ES2638861T3 - Método y aparato de detección de partículas raras - Google Patents

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Abstract

1.Un aparato para detectar una partícula rara en una muestra de fluido, comprendiendo el aparato: (a) al menos un canal de entrada; (b) al menos un canal de salida; (c) al menos un detector; (d) un mecanismo capaz de dirigir un flujo de una alícuota de fluido, en el que la alícuota comprende una pluralidad de partículas distribuidas aleatoriamente a lo largo de un espacio tridimensional; y (e) un ordenador capaz de asignar un valor a la alícuota en base a la presencia, ausencia, identidad, composición o cantidad de las partículas raras en la alícuota, en el que el ordenador está en comunicación con el detector y el mecanismo para dirigir el flujo de la alícuota y en el que la partícula rara es una célula o macromolécula presente en la muestra de fluido a un nivel bajo que comprende menos de aproximadamente 1 parte por 103 de la población total de partículas en la muestra de fluido.

Description

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DESCRIPCION
Metodo y aparato de deteccion de parffculas raras ANTECEDENTES DE LA INVENCION
Los fluidos corporales son suspensiones complejas de parffculas biologicas en ffquido. La sangre, por ejemplo, incluye plasma y celulas (globulos rojos, globulos blancos, plaquetas) y las celulas ocupan aproximadamente el 55 % de la sangre. El plasma es principalmente agua y transfiere protemas, iones, vitaminas, enzimas, hormonas y otros qmmicos a las celulas del cuerpo.
Los globulos rojos tienen un tamano de aproximadamente 6 a 8 pm de tamano y sirven para proporcionar oxfgeno a las celulas. Los globulos blancos tienen aproximadamente de 10 a 13 pm de diametro y defienden al cuerpo de la enfermedad como parte de un sistema inmunologico luchando contra virus y bacterias extranas. Las plaquetas son las celulas mas pequenas, de 1,5 a 3 pm, y dejan de sangrar formando coagulos sangumeos.
Los fluidos ademas de la sangre, tales como saliva, lagrimas, orina, ffquido espinal cerebral, asf como otros fluidos corporales en contacto con diversos organos (por ejemplo, pulmon) contienen mezclas de celulas y bioparffculas. El tipo y la cantidad de celulas y bioparffculas que estan presentes en un fluido corporal particular (por ejemplo, sangre) revela informacion sobre la salud del organismo y, en el caso de un individuo infectado, informacion sobre el diagnostico y el pronostico de la enfermedad.
Algunas celulas o bioparffculas estan presentes en cantidades raras en comparacion con las concentraciones nominales de celulas sangumeas. A pesar de su rara aparicion, estas celulas o bioparffculas pueden estar intnnsecamente ligadas a eventos significativos que tienen lugar en el cuerpo que alteran el estado de salud de un individuo. Estas celulas se denominan comunmente "celulas raras".
Por ejemplo, la diseminacion de celulas cancerosas del tumor primario es un factor importante que rige la probabilidad de recafda y la tasa de supervivencia en pacientes con cancer. A medida que las celulas cancerosas crecen sin regulacion y pierden su capacidad de adherirse entre sf, pueden entrar en la sangre y la circulacion linfatica y circular por todo el cuerpo. Estas celulas se denominan comunmente celulas tumorales circulantes (CTC), celulas tumorales diseminadas (DTC), celulas cancerosas circulantes (CCC), celulas epiteliales circulantes (CEC), celulas tumorales ocultas (OTC) u otras permutaciones similares para indicar la naturaleza movil de estas celulas, en contraste con los especimenes obtenidos por biopsia directa de tumores solidos. Se han detectado CTC en la sangre de pacientes que padecen todos los canceres principales: prostata, ovario, mama, gastrico, colorrectal, renal, pulmonar, pancreatico y otros.
De esta manera, se han desarrollado ensayos que cuentan con CTC presentes en los fluidos corporales para ayudar a proporcionar un pronostico para pacientes de cancer. Tambien se puede usar un "ensayo de CTC" para controlar la respuesta de un paciente a un protocolo particular de tratamiento (por ejemplo, radioterapia o quimioterapia). Basandose en los resultados del ensayo de CTC, un paciente con cancer puede evitar costes significativos al minimizar las innecesarias y costosas pruebas diagnosticas y terapias adicionales, que muchas veces no estan cubiertas por el seguro de salud, por ejemplo, la tomograffa computarizada (CT) o la tomograffa por emision de positrones (PET), o acortar los tratamientos farmacologicos que son ineficaces.
Sin embargo, las CTC estan presentes en una concentracion extremadamente baja en la sangre periferica, estimada en el orden de una celula tumoral por 106 a 107 celulas mononucleares, que es equivalente a una celula tumoral por 0,5 ml a 5 ml de sangre periferica. A tal concentracion baja, una muestra con aproximadamente 100 millones de celulas mononucleares debe cribarse con el fin de detectar al menos una CTC con un 99,995 % de certeza. El uso de tecnicas convencionales, tales como la exploracion automatica de microscopfa digital (ADM) a una velocidad ffpica de 800 celulas/segundo, requerira 18 horas para completar una muestra de ese tamano, haciendola poco practica monetaria y temporalmente para su uso cffnico.
Por ejemplo, puede emplearse citometna de flujo convencional para determinar la presencia o cantidad de CTC en una muestra de sangre. Sin embargo, la citometna de flujo requiere que las celulas esten organizadas linealmente en una fila y detecten cada celula singularmente porque la deteccion simultanea de dos celulas no puede interpretarse correctamente usando la tecnologfa existente. En la citometna de flujo, los rayos laser se enfocan de tal manera que solo iluminan una unica parffcula en un momento dado. Por ejemplo, si una celula no fluorescente atraviesa el volumen de deteccion simultaneamente con una celula fluorescente configurada para ser detectable por el citometro de flujo, la celula no fluorescente, que es invisible para el citometro de flujo, estana dirigida en la misma trayectoria que la celula fluorescente. Para evitar una interpretacion erronea en citometna de flujo, las suspensiones de celulas se diluyen rutinariamente o se ralentizan para permitir suficiente distancia entre las celulas para evitar la
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superposicion de dos celulas dentro del volumen de deteccion. Los citometros de flujo actuales del estado de la tecnica tienen un Kmite superior de clasificacion de 100.000 objetos/segundo.
Como tal, la citometna de flujo no es adecuada para detectar o recuperar celulas raras. La deteccion de celulas de una en una (en serie) y la toma de decision sobre la trayectoria de cada celula es demasiado lenta cuando se analiza un gran numero de celulas. Por ejemplo, dado que diez mililitros de sangre contienen aproximadamente diez mil millones de celulas, a 100.000 celulas por segundo, que es la velocidad de clasificacion mas alta del citometro de flujo del estado de la tecnica, tardara 100.000 segundos o 28 horas para ordenar por completo el contenido de 10 ml. Para las celulas raras, a menudo se requieren 7-15 ml de sangre para recoger un numero estadfsticamente significativo de celulas raras; la utilizacion de un citometro de flujo para recuperar celulas raras es un consumo poco practico de recursos clmicos y puede traducirse en un coste de ensayo muy alto.
Como tales, se necesitan tecnicas sencillas y rentables para la deteccion y cuantificacion de partfculas y celulas raras en una muestra de fluido. La presente invencion satisface estas y otras necesidades proporcionando metodos y aparatos para la deteccion de partfculas raras en muestras de fluidos.
H. J. Gross et al., "Detection of Rare Cells at a Frequency of One Per Million by Flow Cytometry", Cytometry, 14, 519-526, 1993, pags. 519-526, desvelan la deteccion de celulas raras.
El documento US 2002/081569 A1 desvela metodos para la purificacion y/o identificacion de partfculas en una muestra lfquida.
El documento US 5602042 A desvela un metodo para la recogida y transferencia de partfculas desde una suspension lfquida a un portaobjetos de vidrio.
El documento US 2009/014360 A1 desvela metodos para enfocar partfculas suspendidas dentro de un fluido movil en una o mas lmeas de flujo localizadas.
BREVE RESUMEN DE LA INVENCION
La presente invencion es como se expone en las reivindicaciones. En particular, la presente invencion es como se expone en las siguientes clausulas:
I. Un aparato para detectar una partfcula rara en una muestra de fluido, comprendiendo el aparato:
(a) al menos un canal de entrada;
(b) al menos un canal de salida;
(c) al menos un detector;
(d) un mecanismo capaz de dirigir un flujo de una alfcuota de fluido, en el que la alfcuota comprende una pluralidad de partfculas distribuidas aleatoriamente a lo largo de un espacio tridimensional; y
(e) un ordenador capaz de asignar un valor a la alfcuota en base a la presencia, ausencia, identidad, composicion o cantidad de las partfculas raras en la alfcuota, en el que el ordenador esta en comunicacion con el detector y el mecanismo para dirigir el flujo de la alfcuota y en el que la partfcula rara es una celula o macromolecula presente en la muestra de fluido a un nivel bajo que comprende menos de aproximadamente 1 parte por 103 de la poblacion total de partfculas en la muestra de fluido.
2. El aparato de acuerdo con la clausula 1, que comprende al menos dos canales de salida; opcionalmente, en el que el mecanismo dirige el flujo de la alfcuota a un primer canal de salida si la aifcuota contiene la partfcula rara o un segundo canal de salida si la alfcuota no contiene la partfcula rara; opcionalmente en el que el mecanismo dirige el flujo de la alfcuota que contiene la partfcula rara a un canal de salida dependiendo de la identidad, composicion o cantidad de la partfcula rara.
3. El aparato de acuerdo con una cualquiera de las clausulas anteriores, en el que el mecanismo para dirigir el flujo de la alfcuota comprende un electrodo, un elemento magnetico, un elemento acustico o un elemento electroaccionado; o en el que el mecanismo para dirigir el flujo de la alfcuota comprende una o mas valvulas o pistones electroaccionados, en el que las valvulas o pistones controlan el flujo de la alfcuota en al menos un primer canal de flujo direccional que cruza con el canal de entrada y el canal de salida en una primera union.
4. El aparato de acuerdo con una cualquiera de las clausulas anteriores, en el que el canal de salida esta en comunicacion de fluido con el canal de entrada.
5. El aparato de acuerdo con una cualquiera de las clausulas anteriores, que comprende:
una tubena, un puerto o una interconexion en comunicacion de fluido con el canal de entrada; opcionalmente en el que una pluralidad de alfcuotas de la muestra de fluido se forman externamente al
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aparato y fluyen hacia el canal de entrada del aparato a traves de la tubena, el puerto o la interconexion en comunicacion de fluido con el canal de entrada; y/o,
una pluralidad de canales de flujo, y en el que una pluralidad de alfcuotas de la muestra de fluido se separan ffsicamente en la pluralidad de canales de flujo.
6. El aparato de acuerdo con una cualquiera de las clausulas anteriores, en el que:
el mecanismo es capaz de dirigir en paralelo la pluralidad de alfcuotas de la muestra de fluido; y/o, el detector comprende un dispositivo de formacion de imagenes; y/o,
el detector comprende mas de un dispositivo de deteccion; o en el que el detector comprende un unico dispositivo de deteccion; y/o,
el detector se selecciona del grupo que consiste en una camara, un multiplicador de electrones, un sensor de imagen de dispositivo de carga acoplada (CCD), un tubo fotomultiplicador (PMT), un fotodiodo de avalancha (APD), un diodo de avalancha de foton unico (SPAD), y un sensor de imagen de semiconductor de oxido metalico complementario (CMOS); o comprende un fotodetector, electrodetector, detector acustico o magnetico; o en el que el detector incorpora imagenes de microscopfa por fluorescencia.
7. El aparato de acuerdo con una cualquiera de las clausulas anteriores, en el que:
el aparato comprende una fuente de radiacion electromagnetica para la interrogacion de la alfcuota; y/o, el detector es capaz de detectar en paralelo la presencia o ausencia de la partfcula rara en la pluralidad de alfcuotas de la muestra de fluido; o la formacion en imagenes en paralelo de la partfcula rara en la pluralidad de alfcuotas de la muestra de fluido.
8. Un metodo para detectar una partfcula rara en una muestra de fluido, comprendiendo el metodo:
(a) detectar la presencia o ausencia de la partfcula rara en una alfcuota de la muestra de fluido;
(b) asignar un valor a la alfcuota en base a la presencia o ausencia de la partfcula rara en la alfcuota, en el que la partfcula rara es una celula o macromolecula presente en la muestra de fluido a un nivel bajo que comprende menos de aproximadamente 1 parte por 103 de la poblacion total de partfculas en la muestra de fluido; y
(c) dirigir un flujo de o recoger la alfcuota basandose en el valor asignado.
9. El metodo de la clausula 8, en el que la direccion del flujo de la alfcuota comprende el uso de un mecanismo capaz de dirigir el flujo de la alfcuota, y en el que la alfcuota comprende una pluralidad de partfculas distribuidas aleatoriamente a lo largo de un espacio tridimensional.
10. El metodo de la clausula 8, en el que la deteccion comprende:
(i) poner en contacto la muestra de fluido con un reactivo de deteccion en condiciones adecuadas para transformar el reactivo de deteccion en un complejo que comprende el reactivo de deteccion y una partfcula rara; y
(ii) detectar la presencia o ausencia del complejo formado en (i) en la alfcuota de la muestra de fluido.
11. El metodo de la clausula 8, que comprende:
(i) poner en contacto un fluido biologico de un sujeto con un reactivo de deteccion en condiciones adecuadas para transformar el reactivo de deteccion en un complejo que comprende el reactivo de deteccion y la partfcula rara, en el que la partfcula rara es una celula o macromolecula presente en el fluido biologico en un nivel bajo;
(ii) detectar la presencia o ausencia de un complejo formado en (i) en la alfcuota del fluido biologico;
(iii) asignar un valor a la alfcuota en base a la presencia o ausencia de un complejo formado en (i).
12. El metodo de la clausula 8, en el que la partfcula rara se pone en contacto con un reactivo de deteccion diferenciable.
13. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las clausulas anteriores, en el que a la alfcuota se le asigna un primer valor si la alfcuota contiene la partfcula rara, o un segundo valor si la alfcuota no contiene la partfcula rara; opcionalmente en el que el primer valor depende de la identidad de la partfcula rara o de la concentracion de la partfcula rara en la alfcuota; opcionalmente en el que multiples alfcuotas que tienen el mismo valor asignado se agrupan entre sf.
14. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las clausulas anteriores, que comprende dirigir un flujo o recoger la alfcuota en base al valor asignado, en el que dirigir el flujo de la alfcuota comprende usar un mecanismo capaz de dirigir el flujo de la alfcuota, y en el que la alfcuota comprende una pluralidad de partfculas distribuidas aleatoriamente a lo largo de un espacio tridimensional.
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15. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las clausulas anteriores, en el que:
la deteccion se realiza durante el flujo continuo de la muestra de fluido a traves de un canal de flujo; y/o, la direccion comprende utilizar un mecanismo capaz de dirigir en paralelo el flujo de la pluralidad de alfcuotas de la muestra de fluido; opcionalmente en el que la pluralidad de alfcuotas de la muestra de fluido estan ffsicamente separadas antes de la deteccion; opcionalmente en el que las alfcuotas en la pluralidad de alfcuotas se dividen en canales o camaras de flujo separadas antes de la deteccion; y/o,
la deteccion comprende:
(i) interrogar la alfcuota con una fuente externa de radiacion electromagnetica; y
(ii) detectar la fluorescencia de la partfcula rara; y/o
la deteccion comprende usar mas de un dispositivo de interrogacion y/o dispositivo de deteccion; o en el que la deteccion comprende el uso de un unico dispositivo de interrogacion y/o dispositivo de deteccion; y/o,
la deteccion comprende detectar la bioluminiscencia o quimioluminiscencia de la partfcula rara; y/o, el reactivo de deteccion es diferenciable por fluorescencia a diferentes longitudes de onda; y/o, la muestra de fluido se pone en contacto simultaneamente con una pluralidad de reactivos de deteccion diferenciables, teniendo cada uno una especificidad diferente en condiciones suficientes para transformar la pluralidad de reactivos de deteccion en una pluralidad de complejos que comprenden los reactivos de deteccion y una pluralidad de partfculas raras; opcionalmente en el que la pluralidad de complejos se detectan en paralelo; y/o
la deteccion comprende detectar en paralelo la presencia o ausencia de la partfcula rara en una pluralidad de alfcuotas de la muestra de fluido; o formar imagenes en paralelo de la partfcula rara en una pluralidad de alfcuotas de la muestra de fluido.
16. El aparato de acuerdo con una cualquiera de las clausulas anteriores o el metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que:
una alfcuota en la pluralidad de alfcuotas comprende un volumen discreto; y/o, la partfcula rara es una celula rara; y/o, la alfcuota contiene mas de una partfcula rara; y/o, la muestra de fluido es un fluido biologico.
Entre otros aspectos, la presente divulgacion proporciona metodos y aparatos que exploran rapidamente un gran volumen de un fluido para la deteccion y/o cuantificacion de biopartfculas deseadas mediante la clasificacion de alfcuotas. En un aspecto, el concepto empleado, denominado clasificacion de alfcuotas de decision de conjunto ("eDAR"), es particularmente util para detectar celulas raras en biofluidos.
En un aspecto, la presente divulgacion proporciona un metodo para detectar una partfcula rara en una muestra de fluido, comprendiendo el metodo las etapas de detectar la presencia o ausencia de la partfcula rara en una alfcuota de la muestra de fluido, asignar un valor a la alfcuota en base a la presencia o ausencia de la partfcula rara, y dirigir el flujo o recogida de la alfcuota en base al valor asignado.
En una segunda realizacion, la presente divulgacion proporciona un metodo para proporcionar a un sujeto un diagnostico o pronostico para una afeccion asociada con la presencia de una partfcula rara en un fluido biologico, comprendiendo el metodo las etapas de detectar la presencia o ausencia de la partfcula rara en una alfcuota del fluido biologico, asignando un valor a la alfcuota en base a la presencia o ausencia de la partfcula rara, y proporcionando un diagnostico o pronostico al sujeto en base al valor asignado.
En un tercer aspecto, la presente divulgacion proporciona un dispositivo para detectar una partfcula rara en una muestra de fluido, comprendiendo el dispositivo al menos un primer canal de entrada, al menos dos canales de salida, al menos un detector capaz de detectar una o mas partfculas raras en una alfcuota de la muestra de fluido, un mecanismo para dirigir el flujo de la alfcuota, y un ordenador capaz de asignar un valor a la alfcuota en base a la presencia, ausencia, identidad, composicion o cantidad de las partfculas raras en la alfcuota, en el que el ordenador esta en comunicacion con el detector y el mecanismo para dirigir el flujo de la alfcuota.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
La figura 1 ilustra la deteccion simultanea de multiples partfculas en una alfcuota y las direcciones de la alfcuota.
La figura 2 ilustra una mascara con aperturas para mejorar la relacion senal/ruido como se utiliza en la eDAR.
La figura 3 ilustra una mascara con aperturas estrechamente espaciadas para mejorar la relacion senal- ruido como se utiliza en la eDAR.
La figura 4 ilustra un aparato eDAR que cosiste en un unico canal de flujo, 2 laseres y tres detectores.
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La figura 5 ilustra un aparato eDAR que consiste en tres canales de flujo, un laser y un detector.
La figura 6 ilustra un aparato eDAR que consiste en tres canales de flujo, un laser y tres detectores.
La figura 7 ilustra un aparato eDAR que consiste en cinco canales de flujo, un laser y tres detectores.
