JP7281156B2 - 皮膚外用剤 - Google Patents
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Description
すなわち、本発明は、植物由来のイソフラボン(フォルモノネチン及びバイオカニンA)、又はそれらイソフラボン又を含む植物抽出物を有効成分とする皮膚外用剤である。
本発明の有効成分であるイソフラボンは、フォルモノネチン(formononetin)及びバイオカニンA(Biochanin A)である。また、本発明の有効成分は、それら2種のイソフラボンに加えて、他のイソフラボン他のイソフラボン(プエラリン、ダイジン、ゲニスチン、ダイゼイン、グリシテイン、ゲニステイン、プラテンセイン、シュードバプチゲニン、イリロン、又はプルネチン)を含むことでもよい。
アカツメクサの花乾燥物粉砕物100gに、精製水とエタノールの混合液(1:1)を1000g加え、40℃で2時間抽出し、これを濾過して、褐色透明のアカツメクサ花抽出物(固形分濃度1.28%)947gを得た。
アカツメクサの花乾燥物粉砕物100gに、精製水とエタノールの混合液(7:3)を1000g加え、40℃で2時間抽出し、これを濾過して、褐色透明のアカツメクサ花抽出物(固形分濃度1.30%)950gを得た。
水洗したアカツメクサの花乾燥物粉砕物100gに、精製水とエタノールの混合液(1:1)を1000g加え、室温で4日間抽出し、抽出液を濾過して、褐色透明のアカツメクサ花抽出物(固形分濃度1.43%)962gを得た。
アカツメクサの花乾燥物粉砕物100gに、精製水と1,3-プロパンジオールの混合液(3:7)を1000g加え、室温で4日間抽出し、抽出液を濾過して、褐色透明のアカツメクサ花抽出物(固形分濃度1.31%)918gを得た。
アカツメクサの花乾燥物粉砕物100gに、精製水を1000g加え、40℃で2時間抽出し、これを濾過して、褐色透明のアカツメクサ花抽出物(固形分濃度1.66%)938gを得た。
[定量法]
製造例1~3及び比較製造例1の抽出液2.0gを精密に量り、70%エタノール水溶液に溶かして正確に10mLとし、試料溶液とした。試料溶液10μLを正確にとり、次の試験条件で液体クロマトグラフィー(HPLC)により試験を行った。予め作成した検量線から、本品中のフォルモノネチンおよびバイオカニンAの含量(%)を算出した。
本品中のフォルモノネチン又はバイオカニンAの含量(ppm)=検量線より求めた試料溶液中の成分量の含量(ppm)×(2/本品の採取量(g))×5
[検量線の作成]
定量用のフォルモノネチン、及びバイオカニンAの約10.0mgを精密に量り、70%エタノール水溶液に溶かして正確に100mLとし、これを標準原液とした。次に、標準原液から1mLと2mLを各々正確に量り、70%エタノール水溶液を加えて正確に10mLとし、標準溶液とした。標準原液を試料溶液と同一条件で、液体クロマトグラフィーにより試験を行う.得られたクロマトグラムから,横軸にピーク面積,縦軸に標準溶液中の標準品の濃度(w/v%)とし、検量線を作成した。
[試験条件]
(1)検出器:紫外吸光光度計(測定波長:255nm)
(2)カラム:内径4.6mm,長さ150mmのステンレス管に平均粒径5μmの液体クロマトグラフィー用オクタデシルシリル化シリカゲルを充填した。
(3)カラム温度:30℃付近の一定温度
(4)移動相A:アセトニトリル/ギ酸(100)混液(99.9:0.1)
(5)移動相B:水/ギ酸(100)混液(99.9:0.1)
(6)移動相の送液:移動相A及び移動相Bの混合比を次のように変えて濃度勾配を制御する。
(i)注入後の時間:0~40分,移動相A(Vol%):5→40, 移動相B(Vol%):95→60
(ii)注入後の時間:40~55分,移動相A(Vol%):40, 移動相B(Vol%):60
(8)流量:毎分1.0mL
(9)面積測定範囲:試料注入後55分間
