KR101671039B1

KR101671039B1 - 항 ｃｘｃｒ4 항체 및 그들의 암의 치료를 위한 용도

Info

Publication number: KR101671039B1
Application number: KR1020117009556A
Authority: KR
Inventors: 크리스땅 끌렝귀에르-앙무르; 베로니끄 그랑이에르-꼬쌰넬; 베로니끄 그랑이에르-꼬?넬
Original assignee: 피에르 파브르 메디카먼트
Priority date: 2008-10-01
Filing date: 2009-10-01
Publication date: 2016-11-01
Also published as: PT2342233E; EP2172485A1; MX2011003509A; CN102209730B; GEP20146084B; DK2342233T3; ZA201102969B; RU2573897C2; PL2342233T3; AU2009299787A1; US9388248B2; SI2342233T1; JP5723279B2; US20140050661A1; RU2011115559A; US20110020218A1; RS53578B1; ES2503732T3; US20110287451A1; IL212066A

Abstract

본 발명은 CXCR4에 결합할 수 있을 뿐만 아니라 CXCR4 호모이중머 (homodimers) 및/또는 헤테로이중머 (heterodimers)의 형태적 변화 (conformational change)를 유도할 수 있는 새로운 분리된 항체, 또는 이로부터 유래된 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 CXCR4 단백질에 대해 특이적인 414H5 및 515H7 항체뿐만 아니라 그들의 암의 치료를 위한 용도에 관한 것이다. 이러한 항체로 구성되는 약제학적 조성물 또한 이러한 항체를 선별하는 방법도 역시 포함된다.

Description

항 ＣＸＣＲ4 항체 및 그들의 암의 치료를 위한 용도 {Anti CXCR4 antibodies and their use for the treatment of cancer}

본 발명은 새로운 항체, 보다 상세하게는 케모카인 수용체 (chemokine receptors, CXCR)뿐만 아니라 이러한 항체를 코딩하는 아미노산 및 핵산 서열에 특이적으로 결합할 수 있는, 마우스의 키메라 (chimeric) 또는 인간화 (humanized) 모노클론 항체에 관한 것이다. 한 가지 관점으로부터, 본 발명은 상기 CXCR4에 특이적으로 결합할 수 있고 강한 항-종양 활성을 가지는 새로운 항체, 이로부터 유래된 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다. 또한 본 발명은 암의 예방적 및/또는 치료적 처치를 위한 약물로서, 뿐만 아니라 암 진단과 관련된 방법 또는 키트에서 이러한 항체의 용도를 포함한다. 마지막으로, 본 발명은 항체, 독소, 세포독성제 (cytotoxic)/세포증식억제제 (cytostatic)와 같은 기타 항-암 화합물과 조합되거나 결합된 이러한 항체를 포함하는 조성물, 및 그의 소정의 암 예방 및/또는 치료를 위한 용도를 포함한다.

케모카인 (chemokines)은. 케모카인 구배 (chemokine gradient)라고 알려져 있는 리간드의 화학적 구배를 따라 특히 면역 반응 시 백혈구의 이동을 조절하는 작은 분비 단백질이다 (Zlotnick A. et al., 2000). 그들은 NH₂-말단 시스테인 잔기의 위치에 기초하여 두 가지의 주요 서브패밀리, CC 및 CXC로 나누어지고, G 단백질과 연결된 수용체에 결합하며, 이들 두 가지 주요 서브패밀리는 CCR 및 CXCR 이라고 명명된다. 지금까지 50가지 이상의 인간 케모카인 및 18가지의 케모카인 수용체가 발견되어 왔다.

많은 암은 종양의 면역세포 침윤뿐만 아니라 종양세포 성장, 생존, 이동 (migration) 및 혈관형성 (angiogenesis)에 영향을 주는 복잡한 케모카인 연결망 (network)를 가진다. 면역세포, 내피세포 및 종양세포는 스스로 케모카인 수용체를 발현시키고 케모카인 구배에 반응할 수 있다. 인간 암 생검 시료와 마우스 암 모델의 연구는 암 세포의 케모카인-수용체 발현이 전이 능력 (metastatic capacity)의 증가와 관련된 것을 보여준다. 서로 다른 암 유형으로부터 나온 악성 (malignant) 세포들은 서로 다른 케모카인-수용체 (chemokine-receptor) 발현의 프로파일을 가지지만, 케모카인 수용체 4 (CXCR4)는 가장 공통적으로 발견되고 있다. 표피 (epithelial), 중간엽 (mesenchymal) 및 조혈 (haematopoietic) 기원의 적어도 23가지 서로 다른 유형의 인간 암으로부터 나온 세포가 CXCR4 수용체를 발현한다 (Balkwill F. et al ., 2004).

케모카인 수용체 4 [퓨신 (fusin), CD184, 레스터 (LESTR) 또는 험스터 (HUMSTR)라고도 알려져 있음]는 352개 또는 360개의 아미노산을 포함하는 두 가지 이소형으로서 존재한다. Asn 11번 잔기는 당화되어 있고 Tyr 21번 잔기는 설페이트 그룹의 부가에 의해 변형되어 있으며 Cys 109번 및 186번은 수용체의 세포외 (extracellular) 부분 상에 디설파이드 연결 (disulfide bridge)로 결합되어 있다 (Juarez J. et al., 2004).

이 수용체는 서로 다른 종류의 정상 조직, 그대로의 (naive) 비-메모리 T-세포, 조절 T-세포, B-세포, 호중성구, 내피세포, 일차 단핵구, 가지세포 (dendritic cells), 자연 킬러 세포, CD34+ 조혈 줄기세포에 의해, 또한 낮은 수준으로는 심장, 결장, 간, 신장 및 뇌에서 발현된다. CXCR4는 백혈구 포집 (trafficking), B 세포 백혈구 형성 (lymphopoiesis) 및 골수 형성 (myelopoiesis)에서 중요한 역할을 한다.

CXCR4 수용체는, 이에 제한되는 것은 아니지만 결장 (Ottaiano A et al ., 2004), 유방 (Kato M. et al., 2003), 전립선 (Sun Y. X. et al., 2003), 폐 [소세포- 및 비-소세포 암종 (Phillips R. J. et al., 2003)], 난소 (Scotton C. J. et al., 2002), 췌장 (Koshiba T. et al., 2000), 신장, 뇌 (Barbero S. et al., 2002), 아교모세포종 (glioblastoma) 및 림프종 (lymphomas)을 포함하는 많은 수의 암에서 과다-발현 (over-express)된다.

지금까지 기술된 CXCR4 수용체의 유일한 리간드는 간질세포-유래 인자-1 (Stromal-cell-derived factor-1, SDF-1) 또는 CXCL12 이다. SDF-1은 림프절, 골수, 간, 폐에서 다량 분비되고, 보다 소량으로는 신장, 뇌 및 피부에 의해 분비된다. 또한 CXCR4는 인간 허피스바이러스 타입 III에 의해 인코딩되는 길항적 케모카인 (antagonistic chemokine)인 바이러스성 대식세포 염증 단백질 II (vMIP-II)에 의해 인식된다.

CXCR4/SDF-1 주축 (axis)은 암에서 중요한 역할을 하고, 전이를 유도하는 이동, 침투에 직접적으로 연루되어 있다. 따라서, 암 세포는 CXCR4 수용체를 발현하고, 그들은 이동하여 전신 순환 (systemic circulation)에 들어간다. 그 다음 암세포는 높은 수준의 SDF-1를 생산하는 기관의 혈관 베드에 정지하게 되고 여기에서 그들은 증식하고 혈관형성을 유도하며 전이성 종양을 형성한다 (Murphy P. M., 2001). 이 주축은 또한 세포외-신호-조절된 키나제 (ERK) 경로의 활성화를 통한 세포 증식 (Barbero S. et al ., 2001) 및 혈관형성 (Romagnani P., 2004)에도 관여한다. 따라서, CXCR4 수용체 및 그의 리간드 SDF-1은 이후에 CXCR4/SDF-1의 발현을 증가시키는 VEGF-A 발현을 촉진시킴으로써 혈관형성을 확실하게 촉진시킨다 (Bachelder R. E. et al ., 2002). 또한 종양 관련된 대식세포 (tumor associated macrophages, TAM)가 종양의 저산소 (hypoxic) 영역에 축적되었고, 자극되어 종양세포와 협력하고 혈관형성을 촉진시키는 것으로 알려져 있다. 저산소증 (hypoxia)이 TAM을 포함한 다양한 세포 유형에서 CXCR4의 발현을 선택적으로 상승-조절하는 (up-regulate) 것이 관찰되었다 (Mantovani A. et al., 2004). 최근에는 CXCR4/SDF-1 주축이 CXCR4+ 조혈 줄기/전구체 세포 (HSC)의 운반 (trafficking)/회귀 (homing)를 조절하고 신생혈관증식 (neovascularization)에서 역할을 담당할 수 있는 것으로 기술되어 왔다. HSC 이외에 기능적 CXCR4도 역시 다른 조직으로부터 나온 줄기세포 (조직-고정 줄기세포 = TCSCs) 상에서 발현되어 기관/조직 재생에 필요한 CXCR4+ TCSCs를 화학적 유도하는 데 결정적인 역할을 할 수 있지만, 이들 TCSC도 또한 암 발생의 세포성 기원이 될 수 있는 것 (암 줄기세포 이론)을 증거로 보여준다. 암 줄기세포 기원은 인간 백혈병에 대해 또한 최근에는 뇌 및 유방과 같은 몇 가지의 고형 종양에 대해 기술되었다. 백혈병, 뇌 종양, 소세포 폐암, 유방암, 간모세포종 (hepatoblastoma), 난소 및 자궁경부 암과 같은 정상 CXCR4+ 조직/기관-특이 줄기세포로부터 유래할 수 있는 CXCR4+ 종양의 몇 가지 예가 있다 (Kucia M. et al ., 2005).

CXCR4 수용체로의 간섭에 의해 암 전이를 표적하는 것 (targeting cancer metastasis)이 CXCR4 수용체에게로 유도되는 (directed against) 모노클론 항체를 사용하여 생체내 (in vivo)에서 전시되었다 (Muller A. et al ., 2001). 간략하게, CXCR4 수용체에게로 유도되는 모노클론 항체 (Mab 173 R&D 시스템사)는 SCID 마우스의 동소적 (orthotopic) 유방암 모델 (MDA-MB231)에서 림프절 전이의 숫자를 유의하게 감소시켰던 것을 보여주었다. 또한 또 다른 연구도 SDF-1에 대한 폴리클론 항체를 사용하여 동소 폐 암종 모델 (A549)에서 전이에서의 SDF-1/CXCR4 주축의 결정적 역할을 보여주었지만, 이 연구 모두에서 종양 성장 또는 혈관형성에 미치는 효과는 전혀 없었다. 여러 다른 연구들도 역시 CXCR4의 siRNAs 이중체 (duplexes)를 사용한 생체내 전이 (Liang Z. et al ., 2005), 생물안정한 (biostable) CXCR4 펩타이드 길항제 (antagonists) (Tamamura H. et al ., 2003), 또는 AMD 3100 (Rubin J. B. et al ., 2003; De Falco V. et al ., 2007)나 Mab (국제특허출원 제 WO2004/059285 A2호)와 같은 CXCR4의 소분자 길항체를 사용한 생체내 종양 성장의 저해에 대해 기술하였다. 따라서, CXCR4는 암에 대한 입증된 치료적 표적 (therapeutic target)이다.

또 다른 케모카인 수용체인 케모카인 수용체 2 (chemokine receptor 2, CXCR2)도 역시 종양학에서 흥미로운 표적으로서 기술되고 있다. 따라서, CXCR2는 여러 종양세포 유형에서 자가분비 (autocrine) 세포성장 신호를 전달하고 또한 혈관생성을 촉진시킴으로써 직접적으로 종양 성장에 영향을 줄 수 있다 (Tanaka T. et al ., 2005).

CXCR2 케모카인 수용체는 360개 아미노산으로 구성된다. 이것은 주로 내피세포에서 특히 신생혈관 형성 시 발현된다. 다수의 케모카인이 ERL+ 전-혈관형성 (pro-angiogenic) 케모카인에 속하는 CXCR2 수용체: CXCL5, -6, -7, IL-8, GRO-α,-β 및 -γ와 결합한다. 이 CXCR2 수용체는 CXCR4 수용체와 서열 상동성 (sequence homology)을 공유한다: 37% 서열 일치도 (sequence identity) 및 48% 서열 상동성. CXCR2/리간드 주축은 전이 (Singh R. K. et al ., 1994), 세포 증식 (Owen J. D. et al ., 1997)과 같은 여러 종양 성장 기작에 또한 ERL+ 케모카인-매개성 (chemokine-mediated) 혈관형성 (Strieter R. M. et al ., 2004; Romagnani et al., 2004)에 관여한다. 마지막으로, 종양-관련 대식세포 및 호중성구는 염증-유도성 종양 성장의 중요한 요소이고, CXCL5, IL-8 및 GRO-α은 호중성구 채용 (neutrophile recruitment)을 개시시킨다.

이중화 (dimerization)는 케모카인 수용체가 속하는 G-단백질-연결 수용체의 기능을 조절하기 위한 공통적인 기작으로서 나왔다 (Wang J. and Norcross M., 2008). 케모카인 결합에 반응한 호모- 및 헤테로-이중화는 많은 케모카인 수용체에 의한 신호전달 (signaling)의 개시 및 변화에 필요한 것으로 관찰되어 왔다. 점차 많이 나오고 있는 증거는 수용체 이중머 (dimers) 또는 올리고머 (oligomers)가 아마도 케모카인 수용체의 기본 기능적 단위일 것이라는 개념을 지지하고 있다. 케모카인 수용체 이중머가 리간드 부재 시에 발견되고 있고 케모카인은 수용체 이중어의 형태적 변화를 유도한다. CXCR4는 호모이중머 뿐만 아니라 헤테로이중머도, 예를 들어 δ-아편 수용체 (δ-opioid receptor, DOR) (Hereld D., 2008) 또는 CCR2 (Percherancier Y. et al ., 2005)와 함께 형성하는 것으로 알려져 있다. 후자의 예에서는, CXCR4의 막통과 도메인 (transmembrane domains)으로부터 유래된 펩타이드가 이중머의 리간드-유도성 형태 전이 (conformational transitions)를 방해하여 활성화를 저해하였다 (Percherancier Y. et al., 2005). 또 다른 연구는 CXCR4의 막통과 부위의 합성 펩타이드인 CXCR4-TM4 펩타이드가 CXCR4 호모이중머의 프로모터 간 에너지 전달을 감소시키고 악성 세포에서 SDF-1-유도성 이동 및 액틴 다중화 (actin polymerization)를 저해하는 것을 보여주었다 (Wang J. et al., 2006). 또한 더욱 최근에는, CXCR7이 CXCR4와 기능적 헤테로이중머를 형성하고 SDF-1-유도성 신호전달을 증진시키는 것도 기술되었다 (Sierro F. et al ., 2007). 전신발현 (constitutive) 헤테로이중머의 기타 예로는 CXCR1 및 CXCR2가 상호작용할 뿐만 아니라 각각 호모이중머도 형성하는 것을 보여주는 연구를 들 수 있다. 이들 어느 경우에도 또 다른 GPCR [알파(1A)-아드레노수용체 (adrenoreceptor)]와의 상호작용은 전혀 관찰되지 않았으며, 이는 CXCR1와 CXCR2의 상호작용의 특이성을 나타낸다 (Wilson S. et al ., 2005).

앞서 언급된 바와 같이, CXCR1 및 CXCR2 수용체는 흥미로운 종양 표적이다. 이들 수용체로 간섭하는 것은 종양세포 증식, 혈관형성, 종양세포 이동 및 침투 (invasion), 종양에 의한 호중성구 및 대식세포의 채용을 감소시켜 또한 CXCR4 암 줄기세포를 저해하여 매우 효율적인 방식으로 종양 성장 및 전이 (metastases)를 저해해야 한다.

본 발명의 발명적 관점의 하나는 CXCR4 이중머의 형태적 변화 (conformational change)를 유도하는 마우스 모노클론 항체를 생성하는 것이다. 본 발명은 CXCR4 호모이중머 (homodimers) 및 CXCR4/CXCR2 헤테로이중머 (heterodimers) 둘 다를 결합시킬 수 있고 이들의 형태적 변화를 유도할 수 있으며 마우스 이종이식 (xenograft) 및 생존 모델 둘 다에서 강한 항-종양 활성을 가지는 CXCR4 Mab 414H5 (또는 그의 단편)를 포함한다. 또한, 본 발명은 CXCR4 호모이중머 및 CXCR4/CXCR2 헤테로이중머 둘 다를 결합시킬 수 있고 이들의 형태적 변화를 유도할 수 있으며 강한 항-종양 활성을 가지는 CXCR4 Mab 515H7 (또는 그의 단편)를 포함한다. 항-CXCR4 414H5 Mab는 MDA-MB-231 이종이식 모델에서 종양 성장을 저해하고 U937 모델에서 마우스 생존을 증가시킨다. 그들은 CXCR4 호모이중머 상에서 뿐만 아니라 CXCR4/CXCR2 헤테로이중머 상에서도 형태적 변화를 유도한다. 이러한 새로운 특성은 이들 두 가지 케모카인 수용체가 암에서 중요한 역할을 하기 때문에 암 치료법의 적용을 위해 당연히 흥미로운 것이 될 것이다.

수용체의 호모- 및 헤테로-이중머 둘 다를 표적하는 것은 이미 Mab의 치료적 효과를 증가시키는 것으로 밝혀져 왔다. 따라서, 예를 들어 IGF-1R 및 인슐린/IGF-1 하이브리드 수용체 둘 다를 표적하는 Mab (h7C10)가 생체내 종양 성장을 저해하는 데 있어 IGF-1R만을 표적하는 Mab보다 더 강력하였던 것이 이미 기술되었다 (Pandini G., 2007).

더우기 항-CXCR4 Mabs 414H5 및 515H7은 CXCR4에 대한 침묵의 길항제 (silent antagonists)이고, 그들은 시험관내 분석법 (in vitro assays)에서 기저 신호 (basal signal)를 변화시키지 않지만 다른 분석법에서 (GTPγS 결합, cAMP 방출) SDF-1에 의해 유도되는 신호전달을 저해하며, 또한 SDF-1 유도성 종양세포 증식 및 이동도 시험관내 에서 저해할 수 있다.

부분적 작동제 (partial agonists) 또는 역 작동제 (inverse agonists)로서 작용하는 분자는 리간드 부재 시 고유의 (intrinsic) 활성을 나타낸다. 이들 유형의 분자는 심지어 리간드 부재 시라도 고-친화성 또는 저-친화성 GPCR 상태를 각각 안정화시키고 이에 의해 하위 신호전달 연쇄반응 (downstream signalling cascades)을 활성화 시키거나 저해시킨다 (Galandin et al ., 2007; Kenakin, 2004).

414H5 및 515H7 Mab의 경우, 이들 분자는 SDF-1 부재 시 CXCR4 수용체에 대해 고유의 활성이 전혀 없는 침묵의 길항제로서 행동한다. 이러한 약제학적 특성은 아편 수용체 리간드에 대해 이미 관찰된 바와 같이, 부분적 또는 역 작동제에 비해 부작용이 덜 유해한 것과 연관되는 것 같다 (Bosier and Hermans, 2007). 따라서, 414H5 및 515H7 Mab 모두의 기능적 활성은 전체적으로 SDF-1의 존재에 의존하게 되고 CXCR4 수용체 활성의 조정 (modulation)은 SDF-1 리간드가 발현, 분비 또는 혈액 순환에 의해 공급되지 않는 조직 및 기관에서 전혀 관찰되지 않을 것이다. 따라서, 414H5 및 515H7 Mab는 양성적 또는 음성적 효능을 가지는 다른 CXCR4 수용체 리간드에 비해 독성을 덜 띠는 것 같다. 또한, 침묵의 길항제는 약제학적 영역에서는 소수인 종류이다 (Wurch et al ., 1999; Kenakin, 2004).

놀랍게도, 처음부터 본 발명자들은 CXCR4에 결합할 수 있을 뿐만 아니라 CXCR4 호모이중머 및/또는 헤테로이중머의 형태적 변화도 유도할 수 있는 항체를 생산하려고 시도하여 왔다. 보다 상세하게, 본 발명의 항체는 CXCR4/CXCR2 헤테로이중머 뿐만 아니라 CXCR4 호모이중머의 형태적 변화도 유도할 수 있다.

하기 본 명세서에서, 복수의 용어 표현 "CXCR4 이중머 (CXCR4 dimers)"는 CXCR4 호모이중머와 또한 CXCR4/CXCR2 헤테로이중머도 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

이 단계에서 이러한 항체가 선행 기술에는 전혀 기술되지 않았던 점이 언급되어야 한다. 또한 CXCR4/CXCR2 헤테로이중머의 존재도 전혀 기술되지 않았던 점이 언급되어야 한다.

본 발명의 일부분은 CXCR4 및 CXCR2에 의해 형성되는 헤테로이중머의 존재가 발견된 것이다.

따라서 상세한 관점에서, 본 발명은 CXCR4/CXCR2 헤테로이중머를 포함하거나 이로 구성되는 분리된 복합체 (isolated complex)를 지향한다.

바람직하게, 상기 CXCR4/CXCR2 헤테로이중머 복합체의 CXCR4 화합물 부분은:

- 진뱅크 (Genebank) 기탁번호 제 NP_003458호 하에 나타난 바와 같은 서열번호 29의 서열을 가지는 케모카인 (C-X-C 모티브) 수용체 4 이소형 b [호모 사피엔스]:

- 진뱅크 기탁번호 제 NP_001008540호 하에 나타난 바와 같은 서열번호 30의 서열을 가지는 케모카인 (C-X-C 모티브) 수용체 4 이소형 a [호모 사피엔스]:

- 서열번호 29 또는 30을 가지는 이들 b 또는 a 이소형의 하나와 적어도 95% 일치도를 가지는 임의적인 전사 스프라이싱 변형체 (transcriptional splice variant) 또는 그의 자연적 변형체; 또한

- 그의 자연적 리간드 간질세포-유래 인자-1 (SDF-1)에 의해 특이적으로 인식될 수 있고 바람직하게는 적어도 100, 150 및 200개 아미노산의 길이를 가지는 그의 단편,으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 두 가지 인간 CXCR4 이소형의 하나이다.

바람직하게, 상기 CXCR4/CXCR2 헤테로이중머 복합체의 CXCR2 화합물 부분은:

- 진뱅크 기탁번호 제 NP_001548호 하에 나타난 바와 같은 서열번호 31의 서열을 가지는 인터루킨 8 수용체 베타 [호모 사피엔스]:

- 서열번호 31을 가지는 본 인터루킨 8과 적어도 95% 일치도를 가지는 임의적인 전사 스프라이싱 변형체 또는 그의 자연적 변형체; 및

- IL-8에 의해 특이적으로 인식될 수 있고 바람직하게는 적어도 100, 150 및 200개 아미노산의 길이를 가지는 그의 단편,으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

본 상세한 관점에서, 본 발명은 또한 상기 CXCR4/CXCR2 헤테로이중머 복합체를 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 분리된 RNA 또는 DNA를 포함한다.

본 발명은 더 나아가 핵산 작제물 (nucleic construct), 바람직하게는 상기 CXCR4/CXCR2 헤테로이중머 복합체를 인코딩하는 플라스미드와 같은 발현 벡터를 포함한다.

본 발명은 더 나아가 적어도 하나의 핵산 작제물, 바람직하게는 상기 CXCR4/CXCR2 헤테로이중머 복합체의 CXCR4 부분을 인코딩하는 플라스미드와 같은 발현 벡터, 또한 두 번째 작제물, 바람직하게는 상기 CXCR4/CXCR2 헤테로이중머 복합체의 CXCR2 부분을 인코딩하는 플라스미드와 같은 발현 벡터를 포함하는 조성물을 포함한다.

본 관점에서, 본 발명은 더 나아가 상기 CXCR4/CXCR2 헤테로이중머 복합체를 발현하는 재조합 숙주세포를 제조하는 방법을 포함하고, 여기에서 본 방법은 상기 숙주세포를:

a) 적어도 하나의 핵산 작제물, 바람직하게는 상기 CXCR4/CXCR2 헤테로이중머 복합체를 인코딩하는 플라스미드와 같은 발현 벡터로; 또는

b) 적어도 하나의 핵산 작제물, 바람직하게는 상기 CXCR4/CXCR2 헤테로이중머 복합체의 CXCR4 부분을 인코딩하는 플라스미드와 같은 발현 벡터, 및 두 번째 작제물, 바람직하게는 상기 CXCR4/CXCR2 헤테로이중머 복합체의 CXCR2 부분을 인코딩하는 플라스미드와 같은 발현 벡터로, 형질전환시키는 단계를 포함한다.

바람직한 구현예에서, 상기 숙주세포는 포유동물 세포와 같은 진핵세포이다.

바람직한 구현예에서, CXCR4/CXCR2 헤테로이중머 복합체를 인코딩하는 핵산 작제물(들)도 역시 luc 마커와 같은 CXCR4 서열과 연관되어 있는 (상세하게는 공유 결합에 의해) 첫 번째 마커 또한 GFP 마커 (예로, BRET 분석법의 경우)와 같은 CXCR2 서열과 연관되어 있는 (상세하게는 공유 결합에 의해) 두 번째 마커를 인코딩한다.

또한 본 발명은 항암 활성을 가지는 화합물을 선별하는 방법을 포함하고 이는 암의 치료를 위한 조성물을 제조하는데 사용될 수 있으며, 상기 방법은,

a) 상기 CXCR4/CXCR2 헤테로이중머 복합체를 발현하는 본 발명의 재조합 숙주세포를 테스트할 화합물과 접촉시키고; 또한

b) 본 화합물이 상기 재조합 숙주세포에서 이 CXCR4/CXCR2 헤테로이중머 복합체의 활성을 조정할 수 있는지 여부, 바람직하게는 저해할 수 있는지 여부를 결정하는: 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

첫 번째 관점에서, 본 발명의 주제는 본 발명에 따른 항체를 생성하고 선별하는 방법이다.

보다 상세하게는, 본 발명은 CXCR4의 리간드-의존성 및 리간드-비의존성 활성화 모두를 저해할 수 있는 항-CXCR4 항체, 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체의 하나를 선별하는 방법에 관한 것이고 상기 방법은,

i) 생성된 항체를 검색하여 CXCR4에 특이적으로 결합하면서 CXCR4 활성화도 조정할 수 있는 항체를 선별하고;

ii) 단계 i)의 상기 선별된 항체를 테스트하여 CXCR4 호모이중머의 형태적 변화를 유도할 수 있는 항체를 선별하고; 또한 그 다음

iii) 단계 ii)의 상기 선별된 항체를 테스트하여 CXCR4/CXCR2 헤테로이중머의 형태적 변화를 유도할 수 있는 항체를 선별하는: 단계를 포함한다.

용어 표현 "조정하는 것 (to modulate)"에 의해, 이것은 증가 또는 저해로 이해되어야 한다. 바람직하게, 본 발명의 선별된 항체는 CXCR4 활성화를 저해해야 한다.

이전에 설명된 바와 같이, CXCR4 이중머 형태적 변화의 유도는 이러한 항체가 더 많은 환자 집단에게 진정한 이익을 줄 수 있기 때문에 본 발명의 중대한 관점이 된다.

항체의 생산은, 예를 들어 면역화된 마우스 또는 선별된 마이엘로마 세포와 양립가능한 (compatible) 다른 종 (species)로부터 나온 비장세포와 마이엘로마 세포의 융합과 같은 당업자가 숙지하고 있는 모든 방법에 의해서 실현될 수 있다 [Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256: 495-497]. 면역화된 동물로는 인간 면역글로불리 좌위 (loci)를 가지고 직접적으로 인간 항체를 생산하는 형질전환 동물이 포함될 수 있다. 또 다른 가능한 구현예는 라이브러리를 검색하기 위해 파지 디스플레이 기법 (phage display technologies)을 사용하는 것으로 이루어질 수 있다.

