KR102051457B1 - 신규한 snp 마커 및 이를 이용한 밤나무 품종 선별 - Google Patents

신규한 snp 마커 및 이를 이용한 밤나무 품종 선별 Download PDF

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Abstract

본 발명에서는 신규한 SNP 마커 및 이를 이용한 밤나무 품종 선별용 조성물, 상기 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 조성물, 상기 SNP 마커를 포함하는 마이크로 어레이, 상기 조성물을 포함하는 대립성 밤을 생산하는 밤나무 품종 선별용 키트, 및 대립성 밤을 생산하는 밤나무 품종의 선별 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 신규 SNP 마커, 조성물, 및 이를 포함하는 마이크로 어레이 또는 키트를 이용하면, 과실 크기에 대한 우량개체 즉, 대립성 밤을 생산하는 밤나무 품종(유전자형)을 용이하면서도 신속하고 정확하게 선별할 수 있다. 뿐만아니라 이와 같이 선별된 밤나무 품종(유전자형)을 이용하여 밤나무의 우량목 육종 및 품종개량이 가능하다.

Description

신규한 SNP 마커 및 이를 이용한 밤나무 품종 선별{Novel SNP markers and selecting Castanea cultivar producing big chestnuts by using them}
본 발명은 신규한 SNP 마커 및 이를 이용한 밤나무 품종 선별에 관한 것으로, 더 상세하게는 대립성(大粒性) 밤을 생산하는 밤나무 품종 선별용 SNP(single nucleotide polymorphism) 마커 조성물, 상기 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 조성물, 상기 SNP 마커를 포함하는 마이크로 어레이, 상기 조성물을 포함하는 대립성 밤을 생산하는 밤나무 품종 선별용 키트, 및 대립성 밤을 생산하는 밤나무 품종의 선별 방법에 관한 것이다.
밤나무는 참나무과(Fagaceae) 밤나무속(Castanea)의 낙엽활엽성 교목으로 원산지는 아시아, 유럽, 북아메리카, 북아프리카 등 4개 대륙에 걸쳐 있으며, 북반구의 온대지역의 야산에 널리 분포, 자생하고 있다. 전세계에 분포하는 밤나무 종류는 학자의 견해에 따라 약간의 차이가 있지만 10여종이 분포한다.
우리나라에서 밤은 예로부터 관혼상제에 빠져서는 안 되는 중요한 과일로 영양가도 풍부하여 식량 대용자원 및 기호식품으로 널리 재배되어온 대표적인 구황식품의 하나이다. 밤은 독특한 향과 단맛이 있어 날로 또는 삶아서 먹거나 구워 먹으며, 각종 요리에 첨가하기도 하고, 감로자, 마론그랏세(marrons glaces), 밤양갱 등의 가공원료 및 빵이나 과자 등의 제과원료로도 많이 사용되어 실제 그 이용범위가 아주 넓다. 또 밤은 농가소득을 올리는 농산촌의 주요 소득 작목으로 임산물 중 1위의 수출품목이다. 따라서 다양한 소비자의 기호에 적합한 고품질의 세계적인 브랜드의 밤나무 품종을 육종한다면 밤 산업의 국제경쟁력을 높이는 데 일조를 할 수 있다.
밤나무는 농작물과는 달리 생장기간이 길어 품종선택이 경영상에 미치는 영향이 지대하므로 우량품종의 선별이 매우 중요하다.
최근 SSR(simple sequence repeat), RAPD(random amplified polymorphic DNAs), RFLP(restriction fragment length polymorphism), SNP(single nucleotide polymorphisms), AFLP(amplified fragment length polymorphism) 등 분자마커를 이용한 동식물의 품종 선별 기술이 대두되고 있다. 그 중에서 SNP는 여러 분자마커 중 종내 또는 개체별 유전적인 변이를 가장 잘 나타낼 수 있는 분자마커이며, 목본류의 품종 선별에도 활용되고 있으나, 작물과 같은 초본류에 비하면 활발하지 않은 편이며, 그 일례로서 등록특허 제1409012호는 소나무류 구별용 SNP 프라이머, 이를 포함하는 키트 및 이를 이용한 소나무 구별방법을 개시하고 있는 정도이다.
따라서 대립성(밤알의 중량이 큰) 밤을 생산하는 밤나무와 같은 우량 품종을 선별할 수 있는 SNP 마커의 발굴의 필요성이 높아지고 있는 실정이다.
