　２９２９−２９３４゜ ８、　５ｔｕｄｉｅｒ、Ｆ、Ｗ、、Ａ、Ｈ，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、Ｊ、Ｊ、Ｄｕ ｎｎ、ａｎｄ　Ｊ、Ｗ、Ｄｕｂｅｎｄｏｒｆ。

１９９０、Ｕｓｅｄ　ｏｆ　Ｔ７　ＲＮＡ　ｐｏｌｙＩｌｌｌｅｒａｓｅ　ｔｏ 　ｄｉｒｅｃｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｃｌｏｎｅ■ ｇｅｎｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１８５　：　６０ −８９゜９、ｄｅ　Ｖｏｓ、Ｗ、Ｍ、１９８７．　Ｇｅｎｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ　 ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　１ａｃｔｉｃｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ 、ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｒｅｖｉｅｗｓ　４６　：　２８１−２９５ ゜１０、）ｌａｇｅｒ、Ｐ、Ｗ、、　ａｎｄ　Ｊ、Ｃ，Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ、 １９８５．　Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　ｉｎ　Ｂａ ｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ、　ｐｉ−２９，Ｉｎ　Ｄ、Ａ、Ｄｕｂｎａｕ 　（ｅｄ、）。

Ｔｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｂａｃｉｌｌｉ 、ｖｏｌ　Ｉｌ、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ。

ａｃｉｄ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｒｏｕｐ　Ｎ　ａｎｄ　ｇｒ ｏｕｐ　Ｄ　５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ、　Ｃｕｒｒ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　７　：　２４５−２５０゜１２、ｄｅ　Ｖｏｓ、Ｗ、Ｍ、 ａｎｄ　Ｇａ５５ｏｎ　Ｍ、Ｊ、１９８９．　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｅ ｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ　ｔｈｅ　Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　１ａｃｔｉｓ　ｇ ｅｎｅ　ｆｏｒ　、ｐｈｏｓｐｈｏ−ｂ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ（Ｉａｃ Ｇ）　ｉｎ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ａｎｄ　Ｌ、Ｉａｃｔｉｓ、 Ｊ、Ｇｅｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１３５：１８３３−１８４６゜ １３、Ｆｅ１ｔｅｌｓｏｎ、Ｐａｙｎｅ　＆　Ｋｉｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｔｈ ｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　：　Ｉｎ５ｅｃｔｓａｎｄ　Ｂｅｙｏｎｄ　；　Ｂｉ ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　ｔｏ　：　２７１−２７５　（１９９２）。

１４、Ｇａ５５ｓｏｎ、Ｍｌ、１９８３．　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１５４： 　１−９゜１５、Ｍａｅｄａ、Ｓ、、ａｎｄ　Ｍ、Ｊ、Ｇａ５５ｏｎ、１９８６ ．　Ｊ、Ｇｅｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１３２：３３１−３４０゜ １６、　Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｌｔｄ、、　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　ＬＩＫ。

＋７．　Ｈａｎａｈａｎ、Ｄ、　１９８３．　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、１６６： 　１−１９゜１８、Ｄａｎｖａｌｏｏ、Ｐ、、Ａ、Ｈ，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、Ｊ 、Ｊ、Ｄｕｎｎ、ａｎｄ　Ｆ、Ｗ、５ｔｕｄｉｅｒ。