상기 검색하는 단계 i)은 당업자가 숙지하고 있는 방법 또는 공정에 의해 실현될 수 있다. 비제한적인 예로서, 엘라이자 (ELISA), BIAcore, 면역조직화학법 (immunohistochemistry), FACS 분석법 및 기능적 검색법 (functional screens)이 언급될 수 있다. 바람직한 방법은 생산된 항체가 종양 세포 상의 자연 그대로 (native) 수용체도 역시 인식할 수 있을 것인지 확인하기 위하여 CXCR4 형질전환체 상 및 적어도 종양 세포주 상의 FACS 분석법에 의한 검색으로 이루어진다. 본 방법은 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술될 것이다.

용어 표현 "CXCR4 활성화를 조정하는 것 (to modulate CXCR4 activation)"에 의해, 이것은 하기 실시예 4, 5, 7 및 13에 나타난 활성의 적어도 하나를 조정하는 것을 의미하려고 하고:

바람직하게는

- 상세하게는 인간 야생형 CXCR4 수용체를 안정적으로 발현하는 CHO-K1 막과 같은 진핵성 형질전환된 세포의 막 상 경쟁에 의한, CXCR4 수용체 상의 리간드 SDF-1의 세포막에 대한 특이적 결합 (실시예 4 참조);

- CXCR4 수용체 상, 상세하게는 야생형 CXCR4 수용체 막을 안정적으로 또한 전신적으로 발현하는 NIH-3T3 세포와 같은 진핵성 형질전환된 세포 막 상의 GTPγS의 세포막에 대한 특이적 결합 (실시예 5 참조);

- cAMP 생산의 CXCR4-매개성 저해 (실시예 7 참조); 및

- 세포내 저장 칼슘 (intracellular calcium store)의 CXCR4 수용체-매개성 가동화 (mobilization) (실시예 13 참조),을 조정하는 것이다.

보다 바람직하게는, 이러한 이들 활성의 적어도 하나의 조정은 활성의 저해이다.

본 발명의 선별하는 방법의 단계 ii) 및iii)의 바람직한 구현예에서, 상기 단계 ii) 및 iii)는 CXCR4-RLuc/CXCR4-YFP 및 CXCR4-RLuc/CXCR2-YFP를 각각 발현하는 세포 상에서 BRET 분석법에 의해 항체를 평가하여 BRET 신호의 적어도 40%, 바람직하게는 45%, 50%, 55%, 또한 가장 바람직하게는 60%를 저해할 수 있는 항체를 선별하는 것으로 이루어진다.

BRET 기법은 단백질 이중화 (dimerization)에 있어서 대표적인 것이라고 알려진 기법이다 [Angers et al ., PNAS, 2000, 97: 3684-89].

본 방법의 단계 ii) 및 iii)에 사용된 BRET 기법은 당업자에게 잘 알려져 있으며 하기 실시예서 상세하게 기술될 것이다. 보다 상세하게는, BERT (생물발광 공명 에너지 전이, Bioluminescence Resonance Energy Transfer)는 생물발광 공여자 [레닐라 루시퍼라제 (Renila Luciferase)(Rluc)] 및 GFP (녹색 형광 단백질, Green Fluorescent Protein) 또는 YFP (노란색 형광 단백질, Yellow Fluorescent Protein) 간에 일어나는 비-방사성 에너지 전이이다. 본 경우에는 EYFP (증진된 노란색 형광 단백질, Enhanced Yellow Fluorescent Protein)가 사용되었다. 전이의 효능 (efficacy of transfer)은 공여자와 수여자 간의 방향 및 거리에 의존한다. 따라서 에너지 전이는 두 개의 분자가 매우 근접한 거리 (1 - 10 nm)에 있는 경우에만 일어날 수 있다. 이러한 특성은 단백질-단백질 상호작용 분석법 (interaction assay)을 생성하는 데 이용된다. 따라서, 두 개 파트너 간 상호작용을 연구하기 위하여, 첫 번째 파트너는 레닐라 루시퍼라제와 또한 두 번째 파트너는 GFP의 노란색 돌연변이와 유전적으로 융합된다. 융합 단백질은 일반적으로 강제적이 아니더라도 포유동물 세포에서 발현된다. Rluc는 그의 막투과성 기질 [실렌터라진 (coelenterazine)]의 존재 시 파란색 빛을 방출한다. GFP 돌연변이가 Rluc로부터 10 nm 이내로 근접하는 경우 에너지 전이가 일어날 수 있고, 부가적인 노란색 신호이 검출될 수 있다. BRET 신호는 수여자에 의해 방출되는 빛과 공여자에 의해 방출되는 빛 간의 비율로서 측정된다. 따라서 BRET 신호는 두 가지 융합 단백질이 근접하게 될수록 또는 형태적 변화가 Rluc 및 GFP 돌연변이를 근접하게 만드는 경우 증가될 것이다.

BRET 분석법이 바람직한 구현예에 있는 경우라면, 당업자라면 숙지하고 있는 방법이라면 모두가 CXCR4 이중머의 형태적 변화를 측정하기 위해 사용될 수 있다. 하기 기법이 이에 제한되지 않고 언급될 수 있다: FRET (형광 공명 에너지 전이, Fluorescence Resonance Energy Transfer), HTRF (균질한 시간에 따른 형광, Homogenous Time resolved Fluorescence), FLIM (형광수명 영상 현미경 분석법, Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) 또는 SW-FCCS (단일파장 형광 교차-상호연관 분광분석법, Single Wavelength Fluorescence Cross-Correlation spectroscopy).

또한 공-면역침전법 (Co-immunoprecipitation), 알파 검색 (alpha screen), 화학적 교차-연결 (chemical cross-linking), 이중-하이브리드 (Double-Hybrid), 친화 크로마토그래피 (affinity chromatography), 엘라이자 (ELISA) 또는 파 웨스턴 블럿 (Far western blot)과 같은 다른 고전적인 기법도 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 방법의 상세한 관점에서, 단계 ii)는 CXCR4-RLuc/CXCR4-YFP 둘 다를 발현하는 세포 상에서 BRET 분석법에 의해 항체를 평가하여 BRET 신호의 적어도 40%를 저해할 수 있는 항체를 선별하는 것으로 이루어진다.

본 발명에 따른 방법의 또 다른 상세한 관점에서, 단계 iii)는 CXCR4-RLuc/CXCR2-YFP 둘 다를 발현하는 세포 상에서 BRET 분석법에 의해 항체를 평가하여 BRET 신호의 적어도 40%를 저해할 수 있는 항체를 선별하는 것으로 이루어진다.

두 번째 관점에서, 본 발명의 주제는 상기 방법으로 획득된 분리된 항체, 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체의 하나이다. 상기 분리된 항체, 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체의 하나는 인간 CXCR4에 특이적으로 결합할 수 있고, 더구나 필요한 경우 바람직하게는 그의 리간드의 자연적 부착 (natural attachment)을 저해할 수 있으며, 또한 상기 항체는 CXCR4 이중머의 형태적 변화를 유도할 수 있다.

용어 표현 "기능적 단편 및 유도체 (functional fragments and derivatives)"는 이후 본 명세서에서 상세하게 정의될 것이다.

본 발명은 천연 그대로 형태의 항체에 관한 것이 아니라, 다시 말해 그들은 자연 환경에 존재하지 않긴 하지만 자연적 출처로부터 분리되거나 획득되거나 그 밖에도 유전적 재조합에 의해 또는 화학적 합성에 의해 획득될 수 있었으며, 하기 상세하게 기술될 것인 바와 같이 그들은 비-자연적인 아미노산도 다시 포함할 수 있는 것으로 이해되어야 한다.

더욱 상세하게는 본 발명의 또 다른 관점에 따르면, 항체, 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체의 하나가 청구되고, 상기 항체는 서열번호 1 내지 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDRs로부터 선택되는 적어도 하나의 상보적 결정 부위 CDR을 포함하는 것을 특징으로 한다.

보다 상세하게는 본 발명의 또 다른 관점에 따르면, 항체, 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체의 하나가 청구되고, 상기 항체는 서열번호 2, 5 또는 40 내지 49의 아미노산 서열을 포함하는 CDRs로부터 선택되는 적어도 하나의 상보적 결정 부위 CDR을 포함하는 것을 특징으로 한다.

첫 번째 관점에 따르면, 본 발명은 적어도 서열번호 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 서열의 CDRs 중에서 선택된 적어도 하나의 CDR 또는 그의 서열이 서열번호 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98% 일치도를 가지는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 분리된 항체, 또는 이로부터 유래된 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.

또 다른 관점에 따르면, 본 발명은 적어도 서열번호 40, 2, 41, 42, 5 또는 43 서열의 CDRs 중에서 선택된 적어도 하나의 CDR 또는 그의 서열이 서열번호 40, 2, 41, 42, 5 또는 43의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98% 일치도를 가지는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 분리된 항체, 또는 이로부터 유래된 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.

항체의 "기능적 단편 (functional fragment)"은 상세하게 단편들 Fv, scFv [sc = 단일 사슬 (single chain)], Fab, F(ab')₂, Fab' 또는 scFv-Fc 단편 또는 다이아바디 (diabodies), 또는 반감기가 연장될 수 있었던 단편이라면 모두와 같은 항체 단편을 의미한다. 이러한 기능적 단편은 이후 본 발명의 기술내용 (description)에 상세하게 기재될 것이다.

항체의 "유래된 화합물 (derived compound)" 또는 "유도체 (derivative)"는 상세하게 펩타이드 스캐폴드 (scaffold) 및 그의 인식하는 능력을 보존하기 위해 고유 항체 (original antibody)의 적어도 하나의 CDRs로 구성되는 결합 단백질 (binding protein)을 의미한다. 이러한 유래된 화합물은 당업자에게 잘 알려져 있고 이후 본 발명의 기술내용에 더욱 상세하게 기재될 것이다.

더욱 바람직하게, 본 발명은 명확하게 키메라 (chimeric) 또는 인간화 (humanized)되고 유전적 재조합 (genetic recombination) 또는 화학적 합성에 의해 획득된 본 발명에 따른 항체, 이로부터 유래된 화합물 또는 그들의 기능적 단편을 포함한다.

바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 항체, 또는 이로부터 유래된 화합물 또는 기능적 단편은 모노클론 항체로 구성되는 것을 특징으로 한다.

"모노클론 항체 (monoclonal antibody)"는 거의 균질한 (nearly homogeneous) 항체의 집단으로부터 유래한 항체로서 이해된다. 더욱 상세하게는, 집단의 개별 항체는 최소 비율로 발견될 수 있는 자연적으로 일어나는 일부 가능한 돌연변이를 제외하고는 일치한다. 달리 말하면, 모노클론 항체는 단 하나의 세포 클론 (예를 들어, 하이브리도마, 균질한 항체를 코딩하는 DNA 분자로 형질전환된 진핵성 숙주세포, 균질한 항체를 코딩하는 DNA 분자로 형질전환된 원핵성 숙주세포 등등)의 성장으로부터 나오는 균질한 항체로 구성되고, 일반적으로 한 가지 및 동일한 클래스와 서브클래스의 중쇄 그리고 단 한 가지 타입의 경쇄에 의해 특성이 결정된다. 모노클론 항체는 매우 특이적이고 단일 항원에게로 유도된다 (directed against). 또한, 통상적으로 서로 다른 결정기 (determinants) 또는 에피토프 (epitopes)에게로 유도되는 서로 다른 항체들을 포함하는 폴리클론 항체의 조제물과는 대조적으로, 각 모노클론 항체는 항원의 단일 에피토프에게로 유도된다.

본 발명은 천연 그대로 형태의 항체에 관한 것이 아니고, 다시 말해 그들은 자연 환경으로부터 가져올 수는 없지만 자연적 출처로부터 분리되거나 획득되거나 또는 유전적 재조합에 의해 또는 화학적 합성에 의해 획득될 수 있으며, 따라서 하기 상세하게 기술될 바와 같이 그들은 비자연적인 아미노산도 포함할 수 있는 것으로 이해되어야 한다.

더욱 상세하게는 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 항체, 또는 이로부터 유래된 화합물 또는 기능적 단편은 서열번호 1, 2 또는 3의 아미노산 서열 CDRs 중에서 선택된 적어도 하나의 CDR, 또는 서열번호 1, 2 또는 3의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98% 일치도를 가지는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 경쇄; 또는 서열번호 4, 5 또는 6의 아미노산 서열 CDRs 중에서 선택된 적어도 하나의 CDR, 또는 서열번호 4, 5 또는 6의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98% 일치도를 가지는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 한다.

또 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 항체, 또는 이로부터 유래된 화합물 또는 기능적 단편은 서열번호 1, 2 또는 3 서열의 세 가지 CDRs의 적어도 하나, 또는 서열번호 1, 2 또는 3의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98% 일치도를 가지는 적어도 하나의 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 한다.

바람직한 방식으로, 본 발명의 항체, 또는 그들의 화합물 또는 기능적 단편의 하나는 각각 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3인 하기 세 가지 CDRs를 포함하는 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하고:

여기에서,

- CDR-L1은 서열번호 1 또는 9의 서열, 또는 서열번호 1 또는 9 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하고;

- CDR-L2은 서열번호 2 또는 10의 서열, 또는 서열번호 2 또는 10 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하고; 또한

- CDR-L3은 서열번호 3의 서열, 또는 서열번호 3 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함한다.

상세한 구현예에 따르면, 항체, 또는 이로부터 유래된 화합물 또는 기능적 단편의 하나는 서열번호 1의 CDR-L1 서열, 서열번호 2의 CDR-L2 서열 및 서열번호 3의 CDR-L3 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 한다.

또 다른 상세한 구현예에 따르면, 항체, 또는 이로부터 유래된 화합물 또는 기능적 단편의 하나는 서열번호 9의 CDR-L1 서열, 서열번호 10의 CDR-L2 서열 및 서열번호 3의 CDR-L3 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 한다.

더욱 상세하게는, 본 발명의 항체, 또는 그들의 화합물 또는 기능적 단편의 하나는 서열번호 4, 5 또는 6 서열의 세 가지 CDRs의 적어도 하나, 또는 서열번호 4, 5 또는 6의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98% 일치도를 가지는 적어도 하나의 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 한다.

훨씬 더 상세하게는, 본 발명의 항체, 또는 이로부터 유래된 화합물 또는 기능적 단편의 하나는 각각 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3인 하기 세 가지 CDRs를 포함하는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 하고:

여기에서,

- CDR-H1은 서열번호 4, 7 또는 11의 서열, 또는 서열번호 4, 7 또는 11 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하고;

- CDR-H2은 서열번호 5 또는 12의 서열, 또는 서열번호 5 또는 12 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하고; 또한

- CDR-H3은 서열번호 6 또는 8의 서열, 또는 서열번호 6 또는 8 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함한다.

상세한 구현예에 따르면, 항체, 또는 이로부터 유래된 화합물 또는 기능적 단편의 하나는 서열번호 7의 CDR-H1 서열, 서열번호 5의 CDR-H2 서열 및 서열번호 8의 CDR-H3 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 한다.

또 다른 상세한 구현예에 따르면, 항체, 또는 이로부터 유래된 화합물 또는 기능적 단편의 하나는 서열번호 11의 CDR-H1 서열, 서열번호 12의 CDR-H2 서열 및 서열번호 6의 CDR-H3 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 한다.

더욱 상세하게 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 항체, 또는 이로부터 유래된 화합물 또는 기능적 단편은 서열번호 40, 2 또는 41의 아미노산 서열의 CDRs 중에서 선택된 적어도 하나의 CDR, 또는 서열번호 40, 2 또는 41의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98% 일치도를 가지는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 경쇄를 포함하고; 또는 서열번호 42, 5 또는 43의 아미노산 서열의 CDRs 중에서 선택된 적어도 하나의 CDR, 또는 서열번호 42, 5 또는 43의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98% 일치도를 가지는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 한다.

또 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 항체, 또는 이로부터 유래된 화합물 또는 기능적 단편의 하나는 서열번호 40, 2 또는 41의 세 가지 CDRs 서열의 적어도 하나, 또는 서열번호 40, 2 또는 41의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98% 일치도를 가지는 적어도 하나의 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 한다.

바람직한 방식으로, 본 발명의 항체, 또는 이로부터 유래된 화합물 또는 기능적 단편의 하나는 각각 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3인 하기 세 가지 CDRs를 포함하는 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하고:

여기에서,

- CDR-L1은 서열번호 40 또는 46의 서열, 또는 서열번호 40 또는 46 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하고;

- CDR-L2은 서열번호 2 또는 47의 서열, 또는 서열번호 2 또는 47 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하고; 또한

- CDR-L3은 서열번호 41의 서열, 또는 서열번호 41 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함한다.

상세한 구현예에 따르면, 항체, 또는 이로부터 유래된 화합물 또는 기능적 단편의 하나는 서열번호 40의 CDR-L1 서열, 서열번호 2의 CDR-L2 서열 및 서열번호 41의 CDR-L3 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 한다.

또 다른 상세한 구현예에 따르면, 항체, 또는 이로부터 유래된 화합물 또는 기능적 단편의 하나는 서열번호 46의 CDR-L1 서열, 서열번호 47의 CDR-L2 서열 및 서열번호 41의 CDR-L3 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 한다.

더욱 상세하게는, 본 발명의 항체, 또는 이로부터 유래된 화합물 또는 기능적 단편의 하나는 서열번호 42, 5 또는 43 서열의 세 가지 CDRs의 적어도 하나, 또는 서열번호 42, 5 또는 43의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98% 일치도를 가지는 적어도 하나의 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 한다.

여기에서,

- CDR-H1은 서열번호 42, 44 또는 48의 서열, 또는 서열번호 42, 44 또는 48 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하고;

- CDR-H2은 서열번호 5 또는 49의 서열, 또는 서열번호 5 또는 49 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하고; 또한

- CDR-H3은 서열번호 45 또는 43의 서열, 또는 서열번호 45 또는 43 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함한다.

상세한 구현예에 따르면, 항체, 또는 이로부터 유래된 화합물 또는 기능적 단편 하나는 서열번호 44의 CDR-H1 서열, 서열번호 5의 CDR-H2 서열 및 서열번호 45의 CDR-H3 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 한다.

또 다른 상세한 구현예에 따르면, 항체, 또는 이로부터 유래된 화합물 또는 기능적 단편의 하나는 서열번호 48의 CDR-H1 서열, 서열번호 49의 CDR-H2 서열 및 서열번호 43의 CDR-H3 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 기술내용에서, 항체 화합물 또는 그들의 서열과 관련된 용어 " 폴리펩타이드 (polypeptides)", "폴리펩타이드 서열 (polypeptide sequences)", "펩타이드 (peptadies)" 및 "항체 화합물에 또는 그들의 서열에 부착된 단백질"은 상호교환이 가능하다.

첫 번째 구현예에서, 상보성-결정 부위 (complementarity-determining region), 또는 CDR은 카밧 등에 의해 정의된 바와 같이 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 과다가변 부위 (hypervariable regions)를 의미한다 [Kabat et al., 면역학적으로 흥미로운 단백질의 서열 (Sequences of proteins of immunological interest), 제 5판., 미국 보건복지부 (US Department of Health and Human Services) , NIH, 1991, 및 이후 개정판]. 세 가지의 중쇄 CDRs 및 세 가지의 경쇄 CDRs가 존재한다. 여기에서, 용어 "CDR" 및 "CDRs"는 경우에 따라서 항체가 인식하는 항원 또는 에피토프에 대한 항체의 결합 친화도를 부여할 수 있는 대다수의 아미노산 잔기를 포함하는 하나 이상의 부위, 또는 심지어 모든 부위를 가르키는 데 사용된다.

두 번째 구현예에서는, CDR 부위 또는 CDR(s)에 의해 IMGT에 의해 정의된 바와 같이 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 과다가변 부위를 가르키려고 한다.

독특한 IMGT 번호매김 시스템 (IMGT unique numbering system)은 어떤 항원 수용체, 사슬 타입 또는 종이라도 가변 도메인을 비교할 수 있도록 정의되어 왔다 [Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997); Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999); Lefranc, M. P., Pommie C., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)]. 이 번호매김 시스템에서, 보존되는 아미노산은 항상 23번 시스테인 (1st-CYS), 41번 트립토판 (보존되는 TRP), 89번 소수성 아미노산, 104번 시스테인 (2nd-CYS), 118번 페닐알라닌 또는 트립토판 (J-PHE 또는 TRP)과 같이 동일한 위치를 보유한다. 독특한 IMGT 번호매김 시스템은 구조틀 부위 (FR1-IMGT: 1 내지 26번 위치, FR2-IMGT: 39 내지 55번 위치, FR3-IMGT: 66 내지 104번 위치 및 FR4-IMGT: 118 내지 128번 위치) 또한 상보성 결정 부위 (CDR1-IMGT: 27 내지 38번 위치, CDR2-IMGT: 56 내지 65번 위치 및 CDR3-IMGT: 105 내지 117번 위치)의 표준화된 구획 (standardized delimitation)을 제공한다. "공간 (gaps)"은 채워지지 않은 위치를 나타내기 때문에, CDR-IMGT 길이 (괄호들 사이에 나타나고 점으로 분리됨)는 결정적인 정보가 된다. IMGT 시스템은 IMGT 진주목걸이 (IMGT pearl necklace)라고도 명명되는 [Ruiz, M. and Lefranc, M. P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002); Kaas, Q. and Lefranc, M. P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)] 2차원 그래픽 전시 및 IMGT/3D 구조-DB 라고 언급되는 3차원 구조 [Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M. P., T cell receptor and MHC structural data . Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)]에서 사용된다.

세 가지의 중쇄 CDRs 및 세 가지의 경쇄 CDRs가 존재한다. 본 명세서에서, 용어 "CDR" 및 "CDRs"는 경우에 따라 항체가 인식하는 항원 또는 에피토프에 대한 항체의 결합 친화도를 부여할 수 있는 대다수의 아미노산 잔기를 포함하는 하나 이상의 이들 부위, 또는 심지어 부위 전체를 가르키는 데 사용된다.

더욱 명확하게 하기 위해, 하기 기술내용 더욱 상세하게는 표 1 및 3에서 CDRs는 IMGT 번호매김 (IMGT numbering), 카밧 번호매김 (Kabat numbering) 및 공통 번호매김 (common numbering)에 의해 정의될 것이다.

공통 번호매김은 IMGT 및 카밧 번호매김 시스템에 의해 정의된 바와 같이 CDRs에 공통적인 각 CDR의 잔기 부분을 재그룹화한다.

IMGT 번호매김 시스템은 상기 정의된 바와 같이 IMGT 시스템에 따라 CDRs를 정의하는 한편, 카밧 번호매김 시스템은 상기 정의된 바와 같이 카밧 시스템에 따라 CDRs를 정의한다.

더욱 상세하게, CDR-L1은 공통 및 IMGT 번호매김 시스템에서는 서열번호 1

로 구성되고, 카밧 번호매김 시스템에서는 서열번호 9

로 구성된다.

CDR-L2에 관하여, 이것은 공통 및 IMGT 번호매김 시스템에서는 서열번호 2 (WAS)로 구성되고, 카밧 번호매김 시스템에서는 서열번호 10 ( WASTRES)으로 구성된다.

CDR-L3는 세 가지 번호매김 시스템 각각에서 서열번호 3

으로 구성된다.

중쇄의 경우, CDR-H1은 공통 번호매김 시스템에서 서열번호 4 ( TDYY )로 구성되고 IMGT 번호매김 시스템에서는 서열번호 7 (GFTFTDYY )로 구성되며 카밧 번호매김 시스템에서는 서열번호 11 ( TDYYMS)로 구성된다.

CDR-H2는 공통 및 IMGT 번호매김 시스템에서 서열번호 5

로 구성되고 카밧 번호매김 시스템에서는 서열번호 12

로 구성된다.

마지막으로, CDR-H3은 공통 및 카밧 번호매김 시스템에서 서열번호 6 (DIPGFAY)으로 구성되는 한편 IMGT 번호매김 시스템에서는 서열번호 8 (ARDIPGFAY )로 구성된다.

더욱 상세하게, CDR-L1은 공통 및 IMGT 번호매김 시스템에서는 서열번호 40

으로 구성되고, 카밧 번호매김 시스템에서는 서열번호 46

으로 구성된다.

CDR-L2에 관하여, 이것은 공통 및 IMGT 번호매김 시스템에서는 서열번호 2 (WAS)로 구성되고, 카밧 번호매김 시스템에서는 서열번호 47 ( WASARDS)로 구성된다.

CDR-L3는 세 가지 번호매김 시스템 각각에서 서열번호 41

으로 구성된다.

중쇄의 경우, CDR-H1은 공통 번호매김 시스템에서 서열번호 42 ( DNY )로 구성되고 IMGT 번호매김 시스템에서는 서열번호 44 (GFTFTDNY )로 구성되며 카밧 번호매김 시스템에서는 서열번호 48 ( DNYMS)로 구성된다.

CDR-H2는 공통 및 IMGT 번호매김 시스템에서 서열번호 5

로 구성되고 카밧 번호매김 시스템에서는 서열번호 49

로 구성된다.

마지막으로, CDR-H3은 공통 및 카밧 번호매김 시스템에서 서열번호 43

으로 구성되는 한편 IMGT 번호매김 시스템에서는 서열번호 45

로 구성된다.

본 발명의 의미에서, 두 개의 핵산 또는 아미노산 서열들 간 "일치도 퍼센트 (percentage identity)"는 최적의 정렬에 따라 획득되어 비교되는 두 개의 서열들 간에 일치하는 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 퍼센트를 의미하고, 이 퍼센트는 순수하게 통계적이고 이 두 서열들 간의 차이는 그들 서열 전체를 통하여 무작위적으로 분포한다. 두 개의 핵산 또는 아미노산 서열들 간 서열 비교는 통상적으로 그들을 최적으로 정렬시킨 이후 서열들을 비교하여 수행되고, 상기 비교는 분절마다 또는 "비교창 (comparison window)"에 의해 수행될 수 있다. 비교를 위한 서열의 최적의 정렬은 수동적으로 수행되는 것과 함께 스미스 및 워터맨 (Smith and Waterman) (1981)의 로칼 상동성 알고리즘 [local homology algorithm; Ad. App. Math. 2:482]에 의해, 네들만 및 운쉬 (Neddleman and Wunsch) (1970)의 로칼 상동성 알고리즘 [J. Mol. Biol. 48:443]에 의해, 피어슨 및 립만 (Pearson and Lipman) (1988)의 유사도 조사 방법 (similarity search method)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444]에 의해, 또는 이들 알고리즘을 사용하는 컴퓨터 소프트웨어 (위스콘신 유전학 소프트웨어 패키지, 유전학 컴퓨터 그룹, 575 Science Dr., Madison, WI 에서의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA, 또는 비교 소프트웨어 BLAST N 또는 BLAST P 에 의해)에 의해 수행될 수 있다.

두 개의 핵산 또는 아미노산 서열들 간 일치도 퍼센트는 비교되는 핵산 또는 아미노산 서열이 이들 두 서열들 간 최적의 정렬을 위한 기준 서열 (reference sequence)에 비해 부가 (addition) 또는 결실 (deletion)을 포함할 수 있는 두 개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하여 결정된다. 일치도 퍼센트는 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기가 두 개 서열들 간에 일치하는 동일한 위치의 숫자를 결정하고, 동일한 위치의 숫자를 정렬창에서의 전체 위치 숫자로 나눈 다음 획득된 결과를 두 개 서열들 간 일치도 퍼센트를 얻기 위하여 100으로 곱하여 계산된다.

