KR101863978B1

KR101863978B1 - 면역 억제 활성을 갖는 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 단편

Info

Publication number: KR101863978B1
Application number: KR1020137006995A
Authority: KR
Inventors: 슈지 사토; 타케시 고토; 시게루 고토; 토시아키 나카노; 나오야 오모리; 쿠에첸 시앙; 야요이 시마다; 켄지 모리; 타카미츄 미야기
Original assignee: 각코우호우진 조사이 다이가쿠
Priority date: 2010-08-20
Filing date: 2011-08-19
Publication date: 2018-06-01
Also published as: TW201300416A; JPWO2012023614A1; RU2559550C2; JP5960596B2; US20140010815A1; CN103534271B; US9701739B2; KR20130137612A; EP2631246A4; EP2631246B1; RU2013112324A; IN2013MN00513A; CN103534271A; TWI449710B; EP2631246A1; WO2012023614A1

Abstract

본 발명은 우수한 면역억제 활성을 갖는 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 SSVLYGGPPSAA (SEQ ID NO: 1)으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드 또는 상기 펩티드와 약제학적으로 허용가능한 담체의 컨쥬게이트에 결합하는 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 단편에 관한 것으로, 상기 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 히스톤 H1에 대한 결합 친화력보다 코어 히스톤에 대해 더 높은 결합 친화력을 갖는다.

Description

면역 억제 활성을 갖는 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 단편{MONOCLONAL ANTIBODY HAVING IMMUNOSUPPRESSIVE ACTIVITY OR ANTIGEN BINDING FRAGMENT THEREOF}

본 발명은 2010년 8월 20일에 출원한 일본 특허 출원 번호 2010-185406을 우선권으로 주장하고, 본 명세서에 그 전체가 참고문헌으로 통합된다.

본 발명은 우수한 면역억제 활성을 갖는 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 단편 그리고 그들을 제조하는 하이브리도마에 관한 것이다.

장기 이식 치료에서, 통상적으로, 다양한 면역 억제제가 장기 이식 후의 거부 반응을 억제하기 위해 사용된다. 이 면역 억제제는, 예를 들면, 타크로리무스(tacrolimus)(FK506) 및 시클로스포린 A(ciclosporin)(Jpn J Pharmacol, 71, 89-100, 1996)을 포함한다. 그러나, 통상적인 면역 억제제는 암 세포의 성장 자극 및 골수억제: 전염성 질병 및 심지어 일생의 투여를 요하는 심한 부정적 영향을 포함하는 단점을 갖는다 (비특허 문헌 1: Transplantation, 58, 170-178, 1994).

더욱, 면역 억제제의 투여 중지 시기를 결정하는 것은 일반적으로 어렵다. 예를 들어, 조직 생착은 면역 억제제의 지속적인 투여 없이 달성될 수 있다. 이 경우에, 면역 억제제 약물의 무심한 지속적 투여는 단순히 독성 때문에 환자에게 손상을 줄 수 있다.

한 편, 면역 억제제의 투여 중단은 성공적으로 생착된 조직이 거부반응을 나타내기 시작하도록 할 수 있다. 이 경우에, 면역 억제제의 재 투여는 거부반응을 억제하는데 종종 효과적이지 않다.

한 편, 장기 이식에 대한 여러 가지 연구가 수행되어 왔다. 예를 들어, 높은 이식 생착률을 갖는 제공자 DA 레트 간 (MHC 단산형 RT1a)이 수혜자 PVG 레트 (RT1c)에게 이식된 경우 면역 억제제의 투여 없이 이식의 성공적인 생착이 레트 동소성의 간 이식(OLT) 시스템에서 보고되어 왔다 (비특허 문헌 2: 이식, 35, 304-311-1983).

더욱, 이식 거부 반응이 거부 반응이 일어나는 조합에서 이식 모델 시스템에 이식된 DA 쥐 간(post-OLT 혈청)을 갖는 수혜자 PVG 쥐의 혈청을 수술 전의 한 번의 투여함에 의해 억제된다는 보고가 있다 (비특허 문헌 3: J.Surg.Res., 80, 58-61, 1998).

더욱, 거부 반응이 확실히 일어나는 심장 이식 시스템(인치 생체)에 항-히스톤 H1 폴리클로날의 항체를 수술 후 투여함으로써 DA(RT1a) 및 LWIS 레트(RT1L)의 거부 반응이 억제되고 수혜자가 생존한다는 것이 개시된다 (비특허 문헌 4: 이식, 77, 1595-1603, 2004).

더욱, 본 발명자들 중 몇몇은 혼합된 림프구 배양 반응 (MLR)이 PVG 레트로부터 이식-후 최초 혈청을 사용함에 의해 억제되고, 항 히스톤 H1 항체는 MLR 억제 활성을 나타낸다는 것을 개시해왔다 (특허 문헌 1: 일본 특허 공개 번호 2004-149507).

게다가, 본 발명자들 중 몇몇은 항 히스톤 H1 모노클로날 항체가 제조되고, 그리고 하이브리도마 16G9 (수탁 번호 FERM BP-10413)에 의해 제조된 항 히스톤 H1 단일세포 항체는 파지 발현 방법에 의해 획득한 SEQ ID NO:1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드에 결합한다는 것을 개시해왔다 (특허 문헌 2: WO2006/025580).

더욱 더, 본 발명자들 중 몇몇은 SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 항원으로 하는 폴리클로날 항체가 제조되는 것에 대해 보고해 왔다.

그러나, 장기 이식에서 이식 거부를 억제하기 위해 사용될 수 있는 우수한 면역 억제 활성을 갖는 단일세포 항체를 제조하는 것은 여전히 요구된다.

참고문헌 리스트

비특허 문헌

비특허 문헌 1: Transplantation, 58, 170-178, 1994

비특허 문헌 2: Transplantation, 35, 304-311, 1983

비특허 문헌 3: J. Surg.Res., 80, 58-61, 1998

비특허 문헌 4: Transplantation, 77, 1595-1603, 2004

특허 문헌

특허 문헌 1: 일본 특허 공개 공보 번호 2004-149507

특허 문헌 2: WO2006/025580

특허 문헌 3: US-2009-008247-A1

본 발명자들은 우수한 면역 억제제 활성을 갖는 신규의 모노클로날 항체 및 그것의 항원 결합 단편, 그리고 그들을 제조하는 하이브리도마를 발견하였다. 본 발명은 이러한 발견을 근거로 한다.

그러므로, 본 발명의 목적은 우수한 면역 억제 활성을 갖는 신규의 모노클로날 항체 및 그것의 항원 결합 단편, 그리고 그들을 제조하는 하이브리도마를 제공하는 것이다.

따라서, 본 발명의 모노클로날 항체 또는 항원 결합 단편은 SSVLYGGPPSAA (SEQ ID NO:1)으로 표시된 아미노산 서열로 이루어진 펩티드 또는 상기 펩티드와 약제학적으로 허용가능한 담체의 컨쥬게이트에 결합하고, 그리고

본 발명의 모노클로날 항체 또는 항원 결합 단편은 히스톤 H1보다 코어 히스톤에 높은 결합 친화성을 갖는다.

더욱, 본 발명의 하이브리도마는 상기 모노클로날 항체 또는 항원 결합 단편을 제조한다.

