KR102052428B1 - 머루 자원 구별을 위한 ssr 분자마커 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 머루 자원 구별을 위한 SSR 분자마커 및 이의 용도에 관한 것으로서, 국내 자생 머루의 종 판별과 머루 유전 육종자원의 품종 구분 및 국내 육성 포도품종 보호를 위한 마커 세트를 개발하고자 했고, 마커의 형태는 소규모 실험실에서도 사용할 수 있는 형태로 개발하고자 하였다. 이를 위해 핵 SSR은 포도유전체 정보를 이용하여 개발된 21개의 SSR 마커 중에서 근연 교배 머루 품종도 구분이 가능한 최소 개수의 SSR을 선발하고자 했다. 모계를 구분하기 위한 엽록체 SSR은 NCBI에 등록된 13개 머루 엽록체 염기서열 정보를 비교한 후, 다형성 좌위를 조사하여 SSR 마커 형태로 개발함으로써 근연인 머루 교배 품종의 구분도 가능하게 하고자 했다. 핵 SSR 및 엽록체 SSR 마커를 조합한 마커세트는 머루 자원의 구분 뿐 아니라 머루와 교배한 품종 개발 시 양친 교배 실생 여부를 판별할 수 있어서 머루관련 신품종 개발에도 유용하게 사용할 수 있을 것이다.

Description

머루 자원 구별을 위한 SSR 분자마커 및 이의 용도{SSR molecular markers for discriminating Korean wild grape accessions and uses thereof}
본 발명은 머루 자원 구별을 위한 SSR 분자마커 및 이의 용도에 대한 것이다.
머루(Vitis coignetiae)는 포도과(Vitaceae), 포도속(Vitis)에 속하는 낙엽성 덩굴식물로 우리나라에 자생하는 머루 종에는 머루와 같은 속에 속하는 새머루(V. flexuosa), 왕머루(V. amurensis), 까마귀머루(V. thunbergii), 그리고 개머루속(Ampelopsis)에 속하는 개머루(Ampelopsis brevipedunculata)를 포함하여 5종이 자생하고 있다. 자생 머루는 내한성, 내습성, 내건성 등 환경 스트레스에 대한 적응성이 높아 최근에 포도 신품종 육성시 교배 모·부본으로서 그 중요성이 부각되고 있다). 그러나 머루가 속한 분류군의 구분이나 머루와의 교배 품종들의 구분에 대한 보고는 전무한 실정이다.
최근에는 포도 과실 품질 향상, 내건성 및 내한성 등 비-생물학적 스트레스에 대한 내성을 증가시키기 위한 육종 목표들이 대목 육성 프로그램에 추가 되면서, 주요 포도 생산국들을 중심으로 목표 형질에 적합한 자생 유전자원의 수집, 평가 및 유연관계 분석 연구가 진행되고 있다. 우리나라에서도 머루를 포도와의 교배를 통해 우리나라 기후에서도 잘 재배되는 포도를 육종하고자 하는 노력이 계속되고 있다.
머루의 기능성 물질이 알려지면서 개량머루, 머루포도 등의 머루 품종의 소비가 증가하고 있는 추세이며, 이들 품종을 이용한 건강식품개발 등이 이루어지고 있다. 강원도농업기술원에서는 강원도 일원 등에서 수집된 왕머루 155개 유전자원 계통 중에서 선택된 KW03 계통과 KW10 계통을 교배하였고, 교배실생 중 생육 및 과실특성이 우수한 계통들을 선발하여 수분용 수머루 품종인 ‘나래(Narae)’, 양조용 왕머루 품종인 ‘청풍(Cheongpung)’과 ‘청산(Cheongsan)’을 육성하였다. 또한 자생 머루의 유용 유전자형질을 상업적으로 이용하기 위해 왕머루와 재배용 포도 품종 중 하나인 ‘Muscat Bailey A (MBA)’와의 교배를 통해서 기능성 와인용 포도인 ‘블랙 썬’과 내병성이 우수한 고품질의 포도인 ‘블랙 아이’를 육성하였다.
머루는 한국 뿐 아니라 동북아시아 지역, 중국, 일본의 해발 100~1300m 사이에 분포한다고 알려져 있다. 머루의 resveratrol (phytoalexin)은 지방과산화 억제 및 자유 라디칼 소거기능(항산화작용), cyclooxygenase 저해(항염증 작용), 혈소판 응집 저해, LDL(low density lipoprotein)의 산화 억제, 동맥경화방지, 암세포 성장 억제 및 암 예방 효능 등이 보고되었다.
포도의 유전체에 관한 연구는 아주 오랫동안 행해져 왔으며, 유럽종 양조용 포도 품종인 ‘Pinot Noir (V. vinifera)’을 대상으로 유전체 염기서열이 분석이 완료되었다. 포도 유전체 서열 해독은 열매 작물로서는 처음이고 개화 식물 중에서는 네 번째로 이루어진 것이다. 포도 유전체 서열 해독 이후 다양한 포도 유전자원을 대상으로 유용형질과 연관된 SSR 표지와 SNP 표지를 발굴하고, 유전자지도 작성, 종 간 비교유전체 연구 유전체 구조 및 재배기원을 밝히는 연구 등 전 세계에서 포도유전자원의 유전체 연구가 진행되고 있다.
외부 형태적 특성에 의한 유전자원의 평가는 작물 생육상태와 여러 가지 환경요인에 따라 영향을 받지만, 분자생물학적 방법을 기반으로 한 유전적 다양성 분석은 종간 또는 종 내에서의 변이 정도와 유연관계를 규명하는데 있어 비교적 신뢰성 있는 자료를 제공할 수 있다는 점에서 유전육종 기초연구에 효과적인 수단으로 이용된다.
식물체의 DNA는 보통 핵 DNA와 세포소기관내의 엽록체 DNA 및 미토콘드리아 DNA로 구분된다. 미토콘드리아 DNA는 식물체에서의 분자유전학적 연구방법상 적합하지 않은 구조 및 방법론 등에 의해서 현재 식물분자계통학에서는 재현성의 용이함과 유전자의 구조적 장점 등으로 인하여 핵 DNA와 엽록체 DNA가 중요한 계통학적 도구로 가장 폭넓게 사용되고 있다. 엽록체 DNA는 핵 DNA보다 보존이 잘 되어 있고, 모계 유전이 되기 때문에 종간의 다형성을 가지는 분자마커를 개발하기 용이하다고 알려져 있다. 다양한 식물체에서 엽록체 유전체 기반 SSR 마커를 사용하여 종 판별 연구를 수행하고 있다.
