KR102369297B1 - 싸리수염진딧물 저항성 또는 감수성 콩 자원 판별용 마커 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 콩의 싸리수염진딧물 저항성 또는 감수성 판별용 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 SNP 마커는 싸리수염진딧물 저항성 관련 유전자와 매우 높은 연관성을 가지고 있어 싸리수염진딧물 저항성 또는 감수성 콩 자원을 조기에 효율적으로 판별할 수 있다.

Description

싸리수염진딧물 저항성 또는 감수성 콩 자원 판별용 마커 및 이의 용도{Marker for discriminating foxglove aphid-resistant or sensitive soybean and uses thereof}
본 발명은 싸리수염진딧물 저항성 또는 감수성 콩 자원 판별용 마커 및 이의 용도에 관한 것이다.
콩(Glycine max)은 단백질 및 유(油) 자원, 가축 사료 및 생물 연료와 같은 용도로 세계적으로 널리 사용되는 주요 곡물 중 하나이다. 지난 20년간 콩 생산량이 현저히 증가했음에도 불구하고, 유해 동물, 병원균 및 바이러스에 의해 실제 수확량의 약 19% 정도의 손실이 있는 실정이며, 이러한 손실을 막기 위해 해충 저항성 콩의 개발이 필요하다.
반시목 해충인 콩 진딧물(soybean aphid, Aphis glycines Matsumura)은 북아메리카에서 재배하는 콩에 대하여 연간 약 58%의 수확량 손실, 그리고 약 24억 달러의 손실을 야기하는 경제적으로 상당히 중요한 해충이다. 콩 진딧물은 잎 아랫면에 서식하며, 콩의 잎에서 수액을 섭취하여 광합성의 손실을 가져오며 콩 모자이크 바이러스(soybean mosaic virus)를 전염시킨다. 주요 반시목 해충 중 하나인 싸리수염진딧물(Aulacorthum solani Kaltenbach)은 25개의 과(family)에서 95종(species)에 달하는 넓은 범위의 식물을 숙주로 하며, 최근에는 세계적으로 다양한 작물에 심각한 손상을 일으킨다. 싸리수염진딧물은 콩에서 전 세계적으로 상당한 양의 수확 손실을 일으키지만, 콩 진딧물을 효과적으로 제어하는 방법 측면에서 거의 연구된 바가 없다.
한편, 한국등록특허 제1878539호에 콩 7번 염색체의 5,497,330번째 염기에 존재하는 '콩의 싸리수염진딧물 저항성 염기다형성 마커 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 콩 7번 염색체의 7,096,343 내지 7,096,564번째 염기에 존재하는 '싸리수염진딧물 저항성 또는 감수성 콩 자원 판별용 마커 및 이의 용도'에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 PI366121(싸리수염진딧물 저항성)과 PI483463(싸리수염진딧물 감수성)을 교배하여 얻어진 F3 RIL(recombinant inbred line) 집단에 싸리수염진딧물을 접종한 후, 회피저항성 테스트(Choice test) 및 진정저항성 테스트(non-choice test)를 통해 접종엽에 대한 피해정도(primary leaf damage, PLD) 및 전체식물체 피해정도(total plant damage, TPD)을 측정하여 싸리수염진딧물 저항성 유전자가 단일 우성 유전자임을 확인하였다. 또한, PI366121(싸리수염진딧물 저항성), Williams 82(싸리수염진딧물 감수성) 및 이들의 F4:8 RIL 집단을 대상으로 SNP Chip을 활용하여 고밀도 유전자 지도를 작성한 후 Williams 82의 전체 시퀀스 정보(Williams82.a2.v1)와 비교하여, 7번 염색체 상의 AX-90462843과 AX-90334585 사이의 76 kbp 영역에서 싸리수염진딧물 저항성과 가장 밀접하게 연관된 Glyma.07g077700 유전자를 선별하였고, 상기 Glyma.07g077700 유전자의 엑손 5번 영역(7,096,343 내지 7,096,564 bp) 내에서 싸리수염진딧물 저항성 또는 감수성 콩 자원 간에 뚜렷한 차이를 보이는 SNP(single nucleotide polymorphism)를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열 중 50번째에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism); 서열번호 2의 염기서열 중 50번째에 위치한 SNP; 서열번호 3의 염기서열 중 51번째에 위치한 SNP; 서열번호 4의 염기서열 중 51번째에 위치한 SNP; 서열번호 5의 염기서열 중 51번째에 위치한 SNP; 및 서열번호 6의 염기서열 중 52번째에 위치한 SNP;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 