본 발명의 모노클로날 항체는 상당한 면역 억제제 활성을 갖고 장기 이식에서의 이식 거부 억제를 위해 유리하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 모노클로날 항체의 이소타입을 확인하기 위한 시험의 결과를 나타낸다 (이하, "SSVmAb"라고도 함).
도 2는 히스톤 H1, 히스톤 H2A, H2B, H3 또는 H4에 대한 본 발명 (SSVmAb)의 모노클로날 항체의 결합 친화성을 비교한 테스트의 결과를 나타낸다.
도 3은 히스톤 H1, 히스톤 H2A, H2B, H3 또는 H4에 대한 하이브리도마 16G9 (이하, "16G9mAb"라고도 함)에 의해 제조된 모노클로날 항체의 결합 친화성을 비교한 시험의 결과를 나타낸다. 하이브리도마는 수탁 번호 FERM BP-10413 (참조)로 기탁되었다.
도 4는 본 발명의 모노클로날 항체(SSVmAb) 및 16G9mAb를 사용한 혼합된 림프구 반응 (MLR)의 시험 결과를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 모노크로날 항체(SSVmAb) 및 16G9mAb의 T 세포와의 반응성을 흐름 세포 분석법에 의해 비교한 비교 결과를 나타낸다.
도 6A는 본 발명의 모노클로날 항체 (SSVmAb) 및 대조 시약(이소타입 IgG1)에 대한 ATP 합성효소가 siRNA에 의해 제거되지 않는 비장 세포를 사용한 MLT 시험의 결과를 나타낸다.
도 6B는 본 발명의 모노클로날 항체 (SSVmAb) 및 대조 시약(이소타입 IgG1)에 대한 ATP 합성효소가 siRNA에 의해 제거된 비장 세포를 사용한 MLT 시험의 결과를 나타낸다.

본 발명의 하이브리도마 마우스-마우스 하이브리도마 SSV-C 93-3는 수탁 번호 NITE BP-972 하에 최초 보관일인 2010년 8월 17일에 독립행정법인제품 평가기술 기관, 특허 미생물 수탁기관에 보관되었다.

모노클로날 항체 및 하이브리도마

본 발명의 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 단편의 한 가지 특징은 본 발명의 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 단편이 SSVLYGGPPSAA (SEQ ID 번호: 1)로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드 또는 상기 펩티드와 약제학적으로 허용가능한 담체의 컨쥬게이트에 결합하는 것, 그리고 본 발명의 상기 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 단편이 연결자 히스톤(histone H1)에 보다 코어 히스톤에 더 높은 결합 친화성을 갖는다는 것이다. 놀랍게도, 본 발명자들은 이러한 반응성을 갖는 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 단편이 상당한 면역 억제 활성을 갖는 것을 발견하였다.

본 발명의 바람직한 면에 따르면, 상기 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 SSVLYGGPPSAA (SEQ ID 번호: 1)로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드 또는, 상기 펩티드와 약제학적으로 허용가능한 담체에 대한 것이다.

본 발명의 또 다른 바람직한 면에 따르면, 코어 히스톤은 히스톤 H2A, H2B, H3 또는 H4이고, 더욱 바람직하기는 H2A, H3 또는 H4이다.

본 발명의 항체 또는 그것의 항체 결합 단편은 또한 중사슬 그리고/또는 경사슬을 포함할 수 있다. 경사슬 및 중사슬 각각은 N-말단에 가변 영역을 가질 수 있고, 그리고 각각의 가변 영역은 번갈아 4개의 프레임워크 구역 (FR) 및 세 개의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함할 수 있다. 통상적으로, 가변 영역의 잔기는 Katat 등에 의해 고안된 시스템에 따라 번호가 부여된다. 상기 시스템은 미국의 보건 사회 복지부(US Department of Health and Human Services) NIH의 면역학적 관심 단백질의 서열(Sequences of Proteins of Immunological Interest), 1987년, Katat 등에서 기재된다. 다른 언급이 없다면, 이 번호 부여 시스템이 본 명세서에서 사용된다. Kabat 등에 의한 방법을 근거로 하는 번호 부여는, 예를 들어, http://www.bioinf.org.uk/abysis/tools/analyze.cgi.에서 웹 사이트를 이용해 쉽게 수행될 수 있다.

잔기의 Kabat 명명법은 아미노산 잔기의 선형 번호 부여에 반드시 상응하지는 않는다. 가변 영역의 기본 구조의 구조적 요소인 프레임워크 또는 CDR에서 실제 선형의 아미노산 서열은 단축(trancation) 또는 삽입에 따른 엄격한 Kavat 번호 부여와 비교할 때 더 적거나 추가의 아미노산을 가질 수 있다. 주어진 항체에서, 잔기의 정확한 Kabat 번호 부여는 "표준" Kabat 번호 부여에 따라 번호 부여된 배열 및 항체의 배열에서 상응하는 잔기를 정렬해서 결정될 것이다.

한 면에 따르면, 본 발명의 항체의 경사슬 가변 영역 또는 그것의 항원 결합 단편은 RASSSVSYMH (SEQ ID NO: 2)로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDR1, ATSNLAS (SEQ ID NO: 3)으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDR2 그리고 QQWSSNPWT (SEQ ID NO: 4)로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDR3을 포함한다. 더 바람직한 면에 따르면, 상기 경사슬 가변 영역은 SEQ ID NO: 6의 제 23번 내지 제 128번에 의해 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.

다른 면에 따르면, 본 발명의 항체의 중사슬 가변 영역 또는 그것의 항원 결합 단편은 GYNMN (SEQ ID NO: 7)으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, NINPYYGSTSYNQKFKG (SEQ IN NO: 8)으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 SPYYSNYWRYFDY (SEQ ID NO: 9)으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다. 더 바람직한 면에 따르면, 상기 중사슬 가변 영역은 SEQ ID NO: 11의 제 20번 내지 제 141번으로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.

더욱, 본 발명의 더욱 바람직한 면에 따르면, 본 발명의 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 RASSSVSYMH (SEQ ID NO: 2)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, ATSNLAS (SEQ ID NO: 3)으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 QQWSSNPWT (SEQ ID NO: 4)으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 경사슬 가변 영역, 그리고 GYNMN (SEQ ID NO: 7)로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, NINPYYGSTSYNQKFKG (SEQ ID NO: 8)으로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 SPYYSNYWRYFDY (SEQ ID NO: 9)로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬 가변 영역을 포함한다.

더욱, 본 발명의 더욱 더 바람직한 면에 따르면, 본 발명의 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 6의 제 23번 내지 제 128번으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역 및 SEQ ID NO: 11의 제 20번 내지 제 141번으로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역을 포함한다.

게다가, 본 발명의 바람직한 면에 따르면 상기 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 ATP 합성효소의 활성을 하향조정할 수 있다. 이에 더하여, 본 발명의 더욱 바람직한 면에 따르면, 상기 ATP 합성효소는 미토콘드리아 ATP 합성효소다.

상기 본 발명의 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 단편의 결합 친화성 및 ATP 합성효소 활성의 하향 조절은, 예를 들면, 본 명세서의 시험예 2 및 4에 기재되는 방법에 의해 결정된다.

더욱, 본 발명의 모노클로날 항체는 바람직하기는 키메릭 항체, 인간화 항체 또는 완전 인간 항체다. 당업자는, 예를 들면, Morrison, S.L., Oi, V. T., "immunoglobulin genes" 학회 간행물 (런던), 260-274(1989); Roguska, M. L. et. Al., Humanization of murine monoclonal antibodies through variable domain resurfacing, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 969-973(1994); Tomizuka, K. et. al. Functional expression and germline transmission of a human chromosome fragment in chimaeric mice, Nature Genet., 16, 133-143 (1997); Winter, G. et.al., Making antibodies by phage display technology, Ann. Rev. Immunol., 12, 433-455 (1994); Griffiths, A. D. et. al., Isolation of high affinity human antibodies directly from large synthetic repertoires, EMBO. J., 13, 3245-3260 (1994)에 기재된 바와 같이 본 분야에 알려진 기술에 따라 제조될 수 있다.