해외에서는 포도의 품종 개발 및 보호 그리고 포도 품종 구분과 관련된 연구는 여러 다양한 집단에서 폭넓게 연구되고 있으나, 국내에서는 이와 관련 연구가 미미한 수준이다.
한국등록특허 제10-1834774호(2018.02.27 등록)
본 발명의 목적은 머루 품종 구별용 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 머루 품종 구별용 키트 및 이를 이용한 머루 품종 구별 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 11 및 서열번호 12로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 13 및 서열번호 14로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 15 및 서열번호 16으로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 17 및 서열번호 18로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 19 및 서열번호 20으로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 21 및 서열번호 22로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 23 및 서열번호 24로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 25 및 서열번호 26으로 표시되는 프라이머 세트 및 서열번호 27 및 서열번호 28로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는 머루 품종 구별용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 머루 품종 구별용 프라이머 세트를 포함하는 머루 품종 구별용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 머루 품종 구별용 프라이머 세트를 이용한 머루 품종 구별 방법을 제공한다.
본 발명은 머루 자원 구별을 위한 SSR 분자마커 및 이의 용도에 관한 것으로서, 국내 자생 머루의 종 판별과 머루 유전 육종자원의 품종 구분 및 국내 육성 포도품종 보호를 위한 마커 세트를 개발하고자 했고, 마커의 형태는 소규모 실험실에서도 사용할 수 있는 형태로 개발하고자 하였다. 이를 위해 핵 SSR은 포도유전체 정보를 이용하여 개발된 21개의 SSR 마커 중에서 근연 교배 머루 품종도 구분이 가능한 최소 개수의 SSR을 선발하고자 했다. 모계를 구분하기 위한 엽록체 SSR은 NCBI에 등록된 13개 머루 엽록체 염기서열 정보를 비교한 후, 다형성 좌위를 조사하여 SSR 마커 형태로 개발함으로써 근연인 머루 교배 품종의 구분도 가능하게 하고자 했다. 핵 SSR 및 엽록체 SSR 마커를 조합한 마커세트는 머루 자원의 구분 뿐 아니라 머루와 교배한 품종 개발 시 양친 교배 실생 여부를 판별할 수 있어서 머루관련 신품종 개발에도 유용하게 사용할 수 있을 것이다.
도 1은 유용한 엽록체 SSR 마커를 선발하기 위한 모식도를 나타낸다.
도 2는 9개 핵 SSR 마커를 이용하여 17종 머루 품종 간의 유전적 유사도를 토대로 작성된 UPGMA 계통수를 나타낸다.
도 3은 5개 엽록체 SSR 마커를 이용하여 17종 머루 품종 간의 유전적 유사도를 토대로 작성된 UPGMA 계통수를 나타낸다.
도 4는 9개 핵 SSR 마커 및 5개 엽록체 SSR 마커를 이용하여 17종 머루 품종 간의 유전적 유사도를 토대로 작성된 UPGMA 계통수를 나타낸다.
자생 머루는 내한성, 내습성, 내건성 등 환경 스트레스에 대한 적응성이 높아 최근에 포도 신품종 육성 시 교배 모·부본으로서 그 중요성이 부각되고 있다. 식물체의 외부적 형태는 환경적인 영향에 따라 영향을 받기 때문에 형태에 의한 분류는 한계가 있다. 그러나 머루가 속한 분류군의 구분이나 머루와의 교배 품종들의 구분을 위한 체계적인 분자마커에 대한 보고는 전무한 실정이다. 이에, 본 발명자들은 자생머루 자원에 대한 구분, 자원보존 시 자원의 중복여부 판별, 머루 교배 육종 프로그램에서 근연종 및 신품종 구분을 위한 분자마커 세트를 개발하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명에서 국내 자생 머루나 교배된 머루의 근연 품종을 구분하기 위해, 9개 핵 SSR 마커 및 5개 엽록체 SSR 마커로 이루어진 마커세트를 제안하였다. 9개의 핵 SSR은 기존 보고한 21개 SSR 중에서 최소한의 개수인 9개를 선발하였다. 기존 핵 SSR 마커들은 포도 유전체 정보와 포도 15 품종의 염기서열재분석 데이터를 비교하여 발굴되었다. 엽록체 SSR 마커는 NCBI에 등록된 13종류의 포도속 엽록체 유전체 서열을 비교하여 디자인되었다. 본 세트를 사용하여 4종의 국내 자생머루와 6종의 머루 유전 육종 자원, 육종에 사용된 2개의 포도 품종이 포함된 총 17개 시료에 적용하였을 때 모두 잘 구분되었다.
본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 11 및 서열번호 12로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 13 및 서열번호 14로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 15 및 서열번호 16으로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 17 및 서열번호 18로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 19 및 서열번호 20으로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 21 및 서열번호 22로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 23 및 서열번호 24로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 25 및 서열번호 26으로 표시되는 프라이머 세트 및 서열번호 27 및 서열번호 28로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는 머루 품종 구별용 프라이머 세트를 제공한다. 바람직하게는, 상기 프라이머 세트는 단순 반복 염기 서열(Simple sequence repeat; SSR) 마커 증폭용 프라이머 세트일 수 있다.
본 발명에 있어서, “마커(marker)”는 유전적으로 불특정 연관된 유전자좌를 동정할 때 참고점으로 사용되는 염기서열을 말한다. 이 용어는 또한 마커 서열을 증폭할 수 있는 프라이머 세트로 사용되는 핵산과 같은 마커 서열에 상보적인 핵산 서열에도 적용된다. 분자 마커(molecular marker)의 유전자 지도상의 위치는 유전자좌(genetic locus)로 일컬어진다.
본 발명에 있어서, "분자 마커"는 작물의 재배 환경이나 성장 시기에 영향을 받지 않고 신속하게 품종을 구별할 수 있으므로 유용하게 사용될 수 있다. 분자 마커는 유전현상의 본질인 DNA의 염기서열 차이를 대상으로 개체간 다형성(polymorphism)을 나타내는 방법으로, 주로 단순 반복 염기 서열(Simple sequence repeat; SSR)이나 유전자 염기 서열을 이용한 마커 또는 RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism) 프로브나 SCAR(Sequence Characterised Amplified Region) 마커가 이용되고 있다.
