KR101850601B1 - 초임계유체기술과 생물전환을 통해 제조된 녹차다당체를 함유하는 항염 및 보습 기능성 화장료 조성물 및 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 초임계유체기술에 의해 정제된 녹차다당체를 생물전환공정을 통하여 제조된 다당체의 항염 및 보습 기능성 강화 화장료 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로 초임계추출공정과 생물전환공정을 통하여 추출공정에서 다당체의 손실은 적고 그 함량이 높은 녹차다당추출물 제조방법을 제공하는 효과가 있을 뿐 아니라, 상기 제조방법에서 제조된 항염 및 보습기능이 강화된 화장료 조성물을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

Description

초임계유체기술과 생물전환을 통해 제조된 녹차다당체를 함유하는 항염 및 보습 기능성 화장료 조성물 및 그 제조방법{A functional cosmetic composition for anti-inflammatory and moisturizing effect containing polysaccharide of green tea produced by supercritical fluid technology and bioconversion process, and the method for preparing of the same}

본 발명은 초임계유체기술에 의해 수득한 녹차다당체를 다시 생물전환공정을 통하여 항염 및 보습 기능성이 강화된 화장료 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로 더욱 상세하게는 녹차를 초임계유체 추출공정과 생물전환공정을 순차적으로 적용하여 추출공정에서 다당체의 손실을 최소화하고 그 함량은 극대화하여 항염 및 보습기능을 강화시킨 기능성 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

화장품산업은 소득수준의 향상과 인구 고령화에 따른 미에 대한 관심 증가와 젊고 탄력있는 피부를 갈구하는 시대적인 욕구 증가로 그 수요가 지속적으로 증가하고 있으며 특히, 피부의 보습유지를 위한 기능성 화장품에 대한 매출의 증가가 두드어진다.

피부 보습의 역사는 파라핀 기반 Petrolatum이 소개되면서 시작되었다 볼 수 있는데 이 성분을 이용한 대표적인 보습제로서 바셀린을 들 수 있다. 바셀린의 작용 기전은 간단하게 피부 각질층 표면에 수분 증발을 막는 파라핀 필름을 형성시킴으로서 수분 손실을 막는 물리적인 occlusive film on skin surface로 설명할 수 있다. 이후 NMF(natural moisturizing factor)가 발견되면서 피부 보습에 대한 새로운 이해가 가능해졌다.

NMF는 각질층 세포 내부에서 발견되며, 주로 아미노산과 그들의 대사부산물로 구성되어 있다. 각질층에서의 NMF 부족이나 detergent 사용 등으로 인한 NMF loss 현상은 각질층 수분부족 피부문제를 야기하며 각질층에서의 수분 함유능력 (moisture binding ability)은 NMF 중에서 특히 PCA 함량과 관계가 깊다. 또한 NMF등은 피부 수분을 holding 하는 absorbing 또는 water binding 기능으로서 보습의 일부를 차지하고 있으며 외피(Epidermis) 에서의 보습은 NMF류의 water holding 기능과 달리 복합적인 epidermis skin hydration 기능이 중요하다. 한편, Dermis에서의 보습 작용기전은 Epidermisis와 또 다르며, Dermis에서 HA(hyaluronan) 및 GAGs(glucosaminoglycans)는 대표적인 ECM으로서 dermis 대사작용에 밀접하게 관련되어있다. 특히 hydration 작용기전의 핵심 물질로 알려져 있으므로 HA 와 GAGs의 synthesis 또는 degradation은 dermis hydration의 작용기전이며 이의 조절이 dermal hydration의 근원적인 실마리가 된다. 이전에는 보습제의 기능이나 연구개발은, 주로 각질층 water holding 기능이나 NMF에 의한 water binding activity에 집중하였지만 최근 Epidermis에서의 hydration mechanism 이 알려지면서 보습은 다양한 작용기전에 의하여 조절되는 현상임을 알게 되었다. 여기에 Dermis에서의 HA 및 GAG의 기능에 따라서 hydration이 영향을 받음이 알려지면서 보습의 작용기전은 좀더 복합적인 조절기능을 가짐을 알게 되었다.

