KR101878539B1

KR101878539B1 - 콩의 싸리수염진딧물 저항성 염기다형성 마커 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101878539B1
Application number: KR1020150142670A
Authority: KR
Inventors: 강성택; 이주석; 박수민; 이정동; 김경륜; 김성민; 김은실; 조미정
Original assignee: 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단
Priority date: 2015-10-13
Filing date: 2015-10-13
Publication date: 2018-07-16
Also published as: KR20170043692A

Abstract

본 발명은 염기다형성 마커를 포함하는, 콩의 싸리수염진딧물 저항성 형질 마커, 상기 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 싸리수염진딧물 저항성 콩 선별용 조성물 및 키트, 및 싸리수염진딧물 저항성 콩 선별 방법에 관한 것으로, 싸리수염진딧물 감염에 대해 저항성에 관여하는 게놈 상의 핵산 분자의 위치를 특정하는 표지인자를 제공할 수 있다. 아울러, 콩의 싸리수염진딧물 저항성 형질 마커를 검출할 수 있는 프로브 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 싸리수염진딧물 저항성 콩 선별용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 싸리수염진딧물 저항성 선별용 키트 및 싸리수염진딧물 저항성 콩 선별 방법을 제공할 수 있다.

Description

콩의 싸리수염진딧물 저항성 염기다형성 마커 및 이의 용도 {Nucleotide polymorphism markers for Foxglove aphid resistance in soybean and the use thereof}

본 발명은 염기다형성 마커를 포함하는, 콩의 싸리수염진딧물 저항성 형질 마커, 상기 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 싸리수염진딧물 저항성 콩 선별용 조성물 및 키트, 및 싸리수염진딧물 저항성 콩 선별 방법에 관한 것이다.

콩 (Glycine max (L.) Merr.)은 단백질 및 유(油) 자원, 가축 사료 및 생물 연료와 같은 용도로 세계적으로 널리 사용되는 주요 곡물 중 하나이다. 지난 20 년간 콩 생산량이 현저히 증가했음에도 불구하고, 유해 동물, 병원균 및 바이러스에 의해 실제 수확량의 약 19 % 정도의 손실이 있는 실정이며, 이러한 손실을 막기 위해 해충 저항성 콩의 개발이 필요하다.

상기 해충 저항성은 비선호성 (antixenosis) 및 항충성 (antibiosis)으로 나뉜다. 비선호성은 해충이 숙주 식물을 선호하지 않는, 곤충 행동에 대하여 숙주 식물이 가지는 효과를 의미하며, 이를 평가하기 위해 숙주 식물 사이에서 곤충의 이동 제한 없이 비선호성을 확인하는 선택 시험 (choice test)이 수행된다. 항충성은 식물이 곤충의 먹이가 되는 경우 곤충의 생명 활동, 생활 주기 및 개체 수에 부정적인 영향을 미치는 숙주 식물의 특성으로 정의된다. 항충성을 확인하기 위해서는 개별 식물을 곤충으로 감염시키는 비선택 시험 (no-choice test)이 수행된다.

한편, 반시목 해충인 콩 진딧물 (soybean aphid, Aphis glycines Matsumura)은 북아메리카에서 재배하는 콩에 대하여 연간 약 58 %의 수확량 손실, 그리고 약 24억 달러의 손실을 야기하는 경제적으로 상당히 중요한 해충이다. 콩 진딧물은 잎 아랫면에 서식하며, 콩의 잎에서 수액을 섭취하여 광합성의 손실을 가져오며, 콩 모자이크 바이러스 (soybean mosaic virus)를 전염시킨다.

현재까지 다섯 종의 콩 진딧물 저항성 유전자가 밝혀졌다. 구체적으로, 콩 진딧물 저항성 품종에서 7 번 염색체에 존재하는 단일 우성 유전자 (single dominant gene)인 Rag1이 발견되었다. 또 다른 단일 우성 유전자인 Rag2는 플랜트 인트로덕션 (plant introduction, PI) 식물주 200538의 13 번 염색체에서 54 kb 영역의 정밀지도가 작성되었다. 유사하게, 주요 비선호성 저항성 유전자인 Rag3는 PI 567543C의 16 번 염색체에 지도가 작성되었으며, Rag4는 PI 567541B의 13 번 염색체에 지도가 작성되었다. 주요 QTL인 Rag5는 PI 567301B의 13 번 염색체에서 지도가 작성되었다.

주요 반시목 해충 중 하나인 싸리수염진딧물 (Aulacorthum solani Kaltenbach)은 25 개의 과 (family)에서 95 종 (species)에 달하는 넓은 범위의 식물을 숙주로 하며, 유럽과 북아메리카, 그리고 최근에는 세계적으로 다양한 작물에 심각한 손상을 일으킨다 (Environ Entomol, 2010, 39: 1631-1642). 싸리수염진딧물은 콩에서 전 세계적으로 상당한 양의 수확 손실을 일으키는데, 예를 들어 일본에서는 90 %까지 수확량을 감소시킨다 (Annu Rep Soc Plant Prot N Jpn, 2001, 52: 175-177). 그러나, 싸리수염진딧물은 그 경제적 중요성에도 불구하고, 콩 진딧물에 비해 생물학, 환경학, 그리고 효과적으로 제어하는 방법 측면에서 거의 연구되지 않았다.

이에, 본 발명자들은 PI 366121에서 싸리수염진딧물 저항성을 조절하는 QTL의 위치를 찾고, 상기 유전자와 밀접하게 연관된 단일염기다형성 (single nucleotide polymorphism, SNP) 마커를 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 야생 콩 (Glycine soja)인 PI 366121이 싸리수염진딧물 저항성을 가지는 것을 발견하고 콩의 싸리수염진딧물 저항성 형질 마커를 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 콩의 7 번 염색체의 5,497,330 번째 염기 내지 5,733,055 번째 염기 범위에 존재하는 염기다형성 마커를 포함하는, 콩의 싸리수염진딧물 저항성 형질 마커를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 마커를 검출할 수 있는 프로브 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 싸리수염진딧물 저항성 콩 선별용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 조성물을 포함하는 싸리수염진딧물 저항성 콩 선별용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 (a) 콩으로부터 DNA를 수득하는 단계; (b) 상기 (a) 단계로부터 수득한 DNA로부터 제1항의 염기다형성 마커의 다형성 부위를 프로브와 혼성화하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 혼성화된 다형성 부위의 염기를 확인하는 단계를 포함하는, 싸리수염진딧물 저항성 콩 선별 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 콩의 7 번 염색체의 5,497,330 번째 염기 내지 5,733,055 번째 염기 범위에 존재하는 염기다형성 마커를 포함하는, 콩의 싸리수염진딧물 저항성 형질 마커를 제공한다.

