KR101829182B1 - 표적 핵산의 바코딩을 위한 멀티 프라이머 증폭 방법 - Google Patents

표적 핵산의 바코딩을 위한 멀티 프라이머 증폭 방법 Download PDF

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Abstract

일정 실시 형태에서, 본 발명은 뉴클레오티드 태그(들), 및 선택적으로 바코드 뉴클레오티드 서열이 표적 뉴클레오티드 서열에 첨가되는 증폭 방법을 제공한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명은 다수의 제1 주입 라인과 다수의 제2 주입 라인을 포함하는 미세유체 장치를 제공한다. 미세유체 장치는 또한 다수의 제1 챔버 세트 및 다수의 제2 챔버 세트를 포함한다. 각각의 제1 챔버 세트는 다수의 제1 주입 라인 중 하나와 유체 연통한다. 각각의 제2 챔버 세트는 다수의 제2 주입라인 중 하나와 유체 연통한다. 미세유체 장치는 추가적으로 다수의 제2 주입 라인의 제1 부분과 유체 연통하는 다수의 제1 펌프 요소 및 다수의 제2 주입 라인의 제2 부분과 유체 연통하는 제2 펌프 요소를 포함한다.

Description

표적 핵산의 바코딩을 위한 멀티 프라이머 증폭 방법{MULTI-PRIMER AMPLIFICATION METHOD FOR BARCODING OF TARGET NUCLEIC ACIDS}
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2009년 4월 2일에 출원된 선행 미국 가출원 제61/166,181호, 2009년 4월 2일에 출원된 선행 미국 가출원 제61/166,105호, 2009년 6월 11일에 출원된 선행 미국 가출원 제61/186,327호, 및 2010년 2월 18일에 출원된 선행 미국 가출원 제61/305,907호의 이익을 주장하며, 이들은 모두 전체적으로 본원에 참조로 포함된다.
기술분야
본 발명은 일반적으로 특정한 표적 핵산의 검출 및/또는 염기서열분석(sequencing)에 대한 고효율 분석(high-throughput assay) 분야에 관한 것이다. 임의의 실시 형태에 따르면, 본 발명은 뉴클레오티드 태그(들) 및 바코드 뉴클레오티드 서열이 표적 뉴클레오티드 서열에 첨가된 증폭 방법을 제공한다.
샘플에서 특정 핵산 서열을 검출하는 능력으로 인하여 진단 및 예측 의료, 환경, 식품 및 농업 모니터링, 분자 생물학적 연구, 및 다수의 기타 분야에서 새로운 접근법이 생겨났다. 덧붙여, 새로운 염기서열분석 방법론(sequencing methodology)은 신속한 고효율 핵산 염기서열분석에 대한 수단을 제공한다.
추가적인 방법, 특히 샘플에서 광범위한 범위의 농도에 대하여 동시에 다수의 표적의 분석 및/또는 다수의 샘플의 분석을 용이하게 하는 방법은 큰 이익이 될 것이다.
미세유체 장치는 최근까지 상상하지 못한 규모로 분석, 제조, 계량, 및 기타 조작 기능에 사용될 수 있다. 미세유체 장치의 장점은 값비싼 시약 및 샘플의 보존, 고밀도 및 고효율의 샘플 분석 또는 합성, 육안에 거의 보이지 않는 수준에서의 유체 정밀도 및 정확성, 및 거대유체(macrofluidic) 규모에서 작동하는 대응 장치(counterpart equipment)의 교체를 수반함에 따른 공간 감소를 포함한다. 복잡성의 증가는 미세유체 장치의 크기 감소 및 밀도 증가와 연관되고 더 높은 엔지니어링 및 제작 비용은 점점 더 복잡한 장치 구조와 연관된다.
최근 다양한 화학, 생화학 분석 및 합성을 실행하는 미세유체 시스템을 개발하고 제조하기 위한 공동의 노력이 있어 왔다. 추가적으로, 미세유체 장치는 자동화 시스템과의 사용을 위하여 조정될 수 있는 가능성이 있으며, 그렇게 함으로써 인간의 개입이 감소하여 추가적인 비용이 감소하고 조작자의 실수가 감소하는 추가적인 이익을 제공한다. 미세유체 장치는, 예를 들어 모세관 전기 이동, 가스 크로마토그래피 및 세포 분리를 포함한 여러 가지 적용에서의 사용을 위하여 제안되었다.
그러나, 이와 같이 지금까지 제조된 미세유체 장치와 연관된 다양한 문제 때문에 이러한 이익의 실현은 종종 좌절되었다. 예를 들어, 다수의 현재 미세유체 장치는 실리카 기반 기판으로 제조되지만, 이는 기계 가공하기 어렵고 복잡하다. 그 결과, 이러한 소재로 만들어진 많은 장치는 부서지기 쉽다. 또한, 많은 기존의 미세유체 장치를 통한 유체의 수송은, 상기 장치를 통해 제어된 방식으로 유체를 수송하도록 복잡한 전기장의 조절을 필요로 한다.
따라서, 미세유체 장치로 달성할 수 있는 상기한 이익이 있지만 기존 장치의 현재 한계의 관점에서, 다양한 화학 및 생화학 분석의 수행에 사용하기 위하여 고안된 미세유체 장치에 대한 요구가 남아 있다. 현대 생화학에서 미세유체 장치의 중요성 때문에, 다른 유형의 분석에서의 사용에 대하여 충분한 융통성을 가지면서, 뿐만 아니라 다양한 핵산 증폭 반응을 수행하는데 사용될 수 있는 장치에 대한 특정 요구가 있다.
핵산 증폭을 수행하는 능력을 가진 장치는 다양한 유용성을 가질 것이다. 예를 들어, 이러한 장치는 관심의 특정 표적 핵산이 샘플 내에 존재하는지 존재하지 않는지 여부를 결정하는 분석 도구로서 사용될 수 있다. 따라서, 상기 장치는 특정 병원체(예컨대, 바이러스, 박테리아 또는 균류)의 존재에 대하여, 그리고 식별 목적(예컨대, 친자(paternity) 및 법과학적(forensic) 적용)을 위하여 테스트하는데 사용될 수 있다. 이러한 장치는 또한 이전에 특정 질병 또는 유전적 장애와 관련된 특이적인 핵산을 검출하거나 특성화하는데 사용될 수 있다. 분석 도구로서 사용될 때, 상기 장치는 또한 유전형 분석 및 유전자 발현 분석(예컨대, 차등 유전자 발현 연구)을 수행하는데 사용될 수 있다. 대안적으로, 상기 장치는 증폭된 생성물, 혈구형 검사(cell-typing), DNA 지문 분석(DNA fingerprinting) 등과 같은 추가 분석을 위하여 충분한 핵산을 증폭하는 제조 방식으로 사용될 수 있다. 증폭된 생성물은 또한 그 다음 원하는 단백질 생성물의 생성을 위하여 세포를 변형시키는데 사용될 수 있는 벡터 내로의 삽입과 같은 다양한 유전 공학 적용에서 사용될 수 있다.
미세유체 고안 및 사용에서 이러한 발전에도 불구하고, 미세유체 칩의 복잡도를 감소시키고 미세유체 칩의 작동을 단순화하는 것이 유용할 것이다. 추가적으로, 미세유체 장치로부터 반응 생성물을 회수하는 능력의 증가에 대한 요구가 존재한다. 따라서, 업계에서 미세유체 장치와 관련된 개선된 방법 및 시스템에 대한 요구가 있다.
임의의 실시 형태에서, 본 발명은 다수의 샘플에서 다수의 표적 핵산을 증폭, 태깅(tagging) 및 바코딩하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 각각의 표적 핵산에 대하여 증폭 혼합물을 제조하는 단계를 수반한다. 각각의 증폭 혼합물은 하기를 포함한다:
표적 특이적 부분을 포함하는 정방향 프라이머(forward primer);
표적 특이적 부분을 포함하는 역방향 프라이머(reverse primer)(여기에서 정방향 프라이머는 추가적으로 제1 뉴클레오티드 태그를 포함하고/포함하거나 역방향 프라이머는 추가적으로 제2 뉴클레오티드 태그를 포함함); 및
바코드 뉴클레오티드 서열과 제1 및/또는 제2 뉴클레오티드 태그 특이적 부분을 포함하는 적어도 하나의 바코드 프라이머(여기에서 바코드 프라이머는 정방향 및/또는 역방향 프라이머(들)보다 과량임).
각각의 증폭 혼합물은 증폭되어 다수의 표적 앰플리콘(amplicon)을 생성하고, 여기에서 각각의 표적 앰플리콘은 표적 뉴클레오티드 서열의 측면에 위치하는 제1 및/또는 제2 뉴클레오티드 태그, 및 표적 앰플리콘의 5' 또는 3' 말단에 적어도 하나의 바코드 뉴클레오티드 서열을 가지는, 태그된 표적 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정 실시 형태에서, 정방향 프라이머는 추가적으로 제1 뉴클레오티드 태그를 포함한다. 원한다면, 역방향 프라이머는 추가적으로 제2 뉴클레오티드 태그를 포함할 수 있다.
태깅/바코딩 방법의 임의의 실시 형태에서, 증폭 혼합물 내 바코드 프라이머의 농도는 정방향 및/또는 역방향 프라이머(들)의 농도의 적어도 4배이다. 이러한 실시 형태의 변형에서, 증폭 혼합물 내 바코드 프라이머의 농도는 정방향 및/또는 역방향 프라이머(들)의 농도의 적어도 50배이다.
바코딩/태깅 방법의 특정 실시 형태에서, 표적 핵산에 대한 실질적인 어닐링을 피하도록 제1 및/또는 제2 뉴클레오티드 태그 및/또는 바코드 뉴클레오티드 서열이 선택된다. 예시적인 실시 형태에서, 바코드 뉴클레오티드 서열은 특정 샘플을 식별한다. 바코드 프라이머가 바코드 뉴클레오티드 서열 및 제1 뉴클레오티드 태그 특이적 부분을 포함할 경우, 임의의 실시 형태에서 다수의 정방향 프라이머는 동일한 제1 뉴클레오티드 태그를 포함한다. 예를 들어, 다수의 표적이 상이한 샘플에서 증폭될 경우, 표적의 세트에 해당하는 정방향 프라이머의 세트가 모두 동일한 제1 뉴클레오티드 태그를 가질 수 있다.
바코딩/태깅 방법의 특정 실시 형태에서, 각각의 표적에 대한 정방향 및 역방향 프라이머는 처음에 샘플과 별도로 결합되고, 각각의 바코드 프라이머는 처음에 바코드 프라이머의 해당 샘플과 결합된다. 예를 들어, T개 표적이 S개 샘플에서 증폭될 경우(T와 S는 1 초과의 정수임), 상기 방법은 처음에 결합한 정방향 및 역방향 프라이머가 처음에 결합한 샘플 및 바코드 프라이머에 첨가되는 S×T개 증폭 혼합물을 제조하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
바코딩/태깅 방법의 임의의 실시 형태에서, 증폭은 적어도 3사이클 동안 실행되어 제1 및 제2 뉴클레오티드 태그 및 바코드 뉴클레오티드 서열을 도입한다. 이러한 실시 형태의 변형에서, 증폭은 5 내지 50사이클 동안 실행된다. 특정 실시 형태에서, 증폭은 충분한 수의 사이클 동안 실행되어 표적 및 샘플에 대하여 표적 앰플리콘 복제 수를 표준화한다.
바코딩/태깅 방법의 임의의 실시 형태에서, 증폭시 생성된 표적 앰플리콘의 적어도 50%는 표적 앰플리콘의 평균 복제 수의 50% 초과로 존재하고 표적 앰플리콘의 평균 복제 수의 2배 미만으로 존재한다.
다른 실시 형태에서, 본 발명은 바코딩이 선택적으로 생략되고 표적 뉴클레오티드 서열이 증폭 후에 태깅되는 방법을 제공한다. 이 방법은 통상적으로 다수의 샘플에서 다수의 표적 핵산을 증폭하는 단계를 수반한다. 증폭 혼합물은 각각의 표적 핵산에 대하여 제조되며, 여기에서 각각의 증폭 혼합물은 하기를 포함한다:
표적 특이적 서열을 포함하는 정방향 프라이머; 및
표적 특이적 서열을 포함하는 역방향 프라이머.
각각의 증폭 혼합물은 증폭되어 다수의 표적 뉴클레오티드 서열을 생성한다. 그 다음 표적 뉴클레오티드 서열은 태깅되어(예컨대, 표적 뉴클레오티드 서열의 한쪽 또는 양쪽 말단까지 뉴클레오티드 태그의 결찰에 의함) 다수의 표적 앰플리콘을 생성한다. 각각의 표적 앰플리콘은 표적 뉴클레오티드 서열의 측면에 위치하는 제1 및/또는 제2 뉴클레오티드 태그를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 표적 앰플리콘의 적어도 50%는 표적 앰플리콘의 평균 복제 수의 50% 초과로 존재하고 표적 앰플리콘의 평균 복제 수의 2배 미만으로 존재한다.
본원에 기재된 증폭 방법의 임의의 실시 형태에서, 표적 앰플리콘의 적어도 70%는 표적 앰플리콘의 평균 복제 수의 50% 초과로 존재하고 표적 앰플리콘의 평균 복제 수의 2배 미만으로 존재한다. 예시적인 실시 형태에서, 표적 앰플리콘의 적어도 90%는 표적 앰플리콘의 평균 복제 수의 50% 초과로 존재하고 표적 앰플리콘의 평균 복제 수의 2배 미만으로 존재한다.
다양한 실시 형태에서, 표적 앰플리콘의 평균 길이는 적어도 25개 염기, 50개 염기, 100개 염기, 200개 염기, 500개 염기 및 750개 염기이다. 예를 들어 증폭이 긴 범위의 PCR(long-range PCR)로 실행되는 경우와 같이, 1킬로베이스 이상과 같은 더 긴 평균 길이도 또한 가능하다. 이러한 실시 형태에서, 증폭은 표적 앰플리콘의 적어도 70%가 표적 앰플리콘의 평균 복제 수의 50% 초과로 존재하고 표적 앰플리콘의 평균 복제 수의 2배 미만으로 존재하는 표적 앰플리콘을 만들어낼 수 있다.
본원에 기재된 방법의 장점은 증폭이 소량의 반응 부피로 실행될 수 있다(그러나 그럴 필요는 없다)는 것이다. 특정 실시 형태에서, 증폭 혼합물의 부피는 약 1피코리터 내지 약 50나노리터의 범위에 있다. 임의의 실시 형태에서, 증폭 혼합물의 부피는 약 5피코리터 내지 약 25나노리터의 범위에 있다.
본원에 기재된 방법은 선택적으로 증폭 혼합물에서 표적 앰플리콘을 회수하는 단계를 포함할 수 있다. 임의의 실시 형태에서, 표적 앰플리콘은 회수되는 표적 앰플리콘 중에서 약 50% 미만으로 변하는 부피 및/또는 복제 수로 회수된다. 회수된 앰플리콘은 추가의 증폭 및/또는 분석(예컨대, DNA 염기서열분석)에 이용될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 적어도 하나의 표적 앰플리콘은 제1 및 제2 뉴클레오티드 태그에 특이적인 프라이머를 사용하여 증폭되어, 원한다면 바코드 뉴클레오티드 서열이 없는 표적 앰플리콘을 생성할 수 있다.
본원에 기재된 방법의 특정 실시 형태에서, 표적 핵산은 유전체 DNA(genomic DNA)를 포함한다. 이러한 실시 형태의 변형에서, 유전체 DNA는 DNA 염기서열분석, 예컨대 자동화 DNA 염기서열분석을 위한 DNA일 수 있다.
임의의 실시 형태에서, 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 바코드 프라이머 중 적어도 하나는 적어도 하나의 추가 프라이머 결합 부위를 포함할 수 있다. 예를 들어 바코드 프라이머가 이용되면, 바코드 프라이머는 제1 뉴클레오티드 태그의 상류인 바코드 뉴클레오티드 서열의 상류에 적어도 제1 추가 프라이머 결합 부위를 포함할 수 있다. 이러한 실시 형태에서, 역방향 프라이머는 제2 뉴클레오티드 태그의 하류에 적어도 제2 추가 프라이머 결합 부위를 포함할 수 있다. 특정 실시 형태에서, 표적 뉴클레오티드 서열이 자동화 DNA 염기서열분석으로 서열분석될 경우, 제1 및 제2 추가 프라이머 결합 부위는 DNA 염기서열분석 프라이머에 의해 결합될 수 있다.
바코드 프라이머가 이용되지 않고 표적 뉴클레오티드 서열이 증폭 후에 태깅되면, 제1 및 제2 뉴클레오티드 태그는 DNA 염기서열분석 프라이머에 의해 결합될 수 있다.
따라서, 본원에 기재된 방법은 선택적으로 적어도 하나의 표적 앰플리콘을 DNA 염기서열분석하는 단계를 포함할 수 있다.
임의의 실시 형태에서, 상기 방법은 선택적으로 증폭 혼합물에서 표적 앰플리콘의 양을 정량화하는 단계를 포함할 수 있다. 이 단계는 예를 들어 자동화 DNA 염기서열분석을 수행하기 전에 실행될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 정량화는 표적 앰플리콘을 회수하는 단계 및 회수한 표적 앰플리콘을 디지털 증폭시키는 단계를 포함한다. 디지털 증폭은 특정 실시 형태에서 하기를 포함한다:
사전증폭된(preamplified) 표적 앰플리콘을 별도의 반응 혼합물로 분배하는 단계(여기에서 각각의 반응 폰합물은 평균적으로 반응 혼합물 당 1개 이하의 앰플리콘을 포함함); 및
반응 혼합물을 증폭시키는 단계.
디지털 증폭에서의 정량화는 실시간 PCR 및/또는 종말점 PCR(endpoint PCR)로 실행될 수 있다.
본원에 기재된 증폭 방법은 선택적으로 각각의 샘플에 존재하는 각각의 표적 핵산의 양을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 임의의 실시 형태에서, 상기 방법은 각각의 샘플에서 표적 핵산의 복제 수를 측정하는 것으로 실행될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 상기 방법은 표적 핵산에 해당하는 좌위(locus)에서 유전자형을 측정하는 것으로 실행될 수 있다. 다른 실시 형태에서, 상기 방법은 표적 핵산의 발현 수준을 측정하는 것으로 실행될 수 있다.
특정 실시 형태에서, 본 발명은 미세유체 장치와 관련된다. 보다 특히, 본 발명은 반응 생성물의 회수를 위해 제공되는 미세유체 장치와 관련된다. 단순히 예를 들면, 상기 방법 및 장치는 차세대 염기서열분석(next generation sequencing)을 위한 라이브러리를 제조하는데 사용되는 PCR 샘플 제조 시스템에 적용되었다. 그러나, 본 발명은 훨씬 더 광범위한 적용가능성이 있음이 인식될 것이다.
본 발명의 실시 형태에 따르면, 미세유체 장치가 제공된다. 미세유체 장치는 다수의 제1 주입 라인 및 다수의 제2 주입 라인을 포함한다. 미세유체 장치는 또한 다수의 제1 챔버 세트 및 다수의 제2 챔버 세트를 포함한다. 각각의 제1 챔버 세트는 다수의 제1 주입 라인 중 하나와 유체 연통하고, 각각의 제2 챔버 세트는 다수의 제2 주입 라인 중 하나와 유체 연통한다. 미세유체 장치는 다수의 제2 주입 라인의 제1 부분과 유체 연통하는 다수의 제1 펌프 요소 및 다수의 제2 주입 라인의 제2 부분과 유체 연통하는 다수의 제2 펌프 요소를 추가로 포함한다.
본 발명의 다른 실시 형태에 따르면, 분석물 챔버, 샘플 챔버 및 수확 포트를 가지는 미세유체 장치를 작동하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 분석물 챔버와 샘플 챔버 사이의 유체 라인을 폐쇄하는 단계, 샘플 주입 라인을 통하여 샘플 챔버 내로 샘플을 유입하는단계, 및 분석물 주입 라인을 통하여 분석물 챔버 내로 분석물을 유입하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 또한 분석물 챔버와 샘플 챔버 사이의 유체 라인을 개방하는 단계, 샘플의 적어도 일부분과 분석물의 적어도 일부분을 결합하여 혼합물을 형성하는 단계, 및 상기 혼합물을 반응시켜 반응 생성물을 형성하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 분석물 챔버와 샘플 챔버 사이의 유체 라인을 폐쇄하는 단계, 수확 포트로부터 샘플 챔버로 수확 시약을 유입하는 단계, 및 미세유체 장치로부터 상기 반응 생성물을 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 특정 실시 형태에 따르면, 반응 생성물을 제조하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 M개 샘플을 제공하는 단계 및 N개 분석물을 제공하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 또한 M개 샘플과 N개 분석물을 혼합하여 MxN개 쌍요소 조합(pairwise combination)을 형성하는 단계를 포함한다. 각각의 MxN개 쌍요소 조합은 폐쇄된 부피 내에 포함된다. 상기 방법은 MxN개 쌍요소 조합에서 MxN개 반응 생성물을 형성하는 단계 및 MxN개 반응 생성물을 회수하는 단계를 추가로 포함한다.
종래 기술보다 많은 이익이 본 발명에 의해 획득된다. 예를 들어, 본 발명의 실시 형태는 MxN개 샘플과 분석물의 혼합 및 반응, 그 후 샘플별 풀(sample-by-sample pool)에서 반응 생성물의 회수를 제공한다. 추가적으로, 확장 펌핑이 미세유체 장치에서 실질적으로 모든 반응 생성물을 제거하는데 사용되어, 다양한 반응 생성물 풀 사이의 균일성을 제공한다. 본원에 기재된 시스템과 방법을 사용함으로써, 종래 기술과 비교하여 라이브러리를 제조하는데 필요한 시간과 수고가 감소된다. 본 발명의 많은 장점 및 특징과 함께 본 발명의 이들 및 다른 실시 형태가 하기의 본문 및 첨부된 도면과 함께 보다 상세히 기재되어 있다.
본 발명은 본 발명의 임의의 특정 실시 형태를 도시하는 첨부된 도면과 함께 기술된 하기 기재를 참조하여 이해될 수 있다.
도 1은 예시적인 매트릭스 유형의 미세유체 장치를 평면도로 나타낸다.
도 2는 반응 생성물의 회수를 허용하는 미세유체 장치 및 캐리어의 간략화된 사시도이다.
도 3은 반응 생성물의 회수를 허용하는 미세유체 장치의 간략화된 개략도이다.