더욱, 본 발명의 바람직한 면에 따르면, 상기 항원 결합 단편은 바람직하기는 Fab, Fab', (Fab')₂, Fv 또는 scFv이다.

게다가, 본 발명의 또 다른 면에 따르면, 상기 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 단편을 제조하는 하이브리도마가 개시된다. 또한, 본 발명의 다른 바람직한 면에 따르면, 하이브리도마는 마우스-마우스 하이브리도마 SSV-C 93-3이다.

본 발명의 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 단편, 그리고 하이브리도마는, 예를 들어, 다음과 같이 제조될 수 있다. 즉, 첫째로, 본 발명의 하이브리도마는 SSVLYGGPPSAA (SEQ ID NO: 1)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 항원으로서 상기 펩티드와 약제학적으로 허용가능한 담체의 컨쥬게이트를 사용하여, 상기 감작 항원에 의해 면역화된 포유동물 혈장 세포 (면역 세포)를 포유동물 골수종 세포와 융합하고, 그리고 생성된 하이브리도마를 클로닝하고 그리고 스크리닝하여 얻을 수 있다. 그 다음 본 발명의 모노클로날 항체는 본 발명의 하이브리도마를 배양하고 이것에 의해 제조되는 항체를 수집하여 얻을 수 있다.

포유동물을 면역시키는 방법에 있어서, 본 분야의 어느 일반적인 투여 방법이 이용될 수 있다. 특히, 상기 방법들은 복막내 주입, 비장내 주입, 근육내 주입, 피하 주입, 피내 주입, 경구 투여, 점막관통 투여, 경피 투여를 포함하지만 바람직하기는 복막내 주입, 비장내 주입을 포함한다. 감작 항원의 복용 간격은 감작 항원의 복용량, 포유동물 종 등에 따라 적절히 결정된다. 예를 들어, 1개월간 수회일 수 있다.

면역화 되어질 포유동물은 특별히 제한되지 않지만 바람직하기는, 예를 들면, 세포 융합에 사용되는 골수 세포와의 적합성을 고려한 후 선택된다. 그것들은, 예를 들면, 마우스, 래트 그리고 햄스터를 포함한다. 바람직하기는, 포유동물은 마우스다.

더욱, 바람직하기는 비장 세포가 면역 세포로서 사용된다.

본 발명에 사용되는 골수 세포는, 예를 들면, P3 (P3X63Ag8.653) (J.Immunol., 123,1548, 1978), p3-U1 (Current Topics in Micro-biology and Immunology, 81, 1-7, 1978), NS-1 (Eur. J. Immunol., 6, 511-519, 1976), MPC-11(Cell, 8, 405-415, 1976), Sp2/0-Ag14 (Nature, 276, 269-270, 1978), FO (J. Immunol. Meth., 35, 1-21, 1980), S194 (J. Exp. Med., 148, 313-323, 1978) 그리고 R210 (Nature, 277, 131-133, 1979)를 포함한다. 골수 세포는 바람직하기는 P3 또는 p3-U1, 더욱 바람직하기는 P3이다.

면역 세포 및 골수 세포는, 예를 들어, Milstein 등(Methodds Enzymol., 73, 3-46, 1981)에 따른 방법에 의해 융합될 수 있다. 구체적으로, 세포 융합은, 예를 들어, 융합 촉진제의 존재 하에 배지에서 면역 세포와 골수 세포를 혼합하여 실시될 수 있다. 그 다음, 배지의 첨가 및 원심분리가 하이브리도마를 제조하기 위해 세포 융합 동안에 적절히 반복될 수 있다.

세포 융합에 사용되는 배지는, 예를 들어, RPMI-1640 배지 및 MEM 배지와 같은 세포 융합에 통상 사용되는 배지를 포함한다. 더욱, 송아지 태아 혈청 (FBS)과 같은 혈청 보충물이 적절히 함께 사용될 수 있다.

세포 융합을 위한 온도는 바람직하기는 25 내지 37℃, 그리고 더 바람직하기는 30 내지 37℃이다.

골수증 세포 및 면역 세포의 혼합 비율은 바람직하기는 1:1 내지 1:10이다.

융합 촉진제는, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 센다이(Sendai) 바이러스 (HVJ)를 포함할 수 있다. 융합 촉진제는 바람직하기는 PET다. PEG의 분자량은 적절히 선택될 수 있고, 예를 들어, 평균 분자량은 약 1,000 내지 6,000 사이일 수 있다. 배지에서 PEG의 농도는 바람직하기는 약 30 내지 60% (W/V)이다.

디메틸 설폭시드와 같은 보조제가 필요에 따라 배지에 적절히 첨가될 수 있다.

본 발명의 하이브리도마의 선택은, 예를 들면, HAT 배지와 같은 일반적인 선택 배지에서, 세포 융합에 의해 얻어진 하이브리도마를 배양하고, 그리고, 예를 들면, SSVLYGGPPSAA (SEQ ID NO: 1)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 상기 펩티드와 약제학적으로 허용가능한 담체의 컨쥬게이트에 대한 항체 염가과 같은 지표를 근거로 하여, 스크리닝을 수행하기 위한 제한 희석 방법을 사용하여 실시될 수 있다. HAT 배지에서의 배양 기간은 관심의 하이브리도마 이외의 세포가 (미융합 세포) 사멸하기에 충분한 기간이고, 보통 수일 내지 수 주일 수 있다. 이런 방식으로 얻어지는 본 발명의 하이브리도마는 일반적인 배지에서 2차 배양될 수 있고, 그리고 또한 액체 질소에서 오랜 기간 동안 저장될 수 있다.

본 발명의 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 단편을 얻는 방법은, 예를 들면, 하이브리도마가 배양 상등액으로부터 모노클로날 항체 등을 얻는 통상적인 방법에 따라 배양되는 방법 또는 하이브리도마가 증식을 위해 적합한 포유동물에게 투입되고 모노클로날 항체 등은 그것의 복수로부터 얻어지지는 방법을 포함한다. 여기서, 후자의 방법은 많은 양의 항체를 제조하는 데 바람직한 반면 전자 방법은 매우 순수한 항체를 얻는데 바람직하다.

더욱, 본 발명의 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 염석법, 겔 여과법 및 친화성 크로마토그래피와 같은 방법에 의해 고순도로 정제될 수 있다.

본 발명의 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 상기된 바와 같이 상당한 면역 억제 활성을 갖는다. 본 발명의 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 그 자체로 이용될 수 있고, 또는 약제학적으로 허용가능한 첨가제와 함께 약제학적 조성물로서 사용될 수 있다. 그러므로, 본 발명의 한 면에 따르면, 본 발명의 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 단편을 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 더욱, 본 발명의 바람직한 면에 따르면, 상기 약제학적 조성물은 면역 억제제 약물로서 사용된다. 더욱, 본 발명의 또 다른 면에 따르면, 약제학적 조성물을 제조하는 데 있어서 본 발명의 모노클로날 항체의 용도가 제공된다.