SNP를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 콩(Glycine max)의 싸리수염진딧물 저항성 또는 감수성 판별용 마커를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 콩의 싸리수염진딧물 저항성 또는 감수성 판별용 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 싸리수염진딧물 저항성 또는 감수성 콩 판별용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 싸리수염진딧물 저항성 또는 감수성 콩 판별용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 콩 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 및 상기 기재된 서열번호 1 내지 6의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오드의 각 SNP 위치 염기인 다형성 부위의 유전자형을 결정하는 단계를 포함하는, 싸리수염진딧물에 대해 저항성 또는 민감성을 갖는 콩 품종을 판별하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명의 SNP 마커는 싸리수염진딧물 저항성 관련 유전자와 매우 높은 연관성을 가지고 있어 싸리수염진딧물 저항성 또는 감수성 콩 자원을 조기에 효율적으로 판별할 수 있으므로, 싸리수염진딧물에 대해 저항성을 가지는 콩을 육종하는데 소요되는 시간, 비용 및 노력을 절감하는데 매우 유용할 것으로 기대되며, 본 발명의 SNP 마커를 이용하여 육성한 싸리수염진딧물 저항성 콩 자원의 보급은 콩 재배 농가의 소득 창출에 기여할 수 있을 것이다.
도 1은 Williams 82(싸리수염진딧물 감수성)와 PI366121(싸리수염진딧물 저항성)을 교배하여 얻어진 F4:8 105계통의 RIL 집단의 유전자 지도에서 싸리수염진딧물 형질과 관련된 QTL(quantitative trait loci)의 위치를 보여준다. 상기 싸리수염진딧물 형질은 회피저항성 테스트(Choice test)에서의 접종엽에 대한 피해정도(primary leaf damage, PLD) 및 전체식물체 피해정도(total plant damage, TPD), 진정저항성 테스트(non-choice test)에서의 접종엽에 대한 피해정도(PLD) 및 전체식물체 피해정도(TPD)를 의미한다.
도 2는 Williams 82(싸리수염진딧물 감수성)와 PI366121(싸리수염진딧물 저항성)을 교배하여 얻어진 F4:8 105계통의 RIL 집단의 유전자 지도에서, 7번 염색체에 존재하는 싸리수염진딧물 저항성 관련 후보 유전자의 위치(Glyma.07g077000, Glyma.07g077100, Glyma.07g077200, Glyma.07g077300, Glyma.07g077400, Glyma.07g077500, Glyma.07g077600 및 Glyma.07g077700)와 최종 선발된 Glyma.07g077700 유전자의 엑손 5번에 존재하는 SNP 마커를 보여준다.
도 3은 Williams 82(싸리수염진딧물 감수성)와 PI366121(싸리수염진딧물 저항성)에 싸리수염진딧물을 접종한 후 Glyma.07g077700 유전자의 상대적 발현 수준을 비교한 RT-PCR 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열 중 50번째에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism); 서열번호 2의 염기서열 중 50번째에 위치한 SNP; 서열번호 3의 염기서열 중 51번째에 위치한 SNP; 서열번호 4의 염기서열 중 51번째에 위치한 SNP; 서열번호 5의 염기서열 중 51번째에 위치한 SNP; 및 서열번호 6의 염기서열 중 52번째에 위치한 SNP;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 SNP를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 콩(Glycine max)의 싸리수염진딧물 저항성 또는 감수성 판별용 마커를 제공한다.
본 발명의 마커에 있어서, 상기 연속된 뉴클레오티드는 8 내지 100개의 연속된 뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 용어 "뉴클레오티드"는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이며, 특별하게 다르게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오티드의 유사체를 포함한다.