도 4는 도 3에 도시된 미세유체 장치의 수개의 단위 세포의 간략화된 개략도이다.
도 5a는 반응 생성물의 회수를 허용하는 미세유체 장치의 간략화된 개략도이다.
도 5b는 도 5a에 도시된 미세유체 장치 부분의 간략화된 개략도이다.
도 6은 도 5a에 도시된 미세유체 장치의 수개의 단위 세포의 간략화된 개략도이다.
도 7은 반응 생성물의 회수를 허용하는 미세유체 장치를 작동하는 방법의 간략화된 흐름도이다.
도 8a 내지 8d는 작동 동안 반응 생성물의 회수를 허용하는 미세유체 장치의 단위 세포를 통한 유체 흐름을 도시하는 간략화된 개략도이다.
도 9a 내지 9d는 작동 동안 반응 생성물의 회수를 허용하는 미세유체 장치를 통한 유체 흐름을 도시하는 간략화된 개략도이다.
도 10은 염기서열분석 전에 표적 핵산을 바코딩하는 3-프라이머 증폭 방법의 실시 형태를 도시한다.
도 11은 실시예 1에 기재된 겔의 사진을 나타낸다. 레인은 다음과 같다: (2) 분자 마커; (4) 454개의 꼬리(tail)로 증폭된 샘플; (5) 454개의 꼬리로 증폭된 샘플(NTC); (7) A5 프라이머 쌍으로 증폭된 샘플; (8) A5 프라이머 쌍으로 증폭된 샘플(NTC); (10) 3개의 프라이머로 증폭된 샘플; 및 (11) 3개의 프라이머로 증폭된 샘플(NTC).
도 12는 실시예 4에서 Access Array IFC(Integrated Fluidic Circuit)에서 실행된 각각의 개별적인 샘플에 대하여 4개 Agilent 1K Biolanalyzer 칩에서 얻은 겔에서 본 전기영동도(gel-view electropherogram)를 나타낸다. 상기 도면의 각각의 컬럼은 각각의 샘플에서 DNA 생성물의 크기 분포를 나타낸다. 모든 샘플은 생성물의 유사한 분포를 생성한다.
도 13a 내지 13b는 실시예 4의 결과를 나타낸다. a) 표적 특이적 프라이머의 이러한 세트에 대하여 모든 PCR 생성물의 예측된 크기. b) Access Array IFC에서 얻은 샘플 풀 중 하나의 전기영동도. 단일 생성물 풀 내에서 생성물 크기의 분포. 모든 생성물은 (b)에 나타낸 예측된 크기 범위 내에 포함된다.
도 14a 내지 14c는 실시예 4의 결과를 나타낸다. a) 454개 서열의 실행에서 바코드 당 계수된 서열의 수. 상부 수평선은 바코드 당 평균 수치의 2배를 나타낸다. 하부 수평선은 바코드 당 평균 수치의 50%를 나타낸다. b) 앰플리콘 당 계수된 서열의 수. 도표에서 각각의 점은 Access Array IFC에서 개별적인 챔버에 대한 서열이 염기서열분석기에서 측정된 횟수를 나타낸다. 삼각형의 점은 평균 표시의 2배 초과인 PCR 반응을 나타낸다. 어두운 회색 점은 평균 표시의 0.5배 미만인 PCR 반응을 나타낸다. c) 앰플리콘 표시의 도수분포. 어두운 회색 선은 주어진 표시에 존재하는 앰플리콘의 수를 나타낸다. 밝은 회색 선은 주어진 범위(예컨대, 20x 범위에서 98%)에서 측정될 판독 수를 나타낸다. 평균의 2배 이내 앰플리콘의 백분율: 95.8%; 평균의 5배 이내 앰플리콘의 백분율: 99.7%.
도 15A 내지 15B는 프라이머 결합 부위 및 뉴클레오티드 태그의 상이한 결합을 가진 4개의 외부 프라이머(outer primer)를 사용하여 멀티 프라이머 반응 구성(set-up)의 예를 나타낸다. (실시예 5) A) 2개의 정방향 바코드 프라이머(454B-BC-Tag8, 454A-BC-Tag8) 및 2개의 역방향 바코드 프라이머(454A-BC-Tag5, 454B-BC-Tag8)는 하나의 내부 프라이머(inner primer) 쌍(Tag8-TSF 및 Tag5-TSR)과 결합된다. B) 이러한 PCR 반응에서 형성된 2개의 주요 PCR 생성물. 각각의 말단에서 454-A Tag8 및 454A-Tag5, 또는 각각의 말단에서 454B-Tag8 및 454B-Tag5를 포함하는 PCR 생성물은 PCR 억제 때문에 상당한 양의 PCR 생성물을 생성하지 않는다.
도 16a 내지 16b는 도 15B에서 각각의 앰플리콘에 대한 각각의 샘플에서 각각의 프라이머 서열의 표시를 나타낸다. 앰플리콘 당 계수된 서열의 수는 샘플 내 앰플리콘 당 평균수로 표준화되었다. 개별적인 앰플리콘에 대한 표준화된 수는 (a) 에멀젼 A 내 Tag5 앰플리콘 + 에멀젼 B 내 Tag 8 앰플리콘에 대하여 A 및 B 에멀젼 사이에, 그리고 (b) 에멀젼 B 내 Tag5 앰플리콘 + 에멀젼 A 내 Tag 8 앰플리콘에 대하여 A 및 B 에멀젼 사이에 합하여졌다. 중간의 어둔운 회색 선은 각각의 앰플리콘의 평균 표시를 나타낸다. 상부의 밝은 회색 선은 평균 범위의 2배를 나타낸다. 하부의 밝은 회색 라인은 평균 표시의 50%를 나타낸다.
도 17은 실시예 6의 결과를 나타낸다. Illumina GA II 염기서열분석기에서의 사용을 위하여 고안된 4개 프라이머(4-primer) 전략을 사용한 PCR 생성물의 성공적인 증폭. 표 14에 열거된 바코드 프라이머는 Outer Short로서 표지된다.
도 18은 실시예 8의 결과를 나타낸다. PCR 반응이 4개 프라이머 방식에서 오직 주형 특이적 프라이머에 대하여 실행될 때 PCR 프라이머 10개 세트 중 3개의 풀(A, B, C)의 PCR 반응. 4개 프라이머 전략에서 보다 큰 분자량 생성물의 존재는 성공적인 4개 프라이머 집합체를 입증한다.
도 19는 실시예 8의 결과를 나타낸다: 내부 및 외부 프라이머의 비율을 변화시키는 것은 내부 및 외부 프라이머를 사용한 멀티플렉스 4개 프라이머 PCR에서의 수율에 영향을 준다.
임의의 실시 형태에서, 본 발명은 뉴클레오티드 태그(들) 및 바코드 뉴클레오티드 서열이 표적 뉴클레오티드 서열에 첨가된 증폭 방법을 제공한다. 그 다음 첨가된 서열은 프라이머 및/또는 프로브 결합 부위로서의 역할을 할 수 있다. 바코드 뉴클레오티드 서열은 바코드 뉴클레오티드 서열이 부착된 표적 뉴클레오티드 서열에 대하여, 예컨대 샘플 기원(sample origin)과 같은 정보를 암호화할 수 있다. 표적 뉴클레오티드 서열을 태깅 및/또는 바코딩하는 것은, 분석 비용에서의 증가는 최소화하면서 단일 분석에서 하나 또는 다수의 표적에 대하여 분석될 수 있는 샘플의 수를 증가시킬 수 있다. 상기 방법은 특히 미세유체 장치에서 실행된 분석의 효율을 증가시키는데 매우 적합하다.
특정 실시 형태에서, 상기 방법은, 예컨대 DNA 염기서열분석 프라이머를 위한 결합 부위를 첨가하고, 선택적으로 그 후 DNA 염기서열분석을 위한 샘플 보정(sample calibration)을 함으로써 DNA 염기서열분석을 위한 핵산을 제조하는 데 사용된다. 구체적이고 예시적인 실시 형태에서, 상기 방법은 반응 생성물의 회수를 허용하는 미세유체 장치에서 DNA 염기서열분석 프라이머를 위한 결합 부위를 첨가하는데 이용될 수 있다. 이 유형의 예시적인 장치에서, 확장 펌핑은 미세유체 장치에서 실질적으로 모든 반응 생성물을 제거하는데 사용되어, 다양한 반응 생성물 풀 간의 균일성을 제공할 수 있다. 따라서, 부피 및 복제 수에 대하여 균일한 바코딩된 반응 생성물의 풀(pool)을 생성할 수 있다. 다양한 실시 형태에서, 부피 및/또는 복제 수 균일성은 부피 및/또는 복제 수에 대하여 장치에서 회수된 각각의 풀의 변동성이 약 100% 미만, 약 90% 미만, 약 80% 미만, 약 70% 미만, 약 60% 미만, 약 50% 미만, 약 40% 미만, 약 30% 미만, 약 20% 미만, 약 17% 미만, 또는 약 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4.5, 4, 3.5, 3, 2.5, 2, 1.5, 1, 또는 0.5% 미만인 것이다. 당업자는 부피 및/또는 복제 수 변동성이 이들 값중 임의의 값으로 한정된 임의의 범위(예컨대, 약 2 내지 약 7%)에 속할 수 있음을 인식한다. 예시적인 실시 형태에서, 미세유체 장치에서 회수된 샘플의 부피는 약 10% 이하로 다양하다. 표준 피펫팅 오류는 약 5 내지 10%이다. 따라서, 부피에서 관찰된 변동성은 피펫팅 오류에 크게 기인한다. 본원에 기재된 시스템과 방법을 사용함으로써, 종래 기술과 비교하여 염기서열분석 라이브러리를 제조하는데 필요한 시간과 수고가 감소된다.
본 발명은, 당업자에 의해 변경될 수 있는 본원에 기재된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약 등으로 한정되지 않음이 이해된다. 또한 본원에 사용된 용어는 특정한 예시적인 실시 형태만을 기재하는 목적으로 사용되며, 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 의도되지 않음이 이해된다. 또한 본원 및 첨부된 청구항에서 사용된 바와 같이, 문맥이 분명하게 달리 지시하지 않는다면 단수형(“a,” “an,” 및 “the”)은 복수 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어 “세포”에 대한 언급은 하나 이상의 세포 및 당업자에게 공지된 이의 등가물에 대한 언급이다.
본 발명의 실시 형태, 다양한 특징 및 이의 유리한 세부 사항은 첨부된 도면에서 기재되며/기재되거나 예시되고 하기 기재에서 상술된 비제한적인 실시 형태 및 실시예와 관련하여 보다 충분히 설명된다. 도면에 도시된 특징은 반드시 일정한 비례로 그려질 필요는 없으며, 본원에 명백하게 언급되어 있지 않다해도 당업자가 인식할 바와 같이 하나의 실시 형태의 특징은 다른 실시 형태와 함께 이용될 수 있음을 주목하여야 한다. 본 발명의 실시 형태를 불필요하게 모호하게 하지 않도록 공지된 구성 요소 및 처리 기술의 기재는 생략될 수 있다.
정의
청구항 및 명세서에 사용된 용어는 달리 명시되지 않는다면 하기 제시된 바와 같이 정의된다. 이러한 용어는 명확성을 위하여 구체적으로 정의되지만, 그러나 모든 정의는 당업자가 얼마나 이 용어를 이해할 것인지와 일치한다.
본원에서 핵산 내 2개의 뉴클레오티드 서열을 지칭하는데 사용될 때, 용어 “인접한”은 0 내지 약 20개 뉴클레오티드, 보다 구체적으로는 약 1 내지 약 10개 뉴클레오티드의 범위로 떨어진 뉴클레오티드 서열, 또는 서로 직접적으로 인접한 서열을 지칭할 수 있다.
용어 “핵산”은 뉴클레오티드 폴리머를 지칭하며, 달리 한정되지 않는다면 자연적으로 발생한 뉴클레오티드와 유사한 방식(예컨대, 혼성화)으로 작용할 수 있는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체(analog)를 포함한다.
용어 핵산은, 예를 들어 유전체 DNA; 상보 DNA(cDNA)(이는 보통 전령 RNA(mRNA)의 역전사 또는 증폭으로 얻어지는 mRNA의 DNA 표현임); 합성으로 또는 증폭으로 생성된 DNA 분자; 및 mRNA를 포함한 임의의 형태의 DNA 또는 RNA를 포함한다.
용어 핵산은 단일 가닥 분자뿐만 아니라 이중 또는 삼중 가닥 핵산을 포함한다. 이중 또는 삼중 가닥 핵산에서, 핵산 가닥은 동연(coextensive)일 필요는 없다(즉, 이중 가닥 핵산은 양 가닥의 전체 길이를 따라 이중 가닥일 필요는 없다).
용어 핵산은 또한 메틸화 및/또는 캡핑과 같은 것에 의한 이의 임의의 화학적 개질을 포함한다. 핵산 개질은 개별적인 핵산 염기 또는 핵산 전체에 추가적인 전하, 분극률, 수소 결합, 정전기 상호작용, 및 기능성을 포함하는 화학기의 첨가를 포함할 수 있다. 이러한 개질은 2' 위치 당 개질, 5 위치 피리미딘 개질, 8 위치 퓨린 개질, 시토신 환외(exocyclic) 아민에서의 개질, 5-브로모-우라실의 치환, 주쇄 개질, 이소염기 이소시티딘 및 이소구아니딘과 같은 특이 염기 쌍 조합 등과 같은 염기 개질을 포함할 수 있다.
보다 특히, 임의의 실시 형태에서, 핵산은 비뉴클레오티드 주쇄를 포함하는 다른 폴리머, 예를 들어 폴리아미드(예컨대, 펩티드 핵산(PNA)) 및 폴리모르폴리노(Anti-Virals, Inc., Corvallis, Oregon에서 Neugene으로 상업적으로 입수가능함) 폴리머, 및 DNA 및 RNA에서 발견되는 것과 같은 염기 쌍형성 및 염기 중첩(base stacking)을 허용하는 배열로 뉴클레오염기를 포함하는 폴리머라면 다른 합성 서열 특이적 핵산 폴리머뿐 만 아니라, 폴리디옥시리보뉴클레오티드(2-디옥시-D-리보스 포함), 폴리리보뉴클레오티드(D-리보스 포함), 및 퓨린 또는 피리미딘 염기의 N- 또는 C-글리코시드인 임의의 다른 유형의 핵산을 포함할 수 있다. 용어 핵산은 또한 연결된 핵산(linked nucleic acid, LNA)을 포함하며, LNA는 미국 특허 제6,794,499호, 제6,670,461호, 제6,262,490호 및 제6,770,748호에 기재되어 있고, 이들은 LNA의 개시에 대하여 전체적으로 본원에 참조로 포함된다.
핵산(들)은 고상 매개 화학적 합성(solid phase-mediated chemical synthesis)과 같은 완전한 화학적 합성 과정으로부터, 핵산을 생성하는 임의의 종으로부터 분리를 통해서와 같은 생물학적 공급원으로부터, 또는 DNA 복제, PCR 증폭, 역전사와 같은 분자 생물학 도구에 의한 핵산의 취급과 관련된 과정으로부터, 또는 이들 과정의 결합으로부터 유도될 수 있다.
용어 “표적 핵산”은 본원에서 본 발명의 방법에서 검출되는 특정 핵산을 지칭하는데 사용된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “표적 뉴클레오티드 서열”은, 예를 들어 표적 핵산 또는 RNA 표적 핵산의 역전사시 생성된 cDNA의 증폭에 의해 얻어진 증폭 생성물과 같은 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분자를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “상보”는 2개의 뉴클레오티드 사이의 정확한 쌍형성에 대한 능력을 지칭한다. 즉, 핵산의 주어진 위치에서 뉴클레오티드가 다른 핵산의 뉴클레오티드와 수소 결합을 할 수 있다면, 2개의 핵산은 그 위치에서 서로 상보적인 것으로 여겨진다. 뉴클레오티드의 일부만이 결합하여 2개의 단일 가닥 핵산 분자 사이의 상보성은 “부분적”일 수 있거나, 또는 전체 상보성이 단일 가닥 분자 사이에 존재할 때 상보성은 완전할 수 있다. 핵산 가닥 사이의 상보성의 정도는 핵산 가닥 사이의 혼성화의 효율 및 강도에 상당한 영향을 미친다.
“특이적 혼성화”는 정의된 엄격(stringent) 조건 하에서 혼성화 혼합물 내 존재하는 다른 뉴클레오티드 서열에 실질적인 결합이 없을 때 표적 뉴클레오티드 서열에의 핵산의 결합을 지칭한다. 당업자는 혼성화 조건의 엄격함을 완화시키는 것이 서열의 미스매치(mismatch)가 용인될 수 있도록 한다는 것을 인식한다.
특정 실시 형태에서, 혼성화는 엄격 혼성화 조건 하에서 실행된다. 어구 “엄격 혼성화 조건”은 일반적으로 정의된 이온 강도 및 pH에서 특이적 서열에 대하여 녹는점(Tm) 보다 낮은 약 5℃ 내지 약 20℃ 또는 25℃의 범위의 온도를 지칭한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, Tm은 일군의 이중 가닥 핵산 분자가 단일 가닥으로 절반이 분리될 때의 온도이다. 핵산의 Tm을 계산하는 방법은 업계에 공지되어 있다(예컨대, 문헌 [Berger와 Kimmel (1987) METHODS IN ENZYMOLOGY, VOL.152: GUIDE TO MOLECULAR CLONING TECHNIQUES, San Diego: Academic Press, Inc.] 및 [Sambrook et al. (1989) MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2ND ED., VOLS. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory] 참조, 둘 다 본원에 참조로 포함됨). 표준 참조 문헌이 나타내는 바와 같이, 핵산이 1M NaCl의 수용액에 있을 경우, Tm 값의 단순한 추정은 식 Tm =81.5+0.41(% G+C)으로 계산될 수 있다(예컨대, 문헌 [Anderson과 Young, Quantitative Filter Hybridization in NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION (1985)] 참조). 하이브리드의 녹는점(및 따라서 엄격 혼성화에 대한 조건)은 염과 다른 성분의 농도(예컨대, 포름아미드, 덱스트란 설페이트, 폴리에틸렌 글리콜의 존재 또는 부재) 뿐만 아니라 프라이머 또는 프로브의 길이 및 특성(DNA, RNA, 염기 조성) 및 표적 핵산의 특성(DNA, RNA, 염기 조성, 용액에의 존재 또는 고정된 상태 등)과 같은 다양한 인자에 의해 영향 받는다. 이러한 인자의 영향은 업계에 공지되어 있으며 표준 참조 문헌에 논의되어 있다. 대부분 서열의 특이적 혼성화를 달성하기에 적합한 예시적인 엄격 조건은 적어도 약 60℃의 온도와 pH 7 에서 약 0.2몰의 염 농도이다.
용어 “올리고뉴클레오티드”는 비교적 짧은 핵산, 일반적으로 200개 뉴클레오티드보다 짧은 핵산, 보다 특히 100개 뉴클레오티드보다 짧은 핵산, 가장 특히 50개 뉴클레오티드보다 짧은 핵산을 지칭하는데 사용된다. 통상적으로, 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥 DNA 분자이다.
용어 “프라이머”는 적절한 버퍼 및 적합한 온도에서 핵산과 혼성화할 수 있고, 적절한 조건 하에서(즉, 4개의 상이한 뉴클레오시드 트리포스페이트, 및 DNA또는 RNA 중합효소 또는 역전사효소와 같은 중합화를 위한 제제의 존재하에) 뉴클레오티드(RNA 또는 DNA) 중합화에 대한 개시 부위의 역할을 할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 프라이머의 적절한 길이는 프라이머의 의도된 용도에 따라 달라지지만, 프라이머는 길이가 통상적으로 적어도 7개 뉴클레오티드 길이, 보다 통상적으로 10 내지 30개 뉴클레오티드 범위, 또는 훨씬 더 통상적으로 15 내지 30개 뉴클레오티드 길이이다. 다른 프라이머는 예컨대 30 내지 50개 뉴클레오티드 길이와 같이 다소 더 길 수 있다. 이 문맥에서, “프라이머 길이”는 상보적인 “표적” 서열에 혼성화하여 뉴클레오티드 합성을 준비하는 올리고뉴클레오티드 또는 핵산의 부분을 지칭한다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정한 하이브리드 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머는 주형의 정확한 서열을 반영할 필요는 없지만 주형과 혼성화하기에 충분히 상보적이어야 한다. 용어 “프라이머 부위” 또는 “프라이머 결합 부위”는 프라이머가 혼성화하는 표적 핵산의 부분을 지칭한다.
프라이머는 프라이머 또는 이의 부분이 핵산 내에서 뉴클레오티드 서열에 혼성화한다면 다른 핵산에 어닐링한다고 말해진다. 프라이머가 특정 뉴클레오티드 서열에 혼성화한다는 서술은 프라이머가 뉴클레오티드 서열에 완전히 또는 배타적으로 혼성화한다는 것을 의미하는 것으로 의도되지 않는다. 예를 들어, 임의의 실시 형태에서, 본원에 사용된 증폭 프라이머는 “뉴클레오티드 태그에 어닐링”되는 것으로 말해진다. 이러한 기재는 뉴클레오티드 태그에 부분적으로 어닐링하고 인접한 뉴클레오티드 서열, 예컨대 표적 뉴클레오티드 서열에 부분적으로 어닐링하는 프라이머 뿐만 아니라 뉴클레오티드 태그에 전체적으로 어닐링하는 프라이머를 포함한다. 이러한 하이브리드 프라이머는 증폭 반응의 특이성을 증가시킬 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “표적 핵산으로의 실질적인 어닐링을 피하기 위한” 프라이머의 선택은 증폭 후에 검출되는 대부분의 앰플리콘이 앰플리콘이 표적 핵산 내에서 시작하여 생성(예상보다 짧은 앰플리콘을 생성함)되는 것과 반대로, 앰플리콘이 표적 핵산의 각각의 말단의 예상된 부위에서 시작하여 생성된다는 의미에서 “전장(full-length)”이도록 프라이머가 선택되는 것을 의미한다. 다양한 실시 형태에서, 프라이머는 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%가 전장이도록 선택된다.
용어 “프라이머 쌍”은 증폭되는 DNA 서열의 5' 말단의 상보물(complement)과 혼성화하는 5' “상류 프라이머” 또는 “정방향 프라이머”및 증폭되는 서열의 3' 말단과 혼성화하는 3' “하류 프라이머” 또는 “역방향 프라이머”를 포함하는 프라이머의 세트를 지칭한다. 당업자가 인식할 바와 같이, 용어 “상류” 및 “하류” 또는 “정방향” 및 “역방향”은 한정하는 것으로 의도되지 않으며, 오히려 특정 실시 형태에서 예시적인 방향을 제공한다.