La figura 8 muestra una comparacion en los recuentos de celulas tumorales circulantes (CTC) de la
sangre usando eDAR (panel superior) y un instrumento comercial (CellSearch de Veridex, panel inferior). Las figuras 9A-C muestran las imagenes opticas de celulas cancerosas atrapadas a partir de sangre de paciente usando eDAR (las flechas marcan las CTC) bajo diversas iluminaciones. La figura 9A es una imagen de campo claro de una CTC en medio de globulos rojos. La figura 9B es una imagen de fluorescencia que indica la presencia de pan-citoqueratina. La figura 9C es una imagen de fluorescencia que indica la ausencia de CD45, descartando asf la posibilidad de falsa identificacion de un globulo blanco como una CTC.
Las figuras 10A-D muestran imagenes opticas de celulas madre cancerosas que se distinguen de las celulas cancerosas ordinarias. Las puntas de flecha indican celulas madre de cancer (CD44+/CD24-). La figura 10A es una imagen de fluorescencia (500-540 nm) para detectar Alexa 488-anti-CD44 (verde); la figura 10B es una imagen de fluorescencia (645-700 nm) para detectar Alexa 647-anti-CD24 (rojo); la figura 10C es la imagen de campo claro. La figura l0D es una imagen compuesta que indica CD44+/CD24- (las flechas indican celulas madre de cancer).
Las figuras 11A-D ilustran el funcionamiento del dispositivo 1110 para dividir en alfcuotas una suspension. Las figuras 12A-C ilustran el dispositivo 1210 utilizado para dividir en alfcuotas la suspension con cinco canales de fluido (1211, 1212, 1213, 1214 y 1215) unidos en la union 1240.
La figura 13 muestra las senales de fluorescencia recogidas de 2 fotodiodos de avalancha (APD) situados en diferentes lugares aguas arriba y aguas abajo de la union 1116 (o 1240). El grafico 1310 muestra la huella de senal 1311 de un APD configurado para detectar la presencia de la molecula de EpCAM en una alfcuota al volumen de deteccion 1140 (o 1270), mientras que el grafico 1320 muestra a huella de senal 1321 de un segundo APD configurado para detectar la presencia de la molecula de EpCAM en el canal 1114 (o 1214).
La figura 14 muestra el grafico 1410 que ilustra el porcentaje de celulas cancerosas recuperado en funcion de la longitud del pulso usando eDAR. La huella 1420 indica que cuando el ancho de pulso era de 10 ms o menos, el 100 % de las celulas cancerosas se recogieron en el canal correcto.
La figura 15 muestra el grafico 1510 indicando la huella 1520 el porcentaje de celulas raras recuperadas en funcion del caudal entrante.
La figura 16 ilustra el uso de alfcuotas acuosas discretas separadas por una fase inmiscible para encapsular biopartfculas antes de alcanzar el volumen de deteccion.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
I. Descripcion general
En un aspecto, la presente divulgacion proporciona metodos y aparatos para detectar y/o recuperar partfculas raras en una muestra de fluido. El concepto incorporado en este aspecto se denomina en el presente documento "Clasificacion de alfcuotas de decision de conjunto" o "eDAR". En un aspecto de la presente divulgacion, la metodologfa eDAR puede caracterizarse como (i) deteccion de la presencia de ausencia de una partfcula rara en una alfcuota de la muestra de fluido, (ii) clasificacion de la alfcuota de acuerdo con la presencia o ausencia de una partfcula rara, y (iii) direccion del flujo o recogida de toda la alfcuota en base a la clasificacion asignada.
Para encontrar celulas raras, la eDAR ofrece una tremenda ventaja en cuanto a velocidad. Como ejemplo de esto, se considera una suspension celular de 10 ml que contiene 10 celulas raras deseadas. En este caso, aproximadamente el 99,9999 % del volumen de la suspension no contiene una unica celula rara deseada. Las tecnologfas existentes, tales como citometna de flujo, FACS, etc., invariablemente exploran en serie a traves de cada celula contenida en todo el volumen de la suspension, lo que da como resultado una perdida de casi todo el tiempo explorando a traves del 99,9999 % del volumen de suspension que no contiene una celula deseada. La EDAR permite una rapida seleccion de alto nivel de toda la suspension alicuotando la suspension. Si las celulas son realmente raras, la mayona de las alfcuotas no contendran ninguna celula deseada. En un aspecto de la presente divulgacion, estas alfcuotas se clasifican como nulas y se descartan a traves de un primer canal. En comparacion, las pocas alfcuotas que contienen celulas raras se clasifican como no nulas y se recogen en un canal o camara separados.
De esta manera, la eDAR es distinta de la citometna de flujo convencional. La citometna de flujo opera (1) fluyendo biopartfculas en una unica hilera (es decir, una por una en una fila) a traves del uso de un flujo envolvente para contener la fila de partfculas, (2) detectando solo una biopartfcula a la vez, y (3) determinando la trayectoria de la biopartfcula detectada. Si se desea la biopartfcula detectada, por ejemplo, la biopartfcula esta dirigida, a traves de uno de una diversidad de metodos, a seguir una cierta trayectoria para alcanzar un recipiente de recogida. Si la biopartfcula detectada es indeseable, la biopartfcula se dirige en una trayectoria diferente para alcanzar un recipiente de recogida diferente.
A diferencia de la citometna de flujo convencional, la eDAR interroga alfcuotas enteras, es decir,
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subdivisiones tridimensionales de un fluido, para tomar una decision de conjunto para toda la aKcuota. A diferencia de la serializacion (subdivision unidimensional del fluido, que da como resultado biopartfculas dispuestas en una sola fila) o planarizacion (subdivision bidimensional del fluido, que da como resultado biopartfculas dispuestas en multiples filas paralelas en un plano), la division en alfcuotas ofrece un rendimiento mucho mayor. La citometna de flujo es incapaz de analizar una alfcuota porque los detectores estan configurados solo para recoger senales de una sola celula o un unico plano de celulas. Las biopartfculas fuera del punto o plano de deteccion son totalmente invisibles para los detectores utilizados en los citometros de flujo y, por consiguiente, el flujo envolvente, los tampones de gma, u otros mecanismos de enfoque hidrodinamico o geometrico son necesarios para evitar la migracion de biopartfculas fuera del punto o plano de deteccion. La EDAR analiza una alfcuota completa que abarca mas de un plano o capa de biopartfculas. En la eDAR, se analizan las senales que emanan de una alfcuota completa, en contraposicion a un unico punto o plano de deteccion.
La eDAR ofrece una sensibilidad significativamente mayor sobre los metodos existentes para detectar o aislar celulas raras. Los componentes de deteccion de eDAR pueden detectar un unico foton emanado dentro de la alfcuota entera y, por lo tanto, no se pierde ninguna biopartfcula que muestre caractensticas detectables. La tasa de falsos negativos es extremadamente baja porque la clasificacion de alfcuotas esta configurada para eliminar solo alfcuotas que se clasifican como completamente desprovistas de biopartfculas deseadas.
Las realizaciones de acuerdo con la presente invencion pueden utilizarse en una amplia diversidad de aplicaciones en biologfa y diagnostico de enfermedades, incluyendo la captura de celulas cancerosas o celulas madre de cancer de fluidos corporales para el pronostico de cancer; parasitos como giardia o cryptosporidium para el control de la calidad del agua; eritrocitos infectados por el paludismo para el diagnostico de la malaria; linfocitos y leucocitos para la monitorizacion del VIH; celulas fetales en la sangre materna para la deteccion de enfermedades; celulas madre para terapia; celulas infectadas por priones para la deteccion de enfermedades relacionadas con priones (por ejemplo, vaca loca).
Ademas de la malaria, la presente invencion puede utilizarse para monitorizar los linfocitos T CD4+ en el diagnostico y monitorizacion del Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH). El recuento absoluto de linfocitos T CD4+ puede servir como criterio para iniciar la terapia antirretroviral y la profilaxis de la infeccion oportunista en pacientes infectados por el VIH. La reduccion de los linfocitos T CD4+, que es una subpoblacion de leucocitos (globulos blancos), se correlaciona fuertemente con la disminucion de la defensa inmunologica. El Servicio de Salud Publica del CDC ha recomendado el monitoreo del nivel de linfocitos T CD4+ cada 3-6 meses en todas las personas infectadas con el VIH como una forma de iniciar estrategias de tratamiento apropiadas y evaluar la eficacia del tratamiento.
En algunos laboratorios, el numero absoluto de linfocitos T CD4+ se establece utilizando el producto de tres tecnicas de laboratorio: el recuento total de globulos blancos, el porcentaje de globulos blancos que son linfocitos, y el porcentaje de linfocitos que son linfocitos T CD4+. Los citometros de flujo de una unica plataforma tal como FACSCount (BD Biosciences) no estan comercialmente disponibles en los pafses en desarrollo o como dispositivos portatiles. Pueden utilizarse realizaciones de acuerdo con la presente materia objeto para distinguir rapidamente los linfocitos T CD4+ de otros leucocitos y hematfes.
Otras aplicaciones posibles para separacion, concentracion y/o aislamiento dirigidas por realizaciones de acuerdo con la presente invencion incluyen monitorizacion de celulas fetales en sangre materna para diagnostico prenatal de trastornos geneticos y deteccion de priones. Un prion incluye una pequena partfcula proteica infecciosa que resiste la inactivacion mediante procedimientos que modifican los acidos nucleicos. Ademas, las realizaciones de acuerdo con la presente materia objeto pueden usarse con celulas fetales u otras partfculas microbiologicas o partfculas nanobiologicas.
II. Definiciones
Como se usa en el presente documento, una "muestra de fluido" se refiere a cualquier lfquido que puede o no contener una partfcula rara de interes. En ciertas realizaciones, la muestra de fluido puede ser una muestra de fluido biologico, por ejemplo, una muestra de sangre, una muestra de plasma, una muestra de saliva, una muestra de orina, una muestra de linfa, una muestra de fluido espinal, y similares. En otras realizaciones, la muestra puede ser una muestra de fluido ambiental, por ejemplo, de un lago, no, oceano, estanque, arroyo, cienaga, pantano, embalse, o similar. En otras realizaciones, la muestra puede ser una muestra de agua, por ejemplo, de una planta de desalinizacion, una planta de tratamiento de agua, un deposito, un muelle, una corriente, un flujo de agua glacial, una torre de agua, u otra fuente de agua que pueda contemplarse como una fuente de agua potable.
Como se utiliza en el presente documento, una "partfcula rara" se refiere a una celula o macromolecula presente en una muestra de fluido a un nivel bajo. En ciertas realizaciones, una partfcula rara puede ser una celula, protema, complejo de protema, acido nucleico, complejo de nucleoprotema, carbohidrato, metabolito, catabolito, y similares. En ciertas realizaciones, una partmula puede considerarse rara si esta
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presente en una muestra de fluido a una concentracion de menos de aproximadamente el 10 % de la poblacion total de partfculas en el fluido, o en menos de aproximadamente el 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1%, 0,05%, 0,01%, o menos de la poblacion total de partfculas en el fluido. En otras realizaciones, la partfcula rara puede estar presente en una muestra de fluido a menos de aproximadamente 1 parte por 103 de la poblacion total de partfculas en el fluido, o en menos de aproximadamente 1 parte por 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, o menos de la poblacion total de partfculas en el fluido.
En una realizacion particular, la partfcula rara es una celula rara. Las celulas raras pueden estar nucleadas o no nucleadas. Las celulas raras incluyen, pero sin limitacion, celulas que expresan un fenotipo maligno; celulas fetales, tales como celulas fetales en sangre periferica materna, celulas tumorales, tales como celulas tumorales que han sido eliminadas de tumor en sangre u otros fluidos corporales; celulas infectadas con un virus, tales como celulas infectadas por VIH, celulas transfectadas con un gen de interes; y subtipos aberrantes de linfocitos T o linfocitos B presentes en la sangre periferica de sujetos afectados con trastornos auto-reactivos.
Como se usa en el presente documento, una "decision de conjunto" se refiere a una decision tomada en base a la deteccion de la presencia o ausencia de una caractenstica en un conjunto, o un grupo de partfculas. En ciertas realizaciones, se tomara una decision de conjunto en base la presencia o ausencia de una unica partfcula distinta en una alfcuota de una muestra de fluido que contiene una pluralidad de partfculas. De forma importante, las decisiones de conjunto hechas en base a la presencia o ausencia de una unica partfcula se aplicaran a toda la alfcuota (es decir, a todas las partfculas presentes en la alfcuota).
Como se usa en el presente documento, una "alfcuota" se refiere a una porcion del volumen total de una muestra de fluido a analizar. Una alfcuota ocupa un espacio tridimensional y las partfculas dentro se distribuyen al azar sin organizacion. Una alfcuota tiene una profundidad finita, y las partfculas pueden distribuirse a lo largo de la profundidad sin capas discernibles. En el contexto de la presente invencion, una alfcuota se analiza en su totalidad sin subdivision. La hoja, la cinta, el plano o terminos similares que sugieren espacios bidimensionales y que se usan para describir metodos de clasificacion de celulas actuales (por ejemplo, citometna de flujo, FACS, etc.) que tfpicamente emplean enfoque hidrodinamico no se consideran una alfcuota.
En ciertas realizaciones, una alfcuota puede consistir en una fraccion de una muestra de fluido mas grande, por ejemplo, aproximadamente 1/2 de una muestra de fluido, o aproximadamente 1/3, 1/4, 1/5, 1/6, 1/7, 1/8, 1/9, 1/10, o menos de una muestra de fluido. En ciertas realizaciones, una alfcuota puede consistir, por ejemplo, en aproximadamente el 10 % de una muestra de fluido, o aproximadamente el 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1%, 0,05%, 0,01%, 0,001%, o menos de una muestra de fluido. Como tal, un fluido que se va a examinar o procesar mediante una metodologfa eDAR proporcionada en el presente documento se puede dividir, por ejemplo, en al menos aproximadamente 2 alfcuotas, o al menos aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.100, 1.200, 1.300, 1.400, 1.500, 1.600, 1.700, 1.800, 1.900, 2.000, 2.500,
3.000, 3.500, 4.000, 4.500, 5.000, 6.000, 7.000, 8.000, 9.000, 10.000, 20.000, 30.000, 40.000, 50.000,
60.000, 70.000, 80.000, 90.000, 100.000, 200.000, 300.000, 400.000, 500.000, 600.000, 700.000,
800.000, 900.000, 1 millon, 2 millones, 3 millones, 4 millones, 5 millones, 6 millones, 7 millones, 8 millones, 9 millones, 10 millones, o mas alfcuotas. Un experto en la tecnica entendera que el numero de alfcuotas en las que se dividira una muestra de fluido dependera del numero de partfculas raras esperadas en el fluido y del volumen total de la muestra de fluido.
En ciertas realizaciones, una alfcuota puede tener un volumen, por ejemplo, de entre aproximadamente 0,1 nl y aproximadamente 10 ml, o entre aproximadamente 1 nl y aproximadamente 1 ml, o entre aproximadamente 1 nl y aproximadamente 100 pl, o entre aproximadamente 1 nl y aproximadamente 10 pl, o entre aproximadamente 1 nl y aproximadamente 1 pl, o entre aproximadamente 1 nl y aproximadamente 100 nl.
Como se usa en el presente documento, el termino "clasificacion" se refiere a la evaluacion de una propiedad cuantitativa, propiedad cualitativa, o importancia de una alfcuota por categorizacion. En una realizacion, una alfcuota puede clasificarse como nula (por ejemplo, cuando una partfcula rara no se detecta en la alfcuota) o no nula (por ejemplo, cuando al menos una partfcula rara se detecta en una alfcuota). En una realizacion, la clasificacion puede ser binaria. En otras realizaciones, una alfcuota puede clasificarse segun categonas adicionales, por ejemplo, que se correlacionan con la concentracion de la partfcula rara en la alfcuota, la identidad de la partfcula rara en la alfcuota, las identidades de una pluralidad de diferentes partfculas raras en la alfcuota, y similares. De esta manera, se pueden asignar cualquier numero de categonas basandose en intervalos de concentracion, por ejemplo, entre aproximadamente 1 y 10, entre aproximadamente 11 y 20, entre aproximadamente 1 y 50, entre aproximadamente 51 y 100, entre aproximadamente 1 y 100, entre aproximadamente 101 y 201, etc. A
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estas clasificaciones se les puede asignar un numero arbitrario que corresponde a una de varias categonas cuantitativas o cualitativas predeterminadas (por ejemplo, 0, 1, 2, 3, 4, 5, etc.), o un numero correspondiente a un valor real para el numero o numero aproximado o partfculas raras en la alfcuota.
Como se usa en el presente documento, una "caractenstica detectable" se refiere a una propiedad asociada con una partfcula rara, por ejemplo, una propiedad fotoactiva, electroactiva, bioactiva o magnetica que es intrmseca a la partfcula rara o que esta asociada con un resto detectable unido a o conjugado con la partfcula rara.
Los ejemplos de propiedades fotoactivas incluyen, por ejemplo, alteraciones en la intensidad optica (reflexion optica, dispersion, deflexion, transmision o absorbancia) comunmente inducida por la morfologfa de biopartfculas (tamano de partfcula, granularidad, estructuras subcelulares internas), fluorescencia, inmunofluorescencia, y similares.
Los ejemplos de propiedades electroactivas incluyen, por ejemplo, cambios en la carga electrica, estado de oxidacion, estado de giro, capacitancia, conductancia, propiedades dielectricas, movilidad electroforetica, o polarizabilidad.
Los ejemplos de propiedades bioactivas incluyen, por ejemplo, interacciones detectables con enzimas tales como fosfatasa alcalina (AP), peroxidasa de rabano picante (HRP), p-galactosidasa y sus sustratos quimioluminiscentes, colometricos o quimiofluorescentes, que incluyen, pero sin limitacion, TMB (3,3',5,5'- tetrametilbenzidina), OPD (o-fenilen-diamina, ABTS (sulfonato de 2,2'-azinodietilbenztiazolina), clornaftol, AEC (3-amino-9-etilcarbazol), DAB (Diaminobenzidina), PNPP (fosfato de p-nitrofenilo), BCIP/NbT (fosfato de bromocloroindolilo - nitro azul Tetrazolio, y similares).
En ciertas realizaciones, los restos que pueden usarse para detectar una partfcula rara incluyen, sin limitacion, nanopartfculas, microperlas, anticuerpos y fragmentos de los mismos, anticuerpos fluorescentes, nanopartfculas magneticas, moleculas de polfmero, moleculas de colorante, moleculas de ADN o ARN (por ejemplo, aptameros), moleculas lipfdicas, moleculas de protemas, y similares.
Como se usa en el presente documento, un "anticuerpo" se refiere a un polipeptido que comprende una region de armazon a partir de un gen de inmunoglobulina o fragmentos de los mismos que se une espedficamente y reconoce un antigeno. Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los genes de la region constante kappa, lambda, alfa, gamma, delta, epsilon y mu, asf como los genes de la region variable de inmunoglobulina. Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o epsilon, que a su vez definen las clases de inmunoglobulinas, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Tfpicamente, la region de union a antfgeno de un anticuerpo sera mas cntica en especificidad y afinidad de union. Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales, derivados de suero, un hibridoma o clonados recombinantemente, y tambien pueden ser quimericos, primatizados u humanizados.
Una unidad estructural de inmunoglobulina ejemplar (anticuerpo) comprende un tetramero. Cada tetramero esta compuesto por dos pares identicos de cadenas polipeptfdicas, teniendo cada par una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kD) y una cadena "pesada" (aproximadamente 50-70 kD). El extremo N de cada cadena define una region variable de aproximadamente 100 a 110 o mas aminoacidos que son los principales responsables del reconocimiento del antfgeno. Los terminos cadena ligera variable (VL) y cadena pesada variable (VH) se refieren respectivamente a estas cadenas ligera y pesada.