본 발명에서, 용어 "다형성(polymorphism)"이란 같은 종의 생물이라도 모습이나 고유한 특징이 다양하게 나타나는 것 또는 하나의 유전자 좌(locus)에 두 가지 이상의 대립 유전자(allele)가 존재하는 경우를 말하며, 다형성 부위 중에서 개체에 따라 단일 염기만 다른 것을 "단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)"이라 한다.
본 발명의 마커가 콩에서 싸리수염진딧물 저항성 또는 감수성을 판별할 수 있는 것은 서열번호 1의 염기서열 중 50번째 염기가 G 또는 T로 다르게 나타나고, 서열번호 2의 염기서열 중 50번째 염기가 C 또는 A로 다르게 나타나고, 서열번호 3의 염기서열 중 51번째 염기가 T 또는 C로 다르게 나타나고, 서열번호 4의 염기서열 중 51번째 염기가 G 또는 C로 다르게 나타나고, 서열번호 5의 염기서열 중 51번째 염기가 T 또는 C로 다르게 나타나고, 서열번호 6의 염기서열 중 52번째 염기가 A 또는 C로 다르게 나타나는 것에 근거한 것이다.
보다 바람직하게는 서열번호 1의 50번째 염기가 G, 서열번호 2의 50번째 염기가 C, 서열번호 3의 51번째 염기가 T, 서열번호 4의 51번째 염기가 G, 서열번호 5의 51번째 염기가 T, 서열번호 6의 52번째 염기가 A인 경우에는 싸리수염진딧물 저항성으로 판단할 수 있으며; 서열번호 1의 50번째 염기가 T, 서열번호 2의 50번째 염기가 A, 서열번호 3의 51번째 염기가 C, 서열번호 4의 51번째 염기가 C, 서열번호 5의 51번째 염기가 C, 서열번호 6의 52번째 염기가 C인 경우에는 싸리수염진딧물 감수성으로 판단할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 콩의 싸리수염진딧물 저항성 또는 감수성 판별용 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 싸리수염진딧물 저항성 또는 감수성 콩 판별용 조성물을 제공한다.
상기 콩의 싸리수염진딧물 저항성 형질 판별용 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제는 콩의 싸리수염진딧물 저항성 형질 판별용 마커에 특이적인 프라이머 또는 프로브일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 용어 "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 "프로브(probe)"는 상보적인 단일가닥 표적서열과 혼성화하여 이중가닥 분자(혼성체)를 형성하는 단일가닥 핵산 서열을 말한다.
본 발명에서 SNP 마커에 결합 및 인식하는 프로브는 SNP를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 상보적인 서열을 포함하며, 이에 제한되지 않으나 DNA, RNA 또는 DNA-RNA 잡종(hybrid) 형태일 수 있다. 또한, 육안으로 인식가능하도록 하기 위해 프로브의 5' 또는 3' 말단에 형광 표지인자, 방사선 표지인자 등을 추가로 부착할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 콩의 싸리수염진딧물 저항성 또는 감수성 콩 판별용 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 싸리수염진딧물 저항성 또는 감수성 콩 판별용 조성물을 포함하는, 싸리수염진딧물 저항성 또는 감수성 콩 판별용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위해 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 키트는 또한 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 역전사 완충액 및 PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
본 발명의 키트는, 싸리수염진딧물 저항성 콩 판별용 조성물을 이용하여 본 발명에서 제공하는 SNP 마커의 염기를 검출하여 확인함으로써 싸리수염진딧물 저항성 또는 감수성 콩을 구분할 수 있다. 구체적으로 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, SNP 칩 키트 또는 마이크로어레이 칩 키트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 예로, 상기 RT-PCR 키트는 상기 SNP에 대한 특이적인 각각의 프라이머 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 디옥시뉴클레오타이드(dNTPs), 디디옥시뉴클레오타이드(ddNTPs), Taq폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.