이에 본 발명자들은 종래 기술에서의 요구에 부응하기 위해 지속적으로 연구한 결과, 밤나무 과실인 밤 크기와 관련된 신규한 SNP들을 발굴하고, 이들을 이용하여 밤 크기에 대한 우량 품종을 선별할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 대립성(大粒性) 밤을 생산하는 밤나무 품종의 선별용 SNP 마커 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 대립성 밤을 생산하는 밤나무 품종의 판별용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 대립성 밤을 생산하는 밤나무 품종의 판별용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 SNP 마커 또는 이의 cDNA를 포함하는 대립성 밤을 생산하는 밤나무 품종의 판별용 마이크로 어레이를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 SNP 마커를 이용하여 대립성 밤을 생산하는 밤나무 품종을 선별하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 7의 염기서열로 이루어진 다형성 폴리뉴클레오티드로부터 선택되는 어느 하나의 다형성 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 다형성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 대립성 밤을 생산하는 밤나무 품종의 선별용 SNP 마커 조성물을 제공한다.
상기 SNP 마커 조성물은 바람직하게는, 서열번호 1로 이루어진 염기서열에서 SNP 위치인 173번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 다형성 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 다형성 폴리뉴클레오티드; 또는
서열번호 2로 이루어진 염기서열에서 SNP 위치인 172번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 다형성 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 다형성 폴리뉴클레오티드; 또는
서열번호 3으로 이루어진 염기서열에서 SNP 위치인 362번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 다형성 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 다형성 폴리뉴클레오티드; 또는
서열번호 4로 이루어진 염기서열에서 SNP 위치인 244번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 다형성 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 다형성 폴리뉴클레오티드; 또는
서열번호 5로 이루어진 염기서열에서 SNP 위치인 123번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 다형성 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 다형성 폴리뉴클레오티드; 또는
서열번호 6으로 이루어진 염기서열에서 SNP 위치인 460번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 다형성 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 다형성 폴리뉴클레오티드; 또는
서열번호 7로 이루어진 염기서열에서 SNP 위치인 160번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 다형성 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 다형성 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
상기 서열번호 1 내지 7은 각각의 SNP 부위를 포함하는 다형성 폴리뉴클레오티드이다.
본 발명에서 '다형성 폴리뉴클레오티드'는 폴리뉴클레오티드 서열 중에 SNP를 나타내는 다형성 부위(polymorphic site)를 포함하는 서열을 말한다.
본 발명에 따른 SNP 마커에서 상기 SNP (다형성 염기) 정보(위치/종류)는 도 3에 나타낸 바와 같다.
본 발명에서 '대립성(大粒性)'은 밤나무의 과실인 밤의 중량이 큰 것을 말하는 것으로 통상적으로 19g 이상인 것을 말한다. 반대로 '소립성'은 밤의 중량이 작은 것으로 통상적으로 5g 이하인 것을 말한다.
본 발명의 실시예에 의하면, 대립성 또는 소립성 밤을 생산하는 밤나무 42 품종을 대상으로 NGS(Next Generation Sequencing) 방법을 이용하여 전사체 염기서열 분석 및 비교를 통해, 대립성 품종 그룹과 소립성 품종 그룹을 식별할 수 있는 7가지 SNP를 확인하였으며, 하기 표 4에 나타낸 바와 같이, 대립성 품종과 소립성의 품종 간에는 특이적인 염기변이가 존재함을 확인하였다 (도 3).
본 발명은 또한 상기 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 대립성 밤을 생산하는 밤나무 품종의 선별용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 'SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제'란, 상기와 같은 유전자의 다형성 부위를 증폭을 통해 확인하여 대립성 밤을 생산하는 밤나무 품종(유전자형)을 선별할 수 있는 조성물을 의미하며, 바람직하게는 상기 SNP 마커의 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머(primer)를 의미한다.
상기 SNP 마커 증폭에 사용되는 프라이머는, 적절한 버퍼 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드가 될 수 있는데, 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드이다. 상기 프라이머 서열은 상기 SNP 마커와 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 상기 SNP 마커와 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 하고, 바람직하게는 서열번호 8 내지 13으로 구성된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 조성물은 또한, 증폭 반응을 수행하기 위한 시약과 조합되어 대립성 밤을 생산하는 밤나무 품종의 선별용 키트로서 제공될 수 있다. 본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다.
또한 본 발명은 서열번호 1 내지 7의 염기서열의 SNP 다형성 폴리뉴클레오티드, 이에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 이의 cDNA를 포함하는 대립성 밤을 생산하는 밤나무 품종의 선별용 마이크로 어레이를 제공한다.