Los anticuerpos existen, por ejemplo, como inmunoglobulinas intactas o como varios fragmentos bien caracterizados producidos por digestion con diversas peptidasas. Por lo tanto, por ejemplo, la pepsina digiere un anticuerpo por debajo de los enlaces disulfuro en la region bisagra para producir F(ab)'2, un dfmero de Fab que a su vez es una cadena ligera unida a Vh-Ch1 por un enlace disulfuro. El F(ab)' 2 puede reducirse en condiciones suaves para romper el enlace disulfuro en la region bisagra, convirtiendo asf el dfmero F(ab)'2 en un monomero Fab'. El monomero Fab' es esencialmente Fab con parte de la region bisagra (vease Fundamental Immunology (Paul ed., 3a ed. 1993). Aunque se definen diversos fragmentos de anticuerpos en terminos de la digestion de un anticuerpo intacto, un experto apreciara que dichos fragmentos pueden sintetizarse de novo qmmicamente o usando metodologfa de ADN recombinante. Por lo tanto, el termino anticuerpo, como se usa en el presente documento, tambien incluye fragmentos de anticuerpo producidos por la modificacion de los anticuerpos completos, o los sintetizados de novo usando metodologfas de ADN recombinante (por ejemplo, Fv monocatenario) o los identificados usando bibliotecas de presentacion en fagos (vease, por ejemplo, McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990)).
En una realizacion, el anticuerpo se conjuga con un marcador o un resto detectable.
Como se usa en el presente documento, un "marcador" o un "resto detectable" se refiere a una composicion detectable por medios espectroscopicos, fotoqmmicos, bioqmmicos, inmunoqmmicos,
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qmmicos u otros medios ffsicos. Por ejemplo, los marcadores utiles incluyen, sin limitacion, radionuclidos, tintes fluorescentes (por ejemplo, fluorescema, isotiocianato de fluorescema (FITC), verde Oregon, rodamina, rojo Texas, isotiocianato de tetrarodimina (TRITC), Cy3, Cy5, etc.), marcadores fluorescentes (por ejemplo, protema fluorescente verde (GFP), ficoeritrina, etc.), compuestos fluorescentes autoinactivados que son activados por proteasas asociadas a tumor, enzimas (por ejemplo, luciferasa, peroxidasa de rabano picante, fosfatasa alcalina, etc.), nanopartmulas, biotina, digoxigenina, y similares.
En ciertas realizaciones, los reactivos de deteccion pueden perfundirse para marcar selectivamente o acentuar las celulas aisladas. Los ejemplos de dichos reactivos incluyen, sin limitacion, moleculas fluorescentes, inmunofluorescentes, conjugadas con tinte (tales como anticuerpos, fragmentos fab, aptameros, polfmeros, ligandos, agonistas, antagonistas o combinaciones de los mismos) compuestos magneticos, electroactivos, bioactivos o fotoactivos. Un ejemplo es usar un tinte que reaccione con citoqueratinas, que son componentes integrales del citoesqueleto en celulas epiteliales cancerosas. Otros ejemplos de tinte incluyen el anticuerpo epitelial antihumano de raton conjugado con isocianato de fluorescema (FITC) y anti-CD45 conjugado con ficoeritrina (PE). Otros ejemplos de anticuerpos conjugados con tinte incluyen, pero sin limitacion, el anticuerpo pan-citoqueratina A45B/B3, AE1/AE3 o CAM5.2 (anticuerpos pan-citoqueratina que reconocen citoqueratina 8 (CK8), citoqueratina 18 (CK18), o la citoqueratina 19 (CK19) y los contrarios: antfgeno de cancer de mama NY-BR-1 (tambien conocido como B726p, ANKRD30A, dominio de repeticion de ankirina 30A); isoforma B305D A o C (B305D-A o B305D-C; tambien conocido como antfgeno B305D); antfgeno de Hermes (tambien conocido como Antigeno CD44, PGP1); E-cadherina (tambien conocida como Uvomorulina, Cadherina-1, CDH1); antfgeno carcino- embrionario (CEA; tambien conocido como CEACAM5 o molecula de adhesion celular 5 relacionada con antfgeno Carcino-embrionario); gonadotropina corionica humana U (p-HCG; tambien conocida como CGB, gonadotropina cronica, polipeptido p); catepsina-D (tambien conocida como CTSD); receptor del neuropeptido Y Y3 (tambien conocido como NpY3R; protema 3 asociada a lipopolisacarido, LAP3, Fusion; quimiocina (motivo CXC, receptor 4); CXCR4); Oncogen ERBB1 (tambien conocido como c-erbB-1, receptor del factor de crecimiento epidermico, EGFR); Her-2 Neu (tambien conocido como c-erbB-2 o ERBB2); receptor GABA A, polipeptido pi (n) (tambien conocido como GABARAP, receptor GABA-A, polipeptido pi (n) (GABA A(n), subunidad pi (n) del receptor A del tipo acido Y-aminobutmco), o GABRP); ppGalNac-T(6) (tambien conocido como p-1-4-N-acetil-galactosaminil-transferasa 6, GalNActransferasa 6, GalNAcT6, UDP-N-acetil-D-galactosamina:polipeptido N-acetilgalactosaminiltransferasa 6, o GALNT6); CK7 (tambien conocida como Citoqueratina 7, Sarcolectina, SCL, Queratina 7, o KRT7); CK8 (tambien conocida como Citoqueratina 8, Queratina 8, o KRT8); CK18 (tambien conocida como Citoqueratina 18, Queratina 18, o KRT18); CK19 (tambien conocida como Citoqueratina 19, Queratina 19, o kRt19); CK20 (tambien conocida como Citoqueratina 20, Queratina 20, o KRT20); Mage (tambien conocido como subtipos A de la familia del antfgeno de melanoma o subtipos de MAGE-A); Mage3 (tambien conocido como familia A del antfgeno de melanoma 3, o MAGA3); receptor del factor de crecimiento de hepatocitos (tambien conocido como HGFR, carcinoma papilar de celulas renales 2, RCCP2, Protooncogen met, o MET); Mucina-1 (tambien conocida como MUC1, antfgeno de carcinoma 15.3, (CA15.3), antfgeno de carcinoma 27.29 (CA 27.29); antfgeno CD227, Episialina, antfgeno de membrana epitelial (EMA), mucina epitelial polimorfica (PEM), mucina urinaria de reactivo de cacahuete (PUM), glicoprotema asociada a tumor 12 (TAG 12)); protema de fluido de enfermedad qrnstica grave (tambien conocida como GCDFP-15, protema inducina por prolactina, PIP); receptor de urocinasa (tambien conocido como uPR, antfgeno CD87, receptor de activador de plasminogeno de tipo urocinasa, PLAUR); PTHrP (protemas relacionadas con la hormona paratiroidea; tambien conocidas como PTHLH); BS106 (tambien conocido como B511S, mucina epitelial de mama pequena, o SBEM); lipofilina B de tipo prostatema (LPB, LPHB; tambien conocido como antfgeno BU101, miembro 2 1-D de la familia de secretoglobina, SCGB1-D2); Mamaglobina 2 (MGB2; tambien conocida como Mamaglobina B, MGBB, Lacriglobina (LGB) Lipofilina C (LPC, LPHC), miembro 1 de la familia de secretoglobina 2A, o SCGB2A1); Mamaglobina (MGB; tambien conocida como Mamaglobina 1, MGB1, Mamaglobina A, MGBA, miembro 2 de la familia de secretoglobina 2A, o SCGB2A2); inhibidor de serina proteasa mamaria (Maspina, tambien conocido como clado B de inhibidor de serina (o cistema) proteinasa (ovalbumina), miembro 5, o SERPINB5); factor de transcripcion Ets espedfico de epitelio prostasico (PDEF; tambien conocido como factor de transcripcion ets que contiene el dominio apuntando al motivo alfa esteril, o SPDEF); transductor de senal de calcio asociado a tumor 1 (tambien conocido como antfgeno de carcinoma colorrectal CO17-1A, Glicoprotema epitelial 2 (EGP2), Glicoprotema epitelial 40 kDa (EGP40), molecula de adhesion de celulas epiteliales (EpCAM), antfgeno espedfico epitelial (ESA), antfgeno asociado a tumor gastrointestinal 733-2 (GA733-2), antfgeno KS1/4, componente de membrana de marcador de superficie 1 del cromosoma 4 (M4S1), antfgeno MK-1, antfgeno MIC18, antfgeno TROP-1, o TACSTD1); transcriptasa inversa de Telomerasa (tambien conocida como subunidad de Telomerasa catalttica, o TERT); Factor 1 de trebol (tambien conocido como secuencia inducible por estrogenos de cancer de mama, BCEI, protema de trebol gastrointestinal, GTF, protema pS2, o TFF1); folato; o Factor 3 de trebol (tambien conocido como Factor de trebol intestinal, ITF, p1.B; o TFF3).
La expresion "se une espedficamente (o selectivamente)" a un anticuerpo o "espedficamente (o selectivamente) inmunorreactiva con", cuando se refiere a una partmula rara, por ejemplo, una protema, acido nucleico o celula, se refiere a una reaccion de union que es determinante de la presencia de la
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partfcula rara, a menudo en una poblacion heterogenea de partfculas y otros productos biologicos. Por lo tanto, bajo las condiciones de inmunoensayo designadas, los anticuerpos especificados se unen a una partfcula rara particular al menos dos veces el fondo y mas tipicamente mas de 10 a 100 veces el fondo. La union espedfica a un anticuerpo en tales condiciones requiere un anticuerpo que se selecciona por su especificidad para una partfcula particular. Por ejemplo, se pueden seleccionar anticuerpos policlonales para obtener solamente aquellos anticuerpos policlonales que son espedficamente inmunorreactivos con el antigeno seleccionado y no con otras protemas. Esta seleccion puede lograrse restando anticuerpos que reaccionan de forma cruzada con otras moleculas.
En un aspecto, la presente invencion proporciona un metodo para detectar una o mas biopartfculas raras en un fluido de muestra; comprendiendo dicho metodo: a) interrogar una o mas alfcuotas de dicho fluido de muestra; b) en una unica medicion detectar la presencia o ausencia de dicha una o mas biopartfculas raras en cada una de dichas alfcuotas, en la que al menos una de dichas alfcuotas comprende multiples biopartfculas; y c) clasificar dichas alfcuotas basandose en la presencia o ausencia de dichas una o mas biopartfculas raras. En ciertas realizaciones, las biopartfculas raras son celulas. En una cierta realizacion, las biopartfculas raras son celulas marcadas por fluorescencia.
En algunas realizaciones de los metodos proporcionados en el presente documento, se detectan multiples parametros en una unica medicion. En una realizacion particular, los multiples parametros son colores fluorescentes diferentes.
En ciertas realizaciones de los metodos proporcionados en el presente documento, el fluido de muestra se estabiliza mediante la adicion de anticoagulantes, compuestos que previenen la aglomeracion de celulas en la muestra que incluye dichas biopartfculas o sus combinaciones.
En algunas realizaciones, la clasificacion de alfcuotas es binaria, por ejemplo, se asigna a una alfcuota un valor de "0" si la alfcuota no contiene un artfculo raro y un valor de "1" si lo contiene. En otras realizaciones, la clasificacion no es binaria, por ejemplo, el valor se asigna en base al numero o las partfculas raras presentes en la alfcuota o la identidad de las partfculas raras en la muestra. En ciertas realizaciones, la clasificacion se realiza mediante un ordenador y un software que representa un algoritmo de clasificacion.
En algunas realizaciones, los metodos proporcionados en el presente documento comprenden ademas una etapa de canalizacion de las alfcuotas basandose en su clasificacion. Por ejemplo, el flujo o la recogida de las alfcuotas se dirige en funcion del valor asignado a la alfcuota. En ciertas realizaciones, esto se consigue mediante el uso de campos externos o mediante la creacion de perturbaciones de flujo.
En ciertas realizaciones, el metodo puede comprender concentrar las biopartfculas raras recogiendo y/o agrupando alfcuotas con dicha clasificacion similar.
En algunas realizaciones de los metodos proporcionados en el presente documento, las biopartfculas raras se seleccionan del grupo que consiste en celulas cancerosas, celulas madre de cancer, giardia, cryptosporium, eritrocitos infectados con malaria, linfocitos, leucocitos, celulas fetales y celulas infectadas por priones.
En otro aspecto, la presente invencion proporciona un dispositivo para detectar una o mas biopartfculas raras en un fluido de muestra; comprendiendo dicho dispositivo: a) uno o mas detectores para detectar la presencia o ausencia de una o mas biopartfculas raras en cada una de una o mas alfcuotas en el que al menos una de dichas una o mas alfcuotas comprende multiples biopartfculas; y b) un ordenador con software para clasificar dichas alfcuotas basandose en la presencia o ausencia de dichas una o mas biopartfculas raras. En una realizacion, la clasificacion es binaria. En otras realizaciones, en las que el dispositivo se utiliza para detectar multiples tipos de biopartfculas, la clasificacion no es binaria.
En ciertas realizaciones, el dispositivo puede comprender ademas canales para canalizar dichas alfcuotas en base a dicha clasificacion. En realizaciones particulares, los canales se tratan con compuestos anticoagulantes, compuestos que se unen preferiblemente a las biopartfculas raras, compuestos que previenen la aglomeracion de biopartfculas o sus combinaciones.
En ciertas realizaciones, el dispositivo puede comprender ademas electrodos para rastrear y manipular la trayectoria de dichas biopartfculas. En otras realizaciones, el dispositivo puede comprender ademas elementos magneticos para la separacion de biopartfculas con partfculas magneticas unidas. En otras realizaciones, el dispositivo puede comprender ademas elementos acusticos para rastrear y manipular la trayectoria de dichas biopartfculas.
En ciertas realizaciones de los dispositivos y aparatos proporcionados en el presente documento, el dispositivo comprende uno o mas detectores que se seleccionan de una camara, un multiplicador de electrones, un sensor de imagen de dispositivo de carga acoplada (CCD), un tubo fotomultiplicador (PMT),
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un fotodiodo de avalancha
(APD), un diodo de avalancha de foton unico (SPAD), o un sensor de imagen de semiconductor de oxido metalico complementary (CMOS).
En ciertas realizaciones de los dispositivos y aparatos proporcionados en el presente documento, el dispositivo puede comprender ademas una o mas fuentes para interrogar una o mas almuotas de dicho fluido de muestra. Por ejemplo, una fuente de radiacion electromagnetica. En realizaciones particulares, la una o mas fuentes de interrogacion se seleccionan de un laser (estado solido, diodo bombeado, ion o tinte), un diodo emisor de luz (LED), una lampara, una descarga de arco, un impulso magnetico, o una luz natural. En otras realizaciones, no se requiere una fuente para la interrogacion de la almuota cuando la biopartmula exhibe una emision de luz tal como quimioluminiscencia o bioluminiscencia.
III. Realizaciones
A. Metodos de deteccion
En un aspecto, la presente invencion proporciona un metodo para detectar una partmula rara en una muestra de fluido, comprendiendo el metodo las etapas de: (a) detectar la presencia o ausencia de la partmula rara en una almuota de la muestra de fluido; (b) asignar un valor a la almuota en base a la presencia o ausencia de la partmula rara, y (c) dirigir el flujo o recogida de la almuota en base al valor asignado.
En una realizacion, la etapa de deteccion de la presencia de la partmula rara comprende las subetapas de: (i) poner en contacto la muestra de fluido con un reactivo de deteccion en condiciones adecuadas para transformar el reactivo de deteccion en un complejo que comprende dicho reactivo de deteccion y una partmula rara; y (ii) detectar la presencia o ausencia de un complejo formado en la etapa (i) en una almuota de la muestra de fluido.
En ciertas realizaciones, el reactivo de deteccion puede comprender un anticuerpo marcado o no marcado, fragmento fab, aptamero, polfmero, nanopartmula, microperla, anticuerpo fluorescente, nanopartmula magnetica, molecula de polfmero, molecula de tinte, aptamero, molecula lipfdica, molecula de protema, y similares.
En otra realizacion, la etapa de deteccion de la presencia de la partmula rara comprende las subetapas de: (i) interrogar la almuota con una fuente externa de radiacion electromagnetica; y (ii) detectar la fluorescencia de la partmula rara.
En una realizacion, la partmula rara puede comprender una celula marcada fluorescentemente. En una cierta realizacion, la celula marcada fluorescentemente puede comprender una celula que expresa una protema fluorescente, o una celula que se ha marcado con un reactivo de deteccion fluorescente. Por ejemplo, una celula que expresa transitoriamente o de manera estable una protema fluorescente roja o verde.
En otra realizacion mas, en la que la partmula rara presenta quimioluminiscencia intrmseca o bioluminiscencia, la etapa de detectar la presencia de una partmula rara comprende detectar bioluminiscencia o quimioluminiscencia de la partmula rara.
En ciertas realizaciones, la partmula rara puede ser una celula, protema, complejo de protema, acido nucleico, complejo de nucleoprotema, carbohidrato, metabolito, catabolito, y similares. En una realizacion, la partmula rara es una celula. En las realizaciones particulares, la celula puede ser una celula cancerosa, una celula tumoral circulante (CTC), una celula madre cancerosa, una celula cancerosa que muestra un antfgeno de superficie de cancer, por ejemplo, uno seleccionado de los grupos que consisten en CD44, CD2, CD3, CD 10, CD 14, CD16, CD24, CD31, CD45, CD64, CD140b, o una combinacion de los mismos.
Las celulas madre cancerosas se pueden distinguir de las celulas cancerosas ordinarias por perfusion de otros reactivos que se unen selectivamente a biomarcadores, que pueden incluir pero sin limitacion, CD44, CD2, CD3, CD10, CD14, CD16, CD24. CD31, CD45, CD64 o CD140b.
En ciertas realizaciones, en las que la partmula rara es una celula cancerosa, las celulas contenidas dentro de las almuotas identificadas como que tienen una celula rara pueden ser ademas diseccionadas individualmente. Por ejemplo, estas celulas pueden dividirse o clasificarse mediante citometna de flujo tradicional o eDAR y las celulas deseadas pueden diseccionarse para comprender el origen del mal funcionamiento de la maquinaria celular. El contenido dentro de cada celula puede analizarse individualmente para determinar el ADN, ARN, la secuencia de ADN, metabolito, lfpido, carbohidrato, contenido de protema, o similares.
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En otras realizaciones, la celula rara puede ser una celula o un organismo parasite, por ejemplo, una especie de Giardia o Cryptosporidium, un eritrocito infectado con una especie de Plasmodium, un linfocito
0 leucocito infectado con VIH, una celula fetal en sangre materna, una celula madre, una celula infectada con priones, un linfocito T CD4+, y similares.
En una realizacion, la muestra de fluido puede comprender mas de un tipo de partfcula rara, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas tipos de partfculas raras. Por consiguiente, en ciertas realizaciones la muestra de fluido se pone en contacto simultaneamente con una pluralidad de reactivos de deteccion diferenciables, teniendo cada uno una especificidad diferente en condiciones suficientes para transformar la pluralidad de reactivos de deteccion en una pluralidad de complejos que comprenden los reactivos de deteccion y una pluralidad de partfculas raras. En algunas realizaciones, la pluralidad de complejos se detectan simultaneamente, por ejemplo, utilizando un aparato eDAR que comprende mas de un dispositivo de interrogacion y/o mas de un dispositivo de deteccion.
