KR101893613B1 - 앙상블 결정 부분 표본 순위화 - Google Patents

Abstract

다른 측면들 중에서도, 여기서는 생체 입자를 포함하는 부유액으로부터 부분 표본의 순위를 매기기 위한 방법과 장치가 제공된다. 특정한 실시형태에서, 생체 입자는 세포, 세포 기관, 단백질, DNA, 생물학적 기원의 잔해, 생물학적 복합물로 코팅된 마이크로비드(Microbead) 혹은 바이러스 입자일 수 있다. 이와 같이, 여기에 제공되는 본 방법과 장치는 질병의 진단, 예상 혹은 치료를 위해, 순회하는 암세포, 태아 세포 및 체액에 존재하는 다른 희소 세포와 같은 희소 세포를 수량화하는데 이용 가능하다.

Description

앙상블 결정 부분 표본 순위화 {ENSEMBLE-DECISION ALIQUOT RANKING}

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2009년 4월 13일자로 제출된 미국 예비출원 제61/168,892호의 이익을 주장하며, 모든 목적을 위해 여기에는 그 전부가 참조로 명확하게 편입되어 있다.

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체액은 액체 상태인 생체 입자의 복합적인 부유물이다. 예컨대, 혈액은 혈장과 세포(적혈구, 백혈구, 혈소판)를 포함하며, 세포는 혈액의 약 55%를 차지한다. 혈장은 대부분 물이고, 단백질, 이온, 비타민, 효소, 호르몬 및 기타의 화학 물질을 인체 내 세포로 전달한다.

적혈구는 약 6 내지 8㎛ 크기이며, 세포에 산소를 제공하는 기능을 한다. 백혈구는 직경이 약 10 내지 13㎛이며, 외부의 바이러스와 박테리아에 대항하여 싸움으로써 면역 체계의 일부로서 인체를 질병으로부터 방어한다. 혈소판은 가장 작은 세포로 1.5 내지 3㎛이며, 혈전을 형성함으로써 피가 흐르는 것을 멈추게 한다.

여러 기관들(예컨대, 폐)과 접촉하는 다른 체액은 물론이고, 침, 눈물, 뇌척수와 같이 혈액에 부가하는 유체는 세포와 생입자(Bioparticle)의 혼합물을 포함한다. 특정한 체액(예컨대, 혈액)에 존재하는 세포와 생입자의 유형 및 양은 생물체의 건강에 관한 정보를, 감염된 사람의 경우에는 질병의 진단과 예후에 관한 정보를 나타낸다.

일부 세포나 생입자는 혈액 세포의 표준 농도에 비해 희소한 양이 존재한다. 이러한 희소성에도 불구하고, 이들 세포나 생입자는 체내에서 발생하여 사람의 건강 상태를 바꾸는 중요한 이벤트에 복잡하게 얽혀있을 수 있다. 보통 이러한 세포들을 "희소 세포"라 한다.

예컨대, 원발성 종양으로부터의 암세포의 파종(Dissemination)은 암 환자의 재발율과 생존율을 지배하는 중요한 인자이다. 암세포는 통제되지 않은 상태로 성장하고 서로에게 달라붙는 능력을 상실하기 때문에, 이는 혈액과 림프 순환에 들어가서 인체 곳곳에서 순환할 수 있다. 통상적으로 이러한 세포는, 단단한 종양의 직접적인 조직 검사에 의해 얻어지는 샘플에 대비하여, 이러한 세포의 이동적 성질을 지칭하기 위해 순환 종양 세포(Circulating Tumor Cell, CTC), 파종 종양 세포(Disseminated Tumor Cell, DTC), 순환 암세포(Circulating Cancer Cell, CCC), 순환 상피 세포(Circulating Epithelial Cell, CEC), 잠재 종양 세포(Occult Tumor Cell, OTC) 혹은 다른 유사한 대체어로 부른다. CTC는 전립선, 난소, 유방, 위, 직장, 신장, 폐, 췌장 및 기타 등 모든 주요 암으로 고통받는 환자의 혈액에서 검출되어 왔다.

이러한 방식으로, 체액 내에 존재하는 CTC를 세는 테스트는 암 환자에 대한 예후를 제공하는데 도움을 주도록 발달해 왔다. 또한, "CTC 테스트"는 특정한 치료(예컨대, 방사선 치료나 화학 요법) 계획에 대한 환자의 반응을 감시하기 위해서 사용 가능하다. CTC 테스트의 결과에 기초하여, 암 환자는 예컨대 컴퓨터 단층 촬영(Computed Tomography, CT)이나 PET(Positron Emission Tomography, 양전자 방사 단층 촬영) 스캔 등 종종 건강 보험에 의해 보장되지 않는 부가적이고 불필요하면서 고가인 진단 테스트와 치료를 최소화함으로써 엄청난 비용을 피하거나, 효과가 없는 약물 치료를 줄이는 것이 가능하다.

그러나, CTC는 말초 혈액에 극히 작은 농도로 존재하고, 10⁶ 내지 10⁷개의 단핵 세포당 1개 종양 세포의 차수인 것으로 평가되며, 이는 말초 혈액 0.5ml 내지 5ml당 1개의 종양 세포에 대응한다. 이와 같이 낮은 농도에서, 추산하여 1억개 단핵 세포를 갖는 샘플은 99.995%의 정확도로 적어도 하나의 CTC를 검출하도록 확인되어야 한다. 보통 초당 800개 세포의 속도로 스캐닝하는 자동 디지털 현미경 검사법(Automatic Digital Microscopy, ADM)과 같은 종래기술을 이용하는 경우, 그러한 크기의 샘플을 완료하는데 18시간이 소요될 것이며, 이는 임상적인 용도에 있어서 금전적으로 그리고 시간적으로 비현실적이다.

예컨대, 종래의 유동 세포 계수법(Flow Cytometry)이 혈액 샘플 내 CTC의 존재나 양을 결정하기 위하여 채택될 수 있다. 그러나, 유동 세포 계수법은 세포가 열을 지어 선형으로 조직되어 있을 것을 요구하고, 현존하는 기술을 이용해서 2개 세포의 동시 검출을 정확하게 해석할 수 없기 때문에 각 세포를 하나씩 검출한다. 유동 세포 계수법에서는, 어떤 주어진 시간에서 하나의 입자에만 조사되도록 레이저 빔을 초점 맞춘다. 예컨대, 만약 하나의 비형광 세포가 유동 세포 계수법으로 검출 가능하도록 구성된 형광 세포와 동시에 검출 체적을 이동한다면, 유동 세포 계수기에 대해서는 비가시적인 비형광 세포가 형광 세포와 동일한 궤적으로 향하게 될 것이다. 유동 세포 계수법의 오류를 피하기 위해, 세포 부유물은 보통 희석되거나 느려져서, 검출 체적 내 2개 세포의 중첩을 피하도록 세포들 간에 충분한 거리를 허용한다. 현재의 기술 상태에서 유동 세포 계수법은 초당 100,000개의 대상체라는 상한을 가지고 있다.

이와 같이, 유동 세포 계수법은 희소 세포를 검출하거나 회복하기에 적합하지 않다. 세포를 (연속적으로) 하나씩 검출하고 모든 세포의 궤적에 대한 결정을 내리는 것은 다수의 세포를 분석하는 경우 너무 시간 소모적이다. 예컨대, 10 밀리리터의 혈액은 대략적으로 100억개의 세포를 포함하고 있으므로, 현재의 기술 상태에서 유동 세포 계수법의 최대 분류 속도인 초당 100,000개 세포인 경우 10mL의 내용물을 완전하게 분류하기 위해서는 100,000초, 즉 28시간이 소요될 것이다. 희소 세포의 경우, 통계적으로 중요한 수의 희소 세포를 수집하기 위해서는 종종 7 내지 15mL의 혈액이 요구되며, 희소 세포를 회복하기 위하여 세포 유동 계수법을 이용하는 것은 임상적 재원의 비실용적인 소모이고, 매우 높은 진단 비용을 유발할 수 있다.

이처럼 간단하고 비용/시간 효율적인 기술이 유체 샘플 내 희소 입자와 세포의 검출 및 계량화를 위하여 필요하다. 본 발명은 유체 샘플 내 희소 입자의 검출을 위한 방법 및 장치를 제공함으로써 이들 및 기타의 요구를 만족한다.

다른 측면들 중에서도, 본 발명은 부분 표본을 순위 매김으로써 원하는 생입자의 검출 및/또는 계량화를 위하여 대량 체적의 유체를 신속하게 스캔하는 방법 및 장치를 제공한다. 일 측면에서, 앙상블-결정 부분 표본 순위화(Ensemble-Decision Aliquot Ranking, "eDAR")라고 하는 채택된 개념은 생체액 내 희소 세포를 검출하는데 특히 유용하다.

일 측면에서, 본 발명은 유체 샘플 내 희소 입자를 검출하기 위한 방법을 제공하며, 본 방법은 상기 유체 샘플의 부분 표본에서 희소 입자의 존재나 부재를 검출하는 단계; 상기 희소 입자의 존재나 부재에 기초하여 상기 부분 표본에 대하여 값을 할당하는 단계; 및 상기 할당된 값에 기초하여 상기 부분 표본의 흐름이나 집합을 안내하는(Directing) 단계를 포함한다.

제 2 실시형태에서, 본 발명은 생체액 내 희소 입자의 존재와 연계된 조건에 대하여 대상체에 진단이나 예상(Prognosis, 예후)을 제공하기 위한 방법을 제공하며, 본 방법은 상기 생체액의 부분 표본에서 희소 입자의 존재나 부재를 검출하는 단계; 상기 희소 입자의 존재나 부재에 기초하여 상기 부분 표본에 대하여 값을 할당하는 단계; 및 상기 할당된 값에 기초하여 대상체에 대한 진단이나 예상을 제공하는 단계를 포함한다.

제 3 측면에서, 본 발명은 유체 샘플 내에서 희소 입자를 검출하기 위한 장치를 제공하며, 본 장치는 적어도 하나의 제 1 입력 채널; 적어도 2개의 출구 채널; 상기 유체 샘플의 부분 표본 내 하나 이상의 희소 입자를 검출할 수 있는 적어도 하나의 검출기; 상기 부분 표본의 흐름을 안내하기 위한 메커니즘; 및 상기 부분 표본 내 상기 희소 입자의 존재, 부재, 실체, 구성 혹은 양에 기초하여 상기 부분 표본에 값을 할당할 수 있는 컴퓨터를 구비하고, 여기서 상기 컴퓨터는 상기 부분 표본의 흐름을 안내하기 위한 상기 메커니즘 및 상기 검출기와 통신한다.

다른 측면들 중에서도, 본 발명은 부분 표본을 순위 매김으로써 원하는 생입자의 검출 및/또는 계량화를 위하여 대량 체적의 유체를 신속하게 스캔하는 방법 및 장치를 제공한다. 일 측면에서, 앙상블-결정 부분 표본 순위화라고 하는 채택된 개념은 생체액 내 희소 세포를 검출하는데 특히 유용하다.

도 1은 부분 표본의 방향과 부분 표본 내 복수 입자의 동시적인 검출을 나타낸다.
도 2는 eDAR에서 사용되는 것과 같은 신호 대 잡음 비를 개선하기 위한 개구를 갖는 마스크를 나타낸다.
도 3은 eDAR에 사용되는 것과 같은 신호 대 잡음 비를 개선하기 위하여 가까이 이격된 개구들을 갖는 마스크를 나타낸다.
도 4는 하나의 흐름 채널, 2개의 레이저, 그리고 3개의 검출기로 구성된 eDAR 장치를 나타낸다.
도 5는 3개의 흐름 채널, 하나의 레이저, 그리고 하나의 검출기로 구성된 eDAR 장치를 나타낸다.
도 6은 3개의 흐름 채널, 하나의 레이저, 그리고 3개의 검출기로 구성된 eDAR 장치를 나타낸다.
도 7은 5개의 흐름 채널, 하나의 레이저, 그리고 3개의 검출기로 구성된 eDAR 장치를 나타낸다.
도 8은 eDAR(상부 패널) 및 상업적인 기구(Veridex의 CellSearch, 하부 패널)를 이용한 혈액으로부터의 순환 종양 세포(CTC) 수를 비교한 것을 나타낸다.
도 9a 내지 도 9c는 다양한 조명하에서 eDAR을 이용하여 환자 혈액으로부터 얻은 암세포의 광학적인 이미지를 나타낸다(화살표는 CTC를 표시함). 도 9a는 적혈구 가운데에 CTC의 명시야 이미지이다. 도 9b는 판-시토케라틴(Pan-cytokeratin)의 존재를 나타내는 형광 이미지이다. 도 9c는 CD45의 부재를 나태내어 백혈구를 CTC로서 오인할 가능성을 배제하는 형광 이미지이다.
도 10a 내지 도 10d는 보통의 암세포와는 구별되는 암 줄기세포의 광학적인 이미지를 나타낸다. 화살표 머리는 암 줄기세포(CD44+/CD24-)를 나타낸다. 도 10a는 Alexa488-anti-CD44(녹색)를 검출하기 위한 형광 이미지(500 내지 540nm)이다. 도 10b는 Alexa647-anti-CD24(적색)를 검출하기 위한 형광 이미지(645 내지 700nm)이다. 도 10c는 명시야 이미지이다. 도 10d는 CD44+/Cd24-를 나타내는 복합 이미지이다(화살표는 암 줄기세포를 나타냄).
도 11a 내지 도 11d는 부유물을 부분 표본화하기 위한 장치(1110)의 동작을 나타낸다.
도 12a 내지 도 12d는 접점(1240)에서 만나는 5개의 유체 채널(1211, 1212, 1213, 1214 및 1215)을 가지고 부유물을 부분 표본화하기 위해 사용되는 장치(1210)를 나타낸다.
도 13은 접점(1116)(혹은 1240)의 상류와 하류에서 서로 다른 위치에 배치된 2개의 APD(Avalanche Photodiode)로부터 수집된 형광 신호를 나타낸다. 도표(1310)는 검출 체적(1140)(혹은 1270)에서 부분 표본 내 EpCAM의 존재를 검출하도록 구성된 하나의 APD로부터의 신호 궤적(1311)을 나타내며, 반면에 도표(1320)는 채널(1114)(혹은 1214) 내 EpCAM 분자의 존재를 검출하도록 구성된 제 2 APD로부터의 신호 궤적(1321)을 나타낸다.
도 14는 eDAR을 이용하여 펄스 길이의 함수로서 복구된 암세포의 백분율을 나타내는 도표(1410)를 나타낸다. 궤적(1420)은 펄스폭이 10ms 이하인 경우 암세포의 100%가 정확한 채널에 수집되었음을 나타낸다.
도 15는 입력 유량(Flow Rate)의 함수로서 복구된 희소 세포의 백분율을 나타내는 궤적(1520)을 갖는 도표(1510)를 나타낸다.
도 16은 검출 체적에 도달하기 이전에 생입자를 포획하기 위하여 비혼합 위상(Immiscible Phase)에 의해 분리된 개별적인 수분을 함유한 부분 표본의 이용을 나타낸다.

Ⅰ. 개요

일 측면에서, 본 발명은 유체 샘플 내 희소 입자를 검출 및/또는 복구하기 위한 방법과 장치를 제공한다. 이러한 측면에서 구체화된 개념은 여기서 "앙상블-결정 부분 표본 순위화(Ensemble-Decision Aliquot Ranking)" 혹은 "eDAR"이라고 한다. 일 실시형태에서, eDAR 방법론은 (ⅰ) 상기 유체 샘플의 부분 표본에서 희소 입자의 존재나 부재를 검출하는 단계; (ⅱ) 상기 희소 입자의 존재나 부재에 따라 상기 부분 표본을 순위 매기는 단계; 및 (ⅲ) 상기 할당된 순위에 기초하여 전체 부분 표본의 흐름이나 집합을 안내하는(Directing) 단계로서 특징지어질 수 있다.

희소 세포를 찾기 위하여, eDAR은 속도에 있어 엄청난 이점을 제공한다. 이 예로서, 10개의 필요한 희소 세포를 포함하는 10mL 세포 부유물을 고려해 본다. 이 경우, 부유물 체적의 약 99.9999%는 하나의 필요한 희소 세포도 포함하지 않는다. 유동 세포 계수법, FACS 등과 같은 현존하는 기술은 전체 부유물 체적 내에 포함되는 모든 세포에 걸쳐서 예외 없이 연속적으로 스캔하며, 이는 필요한 세포를 포함하지 않는 부유물 체적의 99.9999%에 걸친 스캐닝에 거의 모든 시간을 소비하는 결과를 낳는다. eDAR은 부유물을 부분 표본화함으로써 전체 부유물의 신속한 고 레벨 검사를 가능하게 한다. 만약 세포가 정말로 희소하다면, 대부분의 부분 표본은 필요한 세포를 포함하지 않을 것이다. 일 실시형태에서, 이들 부분 표본은 NULL(널)로서 랭크되고, 제 1 채널을 통해 버려진다. 이에 비해서, 희소 세포를 정말로 포함하는 소량의 부분 표본은 NONZERO(넌-제로)로서 랭크되고, 별개의 채널이나 챔버에서 수집된다.

이러한 방식으로, eDAR은 종래의 유동 세포 계수법과 차별화된다. 유동 세포 계수법은 (1) 입자열을 포함하도록 쉬스 흐름(Sheath Flow)을 이용함으로써 1열 종대(즉, 하나의 열에 하나씩)로 생입자를 흘리고, (2) 한번에 하나의 생입자만을 검출하며, (3) 검출된 생입자의 궤적을 결정함으로써 동작한다. 만약 검출된 생입자가 원하는 것이라면, 예컨대 그 생입자는 다양한 방법들 중 하나에 의하여 수집 용기에 도달하는 특정한 궤적을 따르도록 안내된다. 만약 검출된 생입자가 원하지 않는 것이라면, 그 생입자는 다른 수집 용기에 도달하는 다른 궤적으로 안내된다.

종래의 유동 세포 계수법과는 달리, eDAR은 전체 부분 표본에 대한 앙상블 결정을 하기 위하여 전체적인 부분 표본, 즉 유체의 3차원 구획을 조사한다. 열을 짓거나(유체의 1차원 구획, 이는 하나의 열로 배열된 생입자를 유발함) 평면화하는 것(유체의 2차원 구획, 이는 평면에서 복수의 평행한 열로 배열된 생입자를 유발함)과는 달리, 부분 표본화는 훨씬 더 높은 수율을 제공한다. 유동 세포 계수법의 경우 검출기들은 단일 세포 혹은 단일의 세포 평면으로부터 신호를 수집하기만 하도록 구성되어 있기 때문에, 부분 표본을 분석하는 것이 불가능하다. 검출 지점이나 평면 외곽의 생입자는 유동 세포 계수법에서 사용되는 검출기에 대해서 완전히 비가시적이고, 그 결과 검출 지점이나 평면 외곽의 생입자 이동을 방지하기 위해, 쉬스 흐름, 가이딩 버퍼(Guiding Buffer) 혹은 다른 유체 역학이나 기하학적인 초점 메커니즘이 필요하다. eDAR은 하나보다 많은 평면이나 층의 생입자에 이르는 전체 부분 표본을 분석한다. eDAR의 경우, 단일의 검출 지점이나 평면과는 달리 전체 부분 표본으로부터 발하는 신호가 분석된다.

eDAR은 희소 세포를 검출하거나 격리하기 위하여 현존하는 방법들에 비해 월등히 개선된 민감도를 제공한다. eDAR의 검출 컴포넌트는 전체 부분 표본 내에서 발하는 단일의 광자를 검출하며, 따라서 검출 가능한 특성을 나타내는 어떤 생입자라도 놓치지 않는다. 부분 표본 순위는 원하는 생입자가 완전하게 전혀 없도록 순위가 매겨진 부분 표본만을 제거하도록 구성되기 때문에, 가음성율(Rate of False-negative)이 극도로 낮다.