또 다른 예로, 상기 마이크로어레이는 서열번호 1 내지 6의 염기서열로 이루어진 SNP 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하여 구성될 수도 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 싸리수염진딧물 저항성 또는 감수성 콩 자원 간에 다형성을 나타내는 SNP 염기를 포함하고 있으므로, 본 발명에 따른 마이크로어레이는 싸리수염진딧물 저항성 또는 감수성 콩 자원 또는 품종을 판별하는데 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명은 또한,
콩 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 및
상기 기재된 서열번호 1 내지 6의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오드의 각 SNP 위치 염기인 다형성 부위의 유전자형을 결정하는 단계를 포함하는, 싸리수염진딧물에 대해 저항성 또는 민감성을 갖는 콩 품종을 판별하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 다형성 부위의 유전자형을 결정하는 단계는 상기 콩의 싸리수염진딧물 저항성 형질 판별용 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 싸리수염진딧물 저항성 콩 판별용 조성물을 이용하여 수행될 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 식물 재료
본 발명에서 사용된 PI366121, Williams 82, PI96983 및 26개의 콩 자원(갈채, 단백, 대원, 대풍, 대흑, 방사, 새단백, 소명, 소호, 신화, 연풍, 우람, 일품검정, 조생서리, 천알, 청자, 청자3호, 태광, 푸른, 풍원, 한남, 함안, 황금 및 흑정)은 농촌진흥청에서 제공받아 사용하였다. 상기 PI366121는 싸리수염진딧물 저항성 콩 자원이고, 나머지 콩 자원은 싸리수염진딧물 감수성 콩 자원이다.
본 발명에서는 두 개의 재조합 순계 계통(recombinant inbred lines, RIL) 집단이 사용되었다. 첫번째 RIL 집단은 싸리수염진딧물 저항성 관련 QTL 분석을 위해 Williams 82(싸리수염진딧물 감수성)와 PI366121(싸리수염진딧물 저항성)을 교배하여 얻어진 F4:8 105계통의 집단으로, Williams 82는 싸리수염진딧물에 감수성을 가지고 있기 때문에 첫번째 집단의 모본으로 선발되었고 전장 유전체 염기서열 분석의 콩 자원으로도 사용되었다.
두번째 RIL 집단은 싸리수염진딧물 저항성 유전 분리비 확인을 위해 PI366121(싸리수염진딧물 저항성)과 PI483463(싸리수염진딧물 감수성)을 교배하여 얻어진 F3 41계통의 집단으로, 두번째 RIL 집단을 통해 싸리수염진딧물 저항성이 단일 우성 유전자에 의해 조절되고 F3 세대에서 멘델의 유전법칙을 나타낼 것이라 예상하였다.
2. 싸리수염진딧물의 배양
농촌진흥청 국립식량과학원 중부작물부의 콩 포장에서 채집하여 사육 중이던 싸리수염진딧물을 분양받아 사용하였다. 분양받은 싸리수염진딧물은 상대습도 60-80%, 15시간 광조건, 온도 22~25℃의 생장챔버에서 사육하였으며, 기주식물로는 진딧물 감수성 품종인 소원콩을 사용하였다.
3. 싸리수염진딧물 저항성 평가
싸리수염진딧물의 회피저항성 테스트(Choice test) 및 진정저항성 테스트(non-choice test) 평가는 상기 싸리수염진딧물 생육조건과 동일한 조건에서 Williams 82와 PI366121을 교배하여 얻어진 F4:8 105계통의 RIL 집단을 대상으로 수행되었다. 상기 모부본과 F4:8 105계통을 10×5 트레이(550L×270W×120H mm)에 소원콩을 중심열로 하여 파종하였고, 식물체들은 3반복으로 완전임의배치법(complete randomized design, CRD)으로 배치하였다. 콩의 V1 생육 단계에서 페인트 붓을 이용하여 식물체 잎의 윗면에 싸리수염진딧물 성충 4마리를 접종하였고, 접종 14일 후 1 내지 9의 점수로 등급을 나누어 접종엽에 대한 피해정도(primary leaf damage, PLD) 및 전체식물체 피해정도(total plant damage, TPD)을 평가하였는데, 여기서 1은 손상 없음, 9는 심각한 손상을 의미한다.
또한, 진정저항성 테스트를 위해 동일한 트레이에 중심열은 비운채로 상기 모부본과 F4:8 105계통을 파종한 후 상기와 동일한 방법으로 싸리수염진딧물을 접종하고 접종 후 진딧물의 식물체간 이동을 제한하기 위해 120-메쉬 케이지를 덮어주고, 접종 7일 후에 일차 감염 잎 손상(PLD) 및 총 식물 손상(TPD)을 평가하였다.