바람직하게는, 상기 다형성 폴리뉴클레오티드는 아미노-실란, 폴리-L-라이신 또는 알데히드의 활성기가 코팅된 기판에 고정될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 상기 기판은 실리콘 웨이퍼, 유리, 석영, 금속 또는 플라스틱일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 다형성 폴리뉴클레오티드를 기판에 고정화시키는 방법으로는 피에조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting) 법, 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 마이크로어레이는 본 발명에 따른 다형성 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 다형성 폴리뉴클레오티드, 그에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 그의 cDNA를 이용하여 본 분야의 당업자에게 알려져 있는 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명은 또한,
(a) 개체로부터 분리된 시료의 DNA로부터 상기 SNP 마커 부위를 증폭시키는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 증폭된 SNP 마커 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 대립성 밤을 생산하는 밤나무 품종의 선별 방법을 제공한다.
상기에서 SNP 마커는 본 발명에 따른 신규한 SNP 마커를 의미한다.
본 발명의 용어 '개체'란, 과실인 밤의 대립성 여부를 확인하고자 하는 대상인 밤나무를 의미하며, 상기 밤나무로부터 얻어진 검체를 이용하여, 상기 SNP 마커의 유전자형을 분석함으로써 상기 대립성 여부를 판단할 수 있다.
상기 (a) 단계의 DNA 시료로부터 폴리뉴클레오티드를 증폭하는 단계는 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용가능하다. 예를 들면, 표적 핵산을 PCR을 통하여 증폭하고 이를 정제하여 얻을 수 있다. 그 외 리가제 연쇄 반응(LCR), 전사증폭 및 자가유지 서열 복제 및 핵산에 근거한 서열 증폭(NASBA)이 사용될 수 있다.
바람직하게는 (a) 단계에서 증폭은 서열번호 8 내지 13으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열(프라이머)를 사용하여 행하여질 수 있고, 가장 바람직하게는 서열번호 8 및 9, 서열번호 10 및 11, 서열번호 12 및 13으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 프라이머 세트를 사용하여 행할 수 있다.
상기 (b)단계의 증폭된 SNP 마커 부위의 염기를 결정하는 방법은 시퀀싱 분석, 마이크로 어레이에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR, 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(DASH), PCR 연장 분석, PCR-SSCP, PCR-RFLP 분석, HRM 분석 또는 TaqMan 기법, SNPlex 플랫폼, 미니-시퀀싱(mini-sequencing) 방법, Bio-Plex 시스템, CEQ and SNPstream 시스템(Beckman), Molecular Inversion Probe 어레이 기술(예를 들면, Affymetrix GeneChip), 및 BeadArray Technologies(예를 들면, Illumina GoldenGate 및 Infinium 분석법) 등을 이용하여 수행될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에 따른 신규 SNP 마커 조성물, 프라이머, 및 이를 포함하는 마이크로 어레이 또는 키트를 이용하면, 과실 크기에 대한 우량개체 즉, 대립성 밤을 생산하는 밤나무 품종(유전자형)을 용이하면서도 신속하고 정확하게 선별할 수 있다. 뿐만아니라 이와 같이 선별된 밤나무 품종(유전자형)을 이용하여 밤나무의 우량목 육종 및 품종개량이 가능하다.
도 1은 본 발명에 따른 SNP들의 발굴 과정을 보여주는 개요도이다.
도 2는 연관성 분석을 통한 SNP 선별 과정을 나타낸다.
도 3은 본 발명에 따른 7개 SNP 및 이를 포함하는 다형성 폴리뉴클레오티드들을 나타낸다.
도 4는 서열번호 1~7에 해당하는 SNP 좌위 뉴클레오티드 피크(nucleotide peak)를 보여주는 사진이다.
도 5a는 기계학습 모델을 이용한 밤나무 품종 판별 예측 결과를 나타내고, 도 5b는 대립성 품종(large)과 소립성 품종(small) 개체의 구분력 확인을 위한 PCA 분석 그래프이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 구체적인 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 보다 상세히 설명하기로 한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 보다 명확하게 이해시키기 위하여 예시한 것일 뿐이며, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 입중에 따른 밤나무 품종 샘플링
밤나무 과실 크기(입중)에 영향을 주는 유전적 요소를 판별할 수 있는 SNP 마커를 개발하기 위해 국내 야생종 밤나무를 포함한 다양한 품종의 밤나무 품종(유전자형) 42가지의 과실(밤)을 확보하였다.
구체적으로는, 표 1에 나타낸 바와 같이, 과실 1개체의 중량이 25g 이상의 대립성 밤나무 품종 21종과, 과실 1개체의 중량이 15g 이하의 소립성 밤나무 품종 21종을 대상으로 샘플링을 하였다.