외부 형태적 특성에 의한 유전자원의 평가는 작물 생육상태와 여러 가지 환경요인에 따라 영향을 받지만, DNA 마커에 근거한 평가는 환경의 영향을 받지 않기 때문에 표현형의 특성을 대체 하고 보완하는데 활용성이 높다. DNA 마커는 다른 품종임에도 불구하고 동일한 품종명을 가지거나(이품종 동명) 여러 개의 다른 품종명을 가지고 있는 동일한 품종(동품종 이명) 및 유사한 품종을 판별하는데 유용한 기술이다. 따라서 DNA 마커에 의한 품종 판별은 형태적 형질의 조사 없이 추출한 DNA를 이용하여 쉽고 정확하게 품종을 구분할 수 있기 때문에 묘목 유통과정에서 품종 혼입을 방지할 수 있다.
한편, PCR 기반 DNA 마커들 중 하나인 microsatellites는 SSR (Simple Sequence Repeat), STR (Short Tandem Repeat) 등으로 표현되기도 한다. microsatellites는 유전체 상에서 1-6 bp의 짧은 배열이 반복되어 나타나는 염기서열로, 유전체 상에 광범위하게 산재하여 다수의 유전자좌 분석에 활용할 수 있다.
Microsatellite는 보통 1~6bp의 뉴클레오티드 서열이 반복된 것 (e.g. mono-는 1개, di-는 2개, tri-는 3개, tetra-는 4개, penta-는 5개, hexa-는 6개의 뉴클레오티드가 반복되는 것)을 말하며, 반복 수는 n 으로 나타낸다. 예를 들어, AT 의 염기서열이 n 번 반복이 되면 (AT)n 로 나타낼 수 있다. 뉴클레오티드 2개가 반복되는 (CA)6 인 경우, 이는 염기서열에서 CACACACACACA가 나타나는 것으로 C(AC)5A 로도 표현되기 때문에 CA 와 AC 반복은 같은 계열로 구분되며, CA가 존재하면 이의 상보적 염기서열에는 TG가 존재하게 된다. 따라서, CA = AC = TG = GT, GA = AG = CT=TC, AT = TA, GC = CG를 같은 계열로 분류하여，(CA)n，(AT)n, (GA)n와 (GC)n 의 네 가지 유형으로 나눈다. 동물의 경우 (CA)n 빈도 수가 가장 많은데 비해 식물의 경우는 (AT)n가 가장 많고 (GA)n도 높은 빈도로 나타난다.
Microsatellite는 반복서열의 양상에 따라 perfect microsatellite, imperfect microsatellite, compound microsatellite 의 3가지 유형으로 구분할 수 있다. Perfect microsatellite는 치환, 삽입 또는 결실 등의 방해 없이 완전하게 특정 모티프 (motif) 가 연속성을 이룬 것 (e.g. (AT)n) 을 말하고, imperfect microsatellite는 치환, 삽입 또는 결실 등으로 인해 반복 단위의 연속성을 방해하여 불완전하게 이루어진 것 (e.g. (CA)nGA(CA)n) 을 의미한다. Compound microsatellite는 두 개 이상의 SSRs이 서로 인접하여 이루어진 것을 뜻하는데, perfect 와 imperfect microsatellite 두 가지로 나눌 수 있다. Compound perfect microsatellile는 두 개 이상의 다른 반복단위가 동일하게 반복되는 것이며 (e.g. (AT)n(GC)n), compound imperfect microsatellite는 두 개 이상의 다른 반복단위가 반복이 되나 하나 이상의 다른 염기로 인해 반복 단위의 연속성을 방해한 것 (e.g., (GC)nTAC(GA)n) 을 의미한다.
Microsatellites는 염기서열에 대한 변이율이 크고 단일 유전자좌에 대한 대립유전자 다양성이 상당히 높으며, 유전자좌 내 대립유전자의 유무 만을 확인할 수 있는 RAPD, AFLP, ISSR 과는 대조된다. 이러한 특성들로 인해 microsatellites는 유전형 분석을 통한 유전적 특성 규명, 종 또는 근연종 내 집단 유전 분석, 연관 분석을 통한 유전자 지도 작성 등 다양한 활용이 가능하다.
특히, SSR 마커는 염기서열에서 단순염기서열의 반복횟수 차이를 이용하여 다형성을 확인하는 마커로서, 초기 개발비용은 많이 소요되지만 다형성과 재현성이 높고 공우성이며 분석방법이 단순하기 때문에 품종구분에 많이 이용되고 있다. 현재까지 포도에서 개발된 SSR 마커는 약 560여종 이상에 달하며 포도 유전자원의 유전적 다양성 분석 및 유전자지도 작성 등에 널리 이용되고 있다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 증폭하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다. 본 발명에 있어서, 프라이머로 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 머루 품종 구별용 프라이머 세트를 포함하는 머루 품종 구별용 키트를 제공한다.
상기의 프라이머 세트 이외에, PCR 키트에 포함되는 통상적인 구성성분을 포함할 수 있다. 상기 키트에 포함되는 통상적인 구성성분은 반응완충액, 중합효소, dNTP(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP) 및 Mg2+와 같은 조인자 등일 수 있다. 다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭 단계에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 클레나우 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이다. 상기 중합효소 대부분은 박테리아 그 자체로부터 분리될 수 있고 또는 상업적으로 구입할 수 있다.
또한, 본 발명은 (1) 머루에서 DNA를 분리하는 단계; (2) 상기 분리된 DNA를 주형으로 하고, 상기 머루 품종 구별용 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭을 수행하는 단계; 및 (3) 상기 PCR 증폭 산물을 분석하는 단계를 포함하는 머루 품종 구별 방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 PCR 증폭을 수행하는 단계는 단순 반복 염기 서열(Simple sequence repeat; SSR) 마커를 증폭하기 위한 것일 수 있다.
머루에서 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있다. 또한, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.
