KR20140110565A - 율피 추출물 또는 정제물을 유효성분으로 함유하는 피부노화의 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 율피 추출물 또는 정제물을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 율피 추출물 또는 정제물은 DPPH 라디칼 소거능, ABTS 라디칼 양이온 탈색(radical cation decolorization) 활성 증가, 수퍼옥시드 디스무타제 (Sueroxide dismutase; SOD) 유사활성 증가, 크산틴 옥시다제 (Xanthine oxidase) 저해활성 측정, 및 아질산염 소거능 저해활성이 탁월함을 확인함으로써, 상기 조성물을 피부노화의 예방 및 치료용 피부외용 약학조성물 또는 화장료 조성물로 유용하게 이용할 수 있다.

Description

율피 추출물 또는 정제물을 유효성분으로 함유하는 피부노화의 예방 및 치료용 조성물 {A composition comprising the inner shell extract or purified extract of Castane crenata S. et Z. for preventing and treating skin aging}

본 발명은 율피 추출물 또는 정제물을 유효성분으로 함유하는 피부노화의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

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비만세포는 피부, 호흡기, 위장관의 점막, 혈관 주위, 림프관 주위 등 전신의 장기에 분포하고 있으며 알레르기성 비염, 천식, 아토피성 피부염 등 알레르기 반응의 유발에 필수적인 세포로 알려져 있다 (Metcalfe DD, Kaliner M, Donlon MA. The mast cell. Crit. Rev. Immunol. 1981 ; 3 : 23-74.10). 비만세포는 세포막에 있는 여러 가지 수용체를 통해서 활성화된다 (Metzger H, Alcaraz G, Hohman R, Kinet JP, Pribluda V, Quarto R. The receptor with high affinity for immunoglobulin E. Annu. Rev. Immunol. 1986 ; 4 : 419-70). 비만세포의 탈과립을 유도하는 비만세포의 활성화는 IgE 수용체를 통한 자극외에 compound 48/80, protein kinase C (PKC) activator인 phorbol 12-myristate 13-acetate, calcium ionophore A23187 등이 있다(Chand N, Pillar J, Diamantis W, Perhach JL, Sophia RD. Inhibition of calcium ionophore(A23187) stimulated histamine release from rat peritoneal mast cells by azelastine: implications for its mode of action. Eur. J. Pharmacol. 1983 ; 96 : 227-33;11; Takei M, Umeyama A, Shoji N, Arihara S, Endo K. Mechanism of inhibition of IgE-dependent histamine release from rat mast cells by penasterol and penasterone. J. Pharm. Sci. 1995 ; 84 : 228-30.). 비만세포의 탈과립을 유도하는 자극에 의해 과립내에 저장되어 있는 히스타민을 비롯한 화학적 매개물질이 유리되고 이 매개물질에 의해 말초혈관의 투과성 항진과 확장작용, 기관지 평활근에 대한 확장작용, 점막표면에 대한 선세포의 분비 항진작용 등을 일으켜 알레르기 반응이 발현된다. 비만세포로부터 유리되는 화학적 매개물질 외에 염증성 사이토카인인 tumor necrosis factor (TNF)-α, Interleukin (IL)-1β, IL-6, IL-8 등이 이러한 알레르기성 염증반응의 유도에 결정적인 역할을 하는 인자로 알려지고 있다 (Galli SJ, Gordon JR, Wershil BK. Cytokine production by mast cells and basophils. Curr. Opin. Immunol.1991 ; 3 : 865-72;13. Galli SJ, Tsai M, Piliponsky AM. The development of allergic inflammation. Nature 2008 ; 454 : 445-54). 알레르기 반응에는 비만세포를 포함하는 다양한 면역세포가 관여하는데 이들 세포는 TNF-α, IL-6 등과 같은 염증성 사이토카인을 분비한다 (Arend WP, Dayer JM. Inhibition of the production and effect of interleukin-1 and tumor necrosis factor alpha in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 1995 ; 38 : 151-60). TNF-α는 비만세포가 활성되면 분비하는 다기능성 사이토카인으로 면역반응과 염증반응에 관여하며, IL-1β, IL-6, IL-8과 같은 다른 염증성 사이토카인의 분비를 촉진한다 ( Barnes PJ, Adcock I. Anti-inflammatory actions of steroids: molecular mechanisms. Trends Pharmacol. Sci. 1993 ; 14 : 436-41;25; Butler DM, Maini RN, Feldmann M, Brennan FM. Modulation of proinflammatory cytokine release in rheumatoid synovial membrane cell cultures. Comparison of monoclonal anti TNF-a antibody with the IL-1 receptor antagonist. Eur. Cytokine Netw. 1995 ; 6 ; 225-30). IL-6 역시 강력한 염증반응을 매개하는 사이토카인이며 (Erchler WB, Keller ET. Age-associated increased IL-6 gene expression, late-life diseases, and frailty. Annu. Rev. Med. 2000 ; 51 : 245-70), IL-8은 호중구, 림프구, 호산구의 동원을 촉진하는 화학주성인자로서, 호중구를 활성화시켜 리소좀 효소를 방출하고 활성산호 생산을 유발하며, 관절염이나 패혈증 등과 같은 염증성 질환에 관여한다 (Harada A, Mukaida N, Matsushima K. IL-8 as a novel target for intervention theraphy in acute inflammatory disease. Mol. Med. Today. 1996 ; 2 : 482-9).

전사인자인 mitogenactivated protein kinase (MAPK)와 NF-κB는 세포활성, 염증과 같은 다양한 세포내 반응을 조절하는 인자로서 특히 TNF-α, IL-1β, IL-6 및 IL-8와 같은 염증유발 사이토카인의 발현을 조절하고 세포외부로부터의 자극을 세포내부로 전달하는 역할을 주로 담당한다고 알려져 있다(Galli SJ, Kalesnikoff J, Grimbaldeston MA, Piliponsky AM, Williams CM, Tsai M. Mast cells as “tunable” effector and immunoregulatory cells: recent advances. Annu. Rev. Immunol. 2005 ; 23 : 749-86; Azzolina A, Bongiovanni A, Lampiasi N. Substance p induces TNF-α and IL-6 production through NFκB in peritoneal mast cells. Biochim. Biophys. Acta. 2003 ; 1643 : 75-83; Kim SH, Jun CD, Suk K, Choi BJ, Lim H, Park S, Lee SH, Shin HY, Kim DK, Shin TY. Gallic acid inhibits histamine release and pro-inflammatory cytokine production in mast cells. Toxicol. Sci. 2006 ; 91 : 123-31).

PKC (protein kinase C)는 세포활성과 기능에 주요한 역할을 하고 있는 것으로 여러 연구를 통해 알려져있다 (Spitaler M, Cantrell DA. Protein kinase C and beyond. Nature immunology. 2004 ; 5 : 785-90). 특히 면역반응에 있어서 림프구의 생존과 활성 분화 등 많은 부분에서 중요한 역할을 하고 있다. 예를들면 PKC는 B 세포와 관련한 면역 반응에 관여하는 것으로 알려져 있으며 B 세포 수용체의 자극을 통한 B 세포 활성에도 관여하며, PKC가 B 세포 면역반응을 특이적으로 조절하는 기전이 밝혀지면서 B 세포와 관련된 자가면역질환 치료를 위한 새로운 표적 신호전달분자로 제시되고 있다 (Tan SL, Parker PJ. Emerging and diverse roles of protein kinase C in immune cell signaling. Biochem J. 2003 ; 376 : 545-52). 따라서 비만세포로부터 이들 사이토카인의 분비에 대한 조절은 알레르기 염증성 질환에 대한 치료 수단이 될 수 있다.