１９８４、Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇ ｅｎｅ　ｆｏｒ　ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅＴ７　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、　 Ｐｒｏｃ、Ｎａ目、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ　８１　：　２０３５−２ ０３９゜１９、Ｓｔｍｏｎ、Ｄ、、ａｎｄ　Ａ、Ｃｈｏｐｉｎ、１９８８．　Ｃ ｏｎ５ｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｖｅｃｔｏｒｐｌａｓｍｉｄ　ｆａｍｉｌ ｙ　ａｎｄ　ｉｊｓ　ｕｓｅ　ｆｏｒ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　 ｉｎ　５４ｒｅｐｔｏ−ＣＯＣＣｕＳ　１ａｃｔｉｓ、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ　７ ０　：　５５９−５６６゜２０、　ｔ（ａｌｐｅｒｎ、Ｊ、Ｌ、、　Ｗ、Ｈ，Ｈ ａｂｉｇ、　Ｅ、Ａ、Ｎｅａｌｅ　ａｎｄ　Ｓ、５ｔｉｂｉｔｚ、１９９０゜Ｃ ｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　 ｆｒａｇｍｅｎｔ　Ｃｏｆ　ｔｅｔａｎｕｓｔｏｘｉｎ、Ｉｎｆｅｃｔ、ｆ＋＋ ＋＋ｎｕｎｉｔｙ　５８　：　１００４−１００９゜２１、Ｈｅ１１１ｇ　Ｊ、 Ｓ、、Ｋ、Ｌｅｃｈ　ａｎｄ　Ｒ，Ｂｒｅｎｊ、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｌｙｓｉｓ、５ ｅｃｔｉｏｎ１．７．４．　Ｉｎ、Ａｕ５ｕｂｅｌ　Ｆ、Ｍ、ｅｔ　ａｌ、（ｅ ｄｓ）　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅ−ｃｕｌａｒ　 Ｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｗｉｌｅｙ　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒ ｋ。

２２、Ｂｉｒｎｂｏｉｍ、１１．ｃ、、ａｎｄ　Ｄｏｌｙ、Ｊ、１９７９　Ｎｕ ｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ　７　：１５１３−１５１９゜ ２３、Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、、Ｅ、Ｆ、Ｆｒ１ｔｓｃｈ、ａｎｄ　Ｊ、Ｓａｍ ｂｒｏｏｋ、１９８２．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｙ　）Ｊａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｙ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｏｒ、Ｎ、Ｙ。

２４、　Ｅｃｋｅｒｔ、　Ａ、に、、　ａｎｄ　Ｔ、Ａ、Ｋｕｎｋｅｌ、　１９ ９０．　Ｈｉｇｈ　ｆｉｄｅｌｉｔｙ　ＤＮＡ５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｂｙ　ｔｈ ｅ　Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｎ ｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、１８　：　３８３９−３７４４゜２５、　Ｋ ｉｗａｋｉ、　Ｍ、、　Ｈ，Ｉｋｅｍｕｒａ、　Ｍ、Ｓｈｉｍｉｚｕ−Ｋａｄｏ ｌａ　ａｎｄ　Ａ、Ｈｉｒａｓｈｉｍａ。

１９８９、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ　ｏｆ　 ａ　ｃｅｌｌ　ｗａｌｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｐｒｏｊｅｉｎａｓｅ　ｇｅｎ ｅ　ｆｒｏｍ　５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　Ｉａｃｔｉｓ　ＮＣＤ０７６３　 Ｍｏ１．Ｍｔｃｒｏ−ｂｉｏｌ、　３　：　３５９−３６９゜２６、Ｄｏｗｅｒ 、　Ｗ、Ｊ、、Ｊ、Ｆ、Ｍｉｌｌｅｒ、　ａｎｄ　Ｒａｇｓｄａｌｅ、　Ｃ，Ｗ 、１９８８．　ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、１６　：　６１２７゜２７ 、　Ｌａｅｍｍｌｉ、υ、に、　１９７０．　Ｃｌｅａｖａｇｅ　ｏｆ　５ｔｒ ｕｃｔｕｒａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｄｕｒｉｎｇｔｈｅ　ａｓｓｅｍｂｌｙ　 ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｅａｄ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ　Ｔ４．　Ｎａｔ ｕｒｅ　２２７　：　６８０−６８５゜ ２８、　Ｂｕｒｎｅｔｔｅ、　Ｗ、Ｈ，１９８１，Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔ ｉｎｇ：　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃｔｒａｎｆｅｒ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅ ｉｎｓ　ｆｒｏｍ　ＳＤＳ　ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ　ｇｅｌｓ　ｔｏ　 ｕｎｍｏｄｉｆｉｅｄｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　ａｎｄ　ｒａｄｔｏｇｒ ａｐｈｔｃ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ａｎｄｒａｄ ｉｏｉｏｄｉｎａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１ １２　：　１９５−２０３゜２９、　Ａｓ５ｅｌｄｏｎｋ、Ｍ、ｖａｎ、、Ｇ、 Ｒｕｔｔｅｎ、Ｍ、Ｏｔｅｍａｎ、Ｒｊ、５ｉｅｚｅｎ、Ｗ、Ｍ。