Por ejemplo, en el caso de que dos partfculas raras sean detectadas simultaneamente, cada partfcula rara puede ponerse en contacto con un reactivo de deteccion diferenciable, cada uno de los cuales puede ser detectado por uno de dos dispositivos de deteccion. Ademas, cuando los reactivos de deteccion comprenden restos fluorescentes, se pueden usar dos dispositivos de interrogacion (por ejemplo, dos laseres que producen radiacion a diferentes longitudes de onda correspondientes a las longitudes de onda de excitacion de los diferentes restos fluorescentes) y la respectiva radiacion fluorescente puede ser detectada por dos dispositivos de deteccion diferentes. Por consiguiente, en una realizacion, los reactivos de deteccion son diferenciables por fluorescencia a diferentes longitudes de onda.
En otra realizacion mas, las dos o mas partfculas raras pueden detectarse en serie. Por ejemplo, en una realizacion, el metodo puede comprender detectar una primera partfcula rara en una primera ubicacion de un aparato eDAR y detectar una segunda celula rara en una segunda ubicacion de un aparato eDAR. De esta manera, la ateuota en la que residen la primera y segunda partfculas puede canalizarse despues de la primera etapa de deteccion, despues de la segunda etapa de deteccion, o despues de ambas etapas de deteccion.
En ciertas realizaciones de la invencion, la deteccion de una caractenstica de un conjunto de celulas puede ser simultanea o acumulativa en el tiempo. Por ejemplo, la deteccion de una caractenstica puede emanar inmediatamente ("simultanea") de una gran ateuota que contiene un conjunto de biopartfculas.
En ciertas realizaciones, en las que el metodo se realiza en un modo simultaneo, las biopartfculas pueden ser transportadas por un flujo de velocidad variable. Como ejemplo, las biopartfculas pueden ser transportadas por un flujo constante a medida que atraviesan el volumen de deteccion. Como alternativa, el flujo puede detenerse, desacelerarse o acelerarse a medida que las celulas atraviesan el volumen de deteccion. El flujo puede regularse con uno de los siguientes, ya sea aguas arriba o abajo del volumen de deteccion: una valvula, una burbuja, un campo electrico, un campo magnetico, un campo optico, una fuente neumatica de presion, una partfcula solida, una membrana, una gota inmiscible, un diferencial gravitacional, o un revestimiento para alterar la tension superficial del canal.
En algunas realizaciones de los metodos proporcionados en el presente documento, la etapa de deteccion se realiza durante el flujo continuo de la muestra de fluido a traves de un canal de flujo. En ciertas realizaciones, las ateuotas individuales no estan ffsicamente separadas, sino que se definen por la etapa de deteccion optica, es decir, una ateuota puede definirse como el conjunto de partfculas presentes en el volumen de deteccion en el instante en que se produce la deteccion.
En ciertas realizaciones, el evento de deteccion se producira con una frecuencia regular, que depende tanto del tamano del volumen de deteccion como del caudal de la muestra de fluido. Por ejemplo, si el volumen de deteccion de un aparato particular es de 10 pl y la muestra de fluido fluye a traves del aparato a una velocidad de 100 pl/segundo, se detectara una ateuota diferente cada 0,1 segundos o a una velocidad de 10 Hz.
En ciertas realizaciones, dependiendo de la geometna del aparato y del volumen del fluido a procesar, ateuotas discretas atraviesan el volumen de deteccion a una velocidad comprendida entre 0,1 kHz y 100 MHz. En otra realizacion, las ateuotas discretas atraviesan el volumen de deteccion a una velocidad entre aproximadamente 10 Hz y aproximadamente 10 MHz. En otras realizaciones, las ateuotas discretas pueden atravesar el volumen de deteccion a una frecuencia entre aproximadamente 0,1 kHz y aproximadamente 100 MHz, o entre aproximadamente 1 kHz y aproximadamente 10 MHz, o entre aproximadamente 1 kHz y aproximadamente 5 MHz, o entre aproximadamente 1 kHz y aproximadamente
1 MHz. En ciertas realizaciones, la frecuencia con la que las ateuotas atraviesan el volumen de deteccion puede ser de al menos aproximadamente 0,1 kHz, o al menos aproximadamente 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, o 900 kHz, o al menos aproximadamente 1 MHz, o al menos aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, o 100 MHz.
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En otras realizaciones de los metodos proporcionados en el presente documento, la deteccion de una caractenstica de un conjunto de celulas puede emanar a lo largo del tiempo ("acumulativo") a partir de un pequeno volumen de deteccion que esta en el orden de una sola celula, pero con multiples celulas que atraviesan el volumen de deteccion con la ayuda de flujo. El modo acumulativo de la eDAR es distinto de la superposicion temporal de senales o tramas consecutivas que emanan de una unica bioparffcula; la superposicion temporal de una unica bioparffcula no constituye un conjunto de bioparffculas. Tanto de forma simultanea como acumulativa, se toma una decision solo despues de que se ha detectado una caractenstica de un conjunto de celulas.
En aun otras realizaciones de los metodos proporcionados en el presente documento, las affcuotas pueden separarse ffsicamente antes de la deteccion. Esto puede lograrse, por ejemplo, dividiendo el fluido de muestra en affcuotas acuosas discretas separadas por aire o una fase fluida continua inmiscible en aceite, por ejemplo, en una gota.
En una realizacion, la fase inmiscible usada para separar affcuotas acuosas puede incluir una fase organica, un aceite, aceites naturales tales como aceite mineral y aceite de soja, aceites de silicona tales como AR-20, AS-4, aceite PDMS, aceites fluorados tales como Fluorinert y perfluorordecalina, disolventes organicos tales como hexadecano y acetofenona, una cera, aire o gas.
En ciertas realizaciones, una fase inmiscible puede ser continua (es decir, rodea las affcuotas discretas en su totalidad) o segmentada (es decir, ocupa solamente la separacion entre affcuotas discretas pero no rodea completamente las affcuotas).
Por ejemplo, la figura 16 ilustra una fase inmiscible (1642) que rodea las partes affcuotas discretas por completo.
En una realizacion, las affcuotas discretas son gotitas. En otra realizacion, las affcuotas discretas son tapones.
En una realizacion, las affcuotas discretas pueden estar formadas secuencialmente en un aparato eDAR en un canal de flujo en comunicacion de fluido con el canal de flujo.
En ciertas realizaciones, las affcuotas discretas pueden estar formadas externamente del aparato eDAR pero fluidas en un canal de flujo del aparato a traves de una tubena, un puerto o una interconexion en comunicacion de fluido con el canal de flujo.
En una realizacion, se pueden anadir tensioactivos a la suspension celular o la fase inmiscible para estabilizar las affcuotas discretas. Los tensioactivos pueden incluir albumina (albumina serica bovina o humana), Span 80, Pluronic, octaetilenglicol glicol monodecil eter, tetraetilenglicol monodecil eter, tensioactivos zwiterionicos tales como N-dodecil-N, N-dimetil-3-amonio-1-propanosulfonato (DDAPS), tensioactivos anionicos tales como dioctilsulfosuccinato de sodio (AOT), tensioactivos cationicos tales como bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB), y tensioactivos a base de silicona, PEGilados y fluorados.
En otra realizacion mas, la muestra de fluido puede dividirse en affcuotas y separarse ffsicamente en canales o camaras de flujo separados de un aparato eDAR antes de la etapa de deteccion. La etapa de deteccion posterior puede entonces llevarse a cabo en paralelo (es decir, al mismo tiempo usando multiples dispositivos de deteccion o un unico dispositivo de deteccion), o secuencialmente, por ejemplo, dirigiendo las affcuotas individuales secuencialmente a traves de uno o mas volumenes de deteccion.
En algunas realizaciones de la invencion, la muestra de fluido, por ejemplo una muestra de fluido biologico, puede estabilizarse antes de la deteccion de una parffcula rara. En ciertas realizaciones, los fluidos pueden estabilizarse con un reactivo, incluyendo, pero sin limitacion, un anticoagulante tal como citrato, heparina, acido etilendiaminotetraacetico (EDTA), acido dietilentriamina pentaacetico (DTPA), acido 1,2-diaminociclohexano tetraacetico (DCTA), o acido etilen bis(oxietilennitrilo)tetraacetico (EGTA); un aldetffdo tal como derivados de metilol, hidroximetilo de aminas o amidas de formaldetffdo, diazolinidinil urea, imidazolidinil urea, metenamina, paraformaldetffdo, glutaraldetffdo o glioxal, y similares.
En otras realizaciones de la invencion, los metodos proporcionados en el presente documento pueden estar acoplados adicionalmente a un proceso secundario que tiene lugar despues de la canalizacion de las affcuotas deseadas. Los ejemplos de procesos y/o funciones que pueden acoplarse a un metodo proporcionado en el presente documento incluyen, por ejemplo, reacciones selectivas para identificar contenidos celulares (por ejemplo, ADN, ARN, microARN, ffpidos, metabolitos, carbohidratos o protemas encapsuladas dentro de las celulas). Estas reacciones incluyen reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), reaccion en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR), PCR isotermica, reacciones para determinar los estados epigeneticos del ADN, reacciones de hibridacion de molecula unica para determinar el contenido de microARN y siARN o reacciones selectivas de aptameros (cadenas cortas de
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ADN).
En ciertas realizaciones, los metodos proporcionados en el presente documento pueden acoplarse adicionalmente a un protocolo de ensayo despues de una aKcuota o aislamiento celular. Los ejemplos no limitativos de ensayos que se pueden acoplar a los metodos proporcionados en el presente documento incluyen metodos basados en acidos nucleicos tales como extraccion de ARN (con o sin amplificacion), smtesis de ADNc (transcripcion inversa), micromatrices de genes, extraccion de ADN, reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) (unicas, anidadas, cuantitativas en tiempo real, o de enlazador- adaptador), o analisis de metilacion de ADN; metodos de citometna tales como estudios de hibridacion in situ por fluorescencia (FISH), microdiseccion por captura laser, citometna de flujo, clasificacion de celulas activadas por fluorescencia (FACS), cultivo celular, o hibridacion genomica comparativa (CGH); metodos de ensayo qmmico tales como electroforesis, analisis de transferencia Southern o ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA); ensayos para determinar el contenido de microRNA y siRNA; ensayos para determinar el contenido de aDn/ARN; ensayos para determinar el contenido de lfpidos; ensayos para determinar el contenido de carbohidratos; ensayos para determinar el contenido de metabolitos; ensayos para determinar el contenido de protemas; y ensayos de celulas funcionales (por ejemplo, ensayos apoptoticos, ensayos de migracion celular, ensayos de proliferacion celular, ensayos de diferenciacion celular, etc.), y similares.
En otra realizacion mas, los metodos proporcionados en el presente documento pueden acoplarse adicionalmente a la citometna de flujo, por ejemplo, para dividir o aislar adicionalmente las partfculas raras presentes en una alfcuota seleccionada. En una realizacion, un canal del dispositivo eDAR utilizado para los metodos proporcionados en el presente documento puede estar en comunicacion de fluido con un citometro de flujo. En ciertas realizaciones, el acoplamiento de eDAR y citometna de flujo permite que las alfcuotas seleccionadas se examinen adicionalmente o se clasifiquen en serie para enriquecer adicionalmente una poblacion de partfculas o celulas raras. En ciertas realizaciones de los metodos proporcionados en el presente documento, esta configuracion permite la clasificacion en bruto aguas arriba de partfculas o celulas raras y solo dirige alfcuotas que contienen partfculas o celulas raras en procesos aguas abajo, tales como citometna de flujo, que son tiempo, coste y/o mano de obra.
En ciertas realizaciones, los metodos proporcionados en el presente documento pueden realizarse utilizando un aparato eDAR proporcionado en el presente documento.
1. Caracteristicas ventajosas
Como se ha indicado anteriormente, debido en parte a la deteccion del conjunto y a la clasificacion de alfcuotas completas, en lugar de celulas o partfculas individuales, las tecnologfas eDAR son mucho mas rapidas y menos costosas que los metodos de citometna de flujo tradicionales empleados actualmente. Varias caractensticas contribuyen a las metodologfas mejoradas de eDAR.
Por ejemplo, en una realizacion de los metodos proporcionados en el presente documento, una alfcuota comprende mas de una sola partfcula, celula o entidad fluorescente. A este respecto, se pueden interrogar simultaneamente volumenes discretos que contienen una pluralidad de celulas o partfculas, en lugar de celulas o partfculas individuales, o laminas unidimensionales de celulas o partfculas.
En una realizacion relacionada de los metodos proporcionados en el presente documento, las partfculas o celulas de un fluido no necesitan entrar en el punto o volumen de deteccion en serie (es decir, uno tras otro sin presencia de solapamiento). En una realizacion relacionada, las partfculas no necesitan entrar en el punto o volumen de deteccion en una sola fila o lamina. Por consiguiente, en una realizacion de los metodos proporcionados en el presente documento, multiples biopartfculas, dentro de una alfcuota unica, pueden pasar a traves de una seccion transversal o volumen en seccion transversal de un canal de flujo a la vez, por ejemplo, un volumen de interrogacion y/o deteccion.
En una realizacion de los metodos proporcionados en el presente documento, no se necesita un flujo envolvente, tampon de guiado u otros mecanismos de enfoque hidrodinamico o geometrico para enfocar las biopartfculas en una unica fila para interrogacion y/o deteccion.
En una realizacion de los metodos proporcionados en el presente documento, se emplea un esquema de clasificacion o un esquema de asignacion de valor de alfcuotas completas, en lugar de clasificar biopartfculas individuales.
En una realizacion de los metodos proporcionados en el presente documento, un conjunto de partfculas o celulas se detecta simultaneamente, por ejemplo, como una alfcuota unica de una muestra de fluido mas grande. En una realizacion relacionada, una decision tomada para una alfcuota afecta a todo el conjunto de partfculas o celulas contenidas dentro de la alfcuota. En aun otra realizacion relacionada, un conjunto de partfculas o celulas detectadas simultaneamente dentro de una alfcuota permanecera como un conjunto de partfculas o celulas.
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2. Clasificacion de alicuotas
En una realizacion de los metodos proporcionados en el presente documento, la alfcuota se asigna a un primer valor es la alfcuota contiene una partfcula rara o un segundo valor si la alfcuota no contiene una partfcula rara. En una realizacion particular, la clasificacion (es decir, la asignacion de un valor) es binaria. Por ejemplo, a cada alfcuota que contiene al menos una partfcula rara se le asigna un valor de 1, mientras que a cada alfcuota que no contiene una partfcula rara se le asigna un valor de 0.
En otra realizacion de los metodos proporcionados en el presente documento, a la alfcuota se le asigna un valor de acuerdo con la cantidad de partfculas raras presentes en la alfcuota. Por ejemplo, se puede asignar a una alfcuota que contiene 4 partfculas raras un valor de 4. Como alternativa, se puede asignar a una alfcuota que contiene 4 partfculas un valor que corresponde a un intervalo particular de cantidades de partfculas raras, por ejemplo, de 0 a 5 partfculas, de 1 a l0 partfculas, de 4 a 6 partfculas, etc.
En otra realizacion de los metodos proporcionados en el presente documento, en los que mas de un tipo de partfculas raras estan presentes en una unica muestra de fluido, a una alfcuota se le asigna un valor de acuerdo con las identidades de cualquier partfcula rara en la alfcuota. Por ejemplo, en el que una muestra de fluido contiene dos partfculas raras, A y B, una alfcuota que no contiene A ni B puede tener un valor de 0, una alfcuota que contiene solo A puede tener un valor de 1, una alfcuota que contiene solo B puede tener un valor de 2, y una alfcuota que contiene tanto A como B se le puede asignar un valor de 3. Por consiguiente, en una realizacion de los metodos proporcionados en el presente documento, en los que mas de un tipo de partfculas raras estan presentes en una unica muestra de fluido, la clasificacion (es decir, la asignacion de un valor) no es binaria.
En ciertas realizaciones, un valor asignado no nulo puede depender de la identidad de la partfcula rara o de la concentracion de la partfcula rara.
En ciertas realizaciones, multiples alfcuotas que tienen el mismo valor asignado se agrupan o se canalizan juntas.
En una realizacion de los metodos de la presente invencion, se requiere una decision activa para clasificar o asignar un valor a una alfcuota. En ciertas realizaciones, se utiliza un ordenador, controlador, chip con circuitos integrados, placa de circuitos, elemento electronico, software y/o algoritmo para clasificar o asignar un valor a una alfcuota.
3. Canalizacion de alicuotas y flujo de fluido
En ciertas realizaciones de la presente invencion, dirigir el flujo o la recoleccion de una alfcuota se basa en el valor asignado a la alfcuota. Por ejemplo, en una realizacion en la que un unico tipo de partfcula rara esta presente en una muestra de fluido, una alfcuota asignada con un valor nulo o "0" puede dirigirse a un primer canal (canalizado) o salida de desechos y una alfcuota asignada con el valor "1" puede dirigirse hacia un segundo canal o camara de recogida.
En otras realizaciones de la presente invencion, en las que mas de un tipo de partfcula rara esta presente en la muestra de fluido, una alfcuota puede canalizarse basandose en la composicion particular de partfculas raras presentes en la alfcuota. En una realizacion, una alfcuota que no contiene partfculas raras puede dirigirse a un primer canal o salida de desechos, una parte alfcuota que contiene un primer tipo de partfcula rara puede dirigirse a un segundo canal o una primera camara de recogida, y una alfcuota que contiene un segundo tipo o la partfcula rara se puede dirigir a un tercer canal o a una segunda camara de recogida.
En ciertas realizaciones, una alfcuota que contiene mas de un tipo de partfcula rara se puede dirigir a un canal de flujo particular o a una camara de recogida. Como alternativa, la alfcuota se puede dirigir a una camara de mezcla o dilucion y posteriormente la alfcuota mezclada o diluida puede dividirse adicionalmente en subalfcuotas de tal forma que las celulas raras se dividen en diferentes subalfcuotas. Las celulas raras en las subalfcuotas pueden ser detectadas de nuevo de tal manera que las celulas raras se pueden separar entre sf.
En una realizacion de los metodos proporcionados en el presente documento, la etapa de canalizacion (es decir, la direccion del flujo o recoleccion de las alicuotas puede realizarse mediante el uso de campos externos o creando perturbaciones de flujo.
En un aspecto de la invencion, una vez que se clasifica una alfcuota, pueden usarse campos externos para alterar la direccion de la alfcuota. Los campos pueden incluir campo electrico, campo magnetico, fuerzas electrocineticas, electroforeticas, dielectroforeticas, hidrodinamicas, gravitacionales, neumaticas u opticas. Como alternativa, pueden inducirse perturbaciones de flujo externas con una introduccion de
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materiales inmiscibles con suspension de celulas, tales como aire, Ifquido organico inmiscible o microperlas.
En ciertas realizaciones, el flujo puede ser suministrado por, por ejemplo, metodos y dispositivos que inducen una presion de fluido hidrodinamica, que incluye, pero sin limitacion, los que operan sobre la base de principios mecanicos (por ejemplo, bombas de jeringa externas, bombas de membrana neumaticas, bombas de membrana vibratoria, dispositivos de vado, fuerzas centnfugas y accion capilar); principios electricos o magneticos (por ejemplo, flujo electroosmotico, bombas electrocineticas, bombas piezoelectricas/ultrasonicas, tapones de ferroflmdo, bombas electrohidrodinamicas y bombas magnetohidrodinamicas); principios termodinamicos (por ejemplo, generacion de burbujas de gas/expansion de volumen inducida por cambio de fase); principios de humectacion superficial (por ejemplo, electrohumectacion, gradiente de tension superficial inducido qmmicamente, termicamente y radiactivamente); y similares.
En otras realizaciones, el fluido puede ser suministrado o canalizado por una fuerza de accionamiento de fluido proporcionada por alimentacion por gravedad, tension superficial (como la accion capilar), fuerzas electrostaticas (flujo electrocinetico), flujo centnfugo (sustrato dispuesto en un disco compacto y en rotacion), fuerzas magneticas (los iones oscilantes causan flujo), fuerzas magnetohidrodinamicas y un vado o diferencial de presion.