본 발명에서 용어, "다형성 (polymorphism)"이란 하나의 유전자 좌위 (locus)에 두 가지 이상의 대립유전자 (allele)가 존재하는 경우를 말하며, 다형성 마커는 선택된 집단에서 1 % 이상, 특히 10 % 또는 20 % 이상의 발생빈도를 나타내는 두 가지 이상의 대립유전자를 가질 수 있다. 본 발명에서, 다형성 마커는 마이크로새틀라이트, 단일 염기다형성 또는 다른 종류의 다형성 마커일 수 있으며, 특히 본 발명에서는 상기 염기다형성 마커는 단일 염기다형성마커인 것인 콩의 싸리수염진딧물 저항성 형질 마커일 수 있다. 개체에 따라 단일 염기만이 다른 것을 단일 염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)이라 한다.

상기 대립유전자(allele)는 상동염색체의 동일한 유전자좌위에 존재하는 한 유전자의 여러 타입을 말한다. 대립유전자는 다형성을 나타내는데 사용되기도 하며, 예컨대, SNP는 두 종류의 대립인자 (biallele)를 갖는다.

본 발명에서 용어 “싸리수염진딧물 (foxglove aphid)”은 매미목 진딧물과의 해충으로 Aulacorthum solani로도 명명되며, 콩을 포함하는 약 95 종 이상의 식물을 숙주로 하여 작물에 심각한 피해를 입힌다.

본 발명에서 용어 “싸리수염진딧물 저항성”은 콩에 싸리수염진딧물을 감염시켰을 때, 콩이 싸리수염진딧물에 의해 손상을 입거나 성장이 저해되지 않는 표현형질을 말하며, “싸리수염진딧물 민감성”은 콩에 싸리수염진딧물을 감염시켰을 때, 콩이 싸리수염진딧물에 의해 손상을 입거나 성장이 저해되는 표현형질을 말한다.

본 발명에서 용어, “싸리수염진딧물 저항성 형질 마커”는 콩의 7 번 염색체의 5,497,330 번째 염기 내지 5,733,055 번째 염기 범위에 존재하는 단일 염기 다형성 마커일 수 있으며, 특히 5,497,330 번째 염기, 5,501,827 번째 염기, 5,511,541 번째 염기, 5,511,626 번째 염기, 5,526,770 번째 염기, 5,526,975 번째 염기, 5,546,038 번째 염기, 5,554,122 번째 염기, 5,651,095 번째 염기, 5,733,055 번째 염기 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 단일염기다형성 마커일 수 있다.

또한, 상기 단일염기다형성 마커는 하기 표에 표시된 SNP 마커들 중에서 선택된 1 종 이상인 것일 수 있다.

구체적으로, 상기 단일염기다형성 마커는 서열번호 1 내지 10으로 구성된 군에서 선택된 1 이상의 염기서열 중, 50 번째 염기를 SNP로서 포함하고 5 내지 50 개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것으로서, (i) 상기 서열번호 1의 50 번째 염기는 G 또는 A이고, (ii) 상기 서열번호 2의 50 번째 염기는 A 또는 C이고, (iii) 상기 서열번호 3의 50 번째 염기는 G 또는 A이고, (iv) 상기 서열번호 4의 50 번째 염기는 G 또는 T이고, (v) 상기 서열번호 5의 50 번째 염기는 G 또는 A이고, (vi) 상기 서열번호 6의 50 번째 염기는 A 또는 C이고, (vii) 상기 서열번호 7의 50 번째 염기는 T 또는 C이고, (viii) 상기 서열번호 8의 50 번째 염기는 T 또는 C이고, (ix) 상기 서열번호 9의 50 번째 염기는 C 또는 T이고, 및 (x) 상기 서열번호 10의 50 번째 염기는 G 또는 A인 것일 수 있다. 더 구체적으로, (i) 상기 서열번호 1의 50 번째 염기가 G, (ii) 상기 서열번호 2의 50 번째 염기가 A, (iii) 상기 서열번호 3의 50 번째 염기가 G, (iv) 상기 서열번호 4의 50 번째 염기가 G, (v) 상기 서열번호 5의 50 번째 염기가 G, (vi) 상기 서열번호 6의 50 번째 염기가 A, (vii) 상기 서열번호 7의 50 번째 염기가 T, (viii) 상기 서열번호 8의 50 번째 염기가 T, (ix) 상기 서열번호 9의 50 번째 염기가 C, 또는 (x) 상기 서열번호 10의 50 번째 염기가 G인 경우에는 싸리수염진딧물 저항성을 나타내는 마커로 판단할 수 있고, (i) 상기 서열번호 1의 50 번째 염기가 A, (ii) 상기 서열번호 2의 50 번째 염기가 C, (iii) 상기 서열번호 3의 50 번째 염기가 A, (iv) 상기 서열번호 4의 50 번째 염기가 T, (v) 상기 서열번호 5의 50 번째 염기가 A, (vi) 상기 서열번호 6의 50 번째 염기가 C, (vii) 상기 서열번호 7의 50 번째 염기가 C, (viii) 상기 서열번호 8의 50 번째 염기가 C, (ix) 상기 서열번호 9의 50 번째 염기가 T, 또는 (x) 상기 서열번호 10의 50 번째 염기가 A인 경우에는 싸리수염진딧물 민감성을 나타내는 마커로 판단할 수 있어, 이를 통해 싸리수염진딧물 저항성 콩을 선별할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, RIL (recombinant inbred line) 집단에서 조사된 표현형과 유전형 분석 결과를 이용하여 Inclusive Composite Interval Mapping을 통해 7 번 염색체의 5,497,330 bp와 5,733,055 bp 지역의 근접 마커 사이 영역이 싸리수염진딧물에 의한 콩의 저항성 정도에 높은 LOD (Logarithm of odds) 값을 가지는 것을 확인하였다.

본 발명에서 용어 “Inclusive composite interval mapping (ICIM)”은 양친교배를 통해 얻은 개체군에 대한 양적형질 유전자좌 지도 작성을 위한 접근법을 의미한다.

본 발명에서 용어 “양적형질 유전자좌”는 유전적으로 분명한 RIL 집단에서 양적으로 다양한 표현형을 나타내는 유전자 지도상의 위치를 의미하는 것으로, 분자 표지인자를 이용하고 측정이 가능한 형질에 관여하는 염색체의 특정부분을 확인함으로써 특정 환경에서 수량성, 과실 무게, 출수기 등 주요 형질에 관여하는 유전자의 수 및 염색체의 위치, 개개 유전자의 영향력 상위작용, 양적형질 유전자좌와 환경과의 상호작용, 그리고 양적형질 유전자좌와 유전적인 배경과의 상호작용 등 주요 농업형질의 유전적 배경에 대한 전반적이고 직접적인 정보를 얻을 수 있다.