예로부터 제수용품, 기호식품 등으로 사용되어 온 밤(Castane crenata S. et Z.)은 다년생 나무인 밤나무(Castane crenata Lieb. et. Zucc)의 열매로 갈색의 껍질로 쌓여있으며 종피를 벗긴 종자를 건조해 사용하는데 과육은 대부분 전분이고 소량의 단백질과 지방을 함유하고 있다 (Kim MJ, Lee u, Hwang MS, Kim SC, Lee MH. Blooming, fructification and nut characteristics of chestnut cultivars cultivated in korea. Jour. Koreanf For. Soc 2003 ; 92 : 321-32). 이를 한약재로 건율(乾栗), 황율(黃栗)이라 한다. 한의학적으로 건율(乾栗)의 성질은 평(平)하고 맛은 달면서 약간의 짠 맛이 있다. 건율은 원기를 보하며 비위의 기능을 좋게 하고 강건하게 하여 소화불량, 설사를 치료해 준다. 지혈 효능도 있어 토혈, 코피, 혈변에 사용되기도 했다. 어혈을 풀어주는 효능이 있어 근육이나 인대 손상으로 통증이 있으면서 부어오르고 울혈된 경우 건율을 찧어 환부에 붙이면 일정한 효과가 있다. 또한 건율은 맛이 달아서 근육 경련을 가라앉히고 진정 작용을 하며 호흡기를 보하고 기침을 그치게 하는 효능도 있어 만성 기침에 응용하면 도움이 된다. 체질적으로 보면 건율은 체형이 크고 성격이 과묵하며 유난히 땀이 많은 태음인에 좋다. 밤의 딱딱한 껍질을 율각(栗殼)이라고 하는데, 염료로도 사용하고 당뇨병에 의한 갈증을 해소해 준다. 밤나무의 잎은 옻독이나 피부병으로 가려울 때, 습진으로 진물이 날 때 끓인 물로 씻으면 도움이 된다 (Kim CM, Lee JS, An DK, Sim MK. The encyclopedia of China oriental herbal medicine. 1st rev. ed. Seoul : Jungdamsa. 2006. 4372-4373).

밤 가공에서 수작업에 의해 발생되는 율피의 비율은 약 50%로 밤 생산량의 약 30% 이상을 가공, 수출하고 있는 실정을 감안할 때 폐기량은 무시할 수 없는 양이지만 부산물로서 산업 이용도가 개발되지 않아 대부분 폐기처분하고 있으나 (Moon JS. A study of physicochemical properties of starch separated from chestnut inner shell waste. Dongshin University. 1999), 활성산소의 생성을 억제하고 피부 멜라닌 형성을 저해하여 피부미백에 효과가 있음이 항산화 연구를 통하여 밝혀졌으며, 이에 본 연구는 한방화장품의 염증개선 화장품소재로 활용 가능성을 확인하고자 율피 추출물 및 용매 분획물의 염증성 사이토카인 분비량을 측정하였다.

지금까지 상기 문헌 어디에서도 율피 추출물로부터 분리된 정제 분획물이 피부노화 예방 및 치료 효과를 위한 조성물로서 사용가능하다고 교시되거나 기재된 바 없다.

이에 본 발명자는 율피 추출물 또는 정제물은 DPPH 라디칼 소거능, ABTS 라디탈 양이온 탈색(radical cation decolorization) 활성 증가, 수퍼옥시드 디스무타제 (Sueroxide dismutase; SOD) 유사활성 증가 활성이 탁월함을 확인함으로써, 상기 조성물을 피부노화의 예방 및 치료용 피부외용 약학조성물 또는 화장료 조성물로 유용하게 이용을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 율피 추출물 또는 정제물을 유효성분으로 함유하는 피부노화 치료 및 예방용 피부외용 약학조성물을 제공한다.

본원에서 정의되는 "피부노화"는 주름살, 기미, 주근깨, 자외선에 의한 피부 손상, 피부암, 바람직하게는 자외선에 의한 피부 손상을 포함한다.

상기 추출물은 피부외용 약학조성물은 총 중량에 대하여 0.1 내지 50 중량%으로 포함함을 특징으로 한다.

상기 약학 조성물은 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 제형을 포함한다.

또한, 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 율피 추출물 또는 정제물을 유효성분으로 함유하는 피부노화 개선 및 예방용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 상기 화장료 조성물은 화장수, 스킨, 로션, 영양로션, 영양크림, 마사지 크림, 에센스, 팩의 제형을 포함한다.

본원에서 정의되는 율피 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올, 아세톤, 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 물, 에탄올, 아세톤 또는 이들의 혼합용매, 보다 바람직하게 물 및 에탄올 혼합용매 또는 아세톤, 보다 더 바람직하게는 30 내지 90% 물 및 에탄올 혼합용매 또는 아세톤, 가장 바람직하게는 아세톤에 추출가능한 추출물,

구체적으로, 건조 율피를 세척 및 세절 후 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올, 아세톤, 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는, 물, 에탄올, 아세톤 또는 이들의 혼합용매, 보다 바람직하게물 및 에탄올 혼합용매 또는 아세톤, 보다 더 바람직하게는 30 내지 90% 물 및 에탄올 혼합용매 또는 아세톤, 가장 바람직하게는, 아세톤을 수회 섞은 다음에 0℃ 내지 150℃, 바람직하게는 20℃ 내지 100℃의 온도에서 30분내지 72시간, 바람직하게는 12시간 내지 48시간 동안 초음파 추출법, 열수 추출법, 상온 추출법 또는 환류추출법, 바람직하게는 상온 추출법을 약 1 내지 20회, 바람직하게는 2 내지 10회 반복 수행하여 얻은 추출액을 여과, 감압 농축, 및 건조하는 단계를 통하여 수득한 추출물을 포함한다.

본원에서 정의되는 율피 정제물은 상기 율피 추출물을 클로로포름(chlorform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), n-부탄올(butanol) 및 물(water) 분획으로 분획하는 제 1단계; 상기 n-부탄올(butanol)을 Diaion HP-20 column chromatography (H₂O : EtOH = 0→ 100%)를 이용하여 Fraction (Fr) 1번부터 Fr. 6번까지 Fr. 1 (CIeB1), Fr. 2 (CIeB2), Fr. 3 (CIeB3), Fr. 4 (CIeB4), Fr. 5 (CIeB5), 및 6개 분획을 분획하는 제 2단계; 상기 2단계 공정의 Fr. 3 (CIeB3) 정제물을 감암농축 및 건조하는 제 3단계 공정을 통하여 수득된, HPLC 상에서 (HPLC 조건: 컬 럼 : YMC ODS-A 150×4.6 C18 Column (4㎛), 150×4.6 ㎜, Waters; 이동상 : Solvent A: MeOH; Solvent B: Water in 1% HCOOH; 검출기 : 자외부흡광광도계 (UV 280㎚); 유 속 : 1.0㎖/min; 시료 농도 : 1mg/ml; 컬럼 온도 : 40℃)에서 2~4분사이 피크(peak)에서 검출됨을 특징으로 하는 Fr. 3번째 분획 정제물(CIeB3)을 포함한다.

상기 제조방법으로 제조된 추출물 또는 정제물은 DPPH 라디칼 소거능, ABTS 라디칼 양이온 탈색(radical cation decolorization) 활성 증가, 수퍼옥시드 디스무타제 (Sueroxide dismutase; SOD) 유사활성 증가활성이 탁월함을 확인함으로써, 상기 조성물을 피부노화의 예방 및 치료용 피부외용 약학조성물 또는 화장료 조성물로 유용하게 이용을 확인하였다.