본 발명의 약제학적 조성물은 심장, 신장, 간, 뼈 골수 및 피부와 같은 이식된 장기의 거부반응을 억제하고 거부 반응의 발생 위험을 줄이고, 그리고 추가로 자가면역 질환 등을 치료하기 위해 유리하게 사용될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은, 예를 들면, 본 발명의 모노클로날 항체를 주입가능한 염분, 주입가능한 증류수, 주입가능한 완충액 등에서 용해시켜 제조될 수 있다. 본 발명의 면역 억제조성물은 적절한 용액, 가용화제, 보존액, 안정화제, 유화제, 현탁제, 유화제, 긴장조절제, 완충액, 부형제, 점증제, 착색제, 알려진 담체 (다양한 리포좀 폴리아미노산 담체, 합성 고분자, 천연 고분자 등) 등을 더욱 함유할 수 있다.

더욱, 본 발명의 또 다른 면에 따르면, 면역 억제가 필요한 포유동물의 치료 방법이 제공되고, 상기 방법은 본 발명의 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 단편의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 이 문맥에서, 상기 용어 "치료"는 확립된 병리 현상을 완화시키는 것을 의미한다. 더욱, 본 발명의 다른 면에 따르면, 이식 거부 발생의 위험을 줄이는 방법이 제공되고, 상기 방법은 장기를 이식 받은 포유동물에게 본 발명의 모노클로날 항체 또는 항원 결합 단편의 유효량을 투여하는 것을 포함한다.

게다가, 한 면에 따르면, 상기 포유동물은 장기를 이식받았다. 장기 이식을 위한 상기 포유동물 및 제공자는 인간, 돼지 그리고 비비를 포함한다. 그들은 바람직하기는 인간이다.

이식될 장기는, 예를 들어, 간, 심장, 신장 그리고 피부를 포함한다.

더욱, 본 발명의 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 동시의 또는 순차적으로 장기 이식에 사용되는 다른 면역 억제제와 조합하여 포유동물에 투여될 수 있다. 이러한 다른 면역 억제제는, 제한적이지는 않지만, 예를 들어, 시클로포스마이드와 같은 알킬화제, 아자티오프린, 메토트렉사이시트 및 미조리빈과 같은 항대사물질; 시클로스포린 및 타크롤리무스와 같은 T-세포 활성 저해제; 프레드니솔론, 메틸프리드니솔론, 미코페놀레이트 모테필 및 아자티오프린과 같은 스테로이드; 바질릭시맵 및 모로모나브와 같은 림포사이트 표면 기능 저해제; 그리고 그것의 조성물을 포함한다.

더욱, 본 발명의 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 전신에 또는 국부적으로 투여될 수 있다. 투여의 구제적인 방법은 주입, 정맥 주입, 근육 주입, 피하 주입, 피내 주입, 경구 투여, 경점막 투여 및 경피 투여를 포함한다.

더욱, 본 발명의 모노클로날 항체 또는 항원 결합 단편의 유효량은 특별히 제한되지 않고, 그리고 포유동물의 종류, 성질, 성별, 연령 등에 따라 당업자에 의해 적절히 결정될 수 있다. 예를 들어, 이러한 유효량은 0.05 내지 40 mg/kg 체중/일, 더 바람직하기는 0.1 내지 1.0 mg/kg 체중/일으로 1 또는 수회 복용량을 포함한다.

다음에서, 본 발명은 구체적으로 실시예로 참고하여 기재될 것이고, 그러나 본 발명은 이들 실시예로 제한되지 않는다. 실시예 1: 모노클로날 항체( SSVmAb )의 제조

항원 물질의 제조

항원 물질의 경우, SEQ ID NO: 1로 표현되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드와 KLH의 컨쥬게이트를 사용하였다.

항원 물질의 제조에서, 우선 SEQ ID NO: 1로 표현되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 Fmoc 펩티드 고체상 합성 방법(제조 기구: Applied Biosystems ABI 430)에 의해 합성하였다. 인산 완충용액(pH 8.0)에서 상기 펩티드 5 ㎎, KLH 약 20 ㎎ 및 글루타르알데히드(Katayama Chemical Industries Co., Ltd.) 30 ㎍을 실온에서 약 6시간 동안 교반하여, 상기 펩티드와 KLH(SIGMA)의 컨쥬게이트를 합성하였다. 하이브리도마의 제조

면역

항원 물질이 PBS에 용해된 용액 0.8 mL(항원 물질의 농도: 0.5 mg/mL)와 완전한 Freund의 보조제(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 0.8mL를 혼합하여 현탁액(항원 농도: 0.25mg/mL)을 얻었다. 그 후, 상기 현탁액 0.2 mL를 BALB/c 마우스에 복강내 투여하였다. 같은 양의 상기 현탁액을 2주마다 상기 마우스에 추가로 투여하였다. 그러고 나서, 투여 시작 16주 후, 항원이 PBS에 용해된 용액(항원 농도: 600~1000 mg/mL) 0.2mL를 최종 용량으로 마우스에 복강내 투여하였다. 투여 시 눈 뒤쪽의 정맥을 통해 피를 뽑고 ELISA로 항체역가를 측정하였다. 마지막 투여일로부터 4일 후, 채혈을 수행하고, 이로써 얻은 혈액을 원심 분리(2000 rpm, 20분)하여 항혈청을 얻었고, 이것을 하기 실험에서 대조 항혈청으로 사용하였다. 그뿐만 아니라, 채혈 후, 래트로부터 비장 세포를 제거하여, 얻은 비장 세포를 하기의 세포 융합에 사용하였다.

세포 융합

상기 비장 세포와 골수종 세포(P3X63-Ag.8.653)를 비장 세포:골수종 세포 = 10:1~10으로 혼합하여 원심 분리(1500 rpm, 5분)하였다. 원심 분리 후, 흡입기(aspirator)를 사용하여 상등액을 제거하고, 37℃의 폴리에틸렌 글리콜 4000(50% PBS 용액) 1mL를 1분에 걸쳐 앞에서 얻은 세포 펠릿(pellet)에 첨가하여 혼합액을 형성하였다. 상기 혼합액을 37℃에서 1분 동안 방치한 후, 37℃의 IMDM 배지를 30초마다 1mL씩 첨가(총 9mL)한 후, 원심 분리(1500 rpm, 5분)하였다. 원심 분리 후, 흡입으로 상등액을 제거하고, 37℃의 IMDM(GIBCO) 배지를 함유하는 15% FCS(JRH BIOSCIENCES)의 적정량을 첨가하였다. 이로써 얻은 현탁액을 96-웰 배양 플레이트에 각각 100mL씩 배분하고, 37℃/5% CO₂의 배양기에서 하룻동안 배양하였다. 이와 더불어, HAT 배지(HAT 분말(HAT MEDIA SUPPLEMENT(X50), SIGMA)를 무혈청 IMDM 배지 10 mL에 용해시키고, 그 후 IMDM 배지를 함유하는 10% FCS로 50회 희석함) 100mL를 첨가하고, 37℃/5% CO₂의 배양기에서 배양하였다. HAT 배지를 2~3일에 한번씩 교체해주고, 10일 후, HT 배지(HT 분말(HT MEDIA SUPPLEMENT, SIGMA)를 무혈청 IMDM 배지 10mL에 용해시킨 후, IMDM 배지를 함유하는 10% FCS로 50회 희석함)으로 바꾼 후, 37℃/5% CO₂의 배양기에서 3일 동안 배양하였다. 그 후, 배지(HT 배지)를 2~3일에 한번씩 교체하였다. 현미경으로 세포 성장을 확인한 후, 배양 상등액(약 100mL)을 채취하였다. 상기 배양 상등액을 사용하여, 항원역가를 측정함으로써 하이브리도마의 스크리닝을 수행하였다.