En ciertas realizaciones, los dispositivos de control de flujo de fluido, tales como los enumerados con respecto a metodos y dispositivos para inducir presion de fluido hidrodinamica o fuerza de accionamiento de fluido, pueden acoplarse a un puerto de entrada o un puerto de salida de la presente materia objeto. En un ejemplo, se proporcionan puertos multiples en una o ambas entradas y salidas y uno o mas puertos estan acoplados a un dispositivo de control de flujo de fluido.
B. Metodos de diagnostico y pronostico
En un aspecto, la presente invencion proporciona un metodo para proporcionar a un sujeto un diagnostico o pronostico para una afeccion asociada con la presencia de una partfcula rara en una muestra de fluido, por ejemplo, un fluido biologico tal como una muestra de sangre.
En una realizacion, el metodo comprende las etapas de: (a) detectar la presencia o ausencia de la partfcula rara en una alfcuota del fluido biologico; (b) asignar un valor a la alfcuota en base a la presencia o ausencia de la partfcula rara, y (c) dirigir el flujo o recogida de la alfcuota en base al valor asignado.
En otra realizacion, el metodo comprende las etapas de: (a) poner en contacto un fluido biologico del sujeto con un reactivo de deteccion en condiciones adecuadas para transformar el reactivo de deteccion en un complejo que comprende dicho reactivo de deteccion y una partfcula rara; (b) detectar la presencia o ausencia de un complejo formado en la etapa (a) en una alfcuota del fluido biologico; (c) asignar un valor a la alfcuota en base a la presencia o ausencia de un complejo formado en la etapa (a); y (d) proporcionar un diagnostico o pronostico al sujeto basado en el valor asignado.
En otra realizacion, la etapa de deteccion de la presencia de la partfcula rara comprende las subetapas de: (i) interrogar la alfcuota con una fuente externa de radiacion electromagnetica; y (ii) detectar la fluorescencia de la partfcula rara.
Durante mas de 100 anos, los medicos han sabido que los canceres se diseminan vertiendo celulas en la sangre. Dado que la sangre lleva estas celulas cancerosas de organo a organo, el cancer se metastatiza. Estas celulas tumorales sueltas se denominan Celulas Tumorales Circulantes (CTC En un aspecto, la presente invencion ofrece metodos precisos para contar y aislar estas celulas cancerosas de la sangre periferica.
La deteccion exacta de CTC en sangre resulta excesivamente diffcil debido al numero astronomico de globulos rojos y blancos tambien presentes. Con tantos como 5 billones de globulos rojos y 5 millones de globulos blancos que coexisten para enmascarar una unica CTC, el problema de detectar CTC es literalmente encontrar una aguja en un pajar.
Mediante el recuento preciso del numero de celulas cancerosas en sangre, la presente invencion ofrece una instantanea en tiempo real del proceso de propagacion del cancer. La diferenciacion mas notable de una prueba de sangre de CTC de las herramientas pronosticas tradicionales (por ejemplo, el estado de los ganglios linfaticos, el tamano del tumor y las caractensticas morfologicas) es que la prueba de sangre de CTC puede usarse para proporcionar una respuesta temprana sobre si un tratamiento contra el cancer es eficaz. Los pacientes sometidos a la quimioterapia de 6 meses pueden tener sus recuentos de CTC medidos cada 3-4 semanas; si el recuento permanece alto, el oncologo puede considerar que el tratamiento actual es ineficaz y prescribir nuevos farmacos. Desde el punto de vista de los pacientes, tener una prueba de CTC puede (1) proporcionar un ahorro sustancial al eliminar la quimioterapia ineficaz,
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que puede costar entre 3.000 $-10.000/mes por farmaco, (2) concederles valiosas oportunidades para encontrar un tratamiento eficaz antes de que sea demasiado tarde. Estas razones por sf solas son lo suficientemente importantes como para que los oncologos prescriban de forma rutinaria exploraciones de imagenes radiologicas caras (por ejemplo, CT o MRI). Sin embargo, en un aspecto, la presente invencion proporciona una prueba de cTc rapida y economica que es mas barata, mas segura, mas reproducible y proporciona la misma, si no mas exacta, informacion pronostica seis semanas antes que una exploracion de imagenes radiologicas. Actualmente no hay pruebas de biomarcadores disponibles que ofrezcan ventajas similares.
Debido a una alta sensibilidad en las celulas cancerosas detectadas, los metodos descritos en el presente documento proporcionan el potencial de detectar celulas cancerosas antes de que su concentracion alcance el lfmite de deteccion mas bajo de tecnologfas competidoras. Esto significa que los metodos proporcionados en el presente documento son capaces de producir resultados significativos antes que las tecnologfas competidoras. En consecuencia, en lugar de limitar el uso de la tecnologfa actual al cancer metastasico en estadio IV, los oncologos pueden expandir su uso hacia el diagnostico precoz (es decir, estadio III, estadio II, estadio I, metastasico o precanceroso), por ejemplo, prescribiendo periodicamente el uso de los metodos proporcionados en el presente documento para el publico en general que aun no presenta smtomas de cancer. Generalmente las personas sanas no tienen ninguna CTC en sangre; si se detecta cualquier CTC en los pacientes sin sospecha que utilizan la presente invencion, entonces se pueden prescribir mas pruebas (por ejemplo, CT, MRI) para localizar los tumores y confirmar el estado.
En otra realizacion, las celulas tumorales aisladas usando la presente invencion pueden someterse ademas a analisis de subpoblacion (por ejemplo, segun el genotipo o fenotipo) para desarrollar un tratamiento dirigido. Como ejemplo, las celulas tumorales aisladas pueden incubarse con anticuerpos fluorescentes que se unen a dianas espedficas de farmacos para determinar la presencia o el grado de expresion de un farmaco diana. Una vez que la expresion del farmaco diana se confirma, un oncologo puede estar seguro de elegir entre los medicamentos espedficamente desarrollados para dirigir la expresion. En un ejemplo, las celulas tumorales aisladas pueden incubarse con anticuerpos fluorescentes que se unen espedficamente al receptor Her2 para determinar si el tumor de mama que desprende CTC es positivo a Her2. Si las celulas tumorales aisladas exhiben una alta expresion de Her2, el oncologo puede prescribir Herceptina (trastuzumab), ya que este farmaco esta disenado para dirigir y bloquear la funcion de la sobreexpresion de la protema HER2. Otras dianas farmaceuticas conocidas, incluyendo BCR-ABL o PDGFR (dirigido por el farmaco Gleevec), ERBB2 (dirigido por Herceptina), EFGR (dirigido por Iressa, Tarceva), RAR-alfa (dirigido por ATRA), receptor de estrogenos (dirigido por Tamoxifeno), aromatasa (dirigida por Letrazol), receptor de androgenos (dirigido por Flutamida, Biclutamida), CD20 (dirigido por Rituximab), receptor de VEGF (dirigido por Avastina) tambien pueden ser seleccionados de forma similar a partir de las celulas tumorales aisladas antes de prescribir el regimen de quimioterapia apropiado.
En una realizacion espedfica, la partfcula rara es una celula cancerosa o celula tumoral circulante (CTC). En otras realizaciones, la celula rara puede ser una celula o un organismo parasito, por ejemplo, una especie de Giardia o Cryptosporidium, un eritrocito infectado con una especie de Plasmodium, un linfocito o leucocito infectado con VIH, una celula fetal en sangre materna, una celula madre, una celula infectada con priones, un linfocito T CD4+, y similares.
En una realizacion, se proporciona un metodo para diagnosticar malaria, comprendiendo el metodo detectar un eritrocito infectado con Plasmodium usando un metodo y/o aparato eDAR proporcionado en el presente documento.
En otra realizacion, se proporciona un metodo para diagnosticar una infeccion por VIH, comprendiendo el metodo detectar un linfocito o leucocito infectado con el virus VIH utilizando un metodo y/o aparato eDAR proporcionado en el presente documento.
En otra realizacion mas, se proporciona un metodo para diagnosticar una enfermedad asociada con un prion, comprendiendo el metodo detectar un prion en un fluido biologico de un ser humano u otro animal (por ejemplo, una vaca) usando un metodo eDAR y/o un aparato proporcionado en el presente documento. En una realizacion, la enfermedad asociada con un prion es la enfermedad de las vacas locas.
1. Diagnostico del cancer
En una realizacion particular, el metodo comprende detectar una celula tumoral circulante en una muestra de sangre de un sujeto usando un metodo y/o aparato eDAR proporcionado en el presente documento. En ciertas realizaciones, el sujeto puede ser un paciente que ha sido diagnosticado previamente con cancer en estadio I, estadio II, estadio III o estadio IV. En ciertas realizaciones, en las que se detecta una CTC en una muestra de sangre de un paciente previamente diagnosticado con cancer, el paciente puede ser diagnosticado ademas con cancer metastasico.
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En una realizacion, se proporciona un metodo para diagnosticar cancer metastasico en un sujeto que ha sido previamente diagnosticado con un tumor solido, comprendiendo el metodo las etapas de: (a) detectar la presencia o ausencia de una CTC en una alfcuota de una muestra de sangre del sujeto; (b) asignar un valor a la alfcuota en base a la presencia o ausencia de la CTC; y (c) dirigir el flujo o recoleccion de la alfcuota basandose en el valor asignado. En una realizacion, la ausencia de CTC en la muestra de sangre esta correlacionada con el sujeto que no tiene cancer metastasico. En otra realizacion, la presencia de al menos una CTC en la muestra de sangre esta correlacionada con el sujeto que tiene cancer metastasico. En aun otra realizacion, la presencia de al menos un numero de referencia de CTC en la sangre esta correlacionada con el sujeto que tiene cancer metastasico. En algunas realizaciones, el metodo puede comprender ademas una etapa de (d) diagnosticar al sujeto como que no tiene cancer metastasico si no se detectan CTC en la muestra de sangre o diagnosticar al sujeto como que tiene cancer metastasico si se detecta al menos una CTC en la sangre muestra.
En una realizacion relacionada, se proporciona un metodo para monitorizar un sujeto diagnosticado con cancer, que comprende detectar la presencia o ausencia de una CTC en una alfcuota de una muestra de sangre del sujeto usando un metodo eDAR proporcionado en el presente documento. En ciertas realizaciones, el paciente puede ser monitorizado para el avance del cancer a cancer metastasico a intervalos regulares, por ejemplo, al menos una vez al ano, al menos dos veces al ano, o al menos
aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas veces al ano. En algunas realizaciones, el sujeto puede
monitorizarse aproximadamente una vez al mes, o al menos aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas veces al mes. En una realizacion, la ausencia de CTC en la muestra de sangre esta correlacionada con el sujeto que no tiene cancer metastasico. En otra realizacion, la presencia de al menos una CTC en la muestra de sangre esta correlacionada con el sujeto que tiene cancer metastasico. En aun otra realizacion, la presencia de al menos un numero de referencia de CTC en la sangre esta correlacionada con el sujeto que tiene cancer metastasico. En algunas realizaciones, el metodo puede comprender ademas una etapa de (d) diagnosticar al sujeto como que no tiene cancer metastasico si no se detectan CTC en la muestra de sangre o diagnosticar al sujeto como que tiene cancer metastasico si se detecta al menos una CTC en la sangre muestra.
En las realizaciones en las que se detecta una CTC en una muestra de sangre, el metodo puede
comprender ademas una etapa de someter una o mas alfcuotas identificadas como que contienen una
CTC para analisis adicional para identificar una o mas caractensticas de la celula o celulas CTC. Por ejemplo, puede ponerse en contacto una alfcuota o grupo de alfcuotas que contienen una CTC con uno o mas reactivos de deteccion espedficos para uno o mas antfgenos de superficie espedficos del cancer. Mediante la determinacion de que antfgenos espedficos de cancer estan presentes en la superficie de las CTC, la terapia puede disenarse entonces para dirigir el antfgeno superficial expresado. Los ejemplos no limitativos de antfgenos de superficie espedficos del cancer que pueden ser ensayados incluyen, sin limitacion, BCR-ABL o PDGFR (dirigido por el farmaco Gleevec), ERBB2 (dirigido por Herceptina), EFGR (dirigido por Iressa, Tarceva), RAR-alfa (dirigido por ATRA), receptor de estrogenos (dirigido por Tamoxifeno), aromatasa (dirigida por Letrazol), receptor de androgenos (dirigido por Flutamida, Biclutamida), CD20 (dirigido por Rituximab), receptor de VEGF (dirigido por Avastina), y similares. Por consiguiente, en ciertas realizaciones, el metodo puede comprender ademas una etapa de asignar una terapia dirigida al sujeto basada en la deteccion de un antfgeno de superficie espedfico presente en la CTC.
En ciertas realizaciones, el analisis adicional puede realizarse utilizando un metodo eDAR proporcionado en el presente documento, por ejemplo, poniendo en contacto las alfcuotas agrupadas con una pluralidad de reactivos de deteccion marcados diferencialmente en condiciones adecuadas para transformar los reactivos de deteccion en complejos con los antfgenos espedficos del cancer presentes en la superficie de las CTC y detectando los complejos usando una pluralidad de dispositivos de deteccion.
En otras realizaciones, el analisis adicional se puede realizar acoplando el metodo eDAR inicial con una citometna de flujo tradicional o un metodo inmunoqmmico (por ejemplo, inmunotransferencia, ELISA, ensayo multiplex xMAP, etc.). En ciertas realizaciones, el dispositivo eDAR usado para detectar la CTC puede estar en comunicacion de fluido con un segundo dispositivo o medios para realizar el analisis posterior.
En las realizaciones en las que un sujeto es diagnosticado con cancer metastasico, el metodo puede comprender ademas una etapa de asignar una terapia para el cancer metastasico al sujeto.
En otra realizacion particular, se proporciona un metodo para diagnosticar a un sujeto con cancer, comprendiendo el metodo detectar un CTC en una muestra de sangre tomada del sujeto. Por ejemplo, detectar una CTC en una muestra de sangre de un sujeto que no ha sido previamente diagnosticado con cancer. En algunas realizaciones, el sujeto puede tener un riesgo aumentado de tener o desarrollar cancer, por ejemplo, el sujeto puede tener antecedentes familiares de cancer, ser fumador, o haber estado expuesto a una sustancia carcinogena (es decir, amianto, benceno, cadmio, radon, radiactividad, y
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similares).
Como tal, en ciertas realizaciones, se proporciona un metodo para monitorizar un sujeto que no ha sido previamente diagnosticado con cancer, comprendiendo el metodo las etapas de: (a) detectar la presencia o ausencia de una CTC en una alfcuota de una muestra de sangre del sujeto; (b) asignar un valor a la alfcuota en base a la presencia o ausencia de la CTC; y (c) dirigir el flujo o recoleccion de la alfcuota basandose en el valor asignado. En una realizacion, la ausencia de CTC en la muestra de sangre esta correlacionada con el sujeto que no tiene cancer metastasico. En otra realizacion, la presencia de al menos una CTC en la muestra de sangre esta correlacionada con el sujeto que tiene cancer. En aun otra realizacion, la presencia de al menos un numero de referencia de CTC en la sangre esta correlacionada con el sujeto que tiene cancer o cancer metastasico. En algunas realizaciones, el metodo puede comprender ademas una etapa de (d) diagnosticar al sujeto como que no tiene cancer si no se detectan CTC en la muestra de sangre o diagnosticar al sujeto como que tiene cancer si se detecta al menos una CTC en la sangre muestra.
En ciertas realizaciones, la etapa de detectar la presencia o ausencia de la CTC puede realizarse como se ha descrito anteriormente, por ejemplo, (i) poniendo en contacto un fluido biologico del sujeto con un reactivo de deteccion en condiciones adecuadas para transformar el reactivo de deteccion en un complejo que comprende dicho reactivo de deteccion y una partfcula rara; y (ii) detectar la presencia o ausencia de un complejo formado en la etapa (i) en una alfcuota del fluido biologico, o (i) interrogar la alfcuota con una fuente externa de radiacion electromagnetica; y (ii) detectar la fluorescencia de la partfcula rara.
2. Metodos para proporcionar un pronostico
En un aspecto, la presente invencion proporciona metodos para proporcionar un pronostico para una enfermedad o afeccion asociada con la presencia de una partfcula rara en un fluido biologico. En una realizacion, el metodo comprende las etapas de: (a) detectar la presencia o ausencia de la partfcula rara en una alfcuota de una muestra biologica de un sujeto; (b) asignar un valor a la alfcuota basado en la presencia o ausencia de la partfcula rara; (c) dirigir el flujo o recoleccion de la alfcuota en base al valor asignado; y (d) proporcionar un buen pronostico si no se detectan partfculas raras en la muestra o un mal pronostico si se detecta una partfcula rara en la muestra.
En otras realizaciones, a la alfcuota se le asigna un valor basado en la cantidad o la identidad de la partfcula rara en la alfcuota. En algunas de estas realizaciones, se proporciona un pronostico bueno o malo basado en la cantidad de las partfculas raras en la muestra. Por ejemplo, en una realizacion, se proporciona un buen pronostico si la cantidad de las partfculas raras en la muestra es menor que un valor de referencia predeterminado y se proporciona un mal pronostico si la cantidad de las partfculas raras en la muestra es igual o mayor que el valor de referencia.
En ciertas realizaciones, un valor de referencia predeterminado puede estar asociado con una probabilidad de responder a una terapia particular o una probabilidad de supervivencia global o libre de enfermedad durante un penodo de tiempo, por ejemplo, al menos 6 meses, o al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 o mas anos.
En ciertas realizaciones, la etapa de detectar la presencia o ausencia de la partfcula rara puede realizarse como se ha descrito anteriormente, por ejemplo, (i) poniendo en contacto un fluido biologico del sujeto con un reactivo de deteccion en condiciones adecuadas para transformar el reactivo de deteccion en un complejo que comprende dicho reactivo de deteccion y una partfcula rara; y (ii) detectar la presencia o ausencia de un complejo formado en la etapa (i) en una alfcuota del fluido biologico, o (i) interrogar la alfcuota con una fuente externa de radiacion electromagnetica; y (ii) detectar la fluorescencia de la partfcula rara.
En ciertas realizaciones, se puede usar un metodo proporcionado en el presente documento para proporcionar un pronostico para cualquier enfermedad asociada con una partfcula rara. En una realizacion, se proporciona un metodo para proporcionar un pronostico para la malaria, comprendiendo el metodo determinar el numero de eritrocitos infectados con Plasmodium en una muestra de sangre de un individuo usando un metodo y/o aparato eDAR proporcionado en el presente documento y proporcionando un buen pronostico si el numero total de eritrocitos infectados detectados en la muestra de sangre es menor que un valor de referencia predeterminado o un mal pronostico si el numero total de eritrocitos infectados detectados en la muestra es igual o mayor que el valor de referencia.
En otra realizacion, se proporciona un metodo para proporcionar un pronostico para una infeccion por VIH, comprendiendo el metodo determinar el numero de linfocitos o leucocitos infectados con un virus VIH en una muestra de sangre de un individuo usando un metodo y/o aparato eDAR proporcionado en el presente documento y proporcionar un buen pronostico si el numero total de celulas infectadas detectadas en la muestra de sangre es menor que un valor de referencia predeterminado, o un mal pronostico si el numero total de celulas infectadas detectadas en la muestra es igual o mayor que el valor de referencia.
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En otra realizacion mas, se proporciona un metodo para proporcionar un pronostico para una enfermedad asociada con un prion, comprendiendo el metodo determinar el numero de priones en una muestra de fluido biologico de un sujeto utilizando un metodo y/o aparato eDAR proporcionado en el presente documento, y proporcionar un buen pronostico si el numero total de priones detectado en la muestra es menor que un valor de referencia predeterminado, o un mal pronostico si el numero total de priones detectado en la muestra es igual o mayor que el valor de referencia.