상기 추출물 또는 정제물은 피부외용 약학조성물은 총 중량에 대하여 0.1 내지 50 중량%으로 포함함을 특징으로 한다.

상기 약학 조성물은 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 제형을 포함한다.

또한, 상기 화장료 조성물은 화장수, 스킨, 로션, 영양로션, 영양크림, 마사지 크림, 에센스, 팩의 제형을 포함한다.

따라서 본원 발명은 하기 제조방법 및 상기 제조방법으로 수득된 추출물 또는 정제물을 유효성분으로 함유하는 피부노화 치료 및 예방용 피부외용 약학 조성물 및 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명의 율피는 오랫동안 생약 및 식용으로 사용되어 오던 식품으로서 이들로부터 추출된 본 발명의 추출물 역시 독성 및 부작용 등의 문제가 없으며, 피부 첩포 시험에서 무자극 시료임이 입증되었으므로 장기간 사용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명의 추출물 또는 정제물을 함유하는 피부외용 약학조성물은 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제의 피부 외용제 형태의 약학조성물로 제조하여 사용할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 추출물 또는 정제물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물 또는 정제물은 1일 0.0001 내지 100 ㎎/㎏으로, 바람직하게는 0.001 내지 10 ㎎/㎏으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 추출물 또는 정제물은 피부노화 방지 효과를 갖는 화장품 및 세안제 등에 다양하게 이용될 수 있다.

본 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 화장수, 스킨, 로션, 영양로션, 영양크림, 맛사지크림, 에센스, 팩 등과 같은 화장품류와 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 미용액 등이 있다.

본 발명의 화장료는 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 조성물을 포함한다.

수용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B6, 피리독신, 염산피리독신, 비타민 B12, 판토텐산, 니코틴산, 니코틴산아미드, 엽산, 비타민 C, 비타민 H 등을 들 수 있으며, 그들의 염 (티아민염산염, 아스코르빈산나트륨염 등)이나 유도체 (아스코르빈산-2-인산나트륨염, 아스코르빈산-2-인산마그네슘염 등)도 본 발명에서 사용할 수 있는 수용성 비타민에 포함된다. 수용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 수득할 수 있다.

유용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 A, 카로틴, 비타민 D2, 비타민 D3, 비타민 E (d1-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤) 등을 들 수 있으며, 그들의 유도체 (팔미틴산아스코르빈, 스테아르산아스코르빈, 디팔미틴산아스코르빈, 아세트산 dl-알파 토코페롤, 니코틴산 dl-알파 토코페롤비타민 E, dl-판토테닐알코올, D-판토테닐알코올, 판토테닐에틸에테르 등) 등도 본 발명에서 사용되는 유용성 비타민에 포함된다. 유용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 취득할 수 있다.

고분자 펩티드로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 콜라겐, 가수 분해 콜라겐, 젤라틴, 엘라스틴, 가수 분해 엘라스틴, 케라틴 등을 들 수 있다. 고분자 펩티드는 미생물의 배양액으로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 정제 취득할 수 있으며, 또는 통상 돼지나 소 등의 진피, 누에의 견섬유 등의 천연물로부터 정제하여 사용할 수 있다.

고분자 다당으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 히드록시에틸셀룰로오스, 크산탄검, 히알루론산나트륨, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 (나트륨염 등) 등을 들 수 있다. 예를 들어, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 등은 통상 포유동물이나 어류로부터 정제하여 사용할 수 있다.

스핑고 지질로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 세라미드, 피토스핑고신, 스핑고당지질 등을 들 수 있다. 스핑고 지질은 통상 포유류, 어류, 패류, 효모 또는 식물 등으로부터 통상의 방법에 의해 정제하거나 화학 합성법에 의해 취득할 수 있다.

해초 엑기스로는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 갈조 엑기스, 홍조 엑기스, 녹조 엑기스 등을 들 수 있으며, 또, 이들의 해초 엑기스로부터 정제된 칼라기난, 아르긴산, 아르긴산나트륨, 아르긴산칼륨 등도 본 발명에서 사용되는 해초 엑기스에 포함된다. 해초 엑기스는 해초로부터 통상의 방법에 의해 정제하여 취득할 수 있다.

본 발명의 화장료에는 상기 필수 성분과 더불어 필요에 따라 통상 화장료에 배합되는 다른 성분을 배합해도 된다.

이외에 첨가해도 되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.

유지 성분으로서는 에스테르계 유지, 탄화수소계 유지, 실리콘계 유지, 불소계 유지, 동물 유지, 식물 유지 등을 들 수 있다.

에스테르계 유지로서는 트리2-에틸헥산산글리세릴, 2-에틸헥산산세틸, 미리스틴산이소프로필, 미리스틴산부틸, 팔미틴산이소프로필, 스테아르산에틸, 팔미틴산옥틸, 이소스테아르산이소세틸, 스테아르산부틸, 리놀레산에틸, 리놀레산이소프로필, 올레인산에틸, 미리스틴산이소세틸, 미리스틴산이소스테아릴, 팔미틴산이소스테아릴, 미리스틴산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 세바신산디에틸, 아디핀산디이소프로필, 네오펜탄산이소알킬, 트리(카프릴, 카프린산)글리세릴, 트리2-에틸헥산산트리메틸롤프로판, 트리이소스테아르산트리메틸롤프로판, 테트라2-에틸헥산산펜타엘리슬리톨, 카프릴산세틸, 라우린산데실, 라우린산헥실, 미리스틴산데실, 미리스틴산미리스틸, 미리스틴산세틸, 스테아르산스테아릴, 올레인산데실, 리시노올레인산세틸, 라우린산이소스테아릴, 미리스틴산이소트리데실, 팔미틴산이소세틸, 스테아르산옥틸, 스테아르산이소세틸, 올레인산이소데실, 올레인산옥틸도데실, 리놀레산옥틸도데실, 이소스테아르산이소프로필, 2-에틸헥산산세토스테아릴, 2-에틸헥산산스테아릴, 이소스테아르산헥실, 디옥탄산에틸렌글리콜, 디올레인산에틸렌글리콜, 디카프린산프로필렌글리콜, 디(카프릴,카프린산)프로필렌글리콜, 디카프릴산프로필렌글리콜, 디카프린산네오펜틸글리콜, 디옥탄산네오펜틸글리콜, 트리카프릴산글리세릴, 트리운데실산글리세릴, 트리이소팔미틴산글리세릴, 트리이소스테아르산글리세릴, 네오펜탄산옥틸도데실, 옥탄산이소스테아릴, 이소노난산옥틸, 네오데칸산헥실데실, 네오데칸산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 이소스테아르산이소스테아릴, 이소스테아르산옥틸데실, 폴리글리세린올레인산에스테르, 폴리글리세린이소스테아르산에스테르, 시트르산트리이소세틸, 시트르산트리이소알킬, 시트르산트리이소옥틸, 락트산라우릴, 락트산미리스틸, 락트산세틸, 락트산옥틸데실, 시트르산트리에틸, 시트르산아세틸트리에틸, 시트르산아세틸트리부틸, 시트르산트리옥틸, 말산디이소스테아릴, 히드록시스테아르산 2-에틸헥실, 숙신산디2-에틸헥실, 아디핀산디이소부틸, 세바신산디이소프로필, 세바신산디옥틸, 스테아르산콜레스테릴, 이소스테아르산콜레스테릴, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 올레인산콜레스테릴, 올레인산디히드로콜레스테릴, 이소스테아르산피트스테릴, 올레인산피트스테릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소세틸, 12-스테알로일히드록시스테아르산스테아릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소스테아릴 등의 에스테르계 등을 들 수 있다.

