CN107921277A - 使用循环肿瘤细胞作为生物标志物来监测癌症疗法的功效的方法 - Google Patents

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Abstract

本申请描述了使用循环肿瘤细胞动力学作为预测标志物来监测癌症疗法例如放射疗法的功效的方法。

Description

使用循环肿瘤细胞作为生物标志物来监测癌症疗法的功效的 方法
发明简介
本申请要求2015年5月14日提交的美国临时专利申请系列号62/161,595的优先权利益，所述临时申请的内容整体通过参考并入本文。
本发明在美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的合同号R01-CA182528和美国国家科学基金会(National Science Foundation)授予的合同号DMR-1409161的政府支持下做出。美国政府在本发明中具有一定权利。
背景技术
循环肿瘤细胞(CTC)在癌症管理中是重要的生物标志物。它的已确立的临床应用包括用作肿瘤的非侵入性“液体活组织检查样品”和在乳腺、***和结肠直肠癌中用作预后生物标志物(Cohen等，(2008)J.Clin.Oncol.26:3213-3221；Cristofanilli等，(2004)N.Engl.J.Med.351:781-791；de Bono等，(2008)Clin.Cancer Res.14:6302-6309)，以及在***癌中用作功效标志物(de Bono等，(2008)Clin.Cancer Res.14:6302-6309；Goldkorn等，(2014)J.Clin.Oncol.32:1136-1142；Sher等，(2011)J.Clin.Oncol.29(增刊；摘要LBA4517):293s；Lowes等，(2012)Clin.Transl.Oncol.14:150-156)。然而，现有的CTC测定法相对低的灵敏度限制了它在临床上的广泛采用。CTC在血液中极为稀少，在10亿个血液细胞中少到仅有一个。此外，血流中的大部分CTC在循环期间经历凋亡或坏死，导致外周血中可检测的CTC数目甚至更低。为了克服CTC的稀有性以将它们用作生物标志物，开发可以以高灵敏度和特异性检测并捕获CTC的装置，对于CTC研究和临床转化来说是关键的。
已开发了大量CTC检测方法。到目前为止唯一被FDA批准的***CELLSEARCHTM以及大多数目前可用的CTC检测技术利用基于免疫亲和的富集，其依赖于肿瘤上皮标志物例如上皮细胞黏附分子(EpCAM)的表达。然而，基于EpCAM的CTC检测技术显示出具有低的灵敏度，这是因为主要由于上皮间质转换(EMT)，许多CTC常常在细胞表面上显示出上皮标志物被下调。此外，使用现有检测方法所报道的通常低的捕获纯度(在所有捕获的细胞中CTC的百分率低)，阻碍了CTC的捕获后分析。
几种策略已显示出改进CTC的检测。首先，用aEpCAM和E-选择素进行表面功能化，与仅具有aEpCAM的表面相比表现出更高的捕获效率(最多高出3.2倍)。这种富集归因于E-选择素诱导的细胞滚动(cell rolling)，其将流动仓室中快速流动的细胞高效地募集在捕获表面上(Myung等，(2010)Langmuir 26:8589-96)。此外，已证实多价结合可以提高表面的捕获能力。利用G7聚酰胺-胺(PAMAM)树枝状聚合物介导的多价结合效应，表面的捕获能力被显著提高，正如通过解离常数增强超过1百万倍和捕获效率提高超过7倍所观察到的(Myung等，(2011)Angew Chem.Int.Ed.Engl.50(49):11769-72)。此外，已显示细胞滚动和多价结合的组合效应，可以用多种癌细胞特异性抗体例如aEpCAM、抗人类表皮生长因子受体-2抗体(aHER-2)和抗表皮生长因子受体抗体(aEGFR)来实现(Myung等，(2014)Anal.Chem.86(12):6088-94)。利用这些策略，已开发了被命名为UICHIPTM的CTC装置用于CTC的高效捕获，其假设所述观察到的增强适用于临床CTC(WO 2010/124227和WO 2015/134972)。
发明概述
本发明涉及一种用于监测癌症疗法的功效的方法，所述方法包括(a)在癌症疗法之前确定来自于对象的生物样品(例如外周血)中循环肿瘤细胞(CTC)的数目，并且(b)将在(a)中确定的CTC数目与在所述癌症疗法期间或之后的一个或多个时间点从来自于同一对象的类似生物样品确定的CTC数目进行比较，其中所述CTC的数目使用具有至少一个仓室的流式装置来确定，所述仓室包含固定化的细胞滚动剂(例如E-选择素)和一种或多种固定化的CTC特异性捕获剂(例如结合上皮细胞黏附分子(EpCAM)、表皮生长因子受体-2(HER-2)和表皮生长因子受体(EGFR)的抗体)。在一个实施方式中，在使用所述癌症疗法的治疗期间或之后CTC数目的变化(例如减少或增加)，指示了所述对象对所述癌症疗法的响应。在另一个实施方式中，所述一种或多种CTC特异性捕获剂通过共价连接到聚乙二醇的改性的聚酰胺-胺树枝状聚合物被固定化。在其他实施方式中，所述癌症疗法用于治疗头颈癌、肺癌、直肠癌、食道癌或***。在具体的实施方式中，所述癌症疗法是放射疗法，并且所述方法还包括步骤(c)，即如果在所述放射疗法期间或之后CTC的数目改变，则调整所述放射疗法(例如提高或降低电离辐射剂量，通过低分割或超分割施用所述放射，或施用化学疗法、基因疗法、免疫疗法、靶向疗法、激素疗法、放射增敏剂或其组合)。在具体的实施方式中，所述流式装置具有每mL约2.1个细胞的检测阈值，并提供约49％的CTC纯度水平。