따라서 이러한 복합 작용기전을 연구하기 위한 새로운 보습 유효성 평가에 대한 연구가 필요하다. 또한, 보습 복합 작용기전은 피부 내 항염 기전과 밀접한 관계가 있어 보습 유효성 평가와 함께 항염 효과도 평가할 수 있는 새로운 연구가 필요한 실정이다.

세계 3대 기호 음료로 차에 대한 생리활성 및 약리학적 효능 연구는 주로 차카테킨에 국한되어 있는데, 카테킨류는 혈청 지질저하, 고혈압, 동맥경화 및 비만예방, 항혈소판작용, 동맥평활근세포 증식억제 및 과산화지질생성저하 노화예방, 항균작용, 항암, 항염증작용, 충치예방 등에 효과적이며, 2006년 11월 차카테킨을 원료로 한 외용피부병제가 FDA로부터 신약허가되었다.

국내 잎차등 녹차시장은 약 3,000억원 규모(AP가 43% 시장 점유)이고, 녹차음료시장은 약2,000억원(동원F&B 시장점유)이나 일본의 경우 녹차음료 시장만 3조원에 이른다.

최근 본 발명의 선행기술로서 비효소/효소가수분해를 수행한 산성 녹차다당체에 대한 연구결과, 염증성 피부질환, 면역증진 및 항산화 등에 공지된 바 있으나, 추출물의 총다당체 함량이나 그에 의한 피부효능 메카니즘은 전혀 확인된 바 없고, 산성 녹차 다당체이고 역시 가격이 과도히 비싸 사용이 매우 미미한 실정이다.

또한, 증류수로 열수추출 후, 본 발명의 다른 선행기술로서 대한민국 공개특허 10-2011-0045662호에 공지되어 있으나 이는 녹차잎을 열수추출후 여과하고 에탄올 침전시켜 얻은 산성 녹차 다당체 및 송이 버섯 추출물을 함유하는 항염 및 항산화용 화장료 조성물의 제조방법에 관한 것이고, 대한민국 등록특허 10-0602841호에도 녹차를 열수추출한 후 에탄올 침전하여 분리한 산성 다당체와 이를 함유하는 소화성 질환 예빙 및 치료용 조성물이 공지되어 있으나 상기 산성 녹차 다당체 역시 가격이 너무 고가여서 사용이 미미한 실정이다. 그러나 현재까지 초임계유체기술과 생물전환을 순차적으로 수행하여 제조된 녹차다당체를 함유하는 항염 및 보습이 강화된 기능성 화장료 조성물 및 그 제조방법에 대하여는 공지된 바 없다.

따라서, 본 발명의 목적은 본 발명자들이 초임계유체기술에 의해 제조한 공지된 녹차다당체를 생물전환공정을 순차적으로 더 부가하여 총 당함량을 증대시킨 녹차다당추출물의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 제조방법을 통해 제조된 녹차다당추출물을 유효성분으로 하는 항염 및 보습 기능성이 더 강화된 화장료 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 상기 목적은 a)녹차를 초임계추출장치를 이용하여 카테킨과 카페인이 제거된 녹차추출박을 제조하는 단계와; b)상기 단계에서 얻은 녹차추출박을 정제수로 열수추출하여 녹차조다당을 추출하는 단계와; c)상기 단계에서 얻은 녹차조다당에 가수분해효소를 첨가하여 분해시키는 단계와; d)상기 효소분해단계에서 얻은 효소반응물에 저농도의 에탄올을 첨가한 후 원심분리하여 상등액을 제조하는 단계와; e)상기 단계에서 얻은 상등액에 다시 2차 고농도의 에탄올을 첨가한 후 원심분리하여 침전물을 수득하는 단계와; f)상기 단계에서 수득한 침전물을 건조하여 녹차다당추출물을 제조하는 단계로 이루어지고, 이 녹차다당추출물의 함염 및 보습효과를 평가하는 단계를 통하여 달성하였다.