본 발명에 따른 실시형태는 생물학 및 질병의 진단에 있어서 광범위한 응용예에 사용 가능하며, 여기에는 암 예측을 위해 체액으로부터 암세포나 암 줄기세포를 포획하는 것, 수질 검사를 위한 지아디아 혹은 크립토스포리디움과 같은 기생충, 말라리아 진단을 위한 말라리아 감염 적혈구, HIV 감시를 위한 임파구와 백혈구, 질병 검사를 위한 산모 혈액 내 태아 세포, 치료용 줄기세포, 프리온 관련(예컨대, 광우병) 질병 검사를 위한 프리온 감염 세포가 포함된다.

말라리아에 부가하여, 본 주제는 인간 면역 결핍 바이러스(HIV) 진단과 감시에 있어서 CD4+ T-임파구(CD4+ T-세포)의 감시를 위해 사용될 수 있다. 절대적인 CD4+ T-임파구 수는 HIV 감염 환자의 항레트로 치료와 기회 감염성 감염의 예방을 개시하기 위한 기준으로서 이용 가능하다. 백혈구(백혈구)의 소집단인 CD4+ T-임파구의 감소는 면역 체계의 감소와 강하게 연관되어 있다. 모든 HIV 감염 인구에 있어서 매 3~6개월마다 CD4+ T-임파구(CD4+ T-세포)를 감시하는 것이 적절한 치료 전략을 개시하고 치료 효과를 평가하기 위한 방법으로서 CDC 공중 위생국에 의하여 추천되어 왔다.

일부 연구실에서는, 절대적인 CD4+ T-세포가 3가지 실험실 기법의 결과물을 이용하여 설정되는데, 이들은 총 백혈구 수, 임파구인 백혈구의 백분율 및 CD4+ T-세포인 임파구의 백분율이다. FACSCount(BD Bioscience사)와 같은 단일 플랫폼의 유동 세포 계수기는 휴대용 장치로서 혹은 개발도상국에서는 상업적으로 입수가 불가능하다. 본 주제에 따른 실시형태는 다른 백혈구와 RBC로부터 CD4+ T-임파구를 신속하게 구별하기 위해 사용 가능하다.

본 발명에 따른 실시형태에 의해 거론되는 분리, 집결 및/또는 격리에 대한 부가적인 가능한 응용예로는 프리온 검출 및 유전적 장애의 태아기 진단을 위한 산모 혈액 내의 태아 세포 감시가 포함된다. 프리온은 핵산을 변형하는 절차에 의해 비활성활에 저항하는 작은 감염성 단백질 입자를 포함한다. 또한, 본 주제에 따른 실시형태는 태아 세포나 다른 마이크로-생물학 미립자 혹은 나노-생물학 미립자와 함께 사용 가능하다.

Ⅱ. 정의

여기에서 사용되는 바와 같이, "유체 샘플"은 관심 있는 희소 입자를 포함하거나 포함하지 않을 수 있는 어떠한 액체라도 가리킨다. 특정한 실시형태에서, 유체 샘플은 예컨대 혈액 샘플, 플라즈마 샘플, 타액 샘플, 소변 샘플, 림프 샘플, 척수액 샘플 등의 생체액 샘플일 수 있다. 다른 실시형태에서, 상기 샘플은 예컨대 호수, 강, 바다, 연못, 개울, 샘물, 습지, 저수지 등의 환경적인 유체일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 상기 샘플은 예컨대 담수화 플랜트, 정수 처리장, 급수장, 샘물, 개울, 빙하수 흐름, 배수탑 혹은 이동식 급수원으로서 고려할 수 있는 다른 급수원 등으로부터의 물 샘플일 수 있다.

여기에서 사용되는 바와 같이, "희소 입자"는 낮은 레벨로 유체 샘플 내에 존재하는 세포나 고분자를 지칭한다. 특정한 실시형태에서, 희소 입자는 세포, 단백질, 단백질 복합체, 핵산, 핵단백질 복합체, 탄수화물, 대사물, 이화 생성물 등일 수 있다. 특정한 실시형태에서, 입자는, 만약 그것이 유체 내 총 입자수의 약 10% 미만의 농도 혹은 유체 내 총 입자수의 약 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 혹은 그 미만으로 유체 샘플 내에서 존재한다면, 희소하다고 간주할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 희소 입자는 유체 내 총 입자수의 약 1/10³ 미만 혹은 유체 내 총 입자수의 약 10⁴, 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹, 10¹⁰, 10¹¹, 10¹² 분의 1 혹은 그 미만으로 유체 샘플 내에 존재할 수 있다.

특정한 실시형태에서, 희소 입자는 희소 세포이다. 희소 세포는 유핵이거나 무핵일 수 있다. 희소 세포는 악성 형질을 나타내는 세포, 산모의 말초혈 내 태아 세포와 같은 태아 세포, 종양으로부터 혈액이나 기타 체액으로 흐르는 종양 세포와 같은 종양 세포, HIV에 의하여 감염된 세포와 같은 바이러스에 감염된 세포, 관심 유전자로 세포 감염된 세포 및 자가반동 장애로 손상된 대상체의 말초혈 내에 존재하는 T-세포나 B-세포의 비정상적인 아형을 포함하지만, 여기에 한정되는 것은 아니다.

여기에서 사용되는 바와 같이, "앙상블-결정"이란 입자의 앙상블, 즉 그룹 내 특질의 존재나 부재의 검출에 기초하여 이루어지는 결정을 지칭한다. 특정한 실시형태에서, 앙상블-결정은 복수의 입자를 포함하는 유체 샘플의 부분 표본 내 단일의 개별 입자의 존재나 부재에 기초하여 이루어질 것이다. 중요한 것은, 단일 입자의 존재나 부재에 기초하여 이루어진 앙상블-결정은 전체 부분 표본에(즉, 부분 표본 내에 존재하는 모든 입자에) 적용될 것이라는 점이다.

여기에서 사용되는 바와 같이, "부분 표본"은 분석될 유체 샘플의 총 체적의 일부를 지칭한다. 부분 표본은 3차원 공간을 차지하고, 그 내부의 입자들은 조직화되지 않고 랜덤하게 분산되어 있다. 부분 표본은 한정된 깊이를 가지고, 입자는 식별 가능한 층이 없는 깊이를 따라 분산될 수 있다. 본 발명의 문맥에서, 부분 표본은 다시 나누지 않고 그 전체가 분석된다. 통상적으로 유체 역학적인 초점을 채택하는 현재의 세포 분류 기법들(예컨대, 유동 세포 계수법, FACS 등)을 묘사하기 위하여 사용되고 2차원 공간을 제시하는 시트, 리본, 평면 혹은 이와 유사한 용어들은 부분 표본으로 간주하지 않는다.

특정한 실시형태에서, 부분 표본은 예컨대 유체 샘플의 약 1/2 혹은 유체 샘플의 약 1/3, 1/4, 1/5, 1/6, 1/7, 1/8, 1/9, 1/10 혹은 그 미만과 같이 더 큰 유체 샘플의 부분으로 구성될 수 있다. 특정한 실시형태에서, 부분 표본은 예컨대 유체 샘플의 약 10% 혹은 유체 샘플의 약 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01%, 0.001% 혹은 그 미만으로 구성될 수 있다. 이와 같이, 여기에 제공된 eDAR 방법론에 의해 처리되거나 검사되는 유체는 예컨대 적어도 약 2개의 부분 표본으로, 혹은 적어도 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 130, 140, 150, 175, 200, 225, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, , 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2500, 3000, 4000, 4500, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 200000, 300000, 400000, 500000, 600000, 700000, 800000, 900000, 1백만, 2백만, 3백만, 4백만, 5백만, 6백만, 7백만, 8백만, 9백만, 1천만 혹은 그 이상의 부분 표본으로 나누어질 수 있다. 당업자라면 유체 샘플이 분할되는 부분 표본의 개수는 유체 샘플의 총 체적과 유체 내에서 기대되는 희소 입자의 개수에 따라 달라질 것이라는 점을 이해할 것이다.

특정한 실시형태에서, 부분 표본은 예컨대 약 0.1nL와 약 10mL 사이, 약 1nL와 약 1mL 사이, 약 1nL와 약 100μL 사이, 약 1nL와 약 10μL 사이, 약 1nL와 약 1μL 사이 혹은 약 1nL와 약 100nL 사이의 체적을 가질 수 있다.

여기에서 사용되는 바와 같이, "순위화"라는 용어는 양적인 속성, 질적인 속성 혹은 범주화에 의한 부분 표본의 중요도를 평가하는 것을 지칭한다. 일 실시형태에서, 부분 표본은 NULL(예컨대, 희소 입자가 부분 표본 내에서 검출되지 않는 경우)이나 NONZERO(예컨대, 적어도 하나의 희소 입자가 부분 표본 내에서 검출되는 경우) 중 하나로 순위가 매겨질 수 있다. 다른 실시형태에서, 부분 표본은 부분 표본 내 희소 입자의 농도, 부분 표본 내 희소 입자의 실체, 부분 표본 내 복수의 상이한 희소 입자의 실체 및 기타와 상관되는 부가적인 카테고리에 따라 순위가 매겨질 수 있다. 이러한 방식으로, 어떤 수의 카테고리라도 예컨대 약 1과 10 사이, 약 11과 20 사이, 약 1과 50 사이, 약 51과 100 사이, 약 1과 100 사이, 약 101과 201 사이 등의 농도 범위에 기초하여 할당될 수 있다. 이들 순위는 복수의 미리 정해진 양적인 혹은 질적인 카테고리 중 하나에 대응하는 임의의 수(예컨대, 0, 1, 2, 3, 4, 5 등)나 부분 표본 내 희소 입자의 개수나 근사치 개수에 대한 실제적인 값에 대응하는 수를 할당받을 수 있다.

여기에서 사용되는 바와 같이, "검출 가능한 특성"이란 예컨대 희소 입자에 대하여 대칭되거나 얽혀 있는 검출 가능한 일부분(Moiety)과 연계되거나, 희소 입자에 본질적인 광능동적, 전기활성적, 생리활성적 혹은 자기적 특성 등 희소 입자와 연계되는 특성을 지칭한다.

광능동적 특성의 예로는, 예컨대 통상적으로 생입자 형태론(입자 크기, 입상, 내부적인 준세포 구조)에 의하여 얻어지는 광학적인 강도(광학적 반사, 산란, 굴절, 전파 혹은 흡수), 형광, 면역 형광 등에 있어서의 변화가 포함된다.

전기활성적 특성의 예로는, 예컨대 전하, 산화 상태, 스핀(Spin) 상태, 커패시턴스, 컨덕턴스, 유전체 특성, 전기 영동 이동도 혹은 분극률이 포함된다.

생리활정적 특성의 예로는, 예컨대 AP(Alkaline Phosphatase), HRP(Horseradish Peroxidase), β-Galactosidase와 같은 효소 및 이들의 화학 발광적, 전량적(Colometric) 혹은 화학 형광적 기질과의 검출 가능한 상호 작용이 포함되며, 여기에는 TMB(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine), OPD(O-phenylene Diamine), ABTS(2,2'-Azinodiethylbenzthiazoline Sulfonate), Chlornaphthol, AEC(3-Amino-9-Ethylcarbazole), DAB(Diaminobenzidine), pNPP(p-Nitrophenyl Phosphate), BCIP/NBT(Bromochloroindolyl Phosphate-Nitro Blue Tetrazolium) 등이 포함되지만 이에 한정되는 것은 아니다.

특정한 실시형태에서, 희소 입자를 검출하는데 이용 가능한 일부분으로는 제한적이지 않지만 나노 입자, 마이크로비드(Microbead), 항체와 그 분절(Fragment), 형광성 항체, 자기성 나노 입자, 폴리머 분자, 염료 분자, DNA나 RNA 분자(예컨대, 압타머(Aptamer)), 지질 분자, 단백질 분자 등이 포함된다.

여기에 사용되는 바와 같이 "항체"란 특히 항원을 결속하여 인지하는 면역글로불린 유전자나 그 분절로부터의 체계 영역(Framework Region)을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 인지되는 면역글로불린 유전자로는 미리어드(Myriad) 면역글로불린 변수 영역 유전자는 물론이고, 카파(Kappa), 람다(Lambda), 알파(Alpha), 갬마(Gamma), 델타(Delta), 엡실론(Epsilon) 및 뮤(Mu) 상수 영역 유전자가 포함된다. L 사슬(Light Chain)은 카파나 람다 중 하나로 분류된다. H 사슬(Heavy Chain)은 갬마, 뮤, 알파, 델타 혹은 입실론으로서 분류되며, 이는 다시 면역글로불린 계층인 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 각각 정의한다. 통상적으로, 항체의 항원 결합 부위는 결합의 특이도(Specificity)와 친연성(Affinity)에 있어서 가장 중요할 것이다. 항체는 다중 클론성이거나 단일 클론성이고, 혈청, 혼성세포로부터 유도되거나 재조합형으로 클론(Clone, 복제)될 수 있으며, Chimetric, Primatized 혹은 Humanized일 수도 있다.

예시적인 면역글로불린(항체) 구조 유닛은 사합체(Tetramer)를 포함한다. 각 사합체는 2개의 동일한 폴리펩티드 사슬 쌍으로 구성되고, 각 쌍은 하나의 "L(Light)"(약 25kD) 및 하나의 "H(Heavy)" 사슬(약 50 내지 70kD)을 갖는다. 각 사슬의 N-말단은 항원 인지를 1차적으로 책임지는 약 100 내지 110 혹은 그 이상의 아미노산 가변 영역을 정의한다. 가변 L 사슬(VL)과 가변 H 사슬(VH)이라는 용어는 이들 L 및 H 사슬을 각각 지칭한다.

항체는 손상되지 않은 면역글로불린으로서 혹은 다양한 펩티다아제와의 소화로 생성되는 다수의 웰캐릭터라이즈드(Well-Characterized) 분절로서 존재한다. 따라서, 예컨대 펩신은 힌지(Hinge) 영역 내 이황화물 연결 아래에서 항체를 소화하여, F(ab)'₂를 생성하고, Fab의 이합체는 그 자체가 이황화물 결합에 의해 V_H-C_H1에 연결되는 L 사슬이다. F(ab)'₂는 힌지 영역 내 이황화물 연결을 파괴하기 위하여 온화한 조건하에서 감소될 수 있으며, 이로써 F(ab)'₂ 이합체를 Fab' 단위체로 변환한다. 본질적으로 Fab' 단위체는 힌지 영역의 부분을 갖는 Fab이다(Fundamental Immunology 1993년 Paul 에디션 3판 참조). 다양한 항체 분절이 손상되지 않은 항체의 소화라는 형식으로 정의되지만, 당업자라면 이와 같은 분절이 화학적으로 혹은 재조합형 DNA 방법론을 이용함으로써 새롭게 합성될 수 있다는 점을 이해할 것이다. 따라서, 여기에서 사용되는 바와 같은 항체라는 용어는 전체 항체의 변형에 의하여 생성되는 항체 분절들 혹은 파지 디스플레이 라이브러리(Phage Display Library)를 이용하여 확인되는 것들이나 재조합형 DNA 방법론을 이용하여 새롭게 합성되는 것들(예컨대, 단일 사슬 Fv)도 포함한다(예컨대, 1990년도 McCafferty 공저 Nature 348:552-554 참조).

일 실시형태에서, 항체는 라벨이나 검출 가능한 모이어티(Moiety, 일부분)에 대칭(Conjugated)된다.

여기에서 사용되는 바와 같이, "라벨"이나 "검출 가능한 모이어티"는 분광학, 광화학, 생화학, 면역화학, 화학 혹은 기타의 물리적인 수단에 의하여 검출 가능한 구성요소를 지칭한다. 예컨대, 제한적이지는 않지만 유용한 라벨로는 방사성핵종, 형광 염료(예컨대, 플루오레세인, FITC(Fluorescein Isothiocyanate), Oregon Green^TM, 로다민, 텍사스레드, TRITC(Tetrarhodimine Isothiocynate), Cy3, Cy5 등), 형광 마커(예컨대, GFP(Green Fluorescent Protein), 피코에리트린 등), 종양 관련 프로테아제에 의해 활성화되는 오토쿠엔치(Autoquenched) 형광 복합체, 효소(예컨대, 루시페라아제, 홀스래디쉬 페록시다아제, 알카리성 인산가수분해효소 등), 나노 입자, 비오틴, 디곡시제닌 등이 포함된다.

특정한 실시형태에서, 검출 시약은 격리된 세포를 선택적으로 표시하거나 강조하기 위하여 뿌려질 수 있다. 제한적이지는 않지만 그러한 시약의 예로는, 형광성, 면역형광성, 염료 대칭성 분자(항체, Fab 분절, 앱타머, 폴리머, 리간드, 아고니스트, 안타고니스트(Antagonist) 혹은 그 조합 등), 자기성, 전기활성, 생리활성, 광활성 복합체가 포함된다. 상피성 암 세포 내 세포 골격의 필수 구성물인 사이토케라틴과 반응하는 착색제를 이용하는 예가 있다. 다른 염료 예로는 FITC(Fluorescein Isothiocyanate)-대칭형 마우스(Mouse) 항인 상피 항체(Anti-human Epithelial Antibody(HEA)) 및 PE(Phycoerythrin)-대칭형 안티-CD45가 포함된다. 염료 대칭형 항체의 다른 예로는 판-시토케라틴 항체 A45B/B3, AE1/AE3 혹은 CAM5.2(시토케라틴8(CK8), 시토케라틴18(CK18) 혹은 시토케라틴19(CK19) 및 유방암 항원 NY-BR-1(B726P, ANKRD30A, 안키린 리피트 도메인 30A로도 알려져 있음)에 저항하는 것들을 인지하는 판-시토카레틴 항체), B305D 이소폼 A 혹은 C(B305D-A 혹은 B305D-C, 항원 B305D로도 알려져 있음), 헤르메스 항원(항원 CD44, PGP1으로도 알려져 있음), E-카데린(Uvomorulin, 카데린-1, CDH1으로도 알려져 있음), CEA(Carcino-Embryonic Antigen, CEACAM5 혹은 CEA 관련 세포 부착 분자5로도 알려져 있음), β-HCG(β-Human Chorionic Gonadotophin, CGB, Chronic Gonadotrophin, β 폴리펩티드로도 알려져 있음), 카텝신-D(CTSD로도 알려져 있음), NPY3R(Neuropeptide Y Receptor Y3로도 알려져 있음), 지질다당류 연계 단백질3, LAP3, 퓨전(Fusion), 케모카인(Chemokine, CXC 모티프, 수용기4, CXCR4), 암유전자 ERBB1(c-erbB-1으로도 알려져 있음, EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor), Her-2 Neu(c-erbB-2 혹은 ERBB2 로도 알려져 있음), GABA 수용기 A, 파이(π) 폴리펩티드(GABARAP, GABA-A 수용기, 파이(π) 폴리펩티드(GABA A(π),

-Aminobutyric Acid Type A 수용기 파이(π) Subunit) 혹은 GABRP로도 알려져 있음), ppGalNac-T(6)(β-1-4-N-acetyl-galactosaminyl-transferase 6, GalNActransferase 6, GalNAcT6, UDP-N-acetyl-d-galactosamine:polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase 6 혹은 GALNT6으로도 알려져 있음), CK7(Cytokeratin 7, Sarcolectin, SCL, Keratin 7 혹은 KRT7으로도 알려져 있음), CK8(Cytokeratin 8, Keratin 8 혹은 KRT로도 알려져 있음), CK18(Cytokeratin 18, Keratin 18 혹은 KRT18로도 알려져 있음), CK19(Cytokeratin 19, Keratin 19 혹은 KRT19로도 알려져 있음), CK20(Cytokeratin 20, Keratin 20 혹은 KRT20으로도 알려져 있음), 메이지(Mage, Melanoma antigen family A subtytpes 혹은 MAGE-A subtypes로도 알려져 있음), Mage3(Melanoma antigen family A 3 혹은 MAGA3로도 알려져 있음), Hepatocyte growth factor receptor(HGFR, Renal cell carninoma papillary 2, RCCP2, Protooncogene met 혹은 MET로도 알려져 있음), Mucin-1(MUC1, Carcinoma Antigen 15.3, (CA15.3), Carcinoma Antigen 27.29(CA27.29)로도 알려져 있음), CD227 antigen, Episialin, Epithelial Membrane Antigen(EMA), PEM(Polymorphic Epithelial Mucin), PUM(Peanut-reactive urinary mucin), TAG12(Tumor-associated glycoprotein 12), Gross Cystic Disease Fluid Protein(GCDFP-15, Prolactin-induced protein, PIP로도 알려져 있음), Urokinase receptor(uPR, CD87 antigen, Plasminogen activator receptor urokinase-type, PLAUR로도 알려져 있음), PTHrP(parathyrold hormone-related proteins, PTHLH로도 알려져 있음), BS106(B511S, small breast epithelial mucin 혹은 SBEM으로도 알려져 있음), Prostatein-like Lipophilin B(LPB, LPHB, Antigen BU101, Secretoglobin family 1-D member 2, SCGB1-D2로도 알려져 있음), Mammaglobin 2(MGB2, Mammaglobin B, MGBB, Lacryglobin(LGB) Lipophilin C(LPC, LPHC), Secretoglobin family 2A member 1 혹은 SCGB2A1으로도 알려져 있음), Mammaglobin(MGB, Mammaglobin 1, MGB1, Mammaglobin A, MGBA, Secretoglobin family 2A member 2 혹은 SCGB2A2로도 알려져 있음), Mammary serine protease inhibitor(Maspin, Serine(혹은 cystein) proteinase inhibitor clade B(ovalbumin) member 5 혹은 SERPINB5로도 알려져 있음), Prostate epithelium-specific Ets transcription factor(PDEF, Sterile alpha motif pointed domain-containing ets transcription factor 혹은 SPDEF로도 알려져 있음), Tumor-associated calcium signal transducer 1(Colorectal carcinoma antigen CO17-1A, Epithelial Glycoprotein 2(EGP2), Epithelial glycoprotein 40kDa(EGP40), Epithelial Cell Adhesion Molecule(EpCAM), Epithelial-specific antigen(ESA), Gastrointestinal tumor-associated antigen 733-2(GA733-2), KS1/4 antigen, Membrane component of chromosome 4 surface marker 1(M4S1), MK-1 antigen, MIC18 antigen, TROP-1 antigen 혹은 TACSTD1으로도 알려져 있음), Telomerase reverse transcriptase(Telomerase catalytic subunit 혹은 TERT로도 알려져 있음), Trefoil Factor 1(Breast Cancer Estrogen-Inducible Sequence, BCEI, Gastrointestinal Trefoil Protein, GTF, pS2 protein 혹은 TFF1으로도 알려져 있음), folate 혹은 Trefoil Factor 3(Intestinal Trefoil Factor, ITF, p1.B 혹은 TFF3로도 알려져 있음)가 포함되지만, 여기에 한정되는 것은 아니다.