본 발명에서 용어, “RIL (Recombinant Inbred Line)”이란 양적형질 유전자좌에 대한 지도를 제작하기 위해 사용되는 식물의 집단으로서, 동종 교배를 통해 동질성을 가지는 재조합체를 만들고 상기의 재조합체는 형질 지도 제작 및 분석을 위한 자료로 사용된다.

본 발명에서 용어, “유전자 지도”는 유전자 연관지도라 하며, 유전자의 상대적인 위치를 나타내는 유전지도로서, DNA 마커들 (유전자와 다른 식별 가능한 DNA 서열/SNP, SSR)의 유전적 성질 패턴에 따라 그들의 상대적인 염색체 위치를 나타낸다. 지도에서 마커 간 거리는 그들이 얼마나 자주 함께 유전되는지에 대한 빈도를 나타낸다. 유전적 연관 지도는 가계 트리 내에서 두 개의 마커가 얼마나 빈번하게 같이 유전되는지를 관찰함으로써 구축된다. 상기 연관지도는 임의로 육성된 어떤 실험집단에서 양친 사이에 다형성을 보이는 표지를 상호간의 재조합 값 (recombination value)을 거리로 환산하고 이들의 순서를 정하여 표지 간의 연관군 (Linkage group)을 만드는 맵핑 작업을 통해 완성된다.

본 발명에서 용어, “LOD (Logarithm of odds)”는 특정 표현형질과 대립형질 간의 관련 정도를 나타내는 지표이며 로그 수치로 표현될 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 콩의 싸리수염진딧물 저항성 형질 마커를 검출할 수 있는 프로브 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 싸리수염진딧물 저항성 콩 선별용 조성물을 제공한다.

싸리수염진딧물 저항성 형질 마커 및 싸리수염진딧물 저항성 콩 선별에 대하여는 상기 설명한 바와 같다.

본 발명에서 용어, “콩의 싸리수염진딧물 저항성 형질 마커를 검출할 수 있는 프로브”는 상기와 같은 콩의 싸리수염진딧물 저항성 형질 마커 부위와 특이적으로 혼성화 반응을 통해 확인하여 싸리수염진딧물 저항성 콩을 선별할 수 있는 조성물을 의미하며, 이와 같은 유전자 분석의 구체적 방법은 특별한 제한이 없으며, 이 발명이 속하는 기술분야에 알려진 모든 유전자 검출 방법에 의하는 것일 수 있다.

본 발명에서 용어, "콩의 싸리수염진딧물 저항성 형질 마커를 증폭할 수 있는 제제"란 상기와 같은 콩의 싸리수염진딧물 저항성 형질 마커 부위를 증폭을 통해 확인하여 싸리수염진딧물 저항성 콩을 선별할 수 있는 조성물을 의미하며, 바람직하게는 상기 콩의 싸리수염진딧물 저항성 형질 마커의 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머를 의미한다.

상기 다형성 마커 증폭에 사용되는 프라이머는, 적절한 버퍼 중의 적절한 조건 (예를 들면, 4 개의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니나 통상 15 내지 30 뉴클레오티드일 수 있다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화 할 정도로 충분히 상보적이어야 한다.

본 발명에서 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기 (free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기 서열로 상보적인 템플레이트 (template)와 염기쌍 (base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약 (즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소) 및 상이한 4 가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부를 통해 피부 타입을 예측할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

본 발명의 프로브 또는 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 1 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체 (예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체 (예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 싸리수염진딧물 저항성 콩 선별용 조성물을 포함하는 싸리수염진딧물 저항성 콩 선별용 키트를 제공한다.

싸리수염진딧물 저항성 콩 선별용 조성물은 상기 설명한 바와 같다.

상기 키트는 RT-PCR 키트 DNA 칩 키트, SNP 칩 키트 또는 마이크로어레이 칩 키트일 수 있다.

본 발명의 키트는 싸리수염진딧물 저항성 콩 선별용 마커인 SNP 다형성 마커를 증폭을 통해 확인하거나, SNP 다형성 마커의 발현 수준을 mRNA의 발현 수준을 확인함으로써 콩의 싸리수염진딧물 저항성 형질을 선별할 수 있다. 구체적인 일례로서, 본 발명에서 싸리수염진딧물 저항성 콩 선별용 마커의 mRNA 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는, 싸리수염진딧물 저항성 콩 선별용 마커의 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액 (pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드 (dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수 (DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다. 또한 바람직하게는, 본 발명의 키트는 DNA 칩 또는 SNP 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 싸리수염진딧물 저항성 콩 선별용 키트일 수 있다.

DNA 칩 또는 SNP 칩 키트는, 일반적으로 편평한 고체 지지판, 전형적으로는 현미경용 슬라이드보다 크지 않은 유리 표면에 핵산 종을 격자형 배열 (gridded array)로 부착한 것으로, 칩 표면에 핵산이 일정하게 배열되어, DNA 칩 또는 SNP 칩 상의 핵산과 칩 표면에 처리된 용액 내에 포함된 상보적인 핵산 간에 다중 혼성화 (hybridization) 반응이 일어나 대량 병렬 분석이 가능하도록 하는 도구이다.

상기 마이크로어레이는 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다. 상기 마이크로어레이는 프로브 폴리뉴클레오티드에 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로어레이로 이루어진다.

프로브 폴리뉴클레오티드를 기판상에 고정화하여 마이크로어레이를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 프로브 폴리뉴클레오티드는 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 의미하는 것으로, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 본 발명의 프로브는 대립유전자 특이적 프로브로서, 같은 종의 두 개체로부터 유래한 핵산 단편 중에 다형성 부위가 존재하여, 한 개체로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화하나, 다른 개체로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다. 이 경우 혼성화 조건은 대립유전자간의 혼성화 강도에 있어서 유의한 차이를 보여, 대립유전자 중 하나에만 혼성화 하도록 충분히 엄격해야 한다. 이렇게 함으로써 다른 대립유전자 형태 간에 좋은 혼성화 차이를 유발할 수 있다.

본 발명의 상기 프로브는 대립유전자를 검출하여 싸리수염진딧물 저항성 콩 선발에 사용될 수 있다. 상기 진단 방법에는 서던 블롯 등과 같은 핵산의 혼성화에 근거한 검출방법들이 포함되며, DNA 칩을 이용한 방법에서 DNA 칩의 기판에 미리 결합된 형태로 제공될 수도 있다. 상기 혼성화란 엄격한 조건, 예를 들면 1 M 이하의 염 농도 및 25 ℃ 이상의 온도하에서 보통 수행될 수 있다.

예를 들면, 5 x SSPE (750 mM NaCl, 50 mM Na Phosphate, 5 mM EDTA, pH 7.4) 및 25 내지 30 ℃의 조건이 대립유전자 특이적 프로브 혼성화에 적합할 수 있다.