ｄｅ　Ｖｏｓ、ａｎｄ　Ｇ　Ｓｉｍｏｎｓ、１９９０．　ＣＩｏｎｉｎｇ　ｏｆ 　ｕｓｐ４５．　ａ　ｇｅｎｅ　ｅｎｃｏｄｉｎｇａ　５ｅｃｒｅｔｅｄ　ｐｒ ｏｔｅｉｎ　ｆｒｏｍ　Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　１ａｃｔｔｓ　５ｕｂｓｐ、 ＩａｃｔｉｓＭＧ１３６３．　Ｇｅｎｅ　９５　：　１５５−１６０゜３０、　 Ｇａ５５ｏｎ、　Ｍ、１．、　ａｎｄ　Ｐ、Ｈ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ、　１９８５ ．　Ｈｉｇｈ　ｃｏｐｙ　ｎｕｍｂｅｒｐｌａｓｍｉｄ　ｖｅｃｔｏｒｓ　ｆｏ ｒ　ｕｓｅ　ｉｎ　１ａｃｔｉｃ　５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ、ＦＥＭＳ　Ｍｉ ｃｒｏ−ｂｉｏｌ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　３０　：　１９３−１９６゜３１、　Ｖａ ｎ　Ｒｏｏｉｊｅｎ、　Ｒ，Ｊ、、　ａｎｄ　Ｗ、Ｍ、ｄｅ　Ｖｏｓ、１９９０ 　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ。

ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｆｏｎａｌ　ａｎｙｌｙｓｉｓ、ａｎｄ　ｎｕｃｌｅｏｔ ｔｄｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ＩａｃＲ，ａｇｅｎｅ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　 ｔｈｅ　ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ　ｏｆ　ｔｈｅ　１ａｃｔｏｓｅ　ｐｈｏｐｈｏｔ ｒｎｓｆｅｒａｓｅｓｙｓｔｅｍ　ｏｆ　Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　１ａｃｔｉ ｓ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６５　：　１８４９９−１８５０３゜３２、Ｖ ａｎ　Ｒｏｏｉｊｅｎ、Ｒ，Ｊ、、Ｓ　ｖａｎ　Ｓｃｈａｌｋｗｔｊｋ、ａｎｄ 　Ｗ、Ｍ、ｄｅ　Ｖｏｓ、１９９１゜Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、ｃ ｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ、　ａｎｄ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｅｑｕ ｅｎｃｅｏｆ　ｔｈｅ　ｔａｇａｔｏｓｅ　６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｐａｔｈ ｗａｙ　ｇｅｎｅ　ｃｌｕｓｔｅｒ　ｏｆ　ｔｈｅ　１ａｃ−Ｌｏｓｅ　ｏｐｅ ｒｏｎ　ｏｆ　Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　Ｉａｃｔｉｓ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ ｍ、２６６　：　７１７６−７１８１゜ ３３、Ｋｏｋ、Ｊ、（１９９１）　Ｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｅ ｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　５ｔｒｅ−ｐ［ｏｃｏｃｃｉ、Ｌａｃｔｏ ｃｏｃｃｉ、ａｎｄ　Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ、Ｄｕｎｎｙ、Ｇ、Ｍ、、Ｃ１ｅ ａｒｙ。

Ｐ、Ｐ、、＆　ＭｃＫａｙ　ＬＬ　（ｅｄｓ）　Ａｍｅｒｉｃａｎ　５ｏｃｉｅ ｔｙ　ｆｏｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ。