“프로브”는 하나 이상 유형의 화학 결합을 통하여, 일반적으로 상보적 염기 쌍형성을 통하여, 보통 수소 결합 형성을 통하여 상보적인 서열의 표적 핵산에 결합하고 따라서 이중나선(duplex) 구조를 형성할 수 있는 핵산이다. 프로브는 “프로브 결합 부위”에 결합 또는 혼성화한다. 특히, 일단 프로브가 프로브의 상보적인 표적에 혼성화하면 프로브의 검출을 용이하게 하도록 프로브는 검출가능한 표지로 표지될 수 있다. 그러나 대안적으로, 프로브는 표지화되지 않을 수 있지만, 표지화된 리간드와의 특이적 결합에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있다. 프로브는 크기가 상당히 다양할 수 있다. 일반적으로 프로브는 길이가 적어도 7 내지 15개 뉴클레오티드이다. 다른 프로브는 길이가 적어도 20, 30 또는 40개 뉴클레오티드이다. 또 다른 프로브는 다소 더 길며, 길이가 적어도 50, 60, 70, 80, 또는 90개 뉴클레오티드이다. 또 다른 프로브는 더욱 더 길며, 길이가 적어도 100, 150, 200개 또는 그 이상의 뉴클레오티드이다. 프로브는 또한 상기 값(예컨대, 길이가 15~20개 뉴클레오티드)의 임의의 값으로 한정된 임의의 범위 내에 있는 임의의 길이의 것일 수 있다.
프라이머 또는 프로브는 표적 핵산 서열에 완벽히 상보적일 수 있거나 또는 완벽히 상보적인 것보다 덜 상보적일 수 있다. 임의의 실시 형태에서, 프라이머는 적어도 7개 뉴클레오티드의 서열 이상, 보다 통상적으로 10~30개 뉴클레오티드 범위의 서열 이상, 그리고 종종 적어도 14~25개 뉴클레오티드의 서열 이상 표적 핵산 서열의 상보물에 대하여 적어도 65% 동일성을 가지고, 보다 종종 적어도 75% 동일성, 적어도 85% 동일성, 적어도 90% 동일성, 또는 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 가진다. 일정 염기(예컨대, 프라이머의 3' 염기)가 표적 핵산 서열의 해당 염기에 일반적으로 바람직하게 완벽히 상보적인 것으로 이해될 것이다. 프라이머 및 프로브는 통상적으로 엄격 혼성화 조건 하에서 표적 서열에 어닐링한다.
용어 “뉴클레오티드 태그”는 본원에서 표적 뉴클레오티드 서열에 첨가되는 소정의 뉴클레오티드 서열을 지칭하는데 사용된다. 뉴클레오티드 태그는 표적 뉴클레오티드 서열의 아이덴티티(identity) 또는 표적 뉴클레오티드 서열이 유도된 샘플의 아이덴티티와 같은 표적 뉴클레오티드 서열에 관한 정보 항목을 암호화할 수 있다. 임의의 실시 형태에서, 이러한 정보는 예컨대, 2개 뉴클레오티드 태그의 결합과 같은 하나 이상의 뉴클레오티드 태그에 암호화될 수 있고, 표적 뉴클레오티드 서열의 어느 하나의 말단은 표적 뉴클레오티드 서열의 아이덴티티를 암호화할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “바코드 프라이머”는 바코드 프라이머가 증폭 반응에 이용될 때 생성되는 앰플리콘에 대한 정보를 암호화하는 특이적인 바코드 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머를 지칭한다. 예를 들어, 상이한 바코드 프라이머가 많은 상이한 샘플의 각각으로부터 하나 이상의 표적 서열을 증폭하는데 이용될 수 있으며, 이에 따라 바코드 뉴클레오티드 서열은 생성된 앰플리콘의 샘플 기원을 나타낸다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “암호화 반응”은 적어도 하나의 뉴클레오티드 태그가 표적 뉴클레오티드 서열에 첨가되는 반응을 지칭한다. 뉴클레오티드 태그는, 예를 들어 적어도 하나의 프라이머가 표적 특이적 부분 및 표적 특이적 부분의 5' 말단에 위치한 뉴클레오티드 태그 및 표적 특이적 부분만 또는 표적 특이적 부분과 표적 특이적 부분의 5' 말단에 위치한 뉴클레오티드 태그를 포함하는 제2 프라이머를 포함하는 “암호화 PCR”에 의해 첨가될 수 있다. 암호화 PCR에 적용가능한 PCR 프로토콜의 예시적인 예는 계류중인 WO 출원 US 제03/37808호 및 미국 특허 제6,605,451호를 참조한다. 뉴클레오티드 태그는, 또한 적어도 하나의 프라이머가 표적 특이적 부분 및 표적 특이적 부분의 5' 말단에 위치한 뉴클레오티드 태그 및 표적 특이적 부분만 또는 표적 특이적 부분과 표적 특이적 부분의 5' 말단에 위치한 뉴클레오티드 태그를 포함하는 제2 프라이머를 포함하는 결찰 반응을 포함할 수 있는 “암호화 결찰” 반응으로 첨가될 수 있다. 예시적인 암호화 결찰 반응은 예를 들어 미국 특허공개 제2005/0260640호(이는 전체적으로 본원에 참조로 포함됨)에, 특히 결찰 반응에 대하여 기재되어 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “암호화 반응”은 표적 뉴클레오티드 서열에 연결된 뉴클레오티드 태그를 포함하는 “태깅된 표적 뉴클레오티드 서열”을 생성한다.
프라이머의 일부분에 대하여 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “표적 특이적” 뉴클레오티드 서열은 적합한 어닐링 조건 하에서 표적 핵산 또는 표적 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 어닐링할 수 있는 서열을 지칭한다.
프라이머의 일부분에 대하여 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “뉴클레오티드 태그 특이적 뉴클레오티드 서열”은 적합한 어닐링 조건 하에서 뉴클레오티드 태그에 특이적으로 어닐링할 수 있는 서열을 지칭한다.
본 발명의 교시에 따른 증폭은 적어도 하나의 표적 핵산의 적어도 한 부분이, 통상적으로 이로 한정되지 않지만 선형으로 또는 기하급수적으로 핵산 서열을 증폭하기 위한 광범위한 기술을 포함한 주형 의존적 방식으로 재생되는 임의의 수단을 포함한다. 증폭 단계를 실행하기 위한 예시적인 수단은 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction, LCR), 리가아제 검출 반응(ligase detection reaction, LDR), 결찰 후 Q-레플리카제 증폭, PCR, 프라이머 신장법(primer extension), 사슬 치환 증폭법(strand displacement amplification, SDA), 고차가지 사슬 치환 증폭법(hyperbranched strand displacement amplification), 다중 치환 증폭법(multiple displacement amplification, MDA), 핵산 가닥 기반 증폭법(nucleic acid strand-based amplification, NASBA), 2단계 멀티플렉싱된 증폭법(two-step multiplexed amplification), 롤링 서클 증폭법(rolling circle amplification, RCA) 등을 포함하며, 예를 들어 이로 한정되지 않지만 OLA/PCR, PCR/OLA, LDR/PCR, PCR/PCR/LDR, PCR/LDR, LCR/PCR, PCR/LCR(또한 결합된 연쇄 반응--CCR으로도 알려짐)과 같은 복합 형태 및 이의 결합을 포함한다. 이러한 기술의 기재는 다른 출처인 문헌 [Ausbel et al.; PCR Primer: A Laboratory Manual, Diffenbach, Ed., Cold Spring Harbor Press (1995)]; [The Electronic Protocol Book, Chang Bioscience (2002)]; [Msuih et al., J. Clin. Micro. 34:501-07 (1996)]; [The Nucleic Acid Protocols Handbook, R. Rapley, ed., Humana Press, Totowa, N.J. (2002)]; [Abramson et al., Curr Opin Biotechnol. 1993 Feb.;4(1):41-7], 미국 특허 제6,027,998호; 미국 특허 제6,605,451호, PCT 공개 WO 제97/31256호(Barany et al.,); PCT 공개 WO 제01/92579호(Wenz et al.,); [Day et al., Genomics, 29(1): 152-162 (1995)], [Ehrlich et al., Science 252:1643-50 (1991)]; [Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990)]; [Favis et al., Nature Biotechnology 18:561-64 (2000)]; [Rabenau et al., Infection 28:97-102 (2000)]; [Belgrader, Barany, 및 Lubin, Development of a Multiplex Ligation Detection Reaction DNA Typing Assay, Sixth International Symposium on Human Identification, 1995 (월드와이드웹 promega.com/geneticidproc/ussymp6proc/blegrad.html-에서 이용가능함)]; [LCR Kit Instruction Manual, Cat. #200520, Rev. #050002, Stratagene, 2002]; [Barany, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:188-93 (1991)]; [Bi 및 Sambrook, Nucl. Acids Res. 25:2924-2951 (1997)]; [Zirvi et al., Nucl. Acid Res. 27:e40i-viii (1999)]; [Dean et al., Proc Natl Acad Sci USA 99:5261-66 (2002)]; [Barany 및 Gelfand, Gene 109:1-11 (1991)]; [Walker et al., Nucl. Acid Res. 20:1691-96 (1992)]; [Polstra et al., BMC Inf. Dis. 2:18- (2002)]; [Lage et al., Genome Res. 2003 Feb.;13(2):294-307], 및 [Landegren et al., Science 241:1077-80 (1988)], [Demidov, V., Expert Rev Mol Diagn. 2002 Nov.;2(6):542-8.], [Cook et al., J Microbiol Methods. 2003 May;53(2):165-74], [Schweitzer et al., Curr Opin Biotechnol. 2001 Feb.;12(1):21-7], 미국 특허 제5,830,711호, 미국 특허 제6,027,889호, 미국 특허 제5,686,243호, PCT 공개 WO제0056927A3호, 및 PCT 공개 WO 제9803673A1호에서 찾아볼 수 있다.
일부 실시 형태에서, 증폭은 적어도 하나의 표적 핵산에서 상보적인 또는 실질적으로 상보적인 서열과 적어도 하나의 프라이머를 어닐링 하는 단계; 중합효소를 사용하여 주형 의존적 방식으로 뉴클레오티드의 적어도 하나의 가닥을 합성하는 단계; 및 새로 형성된 핵산 이중 나선을 변성시켜 가닥을 분리하는 단계의 순차적인 절차의 적어도 하나의 사이클을 포함한다. 상기 사이클은 반복될 수 있거나 반복되지 않을 수 있다. 증폭은 열순환(thermocycling) 단계를 포함할 수 있거나 등온으로 실행될 수 있다.
용어 “qPCR”은 본원에서 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 지칭하는데 사용되며, 이는 또한 “실시간 PCR” 또는 “동력 중합효소 연쇄 반응(kinetic polymerase chain reaction)”으로도 알려져 있다.
“시약”은 분석물(예컨대, 분석되는 핵산) 이외에 반응에서 사용되는 임의의 제제를 광범위하게 지칭한다. 핵산 증폭 반응을 위한 예시적인 시약은 이로 한정되지 않지만 버퍼, 금속 이온, 중합효소, 역전사효소, 프라이머, 주형 핵산, 뉴클레오티드, 표지, 염료, 뉴클레아제 등을 포함한다. 효소 반응을 위한 시약은 예를 들어 기질, 보조인자(cofactor), 버퍼, 금속 이온, 억제제 및 활성제를 포함한다.
용어 “보편적 검출 프로브”는 생성물에 존재하는 표적 뉴클레오티드 서열의 아이덴티티와 관계없이, 본원에서 증폭 생성물의 존재를 식별하는 임의의 프로브를 지칭하는데 사용된다.
용어 “보편적 qPCR 프로브”는 본원에서 qPCR 동안 증폭 생성물의 존재를 식별하는 임의의 이러한 프로브를 지칭하는데 사용된다. 특정 실시 형태에서, 본 발명에 따른 뉴클레오티드 태그는 보편적 qPCR 프로브와 같은 검출 프로브가 결합하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 태그가 표적 뉴클레오티드 서열의 양쪽 말단에 첨가되는 경우, 원한다면 각각의 태그는 검출 프로브로 인식되는 서열을 포함할 수 있다. 이러한 서열의 결합은 태그된 표적 뉴클레오티드 서열의 아이덴티티 또는 샘플 기원에 관한 정보를 암호화할 수 있다. 다른 실시 형태에서, 하나 이상의 증폭 프라이머는 보편적 qPCR프로브와 같은 검출 프로브가 결합하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 이러한 방식으로, 하나, 둘, 또는 그 이상의 프로브 결합 부위는 본 발명의 방법의 증폭 단계 동안 증폭 생성물에 첨가될 수 있다. 당업자는 (실행된다면) 사전증폭(preamplification) 및 증폭 동안 다수의 프로브 결합 부위의 도입 가능성이 복합 검출을 용이하게 하고, 여기에서 둘 이상의 상이한 증폭 생성물은 주어진 증폭 혼합물 또는 이의 분취액(aliquot)에서 검출될 수 있음을 인식한다.
용어 “보편적 검출 프로브”는 또한 검출가능한 표지(예컨대, 형광 표지)로 표지된 프라이머 뿐만 아니라, SYBR Green과 같은 이중 가닥 DNA(dsDNA) 염료를 포함한 DNA 결합 염료와 같은 서열 비특이적(non-sequence-specific) 프로브를 포함하는 것으로 의도된다.
용어 “표적 특이적 qPCR 프로브”는 생성물에 존재하는 표적 뉴클레오티드 서열에의 qPCR 프로브의 혼성화에 기초하여, 본원에서 qPCR 동안 증폭 생성물의 존재를 식별하는 qPCR 프로브를 지칭하는데 사용된다.
“가수분해 프로브”는 일반적으로 미국 특허 제5,210,015호에 기재되어 있으며, 이는 가수분해 프로브의 기재에 대하여 전체적으로 본원에 참조로 포함된다. 가수분해 프로브는 PCR 반응에서 통상적으로 사용되는 내열성 Taq 중합효소(TaqMan® probe technology, Applied Biosystems, Foster City CA)에 존재하는 5'-뉴클레아제 활성을 이용한다. 가수분해 프로브는 플루오레신과 같은 형광 검출 염료, 및 수용체 염료(acceptor dye) 또는 소광제(quencher)로 표지된다. 일반적으로, 형광 염료는 프로브의 5' 말단에 공유 부착되고 소광제는 프로브의 3' 말단에 부착되며, 프로브가 온전할 경우 검출 염료의 형광이 형광 공명 에너지 전이(fluorescence resonance energy transfer, FRET)로 소광된다. 프로브는, PCR 반응에서 표적 핵산의 한쪽 말단을 한정하는 프라이머 중 하나의 하류에서 어닐링한다. Taq 효소의 중합효소 활성을 사용함으로써, 표적 핵산의 증폭은 프로브의 상류인 하나의 프라이머 및 프로브의 하류지만 표적 핵산의 반대 가닥으로 어닐링되는 제2 프라이머에 의해 지시된다. 상류 프라이머가 연장되면서, Taq 중합효소는 표지된 프로브가 어닐링되는 부위에 도달하고, 기질로서 프로브-주형 하이브리드를 인식하며, 프로브의 포스포디에스테르 결합을 가수분해한다. 가수분해 반응은 리포터 염료 상의 소광제 염료의 소광 효과를 돌이킬 수 없게 해제하고, 따라서 각각의 연속적인 PCR 사이클로 검출 형광을 증가시킨다. 특히, 본 발명에서의 사용에 적합한 가수분해 프로브는 인간 및 다른 게놈 및/또는 전사체(transcriptome)에서 공통되는 8-mer 또는 9-mer 모티프를 검출할 수 있으며, 연결된 핵산(LNA) 유사체의 사용으로 가능하게 된 약 70℃의 높은 Tm을 가질 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “표지”는 검출가능 및/또는 정량적인 신호를 제공하는데 사용될 수 있는 임의의 원자 또는 분자를 지칭한다. 특히, 표지는 핵산 또는 단백질에 직접적으로 또는 간접적으로 부착될 수 있다. 프로브에 부착될 수 있는 적합한 표지는 이로 한정되지 않지만, 방사성동위원소, 형광단, 발색단, 질량 표지(mass label), 전자 치밀 입자(electron dense particle), 자성 입자(magnetic particle), 스핀 표지(spin label), 화학발광하는 분자, 전기화학적으로 활성인 분자, 효소, 보조인자, 및 효소 기질을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “염료”는 일반적으로 340nm 이상의 파장에서 전자기 방사선(electromagnetic radiation)을 흡수하는 임의의 유기 또는 무기 분자를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 “형광 염료”는 일반적으로 램프, 포토다이오드 또는 레이저와 같은 전자기 방사선의 공급원에 의한 방사시 형광 메커니즘에 의하여 더 긴 파장의 전자기 방사선을 발하는 임의의 염료를 지칭한다.
용어 “엘라스토머”는 업계에서 사용되는 일반적인 의미를 가진다. 따라서, 예를 들어 Allcock et al.(Contemporary Polymer Chemistry, 2nd Ed.)는 일반적으로 엘라스토머를 유리 전이 온도와 액화 온도(liquefaction temperature) 사이의 온도에서 존재하는 폴리머로서 기재한다. 폴리머 사슬이 비틀림 운동(torsional motion)을 용이하게 겪어 힘에 대한 반응으로 주쇄 사슬의 풀림(uncoiling)을 허용하고, 힘이 없으면 주쇄 사슬이 다시 감겨서 이전의 모양을 취하기 때문에 엘라스토머 물질은 탄성 특성을 나타낸다. 일반적으로, 힘이 적용되면 엘라스토머는 변형되지만, 그 다음 힘이 제거되면 원래 모양으로 되돌아간다.
“다형성 마커(polymorphic marker)” 또는 “다형성 부위”는 뉴클레오티드 서열의 분기(divergence)가 일어나는 좌위이다. 예시적인 마커는 적어도 2개의 대립유전자를 가지며, 각각 선택된 집단의 1% 초과의 빈도, 보다 통상적으로는 10% 또는 20% 초과의 빈도로 일어난다. 다형성 부위는 하나의 염기 쌍만큼 작을 수 있다. 다형성 마커는 제한효소 단편 길이 다형성(restriction fragment length polymorphism, RFLPs), 다수 직렬 반복 부위(variable number of tandem repeat, VNTR), 초가변영역, 미소부수체(minisatellite), 디뉴클레오티드 반복, 트리뉴클레오티드 반복, 테트라뉴클레오티드 반복, 단순 염기서열 반복(simple sequence repeat), 결실, 및 Alu와 같은 삽입 성분을 포함한다. 제1의 식별된 대립유전자 형태는 참조 형태로서 임의적으로 지정되고 다른 대립유전자 형태는 대안 또는 변형 대립유전자로서 지정된다. 선택된 집단에서 가장 빈번하게 일어나는 대립유전자 형태는 때때로 야생형 형태로서 지칭된다. 이배체 생물(diploid organism)은 대립유전자 형태에 대하여 동형접합적(homozygous) 또는 이형접합적(heterozygous)일 수 있다. 이대립유전자 다형성(diallelic polymorphism)은 2개의 형태를 가진다. 삼대립유전자 다형성(triallelic polymorphism)은 3개의 형태를 가진다.
“단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)”은 단일 뉴클레오티드가 차지하는 다형성 부위에서 일어나며, 상기 부위는 대립유전자 서열 사이에서 변형이 일어나는 부위이다. 상기 부위는 보통 대립유전자의 고도로 보존된 서열(예컨대, 집단의 1/100 또는 1/1000 요소 미만으로 변하는 서열)의 앞에 그리고 뒤에 온다. SNP는 보통 다형성 부위에서 하나의 뉴클레오티드가 다른 뉴클레오티드로 대체되기 때문에 일어난다. 전이는 하나의 퓨린이 다른 퓨린으로 치환 또는 하나의 피리미딘이 다른 피리미딘으로 치환되는 것이다. 전환(transversion)은 퓨린이 피리미딘으로 치환되는 것 또는 그 반대이다. SNP는 또한 참조 대립유전자에 대하여 뉴클레오티드의 삽입 또는 뉴클레오티드의 결실로 일어날 수 있다.
증폭 방법
일반론
특정 실시 형태에서, 본 발명은 다수(예컨대, 적어도 3개)의 선택된 뉴클레오티드 서열을 하나 이상의 표적 핵산(들) 내로 도입하는 증폭 방법을 제공한다. 상기 방법은 통상적으로 다수의 샘플에서 다수의 표적 핵산을 증폭하는 단계를 수반한다. 예시적인 실시 형태에서, 동일 세트의 표적 핵산은 2개 이상의 상이한 샘플 각각에서 증폭될 수 있다. 샘플은 어떤 식으로든 서로 상이할 수 있으며, 예를 들어 샘플은 상이한 조직, 개체, 환경 출처 등으로부터의 것일 수 있다. 적어도 3개의 프라이머, 즉 정방향 및 역방향 증폭 프라이머가 각각의 표적 핵산을 증폭하는데 사용될 수 있으며, 각각의 프라이머는 표적 특이적 부분을 포함하고 하나 또는 두가지 프라이머 모두 뉴클레오티드 태그를 포함한다. 표적 특이적 부분은 적합한 어닐링 조건 하에서 표적에 특이적으로 어닐링할 수 있다. 정방향 프라이머에 대한 뉴클레오티드 태그는 역방향 프라이머에 대한 뉴클레오티드 태그와 동일하거나 역방향 프라이머에 대한 뉴클레오티드 태그와 상이한 서열을 가질 수 있다. 일반적으로 뉴클레오티드 태그는 표적 특이적 부분의 5'이다. 제3 프라이머는 바코드 뉴클레오티드 서열 및 제1 및/또는 제2 뉴클레오티드 태그 특이적 부분을 포함하는 바코드 프라이머이다. 바코드 뉴클레오티드 서열은 바코드 프라이머가 증폭 반응에 이용될 때 생성된 앰플리콘에 대한 정보를 암호화하도록 선택된 서열이다. 태그 특이적 부분은 정방향 및 역방향 프라이머에서 하나 또는 둘 다의 뉴클레오티드 태그에 특이적으로 어닐링할 수 있다. 바코드 프라이머는 일반적으로 태그 특이적 부분의 5'이다.