En ciertas realizaciones, un valor de referencia predeterminado puede estar asociado con una probabilidad de responder a una terapia particular o una probabilidad de supervivencia global o libre de enfermedad durante un penodo de tiempo, por ejemplo, al menos 6 meses, o al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 o mas anos.
En una realizacion espedfica, la presente invencion proporciona un metodo para proporcionar un pronostico para un sujeto diagnosticado con un tumor solido. En una realizacion, el metodo comprende las etapas de (a) detectar la presencia o ausencia de una CTC en una alfcuota de una muestra de sangre del sujeto; (b) asignar un valor a la alfcuota en base a la presencia o ausencia de la CTC; (c) dirigir el flujo o recoleccion de la alfcuota en base al valor asignado; y (d) proporcionar un buen pronostico si no se detectan CTC o un mal pronostico si se detecta una CTC.
En otra realizacion, se proporciona un metodo para proporcionar un pronostico para un sujeto diagnosticado con cancer metastasico, comprendiendo el metodo las etapas de (a) detectar la presencia o ausencia de una CTC en una alfcuota de una muestra de sangre del sujeto; (b) asignar un valor a la alfcuota basado en el numero de CTC detectadas en la alfcuota; (c) dirigir el flujo o recoleccion de la alfcuota en base al valor asignado; y (d) proporcionar un buen pronostico si el numero total de CTC detectado en la muestra de sangre es menor que un valor de referencia predeterminado, o un mal pronostico si el numero total de CTC detectado en la muestra es igual o mayor que el valor de referencia.
En ciertas realizaciones, un valor de referencia predeterminado puede estar asociado con una probabilidad de responder a una terapia particular o una probabilidad de supervivencia global o libre de enfermedad durante un penodo de tiempo, por ejemplo, al menos 6 meses, o al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 o mas anos.
3. Monitorizacion del avance de la enfermedad o respuesta a la terapia
En otro aspecto, la presente invencion proporciona metodos para monitorizar el avance de una enfermedad o la respuesta a una terapia, comprendiendo el metodo detectar una partfcula rara en una muestra de fluido usando un metodo y/o aparato eDAR proporcionado en el presente documento.
En una realizacion, el metodo comprende las etapas de: (a) detectar la presencia o ausencia de la partfcula rara en una pluralidad de alfcuotas de una primera muestra biologica tomada de un sujeto en una primera vez; (b) asignar un valor a las alfcuotas basandose en la presencia, ausencia, cantidad o identidad de la partfcula rara; (c) determinar el valor total de todas las alfcuotas de la primera muestra; (d) detectar la presencia o ausencia de la partfcula rara en una pluralidad de alfcuotas de una segunda muestra biologica tomada del sujeto en una segunda vez; (e) asignar un valor a las alfcuotas basandose en la presencia, ausencia, cantidad o identidad de la partfcula rara; (f) determinar el valor total de todas las alfcuotas de la segunda muestra; y (g) comparar el valor total asignado a la primera muestra con el valor total asignado a la segunda muestra, en el que un valor aumentado asignado a la segunda muestra en comparacion con la primera muestra esta correlacionado con un avance de la enfermedad y/o una mala respuesta a la terapia y/o un valor disminuido asignado a la segunda muestra en comparacion con la primera muestra se correlaciona con una regresion de la enfermedad y/o una buena respuesta a la terapia.
En ciertas realizaciones, las alfcuotas pueden dirigirse ademas a un canal o camara particular (canalizado) en base al valor asignado para la recogida, enriquecimiento adicional o analisis posterior.
En ciertas realizaciones, pueden emplearse metodos de monitorizacion del avance de la enfermedad o de la respuesta a la terapia de forma regular despues del diagnostico de la enfermedad o del inicio del regimen de tratamiento. Por ejemplo, se pueden recoger muestras de un sujeto al menos una vez al ano, al menos dos veces al ano, o al menos aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o mas veces al ano. En algunas realizaciones, el sujeto puede monitorizarse aproximadamente una vez al mes, o al menos aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas veces al mes.
En ciertas realizaciones, en las que se encuentra un avance de la enfermedad o mala respuesta a una terapia, el metodo puede comprender ademas una etapa de asignar una terapia, aumentar un regimen de dosificacion, cambiar un regimen terapeutico y similares.
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En ciertas realizaciones, la enfermedad o afeccion asociada con una partfcula rara puede ser cancer, malaria, VIH/sida, una enfermedad relacionada con priones, o similares.
C. Metodos de monitorizacion de la calidad del agua
En otro aspecto, la presente invencion proporciona un metodo para monitorizar la calidad del agua detectando uno o mas contaminantes de partfculas raras en una muestra de agua usando un metodo o aparato eDAR proporcionado en el presente documento.
En una realizacion, el metodo comprende las etapas de (a) detectar la presencia o ausencia de un contaminante de agua en una alfcuota de una muestra tomada de una fuente de agua; (b) asignar un valor a la alfcuota en base a la presencia, ausencia, cantidad o identidad del contaminante del agua en la alfcuota; y (c) dirigir el flujo o recoleccion de la alfcuota en base al valor asignado, por lo que la calidad de la fuente de agua se determina en base al valor total asignado a todas las alfcuotas detectadas en el metodo.
En ciertas realizaciones, la fuente de agua puede ser un lago, una piscina, un no, un arroyo, u otro cuerpo natural de agua. En algunas de estas realizaciones, el agua puede ensayarse para determinar o predecir el impacto que un objeto o actividad hecha por el hombre tiene o tendra en la masa de agua o para evaluar la viabilidad o seguridad de usar la masa de agua para suministrar agua potable a una poblacion.
En otras realizaciones, la fuente de agua puede ser una piscina o estanque en una planta de tratamiento de agua, un deposito, una torre de agua u otra masa de agua recogida con el fin de suministrar agua potable a una poblacion. En algunas de estas realizaciones, el agua puede ensayarse para evaluar la viabilidad o seguridad de usar la masa de agua para suministrar agua potable a una poblacion.
En ciertas realizaciones, se puede usar un metodo proporcionado en el presente documento para monitorizar regularmente la calidad de una fuente de agua utilizada para suministrar agua potable a una poblacion, por ejemplo, en una planta de tratamiento de agua o en una torre o deposito de agua. En una realizacion de este tipo, la fuente de agua puede monitorizarse al menos una vez al ano, al menos dos veces al ano, o al menos aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas veces al ano. En algunas realizaciones, el sujeto puede monitorizarse aproximadamente una vez al mes, o al menos aproximadamente 2, 3, 4, 5 o mas veces al mes. En otras realizaciones, el agua se puede ensayar al menos una vez a la semana, o al menos 2, 3, 4, 5, 6, o mas veces a la semana, o al menos diariamente o al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas veces al dfa.
En otra realizacion, se puede usar un metodo proporcionado en el presente documento para determinar la viabilidad o seguridad de usar un cuerpo de agua para suministrar agua potable a una poblacion despues de un desastre natural (por ejemplo, despues de un huracan, tsunami o terremoto), accidente o acto de terrorismo.
Los metodos de ensayo o monitorizacion de la seguridad o calidad del agua pueden comprender la deteccion de una partfcula rara que es un contaminante del agua, por ejemplo, un parasito tal como una especie de Giardia, Cryptosporidium u otro contaminante de agua organico o inorganico que cuando esta presente en bajas cantidades supone un riesgo para la salud publica.
D. Aparatos
En un aspecto, la presente invencion proporciona un dispositivo para detectar una partfcula rara en un fluido biologico.
En una realizacion, el dispositivo comprende: (a) al menos un primer canal de entrada; (b) al menos dos canales de salida; (c) al menos un detector capaz de detectar una o mas partfculas raras en una alfcuota del fluido biologico; (d) un mecanismo para dirigir el flujo de la alfcuota; y (e) un dispositivo de clasificacion capaz de asignar un valor a la alfcuota basado en la presencia, ausencia, identidad, composicion o cantidad de las partfculas raras en la alfcuota, en el que el ordenador esta en comunicacion con el detector y el mecanismo para dirigir el flujo de la alfcuota.
En algunas realizaciones, el aparato comprende ademas una fuente para interrogar la alfcuota. En otras realizaciones, en las que la partfcula o celula rara presenta intrmsecamente quimioluminiscencia o bioluminiscencia, el aparato puede no requerir una fuente para interrogar la alfcuota.
En ciertas realizaciones, el aparato proporcionado en el presente documento puede comprender un canal de flujo encerrado por paredes y/o microfabricado sobre un sustrato, con caractensticas de diseno para minimizar el dano inadvertido a celulas raras. Reducir el dano inadvertido de las celulas raras reduce la tasa de falsos negativos, lo que podna conducir a un diagnostico erroneo del paciente o el pronostico. El canal de flujo puede comprender ademas canales con aperturas disenadas hidrodinamicamente para
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excluir celulas biologicas con estres o dano mmimos como se describe en las Solicitudes de Patente de Estados Unidos n.° 2007/0037172 y 2008/0248499. Dichos canales, a los que se hace referencia en las solicitudes de patente mencionadas anteriormente como canales con aperturas unidimensionales ("1-D"), reducen la presion hidrodinamica experimentada por las celulas durante el proceso de exclusion celular y por lo tanto, reducen la probabilidad de lisis celular. Los canales con aperturas 1-D pueden estar dispuestos estrategicamente en una matriz de acuerdo con la configuracion de "filtracion efusiva" como se describe en la Patente de Estados Unidos n.° 2008/0318324 para redirigir, dividir, amortiguar o dispersar adicionalmente el flujo, reduciendo consecuentemente la fuerza del impacto experimentado por las celulas en el momento de la exclusion. Las paredes que encierran el canal de flujo se pueden fabricar usando un proceso de curado UV de acuerdo con los procedimientos descritos en la PCTPCT/US2009/02426, a partir de un material de sustrato biocompatible que es un polfmero de calidad de dispositivo medico, de manera que el aparato eDAR cumpla con las regulaciones que rigen la fabricacion de dispositivos medicos.
1. Mecanismos para dirigir el flujo de una alicuota
En ciertas realizaciones, el mecanismo para dirigir el flujo dirige el flujo de la alfcuota a un primer canal de salida si la alfcuota contiene una partfcula rara o un segundo canal de salida si la alfcuota no contiene una partfcula rara.
En otra realizacion, el mecanismo para dirigir el flujo dirige el flujo de una alfcuota que contiene una partfcula rara en uno de una pluralidad de canales de salida dependiendo de la identidad, composicion o cantidad de la partfcula rara.
En ciertas realizaciones, el mecanismo para dirigir el flujo de la alfcuota comprende un electrodo, un elemento magnetico, un elemento acustico, un elemento electroaccionado, un campo electrico o un campo magnetico.
Todavfa en otras realizaciones, el mecanismo para dirigir el flujo de la alfcuota comprende una o mas valvulas o pistones electroaccionados, en el que las valvulas o pistones controlan el flujo de un lfquido en al menos un primer canal de flujo direccional que cruza con el primer canal de entrada y los dos canales de salida en una primera union.
En una realizacion, los pistones solenoides son subcomponentes de electrovalvulas electroaccionadas. En otra realizacion, los pistones solenoides estan incrustados en el dispositivo por moldeo. En otra realizacion mas, los pistones solenoides incrustados pueden reemplazarse por valvulas de solenoide en comunicacion de fluido a traves de tubenas.
En una realizacion particular, un aparato proporcionado en el presente documento puede comprender uno o mas electrodos para rastrear y/o manipular la trayectoria o flujo de una partfcula, alfcuota o muestra de fluido. En ciertas realizaciones, el electrodo puede mejorar la separacion de una alfcuota basandose en fenomenos tales como dielectroforesis o electrohumectacion.
En ciertas realizaciones, los aparatos de la presente invencion pueden comprender uno o mas elementos acusticos para rastrear y/o manipular la trayectoria o flujo de una partfcula, alfcuota o muestra de fluido. En ciertas realizaciones, se pueden usar elementos acusticos para manipular la trayectoria de partfculas o celulas seleccionadas con energfa acustica (por ejemplo, acustoforesis, ondas ultrasonicas o megasonicas.) para mejorar la separacion celular basandose en la respuesta de las celulas a las ondas de presion de compresion.
En otra realizacion, los aparatos proporcionados en el presente documento pueden comprender ademas un elemento magnetico para la separacion de una partfcula o celula rara unida a o unida por una partfcula magnetica. En ciertas realizaciones, el elemento magnetico puede mejorar la separacion de una alfcuota, partfcula o celula en base a la susceptibilidad magnetica de las celulas o de las partfculas micromagneticas o nanomagneticas unidas a una partfcula o celula.
En ciertas realizaciones, un aparato proporcionado en el presente documento puede comprender el uso de cambios de presion de fluido, cambios de caudal o cambios de flujo electroosmoticos para manipular la trayectoria de partfculas o celulas seleccionadas.
2. Dispositivos de deteccion
En ciertas realizaciones, el detector se selecciona del grupo que consiste en una camara, un multiplicador de electrones, un sensor de imagen de dispositivo de carga acoplada (CCD), un tubo fotomultiplicador (PMT), un fotodiodo de avalancha (APD), un diodo de avalancha de foton unico (SPAD), y un sensor de imagen complementario de semiconductor de oxido metalico (CMOS).
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En ciertas realizaciones, un aparato proporcionado en el presente documento puede comprender un detector fotoelectrico, acustico o magnetico para rastrear el movimiento de celulas seleccionadas o para enumerar partfculas seleccionadas o celulas presentes en una alfcuota.
En algunas realizaciones, un aparato o metodo proporcionado en el presente documento puede incorporar imagenes de microscopfa por fluorescencia (mono o multicolor) en diversas configuraciones, que incluyen, pero sin limitacion, campo luminoso, epi, confocal, DIC (contraste de interferencia diferencial), campo oscuro, Hoffman o contraste de fase.
En algunas realizaciones, los aparatos proporcionados en el presente documento pueden comprender una pluralidad de dispositivos de deteccion, por ejemplo, al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas dispositivos de deteccion. Pueden ser necesarios multiples dispositivos de deteccion para realizar un metodo de la presente invencion, por ejemplo, en los que mas de una partfcula o celula rara esta presente en una muestra de fluido, se esta usando mas de un marcador de celulas para diferenciar diferentes tipos de celulas, o reactivos de deteccion multiples que se detectan simultaneamente.
3. Dispositivos de interrogacion
En ciertas realizaciones, los aparatos proporcionados en el presente documento pueden comprender ademas una fuente para interrogar o excitar un resto detectable presente en una alfcuota. En ciertas realizaciones, la fuente de interrogacion se selecciona de, por ejemplo, un laser (estado solido, diodo bombeado, ion o tinte), un diodo emisor de luz (LED), una lampara, una descarga de arco, un pulso magnetico, o una fuente de luz natural.
En algunas realizaciones, los aparatos proporcionados en el presente documento pueden comprender una pluralidad de dispositivos de interrogacion, por ejemplo, al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas dispositivos de deteccion. Pueden ser necesarios multiples dispositivos de interrogacion para realizar un metodo de la presente invencion, por ejemplo, en los que mas de una partfcula o celula rara esta presente en una muestra de fluido, se esta usando mas de un marcador de celulas para diferenciar diferentes tipos de celulas, o reactivos de deteccion multiples que se detectan simultaneamente.
4. Dispositivos de clasificacion
En ciertas realizaciones, se puede seleccionar un dispositivo de clasificacion de un ordenador, un controlador, un chip con circuitos integrados, una placa de circuito, un elemento electronico, un software, un algoritmo o una combinacion de los mismos.
5. Canales y camaras de flujo
En ciertas realizaciones, un aparato proporcionado en el presente documento puede comprender una pluralidad de canales de flujo, que incluyen uno o mas canales de flujo de entrada (es decir, canales que traen una alfcuota a un volumen de deteccion) y uno o mas canales de salida (es decir, canales que alejan una alfcuota de un volumen de deteccion). En algunas realizaciones, un aparato como se proporciona en el presente documento puede comprender una combinacion de al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5,
6. 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, o mas canales de entrada y al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, o mas canales de salida.
En ciertas realizaciones, un aparato puede comprender canales de flujo multiples que se conectan al canal principal para inyectar fluido adicional para alterar la velocidad local.
En una realizacion, un aparato proporcionado en el presente documento puede comprender un canal de flujo o camara cerrada por paredes fabricadas a partir de materiales que incluyen, pero sin limitacion, materiales polimericos (polidimetilsiloxano (PDMS), poliuretano-metacrilato (PUMA), polimetilmetacrilato (PMMA), polietileno, poliester (PET), politetrafluoroetileno (PTFE), policarbonato, parileno, cloruro de polivinilo, fluoroetilpropileno, lexano, poliestireno, copolfmeros de olefinas dclicas, poliuretano, poliestercarbonato, polipropileno, polibutileno, poliacrilato, policaprolactona, policetona, poliftalamida, acetato de celulosa, poliacrilonitrilo, polisulfona, polfmeros epoxi, termoplasticos, fluoropolfmero, y fluoruro de polivinilideno, poliamida, poliimida), materiales inorganicos (vidrio, cuarzo, silicio, GaAs, nitruro de silicio), sflice fundida, ceramica, vidrio (organico), metales y/u otros materiales y combinaciones de los mismos.
En ciertas realizaciones, pueden fabricarse materiales de pared de membranas porosas, fibras tejidas o no tejidas (tales como tela o malla) de lana, metal (por ejemplo, acero inoxidable o Monel), vidrio, papel o sinteticas (por ejemplo, Nylon, polipropileno, policarbonato, parileno y diversos poliesteres), acero inoxidable sinterizado y otros metales, y materiales inorganicos porosos tales como alumina, sflice o carbono.
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En ciertas realizaciones, los aparatos proporcionados en el presente documento pueden comprender un canal o camara de flujo que se ha pretratado con una molecula qmmica o biologica. Por ejemplo, un canal o camara puede tratarse con un compuesto anticoagulante para prevenir o reducir la asociacion de una partfcula en la muestra de fluido, un compuesto que se une preferiblemente a una partfcula en la muestra de fluido, por ejemplo, una partfcula o celula rara, o un compuesto que evita o reduce la aglomeracion o agregacion de una partfcula en la muestra de fluido.
En una realizacion, las superficies de canal o camara pueden tratarse con compuestos anticoagulantes, compuestos que se unen preferiblemente a celulas tumorales circulantes, o compuestos que impiden el pegado de celulas.
En ciertas realizaciones, una superficie de canal o camara puede ser modificada qmmicamente para mejorar la humectacion o para ayudar en la adsorcion de celulas, partfculas o moleculas seleccionadas. Los productos qmmicos modificadores de superficie pueden incluir, pero sin limitacion, silanos tales como trimetilclorosilano (TMCS), hexametildisilazano (HMDs), (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahidrooctil)triclorosilano, clorodimetiloctilsilano, octadeciltriclorosilano (OTS) o Y-metiacriloxipropiltrimetoxisilano; polfmeros tales como acido acnlico, acrilamida, dimetilacrilamida (DMA), acrilato de 2-hidroxietilo, alcohol polivimlico (PVA), poli(vinilpirrolidona) (PVP), poli(etilenimina) (PEI), polietilenglicol (PEG), epoxi poli(dimetilacrilamida (EPDMA), o acrilato de PEG-monometoxilo; tensioactivos tales como tensioactivos Pluronic, tensioactivos a base de poli(etilenglicol) (PEG), dodecilsulfato de sodio (SDS), cloruro de dodeciltrimetilamonio (DTAC), bromuro de cetiltrietilamonio (CTAB), o polibreno (PB); derivados de celulosa tales como hidroxipropilcelulosa (HPC), o hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC), aminas tales como etilamina, dietilamina, trietilamina, o trietanolamina, compuestos que contienen fluor tales como los que contienen politetrafluoroetileno (PTFE) o Teflon.