본 발명은 초임계유체 추출공정과 생물전환공정을 순차적으로수행함으로써 다당체의 손실을 최소화하고, 총 당함량을 극대화시킨 녹차다당추출물을 제조할 수 있는 제조방법을 제공하는 효과가 있을 뿐 아니라, 상기 제조방법에 따라 제조된 항염 및 보습효과가 더 강화된 화장료 조성물을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

도 1은 초임계추출공정을 모식화한 그림이다.
도 2는 녹차다당추출물의 제조공정을 모식화한 그림이다.
도 3은 본 발명 녹차다당추출물의 보습효과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 피부장벽 재생효과 실험과정 중 SLS의 처리방법을 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명 녹차다당추출물의 TEWL 감소효과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명 녹차다당추출물 처리시 활성화된 Raw 264.7 cell에서의 NO 감소효과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명 녹차다당추출물 처리시 활성화된 섬유아세포(fibroblast)에서의 COX-2 발현양 감소효과를 나타낸 그림이다.
도 8은 본 발명 녹차다당추출물 처리시 활성화된 섬유아세포(fibroblast)에서의 PEG-2 방출양 감소효과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명 녹차다당추출물 처리시 피부 홍반 감소를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 a)녹차를 초임계추출장치를 이용하여 카테킨과 카페인이 제거된 녹차추출박을 제조하는 단계와; b)상기 단계에서 얻은 녹차추출박을(가장바람직하기로는 95℃의 정제수로 1시간) 열수추출하여 녹차조다당을 추출하는 단계와; c)상기 단계에서 얻은 녹차조다당에 가장 바람직하기는 4종의 가수분해효소를 동량비로 혼합하여 첨가하고 분해시키는 단계와; d)상기 효소분해단계에서 얻은 효소반응물에 저농도의 에탄올을 첨가한 후 원심분리하여 상등액을 제조하는 단계와; e)상기 단계에서 얻은 상등액에 고농도의 에탄올을 2차로 첨가한 후 원심분리하여 침전물을 수득하는 단계와; f)상기 단계에서 수득한 침전물을 건조하여 본 발명 녹차다당추출물을 제조한다.

상기 녹차다당추출물은 초임계추출공정과 생물전환공정을 순차적으로 수행하는 수단을 통해 다당체의 손실을 최소화하고 총 당함량을 극대화함으로써 항염 및 보습효과를 강화하거나 증대시키는 특징이 있다.

본 발명은 녹차다당추출물을 유효성분으로 함유하는 항염 및 보습 강화기능성 화장료 조성물을 제공한다. 상기 화장료 조성물은 녹차다당추출물에 추가적으로 피부학적으로 허용된 담체를 혼합하여 사용될 수 있다. 상기 피부학적으로 허용된 담체는 정제수, 오일, 왁스, 지방산, 지방산 알코올, 지방산 에스테르, 계면활성제, 흡습제(humectant), 증점제(thickening agent), 항산화제, 점도 안정화제(viscosity stabilizer), 킬레이팅제, 완충제, 방부제, 저급 알코올 등이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니며, 그 종류와 농도는 다양하고, 당업자가 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 수정 및 변경할 수 있는 부분을 포함한다.

필요에 따라 미백제, 보습제, 항염증제, 항박테리아제, 항진균제, 비타민, 자외선 차단제, 항생제, 여드름 방지제, 향수, 염료가 포함될 수도 있으며, 이들은 화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 양으로 본 발명에 따른 화장용 조성물에 포함될 수 있다.

구체적으로, 상기 오일로는 수소화 식물성유, 파마자유, 면실유, 올리브유, 야자인유, 호호바유, 아보카도유가이용될 수 있고, 왁스로는 밀랍, 경랍, 카르나우바, 칸델릴라, 몬탄, 세레신, 액체 파라핀, 라놀린이 이용될 수있다.

상기 지방산으로는 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 올레산이 이용될 수 있고, 지방산 알코올로는 세틸알코올, 옥틸 도데칸올, 올레일 알코올, 판텐올, 라놀린 알코올, 스테아릴 알코올, 헥사데칸올이 이용될 수 있으며, 지방산 에스테르로는 이소프로필 미리스테이트, 이소프로필 팔미테이트, 부틸 스테아레이트 등이 이용될수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 계면활성제로는 소듐 스테아레이트, 소듐 세틸설페이트, 폴리옥시에틸렌 라우릴에테르 포스페이트, 소듐 N-아실 글루타메이트와 같은 음이온 계면활성제 스테아릴디메틸벤질암모늄 클로라이드 및 스테아릴트리메틸암모늄 클로라이드와 같은 양이온 계면활성제 알킬아미노에틸글리신 하이드로클로라이드 및 레시틴과 같은 양성 계면활성제 글리세린 모노스테아레이트, 소르비탄 모노스테아레이트, 프로필렌 글리콜 모노스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 올레일에테르, 폴리에틸렌 글리콜 모노스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노팔미테이트, 폴리옥시에틸렌 코코넛 지방산 모노에탄올아르니드(monoethaolarnide), 폴리옥시프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌 캐스터유, 폴리옥시에틸렌 라놀린과 같은 비이온성 계면활성제 등이 포함된다.