하이브리도마 세포의 스크니링

항체역가 측정

상기 항원물질(5mg)을 함유하는 완충 용액(중탄산 완충 용액: 100mM NaHCO₃-NaOH, pH 9.2~9.5, 펩티드 농도: 1 ㎍/mL)을 96-웰 납작바닥 플레이트에 웰 1개당 50 ㎕씩 첨가하여, 코팅을 위해 실온에서 2시간 동안 방치하였다. 상기 플레이트를 세척 완충 용액(PBST)으로 3회 세척한 후, 블로킹(blocking) 완충 용액(3% 탈지우유, 1% BSA, PBS)을 웰 1개 당 200~250 ㎕씩 첨가하여, 4℃에서 하루 종일 반응하게 한 후, 3회 세척하였다. 그러고 나서, 하이브리도마의 배양 상등액을 웰 1개당 100 ㎕씩 첨가한 후, 37℃에서 4시간 동안 또는 4℃에서 하루 종일 반응하게 하였다. 상기 플레이트를 3회 세척한 후, 희석 완충 용액(10 nM Tris-HCL (pH 8.0), 0.9% (W/V) NaCl, 0.05% (W/V) Tween 20)으로 10000회 희석된 바이오틴-표지된 항-마우스 IgG(SIGMA)를 웰 1개당 50㎕씩 첨가한 후, 실온에서 2시간 동안 반응하게 하였다. 세척을 6회 수행한 후, 희석 완충 용액으로 1000회 희석된 알칼린 포스파타제-표지된 스트렙타리딘(Streptaridin)을 웰 1개당 50㎕씩 첨가한 후, 실온에서 1~2시간 동안 반응하게 하였다. 그러고 나서, 세척을 6회 수행하고, 형광 기질 완충 용액(Attophos 기질 완충 용액, Roche Diagnostics K.K.)을 웰 1개당 50㎕씩 첨가한 후, 형광이 발연되도록 하기 위해 플레이트를 그늘에 두었다. CytoFluor II(PerSeptive Biosystems)에서 형광 세기를 측정하였다.

하이브리도마의 스크리닝

상기 항체역가 측정에서 양성의 결과(1X0⁵ 세포수/mL)를 나타낸 웰들에, IMDM 배지를 함유한 15% FCS 10% HCF(하이브리도마 클로닝 요인, ORIGIN)를 첨가하였는데, 96-웰 배양 플레이트에 웰 1개당 약 세포수 200으로 배분하여, 37℃/5% CO₂의 배양기에서 배양하였다. 그 후, 상기와 같이 항체역가를 측정하여, 높은 항체 수율을 나타내는 하이브리도마를 선택하였다.

추가로 한계 희석법(limiting dilution)을 수행하여 선택된 하이브리도마를 IMDM 배지를 함유하는 15% FCS 10% HCF로 웰 1개 당 세포수 0.5~1개로 희석하였다. 약 3~4일 동안 37℃/5% CO₂의 배양기에서 배양한 후, 상기와 같이 항체역가를 측정하여 높은 항체 수율을 나타내는 하이브리도마를 선택하였다. 이어서 한계 희석법을 반복하여 상기 항원물질에 대항하는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 얻었다. 이들 중에서 항체역가가 가장 높은 하이브리도마를 선택하여 마우스-마우스 하이브리도마 SSV-C 93-3으로 명명하였다.

모토클로날 항체의 획득

RPMI 배지(1X106 세포수/mL)를 함유하는 15% FCS를 사용하여, 하이브리도마 마우스-마우스 하이브리도마 SSV-C 93-3을 배양하였다. 그러고 나서, 하이브리도마 배지을 채취하고, 죽은 세포 파편을 제거하기 위해 필터를 통해 여과하였다. 그 후, 배양 상등액에 황산암모늄을 첨가하여 최종 농도를 40%로 조정하고, 40℃에서 1시간 동안 교반하였다. 그 후, 원심 분리(3000 g, 30분, 4℃)를 수행하고, 상등액을 처분하여 석출물을 수집하였다. 상기 석출물을 상기 배양 상등액의 양의 1/10에 해당하는 부피의 PBS에 용해시키고, 밤새 PBS에 대하여 여막 분석하였다.

그 후, 상기 석출물을 20mM 인산나트륨 완충 용액(pH 7.0)으로 2회 희석하고, 1M Tris-HCL 완충 용액과 함께 HiTrap NHS 활성 칼럼에 적재하였다. 그 후, 0.1M 글리신 HCl 용액(pH 2.7)으로 항체를 용출시켜, 분획관(fraction tube)에 항체를 수집하였다.

시험예 1: SSVmAb 이소타입의 확인

실시예 1의 모노클로날 항체(SSVmAb)의 이소타입을 확인하기 위해, Mouos 모노클로날 항체 이소타입핑 시약(SIGMA)을 사용하여 이소타입 확인 시험을 수행하였다.

결과를 도 1에 나타내었는데, IgG1이 가장 높은 값을 나타냄을 보여준다.

추가로, 마우스 IgG1(eBioscience)과 실시예 1의 모노클로날 항체(SSVmAb)를 2-메르캅토에탄올로 환원하고 SDS-PAGE로 분석할 때, 중사슬 및 경사슬에 해당하는 밴드들은 둘 다 유사한 위치(50KD, 25KD)에서 관측되었다. 한편, 마우스 IgG1 대신 마우스 IgM(eBioscience)를 사용하여 유사한 실험을 수행할 때 유사한 밴드들이 관측되지 않았다.

도 1 및 SDS-PAGE의 결과로부터, 실시예 1의 모노클로날 항체(SSVmAb)의 이소타입이 IgG1으로 밝혀졌다.

시험예 2: 코어 히스톤에 대한 SSVmAb 의 친화도 측정

WO2006/025580은 하이브리도마 16G9(수탁 번호 FERM BP-10413)에 의해 생산되는 모노클로날 항체(16G9mAb)를, 면역 억제를 위해 사용될 수 있고 SEQ ID NO:1로 표현되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드에 결합하는 항 H1 모노클로날 항체로 보고하였다.

따라서, WO2006/025580에 기술된 항체(16G9mAb)를 참조예 1로 사용하여, 항원에 대한 친화도를 실시예 1의 모노클로날 항체(SSVmAb)의 친화도와 비교하였다.

항원의 경우, 참조예 1의 항원(16G9mAb)인 히스톤 H1과, 히스톤 H1 항원 유사체인 코어 히스톤 H2A, H2B, H3 및 H4를 선택하였다.

히스톤 H1 또는 코어 히스톤과 SSVmAb 사이의 친화도는 ELISA로 측정하였다.

96-웰 마이크로플레이트를 히스톤 H1, H2A, H2B, H3 또는 H4로 코팅하였다. 사용된 각 히스톤을 100mM 탄산나트륨 완충 용액(pH 9.3)에 용해시켰다. 상기 플레이트를 PBS-tween 20(0.05%)으로 세척하고, 3% 탈지 우유 및 1% BSA로 1시간 동안 블로킹하였다. 각각의 웰에 SSVmAb 5 ㎍/mL을 첨가하여 1시간 동안 배양하였다. 퍼옥시다제(HRP) 컨쥬게이트된 항 마우스 IgG1 Ab(SIGMA)를 사용하여 결합된 SSVmAb를 검출하고, 1시간 동안 배양하였다. ABTS [2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-술폰산)] 기질 용액을 사용하여 결합된 SSVmAb를 검출하였고, Multiskan Ascent(Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA)를 사용하여 405 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

결과를 도 2 및 3에 나타내었다.