附图简述
图1A-1C示出了在UICHIPTM-S上通过树枝状聚合物与多种抗体的组合提高CTC捕获灵敏度。图1A，使用UICHIPTM-S获得的来自于所有患者(01-21)的每mL血液的显著CTC计数。图1B，与来自于文献的CELLSEARCHTM结果相比，在UICHIPTM-S上每7.5mL患者血液捕获的CTC计数明显更高(CELLSEARCHTM的5±2，n＝19相比于1663±389，n＝20)。平均线指示平均值±SE。图1C，抗体混合物(ABMIX)、G7树枝状聚合物(G7)和两者的组合相对于在仅用aEpCAM包被的对照表面上捕获的CTC计数(虚线)的提高倍数。平均线指示平均值±SE。
图2A-2C示出了通过向UICHIPTM-D添加E-选择素介导的细胞滚动，提高CTC捕获特异性。图2A，使用UICHIPTM-D获得的来自于患者(UNC 02-21)的每mL血液的显著CTC计数。注意患者01的CTC计数未被包括，因为所述血液样品用EDTA而不是肝素处理，使细胞的滚动响应不稳定。图2B，使用UICHIPTM-D和UICHIPTM-S测量的CTC计数的比较。图2C，使用来自于健康供体的血液样品获得的CTC计数。使用UICHIPTM-S和UICHIPTM-D的基线CTC计数经测量分别为每mL 7.7±1.1和2.1±0.3个细胞。图2D，与使用UICHIPTM-S的情况相比，在使用UICHIPTM-D的所有捕获的细胞中CTC的捕获纯度(％)显著提高。这一结果表明通过E-选择素介导的细胞滚动急剧提高了UICHIPTM-D的捕获特异性。
图3A和3B示出了使用UICHIPTM-D监测放射疗法(RT)的治疗性效果。图3A，与使用CELLSEARCHTM在HNSCC癌症患者中报道的CTC计数(等，(2014)Clin.Cancer Res.20:525-33；Bozec等，(2013)Eur.Arch.Otorhinolaryngol.270:2745-9；Grisanti等，(2014)PLoS ONE 9(8):e103918；Nichols等，(2012)Head Neck 34:1440-4)相比，检测到使用UICHIPTM-D捕获的CTC数目明显更高(1663.3±389.2个细胞/7.5mL血液，平均值±标准误差(SE))。图3B，在RT过程中具有完整的CTC测量的16位患者中，RT前的CTC计数(中位数为152个细胞/mL，范围为43至849个细胞/mL)对RT做出响应统计学显著地降低(在RT结束时中位数为29个细胞/mL，范围为2至150个细胞/mL，p＝0.001)。
发明详述
循环肿瘤细胞(CTC)是癌症护理中的重要生物标志物。然而，CTC的临床实用受到现有CTC捕获测定法的低灵敏度的限制。现在已发现，使用UICHIPTMCTC捕获平台，通过将由E-选择素介导的细胞滚动引起的流动细胞向表面的高效募集与由聚酰胺-胺(PAMAM)树枝状聚合物介导的多价结合效应引起的肿瘤细胞的强烈表面结合和多种癌细胞特异性抗体例如aEpCAM、aHER-2和aEGFR的混合物相组合，各种不同肿瘤细胞的捕获效率被显著提高。具体来说，观察到UICHIPTM的高灵敏度(其主要归因于树枝状聚合物介导的多种抗体混合物的多价结合效应)能够捕获每mL 18.5至662个CTC范围内的CTC。在UICHIPTM-D上诱导细胞滚动，显著提高了CTC检测特异性(高达48.6％的纯度)。重要的是，在放射治疗前和结束之间CTC计数的变化的基础上，UICHIPTM-D显示CTC可用作治疗响应的预测性生物标志物。因此，CTC的UICHIPTM-D捕获可用于监测治疗效果和癌症进展，并允许进行分离到的CTC的捕获后分析。例如，可以在使用UICHIPTM-D分离的患者来源的CTC中评估与癌症发生相关的基因序列(例如KRAS和EGFR)，从而促进新的癌症生物标志物的发现并最终促进个性化的医学应用。
因此，本发明总的来说涉及检测癌症并与癌症疗法相结合预测癌症进展的测定法。在患者被怀疑处于癌症风险中的某些情况下，可以使用预防性治疗。在其他癌症对象中，诊断可以允许进行早期治疗性干预。在其他情形中，本文中描述的测定法的结果可以提供关于对重复治疗的需求的有用信息。最后，本发明可用于证实治疗功效，例如监测治疗和评估对于特定患者来说哪些疗法提供和不提供益处。
根据本发明的方法，在癌症疗法开始之前确定来自于对象的生物样品中CTC的数目，并与所述疗法期间或之后的一个或多个时间点来自于同一对象的类似生物样品中的CTC数目进行比较。在具体的实施方式中，所述方法还可以包括在CTC水平是否高的基础上治疗所述癌症。当所述对象从所述癌症疗法接受治疗益处时，癌症的成功治疗是明显的。这些益处包括与使用所述疗法的治疗前相比，治疗后所述生物样品中存在的CTC的数目减少。成功治疗的其他指示物可以包括所述对象的癌症的征兆或症状的频率或严重性降低，健康状况的改善和/或存活率提高。
术语“循环肿瘤细胞”或“CTC”打算意味着在从对象获得的样品中发现的任何循环的癌细胞。通常，CTC从实体肿瘤脱落。因此，CTC通常是从实体肿瘤脱落的上皮细胞，其以非常低的浓度存在于患有癌症的患者的循环中。CTC也可能是来自于肉瘤的间皮细胞或来自于黑素瘤的黑素细胞。
当在本文中使用时，术语“生物样品”是指包括CTC的任何样品。样品的来源包括全血、骨髓、胸膜液、腹膜液、中心脊髓液、转移肿瘤、新鲜的活检样品(例如新鲜的***活检样品)、尿液、唾液和支气管清洗液。具体来说，所述样品是血液样品，包括例如全血或其任何级分或组分。适用于本发明的血液样品可以从包含血细胞或其组分的任何已知的来源提取，例如静脉血、动脉血、外周血、组织、脐带血等。例如，样品可以使用公知且常规的临床方法(例如用于抽取和处理全血的程序)来获得并处理。在具体的实施方式中，样品可以是从患有癌症的对象抽取的外周血。