예를 들어, 웹 사이트 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html 상에서 입수가능한 BLAST 프로그램 "BLAST 2 서열" (Tatusova et al ., "Blast 2 서열- 단백질 및 뉴클레오타이드 서열을 비교하기 위한 새로운 도구", FEMS Microbiol., 1999, Lett. 174: 247-250)이 디폴트 매개변수 (명확하게, 매개변수 "오픈 갭 페널티 (open gap penalty)"의 경우: 5, 및 "연장 갭 페널티 (extension gap penalty)": 2; 선택된 매트릭스는 예를 들어 프로그램에 의해 제시되는 "BLOSUM 62" 매트릭스일 수 있음)와 함께 사용될 수 있고; 비교를 위한 두 개 서열들 간 일치도 퍼센트는 프로그램에 의해 직접 계산될 수도 있다.

기준 아미노산 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98%의 일치도를 가지는 아미노산 서열로는, 기준 서열, 소정의 변형 (modifications), 명확하게 적어도 하나의 아미노산의 결실 (deletion), 부가 (addition) 또는 치환 (substituiton), 절단 (truncation) 또는 연장 (extension)을 가지는 것들을 바람직한 예로 들 수 있다. 하나 이상의 연속적 (consecutive) 또는 비-연속적 (non-consecutive) 아미노산(들)의 치환의 경우에서, 치환된 아미노산이 "동등한 (equivalent)" 아미노산에 의해 대체되는 치환이 바람직하다. 본 명세서에서 용어 표현 "동등한 아미노산 (equivalent amino acids)"은 해당하는 항체 및 하기 정의된 특정 실시예의 항체의 생물학적 활성을 근본적으로 변형시키지 않지만, 구조적 아미노산의 하나가 치환될 수 있는 아미노산이라면 모두를 표시하려고 한다.

동등한 아미노산은 치환되어진 아미노산과의 구조적인 상동성 (structural homology)을 기초로 하거나 생산될 수 있는 다양한 항체들 간의 생물학적 활성의 비교 테스트 결과를 기초로 하여 결정될 수 있다.

비-제한적인 예로서, 하기 표 1 은 해당되는 변형된 항체의 생물학적 활성의 유의한 변형을 유발하지 않고도 수행될 수 있는 가능한 치환을 정리하고 있고; 역 치환 (inverse substituiton)은 동일한 조건 하에서 자연적으로 가능하다.

표 1

당해 기술분야 및 이 기술분야의 현재 상황에서 당업자라면 여섯 가지 CDRs 간의 가장 큰 다양성 (길이 및 조성)이 세 가지의 중쇄 CDRs, 더욱 상세하게는 이 중쇄의 CDR-H3에서 발견되는 것을 잘 알고 있다. 결과적으로, 본 발명에 따른 항체, 또는 이로부터 유래한 화합물 또는 기능적 단편 하나의 바람직한 특징적 CDRs는 중쇄의 세 가지 CDRs, 예로 414H5의 경우 IMGT 및 카밧에 따라 각각 정의된 서열번호 7, 5, 8 및 11, 12, 6의 서열에 의해 코딩되는 CDRs, 또한 515H7의 경우 IMGT 및 카밧에 따라 각각 정의되는 서열번호 44, 5, 45 및 48, 49, 43의 서열에 의해 코딩되는 CDRs가 될 것이 명백할 것이다. 훨씬 더 바람직하게는, 414H5의 경우 서열번호 8 또는 6의 서열 또한 515H7의 경우 서열번호 45 또는 43의 서열에 의해 코딩되는 CDR-H3에 해당하는 CDR이 될 것이다.

상세한 구현예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 마우스 항체, 또는 이로부터 유래된 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 구현예는 하기 세 가지 CDRs를 포함하는 경쇄:

CDR-L1은 서열번호 1의 서열 또는 서열번호 1 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98% 일치도를 가지는 서열을 포함하고;

CDR-L2은 서열번호 2의 서열 또는 서열번호 2 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98% 일치도를 가지는 서열을 포함하고;

CDR-L3은 서열번호 3의 서열, 또는 서열번호 3 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98% 일치도를 가지는 서열을 포함하며, 또한

하기 세 가지 CDRs를 포함하는 중쇄:

CDR-H1은 서열번호 4의 서열 또는 서열번호 4 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98% 일치도를 가지는 서열을 포함하고;

CDR-H2은 서열번호 5의 서열 또는 서열번호 5 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98% 일치도를 가지는 서열을 포함하고;

CDR-H3은 서열번호 6의 서열, 또는 서열번호 6 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98% 일치도를 가지는 서열을 포함하는,

항체, 또는 이로부터 유래된 화합물 또는 기능적 단편을 개시하고 있다.

본 발명의 보다 또 다른 구현예는 하기 세 가지 CDRs를 포함하는 경쇄:

- CDR-L1은 서열번호 1의 서열 또는 서열번호 1 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하고;

- CDR-L2은 서열번호 2의 서열 또는 서열번호 2 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하고;

- CDR-L3은 서열번호 3의 서열, 또는 서열번호 3 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하며, 또한

하기 세 가지 CDRs를 포함하는 중쇄:

- CDR-H1은 서열번호 7의 서열 또는 서열번호 7 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하고;

- CDR-H2은 서열번호 5의 서열 또는 서열번호 5 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하고;

- CDR-H3은 서열번호 8의 서열, 또는 서열번호 8 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하는,

- CDR-L1은 서열번호 9의 서열 또는 서열번호 9 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하고;

- CDR-L2은 서열번호 10의 서열 또는 서열번호 10 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하고;

하기 세 가지 CDRs를 포함하는 중쇄:

- CDR-H1은 서열번호 11의 서열 또는 서열번호 11 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하고;

- CDR-H2은 서열번호 12의 서열 또는 서열번호 12 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하고;

- CDR-H3은 서열번호 6의 서열, 또는 서열번호 6 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하는,

본 발명에 따른 항체, 또는 이로부터 유래된 화합물 또는 기능적 단편은:

- 서열번호 1의 CDR-L1 서열, 서열번호 2의 CDR-L2 서열 및 서열번호 3의 CDR-L3 서열을 포함하는 경쇄; 및

- 서열번호 7의 CDR-H1 서열, 서열번호 5의 CDR-H2 서열 및 서열번호 8의 CDR-H3 서열을 포함하는 중쇄;를 포함하는 것을 특징으로 한다.

또 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 항체, 또는 이로부터 유래된 화합물 또는 기능적 단편은:

- 서열번호 9의 CDR-L1 서열, 서열번호 10의 CDR-L2 서열 및 서열번호 3의 CDR-L3 서열을 포함하는 경쇄; 및

- 서열번호 11의 CDR-H1 서열, 서열번호 12의 CDR-H2 서열 및 서열번호 6의 CDR-H3 서열을 포함하는 중쇄;를 포함하는 것을 특징으로 한다.

보다 또 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 항체, 또는 이로부터 유래된 화합물 또는 기능적 단편은 서열번호 13의 아미노산 서열 또는 서열번호 13의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98% 일치도를 가지는 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것; 및 서열번호 14의 아미노산 서열 또는 서열번호 14의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98% 일치도를 가지는 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 한다.

CDR-L1은 서열번호 40의 서열 또는 서열번호 40 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98% 일치도를 가지는 서열을 포함하고;

CDR-L3은 서열번호 41의 서열, 또는 서열번호 41 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98% 일치도를 가지는 서열을 포함하며, 또한

하기 세 가지 CDRs를 포함하는 중쇄:

CDR-H1은 서열번호 42의 서열 또는 서열번호 42 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98% 일치도를 가지는 서열을 포함하고;

CDR-H3은 서열번호 43의 서열, 또는 서열번호 43 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98% 일치도를 가지는 서열을 포함하ㄴ는,

- CDR-L1은 서열번호 40의 서열 또는 서열번호 40 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하고;

- CDR-L3은 서열번호 41의 서열, 또는 서열번호 41 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하며, 또한

하기 세 가지 CDRs를 포함하는 중쇄:

- CDR-H1은 서열번호 44의 서열 또는 서열번호 44 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하고;

- CDR-H3은 서열번호 45의 서열, 또는 서열번호 45 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하는,

- CDR-L1은 서열번호 46의 서열 또는 서열번호 46 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하고;

- CDR-L2은 서열번호 47의 서열 또는 서열번호 47 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하고;

하기 세 가지 CDRs를 포함하는 중쇄:

- CDR-H1은 서열번호 48의 서열 또는 서열번호 48 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하고;

- CDR-H2은 서열번호 49의 서열 또는 서열번호 49 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하고;

- CDR-H3은 서열번호 43의 서열, 또는 서열번호 43 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80% 일치도를 가지는 서열을 포함하는,

- 서열번호 40의 CDR-L1 서열, 서열번호 2의 CDR-L2 서열 및 서열번호 41의 CDR-L3 서열을 포함하는 경쇄; 및

- 서열번호 44의 CDR-H1 서열, 서열번호 5의 CDR-H2 서열 및 서열번호 45의 CDR-H3 서열을 포함하는 중쇄;를 포함하는 것을 특징으로 한다.

- 서열번호 46의 CDR-L1 서열, 서열번호 47의 CDR-L2 서열 및 서열번호 41의 CDR-L3 서열을 포함하는 경쇄; 및

- 서열번호 48의 CDR-H1 서열, 서열번호 49의 CDR-H2 서열 및 서열번호 43의 CDR-H3 서열을 포함하는 중쇄;를 포함하는 것을 특징으로 한다.

보다 또 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 항체, 또는 이로부터 유래된 화합물 또는 기능적 단편은 서열번호 50의 아미노산 서열 또는 서열번호 50의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98% 일치도를 가지는 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것; 및 서열번호 51의 아미노산 서열 또는 서열번호 51의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98% 일치도를 가지는 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기에서 본 바와 같이, 본 발명은 또한 본 발명에서 기술된 바와 같은 항체로부터 유래된 화합물이라면 모두에 관한 것이다.

더욱 상세하게, 본 발명의 항체, 또는 이로부터 유래된 화합물 또는 기능적 단편은 초기 항체의 파라토프 인식 (paratope recognition) 특성의 전부 또는 일부를 보존하는 방식으로 적어도 하나의 CDR가 이식된 펩타이드 스캐폴드 (peptide scaffold)를 포함하는 결합 단백질로 구성되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 기술된 CDRs의 서열 중에서 하나 이상의 서열은 또한 면역글로불린의 다양한 단백질 스캐폴드 구조 상에 존재할 수 있다. 이 경우에, 단백질 서열은 이식된 CDRs의 접힘 (folding)에 유리한 펩타이드 골격을 재생산하는 것을 가능하게 하여, 이들이 파라토프 항원-인식 특성을 보존하도록 한다.

일반적으로, 당업자는 고유 항체로부터 나온 CDRs의 적어도 하나에 이식한 단백질 스캐폴드의 유형을 결정하는 방법을 잘 숙지하고 있을 것이다. 더욱 상세하게, 선택되어진 이러한 스캐폴드는 하기와 같은 판단 기준을 가장 많이 만족시켜야 하는 것으로 알려져 있다 (Skerra A., J. Mol. Recogn. 13, 2000, 167-187):

- 좋은 계통유전학적 보존;

- 기지의 삼차원 구조 [예를 들어, 결정학 (crystallography), NMR 분광분석 (NMR spectroscopy) 또는 당업자가 숙지하고 있는 기타 다른 기법과 같은];

- 작은 크기;

- 전사후 변형 (post-transcriptional modification)이 아주 적거나 없음; 및/또는

- 생산, 발현 및 정제의 용이성.

이러한 단백질 스캐폴드의 기원은, 이에 제한되는 것은 아니지만 피브로넥틴 (fibronectin), 바람직하게는 피브로넥틴 타입 III 도메인, 리포칼린 (lipocalin), 안티칼린 (anticalin) (Skerra A., J. Biotechnol., 2001, 74(4): 257-75), 스태필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) 단백질 A의 도메인 B로부터 나온 단백질 Z, 티오레독신 A (thioredoxin A), "안킬린 반복서열 (ankylin repeat)"(Kohl et al ., PNAS, 2003, vol. 100, No. 4, 1700-1705), "아마딜로 반복서열 (amadillo repeat)", "루이신-풍부 반복서열 (leucine-rich repeat)", 또는 "테트라트리코펩타이드 반복서열 (tetratricopeptide repeat)"과 같은 반복된 모티프를 가지는 단백질:로부터 선택되는 구조일 수 있다.

예를 들어 전갈, 곤충, 식물, 연체동물 등으로부터 나온 하기 독소 (toxins), 및 신경성 NO 합성효소 (neuronal NO synthase)의 단백질 저해제 (PIN)와 같은 독소로부터 유래한 스캐폴드도 역시 언급되어야 한다.

이러한 하이브리드 구조의 예로는, 이에 제한되는 것은 아니지만 고유 항체와 동일한 결합 특성을 유지하면서 획득되는 새로운 결합 단백질 (Bes et al ., BBRC 343, 2006, 334-344)인 항-CD4 항체, 즉 13B8.2의 CDR-H1 (중쇄)를 PIN 내의 루프 하나에 삽입하는 것이 언급될 수 있다. 간단히 설명하면, 네오카지노스타틴 (neocarzinostatin) (Nicaise et al ., 2004)의 루프 하나 상에 항-리소자임 VHH 항체의 CDR-H3 (중쇄)를 이식하는 것이 언급될 수 있다.

마지막으로 상기 본 발명의 명세서에 기술된 바와 같이, 이러한 펩타이드 스캐폴드는 고유 항체로부터 유래한 한 가지부터 여섯 가지의 CDR(s)를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 반드시 필요한 것은 아니지만 당업자라면 중쇄로부터 유래한 적어도 하나의 CDR을 선택할 것이고, 후자는 항체의 특이성을 일차적으로 부여하는 것으로 알려져 있다. 하나 이상의 적절한 CDR(s)의 선택하는 것은 당업자에게 명백할 것이고, 당업자는 적합한 기지의 기법을 선택할 것이다 (Bes et al ., FEBS letters 508, 2001, 67-74).

본 발명의 특정한 관점은 본 발명에 따른 항체로부터 유래된 화합물을 선별하는 방법에 관한 것으로서, 상기 유래된 화합물은 종양 세포의 성장을 시험관내 및/또는 생체내 에서 저해할 수 있고, 상기 유래된 화합물은 적어도 하나의 항체 CDR이 이식된 펩타이드 스캐폴드를 포함하며, 하기:

a) 성장할 수 있는 종양 세포를 포함하는 생물학적 시료를 사용하여 이들 세포가 성장하도록 허용하는 조건 하에서 적어도 하나의 CDR이 이식되어 있는 펩타이드 스캐폴드로 구성된 화합물을 시험관내 접촉하도록 두고;

b) 상기 화합물이 이들 종양 세포의 성장을 저해할 수 있는지 여부로 상기 화합물을 선별하는, 단계를 포함하는 것을 특징으로 하고, 또한

상기 적어도 하나의 이식된 CDR은 하기 CDRs:

- 서열번호 1, 9, 40, 46의 서열 또는 서열번호 1, 9, 40, 46의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98% 일치도를 가지는 서열의 CDR;

- 서열번호 2, 10, 47의 서열 또는 서열번호 2, 10, 47의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98% 일치도를 가지는 서열의 CDR;

- 서열번호 3, 41의 서열 또는 서열번호 3, 41의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98% 일치도를 가지는 서열의 CDR;

- 서열번호 4, 7, 11, 42, 44, 48의 서열 또는 서열번호 4, 7, 11, 42, 44, 48의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98% 일치도를 가지는 서열의 CDR;

- 서열번호 5, 12, 49의 서열 또는 서열번호 5, 12, 49의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98% 일치도를 가지는 서열의 CDR; 또한

- 서열번호 6, 8, 43, 45의 서열 또는 서열번호 6, 8, 43, 45의 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98% 일치도를 가지는 서열의 CDR, 중에서 선택되는 것을 특징으로 한다.

바람직한 방식에 따르면, 본 방법은 단계 a)에서 적어도 두 가지 또는 세 가지 항체 CDRs이 이식된 펩타이드 스캐폴드를 포함하는 화합물을 시험관내 접촉하게 두는 것을 포함한다.

본 발명의 훨씬 더 바람직한 방식에 따르면, 펩타이드 스캐폴드는 그의 구조가 상기에 언급되었던 스캐폴드 또는 결합 단백질 중에서 선택된다.

분명하게, 이들 실시예는 제한되지 않고 당업자가 숙지하고 있거나 당업자에게 명확한 그 외 다른 구조는 본 특허 출원에 의해 부여되는 보호범위 내에 포괄되는 것으로 고려되어야 한다.

본 발명은 따라서 상기 펩타이드 스캐폴드가 a) 계통유전학적으로 잘 보존되고, b) 튼튼한 구조물로 이루어지며, c) 잘 알려진 삼차원 분자 조직화를 가지고, d) 크기가 작으며 및/또는 e) 안정성 특성에 변화를 주지않고도 결실 및/또는 삽입에 의해 변형될 수 있는 부위 (regions)를 포함하는 단백질 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항체, 또는 이로부터 유래된 화합물 또는 기능적 단편들에 관한 것이다.

바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 항체, 이로부터 유래된 화합물 또는 기능적 단편은 상기 펩타이드 스캐폴드가 i) 피브로넥틴 (fibronectin), 바람직하게는 타입 3 피브로넥틴의 도메인 10, 리포칼린, 안티칼린, 스태필로코커스 아우레우스의 단백질 A의 도메인 B로부터 나온 단백질 Z, 티오레독신 A, 또는 "안킬린 반복서열" (Kohl et al ., PNAS, 2003, vol. 100, No. 4, 1700-1705), "아마딜로 반복서열", "루이신-풍부 반복서열 ", 및 "테트라트리코펩타이드 반복서열"과 같은 반복된 모티프를 가지는 단백질로부터 나온 스캐폴드, 또한 iii) 신경성 NO 합성효소의 단백질 저해제 (PIN) 중에서 선택되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 관점은 상기 기술된 항체의 기능적 단편들에 관한 것이다.

더욱 상세하게 본 발명은 상기 기능적 단편이 Fv, Fab, F(ab')₂, Fab', scFv, scFv-Fc 단편 및 다이아바디 (diabodies), 또는 PEG화된 (PEGylated) 단편과 같이 반감기가 증가되었던 단편이라면 모두로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항체, 또는 이로부터 유래된 화합물 또는 기능적 단편을 지향한다.

본 발명에 따른 항체의 이러한 기능적 단편은 예를 들어 Fv, scFv (sc = 단순한 사슬), Fab, F(ab')₂, Fab', scFv-Fc 단편 또는 다이아바디, 또는 폴리(에틸렌)글리콜 ["PEG화 (PEGylation)"] (PEG화된 단편은 Fv-PEG, scFv-PEG, Fab-PEG, F(ab')₂-PEG, Fab'-PEG로 약칭된다.)과 같은 폴리알킬렌글리콜의 첨가와 같은 화학적 변형에 의해 또는 리포좀, 마이크로스피어 (microsphere) 또는 PLGA 내의 삽입에 의해 반감기가 연장되었던 단편이라면 모두로 구성되고, 상기 단편은 항체가 나온 항체의 일반적인 활성을 부분적일지라도 나타낼 수 있는 본 발명의 특징적인 CDRs의 적어도 하나를 가진다.

바람직하게, 상기 기능적 단편은 그들이 유래한 항체의 다양한 중쇄 또는 경쇄의 부분적 서열로 구성되거나 이를 포함할 것이며, 상기 부분적 서열은 그들이 유래한 항체와 동일한 결합 특이도 (binding specificity) 및 그들이 유래한 항체와의 적절한 친화도 (affinity), 바람직하게는 적어도 100분의 1, 더욱 바람직하게는 적어도 10분의 1에 해당하는 친화도를 보유하면 충분하다.

이러한 기능적 단편은 그들이 나온 항체의 서열로부터 적어도 5개의 연속적 아미노산, 바람직하게는 6, 7, 8, 10, 15, 25, 50 또는 100개의 연속적 아미노산을 포함할 것이다.

바람직하게, 이들 기능적 단편은 Fv, scFv, Fab, F(ab')₂, Fab', scFv-Fc 타입 또는 다이아바디일 것이고, 이는 일반적으로 그들이 획득된 항체와 동일한 결합특이성 (binding specificity)을 갖는다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 항체의 단편은 상기 기술된 항체로부터 시작하여 펩신 (pepsin) 또는 파파인 (papain)을 포함하는 효소 소화 (enzyme digestion)와 같은 방법에 의해 및/또는 화학적 환원에 의한 디설파이드 연결의 절단 (cleavage)에 의해 획득될 수 있다. 본 발명에 포함된 항체 단편은 또한 당업자에게 마찬가지로 잘 알려져 있는 유전적 재조합 기법에 의해 또는 예를 들어 어플라이드 바이오시스템사 (Applied Biosystems) 등이 시판하는 기기와 같은 자동 펩타이드 합성기 (automatic peptide synthesizers)에 의한 펩타이드 합성에 의해 획득될 수 있다.

더욱 명확하게 하기 위해, 하기 표 2는 본 발명의 항체에 해당하는 다양한 아미노산 서열을 정리하고 있다.

표 2

(여기에서 Mu.= 마우스 및 Ch.= 키메라)

본 발명의 또 다른 특정한 관점은 마우스와 이종유래 (heterologous) 종, 명확하게 사람의 항체로부터 유래한 경쇄 및 중쇄 불변 부위도 역시 포함하는 키메라 항체, 또는 이로부터 유래된 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.

또한 본 발명의 또 다른 특정한 관점은 인간 항체로부터 유래한 경쇄 및 중쇄 불변 부위가 각각 람다 또는 카파 부위 및 감마-1, 감마-2 또는 감마-4 부위가 되는 인간화 항체, 또는 이로부터 유래된 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.

또 다른 관점에 따르면, 본 발명은 본 발명에 따른 모노클론 항체를 분비할 수 있는 마우스 하이브리도마, 명확하게는 프랑스 미생물 배양의 수집기관 (CNCM, 프랑스 파리, 파스퇴르 연구소)에 2007년 10월 22일자 수탁번호 제 I-3860호로 기탁된 마우스 하이브리도마에 관한 것이다. 상기 하이브리도마는 면역화된 Balb/c 마우스 비장세포와 Sp 2O Ag 14 마이엘로마 세포주의 융합에 의해 획득되었다.

본 명세서에서 414H5라고 명명된 모노클론 항체, 또는 이로부터 유래된 화합물 또는 기능적 단편은 2007년 10월 22일자로 수탁번호 제 I-3860호 하에 명확하게 본 발명의 형식 부분으로 기탁된 하이브리도마에 의해 분비되는 것을 특징으로 한다.

또 다른 관점에 따르면, 본 발명은 본 발명에 따른 모노클론 항체를 분비할 수 있는 마우스 하이브리도마, 명확하게는 프랑스 미생물 배양의 수집기관 (CNCM, 프랑스 파리, 파스퇴르 연구소)에 2008년 6월 25일자 수탁번호 제 I-4019호로 기탁된 마우스 하이브리도마에 관한 것이다. 상기 하이브리도마는 면역화된 Balb/c 마우스 비장세포와 Sp 2O Ag 14 마이엘로마 세포주의 융합에 의해 획득되었다.

본 명세서에서 515H7이라고 명명된 모노클론 항체, 또는 이로부터 유래된 화합물 또는 기능적 단편은 2008년 6월 25일자로 수탁번호 제 I-4019호 하에 명확하게 본 발명의 형식 부분으로 기탁된 하이브리도마에 의해 분비되는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 항체는 키메라 또는 인간화 항체를 포함한다.

키메라 항체는 해당 종의 항체로부터 유래된 자연적 가변 부위 (경쇄 및 중쇄)를 상기 해당 종과 이종유래인 종의 항체 경쇄 및 중쇄의 불변 부위와 조합하여 포함하는 것이다.

본 항체, 또는 그의 키메라 단편은 재조합 유전학의 기법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 키메라 항체는 프로모터 및 본 발명의 비인간, 명확하게 마우스의 모노클론 항체의 가변 부위를 코딩하는 서열, 및 인간 항체의 불변 부위를 코딩하는 서열을 포함하는 재조합 DNA를 클로닝하는 것에 의해 생산될 수 있다. 이러한 재조합 유전자에 의해 인코드되는 본 발명의 키메라 항체는 예를 들어 마우스-인간 키메라일 수 있고, 이 항체의 특이성은 마우스 DNA 로부터 유래한 가변 부위에 의해 결정되고 그의 이소타입은 인간 DNA 로부터 유래한 불변 부위에 의해 결정된다. 키메라 항체를 제조하는 방법을 위해, 버호인 등의 문헌 (Verhoeyn et al., BioEssays, 8: 74, 1988)을 참조하라.

또 다른 관점에서, 본 발명은 조합 항체로 이루어진 항체, 또는 이로부터 유래된 화합물 또는 기능적 단편을 기술하고 있다.

상세한 바람직한 구현예에서, 본 발명의 키메라 항체, 또는 이로부터 유래된 화합물 또는 기능적 단편은 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열을 포함하고, 또한 서열번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.

또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 키메라 항체, 또는 이로부터 유래된 화합물 또는 기능적 단편은 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열을 포함하고, 또한 서열번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.

"인간화 항체 (humanized antibodies)"는 비-인간 기원의 항체로부터 유래한 CDR, 하나 (또는 여러 가지의) 인간 항체로부터 유래한 항체 분자의 기타 다른 부분을 포함하는 항체를 의미한다. 또한, 골격의 분절 잔기의 일부 (FR이라고 명명됨)는 결합 친화도를 보존하기 위하여 변형될 수 있다 (Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986; Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536, 1988; Riechmann et al ., Nature, 332: 323-327, 1988).

본 발명의 인간화 항체 또는 그의 단편은 당업자가 숙지하고 있는 기법에 의해 제조될 수 있다 (예를 들어 Singer et al., J. Immun. 150:2844-2857, 1992; Mountain et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10:1-142, 1992; 또는 Bebbington et al., Bio/Technology, 10:169-175, 1992 의 문헌들에 기술되어 있는 것과 같음). 이러한 인간화 항체는 시험관내 진단을 실시하는 방법에서 또는 생체내 예방적인 및/또는 치료적인 처치에서 사용하는 데 바람직하다. 기타 인간화 기법도 역시, 예를 들어 유럽특허 제 EP 0 451 261호, 제 EP　0　682 040호, 제 EP 0 939 127호, 제 EP 0 566 647호 또는 미국특허 제 US 5,530,101호, 제 US 6,180,370호, 제 US　5,585,089호 및 제 US 5,693,761호 특허들로 PDL에 의해 기술된 "CDR 이식 (CDR Grafting)"과 같은 선행기술을 통해 당업자가 잘 숙지하고 있다. 또한 미국 특허 제 US　5,639,641호, 제 US 6,054,297호, 제 US 5,886,152호 및 제 US 5,877,293호도 인용될 수 있다.

또한, 본 발명도 역시 상기에 기술된 마우스 항체로부터 나온 인간화 항체에 관한 것이다.

바람직한 방식으로, 인간 항체로부터 유래한 경쇄 및 중쇄의 불변 부위는 각각 람다 또는 카파 부위 및 감마-1, 감마-2 또는 감마-4 부위일 수 있다.

IgG1 이소타입에 해당하는 구현예에서, 항체의 추가적인 특징은 항체-의존성 세포 독성 (ADCC, antibody dependent cellular cytotoxicity) 및/또는 보체-의존성 세포독성 (CDC, complement dependent cytotoxicity)와 같은 효과기 기능 (effector function)을 나타내는 것이다.

본 발명의 새로운 관점은 분리된 핵산에 관한 것이고, 이는

- 본 발명에 따른 항체, 또는 이로부터 유래된 화합물 또는 기능적 단편을 코딩하는 핵산, DNA 또는 RNA;

- 상기에서 정의된 바와 같은 핵산에 상보적인 핵산;

- 적어도 서열번호 15 내지 26 또는 서열번호 52 내지 61의 핵산 서열 CDRs의 하나 또는 서열번호 15 내지 26 또는 서열번호 52 내지 61 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98% 일치도를 가지는 서열과 높은 엄격도 조건 하에서 혼성화할 수 있는 적어도 18개 뉴클레오타이드의 핵산; 및

- 적어도 서열번호 27 또는 서열번호 62 또는 서열번호 68 또는 70의 핵산 서열의 경쇄 및/또는 서열번호 28 또는 서열번호 63 또는 서열번호 69 또는 71의 핵산 서열의 중쇄 또는 서열번호 27 및/또는 28 또는 서열번호 62 및/또는 63 또는 서열번호 68 및/또는 69 또는 서열번호 70 및/또는 71 서열과 최적의 정렬 이후에 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98% 일치도를 가지는 서열과 높은 엄격도 조건 하에서 혼성화할 수 있는 적어도 18개 뉴클레오타이드의 핵산: 중에서 선택되는 것을 특징으로 한다.