본 발명의 싸리수염저항성 콩 선별과 연관된 프로브 폴리뉴클레오티드의 기판상에 고정화하는 과정도 또한 이러한 종래 기술을 사용하여 용이하게 제조할 수 있다. 또한, 마이크로어레이 상에서의 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 검출은 예를 들면, 핵산 시료를 형광 물질, 예를 들면 Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출 가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질로 표지한 다음, 마이크로어레이 상에 혼성화하고 상기 표지 물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 콩으로부터 DNA를 수득하는 단계; (b) 상기 (a) 단계로부터 수득한 DNA로부터 상기 염기다형성 마커의 다형성 부위를 프로브와 혼성화하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 혼성화된 다형성 부위의 염기를 확인하는 단계를 포함하는, 싸리수염진딧물 저항성 콩 선별 방법을 제공한다.

콩의 싸리수염진딧물 저항성 형질 마커 및 싸리수염진딧물 저항성 콩 선별에 대하여는 상기 설명한 바와 같다.

상기 (a) 단계의 DNA 수득 방법은 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용 가능하다. 특히 CTAB (cetyltrimethylammonium bromide)로 핵산과 결합하여 복합체 형성을 통해서 유전체 (genomic) DNA를 추출하는 방법을 사용할 수 있다.

상기 (b) 단계의 (a) 단계에서 수득한 DNA로부터 상기 단일염기다형성 마커의 다형성 부위를 프로브와 혼성화하는 단계는 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용 가능하다.

상기 방법 중 (c) 단계의 다형성 부위의 염기를 결정하는 것은 시퀀싱 분석, 마이크로어레이에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR (allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법 (dynamic allele-specific hybridization, DASH), PCR 연장 분석, SSCP, PCR-RFLP 분석 또는 TaqMan 기법, SNPlex 플랫폼 (Applied Biosystems), 질량 분석법 (예를 들면, Sequenom의 MassARRY 시스템), 미니-시퀀싱 (mini-sequencing) 방법, Bio-Plex 시스템 (BioRad), CEQ and SNPstream 시스템 (Beckman), Molecular Inversion Probe 어레이 기술 (예를 들면, Affymetrix GeneChip), 및 BeadArray Technologies (예를 들면, Illumina GoldenGate 및 Infinium 분석법)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 방법들 또는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 이용 가능한 다른 방법에 의해, 마이크로새틀라이트, SNP 또는 다른 종류의 다형성 마커를 포함한, 다형성 마커에서의 하나 이상의 대립유전자가 확인될 수 있다. 이와 같은 다형성 부위의 염기를 결정하는 것은 바람직하게는 SNP 칩을 통해 수행할 수 있다.

상기 SNP 칩은 수 십만 개의 SNP의 각 염기를 한번에 확인할 수 있는 DNA 마이크로어레이의 하나를 의미한다.

TaqMan 방법은 (1) 원하는 DNA 단편을 증폭할 수 있도록 프라이머 및 TaqMan 탐침을 설계 및 제작하는 단계; (2) 서로 다른 대립유전자의 탐침을 FAM 염료 및 VIC 염료로 표지 (Applied Biosystems)하는 단계; (3) 상기 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 및 탐침을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; (4) 상기의 PCR 반응이 완성된 후, TaqMan 분석 플레이트를 핵산 분석기로 분석 및 확인하는 단계; 및 (5) 상기 분석결과로부터 단계 (1)의 폴리뉴클레오티들의 유전자형을 결정하는 단계를 포함한다.

상기에서, 시퀀싱 분석은 염기서열 결정을 위한 통상적인 방법을 사용할 수 있으며, 자동화된 유전자분석기를 이용하여 수행될 수 있다. 또한, 대립유전자 특이적 PCR은 SNP가 위치하는 염기를 3' 말단으로 하여 고안한 프라이머를 포함한 프라이머 세트로 상기 SNP가 위치하는 DNA 단편을 증폭하는 PCR 방법을 의미한다. 상기 방법의 원리는, 예를 들어, 특정 염기가 A에서 G로 치환된 경우, 상기 A를 3' 말단염기로 포함하는 프라이머 및 적당한 크기의 DNA 단편을 증폭할 수 있는 반대 방향 프라이머를 고안하여 PCR 반응을 수행할 경우, 상기 SNP 위치의 염기가 A인 경우에는 증폭반응이 정상적으로 수행되어 원하는 위치의 밴드가 관찰되고, 상기 염기가 G로 치환된 경우에는 프라이머는 주형 DNA에 상보결합할수 있으나, 3' 말단 쪽이 상보결합을 하지 못함으로써 증폭반응이 제대로 수행되지 않는 점을 이용한 것이다. DASH는 통상적인 방법으로 수행될 수 있고, 바람직하게는 프린스 등에 의한 방법에 의하여 수행될 수 있다.

한편, PCR 연장 분석은 먼저 단일 염기다형성이 위치하는 염기를 포함하는 DNA 단편을 프라이머 쌍으로 증폭을 한 다음, 반응에 첨가된 모든 뉴클레오티드를 탈인산화시킴으로써 불활성화시키고, 여기에 SNP 특이적 연장 프라이머, dNTP 혼합물, 디디옥시뉴클레오티드, 반응 완충액 및 DNA 중합효소를 첨가하여 프라이머 연장반응을 수행함으로써 이루어진다. 이때, 연장 프라이머는 SNP가 위치하는 염기의 5' 방향의 바로 인접한 염기를 3' 말단으로 삼으며, dNTP 혼합물에는 디디옥시뉴클레오티드와 동일한 염기를 갖는 핵산이 제외되고, 상기 디디옥시뉴클레오티드는 SNP를 나타내는 염기 종류 중 하나에서 선택된다. 예를 들어, A에서 G로의 치환이 있는 경우, dGTP, dCTP 및 dTTP 혼합물과 ddATP를 반응에 첨가할 경우, 상기 치환이 일어난 염기에서 프라이머는 DNA 중합효소에 의하여 연장되고, 몇 염기가 지난 후 A 염기가 최초로 나타나는 위치에서 ddATP에 의하여 프라이머 연장반응이 종결된다. 만일 상기 치환이 일어나지 않았다면, 그 위치에서 연장반응이 종결되므로, 상기 연장된 프라이머의 길이를 비교함으로써 SNP를 나타내는 염기 종류를 판별할 수 있게 된다.

이때, 검출방법으로는 연장 프라이머 또는 디디옥시뉴클레오티드를 형광 표지한 경우에는 일반적인 염기서열 결정에 사용되는 유전자 분석기(예를 들어, ABI사의 Model 3700 등)를 사용하여 형광을 검출함으로써 상기 SNP을 검출할 수 있으며, 무-표지된 연장 프라이머 및 디디옥시뉴클레오티드를 사용할 경우에는 MALDI-TOF(matrix assisted laser desorption ionization-time of flight) 기법을 이용하여 분자량을 측정함으로써 상기 SNP를 검출할 수 있다.