바코드 프라이머는 통상적으로 정방향 및/또는 역방향 프라이머(들)보다 과량으로 증폭 혼합물에 존재한다. 보다 특이적으로, 바코드 프라이머가 정방향 프라이머에서 뉴클레오티드 태그에 어닐링하면, 바코드 프라이머는 일반적으로 정방향 프라이머보다 과량으로 존재한다. 바코드 프라이머가 역방향 프라이머에서 뉴클레오티드 태그에 어닐링하면, 바코드 프라이머는 일반적으로 역방향 프라이머보다 과량으로 존재한다. 각각의 예에서, 증폭 혼합물 내 제3 프라이머, 즉 역방향 프라이머 또는 정방향 프라이머가 각각 예시적인 실시 형태에서 바코드 프라이머의 농도에 거의 유사한 농도로 존재할 수 있다. 일반적으로 바코드 프라이머는 상당히 과량으로 존재한다. 예를 들어, 증폭 혼합물에서 바코드 프라이머의 농도는 정방향 및/또는 역방향 프라이머(들)의 농도에 대해 적어도 2배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 15배, 적어도 20배, 적어도 25배, 적어도 30배, 적어도 35배, 적어도 40배, 적어도 45배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 500배, 적어도 103배, 적어도 5 ×103배, 적어도 104배, 적어도 5 ×104배, 적어도 105배, 적어도 5 ×105배, 적어도 106배, 또는 그 이상일 수 있다. 추가적으로, 바코드 프라이머의 농도 초과는 종말점으로서 임의의 상기 값을 가지는 임의의 범위 내(예컨대, 2배 내지 105배)에 속할 수 있다. 예시적인 실시 형태에서, 바코드 프라이머가 정방향 프라이머에서 뉴클레오티드 태그에 대하여 특이적인 태그 특이적 부분을 가질 경우, 정방향 프라이머는 피코몰 내지 나노몰의 농도, 예컨대 약 5pM 내지 500nM, 약 5pM 내지 100nM, 약 5pM 내지 50nM, 약 5pM 내지 10nM, 약 5pM 내지 5nM, 약 10pM 내지 1nM, 약 50pM 내지 약 500pM, 약 100pM 또는 종말점으로서 임의의 이들 값을 가지는 임의의 다른 범위(예컨대, 10pM 내지 50pM)로 존재할 수 있다. 정방향 프라이머의 임의의 이들 농도와 결합하여 사용될 수 있는 바코드 프라이머의 적합하고 예시적인 농도는 약 10nM 내지 약 10μM, 약 25nM 내지 약 7.5μM, 약 50nM 내지 약 5μM, 약 75nM 내지 약 2.5μM, 약 100nM 내지 약 1μM, 약 250nM 내지 약 750nM, 약 500nM 또는 종말점으로서 임의의 이들 값을 가지는 임의의 다른 범위(예컨대, 100nM 내지 500nM)를 포함한다. 정방향 및 바코드 프라이머의 이러한 농도를 사용하는 증폭 반응에서, 역방향 프라이머는 바코드 프라이머와 동일한 정도(예컨대, 약 10배 이내, 약 5배 이내 또는 동일)로 농도를 가진다.
각각의 증폭 혼합물은 증폭되어 태깅된 표적 뉴클레오티드 서열을 포함하는 표적 앰플리콘을 생성할 수 있고, 각각의 표적 앰플리콘은 표적 뉴클레오티드 서열의 측면에 위치하는 제1 및 제2 뉴클레오티드 태그, 및 (표적 앰플리콘의 하나의 가닥에 대하여) 표적 앰플리콘의 5' 또는 3' 말단에 적어도 하나의 바코드 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 임의의 실시 형태에서, 표적 핵산에 대한 실질적인 어닐링을 피하도록 제1 및 제2 뉴클레오티드 태그 및/또는 바코드 뉴클레오티드 서열이 선택된다. 이러한 실시 형태에서, 태깅된 표적 뉴클레오티드 서열은 다음의 요소를 가지는 분자를 포함할 수 있다: 5'-(바코드 뉴클레오티드 서열)-(정방향 프라이머로부터의 제1 뉴클레오티드 태그)-(표적 뉴클레오티드 서열)-(역방향 프라이머로부터의 제2 뉴클레오티드 태그 서열)-3' 또는 5'-(정방향 프라이머로부터의 제1 뉴클레오티드 태그)-(표적 뉴클레오티드 서열)-(역방향 프라이머로부터의 제2 뉴클레오티드 태그 서열)-(바코드 뉴클레오티드 서열)-3'.
예시적인 실시 형태에서, 바코드 뉴클레오티드 서열은 특정 샘플을 식별한다. 따라서, 예를 들어 T개 표적 핵산의 세트가 각각의 S개 샘플에서 증폭될 수 있으며, 여기에서 S와 T는 일반적으로 1보다 큰 정수이다. 이러한 실시 형태에서, 증폭은 각각의 샘플에 대하여 별도로 실행될 수 있으며, 여기에서 정방향 및 역방향 프라이머의 동일한 세트는 각각의 샘플에 대하여 사용되고 정방향 및 역방향 프라이머의 세트는 상기 세트에서 모든 프라이머에 공통된 적어도 하나의 뉴클레오티드 태그를 가진다. 상이한 바코드 프라이머는 각각의 샘플에 사용될 수 있으며, 여기에서 바코드 프라이머는 공통된 뉴클레오티드 태그에 어닐링할 수 있는 동일한 태그 특이적 부분을 제외하고는 상이한 바코드 뉴클레오티드 서열을 가진다. 이 실시 형태는 다수의 표적 서열에 대하여 생성된 앰플리콘에서 샘플 기원을 암호화하기 위하여 합성될 필요가 있을 상이한 프라이머의 수를 감소시키는 장점을 가진다. 대안적으로, 정방향 및 역방향 프라이머의 상이한 세트는 각각의 샘플에 대하여 이용될 수 있으며, 여기에서 각각의 세트는 다른 세트에서 프라이머와 상이한 뉴클레오티드 태그를 가지고, 상이한 바코드 프라이머는 각각의 샘플에 사용되며, 여기에서 바코드 프라이머는 상이한 바코드 뉴클레오티드 서열 및 상이한 태그 특이적 부분을 가진다. 어느 경우에나, 증폭은 샘플 특이적 바코드를 가지는 각각의 샘플로부터 T 앰플리콘의 세트를 생성한다.
실시 형태에서, 정방향 및 역방향 프라이머의 동일한 세트가 각각의 샘플에서 사용될 경우, 각각의 표적에 대한 정방향 및 역방향 프라이머는 처음에 샘플과 별도로 결합될 수 있고, 각각의 바코드 프라이머는 처음에 바코드 프라이머의 해당 샘플과 결합될 수 있다. 그 다음 처음에 결합된 정방향 및 역방향 프라이머의 분취액은 처음에 결합된 샘플 및 바코드 프라이머의 분취액에 첨가되어 S×T 증폭 혼합물을 생성할 수 있다. 이러한 증폭 혼합물은 증폭에 적합한 조건에 처해질 수 있는 모든 물품에서 형성될 수 있다. 예를 들어, 증폭 혼합물은 증폭 전에 미세유체 장치의 분리된 구획에서 형성되거나 분리된 구획으로 분배될 수 있다. 적합한 미세유체 장치는 예시적인 실시 형태에서 하기 기재된 것과 같은 매트리스 유형의 미세유체 장치를 포함한다.
임의의 증폭 방법은 증폭 혼합물에서 앰플리콘을 생성하는데 이용될 수 있다. 예시적인 실시 형태에서, PCR이 이용된다. 증폭은 일반적으로 적어도 3개의 사이클 동안 실행되어 제1 및 제2 뉴클레오티드 태그 및 바코드 뉴클레오티드 서열을 도입한다. 다양한 실시 형태에서, 증폭은 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50 사이클 동안, 또는 종말점으로서 임의의 이들 값을 가지는 범위에 속하는 임의의 수의 사이클(예컨대, 5~10 사이클) 동안 실행된다. 특정 실시 형태에서, 증폭은 충분한 수의 사이클(예컨대, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50사이클, 또는 종말점으로서 임의의 이들 값을 가지는 범위에 속하는 임의의 수의 사이클) 동안 실행되어 표적 및 샘플에 대하여 표적 앰플리콘 복제 수를 표준화한다.
상기 기재된 방법의 특정 실시 형태는 실질적으로 균일한 증폭을 제공하여, 다수의 표적 앰플리콘을 만들어내며, 여기에서 대부분의 앰플리콘은 다수의 표적 앰플리콘에 대하여 계산된 평균 복제 수에 상대적으로 가까운 수준으로 존재한다. 따라서, 다양한 실시 형태에서, 표적 앰플리콘의 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%는 표적 앰플리콘의 평균 복제 수의 50% 초과로 존재하고 표적 앰플리콘의 평균 복제 수의 2배 미만으로 존재한다.
본 발명은 또한 일정 실시 형태에서 바코딩이 선택적으로 생략되고 표적 뉴클레오티드 서열이 증폭 후에 태깅되는 다수의 표적 뉴클레오티드를 증폭하는 방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 각각의 표적 핵산에 대하여 증폭 혼합물을 제조하는 단계를 수반하는, 일반적으로 다수의 샘플에서 다수의 표적 핵산을 증폭하는 방법을 제공한다. 각각의 증폭 혼합물은 표적 특이적 서열을 포함하는 정방향 프라이머 및 표적 특이적 서열을 포함하는 역방향 프라이머를 포함한다. 증폭 혼합물은 증폭되어 다수의 표적 뉴클레오티드 서열을 생성한다. 그 다음 표적 뉴클레오티드 서열은 태깅되어 다수의 표적 앰플리콘을 생성하고, 각각의 표적 앰플리콘은 표적 뉴클레오티드 서열의 측면에 위치하는 제1 및/또는 제2 뉴클레오티드 태그를 포함한다. 이 방법은 다수의 표적 앰플리콘을 생성하며, 여기에서 표적 앰플리콘의 적어도 50%는 표적 앰플리콘의 평균 복제 수의 50% 초과로 존재하고 표적 앰플리콘의 평균 복제 수의 2배 미만으로 존재한다. 이 방법의 다양한 실시 형태에서, 표적 앰플리콘의 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%는 표적 앰플리콘의 평균 복제 수의 50% 초과로 존재하고 표적 앰플리콘의 평균 복제 수의 2배 미만으로 존재한다.
다양한 실시 형태에서, 증폭된 표적 뉴클레오티드 서열은 예를 들어 25개 염기, 50개 염기, 100개 염기, 200개 염기, 500개 염기, 또는 750개 염기일 수 있다. 상기 기재된 방법의 일정 실시 형태에서, 긴 범위 PCR(long-range PCR)과 같은 긴 범위 증폭 방법이 이용되어 증폭 혼합물에서 앰플리콘을 생성할 수 있다. 긴 범위 PCR은 1 또는 수 킬로베이스(kb) 내지 50kb 초과 범위의 표적 뉴클레오티드 서열의 증폭을 허용한다. 다양한 실시 형태에서, 긴 범위 PCR로 증폭되는 표적 뉴클레오티드 서열은 길이가 적어도 약 1kb, 2kb, 3kb, 4kb, 5kb, 6kb, 7kb, 8kb, 9kb, 10kb, 11kb, 12kb, 13kb, 14kb, 15kb, 20kb, 25kb, 30kb, 35kb, 40kb, 45kb, 또는 50kb이다. 표적 뉴클레오티드 서열은 또한 종말점으로서 임의의 이들 값을 가지는 범위(예컨대, 25개 염기 내지 100개 염기 또는 5kb 내지15kb)에 속할 수 있다. 상기 기재된 방법에서 긴 범위 PCR의 사용은 일부 실시 형태에서 표적 앰플리콘의 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 또는 적어도 70%는 표적 앰플리콘의 평균 복제 수의 50% 초과로 존재하고 표적 앰플리콘의 평균 복제 수의 2배 미만으로 존재하는 다수의 표적 앰플리콘을 만들어낸다.
긴 범위 PCR은 업계에 공지되어 있다. 예컨대, 문헌 [Cheng S, Fockler C, Barnes WM, Higuchi R (June 1994). “Effective amplification of long targets from cloned inserts and human genomic DNA”. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91 (12): 5695-9]를 참조한다. 여기에 기재된 방법에서 사용하기에 적합한 긴 범위 PCR을 위한 효소, 프로토콜 및 키트는 상업적으로 입수가능하며, 예를 들어 SequalPrepTM Long PCR Kit(Invitrogen, USA), PfuUltra® II Fusion HS DNA 중합효소(Stratagene), Phusion® DNA 중합효소, Phusion® Flash High Fidelity PCR Master Mix(Finnzymes)를 포함한다.
일정 실시 형태에서, 표적 앰플리콘은 앰플리콘 혼합물로부터 회수될 수 있다. 예를 들어, 각각의 반응 챔버의 내용물의 회수를 허용하도록 조정된 매트릭스 유형 미세유체 장치(하기 참조)는 증폭에 이용되어 표적 앰플리콘을 생성할 수 있다. 이러한 실시 형태의 변형에서, 표적 앰플리콘은 추가적으로 증폭 및/또는 분석될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 표적 앰플리콘(들)은 제1 및 제2 뉴클레오티드 태그에 특이적인 프라이머를 사용하여 증폭되어 바코드 뉴클레오티드 서열이 없는 표적 앰플리콘을 생성할 수 있다. 일정 실시 형태에서, 증폭 혼합물에서 생성된 표적 앰플리콘의 양은 증폭 동안 예컨대 정량적 실시간 PCR로, 또는 증폭 후에 정량화될 수 있다.
특정 실시 형태에서, 상기 기재된 증폭 방법은 자동화 DNA 염기서열분석에 적합한 앰플리콘을 생성하는데 이용된다. 특히, 상기 기재된 바와 같이 표적 뉴클레오티드 서열의 실질적으로 균일한 증폭을 제공하는 상기 방법의 능력은 양호한 범위를 가지는 DNA 염기서열분석 라이브러리를 제조하는데 도움이 된다. 자동화 DNA 염기서열분석의 맥락에서, 용어 “범위”는 염기서열분석시 서열이 측정되는 횟수를 지칭한다. 실질적으로 균일한 범위를 가지는 DNA 염기서열분석 라이브러리는 범위가 또한 실질적으로 균일한 서열 데이터를 만들어낼 수 있다. 따라서, 다양한 실시 형태에서, 본원에 기재된 바와 같이 제조된 다수의 표적 앰플리콘의 자동화 염기서열분석의 실행시 표적 앰플리콘의 적어도 50%의 서열은 표적 앰플리콘 서열의 평균 복제 수의 50% 초과로 존재하고 표적 앰플리콘 서열의 평균 복제 수의 2배 미만으로 존재한다. 이 방법의 다양한 실시 형태에서, 표적 앰플리콘 서열의 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%는 표적 앰플리콘 서열의 평균 복제 수의 50% 초과로 존재하고 표적 앰플리콘 서열의 평균 복제 수의 2배 미만으로 존재한다.
DNA 염기서열분석을 위한 핵산의 제조
현재 많은 DNA 염기서열분석 기술은 “합성에 의한 염기서열분석”에 의존한다. 이러한 기술은 라이브러리 생성, 라이브러리 분자의 대규모의 병렬 PCR 증폭, 및 염기서열분석을 수반한다. 라이브러리 생성은 적절한 크기의 절편으로 샘플 핵산의 변환, 절편의 말단 상으로 어댑터 서열의 결찰, 및 어댑터가 적절하게 부가된 분자에 대한 선택으로 시작한다. 라이브러리 분자의 말단에서 어댑터 서열의 존재는 무작위 서열(random-sequence) 삽입물의 증폭을 가능하게 한다. 뉴클레오티드 서열을 태깅하는 상기 기재된 방법은 결찰을 대체하여 하기에 보다 상세히 기재된 바와 같이 어댑터 서열을 도입할 수 있다.
특정 실시 형태에서, 대규모의 병렬 PCR 단계에서 생성된 라이브러리 DNA 분자의 수는 동일한 기질, 예컨대 동일한 비드(454개 DNA 염기서열분석에서) 또는 동일한 표면 패치(Solexa DNA 염기서열분석에서)와 회합하는 2개의 분자의 가능성이 낮게 될만큼 낮지만, 증폭된 서열의 수율이 고효율을 제공하기에 충분할 만큼 높다. 하기에 추가적으로 논의된 바와 같이, 적합한 어댑터 서열이 도입된 후에, 디지털 PCR은 합성으로 염기서열분석하기 전에 라이브러리 DNA 분자의 수를 보정하는데 이용될 수 있다.
핵산에 DNA 염기서열분석 프라이머의 추가
염기서열분석되는 DNA는 임의의 유형의 DNA일 수 있다. 특정 실시 형태에서, DNA는 유기체로부터의 유전체 DNA이다. 이러한 실시 형태의 변형에서, 유기체로부터 취해지는 샘플에서 또는 DNA 라이브러리에서 얻은 전체 유전체 DNA는 염기서열분석을 위해 제조된다.
상기 기재된 바와 같이, 적어도 3개의 프라이머, 즉 정방향, 역방향, 및 바코드 프라이머가 염기서열분석을 위한 DNA를 제조하는데 이용된다. 그러나, 정방향 프라이머, 역방향 프라이머, 및 바코드 프라이머 중 적어도 하나는 적어도 하나의 추가 프라이머 결합 부위를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 바코드 프라이머는, 제1 뉴클레오티드 태그 특이적 부분의 상류인 바코드 뉴클레오티드 서열의 상류에 적어도 제1 추가 프라이머 결합 부위를 포함한다. 일정 실시 형태에서, 정방향 프라이머, 역방향 프라이머, 및 바코드 프라이머 중 2개는 적어도 하나의 추가 프라이머 결합 부위를 포함한다(즉, 증폭시 생성된 앰플리콘이 뉴클레오티드 태그 서열, 바코드 뉴클레오티드 서열, 및 2개의 추가 결합 부위를 포함). 예를 들어, 바코드 프라이머가 바코드 뉴클레오티드 서열의 상류에 제1 추가 프라이머 결합 부위를 포함하면, 특정 실시 형태에서, 역방향 프라이머는 제2 뉴클레오티드 태그의 하류에 적어도 제2 추가 프라이머 결합 부위를 포함할 수 있다. 그 다음, 증폭은 5'-(제1 추가 프라이머 결합 부위)-(바코드 뉴클레오티드 서열)-(정방향 프라이머로부터의 제1 뉴클레오티드 태그)-(표적 뉴클레오티드 서열)-(역방향 프라이머로부터의 제2 뉴클레오티드 태그)-(제2 추가 프라이머 결합 부위)-3'의 요소를 가지는 분자를 만들어낸다. 특정 실시 형태에서, 제1 및 제2 추가 프라이머 결합 부위는 DNA 염기서열분석 프라이머에 의해 결합될 수 있어, 상기 논의한 바와 같이 샘플 기원을 나타낼 수 있는 바코드를 포함하여 전체 앰플리콘의 염기서열분석을 용이하게 할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 3개 초과의 프라이머가 원하는 요소를 표적 뉴클레오티드 서열에 첨가하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 4개의 프라이머는 상기 논의된 동일한 5개의 요소와 선택적인 추가적 바코드, 예컨대 5'-(제1 추가 프라이머 결합 부위)-(바코드 뉴클레오티드 서열)-(정방향 프라이머로부터의 제1 뉴클레오티드 태그)-(표적 뉴클레오티드 서열)-(역방향 프라이머로부터의 제2 뉴클레오티드 태그)-(추가 바코드 뉴클레오티드 서열)-(제2 추가 프라이머 결합 부위)-3'을 가지는 분자를 생성하는데 이용될 수 있다. 예시적인 4개 프라이머 실시 형태에서, 정방향 프라이머는 표적 특이적 부분 및 제1 뉴클레오티드 태그를 포함하고, 역방향 프라이머는 표적 특이적 부분 및 제2 뉴클레오티드 태그를 포함한다. 이와 함께, 이들 2개 프라이머는 “내부 프라이머(inner primer)”를 구성한다. 남아 있는 2개의 프라이머는 “외부 프라이머(outer primer)”이고, 이는 내부 프라이머에 존재하는 제1 및 제2 뉴클레오티드 태그에 어닐링한다. 하나의 외부 프라이머는 바코드 프라이머이고, 이는 제1 뉴클레오티드 태그 특이적 부분(즉, 이전의 단락에서 논의된 동일한 바코드 프라이머)의 상류인 바코드 뉴클레오티드 서열의 상류에 적어도 제1 추가 프라이머 결합 부위를 포함할 수 있다. 제2 외부 프라이머는 제2 태그 특이적 부분, 추가 바코드 뉴클레오티드 서열 및 이의 하류에 제2 추가 프라이머 결합 부위를 포함할 수 있다.
3개 초과의 프라이머로부터 요소를 포함하는 증폭은 하나 또는 다수의 증폭 반응에서 실행될 수 있다. 예를 들어, 4개 프라이머 증폭은 4개 프라이머 모두 존재하는 하나의 증폭 반응에서 실행될 수 있다. 대안적으로, 4개 프라이머 증폭은 예컨대 2개의 증폭 반응에서 실행될 수 있으며, 이 때 하나의 증폭 반응은 내부 프라이머를 포함하고 별도의 증폭 반응은 외부 프라이머를 포함한다. 4개 프라이머 모두 하나의 증폭 반응에 존재할 경우, 외부 프라이머는 일반적으로 반응 혼합물에 과량으로 존재한다. 상대적인 농도 값은 정방향 프라이머에 대한 바코드 프라이머에 대해 초과하고/초과하거나 역방향 프라이머는 또한 하나의 단계인 4개 프라이머 증폭 반응에서 내부 프라이머에 대한 외부 프라이머 농도의 상대적인 농도로 적용된다.
4개 프라이머 증폭 반응의 예시적인 실시 형태에서, 각각의 외부 프라이머는 특유의 바코드를 포함한다. 예를 들어, 하나의 바코드 프라이머는 요소 5'-(제1 추가 프라이머 결합 부위)-(제1 바코드 뉴클레오티드 서열)-(제1 뉴클레오티드 태그)-3'로 구성될 것이고, 제2 바코드 프라이머는 요소 5'-(제2 추가 프라이머 결합 부위)-(제2 바코드 뉴클레오티드 서열)-(제2 뉴클레오티드 태그)-3'으로 구성될 것이다. 이러한 실시 형태에서, 제1 바코드 프라이머의 수(J)는 제2 바코드 프라이머의 수(K)와 결합되어 JxK의 특유의 증폭 생성물을 만들 수 있다.