또한, PI366121과 PI483463을 교배하여 얻어진 F3 41계통의 RIL 집단에 대한 진정저항성 테스트도 상기와 같은 방법으로 실시되었다. 각 계통에서 5개체에 5마리의 싸리수염진딧물 성충을 접종한 후 각각 5개체의 반응을 조사하여, 5개 모두 저항성을 보이면 동형접합체 저항성, 5개 모두 감수성을 보이면 동형접합체 감수성, 저항성과 감수성이 2개 및 3개로 분리되면 이형접합체(분리) 계통으로 구분하였다.
4. 게놈 DNA 추출
콩 자원들의 게놈 DNA는 CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide) 방법을 사용하여 추출하였고, 추출된 DNA는 ND-1000 흡광도 측정기를 사용하여 정량하여 사용하였다.
5. Axiom ® 180k(180,961) Soya SNP 분석을 통한 SNP 확인
Axiom® 180k(180,961) Soya SNP array를 이용하여, Williams 82와 PI366121을 교배하여 얻어진 F4:8 105계통의 RIL 집단과 모부본의 게놈 DNA를 GeneTitan® Scanner(Affymetrix, Santa Clare)로 스캔하였으며, 총 180,961개의 SNP 중에서 8,451개의 SNP가 유전자 지도 작성을 위해 사용되었다.
6. 유전자 연관 지도 작성 및 QLT 확인
첫번째 RIL 집단의 유전자 지도 작성을 위해 QTL IciMapping 스포트웨어를 사용하였다. 상기 Axiom® 180k(180,961) Soya SNP 분석을 통해 얻은 180,961개의 SNP 중에서 모부본 간에 다형성을 보이는 SNP 마커만을 선발하였고, 다형성을 보이는 마커 중 유전자 지도 작성에 실제로 사용할 마커를 선발하기 위하여 QTL IciMapping을 통해 Grouping은 LOD 3.0 이상, Ordering은 nnTwoOpt(nearest neighbor was used for tour construction, and two-opt), Rippling은 SARF(Sum of adjacent recombination fractions)의 조건을 이용하였다.
QTL 탐색은 QTL IciMapping을 통해 ICIM(Inclusive Composite Interval Mapping)의 방법으로 실시하였다. 싸리수염진딧물 저항성 관련 후보 유전자의 탐색은 Williams82.a2.v1을 기반으로 하여 작성된 콩 전체 시퀀스 정보로 탐색하였다. Soybase (http://www.soybase.org/)를 이용하여 탐색한 QTL을 바탕으로 물리적 거리를 이용하여 후보 유전자를 탐색하였다.
7. 싸리수염진딧물 저항성 관련 후보 유전자의 발현량 평가
후보 유전자의 발현량을 측정하기 위해 첫번째 RIL 집단의 모부본인 Williams82와 PI366121의 삼복옆에 싸리수염진딧물 10마리를 접종하였다. 접종 후 0시간, 24시간, 48시간 후에 잎의 샘플을 3반복으로 수집하였고, RNA를 추출하고 역전사 반응을 통해 cDNA를 합성하였다. 전사수준은 ABI StepOnePlus 기기로 qRT-PCR 반응으로 확인하였고, 모든 실험은 3반복 수행하였다. 결과는 ABI StepOnePlus Software로 분석하였으며, PCR을 위한 프라이머는 Primer 3.0 프로그램을 사용하여 디자인되었다. PCR을 통해 확인된 표적 유전자(Glyma07G077700)의 발현량을 정규화하기 위해 하우스키핑 유전자인 cons6를 표준 유전자로 사용하였다.