6. Medios para la reduccion de fondo
En cierta realizacion, los aparatos proporcionados en el presente documento pueden comprender ademas un medio para reducir la senal de fondo excesiva y/o mejorar la relacion senal-ruido. Mediante la reduccion de la senal de fondo excesiva y el aumento de la relacion senal-ruido, la sensibilidad de la deteccion es mejorada ya que las senales debiles incluso de una alfcuota altamente diluida pueden detectarse con precision. En otras palabras, cuanto mejor sea la relacion senal-ruido, mas explorada puede ser una alfcuota. Como resultado directo, el rendimiento flrndico se aumenta correspondientemente, ya que se necesita escanear menos alfcuotas (pero mas grandes).
En una realizacion, los medios para reducir la senal de fondo comprenden una mascara. Una mascara puede consistir en cualquier numero de aperturas de cualquier forma o tamano, colocadas en cualquier orientacion con o sin ningun espaciamiento periodico. Por ejemplo, la figura 3 ilustra una mascara (301) que contiene una serie de aperturas (311), colocadas entre el volumen de deteccion y un detector para permitir selectivamente a traves de una caractenstica detectable.
En ciertas realizaciones, una mascara puede comprender un elemento optico que atraviesa selectivamente ciertas longitudes de onda de luz, por ejemplo, un filtro de paso bajo, de paso alto o de paso de banda, o un modulador acustico-optico, un modulador de luz espacial, un interruptor de luz, un holograma fabricado, una apertura ffsica o un escaner galvo.
En otras realizaciones, una mascara puede consistir en elementos magneticos que evitan selectivamente el paso de un campo magnetico.
En algunas realizaciones, pueden usarse otros dispositivos que logren ganancias similares en la relacion senal-ruido en lugar de o junto con una mascara. Por ejemplo, en ciertas realizaciones se puede usar un dispositivo seleccionado de un amplificador de bloqueo, un detector de exploracion, un interrogador o detector modulado o cualquier aparato que modula la frecuencia o la intensidad para aumentar la relacion senal-ruido.
En aun otras realizaciones, los detectores con funcionalidad de modulacion espacial de una mascara directamente incorporada dentro pueden usarse conjuntamente con los aparatos proporcionados en el presente documento. En ciertas realizaciones, no esta presente una mascara separada. En otras realizaciones, tambien esta presente una mascara separada. Los ejemplos no limitativos de detectores con funcionalidad de mascara incorporada incluyen matrices de fotodiodos o camaras con pixelacion espacial de tal forma que se pueden eliminar o conservar senales de fotodiodos individuales o pfxeles seleccionados de camaras.
7. Elementos adicionales
En ciertas realizaciones, los aparatos proporcionados en el presente documento pueden comprender
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ademas elementos adicionales utiles para realizar ensayos, procesos o ensayos de una manera que se acopla a los metodos eDAR proporcionados en el presente documento.
En una realizacion, un aparato proporcionado en el presente documento puede comprender ademas uno o mas elementos de calentamiento resistivos para realizar ensayos celulares en chip tales como reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) o reaccion en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR).
En aun otras realizaciones, un aparato proporcionado en el presente documento puede comprender ademas uno o mas electrodos, por ejemplo, para realizar un ensayo qmmico en chip, tal como electroforesis o electrocromatograffa.
En otra realizacion, un aparato proporcionado en el presente documento puede comprender ademas un elemento de filtro. En una realizacion particular, el elemento de filtro puede estar en forma de micropostes, microimpactadores, microtamices, canales con aperturas mas pequenas que las biopartfculas, canales con aperturas tales que se impide que una biopartfcula entre en una apertura pero se permite que el fluido continue fluyendo alrededor de la biopartfculas a traves de la apertura ("canales 1-D"), microperlas, membranas porosas, protuberancias de las paredes, revestimiento adhesivo, fibras tejidas o no tejidas (tales como tela o malla) de lana, metal (por ejemplo, acero inoxidable o Monel), vidrio, papel o sinteticas (por ejemplo, nylon, polipropileno, policarbonato, parileno y poliester), acero inoxidable sinterizado u otros metales, o materiales inorganicos porosos tales como alumina, sflice o carbono.
Por ejemplo, la figura 16 ilustra un elemento de filtro (1622), que puede estar dispuesto en un canal, tal como un canal de salida (1621), para permitir selectivamente el paso de la porcion de fluido mientras se conservan las biopartfculas deseadas.
En otra realizacion mas, un aparato proporcionado en el presente documento puede acoplarse a un citometro de flujo convencional.
Por ejemplo, la figura 16 ilustra un canal de salida (1621) que puede estar en comunicacion de fluido con un citometro de flujo convencional (con o sin elemento de filtro 1622) de manera que la alfcuota discreta 1661 que contiene la celula rara 1602 se examine o clasifique adicionalmente en serie (celda por celda).
IV. Ejemplos
A. Ejemplo 1
Un ejemplo de un aparato eDAR con un unico puerto de entrada y salida para la deteccion o cuantificacion de partfculas raras en un fluido.
La figura 4 muestra un ejemplo de aparato eDAR que consiste en un dispositivo (411) para dividir en alfcuotas una suspension celular, un dispositivo de interrogacion (421 y 422), un dispositivo de deteccion o formacion de imagenes (431, 432 y 433), y un dispositivo de clasificacion (ordenador no mostrado). En este ejemplo particular, un dispositivo (411) para dividir en alfcuotas una suspension de celulas puede consistir en un canal de fluido (414) contenido dentro de paredes y puertos de fluido (412 y 413). Un laser sirve como un dispositivo de interrogacion. Un microscopio invertido con fotodiodos, fotomultiplicadores o camaras se utiliza como un dispositivo de deteccion. Una mascara (451) se coloca en una trayectoria entre el canal (414) y los dispositivos de deteccion (431, 432 y 433). Un ordenador acepta la senal del dispositivo de deteccion y a traves de un algoritmo clasifica la alfcuota. El ordenador entonces dirige la alfcuota al canal apropiado en base al valor de la clasificacion (es decir, la presencia, ausencia, cantidad, identidad o composicion de partfculas raras en la muestra de fluido). Aunque la figura 4 ilustra tres dispositivos de deteccion (431, 432 y 433) y dos dispositivos de interrogacion (421 y 422), en la practica la eDAR puede consistir solamente en un dispositivo de deteccion y un dispositivo de interrogacion, o multitud de dispositivos de deteccion y dispositivos de interrogacion.
En un uso del aparato ilustrado en la figura 4, los dispositivos de interrogacion (421 y 422) consistfan en un laser bombeado con diodo de estado solido de 488 nm y un laser HeNe de 633 nm que se dirigen a un microscopio invertido. Los dos rayos laser se conformaron usando una optica cilmdrica para formar un haz elfptico colimado con una relacion de aspecto de 10 a 1 antes de entrar en el objetivo del microscopio. Usando una combinacion de media placa de onda y un divisor de haz polarizante, la intensidad de cada haz puede ajustarse, mientras que los espejos dirigen la luz de forma independiente para crear una region de excitacion espacialmente colocalizada. La fluorescencia de las biopartfculas se dividio en tres bandas de longitud de onda por dos espejos dicroicos antes de pasar a traves de los filtros de paso de banda y se centro de nuevo en los tres diodos de avalancha de foton unico (SPAD, 431,432 y 433). Un SPAD recogio la fluorescencia en el intervalo de longitud de onda de 560-610 nm, un segundo SPAD recogio la fluorescencia en el intervalo de 645-700 nm, y un tercer SPAD la recogio en el intervalo de 500-540 nm. Los resultados de los SPAD se dirigieron a un ordenador con una tarjeta de contador/temporizador y se analizaron con varios algoritmos.
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B. Ejemplo 2
Aparato eDAR con dos puertos de salida para la deteccion o cuantificacion de partmulas raras en un fluido.
La figura 5 ilustra un aparato eDAR que consiste en un dispositivo para dividir en almuotas una suspension celular (510), un dispositivo de interrogacion (521), un dispositivo de deteccion o formacion de imagenes (531), un dispositivo de clasificacion (ordenador no mostrado), y un aparato para dividir en almuotas directamente de acuerdo con la clasificacion asignada. Este aparato tambien incluye un unico puerto de entrada (511), dos puertos de salida (512 y 513) y tres canales de fluido (514) unidos en un unico punto para dividir en almuotas el fluido. Un laser sirve como el dispositivo de interrogacion (521) y un microscopio invertido con fotodiodos, fotomultiplicadores o camaras sirve como dispositivo de deteccion (531). Una mascara (551) se coloca entre los canales (514) y el dispositivo de deteccion (531). Un ordenador acepta la senal del dispositivo de deteccion y clasifica la almuota a traves de un algoritmo. El dispositivo utiliza entonces un medio electrico, magnetico, hidrodinamico o neumatico para dirigir la almuota hacia la salida 512 o la salida 513 de acuerdo con la clasificacion asignada.
Ademas del aparato eDAR descrito anteriormente, que tiene un unico dispositivo de interrogacion y un solo dispositivo de deteccion, se pueden usar multiples dispositivos de interrogacion y deteccion junto con los aparatos eDAR descritos en el presente documento. Por ejemplo, la figura 6 ilustra un aparato eDAR con un dispositivo de interrogacion (640) y tres dispositivos de deteccion (650, 651 y 652).
C. Ejemplo 3
Aparato eDAR con multiples puertos de entrada y/o salida para la deteccion o cuantificacion de partmulas raras en un fluido.
En diversos aspectos de la invencion, un aparato eDAR puede consistir en multiples puertos de entrada y/o salida. Por ejemplo, la figura 7 ilustra un dispositivo (710) para dividir en alfcuotas una suspension con cinco puertos (711, 712, 713, 714 y 715) y cinco canales de fluido 716 unidos en un unico punto. Se pueden usar uno o mas puertos como entrada de fluido; se pueden usar uno o mas puertos como salida de fluido. Por ejemplo, el aparato puede utilizarse de tal manera que se usen dos puertos como puertos de entrada y se utilicen tres orificios como puertos de salida, o se puede utilizar de manera que un puerto sea un puerto de entrada y cuatro puertos de salida, etc. En teona, el dispositivo (710) puede contener cualquier numero de entradas y salidas de fluido y cualquier numero de canales de fluido. Estos canales de fluido pueden estar unidos en mas de un punto y el punto de union no necesita estar circunscrito por las entradas o salidas de fluido.
D. Ejemplo 4
Deteccion de celulas tumorales circulantes (CTC) en la sangre de pacientes con cancer de mama mediante el uso de eDAR.
La sangre de reciente venopuncion de pacientes con cancer de mama metastasico en estadio IV se extrajo de una puncion unica en tres tubos separados. La primera porcion de sangre (primer tubo) se descarto para evitar la posible contaminacion de las celulas epiteliales de la puncion de la piel. Se recogio una segunda porcion en un tubo CellSave de Veridex que contema reactivos estabilizantes para la deteccion de celulas tumorales circulantes utilizando un sistema CellSearch de Veridex. Se recogio una tercera porcion en un tubo de recogida que contema anticoagulante de EDTA para analisis separado usando eDAR.
La tercera porcion se incubo con enzimas, fijadores, reactivos de permeabilidad, y anticuerpos fluorescentes dirigidos a la pan-citoqueratina, CD45 y la molecula de adhesion celular epitelial (EpCAM). Una identificacion positiva de celulas tumorales circulantes se define como una celula que expresa pan- citoqueratina y EpCAM, pero no CD45. CD45 es comunmente conocido como antfgeno comun de leucocitos y es indicativo de un globulo blanco. Un objeto ligado con los tres anticuerpos se considera falso positivo, frecuentemente como resultado de la agregacion de protemas.
En resumen, las muestras de sangre marcadas con anticuerpos de 5 a 10 ml fluyeron a traves de un aparato eDAR como se describe en el Ejemplo 1 a un caudal de entre aproximadamente 10-500 pl/min, usando una fuente de aire comprimido que suministra 7,6 psi para conducir el flujo. El aparato eDAR funcionaba en el modo de flujo continuo (simultaneo). Para estos experimentos, se utilizaron microcanales de 200 pm de ancho por 50 pm de altura. Para la interrogacion de los complejos de anticuerpos marcados, se proporcionaron haces de excitacion de lmea confocal a tanto 488 nm como 633 nm, que iluminaron una lamina de luz que era de aproximadamente 5-10 pm de espesor. Como tal, el volumen de deteccion de lmea confocal tema dimensiones de aproximadamente 200 pm (ancho) x 50 pm (altura) x 10
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pm (espesor), proporcionando un volumen de deteccion de aproximadamente 0,1 nl. Tres dispositivos de deteccion de SPAD funcionaban a una frecuencia de muestreo de 10.000 Hz, configurados para detectar senales de fluorescencia que emanaban de las celulas a 450-610 nm, 645-700 nm y 500-540 nm. A esta velocidad, cada almuota fue del orden de 1 nl a 50 ml, estimada para contener 5-250 globulos blancos y 5.000-25.000 globulos rojos. Para una muestra de 5-10 ml, se tarda entre 10-20 min en procesar la muestra a un caudal de 500 pl/min. Una muestra de 5 ml procesada de esta manera se dividira en 10.000 almuotas con un volumen de 50 nl cada una.
Como tal, si se utilizo un aparato eDAR que tema dos canales de salida, una muestra de 5 ml que contema 200 CTC puede reducirse a un volumen de 10 pl en solo 10 minutos, sin el uso de un filtro. Si el aparato eDAR estuviera ademas en contacto lfquido con un citometro de flujo, las 200 celulas CTC presentes en la muestra de 5 ml podnan contarse y/o aislarse individualmente en solo el 2 % del tiempo normal mediante la implementacion de una etapa eDAR antes de la citometna de flujo.
La figura 8 muestra los recuentos de CTC de 27 muestras de sangre de pacientes con cancer de mama en estadio IV (de multiples pacientes extrafdas en fechas diferentes) utilizando el sistema CellSearch de Veridex (panel inferior) y eDAR (panel superior). Como puede observarse facilmente, la mayona de las muestras de pacientes registraron recuentos de CTC nulos utilizando el sistema CellSearch. En contraste, se encontro que mas del 50 % de las extracciones de las mismas pacientes analizadas por eDAR conteman recuentos de 200-400 CTC. Esto demuestra ampliamente cien veces mas sensibilidad con el uso de eDAR, en comparacion con el uso del sistema CellSearch comercial de Veridex. La mayor sensibilidad de eDAR es atribuible a la discriminacion exacta entre CTC y valor de fondo por clasificacion de almuotas y el uso de una mascara.
Como se muestra tambien en la figura 8, el 100 % de las muestras de pacientes analizadas por eDAR indicaron la presencia de CTC, mientras que unicamente el 40 % de las muestras de pacientes analizadas por el sistema CellSearch de Veridex indicaron cualquier presencia de CTC. Esto demostro una tasa significativamente menor de falsos negativos proporcionados por eDAR. Una alta tasa de falsos negativos en una prueba de CTC puede conducir a un pronostico inexacto de metastasis y dar a los pacientes una falsa sensacion de seguridad de que el regimen de tratamiento existente es suficiente.
En la figura 9 se muestran imagenes ejemplares de una CTC detectada mediante este metodo eDAR. En resumen, esta figura muestra las imagenes opticas de celulas cancerosas atrapadas de sangre de paciente usando eDAR (las flechas marcan CTC) bajo diversas iluminaciones. La figura 9A es una imagen de campo claro de una CTC en medio de globulos rojos. La figura 9B es una imagen de fluorescencia que indica la presencia de pan-citoqueratina. La figura 9C es una imagen de fluorescencia que indica la ausencia de CD45, descartando asf la posibilidad de falsa identificacion de un globulo blanco como una CTC.
E. Ejemplo 5
Deteccion de celulas madre de cancer entre una poblacion de celulas cancerosas.
Las celulas cancerosas segregadas por eDAR pueden analizarse adicionalmente para distinguir las subpoblaciones dentro del fluido biologico. Al perfundir con anticuerpos fluorescentes adicionales dirigidos a protemas espedficas, algunas celulas cancerosas pueden distinguirse de otras. Por ejemplo, las celulas cancerosas que expresan protemas CD44, pero no CD24, han sido recientemente denominadas celulas madre de cancer por su asociacion con alto potencial metastasico. Otras protemas pueden estar asociadas con diversos rasgos de celulas.
Por ejemplo, la figura 10 demuestra la identificacion de celulas madre de cancer de mama (marcadas con puntas de flecha). En pocas palabras, las celulas de cancer de mama (MCF-7) se marcaron con Alexa 488-anti-CD44 (positivo) y Alexa 647-anti-CD24 (negativo). La figura 10A es una imagen de fluorescencia (500-540 nm) para detectar Alexa 488-anti-CD44 (verde); la figura 10B es una imagen de fluorescencia (645-700 nm) para detectar Alexa 647-anti-CD24 (rojo); la figura 10C es la imagen de campo claro. La figura 10D es una imagen compuesta que indica CD44+/CD24- (las flechas indican celulas madre de cancer). Se encontro que aproximadamente el 25 % de las celulas cancerosas expresaban CD44 pero no CD24 y cumplfan asf los criterios para las celulas madre de cancer. De esta manera, se puede usar eDAR para distinguir subpoblaciones de celulas cancerosas en un fluido biologico.
F. Ejemplo 6
Deteccion eDAR utilizando almuotas discretas.
En un ejemplo de los metodos proporcionados en el presente documento, la eDAR puede operarse usando almuotas acuosas discretas que estan separadas por una fase inmiscible para encapsular biopartfculas antes de la etapa de deteccion. La figura 16 ilustra un aparato eDAR que funciona de esta
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manera. Por ejemplo, una suspension celular que contiene celulas no deseadas (1601) y celulas raras deseadas 1602 se divide en alfcuotas discretas (1631, 1641, 1651 y 1661), que estan separadas unas de otras por una fase inmiscible (1642). Las partes alfcuotas discretas se dirigen a fluir de izquierda a derecha en un canal de flujo (1603). Cuando la alfcuota 1641 atraviesa el volumen de deteccion (1604; contorno cilmdrico), se detectan simultaneamente multiples celulas encapsuladas dentro de la alfcuota discreta (1641). Si no se detectan celulas deseadas, la alfcuota discreta (1641) se clasifica como nula y se dirige hacia el canal 1611 (vease, por ejemplo, la alfcuota 1651). Si se detectan celulas raras deseadas, la alfcuota discreta se clasifica como no nula y se dirige hacia el canal 1621 (vease, por ejemplo, alfcuota 1661).
En una realizacion, el elemento de filtro 1622 puede estar dispuesto en el canal 1621 para permitir selectivamente el paso de la porcion de fluido mientras se conservan las biopartfculas deseadas. En una realizacion, y el aparato eDAR puede acoplarse a un citometro de flujo convencional. Por ejemplo, en la figura 16, el canal 1621 puede estar en comunicacion de fluido con un citometro de flujo convencional (con o sin elemento de filtro 1622), de manera que la alfcuota discreta 1661 que contiene la celula rara 1602 se examina o se clasifica adicionalmente en serie (una celula a la vez).
La fase inmiscible (1642) puede ser continua (es decir, rodea en su totalidad las alfcuotas discretas) como se ilustra en la figura 16 o segmentada (es decir, la fase inmiscible 1642 ocupa solamente la separacion entre alfcuotas discretas pero no rodea completamente las alfcuotas).