患有癌症的对象打算是指从其获取CTC(或含有CTC的样品)的任何个体或患者或本发明的主题方法实施到的任何个体或患者。一般来说所述对象是人类，尽管所述对象也可以是动物，包括哺乳动物例如啮齿动物(包括小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠)、猫、狗、兔、农畜包括奶牛、马、山羊、绵羊、猪等和灵长目动物(包括猴、黑猩猩、猩猩和大猩猩)。
在某些实施方式中，所述对象患有癌症、被怀疑患有癌症和处于患有癌症的风险中(例如基于家族史、易感性或暴露于致癌剂)。这样的癌症可以包括肺、乳腺、结肠、***、胰腺、食道的癌症，所有胃肠道肿瘤，泌尿生殖系肿瘤，肾癌，黑素瘤，内分泌肿瘤，肉瘤等。在具体的实施方式中，所述癌症是乳腺、宫颈、子宫内膜、***、肺、胰腺、肝、胃肠道、结肠直肠或头颈部的癌症。在具体的实施方式中，所述对象具有实体肿瘤。在一个实施方式中，所述癌症是头颈癌。在另一个实施方式中，所述癌症是肺癌(小细胞和非小细胞)。在其他实施方式中，所述癌症是直肠癌。在另一个实施方式中，所述癌症是食道癌。在又一个实施方式中，所述癌症是***。
可以使用本发明的方法监测的癌症疗法或治疗包括但不限于化学疗法、放射疗法、手术、基因疗法、免疫疗法、靶向疗法、激素疗法或其组合。在某些实施方式中，待监测的癌症疗法是放射疗法。在某些实施方式中，放射疗法与化学疗法相结合使用。
化学疗法。根据本发明，可以使用广泛的各种不同化学治疗剂。术语“化学疗法”是指使用药物治疗癌症。“化学治疗剂”被用于指称在癌症的治疗中给药的化合物或组合物。这些药剂或药物根据它们在细胞内的作用方式，例如它们是否并且在哪个阶段影响细胞周期，来分类。或者，药剂可以在其直接交联DNA、嵌入到DNA中或通过影响核酸合成来诱导染色体和有丝***畸变的能力的基础上来表征。化学治疗剂包括但不限于紫杉醇(紫杉酚)、多西他赛、吉西他滨、阿地白介素、阿仑单抗、阿利维A酸、别嘌呤醇、六甲蜜胺、氨磷汀、阿那曲唑、三氧化二砷、天冬酰胺酶、活卡介苗、蓓萨罗丁胶囊、蓓萨罗丁凝胶、博来霉素、静脉用白消安、口服白消安、卡普睾酮、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、卡莫司汀和聚苯丙生植入物、塞来昔布、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、环磷酰胺、阿糖胞苷、阿糖胞苷脂质体、达卡巴嗪、更生霉素、放线菌素D、阿法达贝泊汀、柔红霉素脂质体、柔红霉素、道诺霉素、地尼白介素、右雷佐生、多西他赛、多柔比星、多柔比星脂质体、屈他雄酮丙酸酯、Elliott's B溶液、表柔比星、阿法依泊汀雌莫司汀、磷酸依托泊苷、依托泊苷(VP-16)、依西美坦、非格司亭、氟尿苷(动脉内)、氟达拉滨、氟尿嘧啶(5-FU)、氟维司群、吉妥珠单抗奥佐米星、醋酸戈舍瑞林、羟基脲、替伊莫单抗、伊达比星、异环磷酰胺、甲磺酸伊马替尼、阿法干扰素-2a、阿法干扰素-2b、伊立替康、来曲唑、甲酰四氢叶酸、左旋咪唑、罗氮芥(CCNU)、二氯甲基二乙胺(氮芥)、醋酸甲地孕酮、美法仑(L-PAM)、巯基嘌呤(6-MP)、美司钠、氨甲喋呤、甲氧沙林、丝裂霉素C、米托坦、米托蒽醌、苯丙酸诺龙、诺非单抗(Nofetumomab)、LOddC、奥普瑞白介素、奥沙利铂、帕米膦酸盐、培加酶、培门冬酶、培非格司亭、喷司他丁、哌泊溴烷、普卡霉素、光神霉素、卟吩姆钠、甲基苄肼、奎纳克林、拉布立酶、利妥昔单抗、沙格司亭、链脲菌素、塔布维定(talbuvidine)(LDT)、滑石、他莫昔芬、替莫唑胺、替尼泊苷(VM-26)、睾内酯、硫鸟嘌呤(6-TG)、塞替派、拓扑替康、托瑞米芬、托西莫单抗、曲妥珠单抗、维甲酸(ATRA)、尿嘧啶氮芥、戊柔比星、伐托他滨(monoval LDC)、长春花碱、长春瑞滨、唑来膦酸盐及其任何混合物。
放射疗法。放射疗法也被称为放疗，是使用电离辐射对癌症和其他疾病的治疗。电离辐射沉积能量，通过损坏细胞的遗传物质损伤或破坏被治疗区域中的细胞，使这些细胞不能继续生长。尽管辐射损坏癌细胞和正常细胞两者，但后者能够自我修复并正常发挥作用。根据本发明使用的放射疗法可以包括但不限于使用γ-射线、X-射线和/或将放射性同位素直接递送到肿瘤细胞。也设想了其他形式的DNA损坏因子，例如微波和UV辐射。对于X-射线来说，剂量范围从用于长时间段(3至4周)的50至200伦琴的每日剂量到2000至6000伦琴的单次剂量。对于放射性同位素来说，剂量范围广泛变化，并取决于同位素的半衰期、发射出的辐射的强度和类型以及肿瘤细胞的摄取。还设想了放射疗法可以包括使用放射性标记的抗体将辐射剂量直接递送到癌症位点(放射免疫疗法)和/或包括使用放射增敏剂。
免疫疗法。在癌症治疗的情形中，免疫治疗剂通常依靠使用免疫效应细胞和分子来靶向并破坏癌细胞。曲妥珠单抗(HERCEPTINTM)是这样的一个实例。所述免疫效应物可以是例如特异性针对肿瘤细胞表面上的某些标志物的抗体。所述抗体单独地可以充当疗法的效应物，或者他可以募集其他细胞以实际上影响细胞杀死。所述抗体也可以偶联到药物或毒素(化学治疗剂、放射性核素、蓖麻毒蛋白A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)并仅仅充当靶向剂。或者，所述效应物可以是带有直接或间接地与肿瘤细胞靶相互作用的表面分子的淋巴细胞。各种不同的效应细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞。治疗方式的组合，即直接的细胞毒性活性与ErbB2的抑制或减少的组合，在ErbB2过表达的癌症的治疗中将提供治疗性益处。