도 2에 나타난 바와 같이, 실시예 1(SSVmAb)의 경우, 히스톤 H2A, H2B, H3 또는 H4에 대한 친화도는 히스톤 H1에 대한 친화도보다 높았다.

한편 도 3에 나타난 바와 같이, 참조예 1(16G9)의 경우, 히스톤 H1에 대한 친화도가 히스톤 H2A, H2B, H3 및 H4에 대한 친화도보다 높았다.

시험예 3: MLR 시험

무처리(naive) DA 래트의 비장 림프구(반응 세포)와, 미토마이신-C(Kyowa Hakko Kogy Co., Ltd.)로 처리된 LEW 래트의 비장 림프구를 사용하였다. 10% FCS-RPMI 배지로 상기 반응 세포를 5×10⁵ 세포수/mL로 조절하였고, 10% FCS-RPMI 배지로 자극된(stimulated) 세포를 8×10⁶ 세포수/mL로 조절하였다. 반응 세포 현탁액과 자극된 세포 현탁액을 96-웰 둥근바닥 플레이트(Nunc Brand Products)에 각 100 ㎕씩 플레이팅 한 후, 참조예 1의 모노클로날 항체 16G9mAb(0.1, 2, 4, 또는 6 ㎍/mL/웰) 또는 실시예 1의 모노클로날 항체 SSVmAb(4 ㎍/mL/웰)을 혼합 배양을 시작할 때 첨가하여, 37℃, 5% CO₂/95% 공기의 조건 하에 3.5일 이상 배양하였다. 그뿐만 아니라, 면역억제제 타크롤리무스(FK506: Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd., 1nM/웰)을 양성 대조표준으로 첨가하였다. 추가로, 배양이 종료되기 15시간 전에 브로모데옥시유리딘(BrdU) 10 ㎕를 첨가하였다. 그러고 나서, 세포 DNA에 도입된 BrdU의 양을 지표로 사용하는 BrdU 표지 & 검출 키트 III (Roche diagnostics K.K.)을 사용하여, 면역억제제로 처리된 세포의 증식 잠재력(proliferation potential)을 측정하였다. 상기 증식 잠재력을 면역 억제의 수준에 대한 지표로 사용하였다.

결과를 표 4에 나타내었다.

실시예 1(SSVmAb)의 경우, 도입된 BrdU의 양을 나타내는 흡광도가 참조예 1(16G9mAb) 및 타크롤리무스(FK506)의 흡광도보다 낮았다. 특히, 실시예 1(SSVmAb)의 흡광도 0.552 ± 0.114(평균 ± S.E.)와 동일한 양(4 ㎍/mL/웰)이 첨가된 참조예 1(16G9mAb)의 흡광도 1.351 ± 0.389 (평균 ± S.E.)을 비교했을 때, 실시예 1의 평균값이 참조예 1의 평균값의 약 41%였다.

시험예 4: T 세포와의 모노클로날 항체( SSVmAb )의 반응성 측정

하기 방법을 사용하여, C57BL/6 마우스(5주령, 암컷, CHARLES RIVER LABORATORIES JAPAN, INC.)에서 비장을 떼어내어 온전한(whole) 비장 세포를 준비하였다.

우선, RPMI 1640 배지(Sigma-Aldrich, R-8758) 5ml를 옮겨 담은 5 ml 배양 접시(BD Bioscience FALCON 351007)에서, 절개용 가위와 겸자로 비장을 분해하여 비장 세포들을 현탁화하고, 이 세포들을 15ml 원심 분리용 시험관(BD Bioscience FALCON 352096)에 옮겨 담았다. 그러고 나서, 5ml 접시를 인산 완충 용액 식염수(PBS, Invitrogen, 20012-027)로 수회 세척하고, 이 세척액을 또한 앞서 세포 현탁액에 첨가하여 방치한 후, 또 다른 15ml 원심 분리용 시험관에 상등액을 수집하였다. 추가로, 상기 잔여 불용성 비장 조직에 다시 RPMI 1640 배지 5ml을 첨가하여 방치한 후, 상등액만을 수집하고, 이것을 상기 세포 현탁핵과 혼합하여 1,500rpm으로 5분 동안 원심 분리를 수행하였다. 수집한 세포에 라이시스 완충 용액(150 mM NH₄Cl/ 15 mM NaHCO₃/ 0.1 mM EDTA-Na₂, pH 7.3) 2ml를 첨가하고, 탭핑(tapping)으로 용혈한 후, PBS 10ml를 첨가하였다. 1,500 rpm으로 5분간 원심 분리함으로써 3회 세척한 후, 온전한 비장 세포를 얻었다.

이후, 하기의 방법에 따라, Pan T 세포 단리 키트, 마우스(Milternyi Biotec, 130-090-861)를 사용하는 자성 분류(magnetic sorting)(MACS)에 의해 상기 비장 세포에서 온전한 T 세포를 정제하였다.

우선, 비장 세포를 5×10⁷ 세포수/200 ㎕ 비율로 MACS 완충 용액(0.5% 소혈청 알부민(BSA, NACALAI TESQUE, INC., 08777-36)/PBS)에 현탁화하고, 여기에 50 ㎕ 바이오틴-항체 칵테일/5×10⁷ 세포수를 첨가하여 4℃에서 10분 동안 배양하였다. 이것을 150 ㎕ MACS 완충 용액/5×10⁷ 세포수에 현탁화한 후, 100 ㎕ 항-바이오틴 마이크로 비즈/5×10⁷ 세포수를 첨가하여 4℃에서 15분 동안 배양하였다.여기에, MACS 완충 용액(10 ml)을 첨가하고 1500rpm으로 5분 동안 원심 분리함으로써 세척한 후, 회수된 세포를 MACS 완충 용액 500 ㎕에 현탁화하였다. MACS 칼럼(MS 칼럼, Miltenyi Biotec, 130-042-201)을 자석(MiniMACS 분리 유닛, Miltenyi Biotec, 130-090-312) 안에 위치시키고 MACS 완충 용액 500 ㎕와 평형을 유지시킨 후, 상기 세포 현탁액을 적재하였다. 흐름 분획(flow through fraction) 500 ㎕와 추후 칼럼 세척 분획(1.5ml)을 MACS 완충 용액과 함께 수집하여 정제된 자극되지 않은 T 세포(순도 약 97%)를 얻었다.

상기의 자극되지 않은 16G9mAb 또는 SSVmAb의 반응성을 유세포 분석기(flow cytometry)(FACS)로 분석하였다.

우선, 각 T 세포 샘플(1X10⁶ 세포수)을 FACS 완충 용액(0.5 % FBS/PBS/0.02% NaN₃) 89 ㎕에 현탁화한 후, 항-마우스 CD16/32-블록 Fc 결합(eBioscience, 14-0161-85) 1 ㎍을 추가하고 4℃에서 20분 동안 배양하였다. 여기에 1차 항체로서 16G9mAb 10 ㎕ 또는 SSVmAb(100 ㎍/ml)를 첨가하고 4℃에서 60분 동안 배양하였다. FACS 완충 용액으로 2회 원심 분리함으로써 세포를 세척한 후, 2차 항체(바이오틴-컨쥬게이트된 항-마우스 IgM mAb(eBioscience, 13-5780-85) 또는 바이오틴-컨쥬게이트된 래트 항-마우스 IgG1 mAb(BD Biosciences, 553441), 각각 1 ㎍/ml) 100 ㎕를 첨가하고, 4℃에서 30분 동안 배양하였다. 세포를 다시 FACS 완충 용액으로 2회 원심 분리함으로써 세척한 후, 스트렙타비딘-PE-Cy7(BD Biosciences, 556463, 1 ㎍/ml) 100 ㎕를 첨가하고, 여기에 FITC-컨쥬게이트된 래트 항-마우스 CD3 mAb(BD Biosciences, 553062)를 첨부하여 최종 농도를 1 ㎍/ml으로 만들고, 4℃에서 30분 동안 배양하였다. FACS 완충 용액으로 2회 원심 분리함으로써 세척한 후, 40 ㎛-세포 스트레이너(cell strainer)(BD Bioscience, FALCON 352340)로 여과 처리한 후, 각 샘플에 FACS Calibur 유세포 분석기 및 CellQuest 소프트웨어(BD Bioscience)를 실시하여 16G9 mAb 또는 SSV mAb 양성/CD3 양성 T 세포의 개수를 분석하였다.