예컨대 단백질, 핵산 혹은 세포 등 희소 입자를 지칭할 때 항체에 대하여 "특별하게(혹은 선택적으로) 바인드(Bind)한다"거나 "특별하게(혹은 선택적으로) 면역 반응성이다"라고 하는 어구는 통상적으로 입자와 기타 생물체의 이종 분포에 있어서 희소 입자의 존재를 결정하는 바인딩 반응(Binding Reaction)을 지칭한다. 따라서, 지정된 면역 측정 조건하에서, 특정한 항체가 적어도 2배의 배경, 그리고 더욱 일반적으로는 10 내지 100배보다 많은 배경에서 특정한 희소 입자에 바인드한다. 그러한 조건하에서 항체에 대한 특정한 바인딩은 희소 입자에 대한 특수성으로 인하여 선택되는 항체를 요구한다. 예컨대, 다클론성 항체는 선택된 항원과 특정하게 면역 반응하고 다른 단백질과는 반응하지 않는 이들 다클론성 항체만을 획득하도록 선택될 수 있다. 이러한 선택은 다른 분자와 상호 반응하는 항체를 제거함으로써 구현될 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 샘플 유체 내 하나 이상의 희소 생입자를 검출하기 위한 방법에 있어서, a) 상기 샘플 유체의 하나 이상의 부분 표본을 검사하는 단계; b) 단일 측정으로, 복수의 생입자를 포함하는 상기 하나 이상의 부분 표본 각각에 있어서 상기 하나 이상의 희소 생입자의 존재나 부재를 검출하는 단계; 및 c) 상기 하나 이상의 희소 생입자의 존재나 부재에 기초하여 상기 부분 표본을 순위 매기는 단계를 포함한다. 특정한 실시형태에서, 희소 생입자는 세포이다. 특정한 실시형태에서, 희소 생입자는 형광 라벨된 세포이다.

여기에 제시된 본 방법의 일부 실시형태에서, 복수의 파라미터는 단일 측정으로 검출된다. 특정한 실시형태에서, 복수의 파라미터는 서로 다른 형광색이다.

여기에 제시된 본 방법의 특정한 실시형태에서, 샘플 유체는 상기 생입자나 그 조합을 포함하여 샘플 내 세포의 응집을 방지하는 혼합물, 항응고제의 부가에 의하여 안정화된다.

일부 실시형태에서, 부분 표본 순위는 이진수이며, 예컨대 부분 표본은 만약 부분 표본이 희소 입자를 포함하지 않는다면 "0"의 값을 할당받고, 만약 그렇다면 "1"의 값을 할당받는다. 다른 실시형태에서, 순위는 이진수가 아니며, 예컨대 해당 값은 샘플 내 희소 입자의 실체나 부분 표본 내 존재하는 희소 입자나 개수에 기초하여 할당된다. 특정한 실시형태에서, 순위는 순위 알고리즘을 나타내는 소프트웨어와 컴퓨터에 의해 수행된다.

일부 실시형태에서, 여기에 제시된 본 방법은 순위에 기초하여 부분 표본을 채널링(Channeling)하는 단계를 포함한다. 예컨대, 부분 표본의 흐름이나 집합은 부분 표본에 할당된 값에 기초하여 방향을 갖는다. 특정한 실시형태에서, 이는 흐름 방해를 형성하거나 외부적 필드(Field)를 사용함으로써 구현된다.

특정한 실시형태에서, 본 방법은 유사한 순위를 갖는 부분 표본을 수집 및/또는 모음으로써 희소 생입자를 집중시키는 단계를 포함할 수 있다.

일부 실시형태에서, 여기에 제시된 본 방법에 있어서 희소 생입자는 암세포, 암 줄기세포, 면모충, 크립토스포륨, 말라리아 감염 적혈구, 임파구, 백혈구, 태아세포, 줄기세포 및 프리온 감염된 세포로 구성된 그룹으로부터 선택된다.

다른 측면에서, 본 발명은 샘플 유체 내 하나 이상의 희소 생입자를 검출하기 위한 장치를 제공하며, 상기 장치는 a) 하나 이상의 부분 표본 중 적어도 하나는 복수의 생입자를 포함하는 경우 하나 이상의 부분 표본 각각에서 하나 이상의 희소 생입자의 존재나 부재를 검출하기 위한 하나 이상의 검출기 및 b) 상기 하나 이상의 희소 생입자의 존재나 부재에 기초하여 상기 부분 표본을 순위 매기기 위한 소프트웨어를 갖는 컴퓨터를 구비한다. 일 실시형태에서, 상기 순위는 이진수이다. 다른 실시형태에서, 상기 장치는 복수 유형의 생입자를 검출하도록 사용되며, 상기 순위는 이진수가 아니다.

특정한 실시형태에서, 상기 장치는 상기 순위에 기초하여 상기 부분 표본을 채널링하기 위한 채널을 더 구비할 수 있다. 특정한 실시형태에서, 상기 채널은 항응고제 혼합물, 희소 생입자에 우선적으로 바인드하는 혼합물, 생입자 집합체를 방지하는 혼합물 혹은 그 조합으로 처리된다.

특정한 실시형태에서, 상기 장치는 상기 생입자의 궤적을 조작하고 추적하기 위한 전극을 더 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 상기 장치는 부착된 자기 입자를 갖는 생입자의 분리를 위한 자기 소자를 더 구비할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 상기 장치는 상기 생입자의 궤적을 추적하고 조작하기 위한 음향 소자를 더 구비할 수 있다.

여기에 제시되는 장치 및 기구의 특정한 실시형태에서, 상기 장치는 카메라, 전자증배관, CCD 이미지 센서, PMT(Photomultiplier Tube), APD(Avalanche Photodiode), SPAD(Single-photon Avalanche Diode) 혹은 CMOS(Complementary Metal Oxide Semiconductor) 이미지 센서로부터 선택되는 하나 이상의 검출기를 포함한다.

여기에 제시된 상기 장치 및 기구의 특정한 실시형태에서, 상기 장치는 상기 샘플 유체의 하나 이상의 부분 표본을 검사하기 위한 하나 이상의 소스를 더 구비할 수 있다. 예컨대, 전자기 방사 소스이다. 특정한 실시형태에서, 정보를 얻기 위한 하나 이상의 소스는 레이저(고체상, 다이오드 펌프형(Diode-pumped), 이온 혹은 염료), LED, 램프, 아크 방전(Arc Discharge), 자기 펄스 혹은 자연광으로부터 선택된다. 또 다른 실시형태에서, 부분 표본의 조사를 위한 소스는 화학 발광이나 생체 발광과 같은 광 방출을 생입자가 나타낼 때 요구되지 않는다.

Ⅲ. 실시형태

A. 검출 방법

일 측면에서, 본 발명은 유체 샘플 내 희소 입자를 검출하기 위한 방법을 제공하며, 본 방법은 (a) 상기 유체 샘플의 부분 표본에서 희소 입자의 존재나 부재를 검출하는 단계; (b) 상기 희소 입자의 존재나 부재에 기초하여 상기 부분 표본에 대하여 값을 할당하는 단계; 및 (c) 상기 할당된 값에 기초하여 상기 부분 표본의 흐름이나 집합을 안내하는(Directing) 단계를 포함한다.

일 실시형태에서, 상기 희소 입자의 존재를 검출하는 상기 단계는, (ⅰ) 검출 시약과 희소 입자를 포함하는 복합체로 상기 검출 시약을 변환하기에 적합한 조건하에서 상기 유체 샘플을 상기 검출 시약으로 접촉하는 하위 단계; 및 (ⅱ) 상기 유체 샘플의 부분 표본에 있어서 상기 (ⅰ) 단계에서 형성된 복합체의 존재나 부재를 검출하는 하위 단계를 포함한다.

특정한 실시형태에서, 상기 검출 시약은 라벨형 혹은 비라벨형 항체, Fab 분절, 앱타머, 폴리머, 나노입자, 마이크로비드, 형광 항체, 자기 나노입자, 폴리머 분자, 염료 분자, 앱타머, 지질 분자, 단백질 분자 등을 포함할 수 있다.

다른 실시형태에서, 상기 희소 입자의 존재를 검출하는 상기 단계는, (ⅰ) 전자기 방사의 외부 소스로 상기 부분 표본을 조사하는 하위 단계; 및 (ⅱ) 상기 희소 입자의 형광을 검출하는 하위 단계를 포함한다.

일 실시형태에서, 희소 입자는 형광 라벨형 세포를 포함할 수 있다. 특정한 실시형태에서, 형광 라벨형 세포는 형광 단백질을 표현하는 세포나 형광 검출 시약으로 라벨된 세포를 포함할 수 있다. 예컨대, 적색 혹은 녹색 형광 단백질을 일시적으로 혹은 안정적으로 표현하는 세포이다.

또 다른 실시형태에서, 희소 입자는 고유한 화학 발광이나 생체 발광을 나타내며, 상기 희소 입자의 존재를 검출하는 상기 단계는, 상기 희소 입자의 생체 발광이나 화학 발광을 검출하는 단계를 포함한다.

특정한 실시형태에서, 상기 희소 입자는 세포, 단백질, 단백질 복합체, 핵산, 핵단백질 복합체, 탄수화물, 대사물, 분해 대사 물질 등일 수 있다. 일 실시형태에서, 희소 입자는 세포이다. 특정한 실시형태에서, 세포는 암세포, CTC(Circulating Tumor Cell), 암 줄기세포, 암 표면항원을 나타내는 암세포일 수 있으며, 예를 들면 CD44, CD2, CD3, CD10, CD14, CD16, CD24, CD31, CD45, CD64, CD140b 혹은 그 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것이다.

암 줄기세포는 생체지표에 선택적으로 바인드하는 다른 시약을 살포함으로써 보통의 암세포와 구별될 수 있으며, 이는 CD44, CD2, CD3, CD10, CD14, CD16, CD24, CD31, CD45, CD64 혹은 CD140b를 포함할 수 있지만 여기에 국한되는 것은 아니다.

특정한 실시형태에서, 희소 입자가 암세포인 경우, 희소 세포를 갖는 것으로 확인된 부분 표본 내에 포함되는 세포들은 더욱 개별적으로 나누어질 수 있다. 예컨대, 이들 세포는 전통적인 유동 세포 계수법이나 eDAR을 통해 추가적으로 분할되거나 분류될 수 있으며, 원하는 세포들은 제대로 기능하지 못하는 세포 조직의 기원을 이해하기 위하여 나누어질 수 있다. 각 세포 내의 내용물은 DNA, RNA, DNA 시퀀스, 대사 물질, 지질, 탄수화물, 단백질 성분 등에 대하여 개별적으로 분석될 수 있다.

다른 실시형태에서, 희소 세포는 기생 세포나 조직, 예컨대 지아르디아나 크립토스포리듐의 종, 변형체의 종으로 감염된 적혈구, HIV로 감염된 림프구나 백혈구, 모혈 내 태아 세포, 줄기세포, 프리온 감염 세포, CD4+ T-세포 등일 수 있다.

일 실시형태에서, 유체 샘플은 하나보다 많은 유형의 희소 입자, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 혹은 그보다 많은 유형의 희소 입자를 포함할 수 있다. 따라서, 특정한 실시형태에서 유체 샘플은 복수의 서로 다른 검출 시약으로 동시에 접촉되며, 그 각각은 복수의 검출 시약을 복수의 희소 입자와 검출 시약을 포함하는 복수의 복합체로 변형하기에 충분한 조건하에서 서로 다른 특수성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 복수의 복합체는 예컨대 하나보다 많은 검출 장치 및/또는 하나보다 많은 검사 장치를 구비하는 eDAR 장비를 이용함으로써 동시에 검출된다.

예컨대, 2개의 희소 입자가 동시에 검출되는 경우, 각각의 희소 입자는 구별되는 검출 시약으로 접촉될 수 있으며, 그 각각은 2개 검출 장치 중 하나에 의하여 검출 가능하다. 나아가, 검출 시약이 형광기를 포함하는 경우, 2개의 검사 장치(예컨대, 서로 다른 형광기의 여기 파장에 대응하는 서로 다른 파장에서 방사선을 생성하는 2개의 레이저)가 이용될 수 있으며, 각각의 형광 방사선은 2개의 서로 다른 검출 장치에 의해 검출될 수 있다. 따라서, 일 실시형태에서, 검출 시약은 상이한 파장에서 형광에 의하여 구별된다.

또 다른 실시형태에서, 2개 이상의 희소 입자가 직렬로 검출될 수 있다. 예컨대, 일 실시형태에서 본 방법은 eDAR 장치의 제 1 위치에서 제 1 희소 입자를 검출하는 단계 및 eDAR 장치의 제 2 위치에서 제 2 희소 세포를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 방식으로, 제 1 및 제 2 입자가 존재하는 부분 표본은 제 1 검출 단계 이후, 제 2 검출 단계 이후 혹은 양 검출 단계 이후에 채널화될 수 있다.

본 발명의 특정한 실시형태에서, 총체적인 세포로부터의 특성 검출은 동시적이거나 시간에 걸쳐서 누적되는 것일 수 있다. 예컨대, 특성 검출은 총체적인 생입자를 포함하는 대형 부분 표본으로부터 한번에("동시에") 발할 수 있다.

본 방법이 동시적인 모드로 수행되는 특정한 실시형태에서, 생입자들은 가변 속도의 흐름에 의하여 운반될 수 있다. 예컨대, 생입자는 검출 체적을 통해 가로지르면서 안정적인 흐름에 의해 운반될 수 있다. 선택적으로, 그러한 흐름은 세포가 검출 체적을 통과하면서 정지되거나, 감속되거나, 가속될 수 있다. 흐름은 다음의 검출 체적의 하류나 상류 중 하나를 따르는 것 중 하나로 규제될 수 있는데, 밸브, 버블, 전기장, 자기장, 광학장, 공기 압축원, 고체 입자, 막, 비혼합 방울, 차등 중력 혹은 채널의 표면 장력을 바꾸기 위한 코팅 등이다.

여기에 제시된 방법의 일부 실시형태에서, 검출 단계는 흐름 채널을 통과하여 유체 샘플의 지속적인 흐름 동안 수행된다. 특정한 실시형태에서, 개별적인 부분 표본은 물리적으로 분리되지 않으며, 그보다는 광학적인 검출 단계에 의하여 정의되는데, 다시 말하면 부분 표본은 검출이 발생하는 순간에서 검출 체적 내에 존재하는 총체적인 입자로서 정의될 수 있다.

특정한 실시형태에서, 검출 이벤트는 규칙적인 주파수를 가지고 발생할 것이며, 이는 유체 샘플의 유량과 검출 체적의 크기 양자에 의존적이다. 예컨대, 특정한 장치의 검출 체적이 10㎕이고, 유체 샘플은 100㎕/초의 속도로 장치를 통과하여 흐른다면, 서로 다른 부분 표본은 매 0.1초마다 혹은 10Hz의 속도로 검출될 것이다.

특정한 실시형태에서, 장치의 기하 구조와 처리될 유체의 체적에 따라, 개별적인 부분 표본은 0.1kHz와 100MHz 사이의 속도로 검출 체적을 통과한다. 다른 실시형태에서, 개별적인 부분 표본은 약 10Hz와 약 10MHz 사이에서의 속도로 검출 체적을 통과한다. 다른 실시형태에서, 개별적인 부분 표본은 약 0.1kHz와 약 100MHz 사이 혹은 약 1kHz와 약 10MHz 사이 혹은 약 1kHz와 약 5MHz 사이 혹은 약 1kHz와 약 1MHz 사이의 주파수에서 검출 체적을 통과할 수 있다. 특정한 실시형태에서, 부분 표본이 검출 체적을 통과하는 주파수는 적어도 약 0.1kHz이거나, 적어도 약 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800 혹은 900kHz 혹은 적어도 약 1MHz나 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 혹은 100MHz일 수 있다.

여기에 제시된 본 방법의 다른 실시형태에 있어서, 세포의 앙상블로부터의 특성 검출은 단일 세포의 차수이지만 흐름의 도움으로 검출 체적을 통과하는 복수의 세포로 작은 검출 체적으로부터 시간에 걸쳐서("누적하여") 발할 수 있다. eDAR의 누적 모드는 연속적인 신호나 단일의 생입자로부터 발하는 프레임의 시간 경과 오버레이(Overlay)와 구별되며, 단일 생입자의 시간 경과 오버레이는 생입자의 앙상블을 구성하지 않는다. 동시적인 경우와 누적적인 경우 양자에 있어서, 세포의 앙상블로부터 특성이 검출된 이후에만 결정이 제공된다.

여기에 제시된 본 방법의 또 다른 실시형태에서, 부분 표본은 검출에 앞서 물리적으로 분리될 수 있다. 예를 들면, 이는 공기나 연속적인 오일과 섞이지 않는 유체 상태에 의해 분리된 개별적인 물 같은 부분 표본으로, 예컨대 작은 물방울로 샘플 유체를 분할함으로써 달성될 수 있다.

일 실시형태에서, 물 같은 부분 표본을 분리하기 위해 사용되는 섞이지 않는 상으로는 유기체 상태, 기름, 미네랄 기름과 콩유와 같은 천연 기름, AR-20, AS-4, PDMS 기름과 같은 실리콘 기름, 플루오리너트(Fluorinert) 및 페르플루오로데칼린(Perfluorordecalin), 헥사데케인(Hexadecane) 및 아세토페논(Acetophenone)과 같은 유기 용매, 왁스, 공기 혹은 가스가 포함될 수 있다.