본 발명의 추가적 예시적인 실시 형태에서, 4개 초과의 프라이머는 단일 반응에서 결합되어 추가 프라이머 결합 부위, 바코드 서열, 및 뉴클레오티드 태그의 상이한 결합을 부가할 수 있다. 예를 들어, 요소 5'-(제1 추가 프라이머 결합 부위)-(제1 바코드 뉴클레오티드 서열)-(제1 뉴클레오티드 태그)-3', 5'-(제1 추가 프라이머 결합 부위)-(제1 바코드 뉴클레오티드 서열)-(제2 뉴클레오티드 태그)-3', 5'-(제2 추가 프라이머 결합 부위)-(제1 바코드 뉴클레오티드 서열)-(제1 뉴클레오티드 태그)-3', 5'-(제2 추가 프라이머 결합 부위)-(제1 바코드 뉴클레오티드 서열)-(제2 뉴클레오티드 태그)-3'을 포함하는 외부 바코드 프라이머는 상기 기재된 바와 같은 내부 표적 특이적 프라이머와 결합되어 원하는 앰플리콘 서열과 바코드 프라이머의 모든 결합을 포함하는 증폭 생성물 풀을 생성할 수 있다.
본 발명의 다른 예시적인 실시 형태에서, 상기 기재된 임의의 결합 또는 당업자에게 명백할 다른 결합의 외부 바코드 프라이머는 동일한 제1 및 제2 뉴클레오티드 태그 서열을 가지는 표적 프라이머 서열 1개 초과의 쌍과 결합될 수 있다. 예를 들어, 동일한 제1 뉴클레오티드 태그와 결합돤 최대 10개의 상이한 표적 특이적 정방향 프라이머 서열 및 동일한 제2 뉴클레오티드 태그와 결합된 최대 10개의 상이한 표적 특이적 역방향 프라이머 서열을 포함하는 내부 프라이머는 최대 2 또는 최대 4개의 외부 바코드 프라이머와 결합되어 상기 기재된 바와 같은 다수의 증폭 생성물을 생성할 수 있다. 다양한 실시 형태에서, 동일한 제1 뉴클레오티드 태그 및 제2 뉴클레오티드 태그를 가지는 적어도 10, 적어도 20, 적어도 50, 적어도 100, 적어도 200, 적어도 500, 적어도 1000, 적어도 2000, 적어도 5000 또는 적어도 10000개의 상이한 표적 특이적 프라이머 쌍은 최대 2개 또는 최대 4개의 외부 바코드 프라이머와 결합되어 다수의 증폭 생성물을 생성할 수 있다.
본 발명의 방법은 임의의 이용가능한 DNA 염기서열분석 방법을 사용하여 적어도 하나의 표적 앰플리콘을 DNA 염기서열분석하는 단계를 포함할 수 있다. 특정 실시 형태에서, 다수의 표적 앰플리콘은 고효율 염기서열분석 방법을 사용하여 염기서열분석된다. 이러한 방법은 통상적으로 시험관내 클로닝 단계를 사용하여 개개의 DNA 분자를 증폭한다. 에멀젼 PCR(em PCR)은 오일상 내에서 수성 액적(droplet) 내 프라이머 코팅된 비드와 함께 개개의 DNA 분자를 분리한다. PCR은 비드 상의 프라이머에 결합한 DNA 분자의 복제를 생성하고, 그 다음 그 이후의 염기서열분석을 위하여 고정화된다. emPCR은 Marguilis et al.(454 Life Sciences, Branford, CT에 의해 상업화됨), Shendure 및 Porreca et al.(“폴로니 염기서열분석(polony sequencing)”으로도 알려짐) 및 SOLiD 염기서열분석(Applied Biosystems Inc., Foster City, CA) 에 따른 방법에서 사용된다. 문헌 [M. Margulies, et al. (2005) “Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors” Nature 437: 376-380]; [J. Shendure, et al. (2005) “Accurate Multiplex Polony Sequencing of an Evolved Bacterial Genome” Science 309 (5741): 1728-1732]를 참조한다. 시험관내 클론 증폭(clonal amplification)은 또한 절편이 고체 표면에 부착된 프라이머 상에서 증폭된 “브릿지 PCR(bridge PCR)”로 실행될 수 있다. Braslavsky et al.는 이러한 증폭 단계를 생략하고, 직접적으로 DNA 분자를 표면에 고정시키는 단일 분자 방법(Helicos Biosciences Corp., Cambridge, MA에 의해 상업화됨)을 개발하였다. 문헌 [I. Braslavsky, et al. (2003) “Sequence information can be obtained from single DNA molecules” Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 100: 3960-3964]을 참조한다.
표면에 물리적으로 결합된 DNA 분자는 동시에 염기서열분석될 수 있다. 염료 종결 전기영동 염기서열분석(dye-termination electrophoretic sequencing)과 같은 “합성에 의한 염기서열분석”은 DNA 중합효소를 사용하여 염기 서열을 결정한다. 가역적 종결기(reversible terminator) 방법(Illumina, Inc., San Diego, CA and Helicos Biosciences Corp., Cambridge, MA에 의해 상업화됨)은 염료 종결기의 가역적 형태를 사용하여 한번에 1개의 뉴클레오티드를 첨가하고, 다른 뉴클레오티드의 중합화가 가능하도록 차단기(blocking group)의 반복적 제거에 의해, 실시간으로 각각의 위치에서 형광을 검출한다. “파이로시퀀싱(pyrosequencing)”은 또한 DNA 중합화를 사용하여 한번에 1개의 뉴클레오티드를 첨가하고 부착된 파이로포스페이트의 방출로 발하는 빛을 통해 주어진 위치에 첨가된 뉴클레오티드의 수를 검출하고 정량화한다(454 Life Sciences, Branford, CT에 의해 상업화됨). 문헌 [M. Ronaghi, et al. (1996). “Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release” Analytical Biochemistry 242: 84-89]을 참조한다.
디지털 PCR에 의한 샘플 제조
일부 실시 형태에서, 샘플은 증폭 장치, 예를 들어 PCR 플레이트 또는 미세유체 장치 내로 웰 또는 챔버 당 평균적으로 하나 미만의 증폭 주형을 포함하는 샘플 농도로 로딩된다. 장치 내 각각의 웰 또는 챔버는 적합하게 태그된 표적 특이적 프라이머 및 정방향 및 역방향 바코드 프라이머의 특유의 결합을 포함하도록 제조된다. 예를 들어, 하나의 웰은 요소 5'-(제1 추가 프라이머 결합 부위)-(제1 바코드 서열)-(제1 뉴클레오티드 태그)-3', 5'-(제2 추가 프라이머 결합 부위)-(제2 바코드 서열)-(제2 뉴클레오티드 태그)-3'을 포함하는 바코드 프라이머를 포함할 수 있다. 제2 웰 또는 챔버는 요소 5'-(제1 추가 프라이머 결합 부위)-(제3 바코드 서열)-(제1 뉴클레오티드 태그)-3', 5'-(제2 추가 프라이머 결합 부위)-(제4 바코드 서열)-(제2 뉴클레오티드 태그)-3'을 포함하는 바코드 프라이머를 포함할 수 있다. 각각의 웰에서 생성된 증폭 생성물은 이 웰 내로 로딩된 바코드 서열의 결합으로 특유하게 표지될 것이다.
디지털 PCR에 의한 샘플 보정
특정 실시 형태에서, 상기 기재된 방법을 사용하여 예컨대 DNA 라이브러리로부터 생성된 표적 앰플리콘의 수는 디지털 증폭 방법을 사용하여 보정될 수 있다. 단계는 합성에 의한 염기서열분석을 위한 DNA를 제조하는데 있어서 특정한 적용의 발견이다. “디지털 PCR”의 논의에 대하여는 예를 들어 문헌 [Vogelstein 및 Kinzler, 1999, Proc Natl Acad Sci USA 96:9236-41]; 미국 특허출원공개 제20050252773호(McBride et al.,), 특히 실시예 5(이들 간행물 각각은 전체적으로, 특히 디지털 증폭의 개시에 대하여 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다. 디지털 증폭 방법은, 통상적으로 다수 및/또는 고밀도의 소부피 반응 부위(예컨대, 나노 부피 반응 부위 또는 반응 챔버)를 포함하는 미세유체 장치와 같은 디지털 PCR에 적합한 일정 고효율 장치를 사용할 수 있다. 예시적인 실시 형태에서, 디지털 증폭은 하기 기재된 Digital Array 미세유체 장치와 같은 미세유체 장치를 사용하여 실행된다. 디지털 증폭은 반응/분석 플랫폼 또는 미세유체 장치에 배치된 수백 내지 수천의 반응 혼합물 사이에서 샘플을 분배하는 단계 또는 나누는 단계를 수반할 수 있다. 이러한 실시 형태에서, 대부분의 반응이 주형 분자를 가지지 않고 음성 증폭 결과를 제공하도록 샘플의 제한적인 희석이 다수의 별도 증폭 반응에 걸쳐 이루어진다. 예컨대 반응 종말점에서 양성 증폭 결과의 수를 계수하는데 있어서, 하나는 주입 샘플에 존재하는 개개의 주형 분자를 하나하나씩 계수하는 것이다. 디지털 증폭의 주요 장점은 정량화가 증폭 효율에서의 변화에 의존적이고, 성공적인 증폭은 하나의 분자로서 계수되어 생성물의 실제 양에 의존한다는 것이다.
임의의 실시 형태에서, 디지털 증폭은 샘플 핵산의 사전증폭 후에 실행될 수 있다. 통상적으로, 디지털 증폭 전의 사전증폭은 열순환의 한정된 수(예컨대, 5사이클, 또는 10사이클)로 실행된다. 일정 실시 형태에서, 사전증폭 동안 열순환의 수는 약 4 내지 15 열순환, 또는 약 4 내지 10 열순환의 범위일 수 있다. 일정 실시 형태에서, 열순환의 수는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 15 초과일 수 있다. DNA 염기서열분석을 위한 어댑터 서열 포함 앰플리콘을 생성하는 상기 기재된 증폭은 통상적인 사전증폭 단계를 대체할 수 있다.
디지털 증폭 방법은 2009년 9월 24일에 공개된 미국 공개 제20090239308호에 기재되어 있으며, 이는 전체적으로, 특히 디지털 증폭 방법 및 장치의 개시에 대하여 본원에 참조로 포함된다. 일반적으로, 디지털 증폭에서 동일한(또는 실질적으로 유사한) 증폭 반응은 유전체 DNA와 같은 핵산 샘플에서 실행된다. 주어진 핵산 샘플에 대한 개별적인 반응의 수는 약 2번 내지 1,000,000번 초과로 다양할 수 있다. 통상적으로 샘플에서 실행되는 반응의 수는 약 100번 이상, 보다 통상적으로 약 200번 이상, 훨씬 더 통상적으로 약 300번 이상이다. 더 큰 규모의 디지털 증폭은 또한 샘플에서 실행되는 반응의 수가 약 500번 이상, 약 700번 이상, 약 765번 이상, 약 1,000번 이상, 약 2,500번 이상, 약 5,000번 이상, 약 7,500번 이상, 또는 약 10,000번 이상으로 실행될 수 있다. 실행되는 반응의 수는 또한 유전체 샘플 당 최대 약 25,000번, 최대 약 50,000번, 최대 약 75,000번, 최대 약 100,000번, 최대 약 250,000번, 최대 약 500,000번, 최대 약 750,000번, 최대 약 1,000,000번, 또는 1,000,000번 분석을 훨씬 더 초과하는 것과 같이 훨씬 더 높을 수도 있다.
특정 실시 형태에서, 디지털 증폭되는 핵산의 양은 일반적으로 별개의 반응 혼합물 내로 분배될 때 각각의 개별적인 증폭 반응이 하나 이하의 증폭가능한 핵산을 포함하는 것으로 예상되도록 선택된다. 당업자는 상기 기재된 바와 같이 생성되는 표적 앰플리콘(들)의 농도를 결정하고 디지털 증폭에서의 사용을 위한 적절한 양을 계산할 수 있다. 보다 편리하게, 표적 앰플리콘(들)의 일련의 희석물이 테스트될 수 있다. 예를 들어, 12.765 Digital Array 미세유체 장치로서 Fluidigm Corp.에서 상업적으로 입수가능한 장치는 12개의 상이한 희석물이 동시에 테스트될 수 있게 한다. 선택적으로, 적합한 희석물은 선형 회귀 도표를 생성함으로써 결정될 수 있다. 최적의 희석물에 대하여, 선은 일직선이어야 하고 원점을 통과하여야 한다. 결과적으로 원래 샘플의 농도는 도표로부터 계산될 수 있다.
표적 앰플리콘(들)의 적절한 양은 각각의 반응이 예를 들어 평균 부피당 약 하나 이하의 앰플리콘을 포함하도록 별도의 위치 또는 반응 웰 또는 챔버 내로 분배될 수 있다. 표적 앰플리콘(들)은 분배 전 또는 후에 정량적 또는 비정량적 증폭을 위해 선택된 시약과 결합될 수 있다.
분배 후, 반응 혼합물은 증폭되어 표적 앰플리콘을 포함한 반응 혼합물을 식별한다. 임의의 증폭 방법이 이용될 수 있지만, 그러나 편리하게는 PCR, 예컨대 실시간 PCR 또는 종말점 PCR이 사용된다. 이러한 증폭은 표적 앰플리콘(들)을 증폭할 수 있는 임의의 프라이머를 이용할 수 있다. 따라서, 특정 실시 형태에서, 프라이머는 이전의 증폭 단계에서 도입된 프라이머 결합 부위에 어닐링하는 DNA 염기서열분석 프라이머일 수 있다.
임의의 표적 앰플리콘의 농도(복제수/μL)는 양성(즉, 증폭 생성물 포함하는) 반응 혼합물의 수와 연관된다. 제목이 “디지털 PCR을 사용하여 복제수 변화를 결정하는 방법 및 장치(Method and Apparatus for Determining Copy Number Variation Using Digital PCR)”인 동시계류중인 미국 출원 제12/170,414호를 참조하며, 이는 모든 목적을 위하여, 특히 디지털 PCR 결과의 분석에 대하여 참조로 포함된다. 또한 문헌 [Dube et al., 2008, “Mathematical Analysis of Copy Number Variation in a DNA Sample Using Digital PCR on a Nanofluidic Device” PLoS ONE 3(8): e2876. doi:10.1371/journal.pone.0002876]을 참조하며, 이는 모든 목적을 위하여, 특히 디지털 PCR 결과의 분석에 대하여 참조로 포함된다.
디지털 PCR에 의한 DNA 염기서열분석을 위한 샘플 보정의 예시적인 실시 형태에서, 대략 μl 당 100~360개 앰플리콘을 포함하는 PCR 반응 혼합물은 하기 기재된 Fluidigm Corporation's(South San Francisco, CA) 12.765 Digital Array 미세유체 장치와 같은 Digital Array 미세유체 장치 상으로 로딩될 수 있다. 미세유체 칩은 12개의 패널을 가지고, 각각의 패널은 765개의 챔버를 포함한다. 라이브러리의 초기 농도의 절대 정량을 얻기 위하여 디지털 칩 상의 복제된 패널이 분석될 수 있다. 9~12%(또는 그 이하) 내에서 (복제물 사이의) 변화의 통상적인 상대 계수를 가지는 희석된 샘플은 염기서열분석에 사용될 수 있다. 예컨대, 문헌 [White III RA, Blainey PC, Fan CH, Quake SR. “Digital PCR provides sensitive and absolute calibration for high throughput sequencing” BMC Genomics 10:116 doi:10.1186/1471-2164-10-116]을 참조한다.
샘플 핵산
핵산(“샘플”)의 제조는 생물학적 출처로부터 얻어지고 업계에 공지된 종래의 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 특히, 본원에 기재된 방법에 유용한 DNA 또는 RNA는 박테리아, 원생동물, 균류, 바이러스, 세포소기관(organelle) 뿐만 아니라 식물 또는 동물, 특히 포유류, 보다 특히 인간과 같은 고등 생물을 포함한 임의의 출처로부터 추출되고/추출되거나 증폭될 수 있다. 적합한 핵산은 또한 환경 출처(예컨대, 연못 물), 인공적인 생성물(예컨대, 음식), 법과학적 샘플 등으로부터 얻을 수 있다. 핵산은 세포, 체액(예컨대, 혈액, 혈액 분획물, 소변 등), 또는 임의의 다양한 표준 기술에 의한 조직 샘플에서 추출되거나 증폭될 수 있다. 예시적인 샘플은 혈장, 혈청, 척수액, 림프액, 복막액, 흉수, 구강액, 및 피부의 외부 부위의 샘플; 기도, 창자 생식기, 및 요로로부터의 샘플; 눈물, 침, 혈액 세포, 줄기 세포, 또는 종양의 샘플을 포함한다. 예를 들어, 태아 DNA의 샘플은 태아 또는 산모 혈액에서 얻을 수 있다. 샘플은 살아있는 생물 또는 죽은 생물에서 또는 시험관내 배양물에서 얻을 수 있다. 예시적인 샘플은 단일 세포, 파라핀 포매(paraffin-embedded) 조직 샘플 및 침생검(needle biopsy)을 포함할 수 있다. 본 발명에 유용한 핵산은 또한 cDNA, 코스미드, YAC, BAC, P1, PAC 라이브러리 등을 포함하여 하나 이상의 핵산 라이브러리에서 유도될 수 있다.
관심의 핵산은 출처, 핵산의 특성 및 유사한 요인에 따라서 특이적인 방법의 선택으로 업계에 공지된 방법을 사용하여 분리될 수 있다. 샘플 핵산은 순수한 형태일 필요는 없지만, 통상적으로 본 발명 방법의 증폭 단계를 실행할 수 있을 정도로 충분히 순수하다. 표적 핵산이 RNA일 경우, RNA는 업계에 공지된 표준 방법으로 그리고 예를 들어 문헌 [Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, Vol. 1, 2, 3 (1989)]에 기재된 바와 같이 cDNA로 역전사될 수 있다. 그 다음, cDNA는 본 발명의 방법에 따라 분석될 수 있다.
표적 핵산
(본원에 기재된) 본 발명의 암호화 반응에서 태깅될 수 있는 임의의 표적 핵산은 본 발명의 방법을 사용하여 검출될 수 있다. 통상의 실시 형태에서, 적어도 일부 뉴클레오티드 서열 정보는 표적 핵산으로 알려질 것이다. 예를 들어, 이용되는 암호화 반응이 PCR이라면, 충분한 서열 정보는 일반적으로 주어진 표적 핵산의 각각의 말단에 대하여 이용가능하여 적합한 증폭 프라이머의 고안을 가능하게 한다. 대안적인 실시 형태에서, 프라이머에서의 표적 특이적 서열은 무작위로 대체되거나 뉴클레오티드 서열을 퇴화시킬 수 있다.
표적은 예를 들어 바이러스, 박테리아, 원생동물, 또는 균류와 같은 병원체와 연관된 핵산; RNA, 예컨대 과발현 또는 과소발현이 질병을 나타내는 RNA, 조직 또는 발생 특이적 방식에서 발현되는 RNA; 또는 특정 자극원으로 유도되는 RNA; 예컨대 유전자형분석(genotyping)에서 특이적 다형성(예를 들어 SNP), 대립유전자, 또는 단상형(haplotype)에 대하여 분석될 수 있는 유전체 DNA를 포함할 수 있다. 특히 유전적 질병 또는 다른 병리학에서 변경(예컨대, 증폭, 결실 및/또는 돌연변이)되는 유전체 DNA; 바람직한 또는 바람직하지 않은 특성과 연관된 서열; 및/또는(예컨대, 법과학 또는 친자 결정에서) 개인을 특유하게 식별하는 서열에 특히 관심이 있다.
프라이머 고안
핵산 증폭에 적합한 프라이머는 중합을 위한 제제의 존재시 연장 생성물의 합성을 준비하기에 충분히 길다. 프라이머의 정확한 길이 및 조성은 예를 들어 어닐링 반응의 온도, 프라이머의 출처 및 조성, 프로브가 이용될 경우 프라이머 어닐링 부위에의 프로브 어닐링 부위의 근접성 및 프라이머:프로브 농도의 비율을 포함하는 많은 요인에 따라 달라질 것이다. 예를 들어 표적 핵산 서열의 복잡성에 따라서, 올리고뉴클레오티드 프라이머는 더 많이 또는 더 적은 뉴클레오티드를 포함할 수 있지만, 통상적으로 약 15개 내지 약 30개 뉴클레오티드의 범위로 포함한다. 프라이머는 각각의 가닥에 선택적으로 어닐링하여 안정한 이중가닥을 형성하기에 충분히 상보적이어야 한다. 당업자는 적절한 프라이머 쌍을 선택하여 관심의 표적 핵산을 증폭하는 방법을 안다.
예를 들어, PCR 프라이머는 Primer3(예컨대, 문헌 [Rozen 및 Skaletsky (2000) Meth. Mol. Biol., 132: 365-386]; www.broad.mit.edu/node/1060 등을 참조)과 같은 임의의 상업적으로 입수가능한 소프트웨어 또는 오픈 소스 소프트웨어를 사용하여 또는 Roche UPL 웹사이트에 접속하여 고안될 수 있다. 앰플리콘 서열은 브래킷에서 UPL 프로브 서열로 Primer3 프로그램 내로 주입되어 Primer3 프로그램은 일괄한 프로브 서열의 한쪽 면에서 프라이머를 고안할 것을 보장한다.
프라이머는 예를 들어 적절한 서열의 클로닝 및 한정을 포함한 임의의 적합한 방법 또는 문헌 [Narang et al. (1979) Meth. Enzymol. 68: 90-99]의 포스포트리에스테르 방법; 문헌 [Brown et al. (1979) Meth. Enzymol. 68: 109-151]의 포스포디에스테르 방법; 문헌 [Beaucage et al. (1981) Tetra. Lett., 22: 1859-1862]의 디에틸포스포라미디트 방법; 미국 특허 제4,458,066호의 고체지지체 방법 등과 같은 방법에 의한 직접적인 화학적 합성으로 제조될 수 있거나, 또는 상업적 출처로부터 제공될 수 있다.
프라이머는 Sephadex 컬럼(Amersham Biosciences, Inc., Piscataway, NJ) 또는 당업자에게 공지된 다른 방법을 사용하여 정제될 수 있다. 프라이머 정제는 본 발명의 방법의 민감도를 개선할 수 있다.