탄화 수소계 유지로서는 스쿠알렌, 유동 파라핀, 알파-올레핀올리고머, 이소파라핀, 세레신, 파라핀, 유동 이소파라핀, 폴리부덴, 마이크로크리스탈린왁스, 와셀린 등의 탄화 수소계 유지 등을 들 수 있다.

실리콘계 유지로서는 폴리메틸실리콘, 메틸페닐실리콘, 메틸시클로폴리실록산, 옥타메틸폴리실록산, 데카메틸폴리실록산, 도데카메틸시클로실록산, 디메틸실록산ㆍ메틸세틸옥시실록산 공중합체, 디메틸실록산ㆍ메틸스테알록시실록산 공중합체, 알킬 변성 실리콘유, 아미노 변성 실리콘유 등을 들 수 있다.

불소계 유지로서는 퍼플루오로폴리에테르 등을 들 수 있다.

동물 또는 식물 유지로서는 아보카도유, 아르몬드유, 올리브유, 참깨유, 쌀겨유, 새플라워유, 대두유, 옥수수유, 유채유, 행인(杏仁)유, 팜핵유, 팜유, 피마자유, 해바라기유, 포도종자유, 면실유, 야자유, 쿠쿠이너트유, 소맥배아유, 쌀 배아유, 시아버터, 월견초유, 마커데이미아너트유, 메도홈유, 난황유, 우지(牛脂), 마유, 밍크유, 오렌지라피유, 호호바유, 캔데리러왁스, 카르나바왁스, 액상 라놀린, 경화피마자유 등의 동물 또는 식물 유지를 들 수 있다.

보습제로서는 수용성 저분자 보습제, 지용성 분자 보습제, 수용성 고분자, 지용성 고분자 등을 들 수 있다.

수용성 저분자 보습제로서는 세린, 글루타민, 솔비톨, 만니톨, 피롤리돈-카르복실산나트륨, 글리세린, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜B(중합도 n = 2 이상), 폴리프로필렌글리콜(중합도 n = 2 이상), 폴리글리세린B(중합도 n = 2 이상), 락트산, 락트산염 등을 들 수 있다.

지용성 저분자 보습제로서는 콜레스테롤, 콜레스테롤에스테르 등을 들 수 있다.

수용성 고분자로서는 카르복시비닐폴리머, 폴리아스파라긴산염, 트라가칸트, 크산탄검, 메틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 수용성 키틴, 키토산, 덱스트린 등을 들 수 있다.

지용성 고분자로서는 폴리비닐피롤리돈ㆍ에이코센 공중합체, 폴리비닐피롤리돈ㆍ헥사데센 공중합체, 니트로셀룰로오스, 덱스트린지방산에스테르, 고분자 실리콘 등을 들 수 있다.

에몰리엔트제로서는 장쇄아실글루타민산콜레스테릴에스테르, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 12-히드록시스테아르산, 스테아르산, 로진산, 라놀린지방산콜레스테릴에스테르 등을 들 수 있다.

계면 활성제로서는 비이온성 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제, 양이온성 계면 활성제, 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

비이온성 계면 활성제로서는 자기 유화형 모노스테아르산글리세린, 프로필렌글리콜지방산에스테르, 글리세린지방산에스테르, 폴리글리세린지방산에스테르, 솔비탄지방산에스테르, POE (폴리옥시에틸렌)솔비탄지방산에스테르, POE 솔비트지방산에스테르, POE 글리세린지방산에스테르, POE 알킬에테르, POE 지방산에스테르, POE 경화피마자유, POE 피마자유, POEㆍPOP (폴리옥시에틸렌ㆍ폴리옥시프로필렌) 공중합체, POEㆍPOP 알킬에테르, 폴리에테르변성실리콘, 라우린산알카놀아미드, 알킬아민옥시드, 수소첨가대두인지질 등을 들 수 있다.

음이온성 계면 활성제로서는 지방산비누, 알파-아실술폰산염, 알킬술폰산염, 알킬알릴술폰산염, 알킬나프탈렌술폰산염, 알킬황산염, POE 알킬에테르황산염, 알킬아미드황산염, 알킬인산염, POE 알킬인삼염, 알킬아미드인산염, 알킬로일알킬타우린염, N-아실아미노산염, POE 알킬에테르카르복실산염, 알킬술포숙신산염, 알킬술포아세트산나트륨, 아실화 가수분해 콜라겐펩티드염, 퍼플루오로알킬인산에스테르 등을 들 수 있다.

양이온성 계면 활성제로서는 염화알킬트리메틸암모늄, 염화스테아릴트리메틸암모늄, 브롬화스테아릴트리메틸암모늄, 염화세토스테아릴트리메틸암모늄, 염화디스테아릴디메틸암모늄, 염화스테아릴디메틸벤질암모늄, 브롬화베헤닐트리메틸암모늄, 염화벤잘코늄, 스테아르산디에틸아미노에틸아미드, 스테아르산디메틸아미노프로필아미드, 라놀린 유도체 제 4급 암모늄염 등을 들 수 있다.

양성 계면 활성제로서는 카르복시베타인형, 아미드베타인형, 술포베타인형, 히드록시술포베타인형, 아미드술포베타인형, 포스포베타인형, 아미노카르복실산염형, 이미다졸린 유도체형, 아미드아민형 등의 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

유기 및 무기 안료로서는 규산, 무수규산, 규산마그네슘, 탤크, 세리사이트, 마이카, 카올린, 벵갈라, 클레이, 벤토나이트, 티탄피막운모, 옥시염화비스무트, 산화지르코늄, 산화마그네슘, 산화아연, 산화티탄, 산화알루미늄, 황산칼슘, 황산바륨, 황산마그네슘, 탄산칼슘, 탄산마그네슘, 산화철, 군청, 산화크롬, 수산화크롬, 칼라민 및 이들의 복합체등의 무기 안료 ; 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리우레탄, 비닐수지, 요소수지, 페놀수지, 불소수지, 규소수지, 아크릴수지, 멜라민수지, 에폭시수지, 폴리카보네이트수지, 디비닐벤젠ㆍ스티렌 공중합체, 실크파우더, 셀룰로오스, CI 피그먼트옐로우, CI 피그먼트오렌지 등의 유기 안료 및 이들의 무기 안료와 유기 안료의 복합 안료 등을 들 수 있다.

유기 분체로서는 스테아르산칼슘 등의 금속비누 ; 세틸린산아연나트륨, 라우릴린산아연, 라우릴린산칼슘 등의 알킬인산금속염 ; N-라우로일-베타-알라닌칼슘, N-라우로일-베타-알라닌아연, N-라우로일글리신칼슘 등의 아실아미노산 다가금속염 ; N-라우로일-타우린칼슘, N-팔미토일-타우린칼슘 등의 아미드술폰산 다가금속염 ; N-엡실론-라우로일-L-리진, N-엡실론-팔미토일리진, N-알파-파리토일올니틴, N-알파-라우로일아르기닌, N-알파-경화우지지방산아실아르기닌 등의 N-아실염기성아미노산 ; N-라우로일글리실글리신 등의 N-아실폴리펩티드 ; 알파-아미노카프릴산, 알파-아미노라우린산 등의 알파-아미노지방산 ; 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리스티렌, 디비닐벤젠ㆍ스티렌 공중합체, 사불화에틸렌 등을 들 수 있다.