하기 표 3은 본 발명의 항체에 관한 다양한 뉴클레오타이드 서열을 정리하고 있다.

표 3

본 발명의 기술내용에서 상호 교환적으로 사용될 용어 " 핵산 (nucleic acid)", "핵산 서열 (nucleic sequence)", "핵산 서열 (nucleic acid sequence)", "폴리뉴클레오타이드 (polynucleotide)", "올리고뉴클레오타이드 (oligonucleotide)", "폴리뉴클레오타이드 서열 (polynucleotide sequence)" 및 " 뉴클레오타이드 서열 (nucleotide sequence)"은 변형 여부에 상관없이 핵산의 단편 또는 부위를 정의하며 비-자연적 뉴클레오타이드를 포함하기도 하는 이중가닥 DNA, 단일가닥 DNA 또는 상기 DNAs의 전사 산물로 존재하는 뉴클레오타이드의 분명한 서열을 의미한다.

또한 본 명세서에서 본 발명은 그들의 자연적 염색체 환경에서, 예로 자연적 상태에서의 뉴클레오타이드 서열에 관한 것이 아니라는 점이 포함되어야 한다. 본 발명의 서열은 이미 분리되어 및/또는 정제되었고, 다시 말해 예를 들어 복제에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 추출되었으며, 그들의 환경은 적어도 부분적으로는 변형되었던 것이다. 본 명세서에서는 또한 예를 들어 숙주세포를 사용하는 유전적 재조합에 의해 획득되거나 또는 화학적 합성에 의해 획득되는 분리된 핵산이 언급되어야 한다.

바람직한 서열과 최적의 정렬에 따른 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98%의 일치도 퍼센트를 나타내는 핵산 서열은 기준 핵산 서열에 대하여 상세하게 결실, 절단, 연장, 조합된 융합 및/또는 치환, 명확하게 점 치환 (punctual)과 같은 소정의 변형을 나타내는 핵산 서열을 의미한다. 바람직하게, 그들은 유전적 암호의 반복성 (degeneracy)과 관련이 있는 기준 서열과 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 서열 또는 기준 서열과, 바람직하게는 높은 엄격도 명확하게 하기 본 명세서에서 정의된 조건 하에서 특이적으로 혼성화할 수 있는 상보적인 서열이다.

높은 엄격도의 조건 하에서의 혼성화는 온도 및 이온 강도에 관한 조건이 그들이 두 가지 상보적인 DNA 단편들 간에 혼성화를 유지하도록 하는 방식으로 선별되는 것을 의미한다. 간단하게 설명하면, 상기에서 기술된 폴리뉴클레오타이드 단편을 정의하려는 목적을 위해 혼성화 단계의 높은 엄격도 조건은 유리하게는 하기와 같다.

DNA-DNA 또는 DNA-RNA 혼성화는 두 단계로 수행된다: (1) 5 x SSC (1 x SSC 는 0.15 M NaCl + 0.015 M 소듐 사이트레이트 용액에 해당한다), 50% 포름아마이드, 7% 소듐 도데실 설페이트 (SDS), 10 x 덴하르트 용액 (Denhardt's), 5% 덱스트란 설페이트, 1% 연어정자 DNA를 포함하는 포스페이트 완충용액에서 42℃에서 3시간 동안 전혼성화 (prehybridization); (2) 탐침의 길이에 의존적인 온도에서 (예로, > 100개 뉴클레오타이드 길이의 탐침의 경우 42℃) 20시간 동안 일차적으로 혼성화, 이어서 2 x SSC + 2% SDS에서 20분 동안 20℃에서 두 번 세척, 0.1 x SSC + 0.1% SDS에서 20분 동안 20℃에서 한 번 세척. 최종 세척은 > 100개 뉴클레오타이드 실이의 탐침의 경우 0.1 x SSC + 0.1% SDS에서 30분 동안 60℃에서 수행된다. 정해진 크기의 폴리뉴클레오타이드에 대한 상기에서 기술된 매우 높은 엄격도는, 샘브룩 등에 기술된 방법에 따라 (Sambrook et al., 1989, 분자 클로닝: 실험실 매뉴얼 제 3판, 2001) 더 길거나 더 짧은 길이의 올리고뉴클레오타이드의 경우 당업자에 의해 적응될 수 있다.

또한 본 발명은 본 발명에 기술된 바와 같은 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.

본 발명은 명확하게 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 클로닝 및/또는 발현 벡터를 지향한다.

본 발명의 벡터는 바람직하게 해당 숙주 세포에서 뉴클레오타이드 서열의 발현 및/또는 분비를 허용하는 요소 (elements)를 포함한다. 따라서 본 벡터는 프로모터, 해독 개시 및 종결 신호뿐만 아니라 적합한 전사 조절 부위를 포함해야 한다. 이것은 숙주세포에서 안정한 방식으로 유지될 수 있어야 하고, 선택 사양으로 해독된 단백질의 분비를 결정하는 (specifying) 특정한 신호를 가질 수 있다. 이들 다양한 요소들은 선택되어 사용된 세포 숙주에 따라 당업자에 의해 최적화된다. 이러한 목적을 위해, 뉴클레오타이드 서열은 선택된 숙주 내에서 자가-복제하는 (self-replicating) 벡터 내로 삽입될 수 있거나 선택된 숙주의 융합 벡터 (intergrative vector)가 될 수 있다.

이러한 벡터는 당업자에 의해 통상적으로 사용되는 방법에 의해 제조될 수 있고 그 결과 얻은 클론은 리포펙션 (lipofection), 전기천공법 (electroporation), 열 충격 (heat shock) 또는 화학적 방법과 같은 표준 방법에 의해 적합한 숙주 내로 도입될 수 있다.

본 벡터는, 예를 들어 플라스미드 또는 바이러스 기원의 벡터이다. 그들은 본 발명의 뉴클레오타이드 서열을 클론하거나 발현시키기 위하여 숙주 세포를 형질전환시키는 데 사용될 수 있다.

또한 본 발명은 본 발명에 기술된 바와 같은 벡터로 형질전환되거나 이를 포함하는 숙주세포를 포함한다.

세포 숙주는 원핵성 또는 진핵성 시스템, 예를 들어 박테리아 세포뿐만 아니라 효모 세포 또는 동물 세포, 특히 포유동물 세포로부터 선택될 수 있다. 곤충 세포 또는 식물 세포도 역시 사용될 수 있다.

또한 본 발명은 본 발명에 따른 형질전환된 세포를 포함하는 인간이 아닌 동물에 관한 것이다.

또 다른 관점에 따르면, 본 발명은

a) 본 발명에 따른 숙주세포에 적합한 배지 및 배양 조건에서의 배양; 및

b) 상기 배양 배지로부터 또는 상기 배양된 세포로부터 생산된 상기 항체, 또는 그의 기능적 단편의 하나의 회수: 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 기능적 단편의 하나를 생산하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 형질전환된 세포는 본 발명에 따른 재조합 폴리펩타이드를 제조하는 방법에서 유용하다. 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 재조합 형태로 제조하는 방법은 상기 방법이 벡터 및/또는 본 발명에 따른 벡터에 의해 형질전환된 세포를 사용하는 것을 특징으로 하고, 이들도 역시 본 발명에 포함된다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 벡터에 의해 형질전환된 세포는 상기 폴리펩타이드의 발현 및상기 재조합 펩타이드의 회수를 가능하게 하는 조건 하에서 배양된다.

이미 기술되었던 바와 같이, 세포 숙주는 원핵성 또는 진핵성 시스템들 중에서 선택될 수 있다. 상세하게는, 이러한 원핵성 또는 진핵성 시스템에서 분비를 용이하게 하는 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열을 확인하는 것이 가능하다. 따라서 이러한 서열을 보유하는 본 발명에 따른 벡터는 분비될 재조합 단백질을 생산하는데 유리하게 사용될 수 있다. 따라서. 흥미로운 이들 재조합 단백질의 정제 과정은 그들이 숙주 내포의 내부보다는 오히려 세포 배양의 상청액에 존재하는 사실로 인해 용이해질 것이다.

또한 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 화학적 합성에 의해 제조하는 것이 가능하다. 이러한 제조 방법 하나가 또한 본 발명의 목적이 된다. 당업자라면 고체상을 사용하는 방법 (명확하게 Steward et al., 1984, Solid phase peptides synthesis, Pierce Chem. Company, Rockford, 111, 2nd Ed., (1984)를 참고하라.) 또는 부분적 고체상을 사용하는 기법과 같은 단편의 응축 수단에 의한, 또는 용액에서의 통상적인 합성에 의한 화학적 합성의 방법을 숙지하고 있다. 화학적 합성에 의해 획득되고 해당하는 비-자연적 아미노산을 포함할 수 있는 폴리펩타이드도 또한 본 발명에 포함된다.

또한 본 발명의 방법에 의해 획득될 수 있는 항체, 또는 이로부터 유래된 화합물 또는 기능적 단편도 본 발명에 포함된다.

본 발명의 보다 또 다른 관점에 따르면, 본 발명은 또한 인간 케모카인 패밀리 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 및/또는 이러한 수용체의 신호전달을 특이적으로 저해할 수 있는 것을 특징으로 하는 상기 기술된 바와 같은 항체에 관한 것이다.

새로운 구현예에 따르면, 본 발명은 항체가 예를 들어 VEGFR, VEGF, EGFR, IGF-1R, HER2neu, HGF, cMET, FGF, 테트라스패닌 (tetraspanins), 인테그린 (intergrins), CXCR4 (본 발명의 항체가 아닌, 예로 또 다른 에피토프를 표적하는 것), CXCR7 또는 CXCR2와 같은 종양의 발달에 관련이 있는 수용체라면 모두와 상호작용할 수 있는 두 번째 모티브를 포함한다는 의미에서 이중특이적 (bispecific) 항체로 이루어진 항체, 또는 이로부터 유래된 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.

이중특이적, 또는 이중기능적 (bifunctional) 항체는 두 가지 서로 다른 가변 부위가 동일한 분자에 결합되어 있는 모노클론 항체의 두 번째 세대로 구성된다 (Hollinger and Bohlen 1999 Cancer and metastasis rev. 18: 411-419). 그들의 유용성은 새로운 효과기 기능을 채용하거나 또는 종양 세포의 표면 상에 다수의 분자를 표적시키는 능력으로 인해 진단 분야 및 치료적 분야 둘 다에서 발휘되어 왔다. 이들 항체는 화학적 방법 (Glennie M J et al. 1987 J. Immunol. 139, 2367-2375; Repp R. et al. 1995 J. Hemat. 377-382) 또는 체세포 방법 (Staerz U.D. and Bevan M.J. 1986 PNAS 83, 1453-1457; Suresh M. R. et al. 1986 Method Enzymol. 121: 210-228)뿐만 아니라, 바람직하게는 이종이중화 (heterodimerization)를 가능하게 하고 또한 찾고 있는 항체의 정제 방법을 용이하게 하는 유전적 조작 기법에 의해 획득될 수 있다 (Merchand et al. 1998 Nature Biotech. 16: 677-681).

이들 이중특이적 항체는 전체 IgGs, 이중특이적 Fab'2s, Fab'PEGs 또는 다이아바디 또는 이중특이적 scFvs로서 뿐만 아니라 두 가지의 고정 부위가 표적된 항원 또는 그의 단편 각각에 존재하는 사가 (tetravalent)의 이중특이적 항체로서 (Park et al., 2000 Mol. Immunol. 37(18): 1123-30) 상기 본 명세서에 기술된 바와 같이 제작될 수 있다.

이중특이적 항체의 생산 및 투여가 두 가지 특이적 항체의 개별 생산보다 저렴하다는 경제적인 장점 이외에도, 이러한 이중특이적 항체의 사용은 치료의 독성을 감소시키는 장점도 가진다. 따라서, 이중 특이적 항체의 사용은 순환하는 항체의 전체 양 그리고 그 결과, 가능한 독성을 감소시키는 것을 가능하게 한다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 이중특이적 항체는 이가 (divalent) 또는 사가 (tetravalent) 항체이다.

마지막으로, 본 발명은 약제로서 사용되기 위한 상기에서 기술되는 항체, 또는 이로부터 유래된 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.

또한 본 발명은 본 발명의 항체, 또는 이로부터 유래된 화합물 또는 기능적 단편으로 구성되는 화합물을 활성 성분으로서 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 항체는 부형제 및/또는 약제학적으로 허용가능한 담체에 의해 보충될 수 있다.

또한 본 발명은 추가적으로 동시적 (simultaneous), 개별적 (separated) 또는 연장된 (extended) 방식으로 사용하기 위한 조합 산물로서 CXCR4에게로 유도되는 항체가 아닌 항-종양 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물에 관한 것이다.

보다 또 다른 구현예에 따르면, 본 발명은 또한 적어도 IGF-IR, EGFR, HER2/neu, cMET, VEGFR 또는 VEGF와 같은 수용체의 타이로신 키나제 활성을 특이적으로 저해할 수 있는 화합물 중에서 선택되는 두 번째 항종양 화합물, 또는 당업자에게 알려져 있는 그 외 다른 항종양 화합물을 포함하는 상기에 기술된 바와 같은 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 두 번째 바람직한 관점에서, 상기 두 번째 화합물은 증식 및/또는 항-세포사멸 및/또는 혈관형성 및/또는 상기 수용체에 의해 촉진되는 전이성 전염 (metastatic dissemination)의 유도 활성을 저해할 수 있는, 분리된 항체 항EGFR, 항IGF-IR, 항HER2/neu, 항cMET, VEGFR, VEGF 등, 또는 그들의 기능적 단편 및 유래된 화합물 중에서 선택될 수 있다.

또한 리투시마브 (rituximab), 이브리투모마브 (ibritumomab) 또는 토시투모마브 (tositumomab)와 같은 항CD20 항체; 젬투주마브 (gemtuzumab) 또는 린투주마브 (lintuzumab)와 같은 항CD33 항체; 에프라투주마브 (epratuzumab)와 같은 항CD22 항체; 아렘투주마브 (alemtuzumab)와 같은 항CD52 항체; 에드레코로마브 (edrecolomab), Ch 17-1A 또는 IGN-101과 같은 항EpCAM 항체; 크사액틴 (Xactin)과 같은 항CTP21 또는 16 항체; ¹³¹I-코타라 TNT-1과 같은 항DNA-Ag 항체; 펨투모마브 또는 R1150과 같은 항MUC1 항체; ABX-MA1과 같은 항MUC18 항체; 미투모마브 (mitumomab)와 같은 항GD3 항체; 시박 (CeaVac) 또는 라베투주마브 (labetuzumab)와 같은 항ECA 항체; 오바렉스 (OvaRex)와 같은 항CA125 항체; 아포리주마브 (apolizumab)와 같은 항HLA-DR 항체; MDX-010과 같은 항CTLA4 항체; MDX-070, ¹¹¹In & ⁹⁰Y-J591, ¹⁷⁷Lu J591, J591-MDI와 같은 항PSMA 항체; IGN311와 같은 항루이스 Y 항체; AS1405 및 90YmuBCI와 같은 항혈관형성 항체; TRAIL R1mAb 또는 TRAIL R2mAb와 같은 항트레일-R1 항체가 언급하기에 적합하다.

또한 또 다른 구현예에 따르면, 본 발명은 또한 상기에서 기술된 바와 같이 동시적, 개별적 또는 연장된 사용을 위한 조합 또는 결합 산물로서 세포독성/세포증식억제 제제를 추가적으로 포함하는 조성물에 관한 것이다.

"동시적 사용 (simutaneous use)"는 하나 및 동일한 약제학적 형태에 포함되는 본 발명에 따른 조성물의 두 가지 화합물의 투여로서 이해된다.

"개별적 사용 (separate use)"은 별도의 약제학적 형태에 포함되는 본 발명에 따른 조성물의 두 가지 화합물의 일시적 (at the same time) 투여로서 이해된다.

"연장된 사용 (extended use)"은 각각 별도의 약제학적 형태에 포함되는 본 발명에 따른 조성물의 두 가지 화합물의 연속적인 투여로서 이해된다.

일반적으로, 본 발명에 따른 조성물은 암 치료의 효능을 유의하게 증가시킨다. 다른 말로 하면, 본 발명의 항체의 치료적 효과는 세포 독성 제제의 투여에 의해 예측하지 못하는 방식으로 증진된다. 본 발명의 조성물에 의해 생산되는 또 다른 주요 연속적 장점은 더 낮은 유효량의 활성 성분을 사용할 수 있는 가능성에 대한 것이고, 이는 나타날 수 있는 이차적인 효과 특히 세포독성 제제의 효과의 위험성을 회피하거나 감소시키는 것을 가능하게 한다. 더우기, 본 발명에 따른 이러한 조성물은 당연히 기대되는 치료적 효과를 더욱 신속하게 달성하는 것을 허용한다.

"치료적 항암 제제 (therapeutic anticancer agent)" 또는 "세포독성 제제 (cytotoxic agent)"는 환자에게 투여될 때 환자에서 암의 발생을 치료하거나 예방하는 물질로서 이해해야 한다. 이러한 제제의 비-제한적인 예로는, "알킬화 (alkylating)" 제제, 항대사물질 (antimetabolites), 항종양 항생제 (antitumour antibiotics), 세포분열 억제제 (mitotic inhibitors), 크로마틴 기능 억제제 (chromatin function inhibitors), 항혈관형성제 (antiangiogenics), 항에스트로전 (antiostrogens), 항안드로겐 (antiandrogens) 및 면역조절자 (immunomodulators)를 들 수 있다.

이러한 제제는 예를 들어 VIDAL에서 종양학 및 혈액학에 할애된 페이지 상에 "세포독성 (cytotoxic)"이라는 제목 하에 언급되고; 이 문헌에 관한 참고문헌을 통해 언급되는 세포독성 화합물은 본 명세서에서 바람직한 세포독성 제제로서 언급된다.

"알킬화 제제 (alkylating agents)"는 세포 내에서 공유적으로 결합할 수 있거나, 어떤 분자라도 바람직하게는 핵산 (예로: DNA)을 알킬화할 수 있는 물질이라면 모두를 말한다. 이러한 알킬화 제제의 예로는 메클로에타민 (mechlorethamine), 클로르암부실 (chlorambucil), 멜팔란 (melphalan), 클로르하이드레이트 (chlorhydrate), 피포브로만 (pipobroman), 프레드니무스틴 (prednimustine), 디소듐 포스페이트 (disodium phosphate) 또는 에스트라무스틴 (estramustine)과 같은 질소 머스타드; 사이클로포스파마이드 (cyclophosphamide), 알트레타민 (altretamine), 트로포스파마이드 (trofosfamide), 설포포스파마이드 (sulfofosfamide) 또는 이포스파마이드 (ifosfamide)과 같은 옥사조포스포린 (oxazophosphorines); 아지리딘 (aziridies) 또는 티오테파 (thiotepa), 트리에틸렌아민 (triethyleneamine) 또는 알테트라아민 (altetramine)과 같은 에틸렌-이민 (ethylene-imines); 카무스틴 (carmustine), 스트렙토조신 (streptozocin), 포테무스틴 (fotemustine) 또는 로무스틴 (lomustine)과 같은 니트로소우레아 (nitrosourea); 부설판 (busulfan), 트레오설판 (treosulfan) 또는 임프로설판 (improsulfan)과 같은 알킬 설포네이트 (alkyl sulfonates); 다카바진 (dacarbazine)과 같은 트리아젠 (triazenes); 또는 시스플라틴 (cisplatin), 옥살리플라틴 (oxaliplatin) 또는 카보플라틴 (carboplatin)과 같은 백금 복합체가 포함된다.

"항대사물질 (antimetabolites)"은 소정의 활성, 일반적으로 DNA 합성에 의해 간섭하여 세포 성장 및/세포 대사를 방해하는 물질을 말한다. 항대사물질의 예로는 메토트렉세이트 (methotrexate), 5-플루오로우라실 (5-fluorouracil), 플로스우리딘 (floxuridine), 5-플루오로데옥시우리딘 (5-fluorodeoxyuridine), 카페시타빈 (capecitabine), 사이타라빈 (cytarabine), 플루다라빈 (fludarabine), 사이토신 아라비노사이드 (cytosine arabinoside), 6-머캅토퓨린 (6-mercaptopurine, 6-MP), 6-티오구아닌 (6-thioguanine, 6-TG), 클로로데옥시아데노신 (chlorodeoxyadenosine), 5-아자사이티딘 (5-azacytidine), 젬시타빈 (gemcitabine), 클라드리빈 (cladribine), 데옥시코포르마이신 (deoxycoformycin) 및 펜토스타딘 (pentostatin)이 포함된다.

"항종양 항생제 (antitumour antibiotics)"는 DNA의, RNA의 및/또는 단백질의 합성을 방해하거나 억제할 수 있는 화합물을 말한다. 이러한 항종양 항생제의 예로는 독소루비신 (doxorubicin), 다우노루비신 (daunorubicin), 이다루비신 (idarubicin), 발루비신 (valrubicin), 미토크산트론 (mitocantrone), 닥티노마이신 (dactinomycin), 미스라마이신 (mithramycin), 플리카마이신 (plicamycin), 미토마이신 C (mitomycin C), 블레오마이신 (bleomycin) 및 프로카바진 (procarbazine)이 포함된다.

"세포분열 억제제 (mitotic inhibitors)"는 세포 주기 (cell cycle) 및 세포 분열 (mitosis)의 정상적인 진행을 막는다. 일반적으로 파크리탁셀 (paclitaxel) 및 독세탁셀 (docetaxel)과 같은 미세소관 억제제 (microtubule inhibitors) 또는 "탁셀류 (taxoids)"는 세포분열을 저해할 수 있다. 빈블라스틴 (vinblastine), 빈크리스틴 (ncristine), 빈데신 (vindesine) 및 비노렐빈 (vinorelbine)과 같은 빈카 알칼로이드 (vinca alkaloids)도 역시 세포 분열을 저해할 수 있다.

"크로마틴 기능 억제제 (chromatin function inhibitors)" 또는 "토포이소머라제 저해제 (topoisomerase inhibitors)"는 토포이소머라제 I 및 II와 같은 크로마틴을 형성하는 단백질의 정상적인 기능을 저해하는 물질이다. 이러한 저해제의 예로는 토포이소머라제 I의 경우 캄프토테신 (camptothecin) 및 이리노테칸 (irinotecan) 또는 토포테칸 (topotecan)과 같은 그의 유도체가; 토포이소머라제 II의 경우는 에토포사이드 (etoposide), 에티포사이드 포스페이트 (etiposide phosphate) 및 테니포사이드 (teniposide)가 포함된다.

"항혈관형성제 (antiangiogenic)"는 혈관의 성장을 저해하는 약제, 화합물, 물질 또는 제제라면 모두를 말한다. 항-혈관형성 제제의 예로는 이에 제한되는 것은 아니지만, 라족신 (razoxin), 마리마스탯 (marimastat), 바티마스탯 (batimastat), 프리노마스탯 (prinomastat), 태노마스탯 (tanomastat), 일로마스탯 (ilomastat), CGS-27023A, 할로푸지논 (halofuginone), COL-3, 네오바스탯 (neovastat), BMS-275291, 탈리도마이드 (thalidomide), CDC　501, DMXAA, L-651582, 스쿠알라민 (squalamine), 엔도스타틴 (endostatin), SU5416, SU6668, 인터페론-알파 (interferon-alpha), EMD121974, 인터루킨-2 (interleukin-12), IM862, 안지오스타틴 (angiostatin) 및 비탁신 (vitaxin)이 포함된다.

"항에스트로겐 (antiestrogen)" 또는 "에스트로겐 길항제 (estrogen antagonist)"는 에스트로겐의 작용을 감소시키거나 길항하거나 저해하는 물질이라면 모두를 말한다. 이러한 제제의 예로는 태목시펜 (tamoxifen), 토레미펜 (toremifene), 라록시펜 (raloxifene), 드로록시펜 (droloxifene), 이오독시펜 (iodoxyfene), 아나스트로졸 (anastrozole), 레트로졸 (letrozole) 및 엑세메스탄 (exemestane)이 포함된다.

"항안드로겐 (antiandrogens)" 또는 "안드로겐 길항제 (androgen antagonist)"는 안드로겐의 작용을 감소시키거나 길항하거나 저해하는 물질이라면 모두를 말한다. 항안드로겐의 예로는 플루타마이드 (flutamide), 닐루타마이드 (nilutamide), 비칼루카마이드 (bicalutamide), 스피로노락톤 (spironolactone), 사이프로테론 아세테이트 (cyproterone acetate), 피나스테라이드 (finasteride) 및 시미티딘 (cimitidine)이 포함된다.

면역조절자 (immunomodulators)는 면역 시스템을 자극하는 물질이다. 이러한 면역조절자의 예로는 인터페론 (interferons), 알데스루킨 (aldesleukin), OCT-43, 데니루킨 디플리톡스 (denileukin diflitox) 또는 인터루킨-2 (interleukin-2)와 같은 인터루킨 (interleukins), 태소너민 (tasonermin)과 같은 종양 괴사인자 (tumour necrosis factors), 또는 렌티난 (lentinan), 시조피란 (sizofiran), 로퀴니멕스 (roquinimex), 피도티모드 (pidotimod), 페가데마제 (pegademase), 티모펜틴 (thymopentin), 폴리 I:C, 또는 5-플루오로우라실 (5-fluorouracil)과 조합된 레바미졸 (levamosole)과 같은 다른 유형의 면역조절자가 포함된다.

더 상세한 사항을 위해, 당업자라면 프랑스 치료 화학의 교사 협회 (French Association of Teachers of Therapeutic Chemistry)에서 발행한 "치료적 화학 (Therapeutic Chemistry), Vol. 6, 항종양 약제 및 암 치료에서의 전망, TEC 및 DOC 개정판, 2003 (프랑스어판)"이라는 제목의 매뉴얼을 참조할 수 있을 것이다.

상세한 바람직한 구현예에서, 조합 산물 형태로의 본 발명의 상기 조성물은 상기 세포독성 제제가 동시적 사용을 위해 상기 항체에 화학적으로 결합되는 것을 특징으로 한다.

상세한 바람직한 구현예에서, 상기 조성물은 상기 세포독성/세포증식 억제 제제가 방추체 저해제 (spindle inhibitor) 또는 안정제, 바람직하게는 비노렐빈 (vinorelbine) 및/또는 빈플루닌 (vinflunine) 및/또는 빈크리스틴 (vincristine) 중에서 선택되는 것을 특징으로 한다.

상기 세포독성 제제와 본 발명에 따른 상기 항체 간의 결합을 용이하게 하기 위하여, 폴리에틸렌글리콜과 같은 폴리(알킬렌)글리콜 또는 아미노산과 같은 공간 분자 (spacer molecules)가 결합될 두 가지 화합물들 사이에 도입될 수 있고; 또는 또 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 상기 항체와 반응할 수 있는 기능이 도입되었던 상기 세포독성 제제의 활성 유도체가 사용될 수 있다. 이들 결합 기법은 당업자에게 잘 알려져 있어 본 기술내용에서 더욱 상세하게 논의되지는 않을 것이다.