본 발명은 싸리수염진딧물 감염에 대해 저항성을 나타내는 콩 유래 싸리수염진딧물 저항성 형질 마커에 관한 것으로, 싸리수염진딧물 감염에 대해 저항성에 관여하는 게놈 상의 핵산 분자의 위치를 특정하는 표지인자를 제공할 수 있다. 아울러, 콩의 싸리수염진딧물 저항성 형질 마커를 검출할 수 있는 프로브 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 싸리수염진딧물 저항성 콩 선별용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 싸리수염진딧물 저항성 선별용 키트 및 싸리수염진딧물 저항성 콩 선별 방법을 제공할 수 있다.

도 1은 손상된 잎 및 손상 등급을 나타낸 것이다. 싸리수염진딧물이 감염된 후 14 일에 잎 색이 변화하였다. 잎에서 색이 변화한 면적에 따라 손상 등급을 1 내지 9로 평가하였다.
도 2는 군집 내에서 표현형 빈도 분포를 나타낸 것이다. 선택 시험 (상단) 및 비선택 시험 (하단)에서 PLD (primary infestation leaf damage) 및 TPD (total plant damage)의 분포를 나타내었다. 여기서 GR1은 손상 없음, GR9은 심각한 손상을 의미한다. 양친 계열인 Williams 82 (흰 화살표) 및 PI 366121 (검은 화살표)의 위치를 표시하였다.
도 3은 선택 시험 및 비선택 시험에서 PLD 및 TPD에 따른 QTL에 대한 ICIM (inclusive composite interval mapping)을 나타낸 것이다. Raso2는 선택 시험 및 비선택 시험 모두에서 PLD 및 TPD 값으로부터 높은 LOD 값으로 나타난 BARC-042815-08424 및 BARC-015945-02020 사이 영역에 지도가 작성되었다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1: 식물 재료

싸리수염진딧물 민감성 품종 'Williams 82' 및 싸리수염진딧물 저항성 품종 PI 366121을 단주계통법 (single seed descent method)을 이용하여 F4까지 교배시켜 141 개체의 F4:8 재조합 근교계 (recombinant inbred lines, RILs) 군집을 수립하였다. 상기 RIL 및 두 양친 계통 (parental line)을 본 발명에서 사용하였다. PI 366121은 일본 후쿠시마산으로 강남콩꼬투리얼룩바이러스 (bean pod mottle virus) 감염에 높은 민감성을 가지고 있다. Williams 82는 싸리수염진딧물에 민감성을 가진 것으로 알려져 있고, 최근 전체 유전체 서열이 공개되었다.

실시예 2: 싸리수염진딧물

싸리수염진딧물은 2008년에 한국 수원에서 채집하였다. 국립식량과학원의 식량환경조사부에서 콩 (var. Sowon)을 이용하여 계속 사육하였으며, 하루에 15 시간 빛을 주는 조건으로 23 내지 25 ℃로 유지되는 성장 챔버 내에 분리된 곤충 케이지에서 키웠다.

실시예 3: 싸리수염진딧물 저항성 평가

선택 시험 및 비선택 시험은 모두 하루에 15 시간 빛을 주고 60 - 80 % 상대 습도 조건에서 23 내지 25 ℃로 유지되는 성장 챔버 내에서 세 번씩 반복하여 수행되었다. 선택 시험을 위해, 10 x 5 트레이 (550 L x 270 W x 120 H mm)에서 컬럼 중앙에는 Sowon을, 나머지는 RIL을 심었다. 비선택 시험을 위해, 동일한 트레이에서 컬럼 중앙은 비운 채로 RIL을 심었으며, RIL 간에 진딧물의 이동을 막기 위해 120-메쉬 케이지로 덮었다. 대조군으로 저항성 정도 및 감염 손상을 평가하기 위해 모든 트레이에는 양친계인 Williams82 및 PI 366121을 포함시켰다. 콩이 V1 단계에 도달했을 때, 4 마리의 싸리수염진딧물을 페인트 붓을 이용하여 각 개체의 잎 윗면에 올려두었다. 싸리수염진딧물 감염 후 14 일에 (DAI-14), 1 내지 9의 점수로 등급을 나누어 총 식물 손상 (total plant damage, TPD) 및 일차 감염 잎 손상 (primary infestation leaf damage, PLD)을 평가하였다. 여기서 1은 손상 없음, 9는 심각한 손상을 의미한다 (도 1). 콩 진딧물 연구에서, 식물 당 진딧물 수는 식물 손상 등급 지표로 사용되어 왔다. 그러나, 싸리수염진딧물에서는, 진딧물 수와 총 식물 손상 등급에 큰 상관관계는 없다고 보고된바 있다. 따라서, 심화 분석을 위해 TPD 및 PLD를 사용하였다.

한편, 비선택 시험을 수행하기 위해, 작은 메쉬 케이지를 사용하였다. 상기 조건은 식물 성장을 제한하므로, 감염 후 14 일에는 비선택성 시험의 식물 점수를 매길 수 없었다. 그러나, DAI-7에 저항성 정도 평가로 비선택 시험에서 싸리수염진딧물에 대한 민감성 및 저항성을 구별할 수 있었다.

실시예 4: DNA 추출 및 GoldenGate 분석

각각의 식물의 비확장된 어린 삼출옆 (trifoliate leaves)을 회수하여 유전체 DNA를 분리하였다. 유전체 DNA는 변형된 CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide) 방법을 사용하여 추출하였다. 유전자 지도를 작성하기 위해, 20 개의 콩 염색체에 잘 분포되어 있는 1,536 SNP 자리를 포함하는 GoldenGate 분석을 이용하여 141 개체의 RIL 및 두 양친 계통을 조사하였고, 504 개의 SNP 마커를 발견하였다. 상기 선택된 504 개의 SNP 마커는 각 염색체 당 약 25 개의 마커로 전체 콩 유전체에 고르게 분포되어 있었다.

실시예 5: 유전자 연관 지도 작성 및 QTL 확인

제조사의 지침에 따라 파라미터를 조절한 QTL IciMapping (version 4.0)을 이용하여 연관 지도를 작성하였다; 파라미터는 LOD 한계치 (logarithm of odds threshold)를 3.0으로 하여 그룹화하고, tour construction을 위해 가장 가까운 이웃 (neighbor)을 사용하는 nnTwoOpt 알고리즘을 사용하였으며, tour improvement를 위해 two-opt를 사용하였고, 인접한 재조합 분획의 합으로 리플링 (rippling)하였다. ICIM (inclusive composite interval mapping) 방법을 이용하여 QTL을 확인하였으며, 파라미터는 다음과 같다: 1.0 cM step 및 3.0 LOD 한계치.