자외선 흡수제로서는 파라아미노벤조산, 파라아미노벤조산에틸, 파라아미노벤조산아밀, 파라아미노벤조산옥틸, 살리실산에틸렌글리콜, 살리신산페닐, 살리신산옥틸, 살리신산벤질, 살리신산부틸페닐, 살리신산호모멘틸, 계피산벤질, 파라메톡시계피산-2-에톡시에틸, 파라메톡시계피산옥틸, 디파라메톡시계피산모노-2-에틸헥산글리세릴, 파라메톡시계피산이소프로필, 디이소프로필ㆍ디이소프로필계피산에스테르 혼합물, 우로카닌산, 우로카닌산에틸, 히드록시메톡시벤조페논, 히드록시메톡시벤조페논술폰산 및 그 염, 디히드록시메톡시벤조페논, 디히드록시메톡시벤조페논디술폰산나트륨, 디히드록시벤조페논, 테트라히드록시벤조페논, 4-tert-부틸-4'-메톡시디벤조일메탄, 2,4,6-트리아닐리노-p-(카르보-2'-에틸헥실-1'-옥시)-1,3,5-트리아진, 2-(2-히드록시-5-메틸페닐)벤조트리아졸 등을 들 수 있다.

살균제로서는 히노키티올, 트리클로산, 트리클로로히드록시디페닐에테르, 크로르헥시딘글루콘산염, 페녹시에탄올, 레조르신, 이소프로필메틸페놀, 아줄렌, 살리칠산, 진크필리티온, 염화벤잘코늄, 감광소 301 호, 모노니트로과이어콜나트륨, 운데시렌산 등을 들 수 있다.

산화 방지제로서는 부틸히드록시아니솔, 갈릭산프로필, 엘리소르빈산 등을 들 수 있다.

pH 조정제로서는 시트르산, 시트르산나트륨, 말산, 말산나트륨, 프말산, 프말산나트륨, 숙신산, 숙신산나트륨, 수산화나트륨, 인산일수소나트륨 등을 들 수 있다.

알코올로서는 세틸알코올 등의 고급 알코올을 들 수 있다.

또한, 이외에 첨가해도 되는 배합 성분은 이에 한정되는 것은 아니며, 또, 상기 어느 성분도 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 배합 가능하지만, 총중량에 대하여 바람직하게는 0.01 - 5 % 중량, 보다 바람직하게는 0.01 - 3 % 중량로 배합된다.

본 발명의 화장료는 용액, 유화물, 점성형 혼합물 등의 형상을 취할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 상기 화합물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함한다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어 유액, 크림, 화장수, 팩, 파운데이션, 로션, 미용액, 모발화장료 등을 들 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클린저의 제형을 포함한다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

상기에 언급한 바와 같이, 본 발명의 율피 추출물 또는 정제물은 DPPH 라디칼 소거능, ABTS 라디칼 양이온 탈색(radical cation decolorization) 활성 증가, 수퍼옥시드 디스무타제 (Sueroxide dismutase; SOD) 유사활성 증가활성이 탁월함을 확인함으로써, 상기 조성물을 피부노화의 예방 및 치료용 피부외용 약학조성물 또는 화장료 조성물로 유용하다.

도 1는 율피로부터의 추출공정을 나타낸 도이며;
도 2는 율피 70% 에탄올 추출물로부터 각 분획물의 분리 공정을 나타난 도이며;
도 3는 CIe 추출물의 n-BuOH 분획물로부터 정제물을 분리하는 공정을 나타난 도이며;
도 4는 CIe 추출물의 HPLC 데이타를 나타난 도이며;
도 5는 CI 추출물의 전자공여능을 나타낸 도이며(BHA : Butylated hydroxyanisole (positive control)이며, 결과는 3중치의 평균(means) ± S.D.으로 표시함);
도 6는 CIeB 추출물로부터 얻은 분획물들의 전자공여능을 나타낸 도이며(BHA : Butylated hydroxyanisole (positive control)이며, 결과는 3중치의 평균(means) ± S.D.으로 표시함);
도 7는 CI 추출물의 ABTS+ 양이온 라디칼 소거 활성을 나타낸 도이며(BHA : Butylated hydroxyanisole (positive control)이며, 결과는 3중치의 평균(means) ± S.D.으로 표시함);
도 8는 CIe 추출물로부터 얻은 분획물들의 ABTS+ 양이온 라디칼 소거 활성을 나타낸 도이며(BHA : Butylated hydroxyanisole (positive control)이며, 결과는 3중치의 평균(means) ± S.D.으로 표시함);
도 9는 CIeB 추출물로부터 얻은 분획물들의 ABTS+ 양이온 라디칼 소거 활성을 나타낸 도이며(BHA : Butylated hydroxyanisole (positive control)이며, 결과는 3중치의 평균(means) ± S.D.으로 표시함);
도 10는 CI 추출물의 수퍼옥시드 음이온 (O2-) 라디칼 소거 활성을 나타낸 도이며(BHA : Butylated hydroxyanisole (positive control)이며, AA : 아스크로빈산(Ascorbic acid, 양성 대조군이며, 결과는 3중치의 평균(means) ± S.D.으로 표시함);
도 11는 CIe 추출물로부터 얻은 분획물들의 수퍼옥시드 음이온 (O2-) 라디칼 소거 활성을 나타낸 도이며(BHA : Butylated hydroxyanisole (positive control)이며, AA : 아스크로빈산(Ascorbic acid, 양성 대조군이며, 결과는 3중치의 평균(means) ± S.D.으로 표시함);
도 12는 CIe 추출물로부터 얻은 분획물들의 수퍼옥시드 음이온 (O2-) 라디칼 소거 활성을 나타낸 도이며(BHA : Butylated hydroxyanisole (positive control)이며, AA : 아스크로빈산(Ascorbic acid, 양성 대조군이며, 결과는 3중치의 평균(means) ± S.D.으로 표시함);
도 13는 CIeB 추출물로부터 얻은 분획물들의 수퍼옥시드 음이온 (O2-) 라디칼 소거 활성을 나타낸 도이며(BHA : Butylated hydroxyanisole (positive control)이며, AA : 아스크로빈산(Ascorbic acid, 양성 대조군이며, 결과는 3중치의 평균(means) ± S.D.으로 표시함);
도 14는 CIe 추출물로부터 얻은 분획물들의 수소 과산화물 소거 활성을 나타낸 도이며(BHA : Butylated hydroxyanisole (positive control)이며, AA : 아스크로빈산(Ascorbic acid, 양성 대조군이며, 결과는 3중치의 평균(means) ± S.D.으로 표시함);
도 15는 CIe 추출물로부터 얻은 분획물들의 수소 과산화물 소거 활성을 나타낸 도이며(BHA : Butylated hydroxyanisole (positive control)이며, AA : 아스크로빈산(Ascorbic acid, 양성 대조군이며, 결과는 3중치의 평균(means) ± S.D.으로 표시함);
도 16는 CIeB 추출물로부터 얻은 분획물들의 수소 과산화물 소거 활성을 나타낸 도이다(BHA : Butylated hydroxyanisole (positive control)이며, AA : 아스크로빈산(Ascorbic acid, 양성 대조군이며, 결과는 3중치의 평균(means) ± S.D.으로 표시함).