본 발명의 방법은 상기 PCR 증폭 산물을 분석하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 젤 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABI Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 젤 전기영동을 수행할 수 있으며, 젤 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로오스 젤 전기영동 또는 아크릴아미드 젤 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행 시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
포도는 전 세계적으로 생산되는 주요 과수 중의 하나로, 7천 9백만 ha의 면적에서 6천 7백만 톤이 생산되어 생식용은 물론 와인과 건포도를 비롯한 가공품으로 소비되고 있으며, 소비시장은 계속해서 확대되고 있다(FAO 2014). 포도는 북위 50도에서부터 남위 40도 지역에 분포하며, 해발 3,000 m의 산간지역에서도 재배되는 적응성이 매우 강한 과종이다. 포도과(Viticeae)는 14개 속이 있는데 그 중 경제적으로 중요한 포도속(Vitis)은 진정포도아속(Euvitis, 2n=38)과 머스카딘포도아속(Muscadinia, 2n=40)으로 구분되며 총 60여 종이 이에 속한다. 북미지역과 동아시아 지역에 다양한 종이 분포하고 있으며, 원생지에 따라 구분하면 서아시아원생종(유럽종), 동아시아원생종 및 북아메리카원생종군으로 구분할 수 있다. 재배종은 주로 유럽종 포도인 Vitis vinifera로부터 유래하였으며, 흑해와 카스피해 인근에서 6,000년~1만년전부터 재배되기 시작하여 아시아와 지중해연안으로 전파되어 현재는 재배되는 포도의 95%가 유럽종 포도에 속한다. 그러나 유럽종 포도를 우리나라에서 재배 시 유럽과 기후가 달라서 재배에 어려움이 있다.
이하에서는, 본 발명을 한정하지 않는 실시예에 따라 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 따라서, 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다.
< 실험예 >
하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.
1. 식물 재료 게놈 및 DNA 추출
식물 재료로는 강원도농업기술원에서 보존 중인 머루 자원과 머루 유전 육종자원 11종과, 농촌진흥청 국립원예특작과학원에서 보존 중인 포도 2종과 머루 자원 2종, 그리고 제주에서 채집한 머루 1종을 이용하였다(표 1). 포도의 어린 잎 조직으로부터 genomic DNA (이하 gDNA) 추출은 Biomedic® Plant gDNA Extraction Kit (www.ibiomedic.co.kr)를 이용하여 추출하였다. 정제된 gDNA의 양과 질은 DeNovix DS-11+ Spectrophotometer (DeNovix, Wilmington, DE, USA)와 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 결정하였다.
No Sample ID Species name 품종/ 계통명 교배내역 비고
1 GW01 Vitis amurensis 청산 실생 강원도
농업
기술원
2 GW02 V. amurensis 청풍 실생
3 GW03 V. coignetiae 머루(GW 05) 실생
4 GW04 V. coignetiae 머루(GW 07) 실생
5 GW05 V. flexuosa 새머루(GW 10) 실생
6 GW06 Vitis interspecific crossing 블랙아이 MBA x 왕머루
7 GW07 Vitis interspecific crossing 블랙썬 MBA x 왕머루
8 GW08 Vitis interspecific crossing BF.통53 09-03 Buffalo x 머루
9 GW09 Vitis interspecific crossing BF.통53 09-05 Buffalo x 머루
10 GW10 Vitis interspecific crossing Neo. K51 09-01 Neo Muscat x 왕머루
11 GW11 Vitis interspecific crossing Neo. K51 09-03 Neo Muscat x 왕머루
12 RDA03 V. amurensis 왕머루 국립
원예 특작
과학원
13 RDA04 V. thunbergii 까마귀머루
14 RDA05 Vitis hybrid MBA
15 RDA06 Vitis hybrid Buffalo
16 JJ01 V. thunbergii 까마귀머루 1 제주 채집
17 JJ02 V. thumbergii 까마귀머루 2
2. 엽록체 유전체 다형성 SSR 마커 발굴
(1) 포도속 엽록체 유전체 정보 비교
NCBI에서 공개된 13종의 포도속 엽록체 유전체의 정보(표 2)를 확보하고, 포도속 엽록체 유전체의 정보 비교를 위해 MAFFT alignment 프로그램을 이용하여 서열을 정렬하고 염기서열의 방향을 확인하였고, Genbank annotation으로 gene, CDS, tRNA, rRNA, Intergenic spacer (IGS) region을 파악하고, Inverted repears (IRs) 관련 서열 및 유전자를 확인하였다.
엽록체 유전체의 IRs region과 large, small single copy region (LSC, SSC)의 위치와 방향성을 확인한 후 Geneious에 있는 유전체내 반복서열 구간 탐색 프로그램인 phobos tandem repeat finder를 이용하여 엽록체 유전체 정보에서 CDS 또는 IGS 영역에 포함되는 서열(tandem repeat)을 찾아 다형성 simple sequence repeat (SSR) 가용 영역을 추출하였다.
No NCBI information Accessions Location Seq size
(bp)
1 AB856290.1 Vitis vinifera L. subsp . Caucasica Georgia 160,927
2 MG586833.1 V. vinifera L. subsp . Sylvestris USA 160,933
3 NC_007957.1 V. vinifera (유럽종 포도) USA 160,928
4 LC341205.1 V. flexuosa (새머루) USA 160,927
5 NC_031383.1 V. amurensis (왕머루) China 160,953
6 NC_036371.1 V. coignetiae (머루) USA 161,012
7 NC_036510.1 V. ficifolia (까마귀 머루) USA 160,983
8 LC342076.1 V. monticola USA 160,996
9 NC_029454.1 V. aestivalis (미국종 포도) USA 160,913
10 NC_036764.1 V. rupestris France 161,008
11 NC_036509.1 V. cordifolia North America 161,018
12 NC_036009.1 V. mustangensis France 161,008
13 NC_036336.1 V. cinerea France 161,020
(2) 엽록체 다형성 SSR 구간 선발
엽록체 유전체 서열을 비교하여 추출한 다형성 SSR 가용 영역은 반복서열이 inversion 된 부분, TA가 반복되는 부분, mono/dinucleotide가 반복되는 부분 등을 제외하고 머루의 종 구분이 가능한 부분, 유전자 영역에 있는 InDel/SSR, simple SSR 영역이면서 차이나는 구간이 긴 것을 위주로 메뉴얼 방법으로 선별하였다.
선별한 SSR 가용 영역에서 수정된 Primer Pro Perl pipeline에 있는 Prime3(version 2.3.6) 알고리즘을 이용하여 구간별로 PCR을 위한 프라이머(primer)를 2쌍씩 임의로 디자인하였다. 이 때 프라이머 길이는 18~25mer, GC contents는 40~60%, PCR product size는 100~300bp 조건으로 하여 수행하였다.
머루 종 구분이 가능한 엽록체 SSR 선발하기 위해 도 1과 같은 전략을 사용하였다.