상기 흡습제로는 글리세린, 1,3-부틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜이 이용될 수 있으며, 저급 알코올로는 에탄올, 이소프로판올이 이용 가능하다. 증점제의 예에는 알긴산 나트륨, 카제인산 나트륨, 젤라틴 한천, 크산탄 고무, 전분, 셀룰로오스 에테르(예, 하이드록시에틸 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 카르복시메틸 셀룰로오스, 하이드록시 프로필메틸 셀룰로오스), 폴리비닐 피롤리돈, 폴리비닐 알코올, 폴리에틸렌 글리콜 및 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스 등이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 항산화제로는 부틸레이티드 하이드록시톨루엔, 부틸레이티드 하이드록시아니솔, 프로필 갈레이트, 시트르산, 에톡시퀸(ethoxyquin)이 이용 가능하고, 킬레이팅제로는 디소듐 에데테이트, 에탄하이드록시 디포스페이트가 이용 가능하다.

상기 완충제로는 시트르산, 소듐 시트레이트, 붕산, 보랙스(borax), 디소듐 하이드로젠 포스페이트가 이용 가능하고, 방부제로는 메틸 파라하이드록시벤조에이트, 에틸 파라하이드록시벤조에이트, 디하이드로아세트산, 살리실산, 벤조산이 이용 가능하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 구체적인 내용을 실시예 및 실험예를 들어 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 발명이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 녹차추출박의 제조

도1에서 알 수 있듯이 먼저 녹차를 초임계유체추출법을 통하여 불순물이 제거된 녹차추출박을 제조한다. 본 발명에서 불순물이라 함은 왁스, 카테킨과 카페인을 통칭한다.

초임계유체추출 공정의 상세한 사항은 먼저 녹차를 추출기①에 충진하고 열교환기⑨를 통하여 추출에 적합하게 가열된 초임계 이산화탄소를 추출기①의 하단부에 공급한다. 공급된 초임계 이산화탄소는 충진된 녹차와 접촉하여 불순물을 추출하며 상승한 뒤 추출기 밖으로 방출되고 추출된 초임계 이산화탄소와 불순물의 혼합물은 감압밸브②를 경유하며 감압되면서 감압기③로 전달된다. 상기 감압기③에서는 추출된 불순물과 이산화탄소가 분리되며, 분리된 이산화탄소는 열교환기④를 통하여 액화된 후 저장조⑤로 순환되어 재사용된다. 감압기③에서 분리된 불순물은 최종 불순물⑩으로 수거되며 이산화탄소 저장조⑥에는 순환되어 공급되는 이산화탄소 외에 전 공정에서 발생하는 약간의 손실을 보충하도록 외부에서 이산화탄소가 보충된다. 상기 저장조⑤에 저장된 이산화탄소는 펌프⑦를 통하여 가압되어 초임계 상태로 열교환기⑨를 통하여 다시 추출기에 공급된다(도1). 본 발명에 따른 상기 초임계유체추출공정이 완료되면 추출기①로부터 불순불이 제거된 녹차추출박을 수득하게 된다.

녹차추출박의 처리조건은 녹차잎 300g을 추출기에 충진하고 온도는 70℃, 압력은 300bar, 초임계이산화탄소 유속은 150ml/min, 보조용매로 80% 에탄올을 사용하고 상기와 같이 본 발명의 초임계유체추출공정을 수행하였다.

실시예 2. 녹차조다당의 제조

녹차조다당의 제조를 위해 상기 실시예1에서 수득한 녹차추출박 300g에 4500mL 정제수를 혼합하여 95℃에서 1시간 동안 교반 추출한 후 농축 또는 건조하여 녹차조다당을 제조하였다(도2).