３４、　Ｋｉｗａｋｔ、　Ｍ、、　ｔ（、Ｉｋｅｍｕｒａ、　Ｍ、Ｓｈｉｍｉｚ ｕ−Ｋａｄｏｔａ　ａｎｄ　Ａ、旧ｒａｓｈｉｍａ。

＋９８９．　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　 ａ　ｃｅｌｌ　Ｗａｌｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　ｇｅｎ ｅ　ｆｒｏｍ　５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　Ｉａｃｔｉｓ　ＮＣＤ０７６３． 　Ｍｏ１．Ｍｉｃｒｏ−ｂｉｏｌ、３　：　３５９−３６９゜ ３５、Ｋｎｏｗｌｅｓ、Ｂ、Ｈ，、ａｎｄ　Ｄ、Ｊ、Ｅｌｌａｒ、＋９８７　Ｃ ｏｌｌｏＣｏｌｌｏｉｄ−ｏｓ　１ｙｓｉｓｉｓ　ａ　ｇｅｎｅｒａｌ　ｆｅａ ｔｕｒｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓＩＩＩｏｆ　ａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　 Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　ｄ−ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ　ｗｉ ｔｈ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　１ｎｓｅｃｔ　ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓＢｉｏ ｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、９２４．　５０９−−５１８゜３６、　 Ｂａｒｔｏｎ　Ｋ、Ａ、、　Ｈ，Ｒ，Ｗｈｉｔｅｌｅｙ、　ａｎｄ　Ｎ、−３， Ｙａｎｇ、　１９８７．　Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｔｎｇｉｅｎｓｉｓ　ｄ− ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ｎｉ ｃｏｔｉａｎａｊａｂａｃｕｍ　ｐｒｏｖｉｄｅｓ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　＋ ｏｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ　１ｎｓｅｃｔｓ、　ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ、 、８５．　：　１１０３−１１０９゜３７、Ｆｉｓｃｈｏｆｆ　ｅｔ　ａｌ、、 １９８７．　Ｉｎ５ｅｃｔ　ｔｏｌｅｒａｎｔ　ｊｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｔｏｍ ａｔｏｅｐｌａｎｔｓ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ、、５：８０７−８１３３８、Ｖａｅ ｃｋ　ｅｔ　ａｌ、、１９８７．　Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｌａｎｔｓ　ｐｒ ｏｔｅｃｔｅｄ　ｆｒｏｍ　１ｎｓｅｃｔａｔｔａｃｋ、Ｎａｔｕｒｅ、３２８ 　：　３３−３７゜３９、Ｏｂｕｋｏｗｉｃｚ　ｅｔ　ａｌ、、１９Ｂ６．　Ｉ ｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｄｅｌｔａ　ｅｎｄｏｔｏｘｉｎｇｅｎ ｅ　ｇｅｎｅ　ｏｆ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　１ｎｔ ｏ　ｔｈｅ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　ｏｆｒｏｏｔ　ｃｏｌｏｎｉｚｉｎｇ　５ ｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｄｓ　ｕｓｉｎｇ　Ｔｎ５．　Ｇｅ ｎｅ　４５　：３２７−３３１゜ ４０、　５ｃｈｎｅｐｆ、Ｅ、）１．、ｌＬｃ、Ｗｏｎｇ、ａｎｄ　Ｈ，Ｒ，Ｗ ｈｉｔｅｌｅｙ　１９８５．　ｔｈｅ　ａｍｉｎ。