미세유체 장치
일정 실시 형태에서, 본 발명의 임의의 방법은 미세유체 장치를 사용하여 실행될 수 있다. 예시적인 실시 형태에서, 장치는 별도의 분리된 반응 챔버에서 시약 용액과 다수의 기질 용액의 동시 조합을 가능하게 하는 매트릭스 유형 미세유체 장치이다. 기질 용액은 하나 또는 다수의 기질을 포함할 수 있고 시약 용액은 하나 또는 다수의 시약을 포함할 수 있음이 인식될 것이다. 예를 들어, 미세유체 장치는 다수의 상이한 증폭 프라이머 및 샘플의 동시 쌍요소(pair-wise) 조합을 가능하게 할 수 있다. 임의의 실시 형태에서, 장치는 각각의 상이한 챔버에서 상이한 조합의 프라이머 및 샘플을 포함하도록 구성된다. 다양한 실시 형태에서, 별도의 반응 챔버의 수는 50개 초과, 보통 100개 초과, 보다 종종 500개 초과, 훨씬 더 종종 1000개 초과, 그리고 때때로 5000개 초과, 또는 10,000개 초과일 수 있다.
특정 실시 형태에서, 매트릭스 유형 미세유체 장치는 Dynamic Array(“DA”) 미세유체 장치이며, 이의 예는 도 1에 나타나 있다. DA 미세유체 장치는 샘플 및 시약(예컨대, 증폭 프라이머, 검출 프로브 등)의 쌍요소 조합을 분리하도록 고안되고 실시간 정량적 PCR 분석을 포함한 정성 및 정량적 PCR 반응을 실행하는데 적합한 매트릭스 유형 미세유체 장치이다. 일부 실시 형태에서, DA 미세유체 장치는 적어도 부분적으로 엘라스토머로 제작된다. DA 미세유체 장치는 PCT 공개 WO 제05107938A2호(열 반응 장치 및 이를 이용하는 방법(Thermal Reaction Device and Method For Using The Same)) 및 미국 특허공개 US 제20050252773A1호에 기재되어 있으며, 이들은 모두 DA 미세유체 장치의 기재를 위하여 전체적으로 본원에 참조로 포함된다. DA 미세유체 장치는 미세유체 장치의 층 사이에서 유체 연통 비아를 사용하는 고밀도 매트릭스 고안을 포함하여 장치를 통하여 그리고 층 사이에 제어 라인 및 유체 라인을 만들 수 있다. 엘라스토머 블록의 다수 층에서의 유체 라인 덕분에, 고밀도의 반응 세포 배열이 가능하다. 대안적으로 DA 미세유체 장치는 모든 시약 및 샘플 채널이 동일한 엘라스토머 층 내에 있고, 제어 채널은 상이한 층에 있도록 고안될 수 있다.
미국 특허공개 제2008/0223721호 및 PCT 공개 WO 제05/107938A2호는 본원에 기재된 방법을 실시하는데 사용될 수 있는 예시적인 매트릭스 유형 장치를 기재한다. PCT 공개 WO 제05/107938A2호의 도 21은 도 1로서 복제되어 있고 제1 엘라스토머층(2110)(제1층) 및 제2 엘라스토머층(2120)(제2층)(각각 여기에서 형성된 유체 채널을 가짐)을 가지는 예시적인 매트릭스 고안을 나타낸다. 예를 들어, 제2층(2120)이 또한 여기에서 샘플 채널을 가지는 동안, 제1층(2110)의 시약 유체 채널은 비아(2130)를 통하여 제2층(2120)의 시약 유체 채널에 연결되고, 샘플 채널 및 시약 채널은 각각 샘플 및 시약 챔버(2180)에서 종결된다. 샘플 및 시약 챔버(2180)는 이와 연관된 인터페이스 밸브(2140)를 가지는 인터페이스 채널(2150)을 통하여 서로 유체 연통하여 반응 세포(2160)의 각각의 챔버(2180) 사이에서 유체 연통을 제어한다. 사용시, 인터페이스는 먼저 폐쇄되고, 그 다음 시약이 시약 주입구에서 시약 채널 내로 도입되며 샘플은 샘플 주입구를 통하여 샘플 채널 내로 도입되고, 그 후 차단 밸브(2170)는 차단되어 다른 반응 세포(2160)로부터 각각의 반응 세포(2160)를 분리한다. 일단 반응 세포(2160)가 분리되면, 인터페이스 밸브(2140)는 개방되어 원하는 반응이 일어날 수 있도록 샘플 챔버 및 시약 챔버가 서로 유체 연통하도록 한다. DA 미세유체 장치가 M개의 상이한 샘플을 N개의 상이한 시약과 반응시키는데 사용될 수 있다는 것이 이것(및 WO 제05/107938A2호의 기재)으로부터 명백할 것이다.
WO 제05/107938호에 상기 기재된 DA 미세유체 장치가 본원에 기재된 방법을 수행하는데 매우 적합하더라도, 본 발명은 임의의 특정 장치 또는 고안으로 한정되지 않는다. 샘플을 나누고/나누거나 시약 및 샘플의 독립적인 쌍요소 조합을 가능하게 하는 임의의 장치가 사용될 수 있다. 미국 특허공개 제20080108063호(이는 전체적으로 본원에 참조로 포함됨)는 Fluidigm Corp.(South San Francisco Calif.)로부터 이용가능한 상업적으로 입수가능한 장치인 48.48 Dynamic Array IFC(Integrated Fluidic Circuit)를 예시하는 도표를 포함한다. 예를 들어 48×96; 96×96; 30×120 등과 같은 다른 구성이 가능하고 고려됨이 이해될 것이다.
특정 실시 형태에서, 미세유체 장치는 디지털 증폭을 실행하도록 조정되는 Digital Array 미세유체 장치일 수 있다. 이러한 장치는 샘플 및 시약의 혼합물을 나노리터 부피의 반응 챔버 내로 나누는 통합된 채널 및 밸브를 가질 수 있다. 일부 실시 형태에서, Digital Array 미세유체 장치는 적어도 부분적으로 엘라스토머로 제작된다. 예시적인 Digital Array 미세유체 장치는 제목이 “디지털 PCR을 사용하여 복제 수 변화를 결정하는 방법 및 장치(Method and Apparatus for Determining Copy Number Variation Using Digital PCR)”인 미국 출원 제12/170,414호와 같은 Fluidigm, Inc.가 소유한 동시계류중인 미국 출원에 기재되어 있다. 하나의 예시적인 실시 형태는 장치에 대하여 12개의 분리된 샘플 주입에 해당하는 12개의 주입 포트를 가진다. 장치는 12개의 패널을 가질 수 있으며, 12개 패널의 각각은 패널당 총 부피가 4.59μL인 765 6nL 반응 챔버를 포함할 수 있다. 미세유체 채널은 패널 상의 다양한 반응 챔버를 유체 공급원에 연결할 수 있다. 압력은 반응 챔버를 유체 공급원에 연결하는 밸브를 개방 및 폐쇄하도록 어큐뮬레이터(accumulator)에 적용될 수 있다. 예시적인 실시 형태에서, 12개의 주입구는 샘플 시약 혼합물의 로딩에 제공될 수 있다. 48개의 주입구는 시약에 대한 공급원을 제공하는데 사용될 수 있으며, 이는 압력이 어큐뮬레이터에 적용될 때 바이오칩에 제공된다. 추가적으로, 바이오칩에 수화를 제공하도록 2개 이상의 주입구가 제공될 수 있다. 수화 주입구는 장치와 유체 연통하여 반응 챔버와 연관된 습도의 제어를 용이하게 한다. 당업자에게 이해될 바와 같이, 장치의 제작에 사용될 수 있는 일부 엘라스토머 물질은 기체 투과성이고, 반응 챔버에서 증발된 기체 또는 증기가 주위 대기로 엘라스토머 물질을 통과하도록 한다. 특정 실시 형태에서, 장치의 주변 부분에 위치하는 유체 라인은 반응 챔버의 패널 주위 바이오칩의 주변 부분에서 수화 액체, 예를 들어 버퍼 또는 마스터믹스(master mix)의 보호물을 제공하고, 따라서 반응 챔버 내에 존재하는 액체의 증발을 감소시키거나 또는 방지한다. 따라서, 장치의 주변 부분에서의 습도는 휘발성 액체, 예를 들어 물을 수화 주입구에 첨가함으로써 증가될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 제1 주입구는 바이오칩의 제1 면에서 패널 주위의 수화 유체 라인과 유체 연통하고 제2 주입구는 바이오칩의 다른 면에서 패널 주위의 수화 유체 라인과 유체 연통한다.
Digital Array 미세유체 장치가 본원에 기재된 디지털 증폭 방법을 실행하는데 매우 적합하지만, 당업자는 이 장치에 대한 많은 변형 및 대안을 인식할 것이다. Fluidigm Corp.(South San Francisco, CA)에서 상업적으로 입수가능한 12.765 Dynamic Array인 미세유체 장치는 12개의 패널을 포함하며, 각각은 반응 챔버 당 부피가 6nL인 765개의 반응 챔버를 가진다. 그러나, 이러한 기하학적 구조는 본원에 기재된 디지털 증폭 방법에 필요하지 않다. 주어진 Digital Array 미세유체 장치의 이러한 기하학적 구조는 특정 적용에 따라 달라질 것이다. 본원에 기재된 방법에서의 사용에 적합한 장치에 관련된 추가적인 기재는 미국 특허출원공개 제2005/0252773호에서 제공되며, 이는 Digital Array 미세유체 장치의 개시에 대하여 본원에 참조로 포함된다.
임의의 실시 형태에서, 본원에 기재된 방법은 반응 생성물의 회수를 위하여 제공하는 미세유체 장치를 사용하여 실행될 수 있다. 이러한 장치는 2009년 4월 2일에 출원된 동시계류중인 미국 출원 제61/166,105호에 상세히 기재되어 있으며, 이는 전체적으로 그리고 구체적으로 반응 생성물의 회수를 가능하게 하는 미세유체 장치 및 관련 방법에 대한 기재에 대하여 본원에 참조로 포함된다. 예를 들어, 염기서열분석 전에 DNA 샘플을 보정하는 디지털 PCR 방법은 이러한 장치에서 실행되어 증폭 생성물의 회수를 가능하게 하며, 그 다음 증폭 생성물은 DNA 염기서열분석을 위한 주형으로서 역할을 할 수 있다.
도 2는 본 발명의 실시 형태에 따른 캐리어 및 미세유체 장치의 간략화된 사시도이다. 도 2에 도시된 바와 같이, 캐리어(100)는 미세유체 장치(110)을 지지하고, 이는 또한 Digital Array 미세유체 장치로서 지칭될 수 있다. 캐리어(100)는 캐리어의 다양한 요소에 적합한 기계적인 지지를 제공하는 물질로부터 만들어질 수 있다. 예로서, 캐리어는 플라스틱 또는 다른 적합한 물질을 사용함으로써 만들어진다. 캐리어의 외부 부분은 표준 384 웰 마이크로플레이트와 동일한 풋프린트(footprint)를 가지며 독립형의 밸브 작동(stand-alone valve operation)을 가능하게 한다. 추가적으로, 캐리어(100)는 종래의 독립형 열순환기(thermal cycler)와 호환가능하다. 하기에 기재된 바와 같이, 캐리어(100)의 제1 면에 위치한 48개의 샘플 주입 포트(120) 및 캐리어의 반대면에 위치한 48개의 분석물 주입 포트(122)가 있다. 샘플 주입 포트(120)와 분석물 주입 포트(122)의 뱅크(bank)는 캐리어의 상부에 대하여 오목하게 형성되어 있다. 이러한 오목한 특징을 사용하여, 압력은 모든 샘플 주입 포트 또는 분석물 주입 포트에 대하여 동시에 적용되어 미세유체 장치(110)에 존재하는 주입 포트 및 어느 하나의 비아, 유체 주입 라인, 또는 이의 조합을 연결하는 유체 라인(140)을 통하여 각각의 포트에 존재하는 유체를 구동한다. 샘플은 암호화된 프라이머를 포함할 수 있고, 분석물은 또한 앰플리콘 특이적(amplicon-specific, AS) 프라이머로서 지칭될 수 있다.
캐리어(100)는 또한 4개의 공급원(130, 132, 134, 및 136)을 포함하며, 이는 미세유체 장치에 존재하는 제어 라인을 작동시키는데 사용될 수 있다. 실시 형태에서, 공급원(130, 132, 및 134)은 미세유체 장치에 존재하는 밸브를 개방하고 폐쇄하도록 동작가능한 제어 라인을 가압하는데 사용된다. 예를 들어, 공급원(132)에 대하여 대기압 보다 큰 압력의 적용은 미세유체 장치에 존재하는 제어 라인으로 흐르는 공급원(132)에 존재하는 액체를 생성할 것이며, 그렇게 함으로써 또한 미세유체 장치에 존재하는 하나 이상의 유체 주입 라인을 통한 흐름을 막도록 동작가능한 밸브를 작동시킨다. 실시 형태에서, 공급원(130)은 수확 시약을 포함하는 유체 웰로서 사용된다. 압력은 공급원(130)에 적용되어, 수확 시약이 캐리어에 제공되는 유체 라인을 통하여 미세유체 장치에 제공되는 유체 라인으로 흐르게 할 수 있다. 따라서 공급원(130)으로의 압력의 적용은 수확 시약 또는 미세유체 장치를 통하여 다른 적합한 유체의 흐름을 야기할 수 있다. 공급원(130 내지136)과 유체 연통하는 제어 라인은 인터페이스 밸브, 차단 밸브, 확장 펌핑에 사용되는 밸브에 대한 제어 라인, 수확 시약의 흐름에 대한 유체 라인 등을 포함할 수 있다. 특정 실시 형태에서, 밸브(1)는 공급원(132)에 의해 제어되고, 밸브(2)는 공급원(134)에 의해 제어되며, 수확 시약은 공급원(130)에서 제공되고, 수화 시약은 공급원(136)에서 제공된다. 이러한 특정 실시 형태에서, 인터페이스 밸브는 공급원(150)에 의해 제어되고 차단 밸브는 공급원(152)에 의해 제어된다. 이러한 특정 실시 형태는 본 발명을 한정하는 것으로 의도되지 않으며, 단지 하나의 구성의 예를 제공하는 것이다. 다른 구성은 특정 적용에 적절하게 사용될 수 있다.
도 3에 관하여 보다 충분히 기재된 바와 같이, 캐리어(100) 상에 존재하는 유체 라인(140)은 미세유체 장치(110) 상에 존재하는 하나 이상의 유체 라인과 유체 연통한다. 이러한 유체 라인은 미세유체 장치의 내로 그리고 미세유체 장치의 밖으로 유체를 운반하는 역할을 할 수 있거나 또는 미세유체 장치 상에 존재하는 밸브를 작동시키는 제어 라인으로서 사용될 수 있다. 따라서, 샘플 주입 포트(120) 또는 분석물 주입 포트(122)에 제공되는 유체는 미세유체 장치의 적절한 유체 주입 라인 및 챔버 내로 로딩될 수 있다. 공급원(130 내지136)에 제공되는 다른 유체(예컨대, 액체)는 또한 미세유체 장치의 유체 주입 라인 또는 제어 라인 내로 로딩될 수 있다. 미세유체 장치의 챔버로부터의 반응 생성물은 미세유체 장치 상의 유체 라인을 통하여 펌프되고, 캐리어 상에 존재하는 유체 라인(140) 내로 그리고 샘플 또는 분석물 주입 포트(120 또는 122) 내로 돌아가면서 회수될 수 있다.
압력 어큐뮬레이터(150 및 152)는 다른 제어 라인을 가압하고, 미세유체 장치의 수화를 제공하는데 사용될 수 있거나, 또는 일부 실시 형태에서 사용되지 않을 수도 있다. 48개의 샘플 주입 포트 및 48개의 분석물 주입 포트는 도 2에 도시된 본 발명의 실시 형태에 나타나 있지만, 이는 본 발명에 필수적이지는 않다. 다른 실시 형태는 특정 적용에 따라 상이한 수의 샘플 및 분석물을 사용한다. 당업자는 많은 변형, 변경 및 대체를 인식할 것이다.
도 3은 본 발명의 실시 형태에 따른 미세유체 장치의 간략화된 개략도이다. 미세유체 장치(200)는 24개의 상이한 샘플에 대하여 유체 흐름 경로를 제공하는데 사용되는 유체 주입 라인(212)에 연결되는 비아(210)를 포함한다. 도 1에 도시된 샘플 주입 포트(120)의 하위세트 내로 로딩될 수 있는 24개의 샘플은 비아(210) 및 유체 주입 라인(212)을 통하여 샘플 주입 라인(312)으로 그리고 결국 도 4에 예시된 바와 같이 샘플 챔버(310)로 흐른다. 미세유체 장치(200)는 또한 21개의 상이한 분석물에 대하여 유체 흐름 경로를 제공하는데 사용되는 유체 주입 라인(222)에 연결된 비아(220)를 포함한다. 분석물 주입 유체 라인에 반대되는 미세유체 장치 면의 비아(250)는 제어 라인의 수화, 작동 또는 다른 적합한 동작을 제공한다. 미세유체 장치의 배열 부분(230)은 도 4에 (부분적으로) 도시되어 있다. 배열 부분(230)에서, 샘플 및 분석물은 샘플 및 분석물 챔버 내로 로딩되고 그 다음 혼합되어 쌍요소 조합을 형성할 수 있다.
본 명세서 전체에 보다 충분히 기재된 바와 같이, 샘플 및 분석물이 혼합되고 반응한 후, 반응 생성물은 도 4에 도시된 바와 같은 미세유체 장치의 유체 주입 라인(212)를 통하여, 분석물 부분(230)을 통하여, 그리고 산출 유체 라인(240) 및 비아(242)를 통하여 회수 유체를 흐르게함으로써 미세유체 장치로부터 회수될 수 있다. 이러한 산출 유체 라인은 캐리어 상에 제공되는 산출 포트와 유체 연통한다. 따라서, 다양한 분석물 각각과 샘플의 조합으로부터 모인 반응 생성물은 독립적인 산출 유체 라인(240) 각각을 통하여 따로따로 제공된다.
도 3에 예시된 샘플 및 분석물 주입 라인의 특정 수는 단지 예로서 제공되며 특정 실행은 이러한 특정 수로 한정되지 않는다. 다른 실시 형태에서, 추가적인 샘플 및 분석물 주입 라인은 미세유체 장치에서 샘플 및 분석물의 추가적인 쌍요소 조합을 용이하게 하기 위하여 제공된다.
도 4는 도 3에 예시된 미세유체 장치의 수개의 단위 세포의 간략화된 개략도이다. 도 4에서, 배열 부분(230)으로부터의 4개의 단위 세포는 명확성의 목적을 위하여 도시된다. 샘플 주입 라인(316)은 유체 주입 라인(212)과 유체 연통하고, 분석물 주입 라인(318)은 도 3에 도시된 바와 같은 분석물 주입 라인(222)과 유체 연통한다. 미세유체 장치의 단위 세포 부분은 샘플 챔버(310) 및 분석물 챔버(312)를 포함한다. 인터페이스 밸브(330)가 개방 위치에 있을 때 유체 라인(314)은 샘플 챔버와 분석물 챔버 사이에 유체 연통을 제공한다. 특정 실시 형태에서, 샘플 주입 라인(316)은 샘플 챔버를 포함하는 층 아래에 위치한 미세유체 장차의 층에 제공된다. 유사한 방식으로, 분석물 주입 라인(318)은 분석물 챔버를 포함하는 층 아래에 위치한 미세유체 장치의 층에 제공된다. 샘플은 도 3에 도시된 샘플 주입 라인(212)에서 샘플 주입 라인(316)으로 흐르고, 하나 이상의 비아(미도시)를 통하여 샘플 주입 라인(316)에서 샘플 챔버(310)로 통과한다. 유체가 샘플 챔버를 지나가면서 샘플 주입 라인(316)이 3개의 주입 라인으로 분지하는 것으로 도시되지만, 이러한 특정 수는 본 발명에 필수적이지 않으며, 다른 수의 샘플 주입 라인, 예를 들어 1개의 주입 라인, 2개, 4개, 또는 4개 초과의 샘플 주입 라인이 사용될 수 있다. 유사한 고안 기준이 샘플 챔버 및 해당 분석물 챔버를 연결하는 3개의 유체 라인(314)에 적용가능하다. 샘플 주입 라인(316)은 도면의 열 방향으로 연속적인 흐름 경로를 제공하며, 단일 샘플이, 예를 들어 샘플 챔버의 상부 열 또는 샘플 챔버의 하부 열과 같은 다수의 샘플 챔버 사이에서 균등하게 분배될 수 있게 한다.
인터페이스 밸브(330) 및 차단 밸브(340)를 사용함으로써, 각각의 샘플 챔버는 분석물 챔버에서 뿐만 아니라 각각의 다른 샘플 챔버로부터 분리될 수 있다. 분석물 챔버는 차단 밸브를 사용하여 다른 분석물 챔버에서 분리될 수 있다. 분리 밸브 및 차단 밸브 둘 다 캐리어 상에 존재하는 해당 제어 라인에 압력을 적용함으로써 또는 다른 수단, 예를 들어 정전기 작용으로 작동된다.
도 4는 분석물 주입 라인(318)을 도시하며, 이는 도 3에 도시된 분석물 주입 라인(222)에서 분석물 챔버(312)로의 분석물 흐름을 제공한다. 차단 밸브가 개방 위치에 있을 때, 분석물은 분석물 주입라인에서 분석물 챔버(312)로 흐를 수 있다. 특정 실시 형태에서, 분석물은 샘플 챔버의 충전과 유사한 방식으로 분석물 챔버와 주입 라인을 연결하는 비아를 통하여 흐른다. 미세유체 장치의 컬럼을 따라서 분석물을 로딩하는 것은 샘플의 각각의 열에 대하여 상이한 분석을 제공하며, M x N 쌍요소 조합을 만들어낸다.
인터페이스 밸브(330)의 개방은 샘플 및 분석물을 자유 인터페이스 확산을 통하여 쌍요소 조합으로 혼합할 수 있게 한다. 샘플 및 분석물이 혼합된 후, 열순환이 실행되어 반응 생성물을 형성할 수 있다. 반응 생성물은 수확 밸브(350)를 개방함으로써 미세유체 장치로부터 회수되고, 반응 생성물은 샘플 챔버에 인접한 샘플 주입 라인의 부분(360) 내로 흐를 수 있게 한다. 샘플 주입 라인(316) 및 온칩 펌프(on-chip pump)(미도시)를 사용함으로써, 반응 생성물은 샘플 주입 라인을 통하여 캐리어 상 회수 포트를 향하여 흐른다.