Sample No. Large 품종 Weight
(g)		 Sample No. Small 품종 Weight
(g)
1 L1 추광 39.4 22 S1 매평조생 14.2
2 L2 암수2호 36.2 23 S2 창방감율 13.5
3 L3 장평 35.6 24 S3 광주조율 13.2
4 L4 광양B(GY-2) 31.7 25 S4 풍은 13.1
5 L5 상피 31.4 26 S5 광주2호 13
6 L6 대한 29.1 27 S6 대전율 12.8
7 L7 서명사4호 28.2 28 S7 일야춘 12.8
8 L8 공주1호 28.1 29 S8 광주3호 12.6
9 L9 미풍 27.3 30 S9 진주1호 11.8
10 L10 진주2호 27.3 31 S10 풍다마조생 11.3
11 L11 서명사 27.2 32 S11 옥비조생 11
12 L12 동농3호 27 33 S12 입원1호 10.7
13 L13 소포시2호 27 34 S13 북관 10.6
14 L14 서명사2호 26.8 35 S14 방사 10.3
15 L15 경제 26.7 36 S15 오십파 8.9
16 L16 광덕 26.7 37 S16 상면1호 8.8
17 L17 정월 26.7 38 S17 판율 7
18 L18 조율 26.6 39 S18 암수3호 8.9
19 L19 덕명 26.5 40 S19 소화광 5.4
20 L20 장광사 25.7 41 S20 장원 8.8
21 L21 부림 25.2 42 S21 함종율 4.8
표 1에 나열된 밤 과실은 경기도 화성시의 산림과학원 유전자원 보존림에 식재된 품종들이고, 수집한 밤 과실은 비닐팩에 담은 후 곧바로 액체질소에 넣은 후 얼리고, -70℃가 유지되는 초저온 냉동고에 보관하는 방법으로 샘플링하였다.
실시예 2: NGS ( Next Generation Sequencing )를 이용한 밤나무 품종의 유전체 변이( variation ) 분석
실시예 1에서 샘플링된 21종의 대립성 밤나무와 21종의 소립성 밤나무에 대한 품종별 RNA 염기서열 분석을 NGS(Next Generation Sequencing) 방법을 이용하여 수행하였다. 라이브러리 제작을 위해 Illumina TruSeq RNA Sample Prep Kit을 사용하여 Hiseq2500 기반으로 RNA 염기서열 분석을 진행하였다. 1ug의 total RNA 를 사용하였고, 그 중 polyA를 갖는 mRNA를 선별하여 절편화하였다. 절편화된 mRNA는 상보적 염기서열을 가지는 cDNA로 역전사 하였으며, 역전사된 cDNA 라이브러리를 가지고 2x101bp paired-end 시퀀싱을 수행하였다.
그리고 나서 표 2와 같은 알려진 중국산 밤나무 Castanea mollisima의 유전체 염기서열을 표준 유전체(reference genome)로 하여, 각 개체별 유전체 맵핑을 수행하였다.
Castanea mollissima (Chinese strain)
Genome size 794 Mbp
Contig 수 　41,260
N50 39.6 kb
유전자 수 　36,478
Tree Genet. Genomes 1-15 (2013)
맵핑 결과, 표 3에 나타낸 바와 같이, 총 3,271,142 SNP와 216,733 Indel 을 탐색하였고, 개체별 평균 SNP는 745,577개, 삽입(insertion) 및 결실(deletion)은 각 37,016개와 44,499개 확인되었다.
　 SNPs Insertions Deletions TsTv
Average 745,577.07 37,016.12 44,499.55 1.42
SD 159,919.05 8,426,30 9,741.06 0.05
Max 1,031,080.00 50,474.00 60,610.00 1.47
Min 390,201.00 18,173.00 23,173.00 1.28
실시예 3: SNP 선발 및 필터링 ( filtering )
실시예 2에서 확인된 SNP들을 대상으로 도 1에 도시된 바와 같이 SNP를 선발 및 필터링하였다.
구체적으로는 각 품종별 변이를 Genome Analysis Toolkit(GATK ver 3.1) 프로그램의 UnifiedGenotyper를 통해 산출하였으며, 모든 변이는 depth >=2, mapping quality >=40 의 조건을 만족하는 것만 분석에 사용하였다. 변이를 이용한 집단 분석을 위해 snfEFF (ver. 4.3)을 이용하여 변이유형을 분석하였고, 745,577개 SNP 중에서 다양성이 높으며 genotyping 비율이 높은 high quality SNP 397,059개를 선발하여 이후 분석에 이용하였다.