실시예 3. 녹차다당추출물의 제조

상기 실시예2에서 제조된 녹차조다당에 가장 바람직하기는 가수분해효소 Pectinex Ultra SP-L, β-glucanase, Termamyl-120L 및 AMG-300L를 각 동량비(w/w/w/w)로 혼합하여 녹차조다당 대비 2중량%를 첨가하여 효소반응을 실시하였다. 상기 효소반응물에 에탄올을 첨가하여 1차로 저농도의 55%(v/v)에탄올 용액에서 용매침전시키고 원심분리하여 상등액을 수득하였다. 상기에서 얻은 상등액에 다시 고농도의 에탄올을 첨가하여 2차로 75%(v/v) 에탄올용액에서 다시 용매침전시키고, 2차 원심분리한 후, 침전물을 수득하였다. 상기에서 얻은 침전물을 건조하여 본 발명 녹차다당추출물을 제조하였으며 이를 냉장실(4℃)에 저장하여 두고 이하 실험의 공시재료로 사용하였다(도2).

실험예 1. 본 발명 녹차다당추출물의 다당체함량 분석

1) 검액의 제조

상기 실시예3에서 얻은 본 발명 녹차다당추출물 2.5g을 플라스크에 넣고 100mL HPLC분석용 물로 용해하였다. 상기 단계에서 얻은 용액을 30분간 초음파추출을 수행하고 가열된 추출액을 찬물에서 식혀 실온으로 냉각하였다. 추출액의 일부는 45μm 시린지 필터를 사용하여 필터링하여 검액으로 사용하였다. 대조군으로는 본 발명에 따른 초임계유체추출공정과 생물전환공정 없이 공지된 방법으로 제조된 시판 산성녹차다당추출물을 사용하였다.

2) HPLC 분석

바이알에 옮긴 표준액과 검액을 10℃로 설정된 sample tray에 30분 이상 정치하여 냉각한 후 아래 조건으로 검액을 주입하여 분석하였다. 분석하여 얻어진 크로마토그램의 피크 면적을 합산하고 이를 동일 농도의 표준품에 대한 평균값과 비교하여 정량하였다.

표준품 : Pullulan series(P-5,10,20,50,100,200,400 및 800)

컬럼 : Asahi-Pak GS-520+GS-320+GS-220 packed column(7.6*300mm)

유속 : 0.5 mL/min

주입량:20μL

검출기: RI

칼럼온도 : 25도

이동상: 50mM ammonium formate buffer(pH 5.5)

총 다당체의 함량	본 발명 녹차다당추출물	대조군	표준폼(평균)
면적	2514322	1821416	5505557
함량 (고형물 전체중량 대비 중량%)	45.7	33.1	100

실험 결과, 본 발명에 따른 녹차다당추출물의 총 다당체의 함량이 전체 고형물 중량 대비 45.7% 수준으로 증대되어 대조군에 비해 전체중량 대비 12.6%나 높았다(표1).

실험예 2. 본 발명 녹차다당추출물의 보습효과

본 발명에 따라 수득한 녹차다당추출물의 보습 효과와 파괴된 피부장벽의 재생효과를 측정하기 위하여 Water holding capacity 평가와 TEWL 평가를 하였다. 본 발명 녹차다당추출물을 DMSO(Dimethylsulfoxide)에 100mg/L 로 용해시켜 실험에 사용하였다.

1) 보습효과 실험

피험자의 상완 내측을 클렌징폼으로 세척하여 피지 제거 후 10분간 자연 건조시킨 후 100mg/L 녹차다당추출물 100㎕를 처리한 후 2시간 단위로 8시간까지 피부 수분량 측정하였다. 대조군으로는 보습 효과가 널리 알려진 BG를 사용하였으며 피험자는 남성 6명 여성 4명이었다.

실험 결과, 도3에서 알 수 있듯이 아무것도 처리하지 않은 피부에서는 시간이 지남에 따라 수분량이 감소하는 것으로 나타났으며 본 발명 녹차다당추출물을 처리한 피부에서는 6시간 후 53% 증가한 것으로 나타났다. 이는 본 발명 녹차다당추출물이 피부 각질층에 수분 증발을 억제하는 막을 형성하여 자연적인 수분 증발을 억제함을 나타낸다.