도 4에 도시된 실시 형태에서, 샘플은 미세유체 장치의 제1면으로부터 로딩된다. 분석물은 미세유체 장치의 인접면으로부터 로딩된다. 처리 후, 수확 시약은 샘플 주입 라인을 사용하여 장치의 제1 면으로부터 주입되고 반응 생성물은 제1 면의 반대인 미세유체 장치의 면을 향하여 연장된 유체 라인 밖으로 미세유체 장치로부터 배출된다. 이 실시 형태에서, 미세유체 장치의 남아있는 면은 샘플 또는 분석물 로딩 또는 반응 생성물 언로딩에 사용되지 않는다. 다른 구성이 본 발명의 범위 내에 포함되며 도 4에 도시된 구성의 예는 단지 예로서 제공된다. 당업자는 많은 변화, 변경, 및 대체를 인식할 것이다.
본원에 기재된 시스템에 의해 제공되는 이점은 샘플 주입 및 분석물 주입 포트 내로 분배되는 피펫팅 부피에 관계없이 반응에서 사용되는 샘플 및 분석물의 부피가 고정되어 있다는 것이다. 샘플 및/또는 분석물 주입 포트에서 부피가 샘플/분석물 주입 라인 및 샘플/분석물 챔버를 충전하는데 충분한 소정 임계값을 초과한다면, 그 후 샘플/분석물 주입 포트로의 압력의 적용은 샘플/분석물 챔버를 완전하게 충전할 것이다. 따라서 완전하게 충전된 챔버는 종래의 미세적정판(microtiter plate) 기술로는 가능하지 않은 고정된 반응 부피를 제공한다.
이로 한정되는 것은 아니지만 ELISA 분석과 같은 면역학적 실험을 포함하여, 많은 동시 결합 분석을 실행하기 위하여 본 양수인에 의해 시스템이 개발되었지만, 본 발명의 실시 형태는 확장 펌핑 “온칩(on-chip)” 및 별도의 샘플 및 분석물 챔버를 제공한다. 따라서, 이전에 개발된 기술로는 가능하지 않은 본원에 기재된 실시 형태를 사용함으로써 샘플 및 분석물의 쌍요소 조합이 가능하다. 결합 분석의 추가적인 기재는 2006년 9월 13일에 출원된 미국 특허출원공개 제2007/0074972호에 제공되어 있으며, 이의 개시는 모든 목적을 위하여 전체적으로 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 실시 형태는 주입 DNA 주형으로부터 앰플리콘 라이브러리의 제조에서 비용, 시간 및 수고를 감소함을 특징으로 하는 PCR 샘플 제조에 적합한 시스템을 제공한다. 통상의 사용 경우에, 제1 증폭은 차세대 염기서열분석을 위한 라이브러리를 생성하는데 사용될 것이다. 본 발명의 실시 형태를 사용함으로써, 샘플 및 암호화된 프라이머는 앰플리콘 특이적(AS) 프라이머와 결합하여 원하는 반응에 적합한 혼합물을 만든다. 미세유체 장치의 MxN 구조에 기초하여, M개의 샘플 각각은 N개의 AS 프라이머(즉, 분석물) 각각과 결합되어 MxN개 쌍요소 조합을 형성한다. 즉, 하나의 반응 부위는 각각의 샘플 및 분석 쌍에 제공된다. 반응(예컨대, PCR)의 완료 후, 반응 생성물은 통상적으로 미세유체 장치를 통하여 흐르는 수확 시약을 사용하여 시스템에서 회수된다. 특이적인 실시 형태에서, 각각의 샘플과 연관된 반응 생성물은 별도의 반응 풀에서 회수되어, 각각의 다양한 분석물과 반응하는 주어진 샘플을 포함하는 풀의 추가적인 처리 또는 연구를 가능하게 한다.
따라서, 본원에 기재된 실시 형태에서, 미세유체 장치는 독립적인 샘플 주입이 MxN 배열 구성에서 프라이머 주입과 결합되는 것으로 제공된다. 따라서, 각각의 반응은 특정 샘플 및 특정 프라이머의 특유한 결합이다. 본 명세서 전체에 보다 충분히 기재된 바와 같이, 샘플은 하나의 구현예에서 컬럼으로 배열된 샘플 주입 라인을 통하여 미세유체 장치에서 샘플 챔버 내로 로딩된다. AS 프라이머 또는 분석물은 미세유체 장치에서 상기 컬럼을 가로지르는 열로 배열된 분석물 주입 라인을 통하여 분석물 챔버 내로 로딩된다. 샘플 챔버 및 분석물 챔버는 로딩 동안 유체 분리된다. 로딩 과정이 완료된 후, 샘플 및 분석물 챔버의 쌍 사이를 지나는 유체 라인을 막는데 작용할 수 있는 인터페이스 밸브는 걔방되어 샘플 및 분석물의 쌍요소 조합의 자유 인터페이스 확산을 가능하게 한다. 샘플 및 분석물의 정확한 혼합물은 반응이 다양한 쌍요소 조합 사이에서 일어날 수 있게 하고, 각각의 샘플이 특유의 바코드로 효과적으로 코딩된 특이적인 PCR 반응의 세트를 포함하는 반응 혼합물을 생성한다. 반응 생성물은 수확되고 그 다음 이후의 염기서열분석 과정에 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이 용어 “분석물” 및 “샘플”은 일부 실시 형태에서 장치의 특정 용도를 기술한다. 그러나, 장치의 용도는 모든 실시 형태에서 “샘플(들)” 및 “분석물(들)”의 용도로 한정되지 않는다. 예를 들어, 다른 실시 형태에서, “샘플(들)”은 “제1 시약” 또는 다수의 “제1 시약”을 지칭할 수 있고, “분석물(들)”은 “제2 시약” 또는 다수의 “제2 시약”을 지칭할 수 있다. 장치의 MxN 특성은 제1 시약의 임의의 세트의 조합이 제2 시약의 임의의 세트와 조합될 수 있게 한다.
본 발명의 실시 형태를 사용하여 실행되는 하나의 특정 과정에 따르면, PCR의 25사이클 후에, MxN 쌍요소 조합으로부터의 반응 생성물은 별도의 풀(M 개의 샘플의 각각에 대한 것)에서 미세유체 장치로부터 회수될 것이다. 통상적으로, 별도의 풀은 캐리어 상에 제공되는 샘플 주입 포트에 포함된다. 일부 과정에서, 반응 생성물은 표준화의 목적을 위하여 “앰플리콘 별”로 수확될 수 있다. 본 발명의 실시 형태를 사용함으로써, (샘플 및 분석물의 동일한 주입 용액으로부터 모인 복제 실험에 대하여) 증폭 생성물의 복제 수가 샘플 내에서 ± 25% 이하 그리고 샘플 사이에서 ± 25% 이하로 변하는 결과를 획득할 수 있다. 따라서, 미세유체 장치에서 회수된 증폭 생성물은 특이적인 알려진 유전자형의 분배로 측정된 바와 같이 주입 샘플을 나타낸다. 바람직하게, 산출 샘플 농도는 2,000복제/앰플리콘/마이크로리터보다 크며 반응 생성물의 회수는 2시간 미만으로 실행될 것이다.
본 발명의 실시 형태가 사용될 수 있는 적용은 염기서열분석기가 준비된(sequencer-ready) 앰플리콘 제조 및 긴 범위 PCR 앰플리콘 라이브러리 생성을 포함한다. 염기서열분석기가 준비된 앰플리콘 제조, 다수의 정방향 프라이머 및 3개 프라이머 결합 프로토콜이 사용될 수 있다.
도 5a는 본 발명의 다른 실시 형태에 따른 미세유체 장치의 간략화된 개략도이다. 도 5a에 도시된 미세유체 장치는 도 2에 도시된 미세유체 장치와 차이점뿐만 아니라 공통된 특징을 공유한다. 샘플은 48개의 비아 및 미세유체 장치의 일단(즉, 도 5a에서 하부단)에서 제공되는 해당 샘플 주입 라인을 통하여 미세유체 장치 내로 로딩된다. 샘플은 샘플 주입 라인을 통하여 미세유체 장치의 배열 부분(430) 내로 흐른다. 분석물은 미세유체 장치의 2개의 면(즉, 도 5a에서 왼쪽면 및 오른쪽면) 상의 비아 및 분석물 주입 라인으로부터 로딩된다. 배열 부분(430)에 존재하는 단위 세포의 추가적인 논의는 도 6과 관련하여 제공된다. 반응 생성물은 샘플 주입 라인을 통하여 제거되고 캐리어(100)에 제공되는 샘플 주입 포트(120)에서 회수된다. 따라서, 도 5a에서 샘플의 로딩 및 반응 생성물의 회수는 미세유체 장치의 하부 면을 통하여 흐르는 것으로 예시된다.
도 5b는 도 5a에 도시된 미세유체 장치 부분의 간략화된 개략도이다. 도 5b에 도시된 부분은 샘플 주입 라인(410), 짝수의 분석물을 위한 분석물 주입 라인(분석물 주입 라인(420)), 홀수의 분석물을 위한 분석물 주입 라인(분석물 주입 라인(422)),및 수확 시약 주입 라인(430)을 포함한다. 실시 형태에서, 샘플 주입 라인(410)은 샘플 주입 라인(140)과 정렬된 비아(412)와 유체 연통하고, 샘플 주입 라인(140)은 도 2에서 도시된 바와 같이 샘플 주입 포트(120)와 유체 연통한다. 다른 실시 형태에서, 추가 샘플 주입 라인(미도시)이 제공되어 샘플 주입 포트(120)와 샘플 주입 라인(410) 사이에서 유체 연통을 가능하게 한다. 따라서 샘플 주입 포트의 뱅크의 가압은 예시된 샘플 주입 라인(410) 내로 다양한 샘플을 흐르게 할 것이다.
하기 도 6과 관련하여 논의된 바와 같이, 샘플 주입 라인(410)은 미세유체 장치에 존재하는 샘플 주입 라인(516) 및 샘플 챔버(510)와 유체 연통한다. 48개의 샘플 챔버 및 48개의 분석물 챔버와의 배열에 대하여, 도 5b에 예시된 48개의 샘플 주입 라인(410)은 48개의 별개의 샘플 챔버 컬럼에 샘플을 제공할 것이고, 이 중 2개가 도 6에 도시되어 있다. 도 5b에 도시된 다양한 유체 라인은 특정 실행에 따라서, 캐리어(100)에 통합될 수 있거나, 미세유체 장치(110)에 통합될 수 있거나, 또는 하나 이상의 다른 구조에 존재할 수 있음에 주목하여야 한다. 따라서, 도 5b에서 샘플 주입 라인(410)의 도시는 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 의도되지 않으며 단지 미세유체 장치의 다양한 챔버로 제어된 유체 흐름을 제공하기에 적합한 유체 라인을 도시하는 것이다.
실시 형태에서, 짝수 분석물 주입 라인(420) 및 홀수 분석물 주입 라인(422)은 분석물 주입 라인(140)과 정렬된 비아(424)와 유체 연통하고, 분석물 주입 라인(140)은 도 2에 도시된 바와 같이 분석물 주입 포트(122)와 유체 연통한다. 다른 실시 형태에서, 분석물 주입 포트(122)와 분석물 주입 라인(420 및 422) 사이에서 유체 연통이 가능하도록 추가 분석물 주입 라인(미도시)이 제공된다. 따라서, 분석물 주입 포트(122)의 뱅크의 가압은 도시된 분석물 주입 라인 내로 다양한 분석물이 흐르게 할 것이다. 도 5b에 도시된 주입 라인을 통하여 흐른 후, 다양한 유체는 결국 도 6에 도시된 단위 세포 내로 들어갈 것이다.
상기 논의된 바와 같이, 다양한 유체 라인은 캐리어, 미세유체 장치, 또는 다른 적합한 구조 내로 통합될 수 있다. 48개 샘플 x 48개 분석물 배열 구조에서, 24개의 짝수 분석물 주입 라인(420)은 도 6에 나타낸 분석물 주입 라인(518)의 열의 절반에 주입을 제공할 것이다. 24개의 홀수 분석물 주입 라인(422)은 도 6에 나타낸 분석물 주입 라인(518)의 열의 절반에 주입을 제공할 것이다. 따라서, 분석물의 로딩이 도 6에서 배열의 오른쪽 면에서 예시되어 있을 뿐이지만, 실제 실행은 통상적으로 짝수/홀수 구성에서 양쪽 면에서 분석물을 로딩할 것이다. 일부 실시 형태에서, 추가적인 비아가 수화 유체 등의 로딩을 위해 제공된다. 또한 일부 실시 형태에서, 기존의 캐리어와의 호환성을 제공하기 위하여, 이러한 호환성을 제공하도록 일부 유체 라인은 사용되지 않거나 또는 개질된다.
수확 시약 주입 라인(430)은 미세유체 장치에서 반응 생성물을 회수하는데 사용되는 수확 시약을 제공한다. 도 5b에 도시된 수확 시약 주입 라인(430)은 도 2에 도시된 수확 시약 주입 포트(136)와 유체 연통하고 미세유체 장치의 상부 부분으로 짝수 분석 주입 라인에 인접한 미세유체 장치를 따라서 지나가며, 그 다음 다수의 수확 시약 주입 라인으로 분지한다. 수확 시약 다중화기(multiplexor)는 모든 샘플 주입 라인에 대하여 실질적으로 동일한 부피를 가져 반응 생성물 회수 작동 동안 균일한 펌핑을 제공한다. 도 5b에 도시된 특정 분지 시스템은 단지 예로서 제공되며 다른 분지 시스템이 본 발명의 범위 내에 포함됨을 주목하여야 한다. 수확 시약 주입 라인(430)은 도 6에 관하여 논의된 샘플 주입 라인(516)과 유체 연통한다. 도 9a 내지 9d에 관하여 논의된 바와 같이, 실시 형태는 샘플 챔버의 각각의 컬럼에 대하여 별도의 수확 시약 주입 라인, 예를 들어 48 x 48 배열 구성을 가지는 미세유체 장치에 대하여 48개의 수확 시약 주입 라인을 이용한다. 추가적으로, 수확 시약 주입 라인이 짝수 분석 주입 라인(420)에 인접한 위치에서 미세유체 장치 내로 들어가더라도, 이는 본 발명의 실시 형태에 필수적인 것은 아니며 다른 구성이 본 발명의 범위 내에 있다. 당업자는 많은 변형, 변경 및 대체를 인식할 것이다.
도 8c에 관하여 기재된 바와 같이, 수확 시약은 캐리어 상에서 수확 시약 주입 포트로부터 수확 시약 주입 라인(430)을 통하여, 그리고 샘플 주입 라인(516)의 한쪽 말단 내로 흐른다. 본 명세서 전체에 보다 충분히 논의된 바와 같이, 샘플 주입 라인은 주입 라인 및 반응 생성물 회수 라인으로서 기능한다. 로딩에 대하여, 샘플 흐름 경로는 샘플 주입 포트(120)로부터, 주입 라인(140)을 통하여, 비아(412)를 통하여, 샘플 주입 라인(410)을 통하여, 샘플 주입 라인(516)을 통하여, 반응 챔버(510)까지 그리고 로딩 볼(830)까지이다. 반응 생성물 회수에 대하여, 생성물 흐름 경로는 수확 시약 주입 포트(136)로부터, 수확 시약 주입 라인(430)을 통하여, 샘플 주입 라인(516)을 통하여, 샘플 주입 라인(410)을 통하여, 비아(412)를 통하여, 수확 동안 유체 회수 웰로서의 역할을 하는 샘플 주입 포트(120)까지이다. 따라서, “주입” 라인은 샘플을 로딩하고 미세유체 장치 및 캐리어로부터 반응 생성물을 회수하거나 제거하는 두 가지 역할을 모두 할 수 있기 때문에, 용어 “주입” 라인의 용도는 실행되는 특정 과정의 맥락에서 고려되어야 한다.
샘플 주입 포트(120)의 뱅크 및 분석 주입 포트(122)의 뱅크에 압력을 적용함으로써, 샘플 및 시약은 미세유체 장치에 존재하는 샘플 및 분석물 챔버 내로 도시된 샘플 및 분석물 주입 라인을 통하여 로딩될 수 있다. 수확 시약 주입 포트(136)에 압력을 적용함으로써, 반응 생성물은 샘플 챔버에서 회수되고 샘플 주입 포트로 전달될 수 있다. 미세유체 장치에 존재하는 밸브는 본 명세서 전체에 보다 충분히 기재된 바와 같이, 샘플, 분석물, 및 반응 생성물의 흐름을 제어하는데 사용된다. 도 5b는 단지 샘플 주입 라인, 분석물 주입 라인, 및 수확 시약 주입 라인의 부분을 도시하고 이러한 주입 라인의 추가적인 부분은 도 5a 및 도 6에 도시되어 있다.
도 6은 도 5a에 도시된 미세유체 장치의 수개의 단위 세포의 간략화된 개략도이다. 도 6에서, 도 5a에 나타낸 배열 부분(430)으로부터의 4개의 단위 세포는 명확성의 목적으로 도시된다. 미세유체 장치의 단위 세포 부분은 샘플 챔버(510) 및 분석물 챔버(512)를 포함한다. 인터페이스 밸브(530)가 개방 위치에 있을 때 유체 라인(514)은 샘플 챔버와 분석물 챔버 사이에서의 유체 연통을 제공한다. 특정 실시 형태에서, 샘플 주입 라인(516)은 샘플 챔버를 포함하는 층 아래에 위치한 미세유체 장차의 층에 제공된다. 유사한 방식으로, 분석물 주입 라인(518)은 분석물 챔버를 포함하는 층 아래에 위치한 미세유체 장치의 층에 제공된다. 샘플은 도 5b에 도시된 샘플 주입 라인(410)으로부터 샘플 주입 라인(516)으로 흐르고 하나 이상의 비아를 통하여 샘플 주입 라인에서 샘플 챔버로 통과한다. 2개의 샘플 라인이 각각의 샘플 챔버에 대하여 도시되지만, 이러한 특정 수는 본 발명에 필수적이지는 않으며, 다른 수의 샘플 주입 라인, 예를 들어 1개의 주입 라인, 3개, 4개, 또는 4개 초과의 샘플 주입 라인이 사용될 수 있다. 샘플 주입 라인(516)은 도면의 컬럼 방향으로 연속적인 흐름 경로를 제공하며, 단일 샘플이 다수의 샘플 챔버 사이에서 균등하게 분배될 수 있게 한다.
도 6은 분석물 주입 라인(518)을 도시하며, 상기 분석물 주입 라인은 도 5b에 도시된 분석물 주입 라인(420 및 422)으로부터 분석물 챔버(512)로의 분석물 흐름을 제공한다. 도 6은 도면의 오른쪽 면으로부터 단위 세포로 들어가는 분석물 주입 라인만을 도시하고 있지만, 도 5b에 도시된 구현예에서 짝수 및 홀수 분석물은 미세유체 장치의 반대측으로부터 로딩되는 것임이 당업자에게는 명백할 것이다. 도 6에 제공된 도시는 단지 명확함의 목적을 위하여 간략화된다. 특정 실시 형태에서, 분석물은 샘플 챔버의 충전과 유사한 방식으로 주입 라인 및 분석물 챔버를 연결하는 비아를 통하여 로딩된다. 미세유체 장치의 열을 따라서 분석물을 로딩하는 것은 각각의 샘플에 대하여 상이한 분석을 제공하며, M x N 배열에 적합한 다수의 쌍요소 조합을 생성한다.
본 명세서 전체에 보다 충분히 기재된 바와 같이, 반응 생성물은 샘플 주입 라인(516) 및 펌프(미도시)를 사용하여 미세유체 장치에서 회수된다. 차단 밸브(540)는 각각의 열에서 다양한 샘플과 분석물 챔버 사이에 차단을 제공한다. 인터페이스 밸브(530) 및 차단 밸브(540)를 사용하여, 각각의 샘플 챔버는 분석물 챔버 뿐만 아니라 각각의 다른 샘플 챔버로부터 분리될 수 있다. 분석물 챔버는 차단 밸브를 사용하여 다른 분석물 챔버에서 분리될 수 있다. 분리 및 차단 밸브는 모두 공급원(130 내지134)과 유체 연통하여 해당 제어 라인에 압력을 적용함으로써 또는 다른 수단, 예를 들어 정전기 작용으로 작동된다.
도 6에서, 4개의 샘플 챔버(510)는 배열 구성에서 도시된다. 4개의 도시된 챔버는 단지 예로서 나타내어져 있고 본 발명의 구현은 4개의 도시된 챔버로 한정되지 않지만, 그러나 통상적으로 48 x 48 배열 구성에서 2,304개의 챔버, 64 x 64 배열 구성에서 4,096개의 챔버, 96 x 96 배열 구성에서 9,216개의 챔버 등을 제공한다.
본 발명의 실시 형태는 대략 수백 미크론의 크기인 단위 세포, 예를 들어 500 x 500μm, 525 x 525μm, 550 x 550μm, 575 x 575μm, 600 x 600μm, 625 x 625μm, 650 x 650μm, 675 x 675μm, 700 x 700μm 등의 크기인 단위 세포를 제공한다. 샘플 챔버 및 분석물 챔버의 크기는 샘플 및 분석물 사용을 감소시키면서 원하는 과정에 충분한 양의 물질을 제공하도록 선택된다. 예로서, 샘플 챔버는 대략 폭이 100 내지 400μm x 길이가 200 내지 600μm x 높이가 100 내지 500μm인 크기를 가질 수 있다. 예를 들어, 폭은 100μm, 125μm, 150μm, 175μm, 200μm, 225μm, 250μm, 275μm, 300μm, 325μm, 350μm, 375μm, 400μm 등일 수 있다. 예를 들어, 길이는 200μm, 225μm, 250μm, 275μm, 300μm, 325μm, 350μm, 375μm, 400μm, 425μm, 450μm, 475μm, 500μm, 525μm, 550μm, 575μm, 600μm 등일 수 있다. 예를 들어, 높이는 100μm, 125μm, 150μm, 175μm, 200μm, 225μm, 250μm, 275μm, 300μm, 325μm, 350μm, 375μm, 400μm, 425μm, 450μm, 475μm, 500μm, 525μm, 550μm, 575μm, 600μm 등일 수 있다. 분석물 챔버는, 통상적으로 더 작은 챔버 부피 보다 더 작은 범위 이상의 유사한 단계 크기를 제공하는, 유사한 크기 범위를 가질 수 있다. 일부 실시 형태에서, 분석물 챔버 부피에 대한 샘플 챔버 부피의 비율은 약 5:1, 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 또는 30:1이다. 열거된 범위 보다 더 작은 챔버 부피는 본 발명의 범위 내에 포함되며, 미세유체 장치 제작 기술을 사용하여 용이하게 제작된다.