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예, 참고예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 율피 조추출물의 제조 (도 1 참조)

1-1. 아세톤 추출물의 제조

건조 상태의 율피는 (재)대구테크노파크 바이오헬스융합센터에서 제공받아 사용하였다. 아세톤 추출물의 경우 70% 아세톤을 시료중량의 10배의 양을 가하여 실온에서 24시간 침지하여 상층액과 침전물을 분리하여 동일한 방법으로 3회 반복 추출하고 No. 2 filter paper로 여과하여, 여액을 진공회전농축기를 사용하여 농축하고, 동결건조 하여 아세톤 추출물 (수율: 31.58%, 이하 CIa라 함)를 획득하였다.

1-2. 70% 에탄올 추출물의 제조

70% 에탄올 추출물 역시 동일한 방법으로 추출하고 여과 및 감압농축하여 70% 에탄올 추출물 (수율: 29.07%, 이하 CIe라 함)를 수득하였다.

1-3. 열수 추출물의 제조

열수 추출물은 85℃에서 3시간 진탕추출을 3회 반복추출 뒤 No. 2 filter paper로 여과하여, 여액을 진공회전농축기를 사용하여 농축하고, 동결건조 하여 열수 추출물 (수율: 45.33%, 이하 CIw라 함)를 수득하였다.

실시예 2. 율피 용매 분획물 및 정제물의 제조 (도 2 및 3 참조)

2-1. 율피 에탄올 추출물 분획의 제조

상기와 같이 추출된 아세톤, 에탄올, 열수 추출물 중에서, 저해활성이 높은 70% 에탄올 추출물로부터 용매 극성 차를 이용해 서로 다른 용매를 첨가하여 단계적으로 분획하였다.

율피 70% 에탄올 추출물과 chlorform을 1:1비율로 분획 깔대기에 넣고, chlorform으로 분획하였고, 3차례 반복 과정을 거친 후 감압농축하여 chlorform층 분획물(이하, CIeC라 함)을 0.05% 수율을 획득하였다.

위와 같은 동일한 과정을 통해 도 2에 나타낸 것과 같이 ethyl acetate 층(이하, CIeE라 함) 11.648%, n-butanol 층(이하, CIeB라 함) 42.668%, water층(이하, CIeW라 함) 45.344% 순차적으로 각 분획물을 획득하였다.

2-2. 율피 분획물의 분리

상기와 같이 분획한 n-BuOH 분획물을 Diaion HP-20 column chromatography (H₂O : EtOH = 0→ 100%)를 이용하여 500ml씩 분획하여 Fraction (Fr) 1번부터 Fr. 6번까지 Fr. 1 (1.72%, 이하 CIeB1라 함), Fr. 2 (19.97%, 이하 CIeB2라 함), Fr. 3 (53.63%, 이하 CIeB3라 함), Fr. 4 (1.03%, 이하 CIeB4라 함), Fr. 5 (0.28%, 이하 CIeB5라 함), Fr.6 (0.09%, 이하 CIeB6라 함)의 수율로 분획물을 얻었으며, 이 중 Fr. 3번째 CIeB3에서 가장 높은 수율을 나타내었다.(도 3)

실험예 1. 총 페놀 및 총 플라보노이드 함량 측정

페놀성 화합물은 식물계에 널리 분포되어 있는 2차 대사산물의 하나로서 다양한 구조와 분자량을 가지며, 이들은 phenolic hydroxy 기를 가지고 있기 때문에 단백질 등의 거대분자들과 결합하는 성질을 가진다. 또한 식물성 polyphenolic 화합물들은 지용성 또는 수용성으로 구분되어 있어 추출되는 용매에 따라 그 성분들이 달라지는데, 율피 열수 추출물을 동결건조하여 얻은 분말의 수율은 표 1에서 보는 바와 같이 28.76%을 나타냈고, 율피 열수 추출물에 대한 총 페놀 함량은 108.21mg/g, 총 플라보노이드 함량은 18.54mg/g을 함유하는 것으로 나타났다.

율피 물추출물의 추출수율 및 총 페놀 및 총 플라보노이드 함량

Measurment	Water extraction
Extraction yield (%)	28.76
Total polyphenol (mg/g)	108.21±0.17
Total flavonoid (mg/g)	18.54±0.01
All measurements were done in triplicate, and all values are mean±standard deviation.`

상기 실시예에서 수득한 율피 용매 분획물 및 정제물에 대한 성분사을 확인하기 위하여 특정 조건의 HPLC를 수행하였다.(HPLC 조건: 컬 럼 : YMC ODS-A 150×4.6 C18 Column (4㎛), 150×4.6 ㎜, Waters; 이동상 : Solvent A: MeOH; Solvent B: Water in 1% HCOOH; 검출기 : 자외부흡광광도계 (UV 280㎚); 유 속 : 1.0㎖/min; 시료 농도 : 1mg/ml; 컬럼 온도 : 40℃)

상기 HPLC 분석 실험 결과, CleB2, CleB3의 HPLC 분석 결과, 2~4분사이 peak 검출되었으며, peak 높이로 보아 CleB2의 함량이 CleB3보다 2배 정도 높은 것으로 분석되었다. (도 4 참조)

실험예 2. 항산화 실험

2-1. DPPH 라디칼 소거능측정

실시예에서 얻은 시료들의 DPPH 라디칼 소거능측정을 이용한 항산화능을 시험하기 위하여 문헌에 개시된 Blois의 방법을 응용하여 하기와 같이 실험하였다(Blois, M. S. 1958.　Antioxidant determination by the use of a stable free radical. Nature 26, 1199-1204.)

1,1 Diphenyl-2-picryl-hydrazil (DPPH) 라디칼을 이용한 항산화능 측정법은 주로 phenolic 구조와 aromatic amine 화합물에서 많이 사용되는 방법이다.

DPPH alcohol 용액은 517nm에서 가장 강한 UV 흡수가 있으며 실온에서 매우 안정한 유리 라디칼이다. 전자공여체로부터 전자나 hydrogen radical을 받아 phenoxy radical을 생성하게 됨으로써 517nm에서 나타났던 DPPH의 특이적인 흡수 band가 사라지게 된다. 가시적인 DPPH의 보라색은 안정해진 분자의 몰수에 비례하여 노란색으로 변하게 된다.

이러한 DPPH는 dioxane이나 CCl4와 같은 비극성 용매 내에서는 2차, 3차 산화 반응이 일어나기도 하나지만 alcohol 용액 내에서는 비교적 안정하다.

전자공여능 측정은 Blois의 방법으로 다음과 같이 측정하였다. 각 시료용액 100 μL에 0.2 mM의1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl 50 μL 넣고 30분 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.

율피의 아세톤, 에탄올, 열수 추출물 모두 10ug/ml 58%의 전자공여능의 활성을 도 5에 나타내었다. 1,000ug/ml농도에서 아세톤 추출물이 62%의 전자공여능 활성을 나타내었지만, 낮은 농도에서의 활성과 큰 차이를 보이지 않았다.

Diaion HP-20 column chromatography(H₂O : EtOH = 0 → 100%)의 율피 분리물 CIeB1 1.72%, CIeB2 19.97%, CIeB3 53.63%, CIeB4 1.03%, CIeB5 0.28%, CIeB6 0.09%로 부터 1ug/ml~100ug/ml 농도의 전자공여능의 활성을 도 6에 나타내었다. 율피 분획물의 농도가 높을수록 전자공여능의 활성이 높아져, 농도 유의차 있는 활성을 나타내었다. 특히 CIeB3의 5ug/ml 농도에서 70% 이상의 전자공여능 활성을 나타내었다.