선발된 high quality SNP를 대상으로 표현형에 대한 연관성 분석(association analysis)을 위해서 PLINK1.9 프로그램을 사용하였다. 각 품종별 표현형은 집단을 기준으로 크고 작은 두 집단으로 구분되는 case-control과, 품종별 중량을 바탕으로 하는 quantitative model로 분석하였다.
그리고 나서, 도 2에 나타낸 바와 같이, 연관성 분석에 의해 선발된 마커들은 각 마커별 집단 구분력의 신뢰도(association p_value)를 기준으로 순차적으로 0.05, 0.01, 0.005, 0.001, 0.00001 이하에 해당하는 마커들로 선별하였고, PCA 분석을 통해 구분력을 확인하였다. 최종적으로, 대립성과 소립성 품종의 구분에 유용할 것으로 판단되는, FDR<1.0-e5의 신뢰도의 set J에 해당하는 21개의 SNP를 선발하였고, 그 중에서 프라이머의 중복성이 있는 7개의 SNP의 결과를 표 4에 나타내었다.
참조번호 SNP 대립성 소립성
1 53971 서열번호 1의 173번째 염기 A G
2 53970 서열번호 2의 172번째 염기 A G
3 66350 서열번호 3의 362번째 염기 A G
4 66232 서열번호 4의 244번째 염기 G A
5 66111 서열번호 5의 123번째 염기 C T
6 57473 서열번호 6의 460번째 염기 A G
7 57173 서열번호 7의 160번째 염기 G A
7개 SNP 지역을 PCR 분석하였고 각각의 SNP를 포함하는 다형성 폴리뉴클레오티드들의 염기서열을 서열번호 1 내지 7 및 도 3에 나타내었다.
실시예 4: 생어 시퀀싱(Sanger Sequencing)을 통한 SNP 검정
실시예 3에서와 같이 선발되고 확인된 7개의 SNP 부위별(다양성 부위별) 증폭이 가능하며, 또한 다양성 부위의 서열변이를 검출할 수 있는 프라이머(primer)를 Primer3 (ver.2.3.6)을 이용하여 제작하였다 (표 5).
참조
번호		 SNP 서열번호 Forward(5'-3')[서열번호] Reverse(5'-3')[서열번호]
53971 1 TCCAATGTTAGAACTGGCAGCT [8] CGGGGTCGAATTTTACTTGTGG [9]
53970 2
66350 3 TTTTTGGTGTAGGGTTTGCTGG [10] TACGACACCTCTTGAATTGGGG [11]
66232 4
66111 5
57473 6 GTATCTGAAGGGAATCTGGATGG [12] GGATCAGCTCCCGCAAATAGTA [13]
57173 7
제작된 서열번호 8 및 9, 서열번호 10 및 11, 서열번호 12 및 13의 프라이머 세트들 중에서 각 SNP에 적합한 프라이머 세트를 사용하여 상기 실시예 １에서의 샘플링된 샘플 이외의 새로운 25종의 대립성 밤나무 품종과 소립성 밤나무 품종의 유전자형별의 게놈 DNA에 대하여 각 SNP 지역을 PCR 분석하여 SNP 위치의 염기를 분석하였고, 그 결과(SNP 지노타이핑 결과)를 표 6 및 도 4 (SNP 좌위 nucleotide peak)에 나타내었다:
품종(입중g)/서열번호 1 2 3 4 5 6 7
대산(22.30) A A A G C A G
유마(19.1) A A A G C A G
화천12(19.7) A A A G C A G
대보(20.5) A A A G C A G
을종(21.3) A A A G C A G
만성(24.5) A A A G C A G
홍천16(12.3) G G G A T G A
강릉4(13.1) G G G A T G A
현리1(13.7) G G G A T G A
홍천22(14.2) G G G A T G A
박미1호(14.8) G G G A T G A
악옥(17) G G G A T G A
박미2호(18.6) G G G A T G A
정선13(7.5) G G G A T G A
구례15(7.8) G G G A T G A
홍천18(9.2) G G G A T G A
양구8(10) G G G A T G A
구례1(10.1) G G G A T G A
홍천23(10.3) G G G A T G A
구례9(10.4) G G G A T G A
하동9(10.4) G G G A T G A
정선11(10.8) G G G A T G A
구례8(11) G G G A T G A
울진10(11.1) G G G A T G A
울진12(11.7) G G G A T G A
표 6에 나타낸 바와 같이, 서열번호 1~7의 SNP 부위에 해당하는 염기 분석결과, 입중이 큰 대립중 품종인 대산, 유마, 화천 12, 대보, 을종, 만성 밤나무에서는 각각의 SNP 위치에 해당하는 다형성 염기 변이(SNV)가 존재함을 확인할 수 있고, 이에 비하여 입중이 적인 소립종 품종인 홍천 16, 강릉 4, 현리 1, 홍천 22, 박미1호, 악옥, 박미2호, 정선 13, 구례 15, 홍천 18, 양구 8, 구례 1, 홍천 23, 구례 9, 하동 9, 정선 11, 구례 8, 울진 10, 울진 12 밤나무에서는 각각의 SNP 위치에 해당하는 다형성 염기 변이가 존재하지 않음을 확인할 수 있었다. 따라서 상기 SNP들은 대립성 밤을 생산하는 밤나무 품종 선별용 마커로서 유용함을 알 수 있다.