그 결과를 도 5에 나타내었다.

참조예 1(16G9 mAb)를 실시예 1(SSV mAb)과 비교할 경우, CD3 양성 T 세포에 대한 반응성과 관련하여 현저한 차이가 관측되지 않았고, 이와 같은 항체들은 동등한 반응성(스튜던트 t-검정, p < 0.05)을 나타내었다. 시험예 5: SSV mAb 에 의한 하향 조정용 표적 확인

실시예 1 (SSV mAb)에 의해 하향 조정될 수 있는 7개의 후보 단백질을 단백질체(proteome) 분석으로 확인하였다.

그 다음 7개의 후보 단백질 중에서, 아래 기재된 방법에 의해 실시예 1 (SSV mAb) 의 표적 항원이 될 ATP 합성효소를 결정하였다.

첫번째, 미토콘드리아 ATP 합성효소가 제거된 Balb/c 마우스의 T 세포를 서모 피숴 사이언티픽 사(Thermo Fisher Scientific Inc)의 Accell siRNA 키트를 사용해 획득하였다.

다음, 시험예 2의 방법에 따라, MLR 시험을 획득한 T 세포를 이용하는 시험 물질로서 실시예 1 (SSV mAb)을 사용해 수행하였다.

시험에서, 이소타입 IgG1 (eBioscience)를 조절제로서 사용하었다. 게다가, 대조 시험으로서 ATB 합성효소가 제거되지 않은 마우스의 T 세포를 사용해 비슷한 테스트를 수행하었다.

상기 결과를 도 6A 및 6B에 나타내었다.

도 6에 나타난 것처럼, 상기 ATP 합성효소는 제거되지 않았을 때, 실시예 1 (SSV mAb)는 이소타입 IgG1과 비교했을 때 세포 성장을 상당히 억제했다.

한 편, 도 6B에 나타난 것처럼, ATP 합성 효소가 제거되었을 때, 실시예 1 (SSV mAb) 및 이소타입 IgG1 사이에 세포 성장 억제에 대해 상당한 차이는 관찰되지 않았다.

도 6A 및 6B는 SSV mAb의 면역 억제 활성이 ATP 합성 효소를 제거함에 의해 감소되고, 그리고 SSV mAb는 면역 억제 후 ATP 합성효소의 활성을 하향 조정한다는 것을 제안한다. 시험예 6: SSV mAb 합성의 경사슬 및 중사슬의 가변 영역에 대한 서열의 확인 cDNA 하이브리도마의 합성

전체 RNA를 FastPure RNA 키트 (TaKaRa)를 사용하여 시험예 1 (마우스-마우스 하이브리도마 SSV-C-93-3)에서 획득한 하이브리도마 1.6×10⁷세포로부터 제조하였다. Total RNA (NIPPON GENE)에서 폴리 (A)⁺분리 키트를 사용하여, 전체 RNA 240 ㎍를 mRNA로부터 제조하였다. mRNA을 침전시키기 위해 Etachinmate (NIPPON GENE)을 사용해 에탄올 침전을 수행하였다. 75% 에탄올로 세척 후에, mRNA을 건조시켰다. 이를 위해, 10 ㎕ RNase 자유수를 mRNA을 용해시키기 위해 첨가하였다. 획득한 mRNA 용액을 -80℃에서 저장하였다. SMARTer RACE cDNA 증폭 키트 (Clontech)를 이용하여, 5'-RACE에 대한 cDNA를 1 ㎍ SSV 하이브리도마 mRNA로부터 합성하였다. 획득한 cDNA 용액을 -20℃에서 저장하었다. SSV mAb 의 경사슬 및 중사슬에서 상보성 결정 영역 ( CDR )의 확인

마우스 IgG1 중사슬이 불면 영역의 염기 서열을 근거로 하여, 프라이머 5'-CAC CAT GGA GTT AGT TTG GGC AGC AG-3' (SEQ ID NO: 12)을 제조하였다. 마우스 경 사슬 κ불변 영역의 서열의 염기 서열을 근거로, 프라이머 5'-CAC GAC TGA GGC ACC TCC AGA TG-3' (SEQ ID NO: 13)를 제조하였다. 각각의 프라이머 및 유니버살 프라이머 A 믹스 (SMARTer RACE cDNA 증폭 키트에 포함된 프라이머)를 사용하여, 주형으로 cDNA를 사용하여 5'-RACE를 수행하였다. RACE 반응에서, Advantage2 PCR 키트(Clontech)를 사용하였다. 반응 혼합물을 아가로오즈 전기이동 시키고, 그리고 약 600 bp의 중사슬 5'-RACE 생성물 및 약 550 bp의 경사슬 5'-RACE 생성물을 E.Z.N.A. 겔 추출 키트 (OMEGA bio-tek)을 사용하여 겔로부터 정제하였다. 이것을 pGEM-T 이지 벡터 (Promega)에 연결시키고, 이것으로 컴피던트 하이(Competent high) E.coli DH5a (TOYOBO)를 변형시켰다. 생성물인 형질전환체로부터, 플라스미드를 E.Z.N.A. 플라스미드 Miniprep 키트I (OMEGA bio-tek)를 사용하여 제조하였다. 제조된 플라스미드를 주형으로 사용하여, 고리 반응을 BigDye 터미네이터 v3.1 사이클 시퀀싱 키트 (Applied Biosystems)를 사용하여 수행하였다.

다음, 경사슬 및 중사슬 가변 영역의 염기 서열을 DNA 서열 분석기를 사용하여 분석하였다 (Applied Biosystems).

그 결과, 상기 경사슬 가변 영역의 염기 서열은 SEQ ID NO: 5의 제 67번 내지 제 384번으로 표시된다는 것을 발견하였다.

더욱, 상기 중사슬 가변 영역의 염기 서열은 SEQ ID NO: 10의 제 58번 내지 제 423번으로 표시된다는 것을 알 수 있다.

이식 개시 코돈 및 Kabat 등에 따른 방법에 의해 결정되는 FR (불변 영역)의 위치를 근거로 하여, 다음을 측정하였다: SEQ ID NO: 5의 제 1번 내지 제 66번은 경사슬 신호 펩티드의 염기 서열에 해당하고, 그리고 SEQ ID NO: 10의 제 1번 내지 제 57번은 중사슬 신호 펩티드의 염기 서열에 해당한다.

다음, 경사슬 및 중사슬의 가변 영역의 아미노산 서열을 획득한 염기 서열로부터 평가하였고, CDR 영역을 Kabat 등의 방법에 따라 확인하였다.

그 결과, 경사슬 가변 영역의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 6의 제 23번 내지 제 128번으로 표시될 수 있다는 것을 발견하였다. 여기서, SEQ ID 번호: 6의 제 1번 내지 제 22번은 경사슬 신호 펩티드의 아미노산 서열에 해당한다.