특정한 실시형태에서, 섞이지 않는 상태는 연속적이거나(즉, 개별적인 부분 표본들을 완전히 둘러쌈) 분할될 수 있다(즉, 개별적인 부분 표본들 사이의 간격만을 차지하지만, 부분 표본을 완전하게 둘러싸지는 않음).

예를 들면, 도 16은 개별적인 부분 표본을 전체로 둘러싸는 섞이지 않는 위상(1642)을 나타낸다.

일 실시형태에서, 개별적인 부분 표본은 작은 물방울이다. 다른 실시형태에서, 개별적인 부분 표본은 플러그이다.

일 실시형태에서, 개별적인 부분 표본은 흐름 채널과 유체 통신하는 흐름 채널에서 eDAR 장치 상에 연속으로 형성될 수 있다.

특정한 실시형태에서, 개별적인 부분 표본은 eDAR 장치의 외부에 형성될 수 있지만, 흐름 채널과 유체 통신하는 튜브, 포트 혹은 상호 접속을 경유하여 장치의 흐름 채널로 흘러갈 수 있다.

일 실시형태에서, 계면 활성제가 개별적인 부분 표본을 안정화시키기 위하여 섞이지 않는 위상이나 세포 부유물에 부가될 수 있다. 계면 활성제는 알부민(보바인(Bovine) 혹은 인간 혈청 알부민), 스팬 80(Span 80), 플루로닉(Pluronic), Octaethylene Glycol Monodecyl Ether, Tetraethylene Glycol Monodecyl Ether, N-dodecyl-N, N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate(DDAPS)와 같은 Zwitterionic Surfactants, Sodium dioctyl sulfosuccinate(AOT)와 같은 Anionic surfactant, cetyl trimethyl ammonium bromide(CTAB)와 같은 Cationic surfactant 및 실리콘 기반의 PEGylated 및 플루오르화 계면 활성제를 포함할 수 있다.

또 다른 실시형태에서, 유체 샘플은 부분 표본으로 분할될 수 있으며, 검출 단계 이전에 eDAR 장치의 챔버나 개별적인 흐름 채널로 물리적으로 분할될 수 있다. 후속의 검출 단계는 이후에 병렬로(즉, 단일 검출 장치나 다중 검출 장치를 이용하여 한번에) 혹은 연속적으로, 예컨대 하나 이상의 검출 체적을 연속적으로 통과하는 개별적인 부분 표본을 안내함으로써 수행될 수 있다.

본 발명의 일부 실시형태에서, 유체 샘플, 예컨대 생체 유체 샘플은 희소 입자의 검출 이전에 안정화될 수 있다. 특정한 실시형태에서, 유체는 시약으로 안정화될 수 있는데, 이것은 구연산염과 같은 항응고제, 헤라핀, EDTA(Ethylenediamine Tetraacetic Acid), DTPA(Diethylenetriamine pentaacetic acid), DCTA(1,2-diaminocyclohexane tetraacetic acid) 혹은 ethylenebis(oxyethylenenitrilo) tetraacetic acid(EGTA), Methylol과 같은 Aldehyde, hydroxymethyl derivatives of amines 혹은 amides of formaldehyde, diazolinidinyl urea, imidazolidinyl urea, methenamine, paraformaldehyde, glutaraldehyde 혹은 glyoxal 등을 포함하지만 여기에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 실시형태에서, 여기에 제시된 방법은 원하는 부분 표본의 채널링 이후에 발생하는 2차적인 프로세스에 추가적으로 결합될 수 있다. 여기에 제시된 방법에 결합 가능한 기능 및/또는 프로세스의 예로는, 예컨대 세포 내용물(예를 들면, DNA, RNA, 마이크로RNA, 지질, 대사 물질, 탄수화물 혹은 세포 내 포위된 단백질)을 식별하기 위한 선택적인 반응이 포함된다. 이들 반응은 PCR(Polymerase Chain Reaction), RT-PCR(Real-Time Polymerase Chain Reaction), 등온 PCR, RNA의 후성적 상태를 결정하기 위한 반응, 마이크로RNA 및 siRNA 내용물을 결정하기 위한 단분자 혼성 반응 혹은 앱타머(DNA의 짧은 가닥)-선택적인 반응을 포함한다.

특정한 실시형태에서, 여기에 제시된 방법은 부분 표본이나 세포 격리에 뒤따르는 측정(Assay) 프로토콜에 추가적으로 결합될 수 있다. 여기에 제시된 방법에 결합 가능한 측정의 비제한적인 예로는 RNA 추출(증폭하거나 증폭하지 않음), cDNA 합성(역전사), 유전자 마이크로어레이(Microarray), DNA 추출, PCR(Polymerase Chain Reaction)(단일, 네스트형(Nested), 양적 실시간 혹은 링커-어댑터(Linker-adapter))이나 DNA-메틸화 반응 분석과 같은 핵산 기반의 방법들, FISH(Fluorescence in situ hybridization), 레이저 포획 현미해부, 유동 세포 계수법, FACS(Fluorescence activated cell sorting), 세포 배양 혹은 CGH(Comparative genomic hybridization) 연구와 같은 혈구 계산법, ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)나 Southern blot 분석, 전기 이동과 같은 화학적 측정, 마이크로 RNA 및 siRNA 내용물을 결정하기 위한 측정, DNA/RNA 내용물을 결정하기 위한 측정, 지질 내용물을 결정하기 위한 측정, 탄수화물 내용물을 결정하기 위한 측정, 대사 물질 내용물을 결정하기 위한 측정, 단백질 내용물을 결정하기 위한 측정 및 기능적 세포 측정(예컨대, 세포사멸 측정, 세포 이동 측정, 세포 확산 측정, 세포 분화 측정 등) 및 기타가 포함된다.

또 다른 실시형태에서, 여기에 제시된 방법은 예컨대 선택된 부분 표본에 존재하는 희소 입자를 추가적으로 격리하거나 구획하기 위하여 유동 세포 계수법에 더욱 결합될 수 있다. 일 실시형태에서, 여기에 제시된 방법에 대해 사용되는 eDAR 장치의 채널은 유동 세포 계수기와 유체 통신할 수 있다. 특정한 실시형태에서, 유동 세포 계수법과 eDAR의 결합은 선택된 부분 표본들이 희소 입자나 세포의 수를 더욱 풍성하게 하기 위하여 추가적으로 검사되거나 연속적으로 분류될 수 있도록 한다. 여기에 제시된 방법의 특정한 실시형태에서, 이러한 구성은 희소 입자나 세포의 상향 그로스 분류(Upstream Gross-Sorting)를 가능하게 하며, 시간, 비용 및/또는 노동 집약적인 유동 세포 계수법과 같은 하향 프로세스(Downstream Process)로 희소 입자나 세포를 포함하는 부분 표본을 안내하기만 한다.

특정한 실시형태에서 여기에 제시된 방법은 여기에 제시된 eDAR 장치를 이용하여 수행 가능하다.

1. 유리한 특징들

전술한 바와 같이, 부분적으로는 개별 세포나 입자보다 전체 부분 표본의 순위와 앙상블 검출로 인하여, eDAR 기술은 현재 채용되는 전통적인 유동 세포 계수법보다 훨씬 더 신속하고 비용이 적게 든다. 몇 가지 특징들이 개선된 eDAR 방법론에 기여한다.

예컨대, 여기에 제시된 방법의 일 실시형태에서 부분 표본은 하나보다 많은 입자, 세포 혹은 형광 독립체를 포함한다. 이와 관련하여, 단일 세포나 입자 혹은 1차원 시트의 세포나 입자보다 복수의 세포나 입자를 포함하는 별개의 체적이 동시에 조사될 수 있다.

여기에 제시된 본 방법의 관련된 실시형태에서, 유체의 입자나 세포는 검출 지점이나 체적에 연속적으로(즉, 중첩하는 존재 없이 하나씩) 들어갈 필요는 없다. 관련된 실시형태에서, 입자는 단일 행이나 시트에서 검출 지점이나 체적으로 들어갈 필요가 없다. 따라서, 여기에 제시된 방법의 일 실시형태에서 단일의 부분 표본 내 복수의 생입자는 예컨대 조사 및/또는 검출 체적을 흐름 채널의 단면 체적이나 단면적을 통해 한번에 통과할 수 있다.

여기에 제시된 본 방법의 일 실시형태에서, 쉬스 흐름(Sheath Flow), 가이딩 버퍼(Guiding Buffer) 혹은 다른 유체 역학이나 기하학적인 초점 메커니즘은 조사 및/또는 검출을 위한 단일 행으로 생입자를 초점 맞출 필요가 없다.

여기에 제시된 본 방법의 일 실시형태에서, 완전한 부분 표본의 순위 체계나 값 할당 체계는 개별 생입자를 분류하는 것 대신에 채용된다.

여기에 제시된 본 방법의 일 실시형태에서, 입자나 세포의 앙상블은 예컨대 더 큰 유체 샘플의 단일 부분 표본으로서 동시에 검출된다. 관련된 실시형태에서, 부분 표본에 대해 이루어진 결정은 부분 표본 내 포함되는 세포나 입자의 전체 앙상블에 영향을 미친다. 또 다른 관련된 실시형태에서, 부분 표본 내 동시에 검출된 세포나 입자의 앙상블은 입자나 세포의 앙상블로서 남을 것이다.

2. 부분 표본 순위

여기에 제시된 본 방법의 일 실시형태에서, 부분 표본은 해당 부분 표본이 희소 입자를 포하하지 않는다면 제 2 값을, 부분 표본이 희소 입자를 포함한다면 제 1 값을 할당받는다. 특정한 실시형태에서, 순위(즉, 값의 할당)는 이진수이다. 예컨대, 적어도 하나의 희소 입자를 포함하는 각 부분 표본은 1의 값을 할당받는 반면에, 희소 입자를 포함하지 않는 각 부분 표본은 0의 값을 할당받는다.

여기에 제시된 본 방법의 다른 실시형태에서, 부분 표본은 부분 표본에 존재하는 희소 입자의 양에 따라 값을 할당받는다. 예컨대, 4개의 희소 입자를 포함하는 부분 표본은 4의 값을 할당받을 수 있다. 선택적으로, 4개의 입자를 포함하는 부분 표본은 예컨대 0 내지 5개의 입자, 1 내지 10개의 입자, 4 내지 6개의 입자 등 희소 입자 양의 특정한 범위에 대응하는 값을 할당받을 수 있다.

여기에 제시된 본 방법의 또 다른 실시형태에서, 단일의 유체 샘플에 하나보다 많은 유형의 희소 입자가 존재하는 경우, 부분 표본은 해당 부분 표본 내 어떤 희소 입자의 실체에 따라서라도 값을 할당받는다. 예컨대, 유체 샘플이 2개의 희소 입자 A 및 B를 포함하는 경우, A도 B도 포함하지 않는 부분 표본은 0의 값을 할당받을 수 있고, A만 포함하는 부분 표본은 1의 값을 할당받을 수 있으며, B만을 포함하는 부분 표본은 2의 값을 할당받을 수 있고, A와 B 양자를 포함하는 부분 표본은 3의 값을 할당받을 수 있다. 따라서, 여기에 제시된 본 방법의 일 실시형태에서, 하나보다 많은 유형의 희소 입자가 단일의 유체 샘플 내에 존재하는 경우 순위(즉, 값의 할당)는 이진수가 아니다.

특정한 실시형태에서, 널(Null)이 아닌 할당 값은 희소 입자의 농도나 희소 입자의 실체 중 어느 하나에 의존할 수 있다.

특정한 실시형태에서, 동일한 할당값을 갖는 복수의 부분 표본은 함께 모으거나 채널링한다.

본 발명의 방법에 따른 일 실형태에서, 부분 표본에 값을 할당하거나 순위를 매기기 위해서 능동적인 결정이 요구된다. 특정한 실시형태에서, 컴퓨터, 컨트롤러, 집적 회로를 갖는 칩, 회로 보드, 전자 소자, 소프트웨어 및/또는 알고리즘을 사용하여 값을 부분 표본에 할당하거나 순위를 매긴다.

3. 부분 표본 채널링 및 유체 흐름

본 발명의 특정한 실시형태에서, 부분 표본의 집합이나 흐름을 안내하는 것은 부분 표본에 할당된 값에 기초한다. 예컨대, 일 실시형태에서 유체 샘플에 단일 유형의 희소 입자가 존재하는 경우, 널이나 "0"값을 할당받는 부분 표본은 제 1 채널(채널링됨)이나 폐기 출구로 안내될 수 이TRh, 양이나 "1" 값을 할당받는 부분 표본은 제 2 채널이나 집합 챔버로 안내될 수 있다.

본 발명의 다른 실시형태에서, 하나보다 많은 유형의 희소 입자가 유체 샘플 내에 존재하는 경우, 부분 표본은 해당 부분 표본 내 존재하는 희소 입자의 특정한 구성에 기초하여 채널링될 수 있다. 일 실시형태에서, 희소 입자가 없는 부분 표본은 제 1 채널이나 폐기 출구로 안내될 수 있고, 제 1 유형의 희소 입자를 포함하는 부분 표본은 제 2 채널이나 제 1 집합 챔버로 안내될 수 있으며, 제 2 유형이나 희소 입자를 포함하는 부분 표본은 제 3 채널이나 제 2 집합 챔버로 안내될 수 있다.

특정한 실시형태에서, 특정한 흐름 채널이나 집합 챔버로 하나보다 맣은 유형의 희소 입자를 포함하는 부분 표본이 안내될 수 있다. 선택적으로, 부분 표본은 혼합 혹은 희석 챔버로 안내될 수 있고, 이후에 그 혼합되거나 희석된 부분 표본은 하위 부분 표본으로 추가 분할되어 희소 세포가 다른 하위 부분 표본으로 나누어지도록 할 수 있다. 하위 부분 표본 내 희소 세포는 이후 희소 세포가 상호 분리될 수 있도록 다시 검출될 수 있다.

여기에 제시된 본 방법의 일 실시형태에서, 부분 표본의 집합이나 흐름을 안내하는 채널링 단계는 외부적 필드의 사용이나 흐름 방해를 형성함으로써 수행될 수 있다.

본 발명의 일 측면에서, 일단 부분 표본이 순위 매겨지고 나면, 외부적 필드는 부분 표본 방향을 변경하기 위하여 사용될 수 있다. 그러한 필드는 전기장, 자기장, 동전기적, 전기 영동적, 유전 이동적, 수력학적, 중력적, 기학적 혹은 광학적 힘을 포함할 수 있다. 선택적으로 외부적 흐름 방해는 공기, 섞이지 않는 유기 액체나 마이크로비드와 같은 세포 부유물과 섞이지 않는 물질을 도입하여 유도될 수 있다.

특정한 실시형태에서, 흐름은 예컨대 수력학적인 유체 압력을 유도하는 방법 및 장치에 의해 전달될 수 있으며, 이는 기계적 원리(예컨대, 외부 시린지 펌프, 공기막 펌프, 진동막 펌프, 진공 장치, 원심력 및 모세관 동작), 전기나 자기적 원리(예컨대, 전기삼투 흐름, 동전기 펌프 압전소자/초음파 펌프, 자성유체 플러그, 전기 수력학 펌프 및 자기 수력학 펌프), 열역학적인 원리(예컨대, 가스 방울 생성/위상-변화-유도 체적 팽창), 표면 젖음 원리(예컨대, 전기 젖음, 화학적으로, 열적으로, 그리고 방사능적으로 유도된 표면 장력 그래디언트) 및 기타에 기반하여 동작하는 것을 포함하지만 여기에 한정되는 것은 아니다.

또 다른 실시형태에서, 유체는 중력 공급, 표면 장력(모세관 동작 등), 정전기력(동전기적 흐름), 원심 흐름(CD 상에 배치되어 회전하는 기판), 자기력(오실레이션하는 이온이 흐름을 유발함), 자기 수력학적인 힘과 진공 혹은 압력 차동에 의하여 제공되는 유체 구동력에 의해 전달되거나 채널링될 수 있다.

특정한 실시형태에, 수력학적인 유체 압력이나 유체 구동력을 유도하기 위한 방법 및 장치와 관련하여 열거한 것들과 같은 유체 흐름 제어 장치는 본 주제의 입구 포트나 출구 포트에 결합될 수 있다. 일 예에서, 복수의 포트는 입구나 출구 중 하나 혹은 양자에서 제공되며, 하나 이상의 포트가 유체 흐름 제어 장치에 결합된다.

B. 진단 및 예상 방법

일 측면에서, 본 발명은 예컨대 혈액 샘플과 같은 생체액 등의 유체 샘플 내 희소 입자의 존재와 연계된 조건에 대하여 대상체에 진단이나 예상(Prognosis)을 대상체에 제공하기 위한 방법을 제공한다.

일 실시형태에서 본 발명은 (a) 생체액의 부분 표본 내 희소 입자의 존재나 부재를 검출하는 단계, (b) 희소 입자의 존재나 부재에 기초하여 부분 표본에 값을 할당하는 단계 및 (c) 할당값에 기초하여 부분 표본의 흐름이나 집합을 안내하는 단계를 포함한다.

다른 실시형태에서, 본 방법은 (a) 검출 시약과 희소 입자를 포함하는 복합체로 상기 검출 시약을 변환하기에 적합한 조건하에서 상기 검출 시약과 상기 대상체로부터의 생체액을 접촉하는 단계; (b) 상기 생체액의 부분 표본에 있어서 상기 (a) 단계에서 형성된 복합체의 존재나 부재를 검출하는 단계; (c) 상기 (a) 단계에서 형성된 복합체의 존재나 부재에 기초하여 상기 부분 표본에 값을 할당하는 단계; 및 (d) 상기 할당된 값에 기초하여 상기 대상체에 진단이나 예상을 제공하는 단계를 포함한다.

다른 실시형태에서, 희소 입자의 존재를 검출하는 단계는 (ⅰ) 전자기 방사의 외부 소스로 부분 표본을 조사하는 하위 단계 및 (ⅱ) 희소 입자의 형광을 검출하는 하위 단계를 포함한다.

100년이 넘도록, 의사는 세포를 혈액에 흘려서 암이 확산하는 것으로 이해하였다. 혈액이 기관마다 암세포를 운반하고, 암이 전이한다. 이러한 묶이지 않은 종양 세포는 순환 종양 세포(CTC)라 한다. 일 측면에서, 본 발명은 주변 혈액으로부터 이러한 아세포를 계수하고 격리하기 위한 정확한 방법을 제시한다.

혈액 내 CTC의 정확한 검출은 역시 존재하는 적혈구와 백혈구의 천문학적인 수로 인해 상당히 어려운 것으로 판명되고 있다. 50조개의 적혈구 세포와 500만개의 백혈구 세포만큼 많은 수가 함께 존재하여 단일 CTC를 가리면서, CTC를 검출하는 문제는 그야말로 건초더미에서 바늘을 찾는 것이다.

혈액 내 암세포의 수를 정확하게 계수함으로써, 본 발명은 암 확산 프로세스의 실시간 스냅샷을 제시한다. 종래의 예상 도구(예컨대, 림프 노드의 상태, 종양 크기 및 형태지표적 특성)와 CTC 혈액 검사의 가장 큰 차이점은 CTC 혈액 검사가 암 치료의 효용성 여부에 대한 조기 피드백을 제공하는데 이용될 수 있다는 점이다. 6개월 화학 요법을 받는 환자는 매 3-4주마다 측정된 CTC 카운트를 가질 수 있으며, 만약 카운트가 높게 유지된다면 종약학자가 현재의 치료는 효과적이지 못하다고 보고 새로운 약물을 처방할 수 있다. 환자의 관점에서 보면, CTC 검사를 하는 경우 (1) 약물당 약 $3,000 내지 $10,000/월 사이의 비용이 들 수 있는 비효과적인 화학 요법을 제거함으로써 상당한 절약을 제공할 수 있고, (2) 너무 늦기 전에 효과적인 치료법을 찾기 위하여 소중한 기회를 허용할 수 있다는 점이다. 이러한 사유들은 그것만으로도 종양학자가 루틴하게 고비용의 방사선 이미지 스캔(예컨대, CT나 MRI)을 처방하기에 충분한 중요성을 갖는다. 그러나, 일 측면에서 본 발명은 신속하고 더 저렴하고 더 안전하고 더욱 재현성 있으면서 비싸지 않은 CTC 검사를 제공하며, 방사선 이미지 스캔보다 6주 빨리 더 정확하지는 않더라도 동일한 예후 정보를 제공한다. 유사한 이점들을 제공하는 가용한 생체지표 테스트는 현재 존재하지 않는다.