目前正在研究或使用的免疫疗法的实例是免疫佐剂例如牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、二硝基氯苯和芳香族化合物(US 5,801,005和US 5,739,169)；细胞因子疗法，例如干扰素α、β和γ；IL-1、GM-CSF和TNF；基因疗法，例如TNF、IL-1、IL-2、p53(US 5,830,880和US 5,846,945)；以及单克隆抗体，例如抗神经节苷脂GM2抗体、抗HER-2抗体、抗p185抗体(US 5,824,311)。
手术。大约60％的患有癌症的人将经历某种类型的手术，其包括预防性、诊断性或分期性、治愈性和缓解性手术。治愈性手术是可以与其他疗法例如本发明的治疗、化学疗法、放射疗法、激素疗法、基因疗法、免疫疗法和/或替代疗法相结合使用的癌症治疗。
治愈性手术包括切除术，其中将所有或部分癌性组织物理去除、切除和/或破坏。肿瘤切除是指至少一部分肿瘤的物理去除。除了肿瘤切除之外，通过手术的治疗还包括激光手术、冷冻手术、电外科手术和显微镜控制的手术(Mohs'手术)。还设想了本发明可以与浅表癌症、癌前病变或附带量的正常组织的去除相结合使用。
在切除部分或所有癌性细胞、组织或肿瘤后，可能在身体中形成空腔。治疗可以通过用其他抗癌症疗法灌注、直接注射或局部施用到所述区域来完成。这种治疗可以例如每1、2、3、4、5、6或7天或每1、2、3、4和5周或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月重复。这些治疗也可能具有变化的剂量。
其他药剂。与化学疗法、放射疗法或生物疗法相结合使用的另一种形式的疗法包括热疗，其是将患者的组织暴露于高温(高达106℉)的程序。在局部、区域性或全身热疗的应用中，可能涉及外部或内部加热装置。局部热疗涉及将热施加到小的区域例如肿瘤。热量可以使用来自于身体外的装置的靶向肿瘤的高频波，在外部产生。内部加热可能涉及无菌探头，包括细的加热的金属丝或填充有温水的中空管、植入的微波天线或射频电极。
也可以使用激素疗法。激素的使用可用于治疗某些癌症例如乳腺、***、卵巢或***，以降低某些激素例如睾酮或***的水平或阻断它们的效应。这种治疗通常与至少一种其他癌症疗法相组合使用，以作为治疗选项或降低肿瘤转移的风险。
在本文中提出的方法中使用的治疗剂的量将是任何药学上有效的量，并取决于多种因素，包括所选治疗剂的特性和效价。本领域普通技术人员熟悉参与确定特定药剂的治疗有效剂量的因素。所述治疗剂可以使用一次或超过一次。在非限制性实例中，所述治疗剂每日一次、每日两次、每日三次、每日四次、每日六次、在醒着时每两小时一次、每四小时一次、隔天一次、每周一次使用等。治疗可以持续本领域普通技术人员所确定的任何时间长度。
本文中呈现的结果证实了CTC是癌症疗法的预测性生物标志物。更具体来说，将CTC动力学、即在癌症疗法治疗方案期间CTC数目的变化，用于评估对癌症疗法的完全或不完全响应。根据本发明的方法，在治疗之前和之后均确定CTC的数目，并且也可以任选地在治疗过程中确定CTC的数目，以评估所述癌症疗法方案例如时间安排和/或剂量的功效。通过将治疗前的CTC数目与治疗期间和/或之后的CTC数目进行比较，来评估CTC数目或CTC动力学的变化。在一个实施方式中，在治疗过程中CTC的一致性减少，预测了对所述疗法(例如使用或不使用化学疗法的放射疗法)的完全肿瘤响应。在另一个实施方式中，如果不论最终CTC计数如何，在治疗期间CTC数目增加，则所述CTC动力学/生物标志物预测了对所述疗法的不完全响应。
正如本文中演示的，生物模拟平台UICHIPTM为测量CTC提供了高度的灵敏度和特异性。事实上，不论癌症阶段、患者的医疗史或癌症类型如何，UICHIPTM-D都能捕获到平均值和中位数分别为每mL外周血222和101个CTC。这明显高于每mL健康志愿者捐献的血液7.5个CTC(UICHIPTM-S)和2.1个CTC(UICHIPTM-D)的截止值。因此，在本发明的方法中，CTC数目使用UICHIPTM装置来确定，其具有连接到基底的细胞滚动诱导剂和至少一种CTC特异性捕获剂。参见WO2010/124227和WO 2015/134972。具体来说，本发明的方法使用流式装置，其中所述装置包括至少一个仓室，所述仓室具有固定化的细胞滚动剂和至少一种固定化的CTC特异性捕获剂。在某些实施方式中，所述捕获剂是结合CTC表面上的组成部分的抗体、抗体片段、工程化改造的抗体、叶酸、转铁蛋白、肽和适体。在具体的实施方式中，所述流式装置包含与上皮细胞黏附分子(EpCAM)、人类表皮生长因子受体-2(HER-2)、表皮生长因子受体(EGFR)、癌胚抗原(CEA)、***特异性抗原(PSA)、CD24和叶酸结合受体(FAR)中的一者或多者结合的捕获剂。为了便于CTC捕获，通过共价连接到聚乙二醇的改性的聚酰胺-胺树枝状聚合物，将所述捕获剂通过连接到装置表面进行固定化。在其他实施方式中，所述细胞滚动诱导剂是选择素或选择素的CTC结合片段。更具体来说，所述选择素是E-选择素、P-选择素或L-选择素。有利的是，在本发明的方法中使用的流式装置通过选择素介导的细胞滚动、由聚酰胺-胺树枝状聚合物介导的多价结合效应引起的肿瘤细胞的强烈表面结合以及多种癌细胞特异性抗体例如aEpCAM、aHER-2和aEGFR的使用，提供流动细胞向表面的高效募集。此外，使用所述流式装置，可以实现每mL约2.1个细胞的检测阈值，并且CTC纯度约为49％，与此相比不含细胞滚动剂的装置通常为0.04％-10.7％。因此，本发明的方法也提供了每mL约2.0个细胞的检测阈值和至少约15％、20％、25％、30％、40％、45％或50％的CTC纯度水平。考虑到使用本发明的方法获得的检测阈值和高的纯度水平，可以容易地测量癌症疗法期间或之后CTC数目或CTC动力学的任何变化。