2-2. ABTS 라디칼 양이온 탈색화 측정

실시예에서 얻은 시료들의 ABTS 라디칼 양이온 탈색화(radical cation decolorization) 법에 의한 항산화 효능을 시험하기 위하여 문헌에 개시된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험하였다(Roterta, R., P. Nicoletta, P. Anna, P. Ananth, Y. Min and R.E. Catherine. 1999. Antioxidant Activity Applying an Improved ABTS　Radical Cation Decolorization Assay. Radic. Biol. Med. 26, 1231-1237.)

ABTS 라디칼 소거능은 추출물들의 상대적인 항산화효과 측정인 hydrogen-donating antioxidant와 chain breaking antioxidant 모두를 측정할 수 있다.

또한 수상(aqueous phase) 모두에 적용이 가능하며 표준물질 사용으로 추출물의 상대비교가 가능하도록 potassium persulfate와의 반응에 의해 생성된 ABTS+ free radical이 추출물속의 항산화 물질에 의해 제거되어 radical 특유의 색인 청록색이 탈색되는 것을 이용한다. ABTS^＋ radical cation decolorization의 측정은 Pellegrin 등의 방법에 따라 측정하였다.

7mM ABTS^＋ 5mL와 2.4mM K₂S₂O₈ 5mL를 ethanol과 약 1:6 비율로 섞어 734nm에서 대조구의 흡광도 값이 0.7±0.002가 되도록 조절한 ABTS^＋ solution을 사용하였다. 시료용액 0.1mL와 ABTS^＋ solution 0.1mL를 혼합하여 실온에서 7분간 반응시키고 734nm에서 흡광도를 측정하였다.

율피의 아세톤, 에탄올, 열수 추출물 모두 10ug/ml 80%의 ABTS 라디칼 소거능의 활성을 도 7에 나타내었다. 50ug/ml농도에서 아세톤, 에탄올, 열수 추출물 모두 98%의 ABTS 라디칼 소거능 활성을 나타내었다.

율피 ethyl acetat, n-butanol, water 분획물 1ug/ml~100ug/ml 농도의 ABTS 라디칼 소거능의 활성을 도 8에 나타내었다. 율피 분획물의 농도가 높을수록 ABTS 라디칼 소거능의 활성이 높아져, 농도 유의차 있는 활성을 나타내었다. 특히 10ug/ml 농도에서 아세톤 추출물이 63%의 ABTS 라디칼 소거능의 활성을 나타내었다.

Diaion HP-20 column chromatography(H₂O : EtOH = 0 → 100%)의 율피 분리물 CIeB1 1.72%, CIeB2 19.97%, CIeB3 53.63%, CIeB4 1.03%, CIeB5 0.28%, CIeB6 0.09%로 부터 1ug/ml~100ug/ml 농도의 도 9에 나타내었다.

율피 분획물의 농도가 높을수록 ABTS 라디칼 소거능의 활성이 높아져, 농도 유의차 있는 활성을 나타내었다. 특히 CIeB3의 5ug/ml 농도에서 70% 이상의 ABTS 라디칼 소거능을 나타내었다.

2-3. 수퍼옥시드 디스무타제 (Sueroxide dismutase; SOD) 유사활성 측정

실시예에서 얻은 시료들의 수퍼옥시드 디스무타제 (Sueroxide dismutase; SOD) 유사활성 측정법에 의한 항산화 효능을 시험하기 위하여 문헌에 개시된 Fidovich의 방법을 응용하여 하기와 같이 실험하였다(Siddhuraju, P., Becker, K. (2007), The antioxidant and free radical scavenging activities of processed cowpea(Vigna unguiculata L.) seed extracts. J. of Food Chemistry. 101: 1019)

Superoxide anion 라디칼은 활성산소 중 가장 중요하게 여겨지는데 이는 다른 활성산소의 상당부분이 superoxide anion 라디칼로부터 생성되며 세포손상, 신경세포사멸, 암 및 노화 등을 초래하는 주된 라디칼로 알려져 있기 때문이다.(Jayaprakasha, G. K., R. L. Jaganmohan and K. K. Sakariah. 2004. Antioxidant activities of flavidin in different in vitro moder systems. Bioorganic & Medicinal Chem . 12, 5141-5146.)

Superoxide anion 라디칼 소거능 측정은 xanthine과 xanthine oxidase가 반응하면 ·O²를 제거할 수 있는 항산화 물질이 존재하면 발색이 저해되는 원리를 이용하였다.

Superoxide anion 라디칼 소거능은 Fidovich의 방법에 의해 측정하였다. 각시료 용액 0.1 mL과 0.1M potassium phosphate buffer (pH7.5) 0.6 mL에 0.4 mM xanthine과 0.24 mM nitro bluetetrazolium (NBT)를 녹인 기질액 1 mL를 첨가하고 xanthineoxidase (0.049 U/mL) 1 mL를 가하여 37℃에서 20분간 반응시킨 후 1 N-HCl 1 mL를 가하여 반응을 종료시킨 다음, 반응액중에 생성된 superoxide anion radical의 양을 560 nm에서 흡광도를 측정하였다.

율피의 아세톤, 에탄올, 열수 추출물 모두 10ug/ml 50% 이상의 Superoxide anion 라디칼 소거능의 활성을 도 10 에 나타내었다. 50ug/ml농도에서 아세톤, 에탄올, 열수 추출물 모두 80%의 Superoxide anion 라디칼 소거능 활성을 나타내었다.

율피 ethyl acetat, n-butanol, water 분획물 1ug/ml~100ug/ml 농도의 전자공여능의 활성을 도 11에 나타내었다. 율피 분획물의 농도가 높을수록 전자공여능의 활성이 높아져, 농도 유의차 있는 활성을 나타내었다. 특히 10ug/ml 농도에서 아세톤 추출물이 63%의 전자공여능 활성을 나타내었다.

율피 ethyl acetat, n-butanol, water 분획물 1ug/ml~100ug/ml 농도의 Superoxide anion 라디칼 소거능의 활성을 도 12 에 나타내었다. 율피 분획물의 농도가 높을수록 Superoxide anion 라디칼 소거능의 활성이 높아져, 농도 유의차 있는 활성을 나타내었다. 특히 100ug/ml 농도에서 ethyl acetat추출물이 89%의 Superoxide anion 라디칼 소거능의 활성을 나타내었다.

Diaion HP-20 column chromatography(H₂O : EtOH = 0 → 100%)의 율피 분리물 CIeB1 1.72%, CIeB2 19.97%, CIeB3 53.63%, CIeB4 1.03%, CIeB5 0.28%, CIeB6 0.09%로 부터 1ug/ml~100ug/ml 농도의 superoxide anion 라디칼 소거능의 활성을 도 13 에 나타내었다. 율피 분리물의 농도가 높을수록 superoxide anion 라디칼 소거능의 활성이 높아져, 농도 유의차 있는 활성을 나타내었다.

특히 CIeB1, CIeB2, CIeB3 분리물 5ug/ml 농도에서 60% 이상의 superoxide anion 라디칼 소거능의 활성을 나타내었다.

2-4. H ₂ O ₂ 소거능 측정

실시예에서 얻은 시료들의 H₂O₂ 소거능 측정법에 의한 항산화 효능을 시험하기 위하여 문헌에 개시된 Jayaprakasha 등 방법을 응용하여 하기와 같이 실험하였다(Jayaprakasha, G. K., R. L. Jaganmohan and K. K. Sakariah. 2004. Antioxidant activities of flavidin in different in vitro moder systems. Bioorganic & Medicinal Chem . 12, 5141-5146.)