검출되는 암세포의 고감도로 인해, 여기에 기술하는 방법은 그 농도가 경쟁 기술의 더 낮은 검출 한계에 도달하기 전에 암세포를 검출하는 잠재력을 제공한다. 이는 여기에 제시된 방법이 경쟁 기술보다 더 신속하게 유의미한 결과를 낳을 수 있음을 의미한다. 결과적으로, 스테이지 Ⅳ 전이암에 대해 본 기술의 이용을 제한하는 것 대신에, 종약학자들은 예컨대 암의 증상을 아직 나타내지 않는 일반 공중에게 여기에 제시된 본 방법의 사용을 주기적으로 처방함으로써, 조기 진단(즉, 스테이지 Ⅲ, 스테이지 Ⅱ, 스테이지 Ⅰ, 혹은 전이성이나 전(前)암 증상)을 위하여 그 용법을 확장할 수 있다. 일반적으로 건강한 사람들은 혈액에 CTC를 전혀 갖지 않으며, 만약 본 발명을 이용하여 예상치 못한 환자에게 CTC가 검출된다면 추가적인 검사(예컨대, CT, MRI)를 처방하여 종양의 위치를 파악하고 그 상태를 확진할 수 있다.

다른 실시형태에서, 본 발명을 이용하여 격리된 종양세포는 맞춤형 치료를 개발하기 위하여 소집단 분석(예컨대, 유전자형이나 표현형에 따라)을 추가적으로 거칠 수 있다. 예로서, 격리된 종양세포는 약물 대상의 표현 정도나 존재를 결정하기 위하여 특정한 약물 대상에 바인딩하는 형광 항체와 함께 배양될 수 있다. 약물 대상의 표현이 확인되고 나면, 종양학자는 그 표현을 타게팅하기 위해 특별하게 개발된 약물들 중에서 선택하도록 확신할 수 있다. 일 예에서, 격리된 종양세포는 CTC를 떨어뜨리는 유선종양이 Her2-양성인지 여부를 결정하기 위해 Her2 수용기에 특별하게 바인딩하는 형광 항체로 배양될 수 있다. 만약 격리된 종양세포가 높은 Her2 표현을 나타낸다면, 종양학자는 Herceptin(trastuzumab)을 처방할 수 있는데, 이 약물은 HER2 단백질 과도표현(Overexpression)의 기능을 대상으로 차단하도록 설계되어 있기 때문이다. BCR-ABL 혹은 PDGFR(약물 Gleevec에 의해 타게팅됨), ERBB2(Herceptin에 의해 타게팅됨), EFGR(Iressa, Tarceva에 의해 타게팅됨), RAR-alpha(ATRA에 의해 타게팅됨), Oestrogen 수용기(Tamoxifen에 의해 타게팅됨), aromatase(Letrazole에 의해 타게팅됨), androgen 수용기(Flutamide, Biclutamide에 의해 타게팅됨), CD20(Rituximab에 의해 타게팅됨), VEGF-수용기(Avastin에 의해 타게팅됨)를 포함하여 다른 알려진 약물 대상 또한 적절한 화학요법 식이요법을 처방하기 전에 격리된 종양세포로부터 마찬가지로 검사될 수 있다.

특정한 실시형태에서, 희소 입자는 암세포이거나 순환 종양세포(CTC)이다. 다른 실시형태에서, 희소 세포는 예컨대 지아르디아 혹은 크립토스포리듐의 종, 플라스모듐의 종으로 감염된 적혈구, HIV 감염된 림프구나 백혈구, 모혈 내 태아 세포, 줄기세포, 프리온 감염 세포, CD4+ T-세포 등 기생 세포나 조직일 수 있다.

일 실시형태에서, 말라리아를 진단하기 위한 방법이 제시되며, 이 방법은 여기에 제시된 eDAR 방법 및/또는 장치를 이용하여 플라즈모듐으로 감염된 적혈구를 검출하는 단계를 포함한다.

다른 실시형태에서, HIV 감염을 진단하기 위한 방법이 제시되며, 이 방법은 여기에 제시된 eDAR 방법 및/또는 장치를 이용하여 HIV 바이러스로 감염된 림프구나 백혈구를 검출하는 단계를 포함한다.

또 다른 실시형태에서, 프리온과 연관된 질병을 진단하기 위한 방법이 제시되며, 이 방법은 여기에 제시된 eDAR 방법 및/또는 장치를 이용하여 사람이나 다른 동물(예컨대, 소)로부터의 생체액 내 프리온을 검출하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 프리온과 연관된 질병은 광우병이다.

1. 암 진단

하나의 특정한 실시형태에서, 본 방법은 여기에 제시된 eDAR 방법 및/또는 장치를 이용하여 대상체로부터의 혈액 샘플 내 순환 종양 세포를 검출하는 단계를 포함한다. 특정한 실시형태에서, 대상체는 스테이지 Ⅰ, 스테이지 Ⅱ, 스테이지 Ⅲ, 스테이지 Ⅳ 암으로 이전에 진단받았던 환자일 수 있다. 특정한 실시형태에서, CTC가 암으로 이전에 진단받은 환자로부터의 혈액 샘플 내에서 검출되는 경우, 그 환자는 전이암으로 추가 진단받을 수 있다.

일 실시형태에서, 고체 암으로 이전에 진단받은 대상에서 전이암을 진단하기 위한 방법이 제공되며, 이 방법은 (a) 상기 대상으로부터의 혈액 샘플의 부분 표본 내 CTC의 존재나 부재를 검출하는 단계, (b) CTC의 존재나 부재에 기초하여 상기 부분 표본에 값을 할당하는 단계 및 (c) 상기 할당된 값에 기초하여 상기 부분 표본의 흐름이나 집합을 안내하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 혈액 샘플 내 CTC의 부재는 전이암을 갖지 않는 대상과 상호 관계된다. 다른 실시형태에서, 혈액 샘플 내 적어도 하나의 CTC의 존재는 전이암을 갖는 대상과 상호 관계된다. 또 다른 실시형태에서, 혈액 내 CTC의 적어도 기준수의 존재는 전이암을 갖는 대상과 상호 관계된다. 일부 실시형태에서, 본 방법은 (d) 적어도 하나의 CTC가 혈액 샘플 내에서 검출된다면 대상이 전이암을 갖는 것으로 진단하거나 혈액 샘플 내 CTC가 검출되지 않는다면 전이암을 대상이 갖지 않는다고 진단하는 단계를 더 포함할 수 있다.

관련된 실시형태에서, 암으로 진단된 대상을 감시하기 위한 방법이 제공되며, 여기에 제시된 eDAR 방법을 이용하여 상기 대상으로부터의 혈액 샘플의 부분 표본 내 CTC의 존재나 부재를 검출하는 단계를 포함한다. 특정한 실시형태에서, 환자는 예컨대 적어도 일년에 한번, 적어도 일년에 두번 혹은 적어도 일년에 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회나 그 이상의 정규 구간에서 전이암으로의 암 발전에 대해 감시될 수 있다. 일부 실시형태에서, 대상은 약 한달에 한번, 한달에 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회나 그 이상 감시될 수 있다. 일 실시형태에서, 혈액 샘플 내 CTC의 부재는 전이암을 갖지 않는 대상과 상호 관계된다. 다른 실시형태에서, 혈액 샘플 내 적어도 하나의 CTC의 존재는 전이암을 갖는 대상과 상호 관계된다. 또 다른 실시형태에서, 혈액 내 CTC의 적어도 기준수의 존재는 전이암을 갖는 대상과 상호 관계된다. 일부 실시형태에서, 본 방법은 (d) 적어도 하나의 CTC가 혈액 샘플 내에서 검출된다면 대상이 전이암을 갖는 것으로 진단하거나 혈액 샘플 내 CTC가 검출되지 않는다면 전이암을 대상이 갖지 않는다고 진단하는 단계를 더 포함할 수 있다.

CTC가 혈액 샘플 내에서 검출되는 실시형태에서, 본 방법은 CTC 세포나 세포들의 하나 이상의 특성을 식별하기 위하여 CTC를 포함하는 것으로 확인된 하나 이상의 부분 표본이 추가적인 분석을 거치도록 하는 단계를 더 포함할 수 있다. 예컨대, CTC를 포함하는 부분 표본들의 집합이나 부분 표본은 하나 이상의 암 특정 표면항원에 대하여 지정된 하나 이상의 검출 시약과 접촉될 수 있다. 어떤 암 특정 항원이 CTC의 표면 상에 존재하는지 결정함으로써, 이후 표현된 표면항원을 대상으로 한 치료가 설계될 수 있다. 분석 가능한 암 특정 표면 항원의 제한적이지 않은 예로는, 한계 없이, BCR-ABL 혹은 PDGFR(약물 Gleevec에 의해 타게팅됨), ERBB2(Herceptin에 의해 타게팅됨), EFGR(Iressa, Tarceva에 의해 타게팅됨), RAR-alpha(ATRA에 의해 타게팅됨), Oestrogen 수용기(Tamoxifen에 의해 타게팅됨), aromatase(Letrazole에 의해 타게팅됨), androgen 수용기(Flutamide, Biclutamide에 의해 타게팅됨), CD20(Rituximab에 의해 타게팅됨), VEGF-수용기(Avastin에 의해 타게팅됨) 등이 포함된다. 따라서, 특정한 실시형태에서, 본 방법은 CTC 상에 존재하는 특정한 표면항원의 검출에 기초하여 대상의 타겟형 치료를 할당하는 단계를 더 포함할 수 있다.

특정한 실시형태에서, 예컨대 복수의 검출 장치를 이용하여 복합체를 검출하고 CTC의 표면 상에 존재하는 암 특정 항원을 갖는 복합체로 검출 시약을 변환하기에 적합한 조건하에서 복수의 다르게 라벨링된 검출 시약과 집합된 부분 표본들을 접촉하게 함으로써, 여기에 제시된 eDAR 방법을 이용하여 추가적인 분석이 수행될 수 있다.

다른 실시형태에서, 면역화학적인 방법(예컨대, 면역 블롯법, ELISA, xMAP 멀티플렉스 분석 등)이나 전통적인 유동 세포 계수법과 초기 eDAR 방법을 결합함으로써 추가적인 분석이 수행될 수 있다. 특정한 실시형태에서, CTC를 검출하는데 사용되는 eDAR 장치는 추가적인 분석을 수행하기 위하여 제 2 장치나 수단과 유체 통신할 수 있다.

대상이 전이암으로 진단받은 실시형태에서, 본 방법은 대상에 전이암에 대한 치료를 할당하는 단계를 더 포함할 수 있다.

다른 특정한 실시형태에서, 암을 가진 대상을 진단하기 위한 방법이 제시되며, 본 방법은 대상으로부터 취해진 혈액 샘플 내 CTC를 검출하는 단계를 포함한다. 예컨대, 이전에 암으로 진단받지 않은 대상으로부터의 혈액 샘플 내 CTC를 검출하는 것이다. 일부 실시형태에서, 그 대상은 암을 가지거나 키우고 있을 증가된 위험을 가질 수 있으며, 예컨대 그 대상은 암의 가족력을 가지거나 흡연자이거나 그렇지 않으면 발암성 물질(예컨대, 석면, 벤젠, 카드뮴, 라돈, 방사선 및 기타)에 노출되었을 수 있다.

이와 같이, 특정한 실시형태에서 암으로 이전에 진단받지 않은 대상을 감시하기 위한 방법이 제시되며, 본 방법은 (a) 상기 대상으로부터의 혈액 샘플의 부분 표본 내 CTC의 존재나 부재를 검출하는 단계, (b) CTC의 존재나 부재에 기초하여 상기 부분 표본에 값을 할당하는 단계 및 (c) 상기 할당된 값에 기초하여 상기 부분 표본의 흐름이나 집합을 안내하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 혈액 샘플 내 CTC의 부재는 전이암을 갖지 않는 대상과 상호 관계된다. 다른 실시형태에서, 혈액 샘플 내 적어도 하나의 CTC의 존재는 전이암을 갖는 대상과 상호 관계된다. 또 다른 실시형태에서, 혈액 내 CTC의 적어도 기준수의 존재는 전이암을 갖는 대상과 상호 관계된다. 일부 실시형태에서, 본 방법은 (d) 적어도 하나의 CTC가 혈액 샘플 내에서 검출된다면 대상이 전이암을 갖는 것으로 진단하거나 혈액 샘플 내 CTC가 검출되지 않는다면 전이암을 대상이 갖지 않는다고 진단하는 단계를 더 포함할 수 있다.

특정한 실시형태에서, 예컨대 (ⅰ) 검출 시약과 희소 입자를 포함하는 복합체로 상기 검출 시약을 변환하기에 적합한 조건하에서 상기 대상체로부터의 생체액을 상기 검출 시약과 접촉하고, (ⅱ) 상기 생체액의 부분 표본에 있어서 상기 (ⅰ) 단계에서 형성된 복합체의 존재나 부재를 검출하거나, 혹은 (ⅰ) 전자기 방사의 외부 소스로 상기 부분 표본을 조사하고, (ⅱ) 상기 희소 입자의 형광을 검출하는 것에 의하여, 전술한 바와 같이 CTC의 존재나 부재를 검출하는 단계가 수행될 수 있다.

2. 예상을 제공하기 위한 방법

일 측면에서, 본 발명은 생체액 내 희소 입자의 존재와 연관된 상태나 질병에 대한 예상(예후)을 제공하기 위한 방법을 제시한다. 일 실시형태에서, 본 방법은 (a) 대상으로부터의 생체 샘플의 부분 표본 내 희소 입자의 존재나 부재를 검출하는 단계, (b) 상기 희소 입자의 존재나 부재에 기초하여 상기 부분 표본에 값을 할당하는 단계, (c) 상기 할당된 값에 기초하여 상기 부분 표본의 흐름이나 집합을 안내하는 단계 및 (d) 희소 입자가 상기 샘플 내에서 검출된다면 좋지 못한 예상을 하거나 상기 샘플 내에서 희소 입자가 검출되지 않는다면 좋은 예상을 제공하는 단계를 포함한다.

다른 실시형태에서, 부분 표본은 해당 부분 표본 내 희소 입자의 실체나 양에 기초하여 값을 할당받는다. 특정한 이들 실시형태에서, 좋거나 그렇지 못한 예후는 상기 샘플 내 희소 입자의 양에 기초하여 제공된다. 예컨대, 일 실시형태에서는 만약 상기 샘플 내 희소 입자의 양이 소정의 기준값보다 작으면 좋은 예후를 제공하고 만약 상기 샘플 내 희소 입자의 양이 기준값보다 크거나 같으면 나쁜 예후를 제공한다.

특정한 실시형태에서, 소정의 기준값은 예컨대 적어도 6개월 혹은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20년 혹은 그 이상의 시간 구간 동안 질병 없이 생존하거나 특정한 치료 혹은 전부에 반응할 가능성과 연관될 수 있다.

특정한 실시형태에서, (ⅰ) 검출 시약과 희소 입자를 포함하는 복합체로 상기 검출 시약을 변환하기에 적합한 조건하에서 상기 대상체로부터의 생체액을 상기 검출 시약과 접촉하고, (ⅱ) 상기 생체액의 부분 표본에 있어서 상기 (ⅰ) 단계에서 형성된 복합체의 존재나 부재를 검출하거나, 혹은 (ⅰ) 전자기 방사의 외부 소스로 상기 부분 표본을 조사하고, (ⅱ) 상기 희소 입자의 형광을 검출하는 것에 의하여, 전술한 바와 같이 희소 입자의 존재나 부재를 검출하는 단계가 수행될 수 있다.

특정한 실시형태에서, 여기에 제시된 방법은 희소 입자와 연관된 어떤 질병에 대한 예상을 제공하기 위하여 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 말라리아에 대한 예상을 제공하기 위한 방법이 제시되며, 이 방법은 여기에 제시된 eDAR 방법 및/또는 장치를 이용하여 개인으로부터의 혈액 샘플 내 플라즈모듐으로 감염된 적혈구의 수를 결정하는 단계 및 만약 혈액 샘플 내 검출된 감염된 적혈구의 총 수가 소정의 기준값보다 작으면 좋은 예후를 제공하거나 만약 샘플 내 검출된 감염 적혈구의 총 수가 기준값보다 크거나 같으면 나쁜 예후를 제공하는 단계를 포함한다.

다른 실시형태에서, HIV 감염에 대한 예후를 제공하기 위한 방법이 제시되며, 이 방법은 여기에 제시된 eDAR 방법 및/또는 장치를 이용하여 개인으로부터의 혈액 샘플 내 HIV 바이러스로 감염된 림프구나 백혈구의 수를 결정하는 단계 및 만약 혈액 샘플 내 검출된 감염된 세포의 총 수가 소정의 기준값보다 작으면 좋은 예후를 제공하거나 만약 샘플 내 검출된 감염 세포의 총 수가 기준값보다 크거나 같으면 나쁜 예후를 제공하는 단계를 포함한다.

또 다른 실시형태에서, 프리온과 연관된 질병에 대한 예후를 제공하기 위한 방법이 제시되며, 이 방법은 여기에 제시된 eDAR 방법 및/또는 장치를 이용하여 대상체로부터의 생체액 샘플 내 프리온의 수를 결정하는 단계 및 만약 샘플 내 검출된 프리온의 총 수가 소정의 기준값보다 작으면 좋은 예후를 제공하거나 만약 샘플 내 검출된 프리온의 총 수가 기준값보다 크거나 같으면 나쁜 예후를 제공하는 단계를 포함한다.

특정한 실시형태에서, 소정의 기준값은 특정한 치료에 반응할 가능성이나 전부 혹은 예컨대 적어도 6개월이나 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20년 혹은 그 이상의 시간 구간 동안 질병 없는 생존의 가능성과 연관될 수 있다.

특정한 실시형태에서, 본 발명은 고체 종양으로 진단받은 대상에 대한 예후를 제공하기 위한 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 본 방법은 (a) 상기 대상으로부터의 혈액 샘플의 부분 표본 내 CTC의 존재나 부재를 검출하는 단계, (b) CTC의 존재나 부재에 기초하여 상기 부분 표본에 값을 할당하는 단계; (c) 상기 할당된 값에 기초하여 상기 부분 표본의 흐름이나 집합을 안내하는 단계; 및 (d) CTC가 검출되지 않는다면 좋은 예후를 제공하거나 CTC가 검출된다면 나쁜 예후를 제공하는 단계를 포함한다.

다른 실시형태에서, 전이암으로 진단받은 대상에 대한 예후를 제공하기 위한 방법이 제공되며, 본 방법은 (a) 상기 대상으로부터의 혈액 샘플의 부분 표본 내 CTC의 존재나 부재를 검출하는 단계, (b) CTC의 존재나 부재에 기초하여 상기 부분 표본에 값을 할당하는 단계; (c) 상기 할당된 값에 기초하여 상기 부분 표본의 흐름이나 집합을 안내하는 단계; 및 (d) 혈액 샘플 내 검출된 CTC의 총 수가 소정의 기준값보다 작으면 좋은 예후를 제공하거나 샘플 내 검출된 CTC의 총 수가 기준값보다 크거나 같다면 나쁜 예후를 제공하는 단계를 포함한다.

특정한 실시형태에서, 소정의 기준값은 특정한 치료에 반응할 가능성이나 전부 혹은 예컨대 적어도 6개월이나 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20년 혹은 그 이상의 시간 구간 동안 질병 없는 생존의 가능성과 연관될 수 있다.

3. 치료에 대한 반응이나 질병 진행의 감시

다른 측면에서, 본 발명은 치료에 대한 반응이나 질병의 진행을 감시하기 위한 방법을 제공하며, 이 방법은 여기에 제시된 eDAR 방법 및/또는 장치를 이용하여 유체 샘플 내 희소 입자를 검출하는 단계를 포함한다.