ａｃｉｄ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｒ　ａ　ｃｒｙｓｔａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｆ ｒｏｒｎ　Ｂａｃｔｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓｄｅｄｕｃｅｄ　ｆ ｒｏｒｎ　ｔｈｅ　ＤＮＡ　ｂａｓｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　 Ｃｈｅｍ、　２６０　：　６２６４−６Q７２゜ ４１、　５ｃｈｎｅｐｆ、Ｅ、、ａｎｄ　Ｈ，Ｒ，Ｗｈｉｊｅｌｅｙ、１９８１ ．　Ｄｅｌｉｎｅａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｔｏｘｉｎ−ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ｓｅｇ ｍｅｎｔ　ｏｆ　ａ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　ｃｒｙ ｓｔａｌｐｒｏｔｅｉｎ　ｇｅｎｅ、ＰＮＡＳ　７８　：　２８９３−２８９７ ゜配列の列挙 （１）一般情報： （ｉ）出願者ニ ー（Ａ）名称：　Ｌｙｎｘｖａｌｅ　１１ｍ１ｔｅｄ（Ｂ）通り：　Ｔｈｅ　Ｏ ｌｄ　５ｃｈｏｏｌｓ（Ｃ）町：　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ （Ｄ）州：　Ｃａｍｂｓ （Ｅ）国：　Ｇｒｅａｔ　Ｂｒ１ｔａｉｎ（Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）　：　ＣＢ ２１Ｔｓ（Ａ）名称：’ＬＨＰＡＧＥ、　Ｒｉｃｈａｒｄ　Ｗｉｌｌｉａｍ　Ｆ ａｌｌａ（Ｂ）通り：　Ｇｏｎｖｉｌｌｅ　＆　Ｃａ１ｕｓ　ＣｏｌｌｅＣｏ１ １ｅ町：　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ （Ｄ）州：　Ｃａｍｂｓ （Ｅ）国：ＧＢ （Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）　：　ＣＢ２１ＴＡ（Ａ）名称：　ＷＥＬＬＳ、　Ｊ ｅｒｅｍｙ　Ｍａｒｋ（Ｂ）通り：　７　Ｃｏｒｎｒｒｅｙ　Ｃｏｕｒｔ、　Ｃ ｈｅｒｒｙ　Ｈｉｎｔｏｎ（Ｃ）町：　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ （Ｄ）州：　Ｃａｍｂｓ （Ｅ）国：ＧＢ （Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）　＋　ＣＢＩ　４ＹＪ（Ａ）名称：　ＷＩＬＳＯＮ、 　Ｐｅｔｅｒ　Ｗｉｌｌｉａｍ（Ｂ）通り＋　３３３Ａ　Ｈｉｓｔｏｎ　Ｒｏａ ｄ（Ｃ）町：　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ （Ｄ）州：　Ｃａｍｂｓ （Ｅ）国：ＧＢ （Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）　：　ＣＤ４３ＮＦ（Ａ）名称：　ＤＥ　ＶＩＬＬＡ ＲＥＡＬ、　Ｐａｍｅｌａ　Ｎｏｒｔｏｎ（Ｂ）通り：　１５　Ｊｏｐｌｉｎｇ 　Ｗａｙ、　）ｌａｕｘｔｏｎ（Ｃ）町：　Ｃａ＋ｎｂｒｉｄｇｅ （Ｄ）州：　Ｃａｍｂｓ （Ｅ）国：ＧＢ （Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）　：　ＣＢ２５１１Ｙ（ｉｉ）発明の名称：乳酸菌に おける異種遺伝子の発現およびその発現産物 （ｉｉ）配列の数＋１６ （ｉｖ　）コンピューター読取りフオーム：（Ａ）媒体タイプ：　Ｆｌｏｐｐｙ 　ｄｉｓｋ（Ｂ）コンピューター：　ＩＢＭ　ＰＣｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ（Ｃ） 操作システム：　ＰＣ−ＤＯ３／ＩＪｓ−ＤＥ３（Ｄ）ソフトウェア：　Ｐａｔ ｅｎｔ　Ｉｎ　Ｒｅ１ｅａｓｅ　＃１．０．　Ｖｅｒｓｉｏｎ＃１．２５　（Ｅ ＰＯ） （Ｖ）現出願データ： 出願番号：　ＰＣＴ／ＧＢ９３１００４．２５（ｖｌ）先願データ： （Ａ）出願番号：　ＧＢ　９２０４２３７．３（Ｂ）出願臼：　２７−　ＦＥＢ −１９９２（ｖｉ　）先願データ： （Ａ）出願番号：　ＧＢ　９２１９８９０．２（Ｂ）出願臼：　２１−５ＥＰ− １９９２（２）配列番号ｌについての情報： （ｉ）配列の特徴二 （Ａ）長さ１８９個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数二二本鎖 （Ｄ）トポロジー：環状 （ｉｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｘ　）特徴： （Ａ）名称／キー：　ＣＤ５ （Ｂ）位置：８１．．８９ （ｘｉ）配列：配列番号ｌ： ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴ　ＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ　ＡＧＡＣＣＡＣＡＡＣＧＧＴＴ ＴＣＣＣＴＣＴＡＧＡＡＡＴＡＡＴ　５０（２）配列番号２についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ、１５個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数二二本鎖 （Ｄ）トポロジー二環状 （ｉｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｘ）特徴・ （Ａ）名称／キー：　ＣＤ５ （Ｂ）位置：１．．１５ （ｘｉ）配列：配列番号２： （２）配列番号３についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：５個のアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：タンパク質 （ｘｉ）配列：配列番号３： （２）配列番号４についての情報； （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：４５個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数二二本鎖 （Ｄ）トポロジー二環状 （ｉｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｉ）配列：配列番号４： ＧＣＡＴＡＡＣＣＣＣＴＴＧＧＧＧＣＣＴＣＴＡＡＡＣＧＧＧＴＣＴＴＧＡＧＧ ＧＧＴＴ　ＴＴＴＴＧ　４５（２）配列番号５についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ二８９個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数二二本鎖 （Ｄ）トポロジー二環状 （ｉｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／キー：　ＣＤ５ （Ｂ）位置：８１．．