유전자 프라이머 명칭 서열정보 (5'→3') (서열번호)
표적 유전자 Glyma07G077700-F2 GTTTGACTCTTAGCTCGTTACCAA (7)
Glyma07G077700-R2 CAAGGTTTGCTGAACGACAT (8)
표준 유전자 cons6_F AGATAGGGAAATGGTGCAGGT (9)
cons6_R CTAATGGCAATTGCAGCTCTC (10)
실시예 1. 유전자 분리모형 분석 결과
PI366121(싸리수염진딧물 저항성)과 PI483463(싸리수염진딧물 감수성)을 교배하여 얻어진 F3 41계통의 RIL 집단을 대상으로 싸리수염진딧물에 대한 진정저항성 테스트를 수행한 결과, 싸리수염진딧물에 대한 동형접합체 저항성 계통은 12계통, 이형접합체 계통은 21계통, 동형접합체 감수성 계통은 8계통으로 확인되었고, 이 비율은 멘델의 우성 유전 현상 분리비와 일치하므로 결과적으로 싸리수염진딧물 저항성 관련 유전자는 단일 우성 유전자임을 알 수 있었다.
실시예 2. 싸리수염진딧물 저항성 관련 QTL 분석
Axiom® 180k(180,961) Soya SNP array를 통해 작성한 유전자 지도를 이용하여 싸리수염진딧물 관련 QTL을 탐색한 결과, 싸리수염진딧물에 대한 회피저항성 테스트(Choice test) 및 진정저항성 테스트(non-choice test)를 통해 확인된 저항성 관련 형질이 모두 7번 염색체에 존재함을 확인하였다(표 2). 상기 QTL은 AX-90462843과 AX-90334585 사이에 존재하였고, 두 마커의 각각의 물리적인 위치로는 각각 7,020 kbp와 7,097 kbp로 그 물리적인 거리는 76 kbp로 나타났다. LOD(logarithm of the odds)값은 PLD-C는 9.5, TPD-C는 7.2, PLD-N은 5.9, TPD-N은 4.4로 높은 상관을 보였으며, PVE(Phenotypic variation explained by the marker)는 PLD-C는 35.3, TPD-C는 28.5, PLD-N은 21.5, TPD-N은 20.2로 각각의 표현형을 잘 보여주었다(도 1).
Figure 112020102651124-pat00001
실시예 3. 싸리수염진딧물 저항성 관련 후보 유전자 탐색
유전자 지도에서 탐색된 싸리수염진딧물 관련 QTL 위치를 기반으로 Soybse.org에서 Williams 82를 바탕으로 제작된 Physical map에서 싸리수염 진딧물 저항성 관련 후보 유전자를 탐색한 결과, 콩의 7번 염색체에 Glyma.07g077000, Glyma.07g077100, Glyma.07g077200, Glyma.07g077300, Glyma.07g077400, Glyma.07g077500, Glyma.07g077600 및 Glyma.07g077700의 총 8개 유전자가 존재함을 확인하였다(도 2).
또한, 상기 후보 유전자들의 엑손 영역의 유전체 재분석을 수행한 결과, Glyma.07g077000, Glyma.07g077400 및 Glyma.07g077700 유전자 위치에서 SNP 마커가 각각 2개, 2개, 12개 탐색되었으나, 나머지 유전자에서는 SNP 마커가 탐색되지 않았다(표 3 및 도 2).
그리고 상기 Glyma.07g077000, Glyma.07g077400 및 Glyma.07g077700의 후보 유전자들 중에서 이미 병원균에 대한 저항성 유전자로 알려진 NB-ARC 유전자(R gene)가 Glyma.07g077700임을 확인함으로써, 싸리수염진딧물 저항성 관련 유전자로 Glyma.07g077700을 최종 선발하였다.
Figure 112020102651124-pat00002
또한, Williams 82(싸리수염진딧물 감수성)와 PI366121(싸리수염진딧물 저항성)에 싸리수염진딧물을 접종한 후 상기 최종 선발된 Glyma.07g077700 유전자의 상대적 발현량을 비교한 결과, 접종 직후(0h)에는 Glyma.07g077700 유전자의 발현량에 차이가 없었고, 접종 24시간 후에는 PI366121 보다 Williams 82에서 Glyma.07g077700 유전자의 발현량이 약간 높았으나 통계적으로 유의적 차이가 없었으며, 접종 48시간 후에는 Williams 82 보다 PI366121에서 Glyma.07g077700 유전자의 발현량이 현저히 증가한 것을 확인하였다. 이를 통해, Glyma.07g077700 유전자가 싸리수염진딧물 저항성과 밀접한 관련이 있음을 알 수 있었다(도 3).