더욱, 경사슬 가변 영역의 아미노산 서열에서, 다음이 결정되었다: CDR1은 RASSSVSYMH (SEQ ID NO: 2)로 표시되고, CDR2는 ATSNLAS (SEQ ID NO: 3)으로 표시되고, 그리고 CDR3는 QQWSSNPWT (SEQ ID NO: 4)로 표시된다.

또한, 중사슬 가변 영역의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 11의 제 20번 내지 제 141번으로 표시된다는 것을 발견하였다. 여기서, SEQ ID NO: 11의 제 1번 내지 제 19번은 중사슬 신호 펩티드의 아미노산 서열에 해당한다.

게다가, 경사슬 가변 영역의 아미노산 서열에서, 다음이 결정되었다: CDR1은 GYNMN (SEQ ID NO: 7)로 표시되고, CDR2는 NINPYYGSTSYNQKFKG (SEQ ID NO: 8)로 표시되고, 그리고 CDR3은 SPYYSNYWRYFDY (SEQ ID NO: 9)로 표시된다.

NPMD (독)제품평가기술기반기구 특허미생물기탁센터(NPMD)

NPMD00972

20100817

SEQUENCE LISTING <110> Josaiuiversity corporation <120> Monoclonal antibody having immunosuppresive activity or antigen-binding fragment thereof <130> 190836PX <150> JP 2010-185406 <151> 2010-08-20 <160> 13 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> SSV PEPTIDE <400> 1 Ser Ser Val Leu Tyr Gly Gly Pro Pro Ser Ala Ala 1 5 10 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> SSV Mab- LIGHT CHAIN VARIABLE REGION CDR1 <400> 2 Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His 1 5 10 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> SSV Mab- LIGHT CHAIN VARIABLE REGION CDR2 <400> 3 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> SSV Mab- LIGHT CHAIN VARIABLE REGION CDR3 <400> 4 Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Trp Thr 1 5 <210> 5 <211> 384 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SSV Mab- LIGHT CHAIN VARIABLE REGION DNA <400> 5 atggattttc aagtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcttcagt cataatgtcc 60 agaggacaaa ttgttctctc ccagtctcca gcaatcctgt ctgcatctcc aggggagaag 120 gtcacaatga cttgcagggc cagctcaagt gtaagttaca tgcactggta ccagcagaag 180 ccaggatcct cccccaaacc ctggatttat gccacatcca acctggcttc tggagtccct 240 gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaatcag cagagtggag 300 gctgaagatg ctgccactta ttactgccag cagtggagta gtaacccgtg gacgttcggt 360 ggaggcacca agctggaaat caaacgg 387 <210> 6 <211> 128 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> SSV Mab- LIGHT CHAIN VARIABLE REGION PRT <400> 6 Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Ile Met Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile 20 25 30 Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser 50 55 60 Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp 100 105 110 Ser Ser Asn Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 115 120 125 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> SSV Mab- HEAVY CHAIN VARIABLE REGION CDR1 <400> 7 Gly Tyr Asn Met Asn 1 5 <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> SSV Mab- HEAVY CHAIN VARIABLE REGION CDR2 <400> 8 Asn Ile Asn Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 9 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> SSV Mab- HEAVY CHAIN VARIABLE REGION CDR3 <400> 9 Ser Pro Tyr Tyr Ser Asn Tyr Trp Arg Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 10 <211> 423 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SSV Mab- HEAVY CHAIN VARIABLE REGION DNA <400> 10 atgggatgga gctggatctt tctcttcctt ctgtcagtaa ctgcaggtgt ccactctgag 60 atccagctgc agcagtctgg agctgagctg gtgaagcctg gggcttcagt gaagatatcc 120 tgcaaggctt ctggttactc attcactggc tacaacatga actgggtgaa gcagagccat 180 ggaaagagcc ttgagtggat tggaaatatt aatccttact atggtagtac tagctacaat 240 cagaagttca agggcaaggc cacattgact gtagacaaat cttccagcac agcctacatg 300 cagctcaaca gcctgacatc tgaggactct gcagtctatt actgtgcaag aagtccctac 360 tatagtaact actggaggta ctttgactac tggggccaag gcaccactct cacagtctcc 420 tca 423 <210> 11 <211> 141 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> SSV Mab- HEAVY CHAIN VARIABLE REGION PRT <400> 11 Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly 1 5 10 15 Val His Ser Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45 Thr Gly Tyr Asn Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Asn Ile Asn Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr Ser Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Pro Tyr Tyr Ser Asn Tyr Trp Arg Tyr Phe 115 120 125 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PRIMER <400> 12 caccatggag ttagtttggg cagcag 26 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PRIMER <400> 13 cacgactgag gcacctccag atg 23

Claims

SSVLYGGPPSAA (SEQ ID NO: 1)으로 표시된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 상기 펩티드와 약제학적으로 허용가능한 담체의 컨쥬게이트에 결합하는 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 단편으로,
RASSSVSYMH (SEQ ID NO: 2)로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDR1, ATSNLAS (SEQ ID NO: 3)로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDR2 및 QQWSSNPWT (SEQ ID NO: 4)로 표시되는 아미노산으로 이루어진 CDR3를 포함하는 경사슬 가변 영역을 포함하고,
GYNMN(SEQ ID NO: 7)로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDR1, NINPYYGSTSYNQKFKG (SEQ ID NO: 8)로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDR2 및 SPYYSNYWRYFDY (SEQ ID NO: 9)로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDR3를 포함하는 중사슬 가변 영역을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.
제1항에 있어서, SSVLYGGPPSAA (SEQ ID NO: 1)으로 표시된 아미노산 서열로 이루어진 펩티드 또는 상기 펩티드와 약제학적으로 허용되는 담체의 컨쥬게이트에 대한(against) 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.
삭제
제1항에 있어서, 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 단편의 경사슬 가변 영역이 SEQ ID NO:6의 제23번 내지 제128번으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.
삭제
제1항에 있어서, 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 단편의 중사슬 가변 영역이 SEQ ID NO: 11의 제20번 내지 제141번으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.
제1항에 있어서, ATP 합성효소 활성을 하향 조절하는 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.
제1항에 있어서, 상기 모노클로날 항체가 키메라, 인간화 또는 인간 항체인 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.
제1항에 있어서, 상기 모노클로날 항체 또는 항원 결합 단편은 히스톤 H1보다 코어 히스톤에 높은 결합 친화성을 가지며,
상기 코어 히스톤은 히스톤 H2A, H2B, H3 및 H4 중으로부터 선택되는 하나 이상인 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.
제1항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용가능한 담체가 키홀 림펫(keyhole limpet) 헤모시아닌, 난백알부민 또는 소혈청 알부민인, 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.
제1항에 있어서, 하이브리도마 마우스-마우스 하이브리도마 SSV-C 93-3에 의해 생산되는, 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.
제1항에 있어서, 항원 결합 단편이 Fab, Fab', (Fab')₂, Fv 또는 scFv인 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.
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제1항, 제2항, 제4항, 제6항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 모노클로날 항체 또는 항원 결합 단편을 생산하는 하이브리도마.
제16항에 있어서, 하이브리도마 마우스-마우스 하이브리도마 SSV-C93-3인 하이브리도마.
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제1항에 따른 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 단편을 포함하는, 포유동물의 면역 억제용 조성물.
제1항에 따른 모노클로날 항체 또는 그것의 항원 결합 단편을 포함하는, 포유동물의 장기 이식 거부의 발생 위험 감소용 조성물.