일 실시형태에서, 본 방법은 (a) 제 1 시간에 대상체로부터 취해진 제 1 생체 샘플의 복수의 부분 표본 내 희소 입자의 존재나 부재를 검출하는 단계; (b) 상기 희소 입자의 존재, 부재, 양 혹은 실체에 기초하여 상기 부분 표본에 값을 할당하는 단계; (c) 상기 제 1 샘플로부터의 모든 부분 표본의 총 값을 결정하는 단계; (d) 제 2 시간에 상기 대상체로부터 취해진 제 2 생체 샘플의 복수의 부분 표본 내 상기 희소 입자의 존재나 부재를 검출하는 단계; (e) 상기 희소 입자의 존재, 부재, 양 혹은 실체에 기초하여 상기 부분 표본에 값을 할당하는 단계; (f) 상기 제 2 샘플로부터 모든 부분 표본의 총 값을 결정하는 단계; 및 (g) 상기 제 2 샘플에 할당된 상기 총 값에 상기 제 1 샘플에 할당된 상기 총 값을 비교하는 단계를 포함하며, 상기 제 1 샘플에 비하여 상기 제 2 샘플에 할당된 증가된 값은 질병의 진행 및/또는 치료에 대한 좋지 못한 반응에 상호 연관되고/되거나 상기 제 1 샘플에 비해 상기 제 2 샘플에 할당된 감소된 값은 상기 질병의 후퇴 및/또는 상기 치료에 대한 좋은 반응과 상호 연관된다.

특정한 실시형태에서, 상기 부분 표본은 수집, 추가적인 농축 혹은 추가적인 분석을 위하여 할당된 값에 기초하여 특정한 채널이나 챔버(채널형)로 더욱 안내될 수 있다.

특정한 실시형태에서, 치료에 대한 반응이나 질병 진행을 감시하기 위한 방법은 치료 체계의 개시나 질병의 진단 이후에 정규적인 기반으로 채택될 수 있다. 예컨대, 샘플은 적어도 일년에 한번, 적어도 일년에 두번 혹은 적어도 일년에 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회나 그 이상 대상체로부터 수집될 수 있다. 일부 실시형태의 경우, 대상체는 약 한달에 한번 혹은 한달에 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회나 그 이상 감시될 수 있다.

특정한 실시형태에서, 치료에 대한 나쁜 반응이나 질병의 진행이 발견되는 경우, 본 방법은 투약 체계를 증가시키거나 치료를 할당하거나 치료법 체계를 변경하는 것 등의 단계를 더 포함할 수 있다.

특정한 실시형태에서, 희소 입자와 연관된 질병이나 상태는 암, 말라리아, HIV/에이즈, 프리온 관련 질병이나 기타의 것일 수 있다.

C. 수질을 감시하는 방법

다른 측면에서, 본 발명은 여기에 제시된 eDAR 방법이나 장치를 이용하여 물 샘플 내 하나 이상의 희소 입자 오염물을 검출함으로써 수질을 감시하기 위한 방법을 제공한다.

일 실시형태에서, 본 방법은 (a) 수원으로부터 취해진 샘플의 부분 표본 내 물 오염물의 존재나 부재를 검출하는 단계; (b) 부분 표본 내 물 오염물의 존재, 부재, 양 혹은 실체에 기초하여 부분 표본에 값을 할당하는 단계; 및 (c) 할당된 값에 기초하여 상기 부분 표본의 흐름이나 수집을 안내하는 단계를 포함하며, 이로써 수원의 품질이 본 방법에서 검출된 모든 부분 표본들에 할당된 총 값에 기초하여 결정된다.

특정한 실시형태에서, 수원은 호수, 수영장, 강, 개울 혹은 기타 물의 자연적인 몸체일 수 있다. 이들 특정한 실시형태에서, 인간이 만든 물체나 활동이 물의 인체에 대해 가질 영향을 결정하거나 예측하기 위하여 혹은 인구에 마시는 물을 공급하도록 물의 본체를 이용하는 가능성이나 안전성을 평가하기 위하여 물을 검사할 수 있다.

다른 실시형태에서, 수원은 수영장이나 정수처리장, 저수지, 수탑 혹은 인구에 마시는 물을 공급할 목적으로 수집된 다른 물의 본체일 수 있다. 이들 특정한 실시형태에서, 물은 인구에 마시는 물을 공급하기 위하여 물의 본체를 이용하는 가능성이나 안전성을 평가하기 위해 검사될 수 있다.

특정한 실시형태에서, 여기에 제시된 방법은 예컨대 수탑이나 저수지에서 혹은 정수처리장에서 인구에 마시는 물을 공급하기 위해 사용되는 수원의 품질을 정규적으로 감시하기 위해 사용 가능하다. 그러한 실시형태에서, 수원은 적어도 일년에 한번, 적어도 일년에 두번 혹은 적어도 일년에 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회나 그 이상 감시될 수 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 약 한달에 한번 혹은 적어도 한달에 약 2, 3, 4, 5회나 그 이상 감시될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 물은 일주일에 적어도 한번, 적어도 일주일에 2, 3, 4, 5, 6회나 그 이상 혹은 적어도 날마다 혹은 적어도 하루에 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회나 그 이상 검사될 수 있다.

다른 실시형태에서, 여기에 제시된 방법은 자연 재해(예컨대, 허리케인, 쓰나미나 지진 이후), 사고 혹은 테러 행위 이후에 인구에 마시는 물을 공급하기 위하여 물의 본체를 이용하는 가능성이나 안전성을 결정하기 위해 사용 가능하다.

물의 안전성이나 품질을 감시하거나 검사하는 방법은 예컨대 지아르디아, 크립토스포리듐의 종과 같은 기생충이나 기타 유기 혹은 비유기 물 오염물로서 적은 양으로 존재하는 경우 공중 보건에 위험을 가하는 것과 같은 물 오염물인 희소 임자의 검출을 포함할 수 있다.

D. 장치

일 측면에서, 본 발명은 생체액 내 희소 입자를 검출하기 위한 장치를 제공한다.

일 실시형태에서, 상기 장치는 (a) 적어도 하나의 제 1 입력 채널; (b) 적어도 2개의 출구 채널; (c) 상기 생체액의 부분 표본 내 하나 이상의 희소 입자를 검출할 수 있는 적어도 하나의 검출기; (d) 상기 부분 표본의 흐름을 안내하기 위한 메커니즘; 및 (e) 상기 부분 표본 내 상기 희소 입자의 존재, 부재, 실체, 구성 혹은 양에 기초하여 상기 부분 표본에 값을 할당할 수 있는 랭킹 장치를 구비하고, 상기 컴퓨터는 상기 부분 표본의 흐름을 안내하기 위한 상기 메커니즘 및 상기 검출기와 통신한다.

일부 실시형태에서, 상기 장치는 상기 부분 표본을 조사하기 위한 소스를 더 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 희소 입자나 세포가 고유하게 화학 발광이나 생체 발광을 나타내는 경우, 상기 장치는 상기 부분 표본을 조사하기 위한 소스를 필요로 하지 않을 수 있다.

특정한 실시형태에서, 여기에 제시된 상기 장치는 희소 세포에 대한 의도하지 않은 손상을 최소화하기 위한 설계 특성을 가지고 기판 상에서 미세 제조되고/되거나 벽에 의하여 에워싼 흐름 채널을 포함할 수 있다. 희소 세포의 의도하지 않은 손상을 줄이는 것은 오류적인 환자 진단이나 예상을 유발할 수 있는 부정 오류의 확률을 줄인다. 흐름 채널은 미국특허출원 제2007/0037172호 및 제2008/0248499호에 기술된 바와 같은 최소 스트레스나 손상을 갖는 생체 세포를 배제하기 위하여 유체 역학적으로 설계된 개구(Aperture)를 갖는 채널들을 더 포함할 수 있다. 이와 같은 채널은 전술한 특허출원에서 1차원("1-D") 개구를 갖는 채널이라고 하는데, 이는 세포 배제 프로세스 도중 세포에 의해 체험되는 유체 역학적인 압력을 줄이고, 따라서 세포 용해의 가능성을 줄인다. 1-D 개구를 갖는 채널은 흐름을 추가적으로 다시 안내하고 구획하고 꺽고 분산시켜서 결과적으로 배제의 순간에 세포가 겪는 충격력을 줄이기 위해 미국특허 제2008/0318324호에 기술된 바와 같은 "유출 여과(Effusive Filtration)" 구성에 따라 어레이 내에 전략적으로 배열될 수 있다. 흐름 채널을 둘러싸는 벽은 의료 장치 등급의 폴리머인 생체 적합성 기판 물질로부터 특허협력조약 PCT/US2009/02426호에 기술된 절차에 따른 UV-경화 프로세스를 이용하여 제조될 수 있으며, 이로써 eDAR 장치는 의료 장치 제조를 규율하는 규정을 충족할 것이다.

1. 부분 표본의 흐름을 안내하기 위한 메커니즘

특정한 실시형태에서, 흐름을 안내하기 위한 메커니즘은 만약 부분 표본이 희소 입자를 포함한다면 제 1 출구 채널로, 만약 부분 표본이 희소 입자를 포함하지 않는다면 제 2 출구 채널로 부분 표본의 흐름을 안내한다.

다른 실시형태에서, 흐름을 안내하기 위한 메커니즘은 희소 입자의 실체, 구성 혹은 양에 따라 복수의 출구 채널 중 하나로 희소 입자를 포함하는 부분 표본의 흐름을 안내한다.

특정한 실시형태에서, 부분 표본의 흐름을 안내하기 위한 메커니즘은 전극, 자기 소자, 음향 소자, 전기 구동 소자, 전기장 혹은 자기장을 포함한다.

또 다른 실시형태에서, 부분 표본의 흐름을 안내하기 위한 메커니즘은 하나 이상의 전기 구동 밸브나 피스톤을 포함하며, 상기 밸브나 피스톤은 제 1 접점에서 2개의 출력 채널 및 제 1 입력 채널과 교차하는 적어도 하나의 제 1 지향성 흐름 채널 내 액체의 흐름을 제어한다.

일 실시형태에서, 솔레노이드 피스톤은 전기 구동 솔레노이드 밸브의 하위 컴포넌트이다. 다른 실시형태에서, 솔레노이드 피스톤은 몰딩에 의해 장치 내에 임베드된다. 특정한 실시형태에서, 전극은 유전이동이나 전기 젖음과 같은 현상에 기초하여 부분 표본의 분리를 강화시킬 수 있다.

특정한 실시형태에서, 본 발명의 장치들은 입자, 부분 표본 혹은 유체 샘플의 궤적이나 흐름을 추적 및/또는 조작하기 위한 하나 이상의 음향 소자를 포함할 수 있다. 특정한 실시형태에서, 음향 소자는 압축된 압력파에 대한 세포의 응답에 기초하여 세포 분리를 개선하기 위해 음향 에너지(예컨대, 음파영동, 초음파 혹은 메가소닉파)를 갖는 선택된 입자나 세포의 궤적을 조작하기 위해 사용 가능하다.

다른 실시형태에서, 여기에 제시된 장치는 자기 입자에 의해 바운드되거나 이에 바운드된 희소 입자나 세포의 분리를 위한 자기 소자를 더 구비할 수 있다. 특정한 실시형태에서, 자기 소자는 입자나 세포에 부착된 나노 자기 입자나 마이크로 자기 입자 혹은 세포의 자화율에 기초하여 부분 표본, 입자 혹은 세포의 분리를 강화시킬 수 있다.

특정한 실시형태에서, 여기에 제시된 장치는 선택된 입자나 세포의 궤적을 조작하기 위한 유체 압력 변화, 유속 변화 혹은 일렉트로오스모스틱(Electroosmostic) 흐름 변화를 이용하는 것을 포함할 수 있다.

2. 검출 장치

특정한 실시형태에서, 상기 검출기는 카메라, 전자증배관, CCD 이미지 센서, PMT(Photomultiplier Tube), APD(Avalanche Photodiode), SPAD(Single-photon Avalanche Diode) 혹은 CMOS(Complementary Metal Oxide Semiconductor) 이미지 센서로 구성된 그룹으로부터 선택된다.

특정한 실시형태에서, 여기에 제시된 장치는 부분 표본 내 존재하는 선택된 입자나 세포를 열거하거나 선택 세포의 움직임을 추적하기 위해 광학, 전자, 음향 혹은 자기 검출기를 구비할 수 있다.

일부 실시형태에서, 여기에 제시된 장치나 방법은 다양한 구성의 형광 (단일 혹은 다중 색상) 현미경 이미징을 포함할 수 있으며, 여기에는 브라이트 필드(Bright Field), EPI, 공초점, DIC(Differential Interference Contrast), 다크 필드(Dark Field), 호프만 혹은 위상 콘트라스트가 포함되지만 여기에 한정되는 것은 아니다.

일부 실시형태에서, 여기에 제시된 장치는 복수의 검출 장치, 예컨대 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 혹은 그 이상의 검출 장치를 포함할 수 있다. 복수의 검출 장치는 본 발명의 방법을 수행하기 위해 필요할 수 있으며, 예컨대 유체 샘플 내 하나보다 많은 희소 입자나 세포가 존재하는 경우 하나보다 많은 세포 표식이 서로 다른 세포 타입을 구별하기 위해 사용되거나 복수의 검출 시약이 동시에 검출된다.

3. 조사 장치

특정한 실시형태에서, 여기에 제시된 장치는 부분 표본 내 존재하는 검출 가능한 모이어티를 조사(Interrogate)하거나 자극(Excite)하기 위한 소스를 더 구비할 수 있다. 특정한 실시형태에서, 조사를 위한 소스는 예컨대 레이저(고체상, 다이오드 펌프형(Diode-pumped), 이온 혹은 염료), LED, 램프, 아크 방전(Arc Discharge), 자기 펄스 혹은 자연광원으로부터 선택된다.

일부 실시형태에서, 여기에 제시된 장치는 복수의 조사 장치, 예컨대 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 혹은 그 이상의 검출 장치를 포함할 수 있다. 복수의 조사 장치는 본 발명의 방법을 수행하기 위하여 필요할 수 있으며, 예컨대 유체 샘플 내 하나보다 많은 희소 입자나 세포가 존재하는 경우 하나보다 많은 세포 표식이 서로 다른 세포 유형을 구별하기 위해 사용되거나 복수의 검출 시약이 동시에 검출된다.

4. 랭킹 장치

특정한 실시형태에서, 랭킹 장치는 컴퓨터, 컨트롤러, 집적회로를 갖는 칩, 회로 보드, 전자 소자, 소프트웨어, 알고리즘 혹은 이들의 조합으로부터 선택 가능하다.

5. 흐름 채널 및 챔버

특정한 실시형태에서, 여기에 제시된 장치는 하나 이상의 입력 흐름 채널(즉, 검출 체적으로 부분 표본을 가져오는 채널) 및 하나 이상의 출력 채널(즉, 부분 표본을 검출 체적으로부터 가져가는 채널)을 포함하여 복수의 흐름 채널을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 여기에 제시된 바와 같은 장치는 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100개 혹은 그 이상의 입력 채널과 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100개 혹은 그 이상의 출력 채널의 조합을 구비할 수 있다.

특정한 실시형태에서, 장치는 국부적인 속도를 변경하기 위해 부가적인 유체를 주입하기 위한 메인 채널에 접속하는 다중 흐름 채널을 구비할 수 있다.

일 실시형태에서, 여기에 제시된 장치는 물질로부터 제조된 벽에 의해 둘러싸여진 챔버나 흐름 채널을 구비할 수 있는데, 제한적이지는 않지만 이 물질은 폴리머 물질(polydimethylsiloxane(PDMS), polyurethane-methacrylate(PUMA), polymethylmethacrylate(PMMA), polyethylene, polyester(PET), polytetrafluoroethylene(PTFE), polycarbonate, parylene, polyvinyl chloride, fluoroethylpropylene, lexan, polystyrene, cyclic olefin copolymers, polyurethane, polyestercarbonate, polypropylene, polybutylene, polyacrylate, polycaprolactone, polyketone, polyphthalamide, cellulose acetate, polyacrylonitrile, polysulfone, epoxy polymers, thermoplastics, fluoropolymer, 그리고 polyvinylidene fluoride, polyamide, polyimide), 비유기 물질(유리, 석영, 실리콘, GaAs, 실리콘 질화물), 용융 실리카, 세라믹, 유리(유기성), 금속 및/또는 다른 물질 및 그 조합을 포함한다.

특정한 실시형태에서, 벽 물질은 다공성 막, 모직의 짜여진 혹은 짜여지지 않은 섬유(옷감이나 그물 등), 금속(예컨대, 스테인리스 스틸 혹은 모넬), 유리, 종이 혹은 합성(예컨대, 나일론, 폴리프로필렌, 폴리카보네이트, 패럴린 및 다양한 폴리에스테르), 소결 스테인리스 스틸 및 기타 금속, 그리고 알루미나, 실리카 혹은 카본과 같은 다공성 비유기 물질로 제조 가능하다.

특정한 실시형태에서, 여기에 제시된 장치는 화학적 혹은 생물학적 분자로 사전 처리된 흐름 채널이나 챔버를 구비할 수 있다. 예컨대, 채널이나 챔버는 예컨대 유체 샘플 내 입자의 집합이나 복합체를 방지하거나 줄이는 합성물이나 세포, 희소 입자 등의 유체 샘플 내 입자에 우선적으로 바인드하는 합성물, 유체 샘플 내 입자의 상관성을 줄이거나 방지하기 위한 항응고 복합체로 처리될 수 있다.

일 실시형태에서, 채널이나 챔버 표면은 세포의 달라붙음을 방지하는 복합체나 순환 종양 세포에 우선적으로 바인드하는 복합체, 항응고 복합체로 처리될 수 있다.

특정한 실시형태에서, 채널이나 챔버 표면은 선택 세포, 입자 혹은 분자의 흡착을 돕거나 젖음(Wetting)을 강화하기 위하여 화학적으로 변형될 수 있다. 표면 변형 화학물질은 제한적이지는 않지만 TMCS(trimethylchlorosilane), HMDS(hexamethyldisilazane), (Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane, chlorodimethyloctylsilane, OTS(Octadecyltrichlorosilane) 혹은 γ-methyacryloxypropyltrimethyoxy-silane과 같은 실란, 아크릴산, 아크릴아미드, DMA(dimethylacrylamide), 2-hydroxyethyl acrylate, PVA(polyvinylalcohol), poly(vinylpyrrolidone(PVP),poly(ethylene imine)(PEI), PEG(Polyethylene glycol), epoxy poly(dimethylacrylamide)(EPDMA), 혹은 PEG-monomethoxyl acrylate와 같은 폴리머, Pluronic surfactants, Poly(ethylene glycol)-based (PEG) surfactants, sodium dodecylsulfate(SDS) dodecyltrimethylammonium chloride(DTAC), cetyltriethylammonium bromide(CTAB) 혹은 Polybrene(PB)와 같은 계면 활성 물질, HPC(hydroxypropylcellulose), HPMC(hydroxypropylmethylcellulose)와 같은 Cellulose derivatives, ethylamine, diethylamine, triethylamine 혹은 triethanolamine, PTFE(polytetrafluoroethylene)이나 테플론을 포함하는 것과 같은 플로우린 포함 복합체 등의 아민을 포함할 수 있다.

6. 배경 감소를 위한 수단

특정한 실시형태에서, 여기에 제시된 장치는 신호대 잡음 비율을 개선하고/하거나 과도한 배경 신호를 줄이기 위한 수단을 더 구비할 수 있다. 과도한 배경 신호를 줄이고 신호대 잡음 비율을 줄임으로써, 고도로 희석된 부분 표본조차로부터의 약한 신호가 정확하게 검출될 수 있기 때문에 검출 감도가 강화된다. 다시 말해, 신호대 잡음 비가 더 나은 경우, 더 큰 부분 표본을 스캔할 수 있다. 직접적인 결과로서, 유체 공학적 수율은 더 적은 (그렇지만 더 큰) 부분 표본이 스캔될 필요가 있기 때문에 그에 따라 증가한다.