3. 핵 SSR과 엽록체 SSR 후보 마커의 증폭 DNA 단편 분석
(1) 핵 SSR 마커의 증폭 DNA 단편 분석
핵 SSR은 포도유전체 정보를 이용하여 개발된 21개의 SSR 마커 중에서 머루 종 구분이 가능한 최소한의 마커를 선발하였다. 21개의 SSR 마커는 NCBI에 공개된 ‘Pinot Noir’ 포도품종의 유전체 염기서열 정보에, 포도 15 품종의 염기서열재분석 데이터를 비교하여 개발되었다. 염색체 위치, 기존좌위와의 중복성 여부, 증폭여부, 단일좌위 여부 등을 고려하여 선발한 SSR 좌위 중 포도의 품종구분이 가능한 최소한의 마커 21개를 개발하였다. 이들을 머루 야생 자원과 근연 머루 교배 품종에 적용하여 자원의 구분이 가능한지 확인하였다.
PCR 증폭을 위한 조건은 다음과 같다: 초기 열변성(1회)-95℃ 5분; DNA 증폭(총 35회 반복)-95℃ 30초, 56℃ 30초, 72℃ 30초; 최종 신장 반응(1회)-72℃ 30분. PCR 증폭산물은 증폭여부를 확인하기 위하여 2%(v/v) 아가로스 겔에서 전기영동하였다.
PCR 반응 조건은 전술한 바와 동일하게 수행하였으며, 정방향 프라이머의 5' 말단은 형광염료인 6-FAM (Applied Biosystems)으로 표지하여 증폭산물의 형광 표지가 이루어지도록 하였다.
PCR 증폭 후, 0.2 ㎕의 PCR 증폭산물을 9.8 ㎕의 Hi-Di formamide 및 0.2 ㎕의 GeneScanTM 500 LIZ　사이즈 스탠다드(Applied Biosystems)와 혼합하였다. 혼합물은 95℃에서 5분간 변성시킨 후 얼음에 방치하였다.
증폭된 DNA 절편은 50 cm 모세관이 장착된 ABI 3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems) 상에서 모세관 전기영동을 통해 DNA 절편들을 분리하였다. 대립유전자의 크기는 GeneMapper 소프트웨어(버전 4.0; Applied Biosystems)를 사용하여 분석하였다.
(2) 엽록체 SSR 마커의 증폭 DNA 단편 분석
엽록체 SSR 마커의 유전형 분석을 위한 DNA 단편 분석은 M13-tailed PCR 방법을 사용하여 수행하였다.
게놈 DNA는 핵산가수분해효소가 제거된 멸균 증류수에 10 ng/㎕이 되도록 희석하였다. PCR 반응은 20 ng 게놈 DNA, 5 ul 2 x HS™ Taq DNA 중합효소 혼합액 (0.3 unit/ul HSTM Taq DNA polymerase, 3.2 mM MgSO4, 0.4 mM dNTPs 함유; Dongsheng Biotech, China), 2 pmol M13-tailed forward primer, 10 pmol reverse primer, 10 pmol 6-FAM labeled M13 primer (6-FAM-TGTAAAACGACGGCCAGT)을 함유하는 10 ㎕의 반응부피에 ABI 2720 thermal cycler (Applied Biosystems)를 사용하여 수행하였다.
PCR 증폭을 위한 조건은 다음과 같다: 초기 열변성(1회)-94도 5분, 1차 DNA 증폭(총 15회 반복)-94도 30초, 58도 30초, 72도 30초; 2차 DNA 증폭(총 20회 반복)-94도 30초, 53도 30초, 72도 30초, 최종 신장 반응(1회)-72도 30분. PCR 증폭산물은 증폭여부를 확인하기 위하여 1.5% 아가로스 겔에서 전기영동 하였다.
PCR 증폭산물에 대한 DNA 절편분석은 위의 핵 SSR 증폭 DNA 단편 분석에 전술한 바와 같다.
4. 유전 분석
주요 대립유전자 빈도(MAF), 대립유전자 수(NA), 유전적 다양성(GD), 다형성 정보 함유량(PIC) 등을 포함한 유전적 매개변수는 PowerMarker 소프트웨어(버전 3.25; Liu and Muse, 2005, Bioinformatics, 21:2128-2129)를 이용하여 공유하는 대립유전자 빈도를 계산함으로써 측정하였다.
UPGMA 계통수는 NTSYSpc 소프트웨어(버전 2.11)를 사용하여 작성하였다.
< 실시예 >
1. 핵 SSR 마커 선발 및 분석
본 연구실에서 기보유하고 있는 포도에서 발굴된 21개의 다형성 핵 SSR 마커를 국내 자생 머루 자원 및 머루 유전 육종자원에 적용하여 유전 다양성 분석을 수행하였다. 17개 시료에 대한 절편 분석(fragment analysis) 결과를 토대로, 핵 SSR의 9개를 선발하였다. 이들에 대한 염기서열 정보는 표 3에 정리하였고, 유전좌위의 특징은 표 4에 정리하였다.
Locus Primer sequence (5' to 3')
(Forward sequence/ Reverse sequence) 		Repeat motif Ta
(℃) 		Size range (bp)
VvSSR01-2 6-FAM-ATAGCCACGTTGTGTCCTGC (서열번호 1) (TGT)7 56 83-130
/ GTTGCACAATTAGCGCACCA (서열번호 2)
VvSSR02-3 6-FAM-CCGCCAACCACCATTGACT (서열번호 3) (AGAAA)5 56 287-301
/ CTGCCTCTGCTCTTCCTGAT (서열번호 4)
VvSSR06-2 6-FAM-ACAGGTGGTTCTTCCTTGTCT (서열번호 5) (CTT)7 56 236-265
/ CGCACATAAGATATCACATCAACAC (서열번호 6)
VvSSR07-1 6-FAM-GGTCGATGTCCACTGTGTCC (서열번호 7) (TGG)9 56 274-287
/ GCCACGGAATCAGCTCTTCT (서열번호 8)
VvSSR10-2 6-FAM-GCTCATGCCTTGCTGCTTAG (서열번호 9) (TTG)12 56 218-260
/ CCACAGGCAACAACATTCCG (서열번호 10)
VvSSR12-1 6-FAM-ACTGATTCTGAACCGAGGCG (서열번호 11) (GAC)7 56 279-288
/ CCAGACCAGGAGAACATGCC (서열번호 12)
VvSSR14-2 6-FAM-GGAAGCAGCAGGAGGATCAG (서열번호 13) (AGG)7 56 247-262
/ GTTCTCGTACCGGCTTGGAG (서열번호 14)
VvSSR15-3 6-FAM-GAAGGACGGCTGGAAGGTTA (서열번호 15) (TC)14(AC)11 56 195-210
/ ATCAACACACACGGAGGAGT (서열번호 16)
VvSSR18-2 6-FAM-ACATGCAAGTCACCAGAAGG (서열번호 17) (TTA)10 56 122-141
/ GAACCTGACCAGACACAGCA (서열번호 18)
Locus SS N OBS Availability N O M AF N A GD Heterozygosity PIC
VvSSR01-2 17 17 1 3 0.68 3 0.47 0.53 0.40
VvSSR02-3 17 17 1 11 0.29 9 0.84 0.35 0.82
VvSSR06-2 17 17 1 12 0.26 10 0.84 0.47 0.82
VvSSR07-1 17 17 1 9 0.35 6 0.78 0.71 0.75
VvSSR10-2 17 17 1 10 0.41 8 0.77 0.59 0.75
VvSSR12-1 17 17 1 7 0.44 4 0.69 0.35 0.63
VvSSR14-2 17 17 1 5 0.82 5 0.31 0.35 0.30
VvSSR15-3 17 17 1 16 0.15 11 0.89 0.65 0.88
VvSSR18-2 17 17 1 9 0.38 7 0.78 0.53 0.76
Mean 17 17 1 9.11 0.42 7 0.71 0.50 0.68
SS, 샘플 크기(sample size); NOBS, 관측치(number of observations); 가용성(Availability): 1-OBS/n, OBS는 관측수, n은 개별 샘플수; NG, 유전형의 수(Genotype number); MAF, 주요 대립형질 빈도(major allele frequency); NA, 대립형질의 수(number of alleles); GD, 유전적 다형성(genetic diversity). 종종 기대 이형접합성(heterozygosity)으로 언급되는 GD는 모집단으로부터 무작위적으로 선택한 대립유전자가 서로 상이한 것인 확률; 이형접합성(Heterozygosity): 모집단 중의 이형접합개체(heterozygous individuals)의 단순 비율; PIC, 다형성 정보 항목(polymorphism information content).