실시예 5: 기계 학습을 이용한 표현형 판별 예측
본 발명에 따른 SNP들을 사용하여 기계학습(Machine learning) 모델로 밤나무 표현형 판별 예측 분석을 수행하였다.
구체적으로는 다섯 가지 기계학습 알고리즘(C5.0, KNN, PLS, RF, SVM)을 활용하였고, 샘플의 70% 유전형(품종, genotype) 정보를 학습세트로 사용하고, 나머지 30%는 예측정확도 판단을 위해 랜덤 샘플링(random sampling)하여 이용하였다. 이러한 과정은 100번 반복적으로 수행하여 일반화하였다. 높은 표현형 예측 정확도를 위해 실시예 １에서의 샘플링된 샘플 이외의 새로운 46가지 품종의 밤나무 과실을 이용하여 기계학습을 이용하여 표현형을 예측하였고 그 결과를 도 5a 및 5b에 나타내었다.
도 5a 및 5b에에 나타낸 바와 같이, 기계학습을 통한 표현형 예측결과 다섯 가지 알고리즘에서 대립종과 소립종으로 구분되는 예측 정확도가 최대 78.3%, 최소 69.6%를 보였으며 평균 70% 이상의 높은 확률로 확인되었다. 이러한 결과는 기계학습 모델을 이용한 표현형 예측이 밤나무 과실 크기에 관련된 SNP를 발굴 및 판별 예측에 효과적인 도구로 사용할 수 있음을 알 수 있다.
<110> National Institute of Forest Science <120> Novel SNP markers and selecting Castanea cultivar producing big chestnuts by using them <130> P-10247 <160> 13 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 455 <212> DNA <213> Castanea crenata <220> <221> variation <222> (173) <400> 1 tccaatgtta gaactggcag ctctagtgat tgtaggttgc actgaattat gcactttctt 60 cttaccaaaa caaacaccag tccacaagca ataaatcaca gtgcaaattc ccgcaaatcc 120 tccaatcgat cccacaatgc aaaaggccaa taaacccctt ctcaaaccct tgaatggtga 180 tgaagtcgat gagggggttg gtgaaggtac tggctgttgc gttgaacttc cattattaca 240 atccgaacaa ataatcccaa aaccagagca taatttctca gaatctagat actcaccaca 300 caaacaatta gattgatcca cacaaggacc tggaagaatc ttaggcaaag ataactcaac 360 cccagaactc aaattacctt cattaggcca cccgggtccc caacacataa tcgataaatc 420 gcccgtcttt aatccacaag taaaattcga ccccg 455 <210> 2 <211> 455 <212> DNA <213> Castanea crenata <220> <221> variation <222> (172) <400> 2 tccaatgtta gaactggcag ctctagtgat tgtaggttgc actgaattat gcactttctt 60 cttaccaaaa caaacaccag tccacaagca ataaatcaca gtgcaaattc ccgcaaatcc 120 tccaatcgat cccacaatgc aaaaggccaa taaacccctt ctcaaaccct tagatggtga 180 tgaagtcgat gagggggttg gtgaaggtac tggctgttgc gttgaacttc cattattaca 240 atccgaacaa ataatcccaa aaccagagca taatttctca gaatctagat actcaccaca 300 caaacaatta gattgatcca cacaaggacc tggaagaatc ttaggcaaag ataactcaac 360 cccagaactc aaattacctt cattaggcca cccgggtccc caacacataa tcgataaatc 420 gcccgtcttt aatccacaag taaaattcga ccccg 455 <210> 3 <211> 426 <212> DNA <213> Castanea crenata <220> <221> variation <222> (362) <400> 3 tttttggtgt agggtttgct ggtattgagt ttctgactct taaattcttg gtattggttt 60 ggaatatctt tctaggtaag agtggctggc agagtgagct tgtggaaagt ttcaccaagc 120 gatgcagaaa ggttatctgg attggcagtt ggtgactggg ttcggttgaa gcaatgtatg 180 ggaacacgac caaattatga atggaatagt gttgggagag acagtgtagc agtagtgcac 240 aacatacagg attactctta tttagagctg gtttcttgtt ttcgaacagg taggttcatt 300 gctcactgca ctgaagttga aaaggtttca ccctttaaaa ttgggcagca cgttaggttc 360 catactggat tgaaagaacc aagatggggg tggagagaag cttgccccaa ttcaagaggt 420 gtcgta 426 <210> 4 <211> 426 <212> DNA <213> Castanea crenata <220> <221> variation <222> (244) <400> 4 tttttggtgt agggtttgct ggtattgagt ttctgactct taaattcttg gtattggttt 60 ggaatatctt tctaggtaag agtggctggc agagtgagct tgtggaaagt ttcaccaagc 120 gatgcagaaa ggttatctgg attggcagtt ggtgactggg ttcggttgaa gcaatgtatg 180 ggaacacgac caaattatga atggaatagt gttgggagag