H₂O₂는 세포 독성 물질로 체내 각 기관들의 DNA에 심각한 손상을 초래해 각종 질병과 노화를 유발한다고 알려져 있다.

또한 H₂O₂ 자체의 독성은 낮지만 세포막을 통과할 수 있고, 금속이온과 반응하여 독성이 강한 hydroxyl radical을 생성하기에 생체에서 문제가 되고 있다.

H₂O₂ 소거능 측정은 Jayaprakasha 등의 방법으로 측정하였다. 시료 0.5 mL에 40 mM H₂O₂ 0.5 mL를 37℃에서 10분간 반응시킨 후 230 nm에서 흡광도를 측정하였다.

율피의 아세톤, 에탄올, 열수 추출물 모두 50ug/ml 80% 이상의 H₂O₂ 소거능 활성을 도 14 에 나타내었다. 1,000ug/ml농도에서 아세톤, 에탄올, 열수 추출물의 활성과 차이점이 나타나지 않아, 낮은 농도에서도 높은 H₂O₂ 소거능 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다.

율피 ethyl acetat, n-butanol, water 분획물 1ug/ml~100ug/ml 농도의 H₂O₂ 소거능 활성을 도 15 에 나타내었다. 율피 분획물의 농도 5g/ml에서 H₂O₂ 소거능 활성이 급격히 높아졌으며, 특히 50ug/ml~100ug/ml 농도에서 율피 ethyl acetat, n-butanol, water 분획물 모두 80%이상의 H₂O₂ 소거능 활성을 나타내었다.

Diaion HP-20 column chromatography(H₂O : EtOH = 0 → 100%)의 율피 분리물 CIeB1 1.72%, CIeB2 19.97%, CIeB3 53.63%, CIeB4 1.03%, CIeB5 0.28%, CIeB6 0.09%로부터 1ug/ml~100ug/ml 농도의 H₂O₂ 소거능 활성을 도 16 에 나타내었다. 율피 분획물의 농도 50g/ml에서 CIeB2, CIeB3 추출물이 85% 이상의 H₂O₂ 소거능 활성이 급격히 높아졌으며, 100ug/ml 농도에서 H₂O₂ 소거능 활성을 비교하였을 때, 미미한 차이를 보였다.

실험예 3. 항균 실험

실시예에서 얻은 시료의 항균 효능을 시험하기 위하여 문헌에 개시된 Disc diffusion assay 방법을 응용하여 하기와 같이 실험하였다.

율피 열수추출물의 항균활성은 Disc diffusion assay 방법으로 처리농도에 따라 항균활성을 측정하였다. 그 결과는 표 2 과 같다. 율피 열수추출물 모두 처리 농도가 증가할수록 항균활성을 나타내는 생육저해환 크기가 비례적으로 증가하였다. 그람 음성균인 Pseudomonas aeruginosa 균주 에서 0.1, 1, 2, 5 mg/disc 에서 모두 항균력이 나타났고, 5 mg/disc 농도에서 생육저해환이 17 mm clear zone으로 다른 균주에 비해 항균활성이 높게 나타났다. Staphylococcus epidermis 와 Staphylococcus aureus 균주에서 1 mg/disc 이상의 농도에서 생육저해환이 나타났고, Samonella typhimurium , Escherichia coli , Candida albicans 에서는 2mg/disc 이상의 농도에서 생육저해환이 나타났으며, 모든 균주에 대해 5mg/disc에서 항균활성이 뛰어난 것으로 나타났다.

항균활성

Strains	Water extraction (mg/disc)
	0.1	1	2	5
Salmonella typhimurim	-	-2)	11	131)
Staphylococcus epidermis	-	11	11	13
Staphylococcus aureus	-	9	12	17
Escherichia coli	-	-	11	14
Candida albicans	-	-	11	13
Pseudomonas aeruginosa	10	21	27	27
1) Inhibition zone in diameter (mm), 2) No inhibition

이하, 본 발명의 제형예로서 크림, 맛사지크림, 로션, 스킨로션, 에센스, 팩, 클렌징폼의 제형을 예시하고 있으나, 본 발명의 화장품 조성물을 포함하는 제형은 이에 한정되는 것은 아니다.

제형예 1. 크림조성물

유상과 수상을 각각 75 ℃로 가열 혼합한 후 실온으로 냉각한다.

제형예 2. 맛사지크림 조성물

유상과 수상을 각각 75 ℃로 가열 용해 혼합한 후 실온으로 냉각한다.

제형예 3. 로션 조성물

유상과 수상을 각각 75 ℃로 가열 혼합 유화한 후 실온으로 냉각한다.

제형예 4. 스킨로션 조성물

수상과 에탄올상을 각각 제조 혼합한 후 여과한다.

제형예 5. 에센스 조성물

수상과 에탄올상을 각각 제조 혼합한 후 여과한다.

제형예 6. 팩 조성물

수상과 에탄올상을 각각 분산 용해하여 혼합시킨 후 실온으로 냉각한다.

제형예 7. 클렌징폼 조성물

수상과 오일상을 각각 분산 용해하여 혼합 검화한 후 실온으로 냉각한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims (7)

1. 율피 추출물 또는 정제물을 유효성분으로 함유하는 피부노화 치료 및 예방용 피부외용 약학조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 율피 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올, 아세톤, 또는 이들의 혼합용매에 추출가능한 추출물임을 특징으로 하는 피부외용 약학조성물.
3. 제 1항에 있어서, 상기 율피 정제물은 상기 율피 추출물을 클로로포름(chlorform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), n-부탄올(butanol) 및 물(water) 분획으로 분획하는 제 1단계; 상기 n-부탄올(butanol)을 Diaion HP-20 column chromatography (H₂O : EtOH = 0→ 100%)를 이용하여 Fraction (Fr) 1번부터 Fr. 6번까지 Fr. 1 (CIeB1), Fr. 2 (CIeB2), Fr. 3 (CIeB3), Fr. 4 (CIeB4), Fr. 5 (CIeB5), 및 6개 분획을 분획하는 제 2단계; 상기 2단계 공정의 Fr. 3 (CIeB3) 정제물을 감암농축 및 건조하는 제 3단계 공정을 통하여 수득된, HPLC 상에서 (HPLC 조건: 컬 럼 : YMC ODS-A 150×4.6 C18 Column (4㎛), 150×4.6 ㎜, Waters; 이동상 : Solvent A: MeOH; Solvent B: Water in 1% HCOOH; 검출기 : 자외부흡광광도계 (UV 280㎚); 유 속 : 1.0㎖/min; 시료 농도 : 1mg/ml; 컬럼 온도 : 40℃)에서 2~4분사이 피크(peak)에서 검출됨을 특징으로 하는 Fr. 3번째 분획 정제물(CIeB3)을 포함하는 피부외용 약학 조성물.
4. 제 1항에 있어서, 상기 피부노화는 주름살, 기미, 주근깨, 자외선에 의한 피부 손상, 또는 피부암임을 특징으로 하는 피부외용 약학조성물.
5. 제 1항에 있어서, 상기 약학 조성물은 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 제형을 포함함을 특징으로 하는 피부외용 약학조성물.
6. 율피 추출물 또는 정제물을 유효성분으로 함유하는 피부노화 개선 및 예방용 화장료 조성물.
7. 제 6항에 있어서 상기 화장료 조성물은 화장수, 스킨, 로션, 영양로션, 영양크림, 마사지 크림, 에센스, 팩의 제형인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.

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