선발한 9 개 마커들의 SSR 좌위 당 평균 대립유전자 수(NA)는 7개였고, 최소 3개(VvSSR 01-2 마커)에서 최대 11개(VvSSR15-3 마커)에 이르렀다. 주요 대립 유전자 빈도(MAF)는 0.15 (VvSSR15-3 마커)에서 0.82 (VvSSR14-2 마커)에 이르기까지 다양했으며, 평균값은 0.42이었다. 이형접합도(Heterozygosity)는 0.35 (VvSSR02-3, VvSSR12-1, VvSSR14-2 마커)에서 0.71 (VvSSR07-1 마커)의 범위를 보였고, 평균값은 0.50이었다. 다형성 정보 함유량(PIC)은 0.30 (VvSSR14-2 마커)에서 0.88 (VvSSR15-3 마커)의 범위를 보였고, 평균값은 0.68이었다.
계통수 분석 결과, 본 발명에 사용된 9개 다형성 핵 SSR 마커는 변별력이 높은 마커로써 교배 계통 간의 구분도 가능함을 볼 수 있었다[예, GW10 (Neo. K51 09-01) vs. GW11 (Neo. K51 09-03), GW6 (블랙아이) vs. GW7 (블랙썬), GW8 (BF.통53 09-03) vs. GW9 (BF.통53 09-05)]. 그러나 머루인 GW3과 GW4가 멀게 구분되는 점, RDA05 (MBA)의 위치가 왕머루 사이 교배종 사이에 구분되는 점 등은 다른 마커의 보완이 필요함을 보여준다.
2. 엽록체 SSR 마커 선발 및 분석
엽록체 유전체 다형성 구간 추출을 위해 Genbank annotation을 이용하여 엽록체 유전체의 gene, CDS, tRNA, rRNA, IRs region과 large, small single copy region (LSC, SSC)의 위치와 방향성을 확인하였고, phobos tandem repeat finder 프로그램을 이용하여 총 57개 (mono-repeat, 역위 부분, 대체 변이 일부 포함) 다형성 구간을 추출하였다. CDS에 포함되어 있는 InDel/SSR 영역이 6개, 나머지 51개는 IGS region에 포함되어 있는 InDel/SSR 영역이었다.
선별한 SSR 가용 영역에서 수정된 Primer Pro Perl pipeline에 있는 Prime3(version 2.3.6) 알고리즘을 이용하여 구간별로 PCR을 위한 프라이머(primer)를 2쌍씩 임의로 디자인하였고, 이 때 SSR locus 서열(LCB), self dimer 존재 여부, primer 길이, PCR product size 등을 고려하였다. 그 결과 포도 엽록체 유전체에서 총 12개의 SSR 좌위에서 다형성 탐색 프라이머를 디자인 할 수 있었다. 이들을 17개 시료에 대해 적용한 후 절편 분석(fragment analysis) 결과를 토대로, 엽록체 SSR을 총 5개 선발하였다. 이들에 대한 염기서열 정보는 표 5에 정리하였고, 유전좌위의 특징은 표 6에 정리하였다.
Locus Primer sequence (5' to 3')
(Forward sequence/ Reverse sequence) 		Region Amplicon
size (bp)
Vi-cp2 TGTAAAACGACGGCCAGTCTAATTTCGTCGGCTCGGAT (서열번호 19) atpF CDS 230
/ ACAACGGGTTTTGCAACAAG (서열번호 20)
Vi-cp8 TGTAAAACGACGGCCAGTTCGAGAACCGCCTAAAGTTC (서열번호 21) psbT CDS 120
/ TTTGAGGAACACGGGGACTA (서열번호 22)
Vi-cp9 TGTAAAACGACGGCCAGTCGCTTCAAAGTGAATTCTCCC (서열번호 23) petD , rpoA 295
/ GCCTCAAAAGGTCCAATATACATAC (서열번호 24)
Vi-cp11 TGTAAAACGACGGCCAGTCCCGCCTTCAATCTAATCGA (서열번호 25) ndhF , trnL - UAG 295
/ TCGTTAGGATTTTCGTTGGGT (서열번호 26)
Vi-cp12 TGTAAAACGACGGCCAGTGAGTGGTGGGATCGTTGTTT (서열번호 27) psbM , trnD - GUC 230
/ CCGGGAGCACATACACAAAT (서열번호 28)
Locus SS N OBS Availability N O M AF N A GD Heterozygosity PIC
Vi-cp2 17 17 1 4 0.47 3 0.64 0.18 0.57
Vi-cp8 17 17 1 4 0.41 4 0.67 0.06 0.60
Vi-cp9 17 17 1 3 0.47 3 0.62 0.00 0.55
Vi-cp11 17 17 1 3 0.74 3 0.40 0.47 0.34
Vi-cp12 17 17 1 5 0.47 4 0.58 0.24 0.49
Mean 17 17 1 3.8 0.51 3.4 0.58 0.19 0.51
SS, 샘플 크기(sample size); NOBS, 관측치(number of observations); 가용성(Availability): 1-OBS/n, OBS는 관측수, n은 개별 샘플수; NG, 유전형의 수(Genotype number); MAF, 주요 대립형질 빈도(major allele frequency); NA, 대립형질의 수(number of alleles); GD, 유전적 다형성(genetic diversity). 종종 기대 이형접합성(heterozygosity)으로 언급되는 GD는 모집단으로부터 무작위적으로 선택한 대립유전자가 서로 상이한 것인 확률; 이형접합성(Heterozygosity): 모집단 중의 이형접합개체(heterozygous individuals)의 단순 비율; PIC, 다형성 정보 항목(polymorphism information content).