다른 EGFR 저해제로는, 이에 제한되는 것은 아니지만 단일클론 항체 C225 및 항EGFR 22Mab (임클론 시스템사), ABX-EGF (앱제닉스사/셀 젠시스사), EMD-7200 (머크 KgaA사) 또는 화합물 ZD-1834, ZD-1838 및 ZD-1839 (아스트라제네카사), PKI-166 (노바티스사), PKI-166/CGP-75166 (노바티스사), PTK 787 (노바티스사), CP 701 (세팔론사), 플루노마이드 (파마시아사/수젠사), CI-1033 (워너 람버트 파크 데이비스사), CI-1033/PD 183, 805 (워너 람버트 파크 데이비스사), CL-387, 785 (와이스-아어스트사), BBR-1611 (뵈링거 만하임 GMBH사/로슈사), 마아미딘 A (Naamidine A) (브리스톨-보드 마이어스 스퀴브사), RC-3940-II (파마시아사), BIBX-1382 (뵈링거 인겔하임사), OLX-103 (머크사), VRCTC-310 (벤테크 리서치사), EGF 융합 독소 (세라젠사), DAB-389 (세라젠사/릴간드사), ZM-252808 (임페리알 암연구소 기금), RG-50864 (INSERM), LFM-A12 (파커 휴그 암 센터), WHI-P97 (파커 휴그 암센터), GW-282974 (글락소사), KT-8391 (교와 하코사) 또는 "EGFR 백신" (요크 메디칼사/분자면역학 센터)이 포함된다.

본 발명의 또 다른 관점은 상기 항체, 또는 이로부터 유래된 화합물 또는 기능적 단편의 적어도 하나가 세포 독소 및/또는 방사성 동위원소와 결합되는 것을 특징으로 하는 조성물에 관한 것이다.

바람직하게, 상기 독소 또는 상기 방사성 동원원소는 종양 세포의 성장 또는 증식을 방해할 수 있고, 명확하게는 상기 종양 세포를 완전히 불활성화시킬 수 있다.

또한 바람직하게, 상기 독소는 엔테로박테리아 독소, 명확하게는 슈도모나스 엑소톡신 A (Pseudomonas exotoxin A)이다.

바람직하게 치료적 항체와 결합된 방사성 동위원소는 감마선, 바람직하게는 요오드 (iodide)¹³¹, 이트륨 (yttrium)⁹⁰, 금¹⁹⁹, 팔라듐 (palladium)¹⁰⁰, 구리⁶⁷, 비스무스 (bismuth)²¹⁷ 및 안티몬 (antimony)²¹¹를 방출하는 방사성 동워원소이다. 베타선 및 알파선을 방출하는 방사성 동위원소도 역시 치료에 사용될 수 있다.

"적어도 하나의 본 발명의 항체, 또는 그의 기능적 단편과 결합된 독소 또는 방사성 동위원소"는 상기 독소 또는 상기 방사성 동위원소를 적어도 하나의 상기 항체에, 명확하게는 결합 분자를 도입하거나 하지 않고 두 가지 화합물들 간 공유 결합에 의해 결합시킬 수 있게 하는 수단이라면 모두를 말한다.

접합체 (conjugate) 요소의 전부 또는 일부의 화학적 (공유적), 정전기적 또는 비-공유적 연결 (bonding)을 허용하는 제제들의 예로는, 상세하게 벤조퀴논 (benzoquinone), 카보디이미드 (carbodiimide), 더욱 상세하게는 EDC (1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]-카보디이미드 하이드로클로라이드), 디말레이미드 (dimaleimide), 디티오비스-니트로벤조산 (dithiobis-nitro-benzoic acid, DTNB), N-숙시니미딜 S-아세틸 티오아세테이트 (N-succinimidyl S-acetyl thio-acetate, SATA), 하나 이상의 그룹을 가지며, 자외선 (UV)과 반응하는 하나 이상의 페닐아자이드 그룹을 가지는 연결 제제 (bridging agents), 가장 바람직하게는 N-[4-(아지도살리실아미노)부틸]-3'-(2'-피리딜디티오)프로피온아미드 (APDP), N-숙시니미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP) 및 6-하이드라진-니코틴아미드 (HYNIC)가 포함된다.

명확하게 방사성 동위원소를 위한 결합의 또 다른 형태는 이중기능적 이온 킬레이트제 (bifunctional ion chelator)의 사용으로 구성될 수 있다.

이러한 킬레이트제의 예로는 금속, 상세하게는 방사성 금속을 면역글로불린과 결합시키기 위해 개발되었던 EDTA (에틸렌디아민테트라아세트산) 또는 DTPA (디에틸렌트리아미노펜타아세트산)으로부터 유래된 킬레이트제가 포함된다. 따라서, DTPA 및 그의 유도체는 탄소 사슬 상에서 서로 다른 그룹에 의해 치환될 수 있어 리간드-금속 복합체의 안정성 및 경도 (rigidity)를 증가시킨다 (Krejcarek et al. (1977); Brechbiel et al. (1991); Gansow (1991); US patent 4,831,175).

예를 들어, TPA (디에틸렌트리아미노펜타아세트산) 및 그의 유도체는 약물 및 생물학에서 그의 자유형 형태로 또는 금속 이온과의 복합체 형태로 오랫동안 널리 사용되어 왔으며, 암 치료법에 사용되는 방사성-면역 접합체 (radio-immuno conjugate)의 개발을 위해 치료적 또는 진단적으로 흥미로운 단백질과 결합될 수 있는 금속 이온과 안정한 킬레이트를 형성하는 탁월한 특성을 나타낸다 (Meases et al., 1984; Gansow et al. 1990).

또한 바람직하게, 상기 접합체를 형성하는 상기 적어도 하나의 본 발명의 항체는 그의 기능적 단편, 명확하게는 scFv 단편과 같은 그들의 Fc 성분이 상실되었던 단편 중에서 선택된다.

본 발명은 또한 암의 예방 또는 치료를 위해 의도된 약물을 제조하기 위한 조성물의 용도를 포함한다.

또한 본 발명은 종양 세포의 성장을 저해하는 약물을 제조하기 위한 본 발명에 따른 항체, 또는 이로부터 유래된 화합물 또는 기능적 단편, 바람직하게는 인간화된 것 및/또는 조성물의 용도에 관한 것이다. 일반적으로, 본 발명은 암의 예방 또는 치료를 위한 약물을 제조하기 위한 항체, 또는 이로부터 유래된 화합물 또는 기능적 단편, 바람직하게는 인간화된 것 및/또는 조성물의 용도에 관한 것이다.

바람직하게는, 예방되고 및/또는 치료될 수 있는 암으로는 전립선 암 (prostate cancer), 골육종 (osteosarcoma), 폐암 (lung cancer), 유방암 (breast cancer), 자궁내막 암 (endometrial cancer), 결장암 (colon cancer), 다발성 골수종 (multiple myeloma), 난소암 (ovarian cancer), 췌장암 (pancreatic cancer) 또는 기타 다른 암이 포함된다.

또한 본 발명은 CXCR4 활성을 조정하는 약물을 제조하기 위한 상기에서 기술된 바와 같은 항체, 또는 이로부터 유래된 화합물 또는 기능적 단편, 및/또는 조성물의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 관점은 CXCR4 발현 수준과 관련된 질환을 진단하는 방법, 바람직하게는 시험관내 방법에서의 기술된 바와 같은 항체의 용도에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 진단 방법에서 상기 CXCR4 단백질과 관련된 질환은 암일 수 있을 것이다.

따라서, 본 발명의 항체, 또는 이로부터 유래된 화합물 또는 기능적 단편은 생물학적 시료에서 CXCR4 단백질을 시험관내 검출하고 및/또는 정량하는 방법에, 명확하게는 암과 같은 이 단백질의 비정상적인 발현과 관련된 질환을 진단하는 방법에 적용될 수 있고, 본 명세서에서 상기 방법은,

a) 생물학적 시료를 본 발명에 따른 항체, 또는 이로부터 유래된 화합물 또는 기능적 단편과 접촉하도록 두고;

b) 가능한 형성된 항원-항체 복합체를 전시하는: 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

따라서, 본 발명은 또한 하기 요소:

a) 본 발명의 폴리클론 또는 모노클론 항체;

b) 선택 사양으로, 면역학적 반응을 선호하는 배지를 구성하기 위한 반응용액;

c) 선택 사양으로, 면역학적 반응에 의해 생산되는 항체-항원 복합체를 검출하는 반응용액:를 포함하는 기술된 방법을 실시하기 위한 키트 (kits) 또는 부속기기 (accessories)를 포함한다.

유익하게는, 상기 항체 또는 그의 기능적 단편은 지지체, 명확하게는 단백질 칩 (protein chip) 상에 고정될 수 있다. 이러한 단백질 칩은 본 발명의 목적이다.

유익하게는, 단백질 칩은 생물학적 시료에서 CXCR4 단백질을 검출하고 및/또는 정량하는 데 필요한 키트 또는 부속기기에 사용될 수 있다.

본 명세서에서 용어 "생물학적 시료 (biological sample)"는 살아있는 생물로부터 가져온 시료 (명확하게는, 포유동물 명확하게는 사람으로부터 가져온 혈액, 조직, 기관 또는 기타 시료) 또는 하나의 이러한 CXCR4 단백질을 포함할 수 있는 시료 (필요한 경우 형질전환된 세포의 시료와 같은)라면 모두에 관한 것이라는 점이 언급되어야 한다.

상기 항체, 또는 그의 기능적 단편은 검출 가능한 (detectable) 및/또는 정량 가능한 (quantifiable) 신호를 획득하기 위해 표지된 (labeled) 면역접합체 (immunoconjugate) 또는 항체의 형태일 수 있다.

본 발명의 표지된 항체 또는 그의 기능적 단편은, 예를 들어 퍼옥시다제 (peroxidae), 알칼라인 포스파타제 (alkaline phosphatase), α-D-갈락토시다제 (α-D-galactosidase), 글루코스 옥시다제 (glucose oxidase), 글루코스 아밀라제 (glucose amylase), 카보닉 안하이드라제 (carbonic anhydrase) 아세틸콜린에스터라제 (acetylcholinesterase), 라이소자임 (lysozyme), 말레이트 디하이드로게나제 (malate dehydrogenase) 또는 글루코스-6 포스페이트 디하이드로게나제 (glucose-6 phosphate dehydrogenase)와 같은 효소와 결합되는 또는 비오틴 (biotin), 디옥시게닌 (digoxigenin) 또는 5-브로모-데옥시우리딘 (5-bromo-deoxyuridine)과 같은 분자에 의해 결합될 수 있는 항체 접합체 (면역접합체)를 포함한다. 또한 형광 표지도 본 발명의 항체, 또는 그의 기능적 단편과 결합될 수 있고, 명확하게는 이는 플루오레신 (fluorescein) 및 그의 유도체, 플루오로크롬 (fluorochrome), 로다민 (rhodamine) 및 그의 유도체, 녹색 형광 단백질 (GFP), 단실 (dansyl), 엄벨리페론 (umbelliferone) 등을 포함한다. 이러한 접합체에서, 본 발명의 항체 또는 그의 기능적 단편은 당업자가 숙지하고 있는 방법에 의해 제조될 수 있다. 그들은 효소 또는 형광 표지를 사용하여 직접적으로; 폴리알데하이드 (polyaldehyde), 글루타르알데하이드 (glutaraldehyde), 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA) 또는 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DPTA)와 같은 공간 그룹 또는 연결 그룹 (linking group)에 의해; 또는 치료적 접합체로서 상기 언급된 것들과 같은 결합 제제의 존재 시 결합될 수 있다. 플루오레신 표지를 가지는 접합체는 이소티오시아네이트 (isothiocyanate)와의 반응에 의해 제조될 수 있다.

기타 다른 접합체로는 루미놀 (luminol) 및 디옥세탄 (dioxetanes)과 같은 화학발광 표지, 루시페라제 (luciferase) 및 루시페린 (luciferin)과 같은 생물발광 표지, 또는 요오드 (iodide)¹²³, 요오드¹²⁵, 요오드¹²⁶, 요오드¹³³, 브로민 (bromine)⁷⁷, 테크네티움 (technetium)¹¹¹, 인디움 (indium)¹¹¹, 인디움¹¹³ ^m, 갈륨 (gallium)⁶⁷, 갈륨⁶⁸, 루테늄(ruthenium)⁹⁵, 루테늄⁹⁷, 루테늄¹⁰³, 루테늄¹⁰⁵, 수은 (mercury)¹⁰⁷, 수은²⁰³, 레늄 (rhenium)^99m, 레늄¹⁰¹, 레늄¹⁰⁵, 스캔듐 (scandium)⁴⁷, 텔륨 (tellium)^121m, 텔륨¹²² ^m, 텔륨¹²⁵ ^m, 툴륨 (thulium)¹⁶⁵, 툴륨¹⁶⁷, 툴륨¹⁶⁸, 플루오린 (fluorine)¹⁸, 이트리움 (yttrium)¹⁹⁹, 요오드¹³¹와 같은 방사성 표지도 역시 포함될 수 있다. 당업자에게 이미 알려져 있는 방사성 동위원소를 항체에 직접적으로 또는 상기에서 언급된 EDTA 또는 DTPA와 같은 킬레이팅 제제에 의해 결합시키는 방법은 진단적 방사성 동위원소에도 사용될 수 있다. 따라서 클로라민 T 기법 [Hunter W.M. and Greenwood F.C. (1962) Nature 194: 495]에 의해 [I¹²⁵]Na를 사용한 표지; 크로포드 등 (Crockford et al., 미국 특허 US 4 424 200)에 의해 기술된 바와 같은 테크네티움⁹⁹ ^m 을 사용한 표지; 또는 나토위치 (Hnatowich, 미국 특허 제 US 4 479 930호)에 의해 기술된 바 있는 DTPA 를 통해 고정되는 것이 언급되어야 한다.

또한 본 발명은 CXCR4를 발현하거나 과다발현하는 세포에게 생물학적으로 활성이 있는 화합물을 특이적 표적화 (specific targeting)하는 약물을 제조하기 위한 본 발명에 따른 항체의 용도에 관한 것이다.

본 명세서의 의미에서 "생물학적으로 활성이 있는 화합물 (biologically active compound)"은 세포의 활성, 명확하게는 성장, 증식, 전사 또는 유전자 해독을 조정할 수 있는, 명확하게는 저해할 수 있는 화합물이라면 모두가 된다.

또한 본 발명은, 바람직하게 표지된, 명확하게는 방사성 표지된 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 기능적 단편으로 구성되는 생체내 진단 반응용액 (diagnostic reagent), 또한 의학적 영상촬영에서의, 명확하게는 CXCR4의 세포 발현 또는 과다발현과 관련된 암을 검출하기 위한 그의 용도에 관한 것이다.

또한 본 발명은 약물로서 사용되는, 본 발명에 따른 조합 산물로의 조성물 또는 항-CXCR4/독소 접합체 또는 방사성 동위원소에 관한 것이다.

바람직하게는 상기 조합 산물로서의 조성물 또는 상기 접합체는 부형제 및/또는 약제학적 담체에 의해 보충될 것이다.

본 발명의 기술내용에서, "약제학적 담체 (pharmaceutical vehicle)"는 이차적인 반응을 유발하지 않고, 예를 들어 활성이 있는 화합물의 투여를 용이하게 하며, 생물에서 그의 수명 및/또는 효능을 증가시키고, 용액에서 그의 수용성을 증가시키며 또는 그의 저장을 향상시키는 약제학적 조성물에 들어가는 화합물 또는 화합물의 조합을 의미한다. 이러한 약제학적으로 허용가능한 담체는 잘 알려져 있고, 선택된 활성이 있는 화합물의 본성 및 투여 경로에 따라 당업자에게 응용될 수 있다.

바람직하게는, 이들 화합물은 전신 경로 (systemic route), 명확하게는 정맥내 (intravenous), 근육내 (intramuscular), 피내 (intradermic), 복강내 (intraperitoneal), 피하 (subcutaneous), 또는 구강 (oral) 경로에 의해 투여될 것이다. 더욱 바람직하게는, 본 발명에 따른 항체로 구성되는 조성물은 동일한 시간차를 두고 여러 번 용량으로 투여될 것이다.

그들의 투여 경로, 용량 섭생 및 최적의 생약 형태 (galenic form)는, 예를 들어 환자의 나이 또는 체중, 그의 일반적 상태의 중증도, 그의 치료에 대한 인내심 및 경험상의 부작용과 같은 환자에 적합한 치료를 확립할 때 일반적으로 고려되는 판단기준에 따라 결정될 수 있다.

따라서, 본 발명은 CXCR4를 발현하거나 과다발현하는 세포에게 생물학적으로 활성이 있는 화합물의 특이적 표적화 하는 약물을 제조하기 위한 항체, 또는 그의 기능적 단편들의 하나의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 기타 다른 특징 및 장점은 실시예들 및 하기 본 명세서에서 설명이 주어진 도면들과 함께 하기 기술내용에 나타날 것이다.

도 1A 및 도 1B는 암 세포에서의 CXCR4 및 CXCR2 발현을 qPCR 분석법에 의해 각각 나타낸 것이다.
도 2는 암 세포에서의 CXCR4 및 CXCR2 단백질 발현을 FACS 분석법에 의해 나타낸 것이다.
도 3A 및 3B는 야생형 인간 CXCR4를 안정적으로 발현하는 CHO-K1 세포의 세포막 상에서 표지되지 않은 SDF-1 (도 3A) 또한 414H5 및 515H7 Mabs (도 3B)에 의한 특이적 [¹²⁵I]SDF1 결합의 경쟁을 나타낸 것이다 (T: 전체 결합; NS: 비-특이적 결합).
도 4A 및 도 4B는 NIH-2T3 세포에서 안정적으로 발현되는 야생형 CXCR4 수용체에서 [³⁵S]GTPγS 결합 반응을 감시하여 414H5 Mab (도 4A) 및 515H7 Mab (도 4B)에 의한 G 단백질의 활성화 조정을 나타낸 것이다.
도 5는 SDF-1 (10 및 100 nM)로 자극된 HeLa 인간 종양세포에서 [³⁵S]GTPγS 결합 반응을 감시하여 항-CXCR4 Mabs 414H5 및 515H7에 의한 G 단백질의 조정을 나타낸 것이다.
도 6A 내지 도 6F는 HEK293 세포에서 생물발광 공명 에너지 전이 (BRET)를 통해 SDF-1에 의한 또한 414H5 및 515H7 Mabs에 의한 서로 다른 상호작용 파트너와의 CXCR4 수용체 연관성의 조정을 나타낸 것이다. (도 6A 및 도 6B: CXCR4:CXCR4 호모-이중화; 도 6C 및 도 6D: CXCR2:CXCR4 헤테로-이중화; 또한 도 6E 및 도 6F: CXCR4-매개성 β-아레스틴의 채용).
도 7A 및 도 7B는 CXCR4 수용체를 안정적으로 발현하는 NIH-3T3 세포에서 SDF-1 또한 414H5 및 515H7 Mabs에 의한 포스콜린 (forskolin)-자극성 cAMP 생산의 저해를 나타낸 것이다.
도 8은 CHO-K1 세포에서 안정적으로 발현되는 전신적 활성이 있는 돌연변이 Asn¹¹⁹Ser CXCR4 수용체에서 [³⁵S]GTPγS 결합 반응을 감시하여 항-CXCR4 Mabs 414H5 및 515H7에 의한 G 단백질의 활성화 조정을 나타낸 것이다.
도 9는 시험관내 Mab 414H5에 의한 SDF-1 유도성 HeLa 세포 증식의 저해를 나타낸 것이다.
도 10A 및 도 10B는 시험관내 항-CXCR4 Mab 414H5 (도 10A) 및 Mab 515H7 (도 10B)에 의한 SDF-1 유도성 U937 세포 이동의 저해를 나타낸 것이다.
도 11은 Nod/Scid 마우스에서 항-CXCR4 Mab 414H5 (도 11A) 및 Mab 515H7 (도 11B)에 의한 MDA-MB-231 이종이식 종양 성장의 저해를 나타낸 것이다.
도 12는 U937 Nod/Scid 마우스 생존 모델에서 항-CXCR4 Mab 414H5 활성을 나타낸 것이다.
도 13A 내지 도 13C는 CHO-CXCR4 세포 (도 13A), MDA-MB-231 (도 13B), 및 U937 (도 13C) 암 세포에서 항-CXCR4 Mab 515H7에 의한 SDF-1-유도성 칼슘 방출 저해를 나타낸 것이다.
도 14는 Nod/Scid 마우스에서 414H5에 의한 T-세포 KARPAS 299 이종이식 종양의 저해를 나타낸 것이다.
도 15는 U937 Nod/Scid 마우스 생존 모델에서 마우스 항-CXCR4 Mab m515H7의 활성을 나타낸 것이다.
도 16은 Nod/Scid 마우스에서 T-세포 KARPAS 299 이종이식 종양 성장의 저해 시 마우스 항-CXCR4 Mab m515H7의 활성을 나타낸 것이다.
도 17은 야생형 인간 CXCR4를 안정적으로 발현하는 CHO-K1 세포의 세포막 상에서 마우스 m414H5 및 m515H7 Mabs 또한 키메라 Mabs c414H5 및 c515H7에 의한 특이적 [¹²⁵I]SDF1 결합의 경쟁을 나타낸 것이다 (T: 전체 결합; NS: 비-특이적 결합).
도 18은 SDF-1 (10 nM)로 자극된 NIH-3T3 세포에서 안정적으로 발현되는 야생형 CXCR4 수용체에서 [³⁵S]GTPγS 결합 반응을 감시하여 마우스 m414H5 및 m515H7 Mabs 및 키메라 m414H5 및 m515H7 Mabs에 의한 G 단백질의 조정을 나타낸 것이다.
도 19는 SDF-1 (10 nM)로 자극된 HeLa 인간 종양세포에서 [³⁵S]GTPγS 결합 반응을 감시하여 항-CXCR4 마우스 m414H5 및 m515H7 Mabs 및 키메라 m414H5 및 m515H7 Mabs에 의한 G 단백질의 조정을 나타낸 것이다.
도 20A 내지 도 20C는 HEK293 세포에서 생물발광 공명 에너지 전이 (BRET)를 통해 SDF-1에 의한 또한 m414H5, c414H5, m515H7 및 c515H7에 의한 서로 다른 상호작용 파트너와의 CXCR4 수용체 연관성의 조정을 나타낸 것이다. (도 20A: CXCR4:CXCR4 호모-이중화; 도 20B: CXCR2:CXCR4 헤테로-이중화; 또한 도 20C: CXCR4-매개성 β-아레스틴의 채용).
도 21A 및 도 21B는 CHO-CXCR4 세포 (도 21A) 및 U937 세포 (도 21B)에서 SDF-1-유도성 칼슘 방출의 저해를 나타낸 것이다.
도 22A 및 22B는 시험관내 항-CXCR4 Mabs m414H5 및 c414H5 (도 22A) 또한 Mabs 515H7 및 c515H7 (도 22B)에 의한 SDF-1 유도성 U937 세포 이동의 저해를 나타낸 것이다.
도 23은 U937 Nod/Scid 마우스 생존 모델에서 항-CXCR4 키메라 Mabs c414H5 및 c515H7 활성을 나타낸 것이다.

실시예들

실시예 1: 암 세포에서 CXCR4 및 CXCR2 의 발현

-Q- PCR 분석법

서로 다른 암 세포주에서 CXCR4 및 CXCR2의 상대적인 발현을 정량하기 위하여 실시간 RT-PCR이 사용되었다.

RNA 시료는 RNeasy 미니 또는 미디 프로토콜 (프랑스, 퀴아젠사)을 사용하여 서로 다른 세포주들로부터 추출되었다. 그 다음 RNA 시료는 엑스페리온 자동화된 전기영동 시스템 (Experion automated electrophoresis system) (프랑스, 바이오-래드사)을 사용하여 조절되었고 우수한 품질/통합성 (quality/integrity)을 보여주었다. 각 RNA 시료의 1 μg이 아이스크립트 cDNA 합성 키트 (iScript cDNA synthesis kit) (프랑스, 바이오-래드사)를 사용하여 cDNA 주형으로 전환되었다. cDNA 수준은 CXCR2의 경우 TaqMan 프로브 또는 CXCR4의 경우 사이버그린 (SYBERGreen) 둘 중 하나로 qPCR을 실시하여 정량되었다. 비교할 시료는 정상화 (normalization)를 필요로 하고, 따라서 내부적 기준 RPL0가 되입되었다. TaqMan 프로브 (CXCR2의 경우 사용됨)는 5' FAM 리포터 표지 및 3' TAMRA 제거인자 (quencher) 그룹을 보유하였다. PCR 효소는 50℃에서 2분 및 95℃에서 10분 동안 가열하여 활성화되었다. 전체 50 μl의 부피에 5 μl의 cDNA 주형 (1/20 희석), 1 x qPCR 마스터믹스 (TaqMan 유니버설 PCR 마스터믹스, 미국 뉴저지 브랜치버그, 어플라이드 바이오시스템사), 50 내지 900 nM의 각 프라이머 및 50 내지 100 nM의 프로브를 포함하는 PCR 혼합액에서 두 단계 과정 95℃에서 15초 및 62℃에서 1분이 40 또는 45회 반복 사용되었다. 모든 반응은 아이사이클러 기기 (iCycler instrument, 바이오-래드사)를 사용하여 수행되었다. Q-PCR은 사이클 한계치 (Cycle threshold, Ct)를 결정하도록 하였다. Ct값이 더 작아질수록, 테스트된 유전자는 더 많이 발현되는 것이다. 인간 리보좀 단백질, 라지 P0 에 대한 프라이머 및 프로브는 다음과 같았다:

전방 프라이머 (서열번호 32);

역방 프라이머 (서열번호 33);

프로브 (서열번호 34).

인간 CXCR4 (케모카인 수용체 4)에 대한 프라이머는 다음과 같았다:

전방 프라이머 (서열번호 35);

역방 프라이머 (서열번호 36).

인간 CXCR2 (케모카인 수용체 2)에 대한 프라이머는 다음과 같았다:

전방 프라이머 (서열번호 37);

역방 프라이머 (서열번호 38);

프로브 (서열번호 39).

우리의 비교 연구에서, 두 가지 유전자의 발현 [테스트된 유전자 (CXCR4 또는 CXCR2) 및 RPL0]이 두 가지 서로 다른 시료에서 정량되었다: 테스트된 세포주 및 기준 세포주. 기준 세포주는 정량된 유전자의 가장 낮은 발현을 포함하는 세포주에 해당한다. 비교 유전자 발현은 하기 공식을 사용하여 계산되었다:

상대적 유전자 발현 = (1 + E_유전자)^-△ ^Ct ⁽¹⁾ / (1 + E_RPL0)^-△ ^Ct ⁽²⁾

E_유전자 = 정량된 유전자의 프로브/프라이머를 사용한 PCR 효율

E_RPL0 = RPL0 프라이머/프로브를 사용한 PCR 효율

Ct = 순환 한계값

△Ct(1) = Ct_유전자 (테스트된 세포주) - Ct_유전자 (기준 세포주)

△Ct(2) = Ct_RPL0 (테스트된 세포주) - Ct_RPL0 (기준 세포주)

일련의 PCR 각각의 경우, 상대적 유전자 정량 값이 계산되었고, 암 세포주는 가장 높은 것부터 음성인 것까지 그들의 발현 수준을 고려하여 그룹으로 분류되었다. 모든 데이타는 도 1A 및 도 1B에 나타나 있다. 테스트된 암 세포주 모두는 CXCR2의 경우에 DU145 및 U-87MG 세포를 제외하고 CXCR4 (도 1A) 및 CXCR2 (도 1B)를 발현하였다.

- FACS 분석법

MDA-MB-231, PC3 및 U937 암 세포주는 투과 처리되었고 (permeabilized), 그 다음 10 μg/mL의 항-CXCR4 모노클론 항체 [클론 44717 (R & D 시스템사)] 및 그의 이소타입 대조군 IgG2b (시그마사) 또는 10 μg/mL의 항-CXCR2 모노클론 항체 (항 h-CXCR2, 클론 48311, R & D 시스템사, Mab 331 대비 그의 이소타입 대조군 IgG2a) 둘 중 하나와 배양되었다. 그 다음 이 세포는 1% BSA/PBS/0.01% NaN₃로 세척되었다. 이후, 알렉사-표지된 (Alexa-labelled) 이차 항체가 세포에 첨가되었고 4℃에서 20분 동안 배양되도록 하였다. 그 다음 세포는 다시 두 번 세척되었다. 두 번째 세척에 이어서, FACS 분석법이 수행되었다. 이들 결합 연구의 결과는 도 2에 제공된다. 따라서, MDA-MB-231, PC3 및 U937과 같은 종양세포는 CXCR4 및 CXCR2 단백질을 둘 다 발현하였다.