因此，本发明的方法还提供了在治疗后CTC数目的变化(即增加或减少)的基础上调整所述癌症疗法。具体来说，当所述癌症疗法是放射疗法时，在CTC的数目增加(即不完全响应)或减少(即完全响应)时可以分别通过提高或降低电离辐射的剂量来调整所述疗法。在其他实施方式中，将电离辐射剂量的低分割或超分割施用到所述肿瘤。在其他实施方式中，通过施用化学疗法、基因疗法、免疫疗法、靶向疗法、激素疗法、放射增敏剂或其组合，对所述放射疗法进行调整。
本发明的特殊特点是一种用于监测放射疗法的功效的方法，所述方法包括(a)在施用放射疗法的剂量之前确定来自于对象的生物样品中循环肿瘤细胞(CTC)的数目，并且(b)将在(a)中确定的CTC数目与在所述放射疗法期间或之后的一个或多个时间点从来自于同一对象的类似生物样品确定的CTC数目进行比较，其中所述CTC的数目使用具有至少一个仓室的流式装置来确定，所述仓室包含固定化的细胞滚动剂和一种或多种固定化的CTC特异性捕获剂。在一个实施方式中，所述方法还包括向所述对象施用增加的辐射剂量的步骤，其中所述辐射剂量与施用到对开始放射治疗做出响应在外周血中不具有升高水平的CTC的对象的剂量相比提高。根据这个实施方式，提高的辐射剂量可以以超分割或低分割方式施用。在另一个实施方式中，所述方法还包括向所述对象施用减少的辐射剂量的步骤，其中所述辐射剂量与施用到对开始放射治疗做出响应在外周血中具有升高水平的CTC的对象的剂量相比减少。在又一个实施方式中，所述方法还包括向所述对象施用与施用到在外周血中不具有升高水平的CTC的对象的剂量相近的辐射剂量，并与药学上有效量的化学疗法、基因疗法、免疫疗法、靶向疗法、激素疗法、放射增敏剂或其组合相结合。
提供了下述非限制性实例以进一步说明本发明。
实施例1：材料和方法
材料.抗人上皮细胞黏附分子(EpCAM)/TROP1抗体(aEpCAM)、抗人表皮生长因子受体-2(HER-2)/TROP1抗体(aHER-2)和重组人E-选择素(E-选择素)购自R&D systems(Minneapolis,MN)。抗人表皮生长因子受体(EGFR)抗体(aEGFR，N-20)从Santa CruzBiotech(Dallas,TX)获得。环氧树脂功能化的玻璃表面购自TeleChem International,Inc.(Sunnyvale,CA)。PAMAM树枝状聚合物(第7代)、牛血清白蛋白(BSA)和所有其他化学品，除非另有指明，否则都从Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)获得，并且除非另有指明，否则都没有经过进一步纯化而直接使用。
通过捕获剂的固定化进行表面功能化。表面功能化使用已建立的方法来进行(Myung等，(2014)Anal.Chem.86(12):6088-94；Myung等，(2011)AngewChem.Int.Ed.Engl.50(49):11769-72)。简单来说，首先给环氧树脂功能化的玻璃载片装上具有图案的聚二甲基硅氧烷(PDMS)垫圈，以限定用于不同试剂的固定化的区域。然后通过使用EDC/NHS化学，顺序固定化异双功能PEG(NH2-PEG-COOH)、第7代部分羧化的PAMAM树枝状聚合物和抗体(Myung等，(2011)Angew Chem.Int.Ed.Engl.50(49):11769-72)，对所述表面进行功能化。对于抗体偶联来说，所有aEpCAM、aHER-2、aEGFR的抗体溶液以5μg/mL的终浓度使用。每种试剂溶液的体积，对于UICHIPTM-S(即不使用E-选择素的装置)来说固定在250μL，对于UICHIPTM-D(即使用E-选择素的装置)来说固定在200μL。在UICHIPTM-D的情况下，将整个固定化有抗体的表面用0.4mL浓度为5μg/mL的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的E-选择素处理4小时。所有表面反应在室温和恒定的轻柔振摇下进行，并且在所有制备步骤之间，将表面用蒸馏过的去离子(DDI)水和PBS清洗三次，以除去残留的试剂。蛋白涂覆和未涂覆区域两者的潜在的非特异性结合，通过最终与1μg/mL的甲氧基PEG-NH2(Nektar Therapeutics,Huntsville,AL)溶液温育来阻断。将所述功能化的表面保持在4℃下，并且使用所述表面的实验在表面制备后一周内进行。
研究设计。这是在北卡罗来纳大学教堂山分校(UNC)Lineberger综合癌症中心(Lineberger Comprehensive Cancer Center at the University of North Carolina-Chapel Hill(UNC))进行的单机构前瞻性研究。患有组织学上证实的癌症的患者是合格的。需要放射学确认的II、III或IV期疾病，患者将开始用标准的放射疗法(RT)流程治疗，并使用或不使用化学疗法。所有患者提供对IRB批准的研究方案的书面正式知情同意书。收集年龄、种族、组织学亚型、吸烟状态、肿瘤转移位点、接受的RT、存活率和RT响应的数据。