선발한 5 개 마커들의 SSR 좌위 당 대립유전자 수(NA)는 3~4개 였고, 평균 대립유전자 수는 3.4개였다. 주요 대립 유전자 빈도(MAF)는 0.41 (Vi-cp8 마커)에서 0.74 (Vi-cp11 마커)의 범위였으며, 평균값은 0.51이었다. 다형성 정보 함유량(PIC)은 0.34 (Vi-cp11 마커)에서 0.60 (Vi-cp2 마커)의 범위를 보였고, 평균값은 0.51이었다.
계통수 분석 결과, 본 발명에 사용된 5개 엽록체 SSR 마커는 모계를 구분할 수 있는 마커로서 이들을 머루 등의 자원에 적용하면 청산(GW01)이나 청풍(GW02)과 같은 왕머루 품종은 구분되지 않았고, 근연 교배 품종인 블랙 아이(GW06)나 블랙 썬(GW07) 품종을 구분할 수 없었다. 반대로 근연 교배 품종이거나 모·부본이 너무 멀게 구분되기도 했다 [예, GW10 (Neo. K51 09-01) vs. GW11 (Neo. K51 09-03), GW8 (BF.통53 09-03) vs. GW9 (BF.통53 09-05)]. 따라서 이들은 머루 자원구분에 단독으로 사용하는 것이 아니라 핵 SSR 마커와 조합하여 세트로 사용하는 것이 필요함을 보여주었다.
3. 9개 핵 SSR 및 5개 엽록체 SSR 세트를 이용한 머루 자원의 구분
9개 핵 SSR 마커와 5개 엽록체 SSR마커를 머루를 포함한 관련 자원 및 품종 17 종류에 적용한 결과는 도 4와 같다. 유전적 유사도 매트릭스를 토대로 UPGMA 계통수를 작성하였다. 계통수 분석 결과, 본 발명에 사용된 9개 다형성 핵 SSR 마커는 변별력이 높은 마커로써 교배 계통 간의 구분도 가능함을 볼 수 있었다[예, GW10 (Neo. K51 09-01) vs. GW11 (Neo. K51 09-03), GW6 (블랙아이) vs. GW7 (블랙썬), GW8 (BF.통53 09-03) vs. GW9 (BF.통53 09-05)]. 또한 교배 모본인 MBA와 Buffalo도 교배 자손과 유연관계를 확인할 수 있었다. 이들의 총 유전좌위의 특징은 표 7에 정리하였고, 각 genotype 별 증폭절편의 크기는 표 8에 정리하였다.
Locus SS N OBS Availability N O M AF N A GD Heterozygosity PIC
VvSSR01-2 17 17 1 3 0.68 3 0.47 0.53 0.40
VvSSR02-3 17 17 1 11 0.29 9 0.84 0.35 0.82
VvSSR06-2 17 17 1 12 0.26 10 0.84 0.47 0.82
VvSSR07-1 17 17 1 9 0.35 6 0.78 0.71 0.75
VvSSR10-2 17 17 1 10 0.41 8 0.77 0.59 0.75
VvSSR12-1 17 17 1 7 0.44 4 0.69 0.35 0.63
VvSSR14-2 17 17 1 5 0.82 5 0.31 0.35 0.30
VvSSR15-3 17 17 1 16 0.15 11 0.89 0.65 0.88
VvSSR18-2 17 17 1 9 0.38 7 0.78 0.53 0.76
Vi-cp2 17 17 1 4 0.47 3 0.64 0.18 0.57
Vi-cp8 17 17 1 4 0.41 4 0.67 0.06 0.60
Vi-cp9 17 17 1 3 0.47 3 0.62 0.00 0.55
Vi-cp11 17 17 1 3 0.74 3 0.40 0.47 0.34
Vi-cp12 17 17 1 5 0.47 4 0.58 0.24 0.49
Mean 17 17 1 7.21 0.45 5.71 0.66 0.39 0.62
SS, 샘플 크기(sample size); NOBS, 관측치(number of observations); 가용성(Availability): 1-OBS/n, OBS는 관측수, n은 개별 샘플수; NG, 유전형의 수(Genotype number); MAF, 주요 대립형질 빈도(major allele frequency); NA, 대립형질의 수(number of alleles); GD, 유전적 다형성(genetic diversity). 종종 기대 이형접합성(heterozygosity)으로 언급되는 GD는 모집단으로부터 무작위적으로 선택한 대립유전자가 서로 상이한 것인 확률; 이형접합성(Heterozygosity): 모집단 중의 이형접합개체(heterozygous individuals)의 단순 비율; PIC, 다형성 정보 항목(polymorphism information content).
Figure 112019006420501-pat00001
즉, 본 발명 마커세트를 사용하여 4종의 국내 자생머루와 6종의 머루 유전 육종 자원, 육종에 사용된 2개의 포도 품종이 포함된 총 17개 시료에 적용하였을 때 모두 잘 구분되었다. 본 발명의 마커세트는 국내 자생 머루 및 근연 교배 머루 품종의 구분이나 머루 자원의 도입 시 자원의 중복여부 판별, 그리고 머루 교배육종 프로그램에서 품종을 구분하는데도 유용하게 이용할 수 있을 것이다.