일 실시형태에서, 배경 신호를 줄이기 위한 수단은 마스크를 포함한다. 마스크는 주기적인 간격을 가지고 혹은 그것 없이 어떤 방향으로도 배치된 어떤 형태와 크기의 어떤 수의 개구라도 포함할 수 있다. 예컨대, 도 3은 개구의 어레이(311)를 포함하는 마스크(301)를 나타내며, 이는 검출 가능한 특성을 통해 선택적으로 가능하도록 검출기와 검출 체적 사이에 배치된다.

특정한 실시형태에서, 마스크는 예컨대 저역 통과, 고역 통과 혹은 대역 통과 필터이거나 음향 광학 모듈레이터, 공간-광 모듈레이터, 광전류 초퍼, 제조형 홀로그램, 물리적 개구 혹은 갈보 스캐너(Galvo Scanner) 등 빛의 특정 파장을 통해 선택적으로 통과하는 광학 소자를 구비할 수 있다.

다른 실시형태에서, 마스크는 자기장의 경로를 선택적으로 막는 자기 소자를 포함할 수 있다.

일부 실시형태에서, 신호대 잡음 비율에 있어서 유사한 이득을 달성하는 다른 장치는 마스크와 결합하여 혹은 그 대신에 사용될 수 있다. 예컨대, 특정한 실시형태에서 락인(Lock-in) 증폭기, 스캐닝 검출기, 모듈레이티드 질문기나 검출기 혹은 주파수나 강도를 변조하는 어떤 장치로부터라도 선택되는 장치는 신호대 잡음 비율을 증가시키기 위하여 사용될 수 있다.

또 다른 실시형태에서, 내부에 직접 포함되는 마스크의 공간 변조 기능성을 갖는 검출기가 여기에 제시된 장치들과 함께 사용 가능하다. 특정한 실시형태에서, 별개의 마스크가 존재하지 않는다. 다른 실시형태에서, 별개으 마스크 또한 존재한다. 통합된 마스크 기능성을 갖춘 검출기의 비제한적인 예로는 공간 화소화를 갖춘 포토다이오드 어레이나 카메라가 포함되며, 이로써 개별적인 포토다이오드나 카메라의 선택 픽셀의 신호가 제거되거나 유지될 수 있다.

7. 부가적인 소자

특정한 실시형태에서, 여기에 제시된 장치는 여기에 제시된 eDAR 방법에 결합되는 방식으로 분석, 공정 혹은 테스트를 수행하기 위하여 유용한 부가적인 소자를 더 구비할 수 있다.

일 실시형태에서, 여기에 제시된 장치는 RT-PCR(Real-Time Polymerase Chain Reaction)이나 PCR(Polymerase Chain Reaction)와 같은 온칩 세포 측정을 수행하기 위하여 하나 이상의 저항성 가열 소자를 더 구비할 수 있다.

또 다른 실시형태에서, 여기에 제시된 장치는 예컨대 전기영동 혹은 전기 크로마토그래피와 같은 온칩 화학적인 측정을 수행하도록 하나 이상의 전극을 더 포함할 수 있다.

다른 실시형태에서, 여기에 제시된 장치는 필터 소자를 더 구비할 수 있다. 특정한 실시형태에서, 필터 소자는 미세지주, 마이크로임팩터(Microimpactor), 마이크로시브(Microsieve), 생입자보다 작은 개구를 갖는 채널, 개구를 통해 생입자 주변에서 계속 유체가 흐를 수 있도록 하면서도 생입자가 개구에 들어가는 것이 방지되는 개구를 갖는 채널("1-D 채널"), 마이크로비드, 다공성 막, 벽으로부터의 돌기, 접착성 코팅, 모직의 짜여진 혹은 짜여지지 않은 섬유(의류나 그물 등), 금속(예컨대, 스테인리스 스틸이나 모넬), 유리, 종이 혹은 합성물(예컨대, 나일론, 폴리프로필렌, 폴리카보네이트, 패릴렌 및 폴리에스테르), 소결 스테인리스 스틸 혹은 기타 금속, 알루미나, 실리카 혹은 카본과 같은 다공성 비유기 물질의 형태일 수 있다.

예를 들면, 도 16은 필터 소자(1622)를 나타내며, 이는 출구 채널(1621)과 같은 채널에 배치되어 원하는 생입자를 보유하는 동안 유체 부분의 통과를 선택적으로 허용할 수 있다.

또 다른 실시형태에서, 여기에 제시된 장치는 종래의 유동 세포 계수기에 결합될 수 있다.

예컨대, 도 16은 종래의 유동 세포 계수기(필터 소자(1622)를 갖는 경우와 그렇지 않은 경우)에 유체 통신할 수 있는 출구 채널(1621)을 나타내며, 이로써 희소 세포(1602)를 포함하는 개별적인 부분 표본(1661)은 연속적으로(세포 하나씩) 추가 검사되거나 분류된다.

Ⅳ. 예제

A. 예제 1

유체 상태에서 희소 입자의 정량화나 검출을 위하여 단일의 입구 포트와 ㅊ출구 포트를 갖는 eDAR 장치의 예이다.

도 4는 세포 부유물을 부분 표본화하기 위한 장치(411), 조사 장치(421 및 422), 검출이나 이미지 장치(431, 432 및 433) 및 랭킹 장치(컴퓨터, 미도시)를 포함하는 eDAR 장치의 예제를 나타낸다. 이 특정한 예에서, 세포 부유물을 부분 표본화하기 위한 장치(411)는 벽과 유체 포트(412 및 413) 내에 포함되는 유체 채널(414)로 구성될 수 있다. 레이저는 조사 장치로서 기능한다. 포토다이오드, 포토멀티플라이어 혹은 카메라를 갖는 역전된 현미경은 검출 장치로서 사용된다. 마스크(451)는 채널(414)과 검출 장치들(431, 432, 433) 사이의 경로에 배치된다. 컴퓨터는 검출 장치로부터의 신호를 수신하고, 알고리즘을 통해 부분 표본을 순위 매긴다. 이후 컴퓨터는 순위의 값(즉, 유체 샘플 내 희소 입자의 구성이나 존재, 부재, 양, 실체)에 기초하여 적절한 채널로 부분 표본을 안내한다. 비록 도 4는 3개의 검출 장치(431, 432, 433)와 2개의 조사 장치(421 및 422)를 나타내고 있지만, 실제로 eDAR은 단 하나의 검출 장치와 하나의 조사 장치 혹은 복수의 검출 장치와 조사 장치로 구성될 수 있다.

도 4에 도시된 장치의 한 가지 용법에 있어서, 역전된 현미경으로 향하는 633nm HeNe 레이저와 488nm 고체상 다이오드 펌프형 레이저로 조사 장치(421 및 422)가 구성되어 있다. 2개의 레이저 빔은 현미경 대물에 진입하기 전 10 대 1의 개구율로 시준된 타원형 빔을 형성하도록 실린더형 광학계를 사용하여 형성된다. 반파장 플레이트와 편광 빔 스플리터의 조합을 이용하여, 각 빔의 강도가 조절될 수 있고, 한편으로는 미러가 공간적으로 함께 국부화된 여기 영역을 형성하기 위하여 빛을 독립적으로 조절한다. 생입자로부터의 형광은 대역통과 필터를 통과하기 이전에 2개의 색선별 거울에 의해 3개의 파장 대역으로 분할되며, 3개의 SPAD(Single-photon Avalanche Diode, 431, 432 및 433) 상에서 다시 초점이 맞추어진다. 제 1 SPAD는 560 내지 610nm 파장 범위의 형광을 수집하고, 제 2 SPAD는 645 내지 700nm 범위의 형광을 수집하며, 제 3 SPAD는 500 내지 540nm 범위에서 수집한다. SPAD의 출력은 카운터/타이머 보드를 갖는 컴퓨터로 보내어져 몇몇 알고리즘으로 분석된다.

B. 예제 2

유체에서 희소 입자의 정량화나 검출을 위한 2개의 출구 포트를 구비한 eDAR 장치이다.

도 5는 세포 부유물을 부분 표본화하기 위한 장치(510), 조사 장치(521), 검출 내지 이미지 장치(531), 랭킹 장치(컴퓨터, 미도시) 및 할당된 랭킹에 따라 부분 표본을 안내하기 위한 장치로 이루어진 eDAR 장치를 나타낸다. 이 장치는 단일의 입구 포트(511), 2개의 출구 포트(512 및 513) 및 유체를 부분 표본화하기 위하여 단일 지점에서 만나는 3개의 유체 채널(514)을 포함한다. 레이저는 조사 장치(521)로서 기능하며, 포토다이오드, 포토멀티플라이어 혹은 카메라를 갖는 역전된 현미경은 검출 장치(531)로서 기능한다. 마스크(551)는 채널(514)과 검출 장치들(531) 사이에 배치된다. 컴퓨터는 검출 장치로부터의 신호를 수신하고, 알고리즘을 통해 부분 표본을 순위 매긴다. 이후 본 장치는 전기적, 자기적, 유체 역학적 혹은 공압적인 수단을 이용하여 부분 표본을 할당된 랭킹에 따라 출구(512)나 출구(513) 중 하나로 안내한다.

단일의 조사 장치와 단일의 검출 장치를 갖는 전술한 eDAR 장치에 부가하여, 복수의 조사 및 검출 장치가 여기에 기술한 eDAR 장치와 함께 사용 가능하다. 예컨대, 도 6은 하나의 조사 장치(640)와 3개의 검출 장치(650, 651 및 652)를 갖는 eDAR 장치를 나타낸다.

C. 예제 3

유체 내 희소 입자의 검출이나 정량화를 위하여 복수의 입구 및/또는 출구 포트를 갖는 eDAR 장치이다.

본 발명의 다양한 측면에서, eDAR 장치는 복수의 입구 및/또는 출구 포트를 구비할 수 있다. 예컨대, 도 7은 한 지점에서 만나는 5개의 유체 채널(716)과 5개의 포트(711, 712, 713, 714 및 715)를 가지고 부유물을 부분 표본화하기 위한 장치(710)를 나타낸다. 하나 이상의 포트가 유체 입구로서 사용 가능하며, 하나 이상의 포트가 유체 출구로서 사용 가능하다. 예컨대, 본 장치는 2개의 포트가 입구 포트로서 사용되고 3개의 포트가 출구 포트로서 사용되도록 사용 가능하며, 혹은 1개의 포트가 입구 포트이고 4개의 포트가 출구 포트가 되도록 사용 가능한 것 등이다. 이론적으로 장치(710)는 어떤 수의 유체 채널과 어떤 수의 유체 입구 및 출구를 포함할 수도 있다. 이들 유체 채널은 한 지점보다 많은 곳에서 만날 수 있으며, 만나는 지점은 유체 입구나 출구에 의해 제한될 필요가 없다.

D. 예제 4

eDAR을 이용함으로써 유방암 환자의 혈액 내 CTC를 검출하는 것이다.

스테이지 Ⅳ 전이 유방암 환자로부터 새로 정맥 채혈한 혈액이 하나의 주사로부터 3개의 개별적인 튜브로 끌려온다. 제 1 혈액부(제 1 튜브)는 피부 주사로부터의 상피 세포의 가능한 오염성을 피하기 위하여 버려진다. 제 2 부분은 Veridex의 CellSearch 시스템을 이용하여 CTC 검출을 위한 안정화 시약을 포함하는 Veridex의 CellSave 튜브로 수집된다. 제 3 부분은 eDAR을 이용하여 개별적인 분석을 위한 EDTA 항응고제를 포함하는 수집 튜브로 수집된다.

제 3 부분은 효소, 고정액, 투과성 시약 및 pan-cytokeratin, CD45 및 EpCAM(Epithelial Cell Adhesion Molecule)을 대상으로 한 형광 항체와 함께 배양된다. CTC의 긍정적인 식별자가 pan-cytokeratin 및 EpCAM을 나타내는 세포로서 정의되지만, CD45는 아니다. CD45는 백혈구 세포를 나타내며, 백혈구 공통 항체로서 일반적으로 알려져 있다. 모든 3개의 항체와 바운드하는 물체는 긍정 오류로 간주되고, 종종 단백질 집적의 결과이다.

간단하게, 5 내지 10mL 항체 라벨된 혈액 샘플이 흐름을 구동하기 위해 7.6psi를 공급하는 압축 공기 소스를 이용하여 약 10 내지 500㎕/분 사이의 유속율로 예제 1에 기술된 바와 같은 eDAR 장치를 통과하여 흐른다. eDAR 장치는 연속적인 흐름(동시적인) 모드에서 동작하고 있다. 이러한 실험에 대하여, 폭 200㎛ 길이 50㎛인 미세 채널이 사용된다. 라벨형 항체 복합체의 조사에 있어서, 라인-공초점 여기 빔이 488nm와 633nm 양자에서 제공되며, 이는 약 5 내지 10㎛ 두께인 빛의 면을 조사한다. 이와 같이, 라인-공초점의 검출 체적은 약 폭 200㎛ x 높이 50㎛ x 두께 10㎛의 치수를 가지며, 약 0.1nL의 검출 체적을 제공한다. 3개의 SPAD 검출 장치는 10,000Hz 샘플링 속도로 동작하며, 450 내지 610nm, 645 내지 700nm 및 500 내지 540nm에서 세포로부터 발하는 형광 신호를 검출하도록 구성된다. 이러한 속도로, 각 부분 표본은 1nL 내지 50nL의 차수 상에 있으며, 5 내지 250개의 백혈구 세포와 5,000 내지 25,000개의 적혈구 세포를 포함하는 것으로 추정된다. 따라서 5 내지 10mL의 예의 경우, 500㎕/분의 유량으로 샘플을 처리하도록 10 내지 20분 사이가 걸린다. 이러한 방식으로 처리되는 5mL 예제는 각각 50nL의 체적을 갖는 10,000개의 부분 표본으로 분할될 것이다.

이와 같이, 2개의 출구 채널을 갖는 eDAR 장치가 사용된다면, 200개의 CTC를 포함하는 5mL 샘플이 필터를 사용하지 않고 단 10분에 10㎕의 체적으로 감소될 수 있다. eDAR 장치가 유동 세포 계수기와 추가적으로 액체 접촉한다면, 5mL 샘플에 존재하는 200개의 CTC 세포 전부는 유동 세포 계수법 이전에 eDAR 단계를 구현함으로써 표준 시간의 단 2%에서 계수되고/되거나 개별적으로 격리될 수 있다.

도 8은 Veridex의 CellSearch 시스템(하부 패널) 및 eDAR(상부 패널)을 이용하여 (서로 다른 날에 얻은 복수 환자들 중) 스테이지 Ⅳ 유방암 환자로부터의 27개 혈액 샘플로부터의 CTC 수를 나타낸다. 쉽게 기재된 바와 같이, 대부분의 환자 샘플은 CellSearch 시스템을 이용하여 0개의 CTC 수를 등록하였다. 반면에, 같은 환자 혈액의 50% 이상이 200 내지 400 CTC 수를 포함하는 것으로 밝혀졌다. 이는 Veridex의 상업적인 CellSearch 시스템의 이용에 비해 eDAR의 이용으로 100배 많은 민감도를 증명한다. eDAR의 높아진 민감도는 마스크의 사용과 부분 표본 순위에 의하여 CTC와 배경 간의 정확한 식별에 기여할 수 있다.

도 8에도 도시된 바와 같이, eDAR에 의해 분석된 환자 샘플의 100%는 CTC의 존재를 나타내었고, Veridex의 CellSearch 시스템으로 분석된 환자 샘플의 40%만이 CTC의 존재를 나타내었다. 이는 eDAR에 의해 제시되는 현저하게 낮은 비율의 부정 오류를 입증하였다. CTC 검사에서 부정 오류의 높은 비율은 전이의 부정확한 예상을 유발할 수 있고, 환자에게 현존하는 치료 체계가 충분하다는 잘못된 안도감을 줄 수 있다.

이 eDAR 방법에 의해 검출된 CTC의 예시적인 이미지가 도 9에 제시되어 있다. 간략하게, 이 도면은 다양한 조사하에서 eDAR(화살표는 CTC를 표시함)을 이용하여 환자 혈액으로부터 얻은 암세포의 광학 이미지를 나타낸다. 도 9a는 적혈구 세포 중간의 CTC에 대한 브라이트필드 이미지이다. 도 9b는 pan-cytokeratin의 존재를 나타내는 형광 이미지이다. 도 9c는 백혈구를 CTC로서 잘못 확인할 가능성을 배제하도록 CD45의 부재를 나타내는 형광 이미지이다.

E. 예제 5

암세포의 분포 중 암 줄기세포를 검출하는 것이다.

eDAR에 의해 분리된 암세포는 생체액 내 소집단을 구별하기 위해 추가적으로 분석될 수 있다. 특정한 단백질을 대상으로 하는 부가적인 형광 항체로 살포함으로써, 몇몇 암세포는 다른 것들과 구별될 수 있다. 예컨대, CD24 단백질이 아니라 CD44를 나타내는 암세포는 높은 전이 잠재성을 갖는 그와 연계된 암 줄기세포로 최근 불려졌다. 다른 단백질은 세포의 다양한 특성과 연관될 수 있다.

예컨대, 도 10은 유방암 줄기세포(화살표 머리로 표시함)의 표시를 나타낸다. 간략하게, 암세포(MCF-7)는 Alexa488-anti-CD44(양성) 및 Alexa647-anti-CD24(음성)로 라벨링된다. 도 10a는 Alexa488-anti-CD44(녹색)를 검출하기 위한 형광 이미지(500 내지 540nm)이고, 도 10b는 Alexa647-anti-CD24(적색)를 검출하기 위한 형광 이미지(645 내지 700nm)이며, 도 10c는 브라이트필드 이미지이다. 도 10d는 CD44+/CD24-를 나타내는 복합 이미지이다(화살표는 암 줄기세포를 나타냄). 대략 암세포의 25%는 CD24가 아니라 CD44를 나타내도록 발견되었으며, 따라서 암 줄기세포에 대한 기준을 충족한다. 이러한 방식으로, eDAR은 생체액 내 암세포의 소집단을 구별하기 위해 사용 가능하다.

F. 예제 6

별개의 부분 표본을 이용하는 eDAR 검출이다.

여기에 제시된 방법의 일 예에서, eDAR은 검출 단계 이전에 생입자를 캡슐화하기 위해 섞이지 않는 상에 의하여 분리되는 개별적인 물 같은 부분 표본을 이용함으로써 동작 가능하다. 도 16은 이러한 방식으로 동작하는 eDAR 장치를 나타낸다. 예컨대, 원치 않는 세포(1601)를 포함하는 세포 부유물과 원하는 희소 세포(1602)는 개별적인 부분 표본(1631, 1641, 1651 및 1661)으로 분할되며, 이는 섞이지 않는 위상(1642)에 의해 서로 분리된다. 개별적인 부분 표본은 흐름 채널(1603)에서 좌에서 우로 흐르도록 안내된다. 부분 표본(1641)이 검출 체적(1604, 실린더형 윤곽)을 지나가고, 개별적인 부분 표본(1641) 내에 캡슐화된 복수의 세포가 동시에 검출된다. 만약 원하는 세포가 검출되지 않으면, 개별적인 부분 표본(1641)이 채널(1611)(예컨대, 부분 표본(1651) 참조)을 향해 안내되고 널로서 랭크된다. 만약 원하는 희소 세포가 검출된다면, 개별적인 부분 표본은 0 아닌 값으로 랭크되고, 채널(1621)(예컨대, 부분 표본(1661) 참조)을 향해 안내된다.

일 실시형태에서, 필터 소자(1622)는 채널(1621)에 배치될 수 있으며, 원하는 생입자를 보유하는 한편 유체 부분의 통과를 선택적으로 허용할 수 있다. 일 실시형태에서, eDAR 장치는 종래의 유동 세포 계수기에 결합 가능하다. 예컨대, 도 16에서 채널(1621)은 종래의 유동 세포 계수기(필터 소자(1622)가 있는 경우 혹은 없는 경우)에 유체 통신할 수 있으며, 이로써 희소 세포(1602)를 포함하는 개별적인 부분 표본(1661)은 연속적으로(한번에 한 세포) 추가 검사되거나 분류된다.

혼합되지 않는 위상(1642)은 도 16에 도시된 바와 같이 연속적이거나(즉, 개별적인 부분 표본을 전체적으로 둘러쌈), 구획될 수 있다(즉, 혼합되지 않는 위상(1642)이 부분 표본을 완전히 둘러싸지는 않으면서 개별적인 부분 표본들 간의 간격만을 차지함).