G. Ejemplo 7
Como ejemplo de la utilidad de un aspecto de la presente invencion, si una suspension celular de 10 ml contiene solo 9 celulas raras deseadas entre 10 mil millones de celulas no deseadas, eDAR, en la forma mas simple, requerira la deteccion de una caractenstica a partir de las celulas deseadas contenidas en 10 alfcuotas. Puesto que hay solo 9 celulas deseadas, al menos una alfcuota estara desprovista de las celulas deseadas y puede clasificarse como nula y descartada inmediatamente. Las celulas no deseadas contenidas en la porcion desechada no tendnan que ser seleccionadas individualmente. Por consiguiente, con solo 10 alfcuotas, al menos 1/10 del volumen total se descarta inmediatamente y 1/10 de las celulas no deseadas (contenidas dentro del volumen desechado) no tendnan que ser detectadas individualmente. Para ponerlo en perspectiva, es decir, 1 billon de celulas no deseadas eliminadas como un conjunto con una decision. Con el clasificador de celulas del estado de la tecnica operando a la velocidad extrema de 70.000 objetos/s, esta decision dio como resultado 1.000.000.000/70.000 = 14.300 s o 4 horas de tiempo ahorrado. Esto da como resultado un aumento significativo en la eficiencia del tiempo.
A partir del escenario presentado anteriormente, se supone que si la suspension celular de 10 ml se divide en 100 alfcuotas de 100 pl cada una, puesto que el volumen total de suspension celular contiene solo 9 celulas deseadas, al menos 91 porciones no contendran ninguna celula deseada. Por lo tanto, realizando solo 100 escaneos y tomando 100 decisiones, se pueden eliminar inmediatamente 91 alfcuotas x 100 pl = 9,1 ml. Las celulas contenidas dentro de las porciones descartadas seran 9,1 billones de celulas, o el 91 % de las celulas no deseadas se eliminan dentro de 100 decisiones.
H. Ejemplo 8
La figura 1 ilustra una realizacion particular de la invencion, en la que una caractenstica de partfcula rara se detecta en una alfcuota durante el funcionamiento de un modo simultaneo. En resumen, una suspension de celulas que contiene celulas indeseables (101) y celulas raras deseables (102) se dirige para fluir de izquierda a derecha en un canal de flujo (103). Multiples celulas pueden atravesar un volumen de deteccion (104) encerrado por un cilindro sombreado en un momento dado y detectarse simultaneamente. Si no se detectan celulas deseadas, una alfcuota equivalente al volumen de deteccion se clasifica como nula y se dirige hacia el canal 111. Si se detectan cualesquiera celulas deseadas, la alfcuota se clasifica como distinta de cero y se dirige hacia el canal 121.
Un elemento de filtro (122) puede estar opcionalmente dispuesto en el canal 121 para permitir selectivamente el paso de la porcion de fluido mientras se conservan las biopartfculas deseadas. El elemento de filtro puede estar en forma de micropostes, microimpactadores, microtamices, canales con aperturas mas pequenas que las biopartfculas, canales con aperturas tales que se impide que una biopartfcula entre en una apertura pero se permite que el fluido continue fluyendo alrededor de la biopartfculas a traves de la apertura ("canales 1-D"), microperlas, membranas porosas, protuberancias de las paredes, revestimiento adhesivo, fibras tejidas o no tejidas (tales como tela o malla) de lana, metal (por ejemplo, acero inoxidable o Monel), vidrio, papel o sinteticas (por ejemplo, nylon, polipropileno, policarbonato, parileno y poliester), acero inoxidable sinterizado u otros metales, o materiales inorganicos porosos tales como alumina, sflice o carbono.
I. Ejemplo 9
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En otro ejemplo de ejecucion de eDAR en un modo simultaneo, el metodo puede consistir ademas en enmascarar selectivamente la aKcuota para reducir la senal de fondo excesiva y mejorar la relacion senal- ruido. La figura 2 ilustra el uso de una mascara (211) con una matriz de aperturas (212) situadas entre el volumen de deteccion y un detector para permitir selectivamente a traves de una caractenstica detectable. Se pueden detectar simultaneamente multiples biopartfculas con el uso de la mascara (211). Mediante la reduccion de la senal de fondo excesiva y el aumento de la relacion senal-ruido, la sensibilidad de la deteccion es mejorada ya que las senales debiles incluso de una alfcuota altamente diluida pueden detectarse con precision. En otras palabras, cuanto mejor sea la relacion senal-ruido, mas explorada puede ser una alfcuota. Como resultado directo, el rendimiento flmdico se aumenta correspondientemente, ya que se necesita escanear menos alfcuotas (pero mas grandes). Si no se detectan las biopartfculas deseadas, una alfcuota equivalente al volumen de deteccion se clasifica como nula y se dirige hacia el canal 221. Si se detectan cualesquiera biopartfculas deseadas, la alfcuota se clasifica como distinta de cero y se dirige hacia el canal 222.
J. Ejemplo 10
El panel 11 de la FIG. 11, que es una ilustracion ampliada del dispositivo 710 (figura 7), ilustra el dispositivo 1110, para dividir en alfcuotas la suspension con cinco canales de fluido (1111, 1112, 1113, 1114 y 1115) unidos en la union 1116. Los canales de fluido 1111, 1112, 1113 llevaban fluido hacia la union 1116, mientras que los canales de fluido 1114 y 1115 llevaban fluido fuera de la union 1116. El piston solenoide 1120 se coloco encima del canal 1111 y el piston solenoide 1121 se coloco encima del canal 1112. Los pistones solenoides 1120 y 1121 se configuraron para empujar hacia abajo una membrana elastomerica de polidimetilsiloxano (PDMS), que separaba los pistones 1120 y 1121 del fluido en los canales 1111 y 1112.
El panel A de la figura 11 ilustra el funcionamiento del dispositivo 1110 para la division en alfcuotas de la suspension. Al empujar el piston solenoide 1120 hacia abajo la membrana PDMS sobre el canal de flujo 1111, el canal 111 se cerro. Al mismo tiempo, el piston solenoide 1121 se configuro para permitir que el fluido pasara a traves del canal 1112 hacia la union 1116. Como resultado, la sangre que contema celulas raras en el canal entrante 1112 se desvio hacia el canal de salida izquierdo 1114 (vease el panel B, 0 ms). Para dirigir la alfcuota 1130 al canal de salida derecho 1115, el piston solenoide 1120 se retiro de la membrana PDMS en la parte superior del canal 1111 mientras que el piston solenoide 1121 empujo hacia abajo la membrana PDMS sobre el canal 1112. Esto dio como resultado dirigir una alfcuota 1130 de sangre que contema celulas raras al canal de salida derecho 1115 (panel C, 5 ms y panel D, 10 ms). La redireccion de alfcuotas usando pistones solenoides como se describe requiere un tiempo tan corto como 5 ms.
K. Ejemplo 11
El panel A de la figura 12 ilustra el dispositivo 1210 utilizado para dividir en alfcuotas la suspension con cinco canales de fluido (1211, 1212, 1213, 1214 y 1215) unidos en la union 1240. Los canales de fluido 1211, 1212 y 1213 llevaban fluido hacia la union 1240, mientras que los canales de fluido 1214 y 1215 llevaban fluido fuera de la union 1240. La valvula solenoide 1220 se conecto al puerto 1216 en comunicacion de fluido con el canal 1211 a traves de la tubena 1221, y la valvula solenoide 1222 se conecto al puerto 1217 en comunicacion de fluido con el canal 1212 a traves del tubo 1223.
Las valvulas solenoides 1220 y 1222 se accionaron para cerrarse o abrirse con una senal electronica o informatica (por ejemplo, senal TTL). Cuando la valvula solenoide 1220 se cerro mientras la valvula solenoide 1222 permanecio abierta, la alfcuota 1260 de sangre que contema celulas raras en el canal entrante 1213 se desvio al canal de salida izquierdo 1214 (vease el panel B, 0 ms). Cuando se abrio la valvula solenoide 1220 mientras se mantuvo cerrada la valvula solenoide 1222, una alfcuota 1260 de sangre que contema celulas raras en el canal entrante 1213 se desvio hacia el canal de salida derecho 1215 (vease el panel C, 2 ms). La redireccion de alfcuotas usando una combinacion de electrovalvulas 1220 y 1222 podna canalizar la alfcuota de un canal a otro en tan solo 2 ms.
L. Ejemplo 12
Para probar el rendimiento del dispositivo eDAR, se preparo una mezcla de sangre y celulas cancerosas de acuerdo con el siguiente procedimiento: Se marcaron 1 x 10E6/ml de celulas MCF-7 con 20 pl de anticuerpo fluorescente EpCAM. Esta mezcla de celulas se diluyo despues a 1 x 10E5 celulas/ml con diluyente hematologico Isoton. Despues se anadieron 10 pl de la mezcla celular diluida a 2 ml de sangre humana completa y fluyo a traves del dispositivo de division en alfcuotas. El caudal en el dispositivo de division en alfcuotas fue nominalmente 30 pl/min a menos que se indique otra cosa.
La figura 13 muestra las senales de fluorescencia recogidas de 2 fotodiodos de avalancha (APD) situados en diferentes lugares aguas arriba y aguas abajo de la union 1116 (o 1240). El grafico 1310 muestra la huella de senal 1311 de un APD configurado para detectar la presencia de la molecula de EpCAM en una
aKcuota al volumen de deteccion 1140 (o 1270), mientras que el grafico 1320 muestra a huella de senal 1321 de un segundo APD configurado para detectar la presencia de la molecula de EpCAM en el canal 1114 (o 1214). Los picos de senal 1312 coincidfan sustancialmente con los picos de senal 1322, indicando que la canalizacion de la alfcuota era correcta, dando como resultado una alta recuperacion de celulas 5 raras.
Con el fin de investigar mas a fondo el rendimiento del dispositivo eDAR, se conto el numero de celulas cancerosas dirigidas al canal de flujo correcto y posteriormente se recogieron ("recuperaron") mientras se ajusto la longitud de tiempo que la valvula solenoide (1220, 1222) o el piston 1120, 1121) permanecen 10 cerrados o abiertos ("longitud de pulso"). El porcentaje de recuperacion se calculo dividiendo el numero de
celulas raras recogidas en el canal correcto por el numero de celulas raras detectadas por un APD en el volumen de deteccion 1140 o 1270. El grafico 1410 de la figura 14 muestra el porcentaje de celulas cancerosas recuperado en funcion de la longitud de pulso. La huella 1420 indica que cuando el ancho de pulso era de 10 ms o menos, el 100 % de las celulas cancerosas se recogieron en el canal correcto. A 15 medida que el ancho de pulso aumento, la huella 1420 disminuyo, indicando una perdida de celulas en el canal incorrecto.
Ajustando el caudal del canal entrante 1113 (o 1213), tambien se observo que la recuperacion podna optimizarse. La figura 15 muestra el grafico 1510 indicando la huella 1520 el porcentaje de celulas raras 20 recuperadas en funcion del caudal entrante. Cuando el caudal fue inferior a 30 pl/min, la recuperacion
estuvo entre el 89-100 %. Sin embargo, a medida que aumento el caudal, la recuperacion disminuyo, indicando una perdida creciente de celulas raras en el canal equivocado.

Claims (16)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un aparato para detectar una partfcula rara en una muestra de fluido, comprendiendo el aparato:
    (a) al menos un canal de entrada;
    (b) al menos un canal de salida;
    (c) al menos un detector;
    (d) un mecanismo capaz de dirigir un flujo de una alfcuota de fluido, en el que la alfcuota comprende una pluralidad de partfculas distribuidas aleatoriamente a lo largo de un espacio tridimensional; y
    (e) un ordenador capaz de asignar un valor a la alfcuota en base a la presencia, ausencia, identidad, composicion o cantidad de las partfculas raras en la alfcuota, en el que el ordenador esta en comunicacion con el detector y el mecanismo para dirigir el flujo de la alfcuota y en el que la partfcula rara es una celula o macromolecula presente en la muestra de fluido a un nivel bajo que comprende menos de aproximadamente 1 parte por 103 de la poblacion total de partfculas en la muestra de fluido.
  2. 2. El aparato de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende al menos dos canales de salida; opcionalmente, en el que el mecanismo dirige el flujo de la alfcuota a un primer canal de salida si la alfcuota contiene la partfcula rara o un segundo canal de salida si la alfcuota no contiene la partfcula rara; opcionalmente en el que el mecanismo dirige el flujo de la alfcuota que contiene la partfcula rara a un canal de salida dependiendo de la identidad, composicion o cantidad de la partfcula rara.
  3. 3. El aparato de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el mecanismo para dirigir el flujo de la alfcuota comprende un electrodo, un elemento magnetico, un elemento acustico o un elemento electroaccionado; o en el que el mecanismo para dirigir el flujo de la alfcuota comprende una o mas valvulas o pistones electroaccionados, en el que las valvulas o pistones controlan el flujo de la alfcuota en al menos un primer canal de flujo direccional que cruza con el canal de entrada y el canal de salida en una primera union.
  4. 4. El aparato de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el canal de salida esta en comunicacion de fluido con el canal de entrada.
  5. 5. El aparato de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende:
    una tubena, un puerto o una interconexion en comunicacion de fluido con el canal de entrada; opcionalmente en el que una pluralidad de alfcuotas de la muestra de fluido se forman externamente al aparato y fluyen hacia el canal de entrada del aparato a traves de la tubena, el puerto o la interconexion en comunicacion de fluido con el canal de entrada; y/o,
    una pluralidad de canales de flujo, y en el que una pluralidad de alfcuotas de la muestra de fluido se separan ffsicamente en la pluralidad de canales de flujo.
  6. 6. El aparato de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que:
    el mecanismo es capaz de dirigir en paralelo la pluralidad de alfcuotas de la muestra de fluido; y/o, el detector comprende un dispositivo de formacion de imagenes; y/o,
    el detector comprende mas de un dispositivo de deteccion; o en el que el detector comprende un unico dispositivo de deteccion; y/o,
    el detector se selecciona del grupo que consiste en una camara, un multiplicador de electrones, un sensor de imagen de dispositivo de carga acoplada (CCD), un tubo fotomultiplicador (PMT), un fotodiodo de avalancha (APD), un diodo de avalancha de foton unico (SPAD), y un sensor de imagen de semiconductor de oxido metalico complementario (CMOS); o comprende un fotodetector, electrodetector, detector acustico o magnetico; o en el que el detector incorpora imagenes de microscopfa por fluorescencia.
  7. 7. El aparato de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que:
    el aparato comprende una fuente de radiacion electromagnetica para la interrogacion de la alfcuota; y/o,
    el detector es capaz de detectar en paralelo la presencia o ausencia de la partfcula rara en la pluralidad de alfcuotas de la muestra de fluido; o la formacion en imagenes en paralelo de la partfcula rara en la pluralidad de alfcuotas de la muestra de fluido.
  8. 8. Un metodo para detectar una partfcula rara en una muestra de fluido, comprendiendo el metodo:
    (a) detectar la presencia o ausencia de la partfcula rara en una alfcuota de la muestra de fluido;
    (b) asignar un valor a la alfcuota en base a la presencia o ausencia de la partfcula rara en la alfcuota,
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    en el que la partfcula rara es una celula o macromolecula presente en la muestra de fluido a un nivel bajo que comprende menos de aproximadamente 1 parte por 103 de la poblacion total de partfculas en la muestra de fluido; y
    (c) dirigir un flujo de o recoger la alfcuota basandose en el valor asignado.
  9. 9. El metodo de la reivindicacion 8, en el que la direccion del flujo de la alfcuota comprende el uso de un mecanismo capaz de dirigir el flujo de la alfcuota, y en el que la alfcuota comprende una pluralidad de partfculas distribuidas aleatoriamente a lo largo de un espacio tridimensional.
  10. 10. El metodo de la reivindicacion 8, en el que la deteccion comprende:
    (i) poner en contacto la muestra de fluido con un reactivo de deteccion en condiciones adecuadas para transformar el reactivo de deteccion en un complejo que comprende el reactivo de deteccion y una partfcula rara; y
    (ii) detectar la presencia o ausencia del complejo formado en (i) en la alfcuota de la muestra de fluido.
  11. 11. El metodo de la reivindicacion 8, que comprende:
    (i) poner en contacto un fluido biologico de un sujeto con un reactivo de deteccion en condiciones adecuadas para transformar el reactivo de deteccion en un complejo que comprende el reactivo de deteccion y la partfcula rara, en el que la partfcula rara es una celula o macromolecula presente en el fluido biologico en un nivel bajo;
    (ii) detectar la presencia o ausencia de un complejo formado en (i) en la alfcuota del fluido biologico;
    (iii) asignar un valor a la alfcuota en base a la presencia o ausencia de un complejo formado en (i).
  12. 12. El metodo de la reivindicacion 8, en el que la partfcula rara se pone en contacto con un reactivo de deteccion diferenciable.
  13. 13. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que a la alfcuota se le asigna un primer valor si la alfcuota contiene la partfcula rara, o un segundo valor si la alfcuota no contiene la partfcula rara; opcionalmente en el que el primer valor depende de la identidad de la partfcula rara o de la concentracion de la partfcula rara en la alfcuota; opcionalmente en el que multiples alfcuotas que tienen el mismo valor asignado se agrupan entre sf.
  14. 14. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende dirigir un flujo o recoger la alfcuota en base al valor asignado, en el que dirigir el flujo de la alfcuota comprende usar un mecanismo capaz de dirigir el flujo de la alfcuota, y en el que la alfcuota comprende una pluralidad de partfculas distribuidas aleatoriamente a lo largo de un espacio tridimensional.
  15. 15. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que:
    la deteccion se realiza durante el flujo continuo de la muestra de fluido a traves de un canal de flujo; y/o,
    la direccion comprende utilizar un mecanismo capaz de dirigir en paralelo el flujo de la pluralidad de alfcuotas de la muestra de fluido; opcionalmente en el que la pluralidad de alfcuotas de la muestra de fluido estan ffsicamente separadas antes de la deteccion; opcionalmente en el que las alfcuotas en la pluralidad de alfcuotas se dividen en canales o camaras de flujo separadas antes de la deteccion; y/o,
    la deteccion comprende:
    (i) interrogar la alfcuota con una fuente externa de radiacion electromagnetica; y
    (ii) detectar la fluorescencia de la partfcula rara; y/o
    la deteccion comprende usar mas de un dispositivo de interrogacion y/o dispositivo de deteccion; o en el que la deteccion comprende el uso de un unico dispositivo de interrogacion y/o dispositivo de deteccion; y/o,
    la deteccion comprende detectar la bioluminiscencia o quimioluminiscencia de la partfcula rara; y/o, el reactivo de deteccion es diferenciable por fluorescencia a diferentes longitudes de onda; y/o, la muestra de fluido se pone en contacto simultaneamente con una pluralidad de reactivos de deteccion diferenciables, teniendo cada uno una especificidad diferente en condiciones suficientes para transformar la pluralidad de reactivos de deteccion en una pluralidad de complejos que comprenden los reactivos de deteccion y una pluralidad de partfculas raras; opcionalmente en el que la pluralidad de complejos se detectan en paralelo; y/o
    la deteccion comprende detectar en paralelo la presencia o ausencia de la partfcula rara en una pluralidad de alfcuotas de la muestra de fluido; o formar imagenes en paralelo de la partfcula rara en una pluralidad de alfcuotas de la muestra de fluido.
  16. 16.EI aparato de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores o el metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que:
    5 una alfcuota en la pluralidad de alfcuotas comprende un volumen discreto; y/o,
    la partfcula rara es una celula rara; y/o, la alfcuota contiene mas de una partfcula rara; y/o, la muestra de fluido es un fluido biologico.
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