실시예 2: 인간 CXCR4 에 대한 모노클론 항체 ( Mabs )의 생성

CXCR4에 대한 모노클론 항체를 생성하기 위하여, Balb/c 마우스가 재조합 NIH3T3-CXCR4 세포 및/또는 CXCR4 세포외 N-말단 및 루프에 해당하는 펩타이드로 면역화되었다. 첫 번째 면역화 시 6 내지 16주령이 된 마우스가 완전 프런드 아쥬반트 (complete Freund's adjuvant)에 녹인 항원으로 한 번 피하적으로 (s.c.) 면역화되었고, 이어서 불완전 프런드 아쥬반트에 녹인 항원으로 피하적으로 2 내지 6번 더 면역화되었다. 면역 반응은 안와후방 채혈 (retroorbital bleeds)에 의해 감시되었다. 혈청은 엘라이자 (ELISA)에 의해 검색되었고 (하기 기술된 바와 같이) 더 높은 항-CXCR4 항체의 역가 (titers)를 가진 마우스가 융합에 사용되었다. 마우스는 희생시켜 비장을 제거하기 이틀 전에 항원으로 정맥내 추가주사 (boost)되었다.

- 엘라이자 ( ELISA )

항-CXCR4 항체를 생산하는 마우스를 선별하기 위하여, 면역화된 마우스로부터 나온 혈청이 엘라이자에 의해 테스트 되었다. 간략하게, 마이크로타이터 플레이트는 BSA에 결합된 정제된 [1-41] N-말단 펩타이드를 사용하여 5 μg의 동등한 펩타이드/mL, 100 μL/웰 농도로 코팅되었고 4℃에서 하룻밤 동안 배양된 다음 250 μL/웰 농도로 PBS에 녹인 0.5% 젤라틴을 사용하여 블록킹시켰다. CXCR4-면역화된 마우스로부터 나온 혈장의 희석액이 각 웰에 첨가되었고 37℃에서 2시간 동안 배양되었다. 플레이트는 PBS로 세척된 다음 HRP에 접합된 염소 항-마우스 IgG 항체 (잭슨 연구소)로 37℃에서 2시간 동안 배양되었다. 세척 이후에, 플레이트는 TMB 기질을 사용하여 현상되었고, 반응은 5분 경과시 100 μL/웰의 1 M H₂SO₄의 첨가에 의해 정지되었다. 더 높은 항-CXCR4 항체의 역가를 가진 마우스가 항체 생성을 위해 사용되었다.

- CXCR4 에 대한 Mabs 를 생산하는 하이브리도마의 생성

더 높은 항-CXCR4 항체의 역가를 나타내었던 Balb/c 마우스로부터 분리된 마우스 비장세포가 PEG를 사용하여 마우스 마이엘로마 세포주 Sp2/O에 융합되었다. 세포는 마이크로타이터 플레이트에 대략 1 x 10⁵/웰 농도로 도말되었고, 이어서 두 주 동안 울트라 배양 배지 + 2 mM L-글루타민 + 1 mM 소듐 피루베이트 + 1 x HAT을 포함하는 선별 배지로 배양되었다. 그 다음, 웰은 항-CXCR4 모노클론 IgG 항체에 대해 엘라이자에 의해 검색되었다. 그 다음 하이브리도마를 분비하는 항체가 희석을 제한하여 적어도 두 번 서브클론 되었고 심화된 분석법을 위한 항체를 생성하기 위하여 시험관내 배양되었다.

실시예 3: FACS 분석법에 의한 항- CXCR4 Mabs 414 H5 및 515 H7 결합 특이성 및 암 세포주 인식의 특성 분석

본 실험에서는, 항-CXCR4 Mabs 414H5 및 515H7의 인간 CXCR4에 대한 특이적 결합이 FACS 분석법에 의해 조사되었다.

NIH-3T3, NIH3T3-hCXCR4 형질전환된 세포, MDA-MB-231, HeLa 및 U937 암 세포주가 10 μg/mL의 단일클론 항체 414H5 및 515H7와 함께 배양되었다. 그 다음 세포는 1% BSA/PBS/0.01% NaN₃로 세척되었다. 이후, 알렉사-표지된 이차 항체가 세포에 첨가되었고 4℃에서 20분 동안 배양되도록 하였다. 그 다음 세포는 다시 두 번 세척되었다. 두 번째 세척에 이어서, FACS 분석법이 수행되었다. 이들 결합 연구의 결과는 하기 표 4에 제공되고, 이는 항-CXCR4 Mabs 414H5 및 515H7가 인간 CXCR4-NIH3T3 형질전환된 세포주에 특이적으로 결합하는 반면 부모 NIH3T3 세포 상에서는 전혀 인식이 없는 점을 [FACS에 의해 획득된 평균 형광 강도 (MFI)]로 보여준다. 또한 이들 Mabs는 인간 암 세포주, 예를 들어 MDA-MB-231 유방암 세포, U937 전골수암 세포 및 HeLa 자궁경부암 세포를 인식할 수 있었다.

항-CXCR4 Mabs 414H5 및 515H7는 NIH3T3-hCXCR4 형질전환된 세포를 인식하였던 반면 부모 NIH3T3 야생형 세포의 인식은 전혀 없었다. Mabs 414H5 및 515H7도 역시 암 세포주를 인식할 수 있었다.

표 4

실시예 4: 인간 CXCR4 수용체를 안정적으로 발현하는 CHO - K1 세포막에서 [ ¹²⁵ I] SDF -1에 대한 항- CXCR4 Mabs 414 H5 및 515 H7 의 결합 경쟁

본 분석법은 414H5 및 515H7 Mabs가 인간 CXCR4 수용체에 대한 방사선 표지된 [¹²⁵I]SDF-1 결합과 경쟁하는 능력을 오소스테릭 (orthosteric) 또는 알로스테릭 (allosteric) 결합 부위에서 평가하도록 한다.

인간 CXCR4 수용체를 안정적으로 및 전신적으로 발현하는 CHO-K1 세포는 인간 CXCR4 수용체의 전체 코딩 서열 (RefSeq NM_003467)을 보유하는 포유동물 발현 벡터를 사용한 그대로의 (naive) CHO-K1 세포 (ATCC CCL-61)의 형질전환으로 획득되었다. 세포는 완전 배양 배지 [5% 우태아 혈청 (FCS) 및 500 μg/ml의 제네티신이 보충된 DMEM-햄 F12]에서 증식되었다. 방사성 리간드 결합 (radioligand binding) 실험이 용출 완충용액 [20 mM의 헤페스 (HEPES), pH 7.4, 150 mM의 NaCl]에서 CHO-CXCR4 세포의 기계적 긁어내기 (mechanical scrapping)로 획득된 세포막 상에서 수행되었고 이어서 원심분리되었다 (10000 g, 15분). [¹²⁵I]SDF-1 결합 (특이적 활성: 1500 Ci/mmol)은 SPA 기술을 사용하여 수행되었다 [신틸레이션 근접 분석법 (scintillation proximity assay) - GE 헬스케어사]. 간략하게, 세포막 (30 μg/웰)은 결합 완충용액 [20 mM의 헤페스, pH 7.4, 1 mM의 CaCl₂, 5 mM의 MgCl₂, 150 mM의 NaCl, 1% BSA]에서 평가될 화합물 (SDF-1 또는 mAb), 방사성 리간드 (1 nM) 및 최종적으로 SPA-WGA-PVT 비드 (7.3 mg/웰)와 함께 배양되었다. 결합 평형 (binding equilibrium)에는 25℃에서 1시간 이후에 도달하였다. 원심분리한 [1000 g에서 10분 동안] 직후에 방사성 측정값은 신틸레이션 측정기 [scintillation counter, 탑카운트 (TopCount), 퍼킨 엘머사]로 측정되었다. 비-특이적 결합은 10 μM의 표지되지 않은 SDF-1의 존재 시 조사되었다.

표지되지 않은 SDF-1은 7.75 ± 0.27 nM (n = 4)의 pKi 값 (IC₅₀ = 특이적 [¹²⁵I]SDF-1 결합의 50% 저해를 가져오는 리간드 농도)으로 [¹²⁵I]SDF-1 결합을 용량-의존적으로 저해하였다 (도 3A). 동일한 실험적 조건 하에서, 우리의 항-CXCR4 Mabs (100 nM)는 하기 랭킹 순서의 경쟁 효능 ([¹²⁵I]SDF-1의 % 저해)을 가지고 [¹²⁵I]SDF-1 결합에 대해 효율적으로 경쟁하였다: 515H7 (64 ± 3%) 414H5 (43 ± 4%) (도 3B).

실시예 5: 야생형 CXCR4 수용체를 발현하는 세포막에서 항- CXCR4 Mabs 414 H5 및 515 H7 에 의한 [ ³⁵ S] GTP γS 결합 조정

본 기능적 분석법은 CXCR4 리간드 또한 414H5 및 515H7 Mabs에 의한 야생형 인간 CXCR4 수용체를 통한 G 단백질 활성화 및 그의 조정을 감시하도록 한다.

야생형 CXCR4 수용체를 안정적으로 및 전신적으로 발현하는 NIH-3T3 세포는 상기 CHO-K1 세포에 대한 상기 실시예에 기술된 바와 같이 획득되었다. HeLa (인간 자궁경부 암종) 세포는 완전 배양 배지 [10% FCS, 1% L-글루타민, 2μM 소듐 바이카보네이트가 보충된 EMEM]에서 증식되었다. [³⁵S]GTPγS 결합이 용출 완충용액 [20 mM의 헤페스, pH 7.4, 150 mM의 NaCl]에서 기계적 긁어내기로 획득된 세포막 상에서 수행되었고 이어서 원심분리되었다 (10000 g, 15분). [³⁵S]GTPγS (특이적 활성: 1000 Ci/mmol)의 도입 및 검출은 SPA 기술 (신틸레이션 근접 분석법 - GE 헬스케어사)을 사용하여 수행되었다. 간략하게, 세포막 (10 μg/웰)은 결합 완충용액 [20 mM의 헤페스, 3 μM의 GDP, 10 mM의 MgCl₂, 100 mM의 NaCl, 100 mM의 EDTA, pH = 7.4]에서 평가될 화합물 (흥미로운 SDF-1 또는 Mab), [³⁵S]GTPγS (0.2 - 0.4 nM) 및 최종적으로 SPA-WGA-PVT 비드 (7.3 mg/웰)와 함께 배양되었다. 결합 반응은 25℃에서 1 시간 동안 수행되었다. 원심분리한 [1000 g에서 10분 동안] 직후에 방사성 측정값은 신틸레이션 측정기 (탑카운트, 퍼킨 엘머사)로 측정되었다. 길항제 효능 (antagonist potency)은 쳉 프루소프 방정식 (Cheng Prussof equation)을 적용하여 계산되었다:

K = [길항제 농도] / {(EC_50'/EC₅₀)-1}

여기에서 EC₅₀ 및 EC_50'는 각각 mAb 부재 및 존재 시의 SDF-1 효능이다.

SDF-1은 CXCR4 수용체에 의한 G 단백질 활성화의 결과로서, [³⁵S]GTPγS 결합의 용량-의존적 증가를 유도하였다. [³⁵S]GTPγS 결합의 자극 최대점은 각각 HeLa 및 NIH3T3/CXCR4 세포막에 대한 기저 [³⁵S]GTPγS 결합에 대비하여 167% 및 320%를 나타낸다. SDF-1의 효능은 세포주 둘 다에서 유사하였고 41.3 ± 9.7 nM에 해당하였다 (도 4A 내지 도 4B). 이들 실험 조건 하에서, 414H5 및 515H7 Mabs의 길항제 효능은 NIH3T3/CXCR4 세포에서 결정된 바, 각각 51 nM 및 15 nM이었다. 유사한 길항제 효능이 HeLa 세포에 대해서도 관찰되었다 (도 5).

실시예 6: 서로 다른 상호작용 파트너와 CXCR4 의 연관성: 호모 및 헤테로이 중화, 생물발광 공명 에너지 전이 ( BRET ) 접근법를 통한 β- 아레스틴의 채용 및 이들 이중머 상에 미치는 414 H5 및 515 H7 Mabs 의 효과

본 기능적 분석법은 CXCR4 수용체에 결합하는 SDF-1 및/또는 414H5 및 515H7 Mabs 상에 유도되는 형태적 변화를 CXCR4 호모-이중머 및 CXCR2/CXCR4 헤테로-이중머 형성뿐만 아니라 β-아레스틴-2 신호전달 단백질의 채용의 수준에서 평가하도록 한다.

조사된 상호작용 파트너 각각의 발현 벡터는 통상적인 분자생물학 기법을 적용하여 해당되는 염색 (레닐라 레니포르미스 루시페라제, Rluc 및 노란색 형광 단백질, YFP)을 가진 융합 단백질로서 제작되었다. BRET 실험을 수행하기 이틀 이전에, HEK293 세포가 해당되는 BRET 파트너를 코딩하는 발현 벡터로 일시적으로 형질전환되었다: CXCR4 호모 이중화를 연구하기 위해 [CXCR4/Rluc + CXCR4/YFP], CXCR4 및 CXCR2 헤테로 이중화를 연구하기 위해 [CXCR4/Rluc + CXCR4:YFP] 또한 β-아레스틴-2의 CXCR4-매개성 채용을 연구하기 위해 [CXCR4/Rluc + β-arr2:YFP]. 그 날 이후에, 세포는 완전 배양 배지 [10% FBS가 보충된 DMEM]를 사용하여 폴리-라이신 전코팅된 흰색 96 MW 플레이트에 분배시켰다. 먼저 세포는 플레이트에 세포 부착을 허용하기 위해 37℃에서 5% CO₂ 조건으로 배양되었다. 그 다음 세포는 200 μl DMEM/웰로 처리하여 하룻밤 동안 굶겼다. BRET 실험 직전에, DMEM은 제거되었고 세포는 PBS로 신속하게 세척되었다. 그 다음 세포는 항체의 존재 또는 부재 시 PBS로 37℃에서 10분 동안 배양되었으며, 이후 300 nM의 SDF-1이 있거나 없이 5μM의 실렌터라진 H (coelenterazine H)가 최종 부피 50 μl로 첨가되었다. 37℃에서 10분 더 배양한 이후에, 미스라스 LB 940 다중표지 리더기 (베르톨드사)를 사용하여 485 nm 및 530 nm에서 빛-방출의 측정이 시작되었다 (상온에서 1s/파장/웰이 15회 반복되었다).

BRET 비율은 이전에 기술된 바와 같이 계산되었다 (Angers et al ., 2000): [(방출₅ ₃₀ _nm)-(방출₄₈₅ _nm) X Cf] / (방출₄₈₅ _nm), 여기에서 동일한 실험 조건 하에서 Rluc 융합 단백질을 단독 발현하는 세포의 경우 Cf =(방출₅₃₀ _nm) / (방출₄₈₅ _nm). 이 방정식을 단순화하면 BRET 비율이 두 가지 BRET 파트너가 존재할 때 획득되는 530/485 nm 비율에 해당하고, 이는 분석법에 Rluc에 융합된 파트너만이 존재할 때 동일한 실험 조건 하에서 획득되는 530/485 nm 비율에 의해 교정되는 것을 보여준다. 해석 (readability)을 위해, 결과는 밀리BRET 유닛 (mBU)으로 표현된다; mBU은 1000을 곱한 BRET 비율에 해당한다.

SDF1 (300 nM)이 CXCR4 수용체에 융합된 연결자 (adaptor) 및 수용자 (acceptor) 단백질의 공간적 접근으로부터 생겨나는 BRET 신호를 약 20% 증가시켰고, 이는 CXCR4/CXCR4 호모-이중머의 형성 또는 기존 이중머의 형태적 변화를 나타내는 것 같다 (도 6A 및 6B). 흥미롭게도, SDF1 (300 nM)이 CXCR2 및 CXCR4에 융합된 연결자 및 수용자 단백질의 공간적 접근으로부터 생겨나는 BRET 신호를 약 24% 감소시켰고, 이는 마찬가지로 CXCR2/CXCR4 헤테로-이중머의 형성 또는 기존 이중머의 형태적 변화를 나타내는 것 같다 (도 6C 및 6D). 이러한 후자의 경우에, CXCR2/CXCR4의 SDF-1-활성화된 형태는 BRET 에너지 전이를 덜 선호하는 것으로 보인다. 모든 경우에서, 414H5 및 515H7 Mabs는 CXCR4 호모-이중머에 대한 SDF-1-유도성 형태적 변화 (각각 414H5의 경우 SDF-1-유도성 BRET 증가의 63% 저해 또한 515H7의 경우 SDF-1-유도성 BRET 증가의 69% 저해, 도 6A 및 6B)뿐만 아니라 CXCR2/CXCR4 헤테로-이중머 형성 (각각 414H5의 경우 SDF-1-유도성 BRET 감소의 50% 저해 또한 515H7의 경우 SDF-1-유도성 BRET 감소의 90% 저해, 도 6C 및 6D)을 조정할 수 있었다. 또한 414H5 및 515H7 Mabs는 그들 스스로 CXCR4/CXCR4 및 CXCR2/CXCR4 공간적 근접을 각각 조정할 수 있었고, 이는 CXCR4/CXCR4 호모 및 CXCR2/CXCR4 헤테로-이중머 형태에 미치는 414H5 및 515H7 Mabs의 영향을 나타내었다 (도 6A, 6B, 6C 및 66D).

SDF-1 (300 nm)에 의한 CXCR4 활성화는 BRET 신호가 233% 증가된 것에서 나타난 바와 같이, 세포내 신호전달 분자인 β-아레스틴의 강한 채용을 가져왔다 (도 6E 및 6F). 이러한 채용은 414H5 및 515H7 Mabs에 의해 부분적으로 저해되었고 (각각 414H5의 경우 약 20% 또한 515H7의 경우 95% 저해, 도 6E 및 6F), 신호전달에 미치는 414H5 및 515H7 Mabs의 효과를 보여주었다.

실시예 7: cAMP 생산의 CXCR4 - 매개성 저해

본 기능적 분석법은 저해성 Gi/o 단백질을 통해 아데닐레이트 사이클라제 (adenylate cyclases)의 수준에서 신호전달하는 CXCR4 수용체를 감시하기 위해 고안되었다.

cAMP 랜스 (cAMP LANCE) 방법 (퍼킨 엘머사)이 공급사에 의해 상세히 기술된 바와 같이 적용되었다. 야생형 CXCR4 수용체를 안정적으로 및 전신적으로 발현하는 NIH-3T3 세포는 상기에서 기술된 바와 같이 획득되어 증식되었다. 세포는 트립신-제거 제제인 베르센 (Versene)을 사용하여 수집되었고 알렉사형광 (AlexaFluor)-결합 항cAMP Mab (1/100 희석) 및 화합물 (포스콜린, SDF-1 및/또는 414H5 및 515H7 Mabs)을 포함하는 용액에 10⁶ 세포/ml의 농도로 재현탁되었다. 상온에서 30분 동안 배양하고 나서, 유로피움-스트렙트아비딘 (1/125배 희석) 및 바이오틴-cAMP (1/125배 희석) 복합체가 포함된 검출 믹스가 첨가되었다. 상온에서 1시간 동안 배양한 다음, 이로부터 나온 FRET 신호가 미스라스 LB940 (베르톨드사) 다중표지 리더기로 측정되었다. 결과는 임의적 형광 측정값으로서 또는 FK 효과를 차감한 SDF-1 반응에 대한 상대적 자극으로서 표현된다.

포스콜린 (FK)는 NIH3T3/CXCR4 세포에서 약 0.3 μM의 효능을 가지고 cAMP 생산을 용량-의존적으로 자극시켰다 (도 7A). SDF-1이 함께 존재 시, 세포내 cAMP 수준은 CXCR4 수용체에 의한 저해성 Gi/o 단백질 활성화의 결과로서 감소하였다. SDF-1의 효능은 5.0 ± 3.1 nM이었다 (도 7A). 414H5 및 515H7 Mabs는 SDF-1의 포스콜린-자극성 효과를 414H5의 경우 60% 이상 또한 515H7의 경우 80% 이상 효율적으로 저해하였다 (도 7B).

실시예 8: 야생형 CXCR4 수용체를 발현하는 세포막에서 항- CXCR4 Mabs 414 H5 및 515 H7 에 의한 [ ¹²⁵ I] SDF -1 결합 조정

본 기능적 분석법은 전신적으로 활성이 있는 돌연변이 (CAM) Asn¹¹⁹Ser CXCR4 수용체을 통한 G 단백질 활성화를 감시하도록 한다 (Zhang et al ., 2002 참조). 본 민감한 분석법은 CXCR4 리간드를 그들 고유의 활성에 근거하여 구별되도록 한다 (부분적 작동제, 침묵의 길항제 또는 역 작동제). 이전에 장 (Zhang)과 그의 동료에 의해 기술된 바와 같이, AMD3100 또는 T140과 같은 CXCR4 리간드는 CAM CXCR4 수용체에서 부분적 작동제 및 역 작동제로서 각각 행동한다. 침묵의 길항제는 이 분자의 부류가 CXCR4의 활성 부위 및 불활성 부위 둘 다에 유사한 친화성을 나타내야 하기 때문에 확인하는 것이 어려울 수 있다 (Wurch et al ., 1999).

CXCR4 수용체의 코딩 서열에 Asn¹¹⁹Ser 돌연변이를 도입하는 것은 통상적인 분자생물학 기법 (QuickChange 부위 지향된 돌연변이화 키트, 미국 스트라타젠사)을 적용하여 수행되었다. CAM CXCR4 수용체를 안정적으로 및 전신적으로 발현하는 CHO-K1 세포가 상기 실시예에 기술된 바와 같이 획득되었다. [³⁵S]GTPγS 결합이 용출 완충용액 [20 mM의 헤페스, pH 7.4, 150 mM의 NaCl]에서의 기계적 긁어내기에 의해 획득된 세포막 상에서 수행되었고 이어서 원심분리되었다 (10000 g, 15분). [³⁵S]GTPγS (특이적 활성: 1000 Ci/mmol)의 도입은 SPA 기술 (신틸레이션 근접 분석법 - GE 헬스케어사)을 사용하여 수행되었다 . 간략하게, 세포막 (10 μg/웰)은 결합 완충용액 [20 mM의 헤페스, 3 μM의 GDP, 10 mM의 MgCl₂, 10 mM의 NaCl, 100 mM의 EDTA, pH = 7.4]에서 평가될 화합물 (SDF-1 또는 Mab), [³⁵S]GTPγS (0.2 - 0.4 nM) 및 최종적으로 SPA-WGA-PVT 비드 (7.3 mg/웰)와 함께 배양되었다. 결합 반응은 25℃에서 1 시간 동안 수행되었다. 원심분리 시 [1000 g에서 10분 동안] 방사성 측정값은 신틸레이션 측정기 (탑카운트, 퍼킨 엘머사)로 측정되었다.

SDF-1 (100 nM)은 [³⁵S]GTPγS 결합을 130% 자극시켰다. 역 작동제 T140은 기저 (-17%) 및 SDF-1 자극된 (-159%) [³⁵S]GTPγS 결합을 둘 다 저해하였다. 대조적으로, 414H5 및 515H7 Mabs는 기저 [³⁵S]GTPγS 결합 (도 8)을 변화시키지 않지만 SDF-1 유도성 [³⁵S]GTPγS 결합 (도 8)을 저해하면서 CAM CXCR4에서 침묵의 길항제로서 행동하였다.

실시예 9: CXCR4 Mab 414 H5 에 의한 SDF -1-유도성 HeLa 세포 증식의 시험관내 저해

ATCC로부터 입수된 HeLa 세포는 EMEM 배지 [벨기에, 베르비어, 론자사 (Lonza Corporation)], 10% FCS (미국 세인트루이스 시그마사), L-글루타민 (영국 스코틀랜드, 인트로겐사), 2% 소듐 바이카보네이트 7.5% 용액 (영국 스코틀랜드, 인트로겐사)에서 일상적으로 배양되었다. 세포는 증식 분석 3일 이전에 분배되어 충만하게 배양되었다.

- SDF -1-유도성 HeLa 세포 증식

HeLa 세포는 200 μl의 무혈청 배지 (1% L-글루타민, 2% 소듐 바이카보네이트 7.5% 용액을 첨가한 EMEM 배지)에서 1 x 10⁴ 세포/웰의 밀도로 96-웰 조직 배양 플레이트 상에 도말되었다. 도말하고 24시간 이후에, SDF-1의 적절한 희석액이 HeLa 세포에 첨가되었다. 전부 76시간의 배양 이후, 세포는 0.25 μCi의 [³H] 티미딘 (스웨덴 웁살라, 에머샴 바이오사이언스사)으로 16시간 동안 표지되었다 (pulsed). DNA에 도입된 [³H] 티미딘의 강도는 액체 신틸레이션 측정법에 의해 정량되었다.

결과는 증식 지수 = [세포의 평균 cpm + SDF-1 / 세포의 평균 cpm - SDF-1]로서 표현되었다.

HeLa 세포는 SDF-1 (0 내지 1000 ng/ml)와 함께 배양되었다. SDF-1는 시험 관내 HeLa 세포 증식을 1.5 내지 2배 자극시켰다. 가장 높고 재생가능한 증식 지수를 획득하는 SDF-1의 농도는 200 ng/ml (25 nM)이었다.

- CXCR4 414 H5 에 의한 SDF -1-유도성 HeLa 세포 증식의 시험관내 저해

HeLa 세포는 200 μl의 무혈청 배지 (1% L-글루타민, 2% 소듐 바이카보네이트 7.5% 용액을 첨가한 EMEM 배지)에서 1 x 10⁴ 세포/웰의 밀도로 96-웰 조직 배양 플레이트 상에 도말되었다. 도말하고 24시간 이후에, 항-CXCR4 Mab 414H5의 적절한 희석, 희석하는 배지가 세 벌 (triplicate)의 HeLa 세포에 SDF-1 존재 시 또는 부재 시 200 ng/ml의 최종 농도 (25 nM)로 첨가되었다. 전부 76시간의 배양 이후, 세포는 0.25 μCi의 [³H] 티미딘 (스웨덴 웁살라, 에머샴 바이오사이언스사)으로 16시간 동안 표지되었다 (pulsed). DNA에 도입된 [³H] 티미딘의 강도는 액체 신틸레이션 측정법에 의해 정량되었다.

결과는 공식을 사용하여 계산된 영향을 받은 분획 (Fa)으로서 표현되었다:

Fa = [1 - (Mab + SDF-1와 배양된 세포의 평균 cpm / 희석 배지 + SDF-1과 배양된 세포의 평균 cpm)] x 100.

SDF-1-유도성 HeLa 세포 증식에 미치는 항-CXCR4 Mab 414H5의 시험관내 효과가 특성분석되었다. HeLa 세포는 SDF-1 (200 ng/ml)이 있거나 없이 414H5 Mab 또는 대조군 둘 중 하나와 배양되었다. SDF-1은 HeLa 세포의 시험관내 성장을 자극시켰다 (1.5 내지 2배). 414H5 Mab에 대한 용량-반응 곡선은 세포 도말 24시간 이후에 세포를 0으로부터 1500 nM 범위까지 Mab를 연속적으로 2배 희석 처리하여 획득되었다. 세포 증식이 도말 76시간 이후에 평가되었기 때문에, 각 테스트된 조건은 Mab 또는 대조군에 48시간 노출 시간에 해당한다. 결과는 상기 기술된 공식을 사용하여 영향을 받은 분획 (Fa)으로서 표현되었다. 이 결과 (도 9에 나타남)는 CXCR4 Mab 414H5가 SDF-1-유도성 HeLa 세포 증식을 시험관내에서 저해하였던 것을 보여주었다.