血液样品。从健康献血者或癌症患者抽取约12mL全外周血。将血液收集在肝素处理的BD VACUTAINER管中以防止凝结，例外的是登记的第一位患者，其基线样本被收集在EDTA处理的BD VACUTAINER管中。血液样本从癌症患者抽取，保持在环境温度下，并在采血后24小时内分析。使用FICOLL-PAQUE Plus(Stemcell Technologies Inc.，Vancouver,Canada)，按照以前描述的出版物(Myung等，(2014)Anal.Chem.86(12):6088-94)，从全血分离血沉棕黄层中包括CTC的单核细胞。在用含有2％FBS的PBS清洗所述血沉棕黄层两次后，将回收的细胞悬浮在0.2mL完全DMEM培养基中并用于后续实验。
CTC捕获测定法。为了从血液样本捕获CTC，将UICHIPTM-S平台与血沉棕黄层中的单核细胞的悬液在温箱中温育。将回收的血沉棕黄层悬液分成两半：一半与650μL完全DMEM培养基混合用于UICHIPTM-S，另一半直接用于UICHIPTM-D。将表面与250μL所述细胞悬液温育2小时。
对于UICHIPTM-D来说，如以前所报道进行流动仓室实验(Myung等，(2010)Langmuir26:8589-96)。使用注射器泵(New Era pump Systems Inc.,Farmingdale,NY)将分离到的血沉棕黄层的悬液注入到流动仓室中。由两个通道(每个通道60mm(L)×10mm(W)×0.125mm(D))构成的流动仓室与用于注入血液样品管线相连。细胞的UICHIPTM-D捕获在25μL/min的流速下连续监测，所述流速对应于0.22dyn/cm2的剪切应力。然后以100μL/min的流速(0.88dyn/cm2)将表面用完全DMEM培养基清洗20分钟，并用PBS清洗15分钟。整个捕获过程使用OLYMPUS IX70倒置显微镜(Olympus America,Inc.,Center Valley,PA)、10×物镜和CCD相机(QImaging Retiga 1300B,Olympus America,Inc.)来监测。
为了在表面捕获的细胞中鉴定CTC，进行一系列免疫染色测定法。在用4％聚甲醛固定15分钟后，将所有捕获的细胞用0.2w/v％TRITON X-100(穿透性缓冲液)处理5-10分钟以提高抗体穿透。为了防止非特异性结合，在免疫染色之前将整个载片用2w/v％BSA溶液处理30分钟。然后将细胞用下述抗体顺序染色：(1)兔抗人角蛋白抗体(CK；1:50，abcam)，(2)ALEXAFLUOR 594偶联的针对抗CK抗体的第二抗体(1:100，Invitrogen)，(3)兔抗人CD45抗体(1:500，BD bioscience)和(4)ALEXAFLUOR 488偶联的针对抗CD45抗体的第二抗体(1:100，Invitrogen)。也使用包含DAPI的封固介质(VectaShield Laboratories,Inc.,Burlingame,CA)来染色单核细胞的核并在分析期间防止光致漂白。然后将载片用盖玻片和指甲油密封，并储存在4℃下。所述免疫染色的平台使用配备有电动载物台和20X物镜和CCD相机的ZEISS 701共聚焦显微镜进行扫描。在从独立的观察/测量获取的图像的基础上，使用ImageJ(NIH)计数表面上的CK+/CD45-/DAPI+CTC的数目。
统计分析.统计分析使用用于WINDOWS的SPSS 21.0版(IBM Corp.,Armonk,NY,USA)进行。对于所有患者来说，RT前和RT结束之间CTC绝对数目的差异使用Wilcoxon符号秩检验来计算。Friedman检验被用于确定通过所评估的三种不同CTC捕获平台(PEG-aEpCAM、PEG-ABmix和G7-ABmix)获得的CTC绝对水平的统计差异(数据示出在图1C中)。RT前与RT结束之间CTC绝对数目的差异通过Wilcoxon符号秩检验来比较(数据示出在图3B中)。所有统计检验以P<0.05(双尾)的显著性水平进行。
实施例2：表面制备和UICHIPTM制造
整合有G7PAMAM树枝状聚合物、E-选择素和抗体混合物的UICHIPTM使用以前描述的表面化学方法来制造(Myung等，(2011)Angew Chem.Int.Ed.Engl.50(49):11769-72)。简单来说，将部分羧化的G7PAMAM树枝状聚合物通过异双功能聚乙二醇(PEG，COOH-PEG-NH2)连接物，使用基于1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺/N-羟基硫代琥珀酰亚胺(EDC/NHS)的胺偶联化学方法(Myung等，(2011)Angew Chem.Int.Ed.Engl.50(49):11769-72)固定化在环氧树脂功能化的玻璃载片上。然后将aEpCAM、aHER-2和aEGFR的抗体混合物(ABmix)通过EDC/NHS偶联(Myung等，(2011)Angew Chem.Int.Ed.Engl.50(49):11769-72；Myung等，(2014)Anal.Chem.86(12):6088-94)，偶联到G7PAMAM树枝状聚合物的羧基端。由于这一步骤允许消耗所述树枝状聚合物表面上可用的大多数伯胺基团，因此它有助于最小化PAMAM树枝状聚合物的带正电荷的胺末端与带负电荷的细胞膜之间的非特异性静电相互作用。与不使用树枝状聚合物的表面相比，由于它们的树枝状纳米结构，固定化有PAMAM树枝状聚合物的表面能够固定更大量的抗体，并介导多价结合效应以显著增强肿瘤细胞结合。另外，将人重组E-选择素分子通过在E-选择素的胺基与玻璃载片上的环氧基之间形成共价键合进行固定化，以将流动细胞有效地募集到捕获表面。最后，为了最小化非特异性结合，将所述功能化的表面与甲氧基-PEG-NH2温育，以消耗表面上残留的环氧基团。所述表面使用X-射线光电子光谱和荧光显微术进行表征，以确认成功的表面功能化。