<110> THE CATHOLIC UNIVERSITY OF KOREA INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> SSR molecular markers for discriminating Korean wild grape accessions and uses thereof <130> ADP-2019-0002 <150> KR 10-2018-0166989 <151> 2018-12-21 <160> 28 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 atagccacgt tgtgtcctgc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gttgcacaat tagcgcacca 20 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ccgccaacca ccattgact 19 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ctgcctctgc tcttcctgat 20 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 acaggtggtt cttccttgtc t 21 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 cgcacataag atatcacatc aacac 25 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ggtcgatgtc cactgtgtcc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gccacggaat cagctcttct 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 gctcatgcct tgctgcttag 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 ccacaggcaa caacattccg 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 actgattctg aaccgaggcg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 ccagaccagg agaacatgcc 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 ggaagcagca ggaggatcag 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 gttctcgtac cggcttggag 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 gaaggacggc tggaaggtta 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 atcaacacac acggaggagt 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 acatgcaagt caccagaagg 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 gaacctgacc agacacagca 20 <210> 19 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 tgtaaaacga cggccagtct aatttcgtcg gctcggat 38 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 acaacgggtt ttgcaacaag 20 <210> 21 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 tgtaaaacga cggccagttc gagaaccgcc taaagttc 38 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 tttgaggaac acggggacta 20 <210> 23 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 tgtaaaacga cggccagtcg cttcaaagtg aattctccc 39 <210> 24 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 gcctcaaaag gtccaatata catac 25 <210> 25 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 tgtaaaacga cggccagtcc cgccttcaat ctaatcga 38 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 tcgttaggat tttcgttggg t 21 <210> 27 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 tgtaaaacga cggccagtga gtggtgggat cgttgttt 38 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 ccgggagcac atacacaaat 20

Claims (7)

  1. 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 11 및 서열번호 12로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 13 및 서열번호 14로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 15 및 서열번호 16으로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 17 및 서열번호 18로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 19 및 서열번호 20으로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 21 및 서열번호 22로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 23 및 서열번호 24로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 25 및 서열번호 26으로 표시되는 프라이머 세트 및 서열번호 27 및 서열번호 28로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는, 청산, 청풍, 머루(GW 05), 머루(GW 07), 새머루(GW 10), 블랙아이, 블랙썬, BF.통53 09-03, BF.통53 09-05, Neo. K51 09-01, Neo. K51 09-03, 왕머루 및 까마귀머루로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 머루 품종 구별용 프라이머 세트.
  2. 제1항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 단순 반복 염기 서열(Simple sequence repeat; SSR) 마커 증폭용 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는 머루 품종 구별용 프라이머 세트.
  3. 제1항에 따른 머루 품종 구별용 프라이머 세트를 포함하는, 청산, 청풍, 머루(GW 05), 머루(GW 07), 새머루(GW 10), 블랙아이, 블랙썬, BF.통53 09-03, BF.통53 09-05, Neo. K51 09-01, Neo. K51 09-03, 왕머루 및 까마귀머루로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 머루 품종 구별용 키트.
  4. 제3항에 있어서, 상기 키트는 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 머루 품종 구별용 키트.
  5. (1) 머루에서 DNA를 분리하는 단계;
    (2) 상기 분리된 DNA를 주형으로 하고, 제1항에 따른 머루 품종 구별용 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭을 수행하는 단계; 및
    (3) 상기 PCR 증폭 산물을 분석하는 단계를 포함하는, 청산, 청풍, 머루(GW 05), 머루(GW 07), 새머루(GW 10), 블랙아이, 블랙썬, BF.통53 09-03, BF.통53 09-05, Neo. K51 09-01, Neo. K51 09-03, 왕머루 및 까마귀머루로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 머루 품종 구별 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 PCR 증폭을 수행하는 단계는 단순 반복 염기 서열(Simple sequence repeat; SSR) 마커를 증폭하기 위한 것을 특징으로 하는 머루 품종 구별 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 PCR 증폭 산물 분석은 젤 전기영동, 모세관 전기영동, DNA 칩, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 머루 품종 구별 방법.
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112481406A (zh) * 2020-12-04 2021-03-12 新疆农业科学院园艺作物研究所 一种基于ssr标记的木纳格葡萄种质资源亲缘鉴定方法
CN113684307A (zh) * 2021-09-30 2021-11-23 河南科技大学 与葡萄早熟性状相关的snp分子标记、引物对、试剂盒和应用
CN117887894A (zh) * 2024-03-14 2024-04-16 南京农业大学三亚研究院 一种葡萄品种的鉴定方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20130102032A (ko) * 2013-09-06 2013-09-16 대한민국(농촌진흥청장) 포도 품종 판별용 scar 프라이머 세트 및 이를 이용한 포도 품종 판별 방법
KR20150056407A (ko) * 2013-11-15 2015-05-26 대한민국(농촌진흥청장) 포도 대목 품종 판별 연관 snp 분자마커 및 이의 용도
KR20160060384A (ko) * 2014-11-20 2016-05-30 대한민국(국립종자원장) 초위성체 마커를 이용한 배 품종식별 방법
KR101834774B1 (ko) 2016-11-18 2018-03-07 대한민국 포도 품종 판별용 snp 마커 및 이의 용도

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20130102032A (ko) * 2013-09-06 2013-09-16 대한민국(농촌진흥청장) 포도 품종 판별용 scar 프라이머 세트 및 이를 이용한 포도 품종 판별 방법
KR20150056407A (ko) * 2013-11-15 2015-05-26 대한민국(농촌진흥청장) 포도 대목 품종 판별 연관 snp 분자마커 및 이의 용도
KR20160060384A (ko) * 2014-11-20 2016-05-30 대한민국(국립종자원장) 초위성체 마커를 이용한 배 품종식별 방법
KR101834774B1 (ko) 2016-11-18 2018-03-07 대한민국 포도 품종 판별용 snp 마커 및 이의 용도

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Francesco Emanuelli et al., BMC Plant Biology, 13:39, 2013. *
M. Gupta et al., Theor. Appl. Genet., 89, p.998-1006, 1994. *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112481406A (zh) * 2020-12-04 2021-03-12 新疆农业科学院园艺作物研究所 一种基于ssr标记的木纳格葡萄种质资源亲缘鉴定方法
CN112481406B (zh) * 2020-12-04 2024-03-26 新疆农业科学院园艺作物研究所 一种基于ssr标记的木纳格葡萄种质资源亲缘鉴定方法
CN113684307A (zh) * 2021-09-30 2021-11-23 河南科技大学 与葡萄早熟性状相关的snp分子标记、引物对、试剂盒和应用
CN113684307B (zh) * 2021-09-30 2024-03-26 河南科技大学 与葡萄早熟性状相关的snp分子标记、引物对、试剂盒和应用
CN117887894A (zh) * 2024-03-14 2024-04-16 南京农业大学三亚研究院 一种葡萄品种的鉴定方法

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