실시예 10: SDF -1-유도성 U937 세포 이동에 미치는 항- CXCR4 Mab 414 H5 및 515H7의 효과

항-CXCR4 모노클론 항체 414H5 및 515H7가 이동 과정에 미치는 저해 효과를 평가하기 위하여, 2% FCS가 보충된 RPMI 1640 배지에 100,000개의 U937 세포가 이동 체임버 (8-μm 기공 크기를 가진 24웰 플레이트)의 상부 체임버에 웰의 하부 부분에 SDF-1의 존재 시 또는 부재 시 상부 체임버에 Mab 414H5 및 515H7가 있거나 없는 상태에서 도말되었다. 이 테스트에서는, 마우스 IgG2a 및 IgG2b가 이소타입 대조군으로 도입되었다. 도말 2시간 이후에, 이동하는 세포가 측정되었다. 결과는 414H5의 경우 도 10A에, 515H7의 경우 도 10B에 표현하였고, 예상된 바와 같이 SDF-1이 U-937 세포 이동의 유의한 증가를 유도할 수 있었던 것을 보여주었다. 세포가 IgG2 이소타입 대조군과 배양되었을 때는 효과가 전혀 관찰되지 않았다. 대조적으로, 414H5 및 515H7 Mabs와 배양된 세포의 경우 SDF-1-유도성 U937 세포 이동에서 유의하고도 재생가능한 감소가 관찰되었다: 414H5 Mab로 50% 및 515H7 Mab로 80% 이상.

실시예 11: Nod / Scid 마우스에서 항- CXCR4 Mab 414 H5 에 의한 MDA - MB -231 이종이식 종양 성장의 저해

이들 실험의 목표는 Nod/Scid 마우스에서 MDA-MB-231 이종이식 종양 성장을 저해하는 항-CXCR4 Mab 414H5 및 515H7의 능력을 평가하는 것이었다.

ECACC로부터 입수된 MDA-MB-231 세포는 10% FCS (미국 세인트루이스, 시그마사)가 포함된 DMEM 배지 (영국 스코틀랜드, 인비트로겐사)에서 일상적으로 배양되었다. 세포는 이식 48시간 이전에 분배되어 성장의 기하급수적 단계에 있었다. 10백만 개의 MDA-MB-231 세포는 PBS에 넣어 7주령 된 Nod/Scid 마우스 (프랑스 찰스 리버사)에 이식되었다. 이식 5일 이후에, 종양은 측정 가능하였고 (34 mm³ < V³ < 40 mm³) 동물은 비교될만한 종양 크기를 가지는 6개의 마우스 그룹으로 나뉘었다. 마우스는 2 mg/마우스 로딩 용량의 Mab 414H5 및 515H7로 각각 복강내 (i.p.) 처리되었다. 그 다음, 마우스는 1 mg/용량/마우스의 Mab 414H5로 주당 두 번 또는 0.5 mg/용량/마우스의 Mab 515H7로 주당 세 번 주입되었다. 이 실험에서 PBS 그룹이 대조군 그룹으로서 도입되었다. 종양 부피는 주당 두 번 측정되었고, 공식: π/6 X 길이 X 너비 X 높이에 의해 계산되었다. 통계적 분석법이 만-휘트니 테스트 (Mann-Whitney test)를 사용하여 각 측정에서 수행되었다.

이들 실험에서, 처리하는 동안 치사는 전혀 관찰되지 않았다. PBS 그룹에 비해, 1 mg/용량의 Mab 414H5 또는 0.5 mg/용량의 515H7의 경우 D7 및 D39 (p ≤ 0.002) 간 종양 성장의 유의한 저해가 있었고, 처리 5주 이후에 평균 종양 부피는 Mab 414H5 및 515H7의 경우 각각 PBS 대비 82% 및 50% 감소되었다 (도 11A 및 11B).

실시예 12: U937 마우스 생존 모델에서 항- CXCR4 Mab 414 H5 의 활성

ATCC로부터 입수된 U937 세포는 10% FCS, 1% L-글루타민이 포함된 RPMI 1640 배지에서 배양되었다. 세포는 이식 이틀 전에 분배되어 성장의 기하급수적 단계에 있었다. 10백만 개의 U937 세포는 암컷 Nod/Scid 마우스에 복강내 주입되었다. 이식 이틀 후에, 마우스는 2 mg의 414H5 mAb/마우스의 로딩 용량으로 피하적으로 (s.c.) 처리되었고 그 다음 1 mg의 항체/마우스로 주당 두 번 처리되었다. 대조군 마우스는 이전 연구에서 보여주었던 바와 같이 PBS 주입을 받았고, PBS가 주입된 마우스와 마우스 IgG 이소타입 대조군이 투여된 마우스 간에 생존에서의 차이점은 전혀 관찰되지 않았다. 마우스 생존은 매일 감시되었다.

도 12에 묘사된 결과는 414H5 Mab로 처리된 마우스가 수명에서 약 343 T/C%의 극적이고도 유의한 증가를 나타낸 것을 보여주었다.

실시예 13: 세포내 칼슘 저장의 CXCR4 수용체- 매개성 가동화

본 기능적 분석법은 세포질 세망 (endoplasmic reticulum)으로부터 나온 세포내 저장으로부터 칼슘 방출을 유도하는 포스포리파제 C (phospholipase C) 경로의 자극을 통한 CXCR4 수용체 신호전달을 감시하기 위하여 고안되었다.

야생형 CXCR4 수용체를 안정적으로 및 전신적으로 발현하는 CHO-K1 세포는 상기 실시예에 기술된 바와 같이 획득되었다. MDA-MB-231 (인간 유방 샘암종) 및U937 (인간 림프종) 세포가 완전 배양 배지 [10% FCS가 보충된 DMEM] 및 [10% FCS, 2 mM의 헤페스, 1% 비-필수 아미노산 용액, 1% 소듐 피루베이트, 1% L-글루타민, 4.5 g/l 포도당이 보충된 RPMI 1640]에서 각각 증식되었다. 모든 유형의 세포가 적절한 배양 배지를 넣은 검은색 96MW 플레이트에 100,000 세포/웰의 밀도로 도말되었다. 세포는 실험을 실시하기 전에 하룻밤 동안 굶겼다. 로딩 완충용액 [1x HBSS, 20 mM의 헤페스, 20 mM의 프로베니시드 산 (probenicid acid)]에 녹인 형광 칼슘 염색약 (Fluo-4 세척 없음, 미국 인비트로겐사)과 함께 37℃에서 30분 동안 로딩되었고 이어서 25℃에서 30분 동안 이루어졌다. SDF-1에 의한 자극은 각 웰 내로 직접 주입되어 수행되었다. 길항기작 (antagonism) 실험을 위해, 10 μl의 Mab 용액이 SDF-1 처리 적어도 10분 이전에 로딩 완충용액 내로 직접 첨가되었다. 동적 형광 측정은 하기 세팅을 사용하는 다중-방식 형광 마이크로플레이트 리더기, 미스라스 LB940 (베르톨드사) 상에서 수행되었다: 485 nm에서 여기, 535 nm에서 방출, 10000 임의적 유닛의 여기 에너지. 각 웰에서의 형광은 SDF-1 주입 (기저 신호) 이전에 0.1초 동안 매초마다 또한 20초의 기간 동안 기록된다. 그 다음 20 μl의 SDF-1이 주입되고 데이타 기록은 2분의 기간 동안 이어진다. 각 실험 조건은 두 벌로 수행된다. 각 웰에 대한 측정값은 먼저 기저 형광 및 세포가 없는 대조군 웰에 의해 방출되는 형광을 차감하여 교정된다. 상대적인 데이타는 SDF-1 (100 nM)에 의해 획득되는 최대 자극의 퍼센트로서 표현된다.

SDF-1 (100 nM)은 재조합 CHO/CXCR4에서 세포내 칼슘의 신속하고도 강한 방출을 유도하였던 반면, 그대로의 CHO-K1 세포에서는 형광 신호가 전혀 검출되지 않았다. 최대 강도는 기저 형광에 대해 > 160%에 도달하였고 SDF-1에 의해 자극하고 나서 약 30초에 관찰되었다; SDF-1 (100 nM)에 의한 최대 형광 강도가 더 낮긴 하지만 (기저값에 대해 130 - 140%), 유사한 운동 곡선이 MDA-MB-231 및 U-937 둘 다에서 관찰되었다 (도 13A, 13B, 13C). 515H7 항체 (133 nM)는 세 가지 조사된 세포주 모두에서 SDF-1 (100 nM)-유도성 칼슘 신호의 강하고도 거의 완전한 저해를 가져왔다.

실시예 14: Nod / Scid 마우스에서 항- CXCR4 Mab 414 H5 에 의한 T-세포 KARPA 299 이종이식 종양 성장의 저해

이 실험의 목표는 Nod/Scid 마우스에서 KARPAS 299 이종이식의 성장을 저해하는 항-CXCR4 Mab 414H5의 능력을 평가하는 것이었다.

ECACC로부터 입수된 KARPAS 299 세포는 1% L-Glu, 10% FCS (미국 세인트루이스, 시그마사)가 포함된 RPMI 배지에서 일상적으로 배양되었다. 세포는 이식 48시간 이전에 분배되어 성장의 기하급수적 단계에 있었다. 5백만 개의 KARPAS 299 세포는 PBS에 넣어 7주령 된 Nod/Scid 마우스 (프랑스 찰스 리버사)에 이식되었다. 이식 5일 이후에, 종양은 측정 가능하였고 (32 mm³ < V³ < 49 mm³) 동물은 비교될만한 종양 크기를 가지는 6개의 마우스 그룹으로 나뉘었다. 마우스는 2 mg/마우스 로딩 용량의 Mab 414H5로 복강내 (i.p.) 주입되었다.

그 다음, 마우스는 1 mg/용량/마우스의 Mab 414H5로 주당 두 번 주입되었다. 이 실험에서 PBS 그룹이 대조군 그룹으로서 도입되었다. 종양 부피는 주당 두 번 측정되었고, 공식: π/6 X 길이 X 너비 X 높이에 의해 계산되었다. 통계적 분석법이 만-휘트니 테스트를 사용하여 각 측정에서 수행되었다.

이 실험에서, 처리하는 동안 치사는 전혀 관찰되지 않았다. PBS 그룹에 비해, 1 mg/용량의 Mab 414H5의 경우 D7 및 D33 (p ≤ 0.002) 간의 종양 성장의 유의한 저해가 있었고, 처리 5주 이후에 평균 종양 부피는 Mab 414H5의 경우 PBS 대비 73% 감소되었다 (도 14).

실시예 15: U937 마우스 생존 모델에서 항- CXCR4 Mab 515 H7 의 활성

ATCC로부터 입수된 U937 세포는 10% FCS, 1% L-글루타민이 보충된 RPMI 1640 배지에서 배양되었다. 세포는 이식 이틀 전에 분배되어 성장의 기하급수적 단계에 있었다. 10백만 개의 U937 세포는 암컷 Nod/Scid 마우스에 복강내 주입되었다. 이식 이틀 후에, 마우스는 2 mg의 515H7 Mab/마우스의 로딩 용량으로 피하적으로 처리되었고 그 다음 1 mg의 항체/마우스로 주당 두 번 처리되었다. 대조군 마우스는 이전 연구에서 보여주었던 바와 같이 PBS 주입을 받았고, PBS가 주입된 마우스와 마우스 IgG 이소타입 대조군이 투여된 마우스 간 생존에서의 차이점은 전혀 관찰되지 않았다. 마우스 생존은 매일 감시되었다.

도 15에 묘사된 결과는 515H7 Mab로 처리된 마우스가 수명에서 약 280 T/C%의 극적이고도 유의한 증가를 나타낸 것을 보여주었다 (도 15).

실시예 16: Nod / Scid 마우스에서 항- CXCR4 Mab 515 H7 에 의한 T-세포 KARPA 299 이종이식 종양 성장의 저해

이 실험의 목표는 Nod/Scid 마우스에서 KARPAS 299 이종이식의 성장을 저해하는 항-CXCR4 Mab 515H7의 능력을 평가하는 것이었다.

ECACC로부터 입수된 KARPAS 299 세포는 1% L-Glu, 10% FCS (미국 세인트루이스, 시그마사)가 포함된 RPMI 배지에서 일상적으로 배양되었다. 세포는 이식 48시간 이전에 분배되어 성장의 기하급수적 단계에 있었다. 5백만 개의 KARPAS 299 세포는 PBS에 넣어 7주령 된 Nod/Scid 마우스 (프랑스 찰스 리버사)에 이식되었다. 이식 5일 이후에, 종양은 측정 가능하였고 (32 mm³ < V³ < 49 mm³) 동물은 비교될만한 종양 크기를 가지는 6개의 마우스 그룹으로 나뉘었다. 마우스는 2 mg/마우스 로딩 용량의 Mab 515H7으로 복강내 (i.p.) 주입되었다.

그 다음, 마우스는 1 mg/용량/마우스의 Mab 515H7으로 주당 두 번 주입되었다. 이 실험에서 PBS 그룹이 대조군 그룹으로서 도입되었다. 종양 부피는 주당 두 번 측정되었고, 공식: π/6 X 길이 X 너비 X 높이에 의해 계산되었다. 통계적 분석법이 만-휘트니 테스트를 사용하여 각 측정에서 수행되었다.

이들 실험에서, 처리하는 동안 치사는 전혀 관찰되지 않았다. PBS 그룹에 비해, 1 mg/용량의 Mab 515H7의 경우 D7 및 D33 (p ≤ 0.002) 간의 종양 성장의 유의한 저해가 있었고, 처리 5주 이후에 평균 종양 부피는 Mab 515H7의 경우 PBS 대비 63% 감소되었다 (도 16).

실시예 17: 항- CXCR4 키메라 Mabs c414H5 및 c515H7 의 생산

마우스 c414H5 및 c515H7 Mabs의 키메라 형식이 고안되었다: 그들은 흥미로운 마우스 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 도메인에 해당하고, 인간 C카파 (Ckappa) 및 IgG1 불변 도메인에 유전적으로 융합되었다. 모든 재조합 Mabs는 pCEP4 발현 벡터를 가진 HEK293/EBNA 시스템 (미국, 인비트로겐사)을 사용하는 일시적 형질전환 (transient transfection) 직후에 생산되었다.

414H5 및 515H7 Mabs 경쇄 및 중쇄의 가변 도메인에 해당하는 전체 뉴클레오타이드 서열이 글로벌 유전자 합성 (룩셈부르크, 진큐스트사)에 의해 합성되었다. 그들은 인간 IgG1 면역글로불린의 경쇄 [C카파] 또는 중쇄 [CH1-힌지-CH2-CH3]의 불변 도메인의 전체 코딩 서열을 보유하는 pCEP4 벡터 (미국, 인비트로겐사) 내로 서브클론 되었다. 모든 클로닝 단계는 실험실 매뉴얼 (Sambrook and Russel, 2001)에 기술된 바와 같은 통상적인 분자생물학 기법에 따라 또는 공급자의 지침에 따라 수행되었다. 각 유전적 작제 (construct)는 빅 염색 종결자 사이클 (Big Dye terminator cycle) 시퀀싱 키트 (미국, 어플라이드 바이오시스템사)를 사용하는 뉴클레오타이드 서열결정에 의해 완전히 확인되었고 3100 유전적 분석기 (3100 Genetic Analyzer)(미국, 어플라이드 바이오시스템사)를 사용하여 분석되었다.

현탁배양-적응된 HEK293 EBNA 세포 (미국, 인비트로겐사)는 50 mL의 6 mM 글루타민이 보충된 무혈청 배지 Excell 293 (SAFC 바이오사이언스사)가 들어있는 250 ml 플라스크로 궤도 진탕기 (orbital shaker) 상에서 (100 rpm의 회전 속도) 성장시켰다. 일시적 형질전환은 직쇄상 1 mg/ml의 최종 농도로 물에 녹인 25 kDa 폴리에틸렌이민 (PEI)(폴리사이언스사) 및 플라스미드 DNA (1 : 1의 중쇄 및 경쇄 플라스미드 비율에 대하 1.25 μg/ml의 최종 농도)를 사용하여 2.106 세포/ml 농도로 수행되었다. 형질전환 4시간 이후에, 배양액은 106 세포/ml의 최종 농도로 맞추기 위하여 동일한 부피의 새로운 배양 배지로 희석되었다. 배양 과정은 세포 생존도 및 Mab 생산을 근거로 하여 감시되었다. 일반적으로, 세포 배양은 4 내지 5일 동안 유지되었다. Mab는 통상적인 크로마토그래피 접근법을 사용하여 단백질 A 레진 (미국, GE 헬스헤어사) 상에서 정제되었다. 모든 서로 다른 Mabs가 기능적 평가에 적합한 수준으로 생산되었다. 생산성 수준은 일반적으로 정제된 Mabs의 6 및 15 mg/l 사이 범위이다.

실시예 18: FACS 분석법에 의한 항- CXCR4 키메라 Mabs c414H5 및 c515H7 결합 특이성 및 암 세포주 인식의 특성 분석

본 실험에서는, 항-CXCR4 키메라 Mabs c414H5 및 c515H7의 인간 CXCR4에 대한 특이적 결합이 FACS 분석법에 의해 조사되었다.

NIH-3T3, NIH3T3-hCXCR4 형질전환된 세포, MDA-MB-231 암 세포주가 10 μg/mL의 단일클론 항체 c414H5 및 c515H7와 함께 배양되었다. 그 다음 세포는 1% BSA/PBS/0.01% NaN₃로 세척되었다. 이후, 알렉사-표지된 이차 항체가 세포에 첨가되었고 4℃에서 20분 동안 배양되도록 하였다. 그 다음 세포는 다시 두 번 세척되었다. 두 번째 세척에 이어서, FACS 분석법이 수행되었다. 이들 결합 연구의 결과는 하기 표 5에 제공되고, 이는 항-CXCR4 키메라 Mabs c414H5 및 c515H7가 인간 CXCR4-NIH3T3 형질전환된 세포주에 특이적으로 결합하고 또한 인간 암 세포주, 예를 들어 MDA-MB-231 유방암 세포를 인식하는 점을 [FACS에 의해 획득된 평균 형광 강도 (MFI)]로 보여준다.

표 5

실시예 19: 인간 CXCR4 수용체를 안정적으로 발현하는 CHO - K1 세포막에서 [ ¹²⁵ I]SDF-1에 대한 항- CXCR4 마우스 Mabs m414H5 및 m515H7 또한 키메라 Mabs c414H5 및 c515H7 의 결합 경쟁

본 분석법은 마우스 Mabs m414H5 및 m515H7 및 키메라 Mabs c414H5 및 c55H7가 인간 CXCR4 수용체에 대한 방사선 표지된 [¹²⁵I]SDF-1의 결합과 경쟁하는 능력을 오소스테릭 또는 알로스테릭 결합 부위에서 평가하도록 한다.

인간 CXCR4 수용체를 안정적으로 및 전신적으로 발현하는 CHO-K1 세포는 인간 CXCR4 수용체의 전체 코딩 서열 (RefSeq NM_003467)을 보유하는 포유동물 발현 벡터를 사용한 그대로의 CHO-K1 세포 (ATCC CCL-61)의 형질전환 직후에 획득되었다. 세포는 완전 배양 배지 [5% 우태아 혈청 (FCS) 및 500 μg/ml의 제네티신이 보충된 DMEM-햄 F12]에서 증식되었다. 방사성 리간드 결합 실험이 용출 완충용액 [20 mM의 헤페스 (HEPES), pH 7.4, 150 mM의 NaCl]에서 CHO-CXCR4 세포의 기계적 긁어내기 직후에 획득된 세포막 상에서 수행되었고 이어서 원심분리되었다 (10000 g, 15분). [¹²⁵I]SDF-1 결합 (특이적 활성: 1500 Ci/mmol)은 SPA 기술을 사용하여 수행되었다 [신틸레이션 근접 분석법 - GE 헬스케어사]. 간략하게, 세포막 (30 μg/웰)은 결합 완충용액 [20 mM의 헤페스, pH 7.4, 1 mM의 CaCl₂, 5 mM의 MgCl₂, 150 mM의 NaCl, 1% BSA]에서 평가될 화합물 (SDF-1 또는 mAb), 방사성 리간드 (1 nM) 및 최종적으로 SPA-WGA-PVT 비드 (7.3 mg/웰)과 함께 배양되었다. 결합 평형에 25℃에서 1시간 이후에 도달하였다. 원심분리한 [1000 g에서 10분 동안] 직후에 방사성 측정값은 신틸레이션 측정기 [scintillation counter, 탑카운트 (TopCount), 퍼킨 엘머사]로 측정되었다. 비-특이적 결합 (NS)은 10 μM의 표지되지 않은 SDF-1의 존재 시 조사되었다.

항-CXCR4 Mabs (100 nM)는 하기 랭킹 순서의 경쟁 효능 ([¹²⁵I]SDF-1의 % 저해)을 가지고 [¹²⁵I]SDF-1 결합에 대해 효율적으로 경쟁하였다: m515H7 (62 ± 10%), c515H7 (55 ± 4%), m414H5 (30 ± 5%) 및 c414H5 (21 ± 10%)(도 17).

실시예 20: 야생형 CXCR4 수용체를 발현하는 세포막에서 항- CXCR4 마우스 Mabs m414H5 및 m515H7 또한 키메라 Mabs c414H5 및 c515H7 에 의한 [ ³⁵ S] GTP γS 결합의 조정

본 기능적 분석법은 항-CXCR4 마우스 Mabs m414H5 및 m515H7 또한 키메라 Mabs c414H5 및 c515H7에 의한 야생형 인간 CXCR4 수용체를 통한 G 단백질 활성화 및 그의 조정을 감시하도록 한다.

야생형 CXCR4 수용체를 안정적으로 및 전신적으로 발현하는 NIH-3T3 세포는 상기 CHO-K1 세포에 대하여 실시예에 기술된 바와 같이 획득되었다. HeLa (인간 자궁경부 암종) 세포는 완전 배양 배지 [10% FCS, 1% L-글루타민, 2μM 소듐 바이카보네이트가 보충된 EMEM]에서 증식되었다. [³⁵S]GTPγS 결합이 용출 완충용액 [20 mM의 헤페스, pH 7.4, 150 mM의 NaCl]에서 기계적 긁어내기 직후에 획득된 세포막 상에서 수행되었고 이어서 원심분리되었다 (10000 g, 15분). [³⁵S]GTPγS (특이적 활성: 1000 Ci/mmol)의 도입 및 검출은 SPA 기술 (신틸레이션 근접 분석법 - GE 헬스케어사)을 사용하여 수행되었다. 간략하게, 세포막 (10 μg/웰)은 결합 완충용액 [20 mM의 헤페스, 3 μM의 GDP, 10 mM의 MgCl₂, 100 mM의 NaCl, 100 mM의 EDTA, pH = 7.4]에서 평가될 화합물 (흥미로운 SDF-1 또는 Mab), [³⁵S]GTPγS (0.2 - 0.4 nM) 및 최종적으로 SPA-WGA-PVT 비드 (7.3 mg/웰)와 함께 배양되었다. 결합 반응은 25℃에서 1시간 동안 수행되었다. 원심분리한 [1000 g에서 10분 동안] 직후에 방사성 측정값은 신틸레이션 측정기 (탑카운트, 퍼킨 엘머사)로 측정되었다. IC₅₀ 값이 각 Mab에 대해 계산되었다.

이들 실험 조건 하에서, m414H5, c414H5, m515H7, c515H7 Mabs의 IC₅₀ 값은 NIH3T3/CXCR4 세포에서 결정된 바, 각각 1.6 nM, 1.1 nM, 1.9 nM 및 1.5 nM이었다 (도 18). 동일한 실험 조건에서 HeLa 세포를 사용하여 결정된 m414H5, c414H5, m515H7, c515H7 Mab의 IC₅₀ 값은 각각 0.5 nM, 0.3 nM, 0.2 nM 및 0.6 nM이었다 (도 19).

실시예 21 : 서로 다른 상호작용 파트너와 CXCR4 의 연관성: 호모 및 헤테로 이중화, 생물발광 공명 에너지 전이 ( BRET ) 접근법을 통한 β- 아레스틴의 채용 및 이들 이중머 상에 미치는 마우스 Mabs m414H5, m515H7, 키메라 Mabs c414H5 및 c515H7의 효과

본 기능적 분석법은 CXCR4 수용체에 결합하는 SDF-1 및/또는 m414H5, m515H7 마우스 Mabs, c414H5, 및 c515H7 키메라 Mabs 상에 유도되는 형태적 변화를 CXCR4 호모-이중머 및 CXCR2/CXCR4 헤테로-이중머 형성뿐만 아니라 β-아레스틴-2 신호전달 단백질의 채용의 수준에서 평가하도록 한다.

조사된 상호작용 파트너 각각의 발현 벡터는 통상적인 분자생물학 기법을 적용하여 해당되는 염색 (레닐라 레니포르미스 루시페라제, Rluc 및 노란색 형광 단백질, YFP)을 가진 융합 단백질로서 제작되었다. BRET 실험을 수행하기 이틀 전에, HEK293 세포가 해당되는 BRET 파트너를 코딩하는 발현 벡터로 일시적으로 형질전환 되었다: CXCR4 호모 이중화를 연구하기 위해 [CXCR4/Rluc + CXCR4/YFP], CXCR4 및 CXCR2 헤테로 이중화를 연구하기 위해 [CXCR4/Rluc + CXCR4:YFP] 또한 β-아레스틴-2의 CXCR4-매개성 채용을 연구하기 위해 [CXCR4/Rluc + β-arr2:YFP]. 그 날 이후에, 세포는 완전 배양 배지 [10% FBS가 보충된 DMEM]를 사용하여 폴리-라이신 전코팅된 흰색 96 MW 플레이트에 배분시켰다. 먼저 세포는 플레이트에 세포 부착을 가능하게 하기 위해 37℃에서 5% CO₂ 조건으로 배양되었다. 그 다음 세포는 200 μl DMEM/웰로 처리하여 하룻 밤 동안 굶겼다. BRET 실험 직전에, DMEM은 제거되었고 세포는 PBS로 신속하게 세척되었다. 그 다음 세포는 항체의 존재 또는 부재 시 PBS로 37℃에서 10분 동안 배양되었으며, 이후 300 nM의 SDF-1이 있거나 없이 5μM의 실렌터라진 H가 최종 부피 50 μl로 첨가되었다. 37℃에서 10분 더 배양한 이후에, 미스라스 LB 940 다중표지 리더기 (베르톨드사)를 사용하여 485 nm 및 530 nm에서 빛-방출의 측정이 시작되었다 (상온에서 1s/파장/웰로 15회 반복수행되었다).

SDF1 (100 nM)이 CXCR4 수용체에 융합된 연결자 및 수용자 단백질의 공간적 접근으로부터 생겨나는 BRET 신호를 약 10% 증가시켰고, 이는 CXCR4/CXCR4 호모-이중머의 형성 또는 기존 이중머의 형태적 변화를 나타내는 것 같다 (도 20A). 흥미롭게도, SDF1 (100 nM)이 CXCR2 및 CXCR4에 융합된 연결자 및 수용자 단백질의 공간적 접근으로부터 생겨나는 BRET 신호를 약 17% 감소시켰고, 이는 마찬가지로 CXCR2/CXCR4 헤테로-이중머의 형성 또는 기존 이중머의 형태적 변화를 나타낸다 (도 20B). 이러한 후자의 경우에, CXCR2/CXCR4의 SDF-1-활성화된 형태는 BRET 에너지 전이를 덜 선호하는 것으로 보인다. 둘 다의 경우에서, m414H5, c414H5 및 m515H7, c515H7 Mabs는 CXCR4 호모-이중머에 대한 SDF-1-유도성 형태적 변화 (c414H5의 경우 SDF-1-유도성 BRET 증가의 75% 저해 또한 c515H7의 경우 SDF-1-유도성 BRET 증가의 96% 저해, 도 20A)뿐만 아니라 CXCR2/CXCR4 헤테로-이중머 형성 (c414H5의 경우 SDF-1-유도성 BRET 감소의 77% 저해 또한 c515H7의 경우 SDF-1-유도성 BRET 감소의 98% 저해, 도 20B)을 조정할 수 있었다. 또한 m414H5, c414h5, m515H7 및 c515H7 Mabs는 그들 스스로 CXCR4/CXCR4 및 CXCR2/CXCR4 공간적 근접을 각각 조정할 수 있었고, 이는 CXCR4/CXCR4 호모 및 CXCR2/CXCR4 헤테로-이중머 형태에 미치는 이들 Mabs의 영향을 나타내었다 (도 20A 및 20B).