正常ヒト表皮細胞を増殖添加剤含有Humedia-KG2[クラボウ社製]にて1×105個/mL調製し、96穴マイクロプレートに100μLを播種して、5%CO2、飽和水蒸気下、37℃で培養した。24時間培養後、HIF-1αが結合する塩基配列(HRE)を組み込んだホタルルシフェラーゼレポーターベクターおよび内部標準としてのウミシイタケルシフェラーゼを組み込んだベクター(Cignal HIF Pathway Reporter Assay Kit)[QIAGEN社製]を細胞へViaFectトランスフェクション試薬 (Promega) を用いて導入した。更に24時間後、製造例1~3の抽出物を試料溶液として培地に添加した。ここで、試料溶液は、培地中に対する溶液としての最終濃度が0.5%,1.0%となるように添加した。24時間後、細胞内容物を抽出し、細胞抽出液のルシフェラーゼ活性をルシフェラーゼアッセイシステム(Promega)を用い、ルミノメーター (Promega GloMax-Multi+Detection System)にて測定した。ホタルルシフェラーゼの測定値(HRE転写量)をウミシイタケルシフェラーゼの測定値 (細胞量) で割った数値を細胞あたりのHIF-1α転写活性作用とし、試料溶液の代わりに比較対照として50%1,3-ブチレングリコール(1.0%)を添加した区(コントロール)のHIF―1α転写活性作用を100としてその相対値を算出した。また、比較製造例1の抽出物とのHIF-1α転写活性作用を比較するために、同時にその抽出物について0.5%,1.0%の濃度にて試験を行った。
正常表皮角化細胞(NHEK(F))を8×103cell/wellで96ウェルプレートに播種後、HuMedia-KG2培地(倉敷紡績株式会社)を用いて、37℃で24時間培養した。培養後、当該培地に製造例1,2の抽出物を試料溶液として添加し、さらに、48時間培養した。ここで、試料溶液は、試験培地中の溶液としての最終濃度がそれぞれ0.5%,1.0%となるように添加した。培養終了後、MCSP抗体を用いた免疫的検出を行った。すなわち、PBS(-)洗浄後、細胞を15%中性緩衝ホルマリン液にて30分処理して固定、0.5%Triton X-100溶液で1時間浸透処理、5倍希釈ブロッキングワンP(ナカライテスク社)溶液で2時間処理によるブロッキングを行った後、MCSP抗体を添加し、室温で1時間静置した。次にPBS(-)洗浄し、蛍光ラベルした二次抗体を添加してさらに暗所で一定時間静置した。その後PBS(-)洗浄し、蛍光強度の測定を行った。まず、蛍光マイクロプレートリーダー(フルオロスキャンアセント、Thermo Fisher Scientific社製)を使用し、二次抗体の蛍光ラベル(Alexa Fluor488)をEx=485nm、Em=520nmで測定し、その後、Hoechst33342によるDNA染色を行い、Ex=355nm、Em=460nmの測定を行った。それぞれの試験区のAlexa Fluor488の蛍光強度をHoechst33342の蛍光強度で割ることで、MCSP発現量を求めた。試料溶液に代えて50%1,3-ブチレングリコール(1.0%)を添加した試料無添加の場合(コントロール)についても上記と同様の操作を行った。ここに得られたMCSP発現量に対する各試料添加時のMCSP発現量の相対値を求め、MCSP発現促進量(%)とした。
ヒト表皮モデル作製キットを使用して表皮細胞を培養カップに播種し、製造例1~2の抽出物を試料溶液としてそれぞれ1.0%含有した培地を添加して3週間培養した。培地は2日おきに交換した。培養終了後、切片を作成し、HE染色とMSCP蛍光免疫染色を行い、それぞれ光学顕微鏡と蛍光顕微鏡を用いて切片を観察した。また、試料溶液に代えて、50%1,3-ブチレングリコール(1.0%)を含む培地(コントロール)で培養した細胞と、比較製造例1の抽出物を含む培地(比較対象)で培養した細胞についても同様に観察を行った。
[成分] 部
オリーブ油 1.0
ポリオキシエチレン(5.5)セチルアルコール 5.0
ブチルパラベン 0.1
製造例1の抽出物 5.0
エタノール 5.0
グリセリン 5.0
1,3-ブチレングリコール 5.0
水酸化カリウム 適量
精製水 全量が100部となる量
香料 適量
処方例1に含まれる製造例1の抽出物に代えて、製造例2の抽出物5.0部を用いるほかは、処方例1と同様にして化粧水を得た。
処方例1に含まれる製造例1の抽出物に代えて、製造例3の抽出物5.0部を用いるほかは、処方例1と同様にして化粧水を得た。
処方例1に含まれる製造例1の抽出物に代えて、製造例4の抽出物5.0部を用いるほかは、処方例1と同様にして化粧水を得た。
[成分] 部
流動パラフィン 6.0
ヘキサラン 4.0
ホホバ油 1.0
ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノステアレート 1.0
親油型ステアリン酸グリセリル 1.0
大豆レシチン 1.5
製造例3の抽出物 3.0
L-アスコルビン酸-2-グルコシド 2.0
水酸化カリウム 0.5
グリセリン 3.0