실시예 4. 싸리수염진딧물 저항성 판별을 위한 SNP 마커 개발 및 상기 마커의 적용성 검정
상기 최종 선발된 싸리수염진딧물 저항성 관련 유전자 Glyma.07g077700의 엑손 1번, 4번, 5번, 6번 및 7번에 존재하는 총 12개의 SNP 마커(SNP 3-1 내지 3-12)를 이용하여 27개의 감수성 콩 자원에 대상으로 SNP 마커의 적용성을 검정하였다.
그 결과, SNP 3-1, SNP 3-9, SNP 3-10, SNP 3-11 및 SNP 3-12 위치에서는 PI366121(저항성 콩 자원)과 일부 감수성 콩 자원이 동일한 대립인자를 가지고 있음을 확인함으로써, 상기 SNP 마커는 싸리수염진딧물 저항성 또는 감수성 콩 자원을 제대로 구별할 수 없음을 알 수 있었다. 반면, 나머지 SNP 위치에서는 PI366121(저항성 콩 자원)과 대부분의 감수성 자원이 서로 다른 대립인자를 가지고 있음을 확인하였다. 즉, 이를 통해 콩의 7번 염색체 내 엑손 5번에 존재하는 SNP 3-3, SNP 3-4, SNP 3-5, SNP 3-6, SNP 3-7 및 SNP 3-8 마커가 싸리수염진딧물 저항성 또는 감수성 콩 자원을 효과적으로 구별할 수 있는 분자마커임을 알 수 있었다(표 4 및 표 5).
Figure 112020102651124-pat00003
본 발명의 SNP 마커를 포함하는 서열 정보
SNP ID resistance allele sequence 서열번호
SNP 3-3 G CCCGCTGCCGTGGCCAAAAATCTTAAGAAGCTTCACTCACTTTTCATTA[T/G]ATCTTGTCAGAGGTTGGAAGAAATTGTTAAAAAGGAAGAAGACGCAGAA 1
SNP 3-4 C CATTTGCTTTTACCCTGAACCATTCACTCTGGGATGCCCTGTGTTAGAT[A/C]AATTACATGTGTAGATTGCCCAAAGTTGGAGCTATTTGAAAGTGCTAAC 2
SNP 3-5 T GCTTTTACCCTGAACCATTCACTCTGGGATGCCCTGTGTTAGATAAATTA[C/T]ATGTGTAGATTGCCCAAAGTTGGAGCTATTTGAAAGTGCTAACAGACAAC 3
SNP 3-6 G ACCCTGAACCATTCACTCTGGGATGCCCTGTGTTAGATAAATTACATGTG[C/G]TAGATTGCCCAAAGTTGGAGCTATTTGAAAGTGCTAACAGACAACCTGTT 4
SNP 3-7 T CATTCACTCTGGGATGCCCTGTGTTAGATAAATTACATGTGCTAGATTGC[C/T]CAAAGTTGGAGCTATTTGAAAGTGCTAACAGACAACCTGTTTTCTCGGAT 5
SNP 3-8 A TTACATGTGCTAGATTGCCCAAAGTTGGAGCTATTTGAAAGTGCTAACAGA[C/A]AACCTGTTTTCTCGGATCTAAAGGTATGTTACATGCAATTTGCACTCTCAATTT 6
[싸리수염진딧물 감수성 관련 SNP/ 싸리수염진딧물 저항성 관련 SNP]
<110> Dankook University Cheonan Campus Industry Academic Cooperation Foundation <120> Marker for discriminating foxglove aphid-resistant or sensitive soybean and uses thereof <130> PN20266 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 99 <212> DNA <213> Glycine max <400> 1 cccgctgccg tggccaaaaa tcttaagaag cttcactcac ttttcattag atcttgtcag 60 aggttggaag aaattgttaa aaaggaagaa gacgcagaa 99 <210> 2 <211> 99 <212> DNA <213> Glycine max <400> 2 catttgcttt taccctgaac cattcactct gggatgccct gtgttagatc aattacatgt 60 gtagattgcc caaagttgga gctatttgaa agtgctaac 99 <210> 3 <211> 101 <212> DNA <213> Glycine max <400> 3 gcttttaccc tgaaccattc actctgggat gccctgtgtt agataaatta tatgtgtaga 60 ttgcccaaag ttggagctat ttgaaagtgc taacagacaa c 101 <210> 4 <211> 101 <212> DNA <213> Glycine max <400> 4 accctgaacc attcactctg ggatgccctg tgttagataa attacatgtg gtagattgcc 60 caaagttgga gctatttgaa agtgctaaca gacaacctgt t 101 <210> 5 <211> 101 <212> DNA <213> Glycine max <400> 5 cattcactct gggatgccct gtgttagata aattacatgt gctagattgc tcaaagttgg 60 agctatttga aagtgctaac agacaacctg ttttctcgga t 101 <210> 6 <211> 106 <212> DNA <213> Glycine max <400> 