８９ （Ｘｌ）配列：配列番号５： ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴ　ＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ　ＡＧＡＣＣＡＣＡＡＣＧＧＴＴ ＴＣＣＣＴＣＴＡＧＡＡＡＴＡＡＴ　５０（２）配列番号６についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ、１５個の塩基対 （Ｂ）型；核酸 （Ｃ）鎖の数二二本鎖 （Ｄ）トポロジー二環状 （ｉｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｘ　）特徴： （Ａ）名称／キー：　ＣＤ５ （Ｂ）位置＋１．．１５ （ｘｉ）配列：配列番号６： （２）配列番号７についての情報； （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ１５個のアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー、直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：タンパク質 （ｘｉ）配列・配列番号７： （２）配列番号８についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝９０個の塩基対 （Ｂ）型；核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー二環状 （ｉｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｘ　）特徴； （Ａ）名称／キー：　ＣＤ５ （Ｂ）位置：８２．．９０ （ｘｉ）配列：配列番号８： ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴ　ＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ　ＡＧＡＣＣＡＣＡＡＣＧＧＴＴ ＴＣＣＣＴＣＴＡＧＡＧＣＴＴＣＡ　５（（２）配列番号９についての情報： （ｉ）配列の特徴： １．５　（Ａ）長さ＝１５個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数二二本鎖 （Ｄ）トポロジー：環状 （ｉｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／キー：　ＣＤ５ （Ｂ）位置：１．．１５ （ｘｉ）配列：配列番号９： （２）配列番号１０についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝５個のアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ　）配列の種類：タンパク質 （ｘｉ）配列：配列番号１０゜ （２）配列番号１１についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ１３９個のアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー、直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ペプチド （ｘｉ）配列：配列番号１１： ｓ　ｌｌｅ ｙ　Ｔｈｒ （２）配列番号１２についての情報・ （ｉ）配列の特＠： （Ａ）長さ二８６個のアミノ酸 （Ｂ）型；アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｊ）配列の種類：タンパク質 （ｘｌ）配列：配列番号１２： ｌ　Ｖａｌ ｅ　Ｖａｌ ｎ　Ｔｙｒ （２）配列番号１３についての情報； （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝４８個の塩基対 ＣＢ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：　ＤＮＡプライマー（ｘｉ）配列：配列番号１３： ＧＡＴＣＧＧＣＣＡＡ　ＧＣＴＴＣＡＴＡＴＧ　ＡＡＡＣＴＴＴＴＧＧ　ＡＡＡ ＧＴＧＧＡＧＧ　ＡＴＡＴＴＧＧＡ　４８（２）配列番号１４についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ１４８個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：　ＤＮＡプライマー（■）アンチセンス：　ＹＥＳ （ｘｉ）配列：配列番号１４： ＣＣＧＡＣＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＣＧＣＣＧＣＣＴＴＴＧＣＴ　ＴＧＧＡＴ ＴＴＣＧＣＣＧＡＣＴＧＧＣ４Ｂ（２）配列番号１５についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ２２８個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：　ＤＮＡプライマー（ｘｉ）配列：配列番号１５： ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＧ　ＡＣＡＡＡＣＣＡＴＡ　ＣＡＴＴＡＧＡＡ（２）配列番 号１６についての情報＝ （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２８個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：　ＤＮＡプライマー（ｘｉ）配列：配列番号１６： ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＡ　ＡＡＴＧＣＴＡＣＧＴ　ＡＧＡＡＧＴＡＣＭＣ５：マル チブルクローニングサイトＡ　３ （Ａ）　細胞抽出物　上清液 （Ｂ）　細胞抽出物　上清液 １’２Ｍ　大きざ Ｄ Ｍｌ　２　３　４ Ｌ２；シグナル分泌リーダー２ Ｔ；ターミネータ− “ローＦＣｉ破傷風毒素フラグメントＣ；ＲＮＡボリメリンぜに特異的なプロモ ーターＰＣＲフラグメントＢ。