1、3-ブチレングリコール 2.0
カルボキシメチルセルロース 0.3
ヒアルロン酸ナトリウム 0.01
精製水 全量が100部となる量
香料 適量
処方例5の成分中、製造例3の抽出物3.0に代えて、製造例1の抽出物3.0部を用いるほかは処方例5と同様にして乳液を得た。
処方例5の成分中、L-アスコルビン酸-2-グルコシド2.0部及び水酸化カリウム0.5部に代えてアルブチン3.0部を用いるほかは処方例5と同様にして乳液を得た。
処方例5の成分中、L-アスコルビン酸-2-グルコシド2.0部及び水酸化カリウム0.5部に代えてトラネキサム酸2.0部を用いるほかは処方例5と同様にして乳液を得た。
処方例5の成分中、L-アスコルビン酸-2-グルコシド2.0部及び水酸化カリウム0.5部に代えてニコチン酸アミド3.0部を用いるほかは処方例5と同様にして乳液を得た。
[成分] 部
製造例1の抽出物 10.0
エタノール 10.0
グリセリン 3.0
1、3-ブチレングリコール 2.0
メチルパラベン 0.2
クエン酸 0.1
クエン酸ナトリウム 0.3
カルボキシビニルポリマー 0.1
キサンタンガム 0.1
香料 適量
水酸化カリウム 適量
精製水 全量が100部となる量
[成分] 部
エタノール 2.0
グリセリン 5.0
1、3-ブチレングリコール 5.0
メチルパラベン 0.1
ヒアルロン酸 0.1
製造例3の抽出物 5.0
クエン酸 0.3
クエン酸ナトリウム 0.6
精製水 全量が100部となる量
処方例11の成分中、製造例3の抽出物5.0部に代えて製造例2の抽出物5.0部を用いるほかは処方例11と同様にしてエッセンスを得た。
[成分] 部
ステアリン酸 2.4
モノステアリン酸プロピレングリコール 2.0
セトステアリルアルコール 0.2
液状ラノリン 2.0
流動パラフィン 3.0
ミリスチン酸イソプロピル 8.5
プロピルパラベン 0.05
製造例1の抽出物 5.0
カルボキシメチルセルロースナトリウム 0.2
ベントナイト 0.5
プロピレングリコール 4.0
トリエタノールアミン 1.1
メチルパラベン 0.1
精製水 全量が100部となる量
酸化チタン 8.0
タルク 4.0
着色顔料 適量
[成分] 部
N-ラウロイルメチルアラニンナトリウム 25.0
ヤシ油脂肪酸カリウム液(40%) 26.0
ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド 3.0
メチルパラベン 0.1
製造例2の抽出物 5.0
1,3-ブチレングリコール 2.0
精製水 全量が100部となる量
[成分] 部
N-ヤシ油脂肪酸メチルタウリンナトリウム 10.0
ポリオキシエチレン(3)アルキルエーテル硫酸ナトリウム 20.0
ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン 10.0
ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド 4.0
メチルパラベン 0.1
クエン酸 0.1
製造例3の抽出物 2.0
1、3-ブチレングリコール 2.0
精製水 全量が100部となる量
[成分] 部
ポリオキシエチレン(10)硬化ヒマシ油 1.0
塩化ジステアリルジメチルアンモニウム 1.5
塩化ステアリルトリメチルアンモニウム 2.0
2-エチルヘキサン酸グリセリル 1.0
セタノール 3.2
ステアリルアルコール 1.0
メチルパラベン 0.1
製造例3の抽出物 2.0
1,3-ブチレングリコール 5.0
精製水 全量が100部となる量
Claims (2)
- フォルモノネチン及びバイオカニンAを有効成分として含むマメ科シャジクソウ属(Trifolium)に属するアカツメクサの花の水及び低級アルコールの抽出物又は水及び多価アルコールの抽出物を配合する皮膚の菲薄化改善剤であって、前記抽出物中にフォルモノネチンが40ppm以上含まれ、バイオカニンAが20ppm以上含まれることを特徴とする皮膚の菲薄化改善剤。
- フォルモノネチン及びバイオカニンAを有効成分として含むマメ科シャジクソウ属(Trifolium)アカツメクサの花の水及び低級アルコールの抽出物又は水及び多価アルコールの抽出物を配合する皮膚外用剤であって、前記抽出物中にフォルモノネチンが40ppm以上含まれ、バイオカニンAが20ppm以上含まれることを特徴とする皮膚外用剤。
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