G. 예제 7

본 발명의 일 측면의 용법에 대한 예로서, 만약 10mL 세포 부유물이 100억개의 원치 않는 세포들 중 단 9개의 원하는 희소 세포만 포함한다면, 가장 간단한 형태의 eDAR은 10개의 부분 표본에 포함된 원하는 세포로부터의 특성 검출을 요구할 것이다. 단 9개의 원하는 세포만 존재하기 때문에, 적어도 하나의 부분 표본은 원하는 세포가 없을 것이고, 널로서 랭크되어 즉시 버려질 수 있다. 버려진 부분에 포함된 원치 않는 세포는 개별적으로 검사될 필요가 없을 것이다. 결과적으로, 단지 10개의 부분 표본을 가지고 총 체적의 적어도 1/10이 즉시 버려지고, 원치 않는 세포(버려진 체적 내에 포함됨)의 1/10이 개별적으로 검출될 필요가 없게 될 것이다. 이를 관점으로 두면, 하나의 결정으로 앙상블로서 제거된 10억개의 원치 않는 세포인 것이다. 70,000 대상체/초의 극도의 속도로 동작하는 현재 상태 기술의 세포 분류기를 가지고 이러한 하나의 결정은 1,000,000,000/70,000 = 14,300 초 내지 4시간을 절약하는 결과를 낳는다. 이는 시간 효율성에 있어서 엄청난 상승을 유발한다.

앞서 제시한 시나리오로부터 뒤이어서, 만약 10mL 세포 부유물이 각각 100㎕의 100개 부분 표본으로 분할된다고 가정하면, 단 9개의 원하는 세포만을 전체 세포 부유물 체적이 포함하고 있기 때문에, 적어도 91개 부분이 원하는 세포를 포함하지 않을 것이다. 따라서, 단 100회 스캔과 100회 결정을 수행함으로써, 91개 부분 표본 x 100㎕ = 9.1mL가 즉시 제거될 수 있다. 버려진 부분에 포함된 세포는 91억개의 세포일 것이며, 다시 말해 원치 않는 세포의 91%가 100회 결정 내에 제거된다.

H. 예제 8

도 1은 본 발명의 특정한 실시형태를 나타내며, 희소 입자 특성은 동시적인 모드의 동작 중에 부분 표본 내에서 검출된다. 간략하게, 원치 않는 세포(101)와 원하는 희소 세포(102)를 포함하는 세포 부유물은 흐름 채널(103)에서 좌로부터 우로 흐르도록 안내된다. 복수의 세포는 주어진 시간에 음형으로 된 실린더에 의해 둘러싸여진 검출 체적(104)을 지나갈 수 있으며, 동시에 검출될 수 있다. 만약 원하는 세포가 검출되지 않는다면, 검출 체적에 등가인 부분 표본이 널로서 랭크되고, 채널(111)을 향해 안내된다. 만약 어떤 원하는 세포라도 검출된다면, 부분 표본은 0 아닌 값으로 랭크되고 채널(121)을 향해 안내된다.

필터 소자(122)는 원하는 생입자를 보유하는 한편 유체 부분의 통과를 선택적으로 허용하도록 채널(121) 내에 선택적으로 배치될 수 있다. 필터 소자는 마이크로포스트(Micropost), 마이크로임팩터, 마이크로시브, 생입자보다 작은 개구를 갖는 채널, 개구를 통해 생입자 주변에서 계속 유체가 흐를 수 있도록 하면서도 생입자가 개구에 들어가는 것이 방지되는 개구를 갖는 채널("1-D 채널"), 마이크로비드, 다공성 막, 벽으로부터의 돌기, 접착성 코팅, 모직의 짜여진 혹은 짜여지지 않은 섬유(의류나 그물 등), 금속(예컨대, 스테인리스 스틸이나 모넬), 유리, 종이 혹은 합성물(예컨대, 나일론, 폴리프로필렌, 폴리카보네이트, 패릴렌 및 폴리에스테르), 소결 스테인리스 스틸 혹은 기타 금속, 알루미나, 실리카 혹은 카본과 같은 다공성 비유기 물질의 형태일 수 있다.

I. 예제 9

동시적 모드로 구동하는 eDAR의 다른 예에서, 본 방법은 과도한 배경 신호를 줄이고 신호대 잡음 비를 개선하기 위하여 부분 표본을 선택적으로 마스킹하는 단계를 더 포함할 수 있다. 도 2는 검출 가능한 특성을 선택적으로 통과할 수 있도록 검출기와 검출 체적 사이에 배치되는 개구(212)의 어레이를 갖는 마스크(211)의 이용을 나타낸다. 복수의 생입자는 여전히 마스크(211)의 사용으로 동시에 검출 가능하다. 과도한 배경 신호를 줄이고 신호대 잡음 비를 증가시킴으로써, 고도로 희석된 부분 표본조차로부터의 약한 신호가 정확하게 검출 가능하므로 검출 감도가 강화된다. 다시 말해, 신호대 잡음 비가 우수할수록 더 큰 부분 표본을 스캔할 수 있다. 직접적인 결과로서, 더 적은 수의 (하지만 더 큰) 부분 표본을 스캔할 필요가 있기 때문에 유체 공학적 수율이 그에 따라 상승한다. 만약 원하는 생입자가 검출되지 않는다면, 검출 체적에 대등한 부분 표본이 널로서 랭크되고 채널(221)을 향해 안내된다. 만약 원하는 어떤 생입자라도 검출된다면, 부분 표본은 채널(222)을 향해 안내되고 0이 아닌 값으로 랭크된다.

J. 예제 10

도 11 패널 A는 장치(710)(도 7)의 확대도이며, 접점(1116)에서 만나는 5개의 유체 채널(1111, 1112, 1113, 1114 및 1115)을 가지고 부유물을 부분 표본화하기 위한 장치(1110)를 나타낸다. 유체 채널(1111, 1112, 1113)은 접점(1116)을 향해 유체를 운반하며, 반면에 유체 채널(1114 및 1115)은 접점(1116)으로부터 멀리 유체를 운반한다. 솔레노이드 피스톤(1120)은 채널(1111)의 상부에 배치되고, 솔레노이드 피스톤(1121)은 채널(1112)의 상부에 배치된다. 솔레노이드 피스톤(1120 및 1121)은 탄성 중합체의 PDMS(polydimethylsiloxane) 막 상에서 아래로 누르도록 구성되며, 이는 채널(1111 및 1112) 내 유체로부터 피스톤(1120 및 1121)을 분리한다.

도 11 패널 A는 부유물을 부분 표본화하기 위한 장치(1110)의 동작을 나타낸다. 흐름 채널(1111)의 상부 상에 PDMS 막에 대하여 아래로 누르는 솔레노이드 피스톤(1120)을 구비함으로써, 채널(1111)은 닫힌다. 동시에 솔레노이드 피스톤(1121)은 접점(1116)을 향해 채널(1112)을 유체가 통과할 수 있도록 구성된다. 결과적으로, 입력 채널(1112) 내 희소 세포를 포함하는 혈액은 좌측 출구 채널(1114)(패널 B 참조, 0ms)로 우회된다. 부분 표본(1130)을 우측 출구 채널(1115)로 안내하기 위하여, 솔레노이드 피스톤(1120)은 채널(1111) 상부 상에서 PDMS 막으로부터 철회되며, 반면에 솔레노이드 피스톤(1121)은 채널(1112) 상부에서 PDMS 막을 아래로 누른다. 이는 우측 출구 채널(1115)(패널 C, 5ms 및 패널 D, 10ms)로 희소 세포를 포함하는 혈액의 부분 표본(1130)을 안내하는 것을 유발한다. 기술한 바와 같은 솔레노이드 피스톤을 이용하는 부분 표본 재안내는 5ms 만큼 적은 시간을 요구한다.

K. 예제 11

도 12 패널 A는 접점(1240)에서 만나는 5개의 유체 채널(1211, 1212, 1213, 1214 및 1215)을 가지고 부유물을 부분 표본화하기 위해 사용되는 장치(1210)를 나타낸다. 유체 채널(1211, 1212 및 1213)은 접점(1240)을 향해 유체를 운반하며, 반면에 유체 채널(1214 및 1215)은 접점(1240)으로부터 멀리 유체를 운반한다. 솔레노이드 밸브(1220)는 튜브(1221)를 경유하여 채널(1211)과 유체 통신하는 포트(1216)에 접속되고, 솔레노이드 밸브(1222)는 튜브(1223)를 경유하여 채널(1212)과 유체 통신하는 포트(1217)에 접속된다.

솔레노이드 밸브(1220 및 1222)는 전자적 혹은 컴퓨터 신호(예컨대, TTL 신호)로 여닫히도록 구동된다. 솔레노이드 밸브(1220)는 솔레노이드 밸브(1222)가 열린 상태에서는 닫히고, 입력 채널(1213) 내 희소 세포를 포함하는 혈액의 부분 표본(1260)은 좌측 출구 채널(1214)로 우회된다(패널 B 참조, 0ms). 솔레노이드 밸브(1220)가 열릴 때 솔레노이드 밸브(1222)는 닫힌 상태로 유지되며, 입력 채널(1213) 내 희소 세포를 포함하는 혈액의 부분 표본(1260)은 우측 출구 채널(1215)로 우회된다(패널 C 참조, 2ms). 솔레노이드 밸브(1220 및 1222)의 조합을 이용하는 부분 표본 재안내는 2ms만큼 적은 시간만에 한 채널로부터 다른 채널로 부분 표본을 채널링할 수 있다.

L. 예제 12

eDAR 장치의 성능을 테스트하기 위하여, 혈액과 암세포의 혼합물이 다음 절차에 따라 준비된다. 1x10E6/mL MCF-7 세포가 형광 EpCAM 항체 20㎕로 라벨링된다. 이 세포 혼합물은 이후 이소톤(Isoton) 혈액학적 희석제로 1x10E5 세포/mL로 희석된다. 10㎕의 희석 세포 혼합물은 이후 전체 인간 혈액의 2mL에 부가되며, 부분 표본화 장치를 통해 흐른다. 부분 표본화 장치의 유량은 달리 나타내지 않는 한 공칭 30㎕/분이다.

도 13은 접점(1116)(혹은 1240)의 상류와 하류의 서로 다른 위치에서 배치된 2개의 APD로부터 수집된 형광 신호를 나타낸다. 플롯(1310)은 검출 체적(1140)(혹은 1270)에서 부분 표본 내 EpCAM 분자의 존재를 검출하도록 구성된 하나의 APD로부터의 신호 궤적(1311)을 나타내며, 반면에 플롯(1320)은 채널(1114)(혹은 1214) 내 EpCAM 분자의 존재를 검출하도록 구성된 두번째 APD로부터의 신호 궤적(1321)을 나타낸다. 신호 피크(1312)는 신호 피크(1322)에 실질적으로 부합하며, 이는 부분 표본의 채널링이 정확함을 나타내고, 높은 희소 세포의 회수를 유발한다.

eDAR 장치의 성능을 더 조사하기 위하여, 정확한 흐름 채널로 안내된 암세포의 개수가 세어지고, 이후에 솔레노이드 밸브(1220, 1222)나 피스톤(1120, 1121)이 닫히거나 열린 상태의 시간 길이("펄스 길이")를 조정하는 동안 수집된다("회수됨"). 회수율은 검출 체적(1140 혹은 1270)에서 APD로 검출된 희소 세포 수에 의해 정확한 채널에 수집된 희소 세포 수를 나눔으로써 연산된다. 도 14 플롯(1410)은 펄스 길이의 함수로서 복구된 암세포의 백분율을 나타낸다. 궤적(1420)은 펄스폭이 10ms 이하인 경우 100%의 암세포가 정확한 채널에 수집되었음을 나타낸다. 펄스폭이 증가하면서 궤적(1420)이 감소하고, 이는 잘못된 채널로의 세포 손실을 나타낸다.

입력 채널(1113)(혹은 1213)의 유속을 조정함으로써, 회수가 최적화될 수 있음을 관찰하였다. 도 15는 입력 유속의 함수로서 복구되는 희소 세포의 백분율을 나타내는 궤적(1520)을 갖는 플롯(1510)을 도시한다. 유속이 30㎕/분 이하인 경우, 회수는 89 내지 100% 사이이다. 그러나, 유속이 증가하면서 회수는 감소하고, 이는 잘못된 채널 내 희소 세포의 손실이 증가함을 나타낸다.

여기에 기술한 실시형태와 예제는 단지 예시적인 목적일 뿐이며, 다양한 변경이나 개조가 당업자에게 제안될 수 있고, 첨부된 청구항의 범위와 본 출원의 범위와 정신 내에 포함된다는 점이 이해된다. 여기에 인용된 모든 문헌, 특허 및 특허출원은 모든 목적을 위하여 그 전체가 여기에 참조로 편입된다.

Claims (26)

1. 유체 샘플 내 희소 입자를 검출하기 위한 방법에 있어서,
   (a) 상기 유체 샘플의 부분 표본에서 희소 입자의 유무를 검출하는 단계-상기 부분 표본은 3차원 공간에 랜덤하게 분산된 복수의 입자를 포함함-;
   (b) 상기 희소 입자의 유무에 기초하여 상기 부분 표본에 대하여 값을 할당하는 단계; 및
   (c) 상기 할당된 값에 기초하여 상기 부분 표본의 흐름이나 집합을 안내하는(Directing) 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
2. 청구항 1에 있어서,
   상기 희소 입자의 유무를 검출하는 상기 단계는,
   (i) 상기 유체 샘플을 상기 검출 시약으로 접촉하는 하위 단계;
   (ii) 상기 검출 시약 및 희소 입자를 포함하는 복합체를 형성하는 하위 단계; 및
   (iii) 상기 유체 샘플의 부분 표본에 있어서 상기 (ii) 단계에서 형성된 상기 복합체의 유무를 검출하는 하위 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 청구항 1에 있어서,
   상기 희소 입자의 유무를 검출하는 상기 단계는,
   (ⅰ) 전자기 방사의 외부 소스로 상기 부분 표본을 조사하는 하위 단계; 및
   (ⅱ) 상기 희소 입자의 형광을 검출하는 하위 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 청구항 1에 있어서,
   상기 희소 입자의 유무를 검출하는 상기 단계는,
   상기 희소 입자의 생체 발광이나 화학 발광을 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 희소 입자는 희소 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
6. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 부분 표본은 하나보다 많은 희소 입자를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 유체 샘플은 생체액인 것을 특징으로 하는 방법.
8. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 유체 샘플은 서로 다른 특수성을 각각 갖는 복수의 식별 가능한 검출 시약으로 접촉되고, 상기 복수의 검출 시약이 상기 검출 시약과 복수의 희소 입자를 포함하는 복수의 복합체로 형성되는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 청구항 8에 있어서,
   상기 복수의 복합체는 동시에 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 청구항 8에 있어서,
    상기 검출 시약은 상이한 파장에서의 형광에 의하여 식별 가능한 것을 특징으로 하는 방법.
11. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 부분 표본은 만약 상기 부분 표본이 희소 입자를 포함한다면 제 1 값을, 만약 상기 부분 표본이 희소 입자를 포함하지 않는다면 제 2 값을 할당받는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 청구항 11에 있어서,
    상기 제 1 값은 상기 부분 표본 내 상기 희소 입자의 농도나 상기 희소 입자의 실체 중 하나에 따라 달라지는 것을 특징으로 하는 방법.
13. 청구항 11에 있어서,
    동일한 할당된 값을 갖는 복수의 부분 표본은 함께 모여지는 것을 특징으로 하는 방법.
14. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 검출 단계는 흐름 채널을 통한 생체 샘플의 연속적인 흐름 중에 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
15. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 유체 샘플의 복수의 부분 표본은 상기 검출 단계 이전에 물리적으로 분리되는 것을 특징으로 하는 방법.
16. 청구항 15에 있어서,
    상기 부분 표본은 상기 검출 단계 이전에 별개의 흐름 채널이나 챔버로 분할되는 것을 특징으로 하는 방법.
17. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 희소 입자는 상기 유체 샘플의 상기 총 입자수의 10³ 분의 1 미만의 낮은 레벨로 유체 샘플 내에 존재하는 세포 또는 고분자인 것을 특징으로 하는 방법.
18. 생체액 내 희소 입자의 존재와 연계된 조건에 대하여 대상체에 진단이나 예상을 제공하기 위한 방법에 있어서,
    (a) 상기 검출 시약과 상기 대상체로부터의 생체액을 접촉하는 단계;
    (b) 상기 검출 시약 및 희소 입자를 포함하는 복합체를 형성하는 단계;
    (c) 상기 생체액의 부분 표본에 있어서 상기 (b) 단계에서 형성된 상기 복합체의 유무를 검출하는 단계-상기 부분 표본은 3차원 공간에 랜덤하게 분산된 복수의 입자를 포함함-;
    (d) 상기 (b) 단계에서 형성된 복합체의 유무에 기초하여 상기 부분 표본에 값을 할당하는 단계; 및
    (e) 상기 할당된 값에 기초하여 상기 대상체에 진단이나 예상을 제공하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
19. 유체 샘플 내에서 희소 입자를 검출하기 위한 장치에 있어서,
    (a) 제 1 입력 채널;
    (b) 적어도 2개의 출구 채널;
    (c) 상기 유체 샘플의 부분 표본 내 하나 이상의 희소 입자를 검출할 수 있는 적어도 하나의 검출기-상기 부분 표본은 3차원 공간에 랜덤하게 분산된 복수의 입자를 포함함-;
    (d) 상기 부분 표본의 흐름을 안내하기 위한 메커니즘; 및
    (e) 상기 부분 표본 내 희소 입자의 존재, 부재, 실체, 구성 혹은 양에 기초하여 상기 부분 표본에 값을 할당할 수 있는 컴퓨터를 구비하고,
    상기 컴퓨터는 상기 부분 표본의 흐름을 안내하기 위한 상기 메커니즘 및 상기 검출기와 통신하는 것을 특징으로 하는 장치.
20. 청구항 19에 있어서,
    상기 메커니즘은, 만약 상기 부분 표본이 희소 입자를 포함한다면 제 1 출구 채널로, 만약 상기 부분 표본이 희소 입자를 포함하지 않는다면 제 2 출구 채널로 상기 부분 표본의 흐름을 안내하는 것을 특징으로 하는 장치.
21. 청구항 19 또는 청구항 20에 있어서,
    상기 메커니즘은 상기 희소 입자의 실체, 구성 혹은 양에 따라 복수의 출구 채널 중 하나로 희소 입자를 포함하는 부분 표본의 흐름을 안내하는 것을 특징으로 하는 장치.
22. 청구항 19 또는 청구항 20에 있어서,
    상기 부분 표본의 흐름을 안내하기 위한 상기 메커니즘은 전극, 자기 소자, 음향 소자 혹은 전기 활성 소자를 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
23. 청구항 19 또는 청구항 20에 있어서,
    상기 부분 표본의 흐름을 안내하기 위한 메커니즘은 하나 이상의 전기 활성 밸브나 피스톤을 포함하고,
    상기 밸브나 피스톤은 제 1 접점에서 상기 제 1 입력 채널 및 상기 2개의 출구 채널과 교차하는 적어도 하나의 제 1 지향성 흐름 채널에서 유체의 흐름을 제어하는 것을 특징으로 하는 장치.
24. 청구항 19 또는 청구항 20에 있어서,
    상기 검출기는 카메라, 전자 배율기, CCD 이미지 센서, PMT(Photomultiplier Tube), APD(Avalanche Photodiode), SPAD(Single-Photon Avalanche Diode) 및 CMOS 이미지 센서로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 장치.
25. 청구항 19 또는 청구항 20에 있어서,
    상기 장치는 상기 부분 표본의 조사를 위한 전자기 방사 소스를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
26. 청구항 19 또는 청구항 20에 있어서,
    상기 희소 입자는 상기 유체 샘플의 상기 총 입자수의 10³ 분의 1 미만의 낮은 레벨로 유체 샘플 내에 존재하는 세포 또는 고분자인 것을 특징으로 하는 장치.

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