Ａ　３ 国際調査報告 フロントページの続き （７２）発明者　ウェルス、ジェレミー　マークイギリス国、ケシブリッジ　シ ービー１４ワイジェイ、チェリー　ヒントン、コンフリー　コート　７ （７２）発明者　ウィルソン、ピータ−ウィリアムイギリス国、ケンブリッジ　 シービー４３エヌエブ、ヒストン　ロード　３３３ニー（７２）発明者　デ　ビ ラリール、パメラ　ツートンイギリス国、ケンブリッジ　シービー２５エイチワ イ、ホークストン、ジョブリング　ウェイ　１５

Claims (38)

【特許請求の範囲】
1. １．乳酸菌宿主において効果的な誘発性プロモーターの制御下に配置されたＴ７ 又はＴ７様ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子及び発現されるべき所望するポリペプチド のためのコード配列の上流の前記ポリメラーゼに対して特異的なプロモーターを 含んで成る組換えＤＮＡにより形質転換された乳酸菌宿主生物であって、ここで 前記プロモーターが前記ポリメラーゼの発現の結果として選択的に前記コード配 列の転写を指図することを特徴とする乳酸菌。
2. ２．前記宿主がラクトコーカスラクチス株である請求の範囲第１項記載の形質転 換された乳酸菌。
3. ３．前記ポリメラーゼ遺伝子がＬ．ラクチスに由来する誘発性プロモーターの制 御下に存在する請求の範囲第２項記載の形質転換された乳酸菌。
4. ４．前記コードＤＮＡの発現に基づいて、前記細胞内に可溶性ポリペプチドを生 成する請求の範囲第１〜３のいづれか１項記載の形質転換された乳酸菌。
5. ５．前記コードＤＮＡの発現に基づいて、前記細胞内に生物学的に活性的なポリ ペプチドを生成する請求の範囲第１〜４のいづれか１項記載の形質転換された乳 酸菌。
6. ６．前記ポリペプチドが宿主細胞からの前記下流のポリペプチド発現生成物の分 泌をもたらすことができる分泌シグナル配列を含んで成る請求の範囲第１〜５の いづれか１項記載の形質転換された乳酸菌。
7. ７．前記分泌シグナル配列が前記下流のポリペプチド発現生成物に通常関与しな い配列である請求の範囲第６項記載の形質転換された乳酸菌。
8. ８．前記シグナル配列がＬ．ラクチスに対して内在性のタンパク質に由来する請 求の範囲第６又は７項記載の形質転換された乳酸菌。
9. ９．前記発現されたポリペプチドが免疫原的に活性的なタンパク質を含んで成る 請求の範囲第１〜８のいづれか１項記載の形質転換された乳酸菌。
10. １０．前記免疫原性タンパク質が、免疫応答を高めることが所望されるエピトー プを担持するポリペプチドに融合される請求の範囲第９項記載の形質転換された 乳酸菌。
11. １１．前記発現されたポリペプチドが病原体に由来する免疫原を含んで成る請求 の範囲第１〜１０のいづれか１項記載の形質転換された乳酸菌。
12. １２．それと共に免疫化された対象に免疫応答を誘発することに使用するための 請求の範囲第１１項記載の形質転換された乳酸菌。
13. １３．前記ポリペプチドが破傷風トキシンＣフラグメント（ＴＴＦＣ）を含んで 成る請求の範囲第１〜１２のいづれか１項記載の形質転換された乳酸菌。
14. １４．前記ポリペプチドがＨＩＶのＶ３ループを含んで成る請求の範囲第１〜１ ３のいづれか１項記載の形質転換された乳酸菌。