실시예 6: 180K AXIOM SoyaSNP 분석을 통한 SNP 확인

최근, Affymetrix 플랫폼으로 180K AXIOM SoyaSNP 분석이 개발되어 고해상도의 유전형질 분석이 가능해졌다. 상기 분석 방법은 180 K 이상의 SNP에 점수를 부여할 수 있으며, 콩 유전체에서 6.5 kb 당 대략 하나의 SNP를 제공한다. 상기 SNP 유전형질 분석은 더욱 정교한 QTL의 위치를 제공하는 고밀도 유전자 지도 작성의 개발을 촉진할 수 있고, 식물 육종에 있어서 마커를 통한 선별이 가능하도록 특정 형질에 대해 매우 연관성이 높은 SNP 개발을 가능하게 한다.

구체적으로, 표본 콩으로부터 변형된 CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide) 방법으로 유전체 DNA를 추출하였다. 유전적 연관 지도를 작성하기 위해, 180K Axiom® SoyaSNP array (Affymetrix, Santa Clara, CA)를 이용하여 양친계통 및 141 개체의 F4-유래 F8 RIL의 유전체 DNA 표본을 GeneTitan® Scanner (Affymetrix, Santa Clara, CA)로 이를 스캔하였으며, 총 180,961개의 마커중 42,170개의 다형성마커를 선발하였다.

실험예 1: 표현형질 평가

141 개체의 F4-유래 F8 RIL, 및 양친 계통인 Williams 82 및 PI 366121의 싸리수염진딧물에 대한 저항성 반응을 표 1에 요약하였다.

형질		양친		F _4:8 RILs
형질		PI 366121	Williams 82	평균	범위
선택 시험	PLD	1 ± 0.0	8.1 ± 1.5	5.2	1-9
선택 시험	TPD	1 ± 0.0	6.0 ± 0.9	3.8	1-9
비선택 시험	PLD	1 ± 0.0	5.8 ± 1.2	3.9	1-9
비선택 시험	TPD	1 ± 0.0	5.6 ± 1.3	3.5	1-9

비선호성 및 항충성을 평가하기 위해, 상기 RIL 군집 및 양친 계통을 이용하여 성장 챔버에서 선택 시험 및 비선택 시험을 수행하였다. 민감성 개체인 Williams 82는 싸리수염진딧물에 의해 심각한 손상을 입었으나, 저항성 개체인 PI366121은 손상을 입지 않았다 (표 1).

선택 시험에서, Williams 82의 PLD는 8.1 점이었고, TPD는 6.0 점이었다. 그러나, PI 3661321의 TPD 및 PLD는 모두 1 점을 기록하였다. RIL의 평균 PLD는 5.2, 평균 TPD는 3.8이었다. 손상 점수 범위는 1 내지 9 점이다.

비선택 시험에서, 분리된 메시 케이지가 최적의 식물 성장을 저해하기 때문에, PLD 및 TPD는 DAI-7에서만 평가했으며, 감염 후 7 일째 평가로 싸리수염진딧물에 대한 저항성 및 민감성 반응을 구별할 수 있었다. Williams 82의 PLD 및 TPD 점수는 각각 5.8 및 5.6이었다. 반면 PI 366121은 싸리수염진딧물에 의해 손상을 입지 않았다. RIL은 비선택 시험에서 싸리수염진딧물에 대해 유사한 PLD 및 TPD를 보였다. 한편, Williams 82 보다 높은 손상 점수를 가지는 초월 분리개체 (transgressive segregant)가 관찰되었다.

상기 선택 시험 및 비선택 시험에서 관찰된 형질 분포를 도 2에 나타내었다. 선택 시험에서, PLD는 정상 분포를 나타내는 대신 1 내지 9 범위에서 바이모덜 형상 (bimodal shape)을 나타냈다 (도 2a). 상기 바이모덜 분포는 PI 366121에서 싸리수염진딧물 저항성이 한정된 수의 주요 유전자들에 의해 이루어진다는 것을 의미한다. PI 366121에서 항충성 저항성에 대한 비선택 시험에서는, DAI-7에서 PLD 및 TPD 점수 및 빈도가 1 내지 9 점에 고르게 분포되어 있었다 (도 2c 및 2d). 총 18 개체의 RIL이 PLD 점수 1 점을 나타냈고, 28, 33, 및 11 개체의 RIL이 각각 3, 5, 및 9점을 나타냈다. TPD의 빈도 분포도 PLD와 유사하게 나타났다.

상기 표현형 평가 결과는 싸리수염진딧물 감염에 대해 양친 계열인 PI 366121은 저항성을, Williams 82는 민감성을 보인다는 것을 의미한다. PI 366121 및 Williams 82를 교배하여 생산한 RIL은 QTL 분석에 적절한 빈도 분포를 보였다.

실험예 2: QTL 분석

싸리수염진딧물 저항성 SNP 마커를 확인하기에 앞서서, 우선적으로 싸리수염진딧물 저항성에 관련이 있는 주요 QTL 영역을 분석하였다. ICIM 방법을 이용한 QTL 지도 작성은 상기 선택 시험 및 비선택 시험으로부터 얻은 PLD 및 TPD 표현형 데이터와 GoldenGate 분석에서 얻은 유전형 분석 데이터를 이용하여 수행되었다. 전체 유전체에서 다형성을 보이는 504 개의 SNP 마커는 각 유전체에서 평균 20 cM 간격으로 위치해 있다. 표현형질로서 PLD 및 TPD를 이용한 싸리수염진딧물 저항성에 대한 QTL 분석을 표 2에 요약하였다.