实施例3：患者的人口统计数据
具有组织学确认的原发癌并经历RT进行肿瘤管理的患者，被登记在本研究中。在6个月期间召集了总共21位患者，其患有直肠癌(n＝1)、***(n＝1)、***癌(n＝1)、口腔癌(n＝2)、鼻窦癌(n＝3)或口咽癌(n＝13)。患者的人口统计学和临床信息概述在表1中。在开始RT的一周内，通常在用于RT计划的CT模拟的当天或治疗前患者准备的当天，收集基线血液样本(RT前)。在RT期间，在多达3个时间点收集样本，包括RT的第一周期间(1W-RT)、整个RT的中途(RT中)和RT的最后一周期间(RT结束)。最终样本在比RT的最后一周晚至少4周(RT后)收集。
表1
21位被征召的患者中的总共19位(90％)具有至少一个收集的治疗中样本，用于基线测量(RT前)后的后续CTC分析，而17位患者(81％)在RT完成之前(RT结束)进行最终血液抽取。RT后样本从总共13位患者(62％)收集。
实施例4：使用树枝状聚合物和多种抗体提高CTC检测灵敏度
在用G7PAMAM树枝状聚合物功能化的表面上固定化有多种抗体的表面的CTC检测灵敏度，使用来自于这些癌症患者的临床血液样品进行测量。注意，利用G7树枝状聚合物和ABmix在静态条件下(无流动)检测CTC的装置被指示为UICHIPTM-S。进行针对细胞角蛋白(CK，上皮标志物)、CD45(白细胞标志物)和核(DAPI)的标准免疫染色，以在表面上捕获的细胞中鉴定CK+/CD45-/DAPI+CTC。如图1A中所示，UICHIPTM-S表面从所有患者捕获CTC，其中CTC计数在4至1,134个细胞/mL的范围内。然后将头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)患者中的CTC计数与使用CELLSEARCHTM获得的报道数目(等，(2014)Clin.Cancer Res.20:525-33；Bozec等，(2013)Eur.Arch.Otorhinolaryngol.270:2745-9；Grisanti等，(2014)PLoS ONE9(8):e103918；Nichols等，(2012)Head Neck 34:1440-4)进行比较，因为HNSCC患者是本研究中的主要癌症患者群体。注意，将所述结果中每mL的CTC数目乘以7.5，以与UICHIPTM-S所使用的血液体积匹配。图1B示出了与在7.5mL中仅仅检测到几个CTC的CELLSEARCHTM的报道结果相比，使用本发明的表面捕获的CTC数目明显更高(2,448±569.4个细胞/7.5mL血液，平均值±标准误差(SE))。通过使用具有下述物质的表面对CTC分别计数，也调查了各个组分对捕获效率的影响：(1)PEG-aEpCAM；(2)PEG-ABmix；和(3)G7-ABmix偶联物(UICHIPTM-S)。每种处理的逐对比较为每种表面组分对CTC捕获灵敏度的总体增强的贡献提供了见解：(1)和(2)这一对用于ABmix的效果；另一对(2)和(3)用于G7PAMAM树枝状聚合物的效果；第三对(1)和(3)用于ABmix和G7PAMAM树枝状聚合物的组合效果。如图1C中所示，这些比较的各自具有>1倍增强的结果，表明每种特定表面组分都具有正面贡献。通过三种比较(ABmix、G7树枝状聚合物及其组合)，表现出正面贡献(≥1倍增强)的样品的百分率分别为57.1％、81.0％和76.2％(图1C)。
实施例5：使用UICHIPTM-D增强CTC检测
在流动下，CTC检测特异性被E-选择素介导的细胞募集显著增强。整合有ABmix、G7树枝状聚合物和E-选择素的UICHIPTM(被称为UICHIPTM-D)在定制的流动仓室中从20位患者的血液样品成功捕获CTC，并且CTC数目在每mL 19至662个细胞的范围内变化(图2A)。由于在EDTA(Ca++螯合剂)存在下在UICHIPTM-D上使用E-选择素的Ca++-依赖性细胞滚动不发生这一事实，用于EDTA处理的患者样品的CTC计数被排除在使用UICHIPTM-D的分析之外。使用UICHIPTM-D获得的CTC计数与UICHIPTM-S的相近(R2＝0.9676，图2B)，这表明UICHIPTM的检测灵敏度不受细胞滚动的显著影响。使用来自于三位没有癌症史的健康参与者的血液样本，UICHIPTM-S和UICHIPTM-D的CTC计数分别为每mL 7.7±1.1和2.1±0.3个细胞，并被用于建立检测阈值(图2C)。尽管灵敏度没有显著提高，但与UICHIPTM-S相比，由UICHIPTM-D的E-选择素引起的细胞滚动显著提高了捕获纯度(图2D)。所述捕获纯度(特异性)通过包括白细胞和CTC的DAPI+细胞的总数中CK+/CD45-/DAPI+CTC计数的比率来计算。根据捕获的细胞中的CTC纯度，与UICHIPTM-S(通常为0.04％-10.7％)相比，UICHIPTM-D的特异性(高达48.6％)急剧提高，最多达到93.5倍。免疫染色后的荧光图像清楚地显示出E-选择素不存在(UICHIPTM-S)和存在(UICHIPTM-D)的情况之间的差异，即白细胞的非特异性捕获显著降低。
实施例6：UICHIPTM-D用于CTC检测的分析显著性