2) 피부장벽 재생효과(TEWL) 실험

도4에서 알 수 있듯이 피험자의 상완 내측을 클렌징폼으로 세척하여 피지 제거 후 10분간 자연 건조시킨 후 2.5 cm X 4 cm 넓이에 5% SLS(Sodium lauryl sulfate) 200㎕를 30분간 처리하여 피부장벽을 손상시켰다. 피부 장벽이 손상된 곳의 TEWL 측정 후 각 부분에 녹차다당추출물 100㎕를 처리한 후 2시간 단위로 TEWL 측정하여 피부장벽의 재생 정도를 확인하였으며 피험자는 보습 효과 측정 인원과 구성이 동일하였다.

실험 결과, 도5에서 알 수 있듯이 TEWL 실험에서 본 발명 녹차다당추출물을 처리한 피부에서는 6시간 후 정상상태에 도달하였으며 대조군인 olive oil은 12시간, 무처리군에서는 24시간의 시간이 소요되었다.

실험예 3. 본 발명 녹차다당추출물의 항염효과

초임계 CO2를 이용하여 추출한 본 발명 녹차다당추출물의 항염증 활성을 측정하기 위하여 LPS에 의해 유도된 대식세포(Raw 264.7 cell)의 NO(nitric oxide) 생성량과 섬유아세포(fibroblast cell) 에서의 COX-2, PGE2 발현량 감소를 측정하였다. 또한 임상적으로 홍반도 테스트를 통하여 녹차다당추출물의 항염효과를 확인하였다.

1) Nitric oxide(NO) 확인

Raw 264.7 cell을 이용하여 녹차다당추출물의 nitric oxide 생성 억제 능력을 측정하였다. Raw 264.7 cell을 페니실린(10U/㎖), 10% FBS(Fetal bovine serum)가 첨가된 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium) 배지에서 37℃, 5% 이산화탄소가 유지된 인큐베이터에서 배양하였다. Raw 264.7 cell을 5×10⁴ cell/well 농도로 96 well plate 에 분주한 후 24시간 동안 배양 후 2㎕의 LPS(0.1㎍/㎖)를 처리하였다. 녹차다당추출물을 DMSO(Dimethylsulfoxide)에 10, 100 및 1000mg/L의 농도로 용해시킨 후 각각의 LPS 처리 된 raw 264.7 cell에 2.5㎕씩 첨가하여 37 ℃, 5% 이산화탄소에서 배양하였다. 24시간 배양 후 상등액을 분리한 후 100㎕의 상층액과 100㎕의 Griess 시약(1 % sulfanilamide, 0.1% N-1-naphthylenediamine dihydrochloride, 5% phosphoric acid)을 혼합한 후 10분 동안 반응시켰다. 마이크로플레이트리더를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하여 nitric oxide 생성량을 측정하였다. 대조군은 Olive oil을 사용하였다.

실험 결과, 도6에서 알 수 있듯이 본 발명 녹차다당추출물이 대식세포에서의 NO 생성량을 녹차다당추출물 1000mg/L의 농도에서 81.5%까지 감소시켰으며 대조군인 olive oil에 비해 36.2% 높은 활성을 갖는 것이 확인되었다.

2) Cyclooxigenase-2(COX-2) 발현량 확인

Human fibroblast cell을 5×10⁴ cell/㎖ 농도로 6 well plate 에 10 ㎖씩 분주한 후 24시간 동안 배양 후 2 ㎕의 LPS(0.1 ㎍/㎖)를 처리하였다. 녹차다당추출물을 DMSO (dimethylsulfoxide)에 100 mg/L의 농도로 용해시킨 후 LPS 처리 된 fibroblast cell에 2.5㎕씩 첨가하여 37℃, 5% 이산화탄소에서 배양하였다. 24시간 배양 후 fibroblast cell을 PBS(Phosphate buffer saline)로 washing 한 뒤 원심분리하여 세포만을 얻었다. 이렇게 얻어진 cell을 protein extraction solution을 이용하여 용혈시킨 후 단백질을 추출하였으며 Bradford method 에 의해 정량하였다. 각 샘플에서 20㎍의 단백질을 니트로셀룰로스 막에 이식한 후 교반기에서 90분간 차단하였다. 위의 막을 일차 항체(anti-COX-2)안에서 3시간 동안 배양 후 0.5% TBS 로 3번 washing 하고, 이어서 HRP-conjugated 이차 항체 용액에서 90분간 세 번 washing. 해당밴드는 chemiluminescence 시약으로 측정하고 photographic 필름에 1분간 노출시켜 COX-2의 발현량을 확인하였다.