^a Primary infestation leaf damage grade

^b Total plant damage grade

^c Log of odds

^d Phenotypic variance explained

^e Additive effect

전체적으로, 상기 분석으로 7 번 염색체에서 주요 QTL 영역을 확인하였는데, 비선택 TPD 시험을 제외한 모든 시험에서 60 내지 72 %의 표현형 다양성이 나타났다. 선택 PLD 시험에서, QTL은 3 번, 6 번, 7 번 및 18 번 염색체에서 확인되었다. 3 번 및 6 번 염색체는 각각 하나의 QTL을 가지고 있으며, 7 번 염색체는 2 개, 18 번 염색체는 3 개의 QTL을 가진다. 7 번 염색체의 2 개의 QTL은 각각 22.3 및 33.2 점의 높은 LOD 점수를 나타냈다. 상기 두 QTL 피크는 7 번 염색체에서 서로 가까이 위치해 있으며 (인접 마커 사이에 거리 3.97 cM), 표현형 다양성이 거의 72 %로 나타났다. TPD에 대하여, 세 개의 QTL이 확인되었다: 2 개의 QTL 피크는 7 번 염색체에 존재하며 7 번 염색체의 PLD에 대한 QTL 위치에 대응되고, 나머지 하나의 QTL 피크는 18 번 염색체에 위치한다. 비선택 시험에서 역시, PLD에 대한 세 개의 QTL이 검출되었고, TPD에 대한 선택 시험에서와 동일하게 7 번 염색체의 2 개의 QTL이 확인되었다. TPD에 대하여, 다른 시험에서도 확인된 QTL에 대응하는 7 번 염색체의 두 개의 QTL이 다시 검출되었다. 상기 확인된 7 번 염색체의 QTL들은 QTL에 의해 야기되는 유전형 다양성인, PVE (phenotypic variance explained value) %가 가장 높게 나타났다 (25 %가 주요 QTL임을 결정하는데 통상적으로 사용된다). 7 번 염색체 QTL들의 첨가 효과 (additive effect, Add)는 음수로 나타났는데, 이는 저항성 개체인 PI 366121로부터 유래된 효과임을 시사한다. 3 번, 6 번 및 18 번 염색체의 다른 QTL들은 낮은 LOD 및 PVE %를 보였다. 상기 LOD 및 PVE % 값에 따라, 비선호성 및 항충성에 대하여 가장 중요한 저항성 QTL은 7 번 염색체에 위치하는 것으로 보인다. 상기 7 번 염색체의 주요 QTL은 7 번 염색체의 71 cM (BARC-042815-08424) 내지 84 cM (BARC-015945-02020) 사이의 영역에 대응하는 13 cM 거리 내에 다 수의 SNP 마커를 가지며, 이를 도 3에 나타내었다.

실험예 3: 싸리수염진딧물 저항성 SNP 확인

상기 실험예 2의 결과를 기반으로 하여 7 번 염색체의 주요 QTL 주변에 존재하는 싸리수염진딧물 저항성에 관한 SNP 마커를 탐색하기 위해 180K Axiom® SoyaSNP 분석을 수행한 결과, 7 번 염색체에서 높은 LOD 값을 나타내는 상위 10 개의 SNP를 확인하였으며, 이를 하기 표 3 및 표 4로 나타내었다.

SNP ID	Chromosome	Physical location	PI366121 (resistance allele)	Williams82 (sensitive allele)
AX-90463543	Chr07	5497330	G	A
AX-90457213	Chr07	5501827	A	C
AX-90428033	Chr07	5511541	G	A
AX-90357286	Chr07	5511626	G	T
AX-90372171	Chr07	5526770	G	A
AX-90464073	Chr07	5526975	A	C
AX-90444435	Chr07	5546038	T	C
AX-90445841	Chr07	5554122	T	C
AX-90335372	Chr07	5651095	C	T
AX-90331100	Chr07	5733055	G	A

SNP ID	resistance allele	sequence	서열번호
AX-90463543	G	CTCTCCCTGGTCTTCGACCTTTACCGGACTGCAAACATCCAGTACATTC[G/A]TTGCGTCAGATTGAAATCAGAAGCCATTCATTATCAGTTCTGAATATAA	서열번호 1
AX-90457213	A	TGTACCCAAAATGCGGCACTTTGTGGTTGAACAAATCCACATCTCTACC[A/C]TCACCAGCTCTGCTGAATTTCTCCGAAATCTTAGGCAAAAAAACAGCAT	서열번호 2
AX-90428033	G	ACACCTTTTTTCCTTTTCACTCAAGTGCTAGACAAAACAACTTCACCTA[G/A]AGATTAACAAATAGGTTTAGAACACTTGCAACTATTTGGCAAAGAATAG	서열번호 3
AX-90357286	G	TTGGCAAAGAATAGCTAAATAAATCACAAATTGACAATCAAGCATGGTG[G/T]CACCAGGCACTTGCCCTTTTGCTGAATATGAAATTACCTTGCGTGTACC	서열번호 4
AX-90372171	G	AAAAGTAGATCCAAGCCAAATGCAGGAACACTTTCGGAATTGGAGATCA[G/A]ATCTCAATTCAATCTCCGAAGGCAAACTTGAAGAAATACGCACTGACTT	서열번호 5
AX-90464073	A	CAGTGAATACGAACCATAGGAGAGAAAGGAATCATGTTGCGGAGTGATC[A/C]GCAATCGATGGTTGGGTTAACCATCATTCCTTTGTTTCTCTTCATTGCA	서열번호 6
AX-90444435	T	TTACTCAAGACCTTTTCGTCAAACACAGCATACTGCTTCTTGAACTCAA[T/C]GAGTGCCTTCTCTGCTAGAGGGTCTATCTTATCCTCATACTTGTCATAC	서열번호 7
AX-90445841	T	TAGGATTATGCCACTGACCAGAGACGTTTTTGAAAATCTTGTAGTATTA[T/C]GGTGTTCTGGTAGCGAAGCAAATATATGAATTGCTTTCACTGCAACTGC	서열번호 8
AX-90335372	C	TTTGGCATTCTGTACAGAATTTGACAGAGACGTTCACCATCATTAACTT[C/T]GCATAACGAAAGCACTTTTAAACGGTGCATTGGATGCTTCACAGTGTTG	서열번호 9
AX-90331100	G	TTTTAAAGAAATTGCAAATGGTTCTAGAACCACTAAACCTATGTTACAG[G/A]CAATAGtaacacagtaacacatgactcaaacactaatcaaacatttcac	서열번호 10