acagtgtagc agtagtgcac 240 aacgtacagg attactctta tttagagctg gtttcttgtt ttcgaacagg taggttcatt 300 gctcactgca ctgaagttga aaaggtttca ccctttaaaa ttgggcagca cgttaggttc 360 cgtactggat tgaaagaacc aagatggggg tggagagaag cttgccccaa ttcaagaggt 420 gtcgta 426 <210> 5 <211> 426 <212> DNA <213> Castanea crenata <220> <221> variation <222> (123) <400> 5 tttttggtgt agggtttgct ggtattgagt ttctgactct taaattcttg gtattggttt 60 ggaatatctt tctaggtaag agtggctggc agagtgagct tgtggaaagt ttcaccaagc 120 gacgcagaaa ggttatctgg attggcagtt ggtgactggg ttcggttgaa gcaatgtatg 180 ggaacacgac caaattatga atggaatagt gttgggagag acagtgtagc agtagtgcac 240 aacatacagg attactctta tttagagctg gtttcttgtt ttcgaacagg taggttcatt 300 gctcactgca ctgaagttga aaaggtttca ccctttaaaa ttgggcagca cgttaggttc 360 cgtactggat tgaaagaacc aagatggggg tggagagaag cttgccccaa ttcaagaggt 420 gtcgta 426 <210> 6 <211> 589 <212> DNA <213> Castanea crenata <220> <221> variation <222> (460) <400> 6 gtatctgaag ggaatctgga tggtgttagg ttagtcaatt ttgatacaca ctcctttact 60 gtagtctata tgtatgcact taagaatcat tgtcattgtt cagaacctcc gatgtcttct 120 tctctgcata tgtagggatc tgcttgctaa gtctgcatca gggaataata gtagttcaat 180 catttctctg ctggaagcac ataattctga tggtcaaact gctctgcact tggcttgtag 240 acggggttgc cctcagattg ttgatgctat tttggagtat ggaaatgtgg atgtggatgt 300 ccctgatgaa aatgggaatc ctccaatagt gtttgcttta gcagttgggt cctcagaatg 360 tgtacgcgct ctcatcagaa aatcagctaa tgccatatct aggtcaatgg aaggctttgg 420 tcgatctgtt gctcatgttt gtgcatatta tgggcaacca gattgcatgc gtgtaagttt 480 tcacttagcc agtgatggtt taagagtact tactcctttt atattgcttc tatattttct 540 caaatgttcc atgacaatca caggaattac tatttgcggg agctgatcc 589 <210> 7 <211> 589 <212> DNA <213> Castanea crenata <220> <221> variation <222> (160) <400> 7 gtatctgaag ggaatctgga tggtgttagg ttagtcaatt ttgatacaca ctcctttact 60 gtagtctata tgtatgcact taagaatcat tgtcattgtt cagaacctcc gatgtcttct 120 tctctgcata tgtagggatc tgcttgctaa gtctgcatcg gggaataata gtagttcaat 180 catttctctg ctggaagcac ataattctga tggtcaaact gctctgcact tggcttgtag 240 acggggttgc cctcagattg ttgatgctat tttggagtat ggaaatgtgg atgtggatgt 300 ccctgatgaa aatgggaatc ctccaatagt gtttgcttta gcagttgggt cctcagaatg 360 tgtacgcgct ctcatcagaa aatcagctaa tgccatatct aggtcaatgg aaggctttgg 420 tcgatctgtt gctcatgttt gtgcatatta tgggcaaccg gattgcatgc gtgtaagttt 480 tcacttagcc agtgatggtt taagagtact tactcctttt atattgcttc tatattttct 540 caaatgttcc atgacaatca caggaattac tatttgcggg agctgatcc 589 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 8 tccaatgtta gaactggcag ct 22 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 9 cggggtcgaa ttttacttgt gg 22 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 10 tttttggtgt agggtttgct gg 22 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 11 tacgacacct cttgaattgg gg 22 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 12 gtatctgaag ggaatctgga tgg 23 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 13 ggatcagctc ccgcaaatag ta 22

Claims (8)

  1. 서열번호 1의 염기서열에서 SNP 위치인 173번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 다형성 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 다형성 폴리뉴클레오티드;