실험 결과, 도7에서 알 수 있듯이 본 발명 녹차다당추출물 처리시 fibroblast 에서 COX-2 생성을 현저하게 감소시켰다.

3) Prostagladin-E2(PGE2) 방출량 확인

PGE2 방출량은 ELISA 키트를 이용하여 측정하였다. 상기 1) Nitric oxide 측정 방법과 동일한 농도의 LPS 및 녹차다당추출물을 처리한 후 동일 조건에서 배양하였다. 24시간 배양 후 원심분리하여 상등액만 얻은 후 ELISA 키트를 이용하여 PGE2를 정량하였다.

실험 결과, 도8에서 알 수 있듯이 COX-2에 의해 생성되는 염증유발인자인 PGE2 발현량이 본 발명 녹차다당추출물 1000mg/L의 농도에서 35.5%, 100mg/L의 농도에서 71.3% 감소하였음이 확인되었다.

4) 홍반도 확인

실제 사람의 피부에 있어서 녹차다당추출물의 염증 억제 효과를 실험하였다. 먼저 피험자의 상완 내측을 클렌징 폼을 이용하여 세정한 후 물기가 없어질 때까지 자연 건조 시킨다. 건조된 부위의 2.5㎝ × 2.5㎝ 넓이에 5% SLS(Sodium lauryl sulfate) 100㎕를 30분간 처리하여 염증을 유발시켰다. 염증이 유발된 후 색차계 CR-14(Minolta, Japan)를 이용하여 홍반도를 측정하였다. 염증이 유발된 부위에 100mg/L 녹차다당추출물과 대조군인 olive 오일을 100㎕씩 바른 후 2시간 단위로 홍반도를 측정하여 염증의 감소를 확인하였다.

실험 결과, 도9에서 알 수 있듯이 본 발명 녹차다당추출물은 실제 사람의 피부에서 발생한 홍반의 적색도를 6시간만에 정상상태로 감소시켰으며 비처리군 24시간, olive oil 12시간에 비해 높은 활성을 갖는 것으로 나타났다.

이상 설명한 바와 같이 본 발명 초임계추출공정과 생물전환공정을 통하여 제조된 녹차다당체추출물은 종래의 녹차다당체 추출공정에서 얻은 다당체에 비하여 추출공정에서 다당체의 손실이 적고 그 함량이 높은 녹차다당추출물로 인하여 항염 및 보습효과가 뛰어난 화장료 조성물을 제공하는 효과가 있으므로 기능성 화장품 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (5)

1. 초임계유체 추출공정과 생물전환공정을 통하여 녹차다당 추출물을 제조하는 방법에 있어서;
   (a)녹차를 초임계추출장치를 이용하여 카페인 및 카테킨이 제거된 녹차추출박을 제조하는 단계와; (b)상기단계에서 얻은 녹차추출박을 정제수로 열수추출하여 녹차조다당을 제조하는 단계와; (c)상기단계에서 얻은 녹차조다당에 가수분해효소를 첨가하여 분해시키는 효소분해단계와; (d)상기 분해단계에서 얻은 효소반응물을 1차로 55%(v/v)농도의 에탄올을 첨가하여 용매침전 후 원심분리하여 상등액을 제조하는 단계와; (e)상기 단계에서 얻은 상등액을 다시 2차로 75%(v/v)농도의 에탄올을 첨가하여 용매침전 후 원심분리하여 침전물을 수득하는 단계와; (f)상기단계에서 수득한 침전물을 건조하는 단계로 이루어진 녹차다당추출물의 제조방법
   
2. 제 1항에 있어서,상기 효소분해는 가수분해효소 pectinex ultra Sp-L, β-glucanase, Termamyl-120L, 및 AMG-300L을 각각 동량비(w/w/w/w)로 혼합하여 녹차조다당 대비 2중량%를 첨가하는 것이 특징인 방법
   
3. 삭제
4. 제 1항 또는 제 2항의 방법에 따라 제조되어 총당함량이 고형물 전체 중량 대비 45.7%수준인 녹차다당추출물
   
5. 제 4항의 녹차다당추출물을 유효성분으로 함유하는 항염 및 보습강화 기능성 화장료 조성물
   
   
   
   
   

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