*[X/Y]에서 X는 저항성 형질, Y는 감수성 형질의 서열임

상기 표 3 및 표 4에 기재된 SNP들은 PI 366121의 비선호성 및 항충성과 관련된 싸리수염진딧물에 대한 저항성을 증가시키는데 주요한 역할을 한다. 이에, 상기 SNP들은 콩의 싸리수염진딧물 저항성 정도를 판단하는데 활용될 수 있으며, 싸리수염진딧물 저항성 품종 개발에 유용하게 이용될 수 있다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> Dankook University Cheonan Campus Industry Academic Cooperation Foundation <120> Nucleotide polymorphism markers for Foxglove aphid resistance in soybean and the use thereof <130> KPA150677-KR <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AX-90463543 <400> 1 ctctccctgg tcttcgacct ttaccggact gcaaacatcc agtacattcr ttgcgtcaga 60 ttgaaatcag aagccattca ttatcagttc tgaatataa 99 <210> 2 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AX-90457213 <400> 2 tgtacccaaa atgcggcact ttgtggttga acaaatccac atctctaccm tcaccagctc 60 tgctgaattt ctccgaaatc ttaggcaaaa aaacagcat 99 <210> 3 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AX-90428033 <400> 3 acaccttttt tccttttcac tcaagtgcta gacaaaacaa cttcacctar agattaacaa 60 ataggtttag aacacttgca actatttggc aaagaatag 99 <210> 4 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AX-90357286 <400> 4 ttggcaaaga atagctaaat aaatcacaaa ttgacaatca agcatggtgk caccaggcac 60 ttgccctttt gctgaatatg aaattacctt gcgtgtacc 99 <210> 5 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AX-90372171 <400> 5 aaaagtagat ccaagccaaa tgcaggaaca ctttcggaat tggagatcar atctcaattc 60 aatctccgaa ggcaaacttg aagaaatacg cactgactt 99 <210> 6 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AX-90464073 <400> 6 cagtgaatac gaaccatagg agagaaagga atcatgttgc ggagtgatcm gcaatcgatg 60 gttgggttaa ccatcattcc tttgtttctc ttcattgca 99 <210> 7 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AX-90444435 <400> 7 ttactcaaga ccttttcgtc aaacacagca tactgcttct tgaactcaay gagtgccttc 60 tctgctagag ggtctatctt atcctcatac ttgtcatac 99 <210> 8 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AX-90445841 <400> 8 taggattatg ccactgacca gagacgtttt tgaaaatctt gtagtattay ggtgttctgg 60 tagcgaagca aatatatgaa ttgctttcac tgcaactgc 99 <210> 9 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AX-90335372 <400> 9 tttggcattc tgtacagaat ttgacagaga cgttcaccat cattaactty gcataacgaa 60 agcactttta aacggtgcat tggatgcttc acagtgttg 99 <210> 10 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AX-90331100 <400> 10 ttttaaagaa attgcaaatg gttctagaac cactaaacct atgttacagr caatagtaac 60 acagtaacac atgactcaaa cactaatcaa acatttcac 99

Claims

콩의 7번 염색체의 5497330번째 염기 위치에 존재하는 단일염기다형성 (single nucleotide polymorphism, SNP)을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 콩의 싸리수염진딧물 저항성 형질 선별용 마커로서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 염기서열 중, 50번째 염기를 SNP로서 포함하고 5 내지 50개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드이며, 상기 서열번호 1의 50번째 염기는 G 또는 A인 것인, 콩의 싸리수염진딧물 저항성 형질 선별용 마커.
제1항에 있어서, 상기 콩의 싸리수염진딧물 저항성 형질 선별용 마커는 서열번호 2 내지 10으로 구성된 군에서 선택된 1 이상의 염기서열 중, 50번째 염기를 SNP로서 포함하고 5 내지 50개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 것으로서,
(i) 상기 서열번호 2의 50 번째 염기는 A 또는 C이고,
(ii) 상기 서열번호 3의 50 번째 염기는 G 또는 A이고,
(iii) 상기 서열번호 4의 50 번째 염기는 G 또는 T이고,
(iv) 상기 서열번호 5의 50 번째 염기는 G 또는 A이고,
(v) 상기 서열번호 6의 50 번째 염기는 A 또는 C이고,
(vi) 상기 서열번호 7의 50 번째 염기는 T 또는 C이고,
(vii) 상기 서열번호 8의 50 번째 염기는 T 또는 C이고,
(viii) 상기 서열번호 9의 50 번째 염기는 C 또는 T이고, 및
(ix) 상기 서열번호 10의 50 번째 염기는 G 또는 A인,
콩의 싸리수염진딧물 저항성 형질 선별용 마커.
제1항 또는 제2항의 콩의 싸리수염진딧물 저항성 형질 선별용 마커를 검출할 수 있는 프로브 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 싸리수염진딧물 저항성 콩 선별용 조성물.
제3항의 조성물을 포함하는 싸리수염진딧물 저항성 콩 선별용 키트.
제4항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트 DNA 칩 키트, SNP 칩 키트 또는 마이크로어레이 칩 키트인, 싸리수염진딧물 저항성 콩 선별용 키트.
(a) 콩으로부터 DNA를 수득하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계로부터 수득한 DNA로부터 제1항의 단일염기다형성의 다형성 부위를 프로브와 혼성화하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계의 혼성화된 다형성 부위의 염기를 확인하는 단계를 포함하는, 싸리수염진딧물 저항성 콩 선별 방법.
제6항에 있어서, 상기 서열번호 1의 50 번째 염기가 G인 경우에는 싸리수염진딧물 저항성 콩으로 판단하는 것인, 싸리수염진딧물 저항성 콩 선별 방법.
제6항에 있어서, 상기 서열번호 1의 50 번째 염기가 A인 경우에는 싸리수염진딧물 민감성 콩으로 판단하는 것인, 싸리수염진딧물 저항성 콩 선별 방법.
(a) 콩으로부터 DNA를 수득하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계로부터 수득한 DNA로부터 제2항의 단일염기다형성의 다형성 부위를 프로브와 혼성화하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계의 혼성화된 다형성 부위의 염기를 확인하는 단계를 포함하는, 싸리수염진딧물 저항성 콩 선별 방법.
제9항에 있어서,
(i) 상기 서열번호 1의 50 번째 염기가 G,
(ii) 상기 서열번호 2의 50 번째 염기가 A,
(iii) 상기 서열번호 3의 50 번째 염기가 G,
(iv) 상기 서열번호 4의 50 번째 염기는 G,
(v) 상기 서열번호 5의 50 번째 염기는 G,
(vi) 상기 서열번호 6의 50 번째 염기는 A,
(vii) 상기 서열번호 7의 50 번째 염기는 T,
(viii) 상기 서열번호 8의 50 번째 염기는 T,
(ix) 상기 서열번호 9의 50 번째 염기는 C, 또는
(x) 상기 서열번호 10의 50 번째 염기는 G인 경우에는 싸리수염진딧물 저항성 콩으로 판단하는 것인, 싸리수염진딧물 저항성 콩 선별 방법.
제9항에 있어서,
(i) 상기 서열번호 1의 50 번째 염기가 A,
(ii) 상기 서열번호 2의 50 번째 염기가 C,
(iii) 상기 서열번호 3의 50 번째 염기가 A,
(iv) 상기 서열번호 4의 50 번째 염기는 T,
(v) 상기 서열번호 5의 50 번째 염기는 A,
(vi) 상기 서열번호 6의 50 번째 염기는 C,
(vii) 상기 서열번호 7의 50 번째 염기는 C,
(viii) 상기 서열번호 8의 50 번째 염기는 C,
(ix) 상기 서열번호 9의 50 번째 염기는 T, 또는
(x) 상기 서열번호 10의 50 번째 염기는 A인 경우에는 싸리수염진딧물 민감성 콩으로 판단하는 것인, 싸리수염진딧물 저항성 콩 선별 방법.
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