15. １５．前記ポリペプチドがＢ．ツリンジエンシスに由来するトキシンを含んで成 る請求の範囲第１〜１２のいづれか１項記載の形質転換された乳酸菌。
16. １６．請求の範囲第１〜１６のいづれか１項記載の乳酸菌宿主生成においてコー ドＤＮＡを発現することを含んで成る方法。
17. １７．前記宿主生物がＬ・ラクチス株である請求の範囲第１６項記載の方法。
18. １８．可溶性ポリペプチドが細胞内に生成される請求の範囲第１６又は１７項記 載の方法。
19. １９．生物学的に活性的なポリペプチドが前記細胞内に生成される請求の範囲第 １６，１７又は１８項記載の方法。
20. ２０．前記ポリペプチドが細胞抽出物から回収される請求の範囲第１８又は１９ 項記載の方法。
21. ２１．前記ポリペプチドが分泌シグナル配列により発現され、それによって前記 ポリペプチドが宿主細胞から分泌される請求の範囲第１６，１７又は１８項記載 の方法。
22. ２２．前記宿主生物がＬ．ラクチス株であり、そして前記分泌シグナル配列がＬ ．ラクチスに由来する請求の範囲第２１項記載の方法。
23. ２３．前記分泌の速度が発現の速度よりも実質的に少なくとも早く、それによっ て前記ポリペプチドが前記宿主細胞に実質的な蓄積を伴わないで生成される請求 の範囲第２１又は２２項記載の方法。
24. ２４．前記ポリペプチドがＴＴＦＣを含んで成る請求の範囲第１６〜２３のいづ れか１項記載の方法。
25. ２５．可溶性異種ポリペプチドを含む、請求の範囲第１８項記載の方法より得ら れるような乳酸菌株。
26. ２６．生物学的に活性的な形で異種ポリペプチドを含む、請求の範囲第１９項記 載の方法により得られるような乳酸菌株。
27. ２７．前記異種ポリペプチドが免疫原的に活性的なタンパク質を含んで成る請求 の範囲第２５又は２６項記載の乳酸菌株。
28. ２８．前記免疫原性タンパク質が、免疫応答を高めることが所望されるエピトー プを担持するポリペプチドに融合される請求の範囲第２７項記載の乳酸菌株。
29. ２９．前記異種ポリペプチドが病原体に由来する免疫原を含んで成る請求の範囲 第２５〜２８のいづれか１項記載の乳酸菌株。
30. ３０．前記異種ポリペプチドがＴＴＦＣを含んで成る請求の範囲第２９項記載の 乳酸菌株。
31. ３１．前記異種ポリペプチドがＨＩＶのＶ３ループを含んで成る請求の範囲第２ ９又は３０項記載の乳酸菌株。
32. ３２．前記異種ポリペプチドがＢ．ツリンジエンシスに由来するトキシンを含ん で成る請求の範囲第２６〜２８のいづれか１項記載の乳酸菌株。
33. ３３．前記乳酸菌株の細胞により接種された対象に免疫応答を誘発することに使 用するための請求の範囲第２９〜３２のいづれか１項記載の乳酸菌株。
34. ３４．粘膜投与される場合に免疫応答を誘発することに使用するための請求の範 囲第３３項記載の乳酸菌株。
35. ３５．免疫原に対する可溶性１ｇＡの生成を包含する粘膜免疫応答を誘発するこ とに使用するための請求の範囲第３４項記載の乳酸菌株。
36. ３６．非経口投与される場合に免疫応答を誘発することに使用するための請求の 範囲第３３項記載の乳酸菌株。
37. ３７．Ｂ．ツリンジエンシス毒素が特異的である生物により感染された対象への 投与に使用するための請求の範囲第３２項記載の乳酸菌株。
38. ３８．Ｂ．ツリンジエンシス毒素が特異的である、ヒト又は動物以外の生物の殺 虫処理への請求の範囲第３２項記載の乳酸菌株の使用。