SDF-1 (300 nm)에 의한 CXCR4 활성화는 BRET 신호가 400% 증가된 것에서 나타난 바와 같이, 세포내 신호전달 분자인 β-아레스틴의 강한 채용을 가져왔다 (도 20C). 이러한 채용은 c414H5에 의해 또한 c515H7 Mabs에 의해 부분적으로 저해되었고 (c414H5의 경우 약 60% 또한 c515H7의 경우 93% 저해, 도 20C), 신호전달에 미치는 이들 Mabs의 효과를 보여주었다.

실시예 22: 세포내 칼슘 저장의 CXCR4 수용체- 매개성 가동화

본 기능적 분석법은 세포질 세망으로부터 나온 세포내 저장으로부터 칼슘 방출을 유도하는 포스포리파제 C 경로의 자극을 통한 CXCR4 수용체 신호전달을 감시하기 위하여 고안되었다.

야생형 CXCR4 수용체를 안정적으로 및 전신적으로 발현하는 CHO-K1 세포는 상기 실시예에 기술된 바와 같이 획득되었다. U937 (인간 림프종) 세포가 완전 배양 배지 [10% FCS가 보충된 DMEM] 및 [10% FCS, 2 mM의 헤페스, 1% 비-필수 아미노산 용액, 1% 소듐 피루베이트, 1% L-글루타민, 4.5 g/l 포도당이 보충된 RPMI 1640]에서 각각 증식되었다. 모든 유형의 세포가 적절한 배양 배지를 넣은 검은색 96MW 플레이트에 100,000 세포/웰의 밀도로 도말되었다. 세포는 실험을 실시하기 전에 하룻밤 동안 굶겼다. 로딩 완충용액 [1x HBSS, 20 mM의 헤페스, 20 mM의 프로베니시드 산]에 녹인 형광 칼슘 염색약 (Fluo-4 세척 없음, 미국 인비트로겐사)과 함께 37℃에서 30분 동안 로딩되었고 이어서 25℃에서 30분 동안 이루어졌다. SDF-1에 의한 자극은 각 웰 내로 직접 주입되어 수행되었다. 길항기작 실험을 위해, 10 μl의 Mab 용액이 SDF-1 처리 적어도 10분 전 로딩 완충용액 내로 직접 첨가되었다. 동적 형광 측정은 하기 세팅을 사용하는 다중-방식 형광 마이크로플레이트 리더기, 미스라스 LB940 (베르톨드사) 상에서 수행되었다: 485 nm에서 여기, 535 nm에서 방출, 10000 임의적 유닛의 여기 에너지. 각 웰에서의 형광은 SDF-1 주입 (기저 신호) 이전에 0.1초 동안 매초마다 또한 20초의 기간 동안 기록된다. 그 다음 20 μl의 SDF-1이 주입되고 데이타 기록은 2분의 기간 동안 이어진다. 각 실험 조건은 두 벌로 수행된다. 각 웰에 대한 측정값은 먼저 기저 형광 및 세포가 없는 대조군 웰에 의해 방출되는 형광을 차감하여 교정된다. 상대적인 데이타는 SDF-1 (100 nM)에 의해 획득되는 최대 자극의 퍼센트로서 표현된다.

SDF-1 (100 nM)은 재조합 CHO/CXCR4에서 세포내 칼슘의 신속하고도 강한 방출을 유도하였던 반면, 그대로의 CHO-K1 세포에서는 형광 신호가 전혀 검출되지 않았다. 최대 강도는 기저 형광에 대해 > 140%에 도달하였고 SDF-1에 의해 자극하고 나서 약 40초에 관찰되었다; 유사한 운동 곡선이 U-937 세포를 사용하여 관찰되었다 (도 21A 및 21B). 키메라 항체 c515H7 (133 nM)는 조사된 세포주 둘 다에서 SDF-1 (100 nM)-유도성 칼슘 신호의 강하고도 거의 완전한 저해를 가져왔다.

실시예 23: SDF -1-유도성 U937 세포 이동에 미치는 항- CXCR4 마우스 Mab m414H5, m515H7 및 키메라 Mabs c414H5 , c515H7 의 효과

항-CXCR4 항체 m414H5, m515H7, c414H5, 및 c515H7가 이동 과정에 미치는 저해 효과를 평가하기 위하여, 2% FCS가 보충된 RPMI 1640 배지에 넣은 100,000개의 U937 세포가 이동 체임버 (8-μm 기공 크기를 가진 24웰 플레이트)의 상부 체임버에 웰의 하부 부분에 SDF-1의 존재 시 또는 부재 시 상부 체임버에 Mab m414H5, m515H7, c414H5, 및 c515H7가 있거나 없는 상태에서 도말되었다. 이 테스트에서는, 마우스 IgG2a 및 IgG2b가 이소타입 대조군으로 도입되었다. 도말 2시간 이후에, 이동하는 세포가 측정되었다. 결과는 도 22A (c414H5 대비 m414H5의 경우) 및 도 22B (c515H7 대비 m515H7의 경우)에 표현하였고, 예상된 바와 같이 SDF-1이 U-937 세포 이동의 유의한 증가를 유도할 수 있었던 것을 보여주었다. 세포가 IgG2 이소타입 대조군과 배양되었을 때는 효과가 전혀 관찰되지 않았다. 대조적으로, c414H5, m414H5, c515H7 및 m515H7 Mabs와 배양된 세포의 경우 SDF-1-유도성 U937 세포 이동에서 유의하고도 재생가능한 감소가 관찰되었다: c414H5 및 m414H5 Mab로 약 50% 또한 c515H7 및 m515H7 Mab로 80% 이상.

실시예 24: U937 마우스 생존 모델에서 항- CXCR4 키메라 Mab c414H5 및 c515H7의 활성

ATCC로부터 입수된 U937 세포는 10% FCS, 1% L-글루타민이 보충된 RPMI 1640 배지에서 배양되었다. 세포는 이식 이틀 전에 분배되어 성장의 기하급수적 단계에 있었다. 10백만 개의 U937 세포는 암컷 Nod/Scid 마우스에 복강내 주입되었다. 이식 이틀 후에, 마우스는 2 mg의 c414H5 또는 c515H7 Mab/마우스의 로딩 용량으로 피하적으로 처리되었고 그 다음 1 mg의 항체/마우스로 주당 두 번 처리되었다. 대조군 마우스는 이전 연구에서 보여주었던 바와 같이 PBS 주입을 받았고, PBS가 주입된 마우스와 마우스 IgG 이소타입 대조군이 투여된 마우스 간에 생존에서의 차이점은 전혀 관찰되지 않았다. 마우스 생존은 매일 감시되었다.

도 23에 묘사된 결과는 c414H5 및 c515H7 Mabs로 처리된 마우스가 수명에서 c414H5 및 c515H7 각각의 경우 약 210 및 180 T/C%의 극적이고도 유의한 증가를 나타낸 것을 보여주었다.

1. 프랑스 미생물 배양의 수집기관 (CNCM, 프랑스 파리, 파스퇴르 연구소)에 2007년 10월 22일자 수탁번호 제 I-3860호로 기탁된 마우스 하이브리도마 414H5

2. 프랑스 미생물 배양의 수집기관 (CNCM, 프랑스 파리, 파스퇴르 연구소)에 2008년 6월 25일자 수탁번호 제 I-4019호로 기탁된 마우스 하이브리도마 515H7

COLLECTION NATIONALE DE CULTURES DE MICROORGANISMES

CNCMI-3860

20071022

COLLECTION NATIONALE DE CULTURES DE MICROORGANISMES

CNCMI-4019

20080625

SEQUENCE LISTING <110> PIERRE FABRE MEDICAMENT <120> Anti CXCR4 antibodies and their use for the treatment of cancer <130> D26935 <140> PCT/EP2009/062787 <141> 2009-10-01 <150> EP 08305631.7 <151> 2008-10-01 <150> US 61/136,772 <151> 2008-10-01 <150> US 61/173,743 <151> 2009-04-29 <160> 71 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> mus musculus <400> 1 Gln Ser Leu Tyr Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr 1 5 10 <210> 2 <211> 3 <212> PRT <213> mus musculus <400> 2 Trp Ala Ser 1 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> mus musculus <400> 3 Lys Gln Ser Tyr Asn Leu Arg Thr 1 5 <210> 4 <211> 4 <212> PRT <213> mus musculus <400> 4 Thr Asp Tyr Tyr 1 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> mus musculus <400> 5 Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr 1 5 10 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> mus musculus <400> 6 Asp Ile Pro Gly Phe Ala Tyr 1 5 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> mus musculus <400> 7 Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> mus musculus <400> 8 Ala Arg Asp Ile 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tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcaccagtg tgcaggctga ggacctggca gttttttact gcaagcaatc ttataatctt 300 cggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa 336 <210> 28 <211> 354 <212> DNA <213> mus musculus <400> 28 gaggtgaagc tggtggagtc tggaggaggc ttggtacagc ctgggggttc tctgagactc 60 tcctgtacaa cttctgggtt caccttcact gattactaca tgagctgggt ccgccagtct 120 ccaggaaagg cacttgagtg gttgactttt attagaaaca aagctaatgg ttacacaaca 180 gagtacagtg catctgtgaa gggtcggttc accatctcca gagataattc ccaaagcatc 240 ctctatcttc aaatgaacac cctgagagct gaggacagtg ccacttatta ctgtgcaaga 300 gatatcccgg ggtttgctta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc tgca 354 <210> 29 <211> 352 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 29 Met Glu Gly Ile Ser Ile Tyr Thr Ser Asp Asn Tyr Thr Glu Glu Met 1 5 10 15 Gly Ser Gly Asp Tyr Asp Ser Met Lys Glu Pro Cys Phe Arg Glu Glu 20 25 30 Asn Ala Asn Phe Asn Lys Ile Phe Leu Pro Thr Ile Tyr Ser Ile Ile 35 40 45 Phe Leu Thr Gly Ile Val Gly Asn Gly Leu Val Ile Leu Val Met Gly 50 55 60 Tyr Gln 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agacatattt cactctcacc 240 atcagccgtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gcatgcaatc ttttaatctt 300 cggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa 336 <210> 63 <211> 360 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 63 gaggtgaacc tggtggagtc tggaggaggc ttggtacagc ctgggggttc tctgagactc 60 tcctgtgcaa cttctgggtt caccttcact gataactaca tgagttgggt ccgccagcct 120 ccaggaaagg cacttgagtg gttgggcttt attagaaaca aagctaatgg ttacacaaca 180 gactacagtg catctgtgag gggtcggttc accatctcaa gagataattc ccaaagcatc 240 ctctatcttc aaatgaacgc cctgagagcc gaagacagtg ccacttatta ctgtgcaaga 300 gatgtcggtt ccaactactt tgactactgg ggccaaggca ccactctcac agtctcctca 360 <210> 64 <211> 239 <212> PRT <213> mus musculus <400> 64 Met Glu Ser Gln Ala Gln Val Leu Ile Leu Leu Leu Leu Trp Val Ser 1 5 10 15 Gly Thr Cys Gly Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala 20 25 30 Val Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Leu Tyr Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln 50 55 60 Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu 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25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Thr Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Thr Asp Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Ala Leu 50 55 60 Glu Trp Leu Thr Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu 65 70 75 80 Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 85 90 95 Gln Ser Ile Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Ser 100 105 110 Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ile Pro Gly Phe Ala Tyr Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 130 135 140 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 145 150 155 160 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 165 170 175 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 180 185 190 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 195 200 205 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 210 215 220 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys 225 230 235 240 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 245 250 255 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 260 265 270 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 275 280 285 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 290 295 300 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 305 310 315 320 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 325 330 335 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 340 345 350 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 355 360 365 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 370 375 380 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 385 390 395 400 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 405 410 415 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 420 425 430 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 435 440 445 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 450 455 460 Pro Gly Lys 465 <210> 66 <211> 239 <212> PRT <213> mus musculus <400> 66 Met Glu Ser Gln Thr Leu Val Phe Ile Ser Ile Leu Leu Trp Leu Tyr 1 5 10 15 Gly Thr Cys Gly Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala 20 25 30 Val Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Leu Phe Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln 50 55 60 Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Ala Arg 65 70 75 80 Asp Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Glu Thr Tyr 85 90 95 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Met Gln Ser Phe Asn Leu Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys 115 120 125 Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 130 135 140 Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 145 150 155 160 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp 165 170 175 Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp 180 185 190 Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys 195 200 205 Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln 210 215 220 Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 67 <211> 469 <212> PRT <213> mus musculus <400> 67 Met Lys Met Trp Leu Asn Trp Val Phe Leu Val Thr Leu Leu Asn Gly 1 5 10 15 Ile Gln Cys Glu Val Asn Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Thr Asp Asn Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu 50 55 60 Glu Trp Leu Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Asp 65 70 75 80 Tyr Ser Ala Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 85 90 95 Gln Ser Ile Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ala Leu Arg Ala Glu Asp Ser 100 105 110 Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Val Gly Ser Asn Tyr Phe Asp Tyr 115 120 125 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 130 135 140 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 145 150 155 160 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 165 170 175 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 180 185 190 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 195 200 205 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val 210 215 220 Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys 225 230 235 240 Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 245 250 255 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 260 265 270 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 275 280 285 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 290 295 300 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 305 310 315 320 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 325 330 335 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 340 345 350 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 355 360 365 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 370 375 380 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 385 390 395 400 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 405 410 415 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 420 425 430 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 435 440 445 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 450 455 460 Leu Ser Pro Gly Lys 465 <210> 68 <211> 720 <212> DNA <213> mus musculus <400> 68 atggagtcac aggcccaggt tcttatattg ctgctgctat gggtatctgg tacctgtggg 60 gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact 120 atgagctgca aatccagtca gagtctgtac aacagtagaa cccgaaagaa ctacttggct 180 tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tctactgggc atccactagg 240 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 300 atcaccagtg tgcaggctga ggacctggca gttttttact gcaagcaatc ttataatctt 360 cggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaacgta cggtggccgc tcccagcgtg 420 ttcatcttcc ccccaagcga cgagcagctg aagagcggca ccgccagcgt ggtgtgtctg 480 ctgaacaact tctaccccag ggaggccaag gtgcagtgga aggtggacaa cgccctgcag 540 agcggcaaca gccaggagag cgtcaccgag caggacagca aggactccac ctacagcctg 600 agcagcaccc tgaccctgag caaggccgac tacgagaagc acaaggtgta cgcctgtgag 660 gtgacccacc agggcctgtc cagccccgtg accaagagct tcaacagggg cgagtgctga 720 <210> 69 <211> 1404 <212> DNA <213> mus musculus <400> 69 atgaagctgt ggctgaactg ggtgttcctg gtgaccctgc tgaacggctt ccagtgcgaa 60 gtgaaactgg tggagtctgg cggcggactg gtgcagccag gcggcagcct gagactgagc 120 tgcaccacct ccggcttcac cttcaccgac tactacatga gctgggtgcg ccagagcccc 180 ggcaaggccc tggaatggct gaccttcatc cggaacaagg ccaacggcta caccaccgag 240 tacagcgcca gcgtgaaggg ccggttcacc atcagccggg acaacagcca gagcatcctg 300 tacctgcaga tgaacaccct gcgggccgag gactccgcca cctactactg cgccagagac 360 atccccggct tcgcctactg gggccagggc accctggtga ccgtgtccgc cgccagcacc 420 aagggcccaa gcgtgttccc gctagccccc agcagcaaga gcaccagcgg cggcacagcc 480 gccctgggct gcctggtgaa ggactacttc cccgagcccg tgaccgtgtc ctggaacagc 540 ggagccctga cctccggcgt gcacaccttc cccgccgtgc tgcagagcag cggcctgtac 600 agcctgagca gcgtggtgac cgtgcccagc agcagcctgg gcacccagac ctacatctgt 660 aacgtgaacc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagtggagcc caagagctgt 720 gacaagaccc acacctgccc cccctgccca gcccccgagc tgctgggcgg acccagcgtg 780 ttcctgttcc cccccaagcc caaggacacc ctgatgatca gcagaacccc cgaggtgacc 840 tgtgtggtgg tggacgtgtc ccacgaggac ccagaggtga agttcaactg gtacgtggac 900 ggcgtggagg tgcacaacgc caagaccaag cccagagagg agcagtacaa cagcacctac 960 agggtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 1020 tgtaaggtgt ccaacaaggc cctgccagcc ccaatcgaaa agaccatcag caaggccaag 1080 ggccagccaa gagagcccca ggtgtacacc ctgccaccca gcagggagga gatgaccaag 1140 aaccaggtgt ccctgacctg tctggtgaag ggcttctacc caagcgacat cgccgtggag 1200 tgggagagca acggccagcc cgagaacaac tacaagacca cccccccagt gctggacagc 1260 gacggcagct tcttcctgta cagcaagctg accgtggaca agagcagatg gcagcagggc 1320 aacgtgttca gctgctccgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac ccagaagagc 1380 ctgagcctgt ccccaggcaa gtga 1404 <210> 70 <211> 720 <212> DNA <213> mus musculus <400> 70 atggagtcac agactctggt cttcatatcc atactgctct ggttatatgg tacctgtggg 60 gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact 120 atgagctgca aatccagtca gagtctgttc aacagtcgaa cccgaaagaa ctacttggct 180 tggtaccagc agaagccagg gcagtctcct aaactgctga tctactgggc atccgctagg 240 gattctgggg tccctgctcg cttcacaggc agtggatctg agacatattt cactctcacc 300 atcagccgtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gcatgcaatc ttttaatctt 360 cggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaacgta cggtggccgc tcccagcgtg 420 ttcatcttcc ccccaagcga cgagcagctg aagagcggca ccgccagcgt ggtgtgtctg 480 ctgaacaact tctaccccag ggaggccaag gtgcagtgga aggtggacaa cgccctgcag 540 agcggcaaca gccaggagag cgtcaccgag caggacagca aggactccac ctacagcctg 600 agcagcaccc tgaccctgag caaggccgac tacgagaagc acaaggtgta cgcctgtgag 660 gtgacccacc 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ccgagctgct gggcggaccc 780 agcgtgttcc tgttcccccc caagcccaag gacaccctga tgatcagcag aacccccgag 840 gtgacctgtg tggtggtgga cgtgtcccac gaggacccag aggtgaagtt caactggtac 900 gtggacggcg tggaggtgca caacgccaag accaagccca gagaggagca gtacaacagc 960 acctacaggg tggtgtccgt gctgaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 1020 tacaagtgta aggtgtccaa caaggccctg ccagccccaa tcgaaaagac catcagcaag 1080 gccaagggcc agccaagaga gccccaggtg tacaccctgc cacccagcag ggaggagatg 1140 accaagaacc aggtgtccct gacctgtctg gtgaagggct tctacccaag cgacatcgcc 1200 gtggagtggg agagcaacgg ccagcccgag aacaactaca agaccacccc cccagtgctg 1260 gacagcgacg gcagcttctt cctgtacagc aagctgaccg tggacaagag cagatggcag 1320 cagggcaacg tgttcagctg ctccgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag 1380 aagagcctga gcctgtcccc aggcaagtga 1410

Claims

i) 생성된 항체를 검색하여 CXCR4에 특이적으로 결합하면서 CXCR4 활성화도 조정할 수 있는 항체를 선별하고;
ii) 단계 i)의 상기 선별된 항체를 테스트하여 CXCR4 호모이중머 (homodimer)의 형태적 변화를 유도할 수 있는 항체를 선별하고; 및 그 다음
iii) 단계 ii)의 상기 선별된 항체를 테스트하여 CXCR4/CXCR2 헤테로이중머 (heterodimer)의 형태적 변화를 유도할 수 있는 항체를 선별하는:
단계들을 포함하는 것을 특징으로 하는, CXCR4의 활성화를 저해할 수 있는, 항-CXCR4 항체, 또는 그의 기능적 단편으로서, 상기 기능적 단편은 단편들 Fv, Fab, (Fab')₂, Fab', scFv, scFv-Fc 및 다이아바디 (diabodies)중에서 선택되는 기능적 단편을 선별하는 방법.
제1항에 있어서,
단계 ii)는 CXCR4-RLuc/CXCR4-YFP 둘 다를 발현하는 세포 상에서 BRET 분석법에 의해 항체를 평가하여 BRET 신호의 적어도 40%를 저해할 수 있는 항체를 선별하는 것으로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
단계 iii)은 CXCR4-RLuc/CXCR2-YFP 둘 다를 발현하는 세포 상에서 BRET 분석법에 의해 항체를 평가하여 BRET 신호의 적어도 40%를 저해할 수 있는 항체를 선별하는 것으로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
CXCR4의 활성화를 저해할 수 있는 항체, 또는 그의 기능적 단편으로서, 상기 기능적 단편들은 단편들 Fv, Fab, (Fab')₂, Fab', scFv, scFv-Fc 및 다이아바디 중에서 선택되는 기능적 단편으로서, 다음으로 이루어진 군에서 선택되는 항체, 또는 그의 기능적 단편:
a) IMGT에 따라 서열번호 1의 CDR-L1, 서열번호 2의 CDR-L2 및 서열번호 3의 CDR-L3를 포함하는 경쇄; 및 IMGT에 따라 서열번호 7의 CDR-H1, 서열번호 5의 CDR-H2 및 서열번호 8의 CDR-H3를 포함하는 중쇄;를 포함하는 항체, 또는 그의 기능적 단편;
b) 카밧에 따라 서열번호 9의 CDR-L1, 서열번호 10의 CDR-L2 및 서열번호 3의 CDR-L3를 포함하는 경쇄; 및 카밧에 따라 서열번호 11의 CDR-H1, 서열번호 12의 CDR-H2 및 서열번호 6의 CDR-H3를 포함하는 중쇄;를 포함하는 항체, 또는 그의 기능적 단편;
c) IMGT에 따라 서열번호 40의 CDR-L1, 서열번호 2의 CDR-L2 및 서열번호 41의 CDR-L3를 포함하는 경쇄; 및 IMGT에 따라 서열번호 44의 CDR-H1, 서열번호 5의 CDR-H2 및 서열번호 45의 CDR-H3를 포함하는 중쇄;를 포함하는 항체, 또는 그의 기능적 단편; 및
d) 카밧에 따라 서열번호 46의 CDR-L1, 서열번호 47의 CDR-L2 및 서열번호 41의 CDR-L3를 포함하는 경쇄; 및 카밧에 따라 서열번호 48의 CDR-H1, 서열번호 49의 CDR-H2 및 서열번호 43의 CDR-H3를 포함하는 중쇄;를 포함하는 항체, 또는 그의 기능적 단편.
제4항에 있어서,
상기 항체, 또는 그의 기능적 단편은 다음으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 항체, 또는 그의 기능적 단편:
a) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열 및 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 서열을 포함하는, 항체, 또는 그의 기능적 단편; 및
b) 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열 및 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 서열을 포함하는, 항체, 또는 그의 기능적 단편.
파리 파스퇴르 연구소, CNCM 에 2007년 10월 22일자로 수탁번호 제 I-3860호 하에 기탁된 또는 파리 파스퇴르 연구소, CNCM 에 2008년 06월 25일자로 수탁번호 제 I-4019호 하에 기탁된 하이브리도마로부터 선택된 마우스 하이브리도마에 의해 분비된 항체.
제4항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서,
상기 항체 또는 그의 기능적 단편은 키메라 항체 (chimeric antibody)로 이루어진 것을 특징으로 하는 항체, 또는 그의 기능적 단편.
제7항에 있어서,
상기 항체, 또는 그의 기능적 단편은 다음으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 항체, 또는 그의 기능적 단편:
a) 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열 및 서열번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 서열을 포함하는, 항체, 또는 그의 기능적 단편; 및
b) 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열 및 서열번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 서열을 포함하는, 항체, 또는 그의 기능적 단편.
분리된 핵산으로서, 제4항에 따른 항체를 코딩하는 핵산, DNA 또는 RNA인 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
제9항에 따른 핵산으로 구성되는 벡터.
제10항에 따른 벡터를 포함하는 숙주세포.
제10항에 따른 벡터에 의해 형질전환된 세포를 포함하는 사람을 제외한 형질전환 동물 (transgenic animal).
다음 단계들:
- 제11항에 따른 숙주세포에 적합한 배지 및 배양 조건에서의 배양; 및
- 상기 배양 배지로부터 또는 상기 배양된 세포로부터 생산된 항체, 또는 그의 기능적 단편으로서, 상기 기능적 단편은 단편들 Fv, Fab, (Fab')₂, Fab', scFv, scFv-Fc 및 다이아바디 (diabodies)중에서 선택되는 기능적 단편의 회수;
를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제4항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 따른 항체, 또는 그의 기능적 단편을 생산하는 방법.
제4항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서,
약물로서 사용하기 위한 항체, 또는 그의 기능적 단편.
약제학적 조성물로서, 제4항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 따른 항체, 또는 그의 기능적 단편을 활성 성분으로서 포함하는 약제학적 조성물.
제15항에 있어서,
상기 조성물은 CXCR4에게로 (against) 유도되는 항체가 아닌 다른 항-종양 항체를 동시적 (simultaneous), 개별적 (separated) 또는 연장된 (extended) 방식으로 사용하기 위한 조합 산물 (combination product)로서 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제15항에 있어서,
상기 조성물은 세포독성/세포증식억제 제제, 세포성 독소 및/또는 방사성 동위원소를 동시적, 개별적 또는 연장된 방식으로 사용하기 위한 조합 또는 결합 산물 (conjugation product)로서 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제15항에 있어서,
약물로서 사용하기 위한 약제학적 조성물.
제4항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서,
세포에서 CXCR4 활성을 조정하는 약물로 사용하기 위한, 항체, 또는 그의 기능적 단편.
제4항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서,
암의 예방 또는 치료를 위한, 항체, 또는 그의 기능적 단편.
제20항에 있어서,
상기 암은 전립선 암 (prostate cancer), 골육종 (osteosarcoma), 폐암 (lung cancer), 유방암 (breast cancer), 자궁내막 암 (endometrial cancer), 다발성 골수종 (multiple myeloma), 난소암 (ovarian cancer), 췌장암 (pancreatic cancer) 및 결장암 (colon cancer) 중에서 선택된 암인 것을 특징으로 하는, 항체, 또는 그의 기능적 단편.
파리 파스퇴르 연구소, CNCM 에 2007년 10월 22일자로 수탁번호 제 I-3860호 하에 기탁된 또는 파리 파스퇴르 연구소, CNCM 에 2008년 06월 25일자로 수탁번호 제 I-4019호 하에 기탁된 하이브리도마로부터 선택된 마우스 하이브리도마.
제15항에 있어서,
세포에서 CXCR4 활성을 조정하는 약물로 사용하기 위한, 약제학적 조성물.
제15항에 있어서,
암의 예방 또는 치료를 위한, 약제학적 조성물.
제24항에 있어서,
상기 암은 전립선 암 (prostate cancer), 골육종 (osteosarcoma), 폐암 (lung cancer), 유방암 (breast cancer), 자궁내막 암 (endometrial cancer), 다발성 골수종 (multiple myeloma), 난소암 (ovarian cancer), 췌장암 (pancreatic cancer) 및 결장암 (colon cancer) 중에서 선택된 암인 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
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