根据在RT前测量的来自于20位患者的血液样品中的CTC计数与在RT结束时测量的来自于16位患者的血液样品中的CTC计数，对所述用于CTC检测的表面进行进一步比较。在RT前，使用G7-ABmix表面的CTC计数分别与使用下述表面平台的CTC计数相比，存在显著增加：PEG-aEpCAM(p＝0.043)和PEG-ABmix(p<0.001)。当在RT结束时测量CTC水平时，不同表面制备之间的这种CTC计数差异仍保持(G7-ABmix相比于PEG-aEpCAM，p＝0.006；G7-ABmix相比于PEG-ABmix，p＝0.001)。然而，当在RT前(p＝0.906)和RT结束(p＝0.076)时比较PEG-aEpCAM和PEG-ABmix方法时，CTC计数不存在统计学显著的差异。通过所有三种方法获得的CTC绝对数目的比较，证实了G7-ABmix平台UICHIPTM-D与PEG-aEpCAM和PEG-ABmix表面相比明显更高的CTC捕获(p<0.001)。具有G7-ABmix和E-选择素的UICHIPTM-D在RT前捕获平均222个CTC/mL(范围为19-849)，在RT结束时捕获44个CTC/mL(范围为2-150)。当与PEG-aEpCAM和PEG-ABmix两种方法相比时明显更多的CTC被捕获，这两种方法分别在RT前仅仅收集到187个CTC/mL(范围为9-814)和161个CTC/mL(范围为16-511)，并且在RT结束收集仅仅32个CTC/mL(范围为2-201)和33个CTC/mL(范围为1-131)。
实施例7：使用UiChipTM-D的CTC计数的临床显著性
在整个群体中，使用UICHIPTM-D检查的所有20位患者(100％)在RT前在他们的血液中都具有可检测的CTC，平均值为每mL 222个CTC，中位数计数为每mL 101个CTC(范围为每mL 19至662个细胞)。它显著高于在来自于3位健康供体的样品中发现的1.0mL血液中2.1±0.3个(平均值±S.E.，图2C)个CTC(p＝0.0091)。重要的是，使用UICHIPTM-D测量的CTC计数显著高于在HNSCC患者中使用CELLSEARCHTM报道的CTC计数(139-6364个细胞/7.5mL血液)(等，(2014)Clin.Cancer Res.20:525-33；Bozec等，(2013)Eur.Arch.Otorhinolaryngol.270:2745-9；Grisanti等，(2014)PLoS ONE9(8):e103918；Nichols等，(2012)Head Neck 34:1440-4)，正如图3A中所示。有趣的是，从在RT过程中具有完整CTC测量值的17位患者，观察到在RT后CTC计数的统计学显著的减少。平均CTC计数从RT前的222个细胞/mL(范围为19至849个细胞/mL)减少到RT结束时的44个细胞/mL(范围为2至150个细胞/mL)(p＝0.001，图3B)。

Claims (20)

1.一种用于监测癌症疗法的功效的方法，所述方法包括：
(a)在癌症疗法之前确定来自于对象的生物样品中循环肿瘤细胞(CTC)的数目，并且
(b)将在(a)中确定的CTC数目与在所述癌症疗法期间或之后的一个或多个时间点从来自于同一对象的类似生物样品确定的CTC数目进行比较，其中所述CTC的数目使用具有至少一个仓室的流式装置来确定，所述仓室包含固定化的细胞滚动剂和一种或多种固定化的CTC特异性捕获剂。
2.权利要求1的方法，其中在使用所述癌症疗法的治疗期间或之后CTC数目的变化，指示了所述对象对所述癌症疗法的响应。
3.权利要求2的方法，其中所述变化是增加。
4.权利要求2的方法，其中所述变化是减少。
5.权利要求1的方法，其中所述细胞滚动剂是E-选择素。
6.权利要求1的方法，其中所述一种或多种固定化的CTC特异性捕获剂包括结合上皮细胞黏附分子(EpCAM)、表皮生长因子受体-2(HER-2)和表皮生长因子受体(EGFR)的抗体。
7.权利要求6的方法，其中所述一种或多种CTC特异性捕获剂通过共价连接到聚乙二醇的改性的聚酰胺-胺树枝状聚合物来固定化。
8.权利要求1的方法，其中所述生物样品是外周血。
9.权利要求1的方法，其中所述癌症疗法用于治疗实体肿瘤。
10.权利要求1的方法，其中所述癌症疗法用于治疗头颈癌、肺癌、直肠癌、食道癌或***。
11.权利要求1的方法，其中所述癌症疗法包括放射疗法。
12.权利要求11的方法，其还包括(c)如果在所述放射疗法期间或之后CTC的数目改变，则调整所述放射疗法。
13.权利要求12的方法，其中通过提高电离辐射剂量来调整所述放射疗法。
14.权利要求13的方法，其中通过降低电离辐射剂量来调整所述放射疗法。
15.权利要求13的方法，其中通过低分割来调整所述放射疗法。
16.权利要求13的方法，其中通过超分割来调整所述放射疗法。
17.权利要求13的方法，其中通过施用化学疗法、基因疗法、免疫疗法、靶向疗法、激素疗法、放射增敏剂或其组合来调整所述放射疗法。
18.权利要求1的方法，其中所述流式装置具有每mL约2.1个细胞的检测阈值。
19.权利要求1的方法，其中所述CTC的纯度约为49％。
20.一种用于监测放射疗法的功效的方法，所述方法包括：
(a)在施用放射疗法的剂量之前确定来自于对象的生物样品中循环肿瘤细胞(CTC)的数目，并且
(b)将在(a)中确定的CTC数目与在所述放射疗法期间或之后的一个或多个时间点从来自于同一对象的类似生物样品确定的CTC数目进行比较，其中所述CTC的数目使用具有至少一个仓室的流式装置来确定，所述仓室包含固定化的细胞滚动剂和一种或多种固定化的CTC特异性捕获剂。
CN201680027936.0A 2015-05-14 2016-05-12 使用循环肿瘤细胞作为生物标志物来监测癌症疗法的功效的方法 Pending CN107921277A (zh)

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