    서열번호 2의 염기서열에서 SNP 위치인 172번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 다형성 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 다형성 폴리뉴클레오티드;
    서열번호 3의 염기서열에서 SNP 위치인 362번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 다형성 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 다형성 폴리뉴클레오티드;
    서열번호 4의 염기서열에서 SNP 위치인 244번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 다형성 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 다형성 폴리뉴클레오티드;
    서열번호 5의 염기서열에서 SNP 위치인 123번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 다형성 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 다형성 폴리뉴클레오티드;
    서열번호 6의 염기서열에서 SNP 위치인 460번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 다형성 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 다형성 폴리뉴클레오티드; 및
    서열번호 7의 염기서열에서 SNP 위치인 160번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 다형성 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 다형성 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 대립성 밤을 생산하는 밤나무 품종 선별용 SNP 마커 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 서열번호 1의 173번째 염기는 아데닌(A), 서열번호 2의 172번째 염기는 아데닌(A), 서열번호 3의 362번째 염기는 아데닌(A), 서열번호 4의 244번째 염기는 구아닌(G), 서열번호 5의 123번째 염기는 시토신(C), 서열번호 6의 460번째 염기는 아데닌(A), 및 서열번호 7의 160번째 염기는 구아닌(G)인 것을 특징으로 하는 대립성 밤을 생산하는 밤나무 품종 선별용 SNP 마커 조성물.
  3. 제 1항에 따른 SNP 마커 조성물을 검출 또는 증폭할 수 있는 15 내지 30 뉴클레오티드 길이의 프라이머를 포함하는 대립성 밤을 생산하는 밤나무 품종 선별용 조성물.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 8 및 9, 서열번호 10 및 11, 및 서열번호 12 및 13의 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는 대립성 밤을 생산하는 밤나무 품종 선별용 조성물.
  5. 제 3항 또는 제 4항에 따른 조성물을 포함하는 대립성 밤을 생산하는 밤나무 품종 선별용 키트.
  6. 서열번호 1의 염기서열에서 SNP 위치인 173번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기; 서열번호 2의 염기서열에서 SNP 위치인 172번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기; 서열번호 3의 염기서열에서 SNP 위치인 362번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기; 서열번호 4의 염기서열에서 SNP 위치인 244번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기; 서열번호 5의 염기서열에서 SNP 위치인 123번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기; 서열번호 6의 염기서열에서 SNP 위치인 460번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기; 및 서열번호 7의 염기서열에서 SNP 위치인 160번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기를 각각 포함하는 다형성 폴리뉴클레오티드들, 또는 이들에 의해 코딩되는 폴리펩티드들 또는 이들의 cDNA들을 포함하는 대립성 밤을 생산하는 밤나무 품종 선별용 마이크로 어레이.
  7. a) 밤나무 품종으로부터 분리된 시료의 DNA로부터 SNP 마커 부위를 증폭시키는 단계; 및
    (b) 상기 (a) 단계의 증폭된 SNP 마커 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하고,
    상기 SNP 마커 부위는 서열번호 1의 염기서열에서 SNP 위치인 173번째 염기; 서열번호 2의 염기서열에서 SNP 위치인 172번째 염기; 서열번호 3의 염기서열에서 SNP 위치인 362번째 염기; 서열번호 4의 염기서열에서 SNP 위치인 244번째 염기; 서열번호 5의 염기서열에서 SNP 위치인 123번째 염기; 서열번호 6의 염기서열에서 SNP 위치인 460번째 염기; 및 서열번호 7의 염기서열에서 SNP 위치인 160번째 염기를 포함하는 것을 특징으로 하는 대립성 밤을 생산하는 밤나무 품종의 선별 방법.
  8. 제 7항에 있어서, (a) 단계에서 증폭은 서열번호 8 및 9, 서열번호 10 및 11, 및 서열번호 12 및 13의 프라이머 세트로 행하여지는 것을 특징으로 하는 대립성 밤을 생산하는 밤나무 품종의 선별방법.
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