6 ttacatgtgc tagattgccc aaagttggag ctatttgaaa gtgctaacag aaaacctgtt 60 ttctcggatc taaaggtatg ttacatgcaa tttgcactct caattt 106 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gtttgactct tagctcgtta ccaa 24 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 caaggtttgc tgaacgacat 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 agatagggaa atggtgcagg t 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 ctaatggcaa ttgcagctct c 21

Claims (7)

  1. 서열번호 1의 염기서열 중 50번째에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism); 서열번호 2의 염기서열 중 50번째에 위치한 SNP; 서열번호 3의 염기서열 중 51번째에 위치한 SNP; 서열번호 4의 염기서열 중 51번째에 위치한 SNP; 서열번호 5의 염기서열 중 51번째에 위치한 SNP; 및 서열번호 6의 염기서열 중 52번째에 위치한 SNP;를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 콩(Glycine max)의 싸리수염진딧물 저항성 또는 감수성 판별용 마커 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 1의 50번째 염기가 G, 서열번호 2의 50번째 염기가 C, 서열번호 3의 51번째 염기가 T, 서열번호 4의 51번째 염기가 G, 서열번호 5의 51번째 염기가 T, 서열번호 6의 52번째 염기가 A인 경우에는 싸리수염진딧물 저항성으로 판단하는 것을 특징으로 하는, 콩의 싸리수염진딧물 저항성 또는 감수성 판별용 마커 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 1의 50번째 염기가 T, 서열번호 2의 50번째 염기가 A, 서열번호 3의 51번째 염기가 C, 서열번호 4의 51번째 염기가 C, 서열번호 5의 51번째 염기가 C, 서열번호 6의 52번째 염기가 C인 경우에는 싸리수염진딧물 감수성으로 판단하는 것을 특징으로 하는, 콩의 싸리수염진딧물 저항성 또는 감수성 판별용 마커 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 콩의 싸리수염진딧물 저항성 또는 감수성 판별용 마커 조성물을 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 싸리수염진딧물 저항성 또는 감수성 콩 판별용 조성물.
  5. 제4항의 조성물을 포함하는 싸리수염진딧물 저항성 또는 감수성 콩 판별용 키트.
  6. 제5항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, SNP 칩 키트 또는 마이크로어레이 칩 키트인 것을 특징으로 하는 키트.
  7. 콩 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 및
    제1항에 기재된 서열번호 1 내지 6의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오드의 각 SNP 위치 염기인 다형성 부위의 유전자형을 결정하는 단계를 포함하는, 싸리수염진딧물에 대해 저항성 또는 민감성을 갖는 콩 품종을 판별하기 위한 방법.
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101878539B1 (ko) * 2015-10-13 2018-07-16 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단 콩의 싸리수염진딧물 저항성 염기다형성 마커 및 이의 용도

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101878539B1 (ko) * 2015-10-13 2018-07-16 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단 콩의 싸리수염진딧물 저항성 염기다형성 마커 및 이의 용도

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JU SEOK LEE ET AL, THEOR APPL GENET., 2015, 128(8), PP.1481_1488 *
NCBI REFERENCE SEQUENCE XM_006583279.3 *
Sumin Park et al., Preceedings of the korean Society of Crop Science Conference, P079, pp.145, 2017. *
Sumin Park et al., Preceedings of the korean Society of Crop Science Conference, P079, pp.145, 2017.*

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