고밀도 미세유체 장치는 통상적으로 단위 세포의 풋프린트를 감소시키기 위하여 더 작은 챔버 부피를 사용할 것이다. 매우 작은 샘플 크기가 이용될 수 있는 적용에서, 감소된 챔버 부피는 이러한 작은 샘플의 테스트를 용이하게 할 것이다.
인터페이스 밸브(530)의 크기는 샘플 및 분석물 챔버를 연결하는 유체 라인(514)의 완전한 차단을 제공하도록 선택된다. 일부 실시 형태에서, 밸브 크기는 약 10 내지 200μm x 10 내지200μm, 예를 들어 50 x 50μm, 50 x 65μm, 50 x 80μm, 50 x 100μm, 65 x 50μm, 65 x 65μm, 65 x 80μm, 65 x 100μm, 80 x 50μm, 80 x 65μm, 80 x 80μm, 80 x 100μm, 100 x 50μm, 100 x 65μm, 100 x 80μm, 100 x 100μm 등의 범위이다. 샘플 주입 라인은 샘플 주입 라인의 수 및 샘플 챔버 부피, 로딩 및 생성물 회수를 위한 원하는 유속에 따라서 다양한 폭을 가질 수 있다. 예로서, 샘플 주입 라인은 높이가 1 내지 20μm, 폭이 50 내지 100μm인 단면적을 가질 수 있다. 예를 들어, 샘플 주입 라인은 높이가 1μm, 2μm, 3μm, 4μm, 5μm, 6μm, 7μm, 8μm, 9μm, 10μm, 11μm, 12μm, 13μm, 14μm, 15μm, 16μm, 17μm, 18μm, 19μm, 또는 20μm이고 폭이 50μm, 55μm, 60μm, 65μm, 70μm, 75μm, 80μm, 85μm, 90μm, 95μm, 또는 100μm일 수 있다.
20 내지 100μm 범위의 층 대 층 정렬을 포함하고 50 내지 200미크론 범위의 크기를 통한 다른 장치 파라미터는 원하는 시스템 성능 특성을 제공하도록 선택된다. 당업자는 많은 변형, 변경 및 대체를 인식할 것이다.
일부 실시 형태에서, 추가 분석물 주입이 수확 시약 주입 라인에 인접한 미세유체 장치측에서 제공된다. 추가적으로, 어떠한 분석물 주입도 캐리어 상의 샘플 주입 포트에 인접한 미세유체 장치측에서 제공되지 않는다. 이러한 구성에서, 추가 분석 주입은 탈수 챔버 로딩에 사용될 수 있다. 통상적으로, 탈수 챔버의 로딩은 5μl 초과의 분석물 용액을 사용할 것이다. 대안적으로, 별도의 탈수 용액은 미세유체 장치에 걸쳐서 분석물 부피를 균일하게 유지하는데 사용될 수 있다.
도 7은 본 발명의 실시 형태에 따른 미세유체 장치를 작동하는 방법의 간략화된 흐름도이다. 도시된 실시 형태에서, 미세유체 장치는 적어도 하나의 분석물 챔버, 적어도 하나의 샘플 챔버, 및 적어도 하나의 수확 포트를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 미세유체 장치는 다수의 분석물 챔버 및 다수의 샘플 챔버를 포함한다. 방법(600)은 분석물 챔버와 샘플 챔버(610) 사이에 유체 라인을 폐쇄하는 단계를 포함한다. 도 6에 대하여, 인터페이스 밸브(530)는 샘플 챔버(510) 내지 분석물 챔버(512) 사이를 통과하는 유체 라인(514)을 폐쇄시키도록 작동할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 인터페이스 밸브(530)는 하기에 보다 충분히 기재된 바와 같이 “푸시업(push-up)” 밸브이다. 인터페이스 밸브는 미세유체 장치의 제1 층에 적어도 부분적으로 포함되는 제어 라인(532) 또는 제어 채널의 교차로 형성된다. 유체 라인은 미세유체 장치의 제2 층에 적어도 부분적으로 포함된다. 제어 라인(532)은 도 2에 도시된 바와 같은 하나 이상의 압력 액추에이터 또는 어큐뮬레이터와 유체 연통한다.
유체 라인(514)과 제어 라인(532)의 교차는 교차점에서 밸브를 형성하고, 밸브는 샘플과 분석물 사이의 인터페이스에서의 혼합을 방지하므로 인터페이스 밸브(530)으로서 지칭된다. 인터페이스 밸브(530)는 제어 라인에서 유체 압력에 반응하여 작동하고 유체 라인을 통한 유체 흐름을 방지하도록 작동한다. 일반적으로, 본원에 논의된 다층 미세유체 장치는 다수의 엘라스토머 층을 포함하고 밸브(530)는 제1층과 제2층 사이에 구부러질 수 있는 막을 포함한다. “푸시업” 구성에서, 밸브의 구부러질 수 있는 막은 제어 라인(532)과의 교차점 위에 위치하는 유체 라인(514) 내로 구부러질 수 있다. 이 구성에서, 구부러질 수 있는 막은 밸브, 따라서 “푸시업” 밸브에 대한 참조의 위치에서 유체 라인에 근접하게 유체 라인 내로 구부러진다. 제어 라인에서 압력을 방출하면 구부러질 수 있는 막이 구부러지지 않은 위치로 되돌아가고 그렇게 함으로써 폐쇄된 밸브가 개방될 것이다. 밸브를 포함한 미세유체 장치의 추가적인 기재는 미국 특허출원 제2005/0226742호에서 제공되며, 이의 전체 개시내용은 모든 목적을 위하여 전체적으로 본원에 참조로 포함된다.
도 6에 도시된 바와 같이, 제어 라인(532)의 작동은 유체 라인(514)을 방해할 것이다. 통상적으로, 제어 라인(532)은 압력 어큐뮬레이터에 압력을 적용함으로써 동시에 작동된다. 인터페이스 밸브(530)의 폐쇄 후 도 7을 다시 한번 참조하면, 샘플은 샘플 주입 라인(516(612))을 통하여 샘플 챔버(510) 내로 흐른다. 도 6에 도시된 바와 같이, 각각의 샘플 챔버(510)는 다수(예컨대, 2개)의 샘플 주입 라인(516)과 유체 연통한다. 다른 실시 형태에서, 다른 수의 샘플 주입 라인이 사용될 수 있다. 당업자는 많은 변형, 변경 및 대체를 인식할 것이다. 통상적으로, 적어도 부분적으로 미세유체 장치의 제2층에 포함되는 샘플 주입 라인은 적어도 부분적으로 미세유체 장치의 제3층에 포함되는 샘플 챔버 아래를 지나간다. 샘플 주입 라인에서 샘플 챔버까지 지나가는 비아(도시되지 않음)는 샘플 주입 라인에서 샘플 챔버까지의 유체 흐름을 제공한다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 컬럼에서, 예를 들어 컬럼 위로, 개방된 차단 밸브(540)를 지나서, 도면의 평면에서 확장된 비아를 통하여, 그리고 다양한 샘플 챔버 내로 샘플이 흐른다. 미세유체 장치를 제작하는데 사용되는 엘라스토머 물질의 투과성의 결과로서 샘플 챔버에 존재하는 공기와 같은 유체는 샘플의 로딩 동안 분출된다.
도 7을 다시 한번 참조하면, 분석물은 분석물 주입 라인(518(614))을 통하여 분석물 챔버(512) 내로 흐른다. 분석물 주입 라인(518)을 통하여, 개방된 차단 밸브(540)을 지나서, 분석물 주입 라인에서 분석물 챔버까지 지나는 비아(미도시)를 통하여 분석물이 흐른다. 인터페이스 밸브(530)의 폐쇄는 샘플 챔버 내 샘플 및 분석물 챔버 내 분석물이 혼합하는 것을 방지한다. 일단 샘플 및 분석물이 로딩되면, 분석물 챔버와 샘플 챔버 사이의 유체 라인은 개방된다(616). 본 발명의 실시 형태에서, 인터페이스 밸브(530)의 개방으로 다수의 유체 라인(514)이 동시에 개방된다. 샘플의 적어도 일부분 및 분석물의 적어도 일부분이 결합하여 혼합물(618)을 형성한다. 샘플 및 분석물의 혼합물은 샘플 챔버 및 분석물 챔버 뿐만 아니라 이들 챔버를 연결하는 유체 라인 도처에서 형성된다. 자유 인터페이스 확산은 혼합이 느린 과정이고 종 평형(species equilibration) 속도는 종 확산 상수에 따라 다르다. 염과 같은 소분자는 확산 상수가 크고, 따라서 빠르게 평형을 유지한다. 대분자(예컨대, 단백질)는 확산 상수가 작고, 더 천천히 평형을 유지한다.
혼합물은 반응하여 반응 생성물(620)을 형성한다. 본 발명의 범위 내에 포함되는 통상적인 반응은 PCR이며, 이는 당업자에게 명백할 것인 다수의 사이클을 통한 미세유체 장치의 열순환을 포함한다. 분석물 챔버와 샘플 챔버 사이의 유체 라인은 인터페이스 밸브(530)의 작동으로 폐쇄된다(622). 인터페이스 밸브의 폐쇄는 샘플 챔버에 존재하는 반응 생성물을 분석물 챔버에 존재하는 반응 생성물과 분리한다. 추가적으로, 차단 밸브(540)는 열순환 과정 동안 침전을 방지하기 위하여 열순환 동안 폐쇄될 수 있다. 수확 시약은 샘플 챔버에 존재하는 반응 생성물을 수확하는 과정을 시작하기 위하여 수확 포트에서 샘플 챔버(624)로 흐른다. 수확 포트(136)는 수확 과정에 유용한 유체 주입 포트의 한 예이다. 도 4에 도시된 바와 같이, 반응 생성물은 샘플 주입 라인(516)을 통하여 샘플이 원래 제공되었던 샘플 주입 포트로 흐른다. 따라서, 도시된 방법에서, 미세유체 장치에서 반응 생성물을 제거하는 단계는 샘플 주입 포트로 샘플을 로딩하는데 사용된 샘플 주입 라인의 적어도 일부분을 통하여 반응 생성물을 유입하는 단계를 포함한다. 따라서, 반응 생성물은 미세유체 장치(626)에서 제거되고 샘플 주입 포트, 예를 들어 도 2에 도시된 샘플 주입 포트(120)로 산출된다.
확장 펌핑은 예시된 실시 형태에서 사용되어 도 9a~9d에 관하여 추가적으로 상세히 논의된 바와 같이 미세유체 장치로부터 반응 생성물을 제거한다. 다시 한 번 도 2를 참고하면, 제어 포트(130 및 132) 또는 압력 어큐뮬레이터(150 및 152)는 확장 펌핑에서 사용되는 밸브를 작동하는데 사용될 수 있다. 따라서, 실시 형태는 미세유체 장치에서 확장 펌핑을 위한 밸브를 제공하며, 이는 미세유체 장치에서 반응 생성물의 제거를 제공한다. 이는 이러한 밸브가 미세유체 장치의 부분으로서 제공되지 않는 종래의 고안과 대조된다.
도 7에 도시된 특정 단계는 본 발명의 실시 형태에 따라 미세유체 장치를 작동하는 특정 방법을 제공하는 것임을 인식하여야 한다. 단계의 다른 순서는 또한 대안적인 실시 형태에 따라서 실행될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 대안적인 실시 형태는 다른 순서로 상기 개괄한 단계를 실행할 수 있다. 게다가, 도 7에 도시된 개별적인 단계는 개별적인 단계에 적절하게 다양한 순서로 실행될 수 있는 다수의 하위단계를 포함할 수 있다. 또한, 추가적인 단계는 특정 적용에 따라서 추가되거나 제거될 수 있다. 당업자는 많은 변형, 변경 및 대체를 인식할 것이다.
도 8a 내지 8d는 본 발명의 실시 형태에 따라서 작동 동안 미세유체 장치의 단위 세포를 통한 유체 흐름을 도시하는 간략화된 개략도이다. 도 8a를 참조하면, 미세유체 장치는 샘플 및 분석물 로딩 과정 동안 도시된다. 차단 밸브(540)가 개방되고, 샘플 주입 라인(516)을 따라 다양한 샘플 챔버(510)로 유체 흐름을 허용한다. 차단 밸브의 개방 상태는 또한 분석물이 분석물 주입 라인(518)을 통하여 다양한 분석물 챔버(512)로 흐를 수 있게 한다. 샘플 주입 라인의 각각의 세트에 대한 단일 샘플(M개 샘플의 m)을 사용하는 것은 샘플 챔버의 각각의 컬럼에서 단일 샘플의 로딩을 가능하게 한다. 추가적으로, 각각의 분석물 주입 라인에 대한 단일 분석물(N개의 분석물의 n)을 사용하는 것은 분석물 챔버의 각각의 열에서 단일 분석물의 로딩을 가능하게 한다. 인터페이스 밸브(530)의 폐쇄된 상태는 샘플 및 분석물의 혼합을 방지한다.
도 8b는 샘플과 분석물의 혼합 과정뿐만 아니라 이후의 반응 과정(예컨대, 증폭) 동안의 미세유체 장치를 도시한다. 차단 밸브(540)가 폐쇄되면, 샘플 주입 라인(516)을 따른 유체 흐름을 방지한다. 따라서 차단 밸브의 폐쇄는 컬럼을 따라서 (상이한 샘플을 잠재적으로 포함하는 각각의 컬럼과) 서로 샘플 챔버를 분리한다. 차단 밸브(540)의 폐쇄는 추가적으로 각각의 열에서 분석물 챔버를 다른 분석물 챔버에서 분리한다. 이러한 챔버 분리가 제공된 후에, 인터페이스 밸브(530)가 개방되고, 샘플 및 분석물이 자유 인터페이스 확산(free interface diffusion, FID)을 통하여 혼합되어 M x N 쌍요소 조합을 형성할 수 있게 한다. 샘플/분석물 챔버의 쌍에서의 물질이 도 8b에 동일한 음영으로 도시되어 있지만, 4개의 상이한 쌍요소 조합이 각각의 쌍의 샘플/분석물 챔버의 하나에 대하여 도시된다. 다수의 단계, 예를 들어 다수의 열순환 단계가 이러한 과정에 수반됨이 당업자에게 명백할 것이지만, 샘플과 분석물을 혼합하고, 그 다음 PCR 증폭을 실행하는데 수반되는 다수의 단계는 도 8b에서 단일 도면으로 나타내어진다.
도 8c는 샘플 챔버 분리 및 수확 시약의 초기 로딩 동안의 미세유체 장치를 도시한다. 인터페이스 밸브(530)는 샘플 챔버와 분석물 챔버 사이에서 분리를 유지하도록 폐쇄된다. 따라서, 분석물 챔버 내 반응 생성물이 회수되지 않는 동안에 샘플 챔버에 존재하는 반응 생성물이 회수된다. 차단 밸브(540)는 도 5b에 도시된 수확 시약 주입 라인(430)에서 샘플 주입 라인(516) 내로 수확 시약이 흐르도록 개방된다. 수확 시약은 샘플 주입 라인을 통하여, 그리고 샘플 챔버 내로 흐른다. 도시된 실시 형태에서. 반응 생성물은 수확 시약이 도 9a 내지 9d에서 추가적으로 상세하게 기재된 확장 펌핑 과정에 반응하여 샘플 주입 라인 및 샘플 챔버를 통하여 흐르는 동안 제거된다. 도 8c에 도시된 바와 같이, 수확 시약은 상부 반응 챔버의 중간 부분에만 도달한다. 확장 펌핑 과정이 계속되는 동안, 수확 시약은 다음 샘플 챔버 내로 계속해서 도입되어 반응 생성물을 대체할 것이다. 결국, 각각의 샘플과 연관된 반응 생성물은 샘플이 원래 분배되었던 샘플 주입 포트에서 반응 생성물 및 수확 시약을 포함하여 모인 유체로서 회수될 것이다.
수확 시약 및 반응 생성물 사이의 인터페이스를 나타내는 직선은 단지 단순성의 목적을 위하여 나타낸 것에 주목하여야 하고, 실행시 보다 복잡한 인터페이스가 존재할 것임이 당업자에게 명백할 것이다.
도 8d는 수확 시약의 최종 로딩 및 반응 생성물의 회수 동안의 미세유체 장치를 도시한다. 확장 펌핑 과정이 계속되는 동안, 수확 시약은 계속해서 수확 시약 주입 라인에서 더 먼 추가 샘플 챔버 내로 유입된다. 도 8d에 도시된 회수 과정의 상태는 반응 생성물이, 수확 시약으로 충전되지 않은 샘플 챔버에서 흘러 나온 것을 나타낸다. 도 8d에 단지 4개의 샘플 챔버만이 도시되어 있지만, 배열내 모든 샘플 챔버로부터의 반응 생성물의 회수는 본원에 기재된 실시 형태로 제공된다.
도 9a 내지 9d는 본 발명의 실시 형태에 따른 작동 동안 미세유체 장치를 통한 유체 흐름을 도시하는 간략화된 개략도이다. 도 9a는 샘플 및 분석물의 로딩 동안 본 발명의 실시 형태에 따른 미세유체 장치의 부분을 도시한다. 도시된 부분은 수확 시약 주입 라인(810), 통풍구 및 로딩 볼 부분(830), 및 분리 밸브(840)를 포함한다. 본 명세서 전체에 보다 충분히 기재된 바와 같이, 밸브(820 및 822)는 샘플 챔버(510)에 존재하는 반응 생성물의 확장 펌핑을 실행하는데 사용된다. 도 9a에 도시된 바와 같이, 밸브(820)는 폐쇄되고 밸브(822)는 개방된다. 밸브(820 및 822)는 통상적으로 본 명세서의 다른 부분에 기재된 “푸시업” 밸브이다.
도 6에 관하여 기재된 바와 같이 샘플은 샘플 챔버(510) 내로 로딩되고 분석물은 분석물 챔버(512) 내로 로딩된다. 인터페이스 밸브(530)는 폐쇄되어 샘플 및 분석물의 혼합을 방지한다. 통풍구 및 로딩 볼은 고갈 프론트(depletion front)와 관련된 효과에서 감소를 허용하도록 일부 실시 형태에 제공된다. 발명자는 미세유체 장치 내로 샘플을 로딩하는 것에서(예컨대, 도 9a에 도시된 수직 샘플 주입 라인을 통하여), 흐름 경로의 선단에서 존재하는 샘플의 일부분의 미세유체 장치의 물질로의 결합은 샘플의 하나 이상의 성분이 이러한 결합 과정의 결과로서 고갈되는 고갈 프론트를 생성할 것이다. 통풍구 및 로딩 볼(830)의 제공은 사용자가 미세유체 장치의 다양한 샘플 챔버를 통하여 고갈 프론트를 밀고 로딩 볼(830) 내에 고갈된 샘플 물질을 저장할 수 있게 한다. 결국, 고갈된 샘플 물질이 장치를 통하여 로딩 볼 내로 넘쳐 흐르는 동안, 미세유체 장치 내에 포함된 샘플은 실질적으로 고갈되지 않을 것이다.
분리 밸브(840)는 샘플 및 분석물 로딩 과정 동안 개방되어 고갈 프론트가 로딩 볼(830) 내로 흐를 수 있게 한다. 밸브(822)는 개방되어, 샘플이 샘플 주입 라인을 통하여 다양한 샘플 챔버로 흐를 수 있게 한다. 밸브(820)는 폐쇄되므로, 샘플은 수확 시약 주입 라인(810) 내로 지나갈 수 없다. 차단 밸브(540)는 도 9a에서 폐쇄된 상태로 도시되어 있음을 주목하여야 한다. 샘플 및 분석물 로딩 동안 차단 밸브가 개방되고 그 다음 샘플 및 분석물 로딩이 완료된 후 도시된 바와 같이 폐쇄된다. 차단 밸브는 반응 및 분석물 챔버의 다양한 쌍을 다양한 쌍요소 조합을 포함하는 다른 쌍과 분리한다.
도 9a에서, 미세유체 장치의 단일 컬럼만이 명확성의 목적을 위하여 도시되어 있다. 추가 컬럼이, 예를 들어 도 6에 도시된 바와 같이 미세유체 장치에 의해 제공됨이 이해된다. 또한, 다수의 컬럼이 명확성의 목적을 위하여 도시되어 있지 않다. 도시된 샘플/분석물 챔버의 2개의 세트는 각각 도 4a의 상부 및 하부의 것이다. 밸브(820)에 인접한 세트는 최상부 세트이고 밸브(822)에 인접한 세트는 최하부 세트이다. 따라서, 이러한 도표는 단지 대표하는 것으로서 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 의도되지 않는다.
도 9b는 샘플 및 분석물의 혼합 및 그 이후의 반응(예컨대, 증폭) 과정을 도시한다. 샘플 및 시약을 혼합하기 위하여, 인터페이스 밸브(530)는 나타낸 바와 같이 개방된 위치에 놓여진다. 차단 밸브(540)의 폐쇄는 연결 유체 라인을 따라서 샘플 및 분석물 챔버에서 반응 생성물을 봉한다. 도 9b에 도시된 바와 같이, 분리 밸브(840)는 폐쇄되어 샘플 주입 라인과 로딩 볼(830) 사이의 유체 흐름을 방지한다. 개방 또는 폐쇄된 위치에 놓인 밸브(840)의 작동은 일부 실시 형태에서는 압력 어큐뮬레이터(미도시)를 사용하여 실행되고 다른 실시 형태에서는 다른 작동 기술, 예를 들어 기계, 정전기, 전기 기계, 열역학, 압전 등의 기술을 사용하여 실행된다. 이러한 추가적인 기술은 또한 본원에 기재된 다른 밸브에도 적용가능할 수 있다. 당업자는 많은 변형, 변경 및 대체를 인식할 것이다.
도 9b는 단일 이미지를 사용하여 혼합 및 반응을 도시하지만, 당업자는 다수의 열순환이 PCR 과정을 사용하여 DNA를 증폭하는데 사용될 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 이러한 단순한 도면은 미세유체 장치에서 일어날 수 있는 혼합 및 이후의 반응을 나타내는 것으로 의도된다.
도 9c는 반응 생성물 수확 과정의 제1 단계에서 미세유체 장치의 일부분을 도시한다. 수확 시약은 도 5a에 도시된 바와 같이 수확 포트에서 수확 시약 주입 라인(810)을 통하여 샘플 챔버로 흐른다. 도 9a에 나타낸 바와 같이, 밸브(820)는 개방되어 수확 시약이 최상부 샘플 챔버 내로 흐르게 한다. 인터페이스 밸브(530)의 폐쇄는 수확 시약이 또한 반응 생성물도 포함하는 분석물 챔버 내로 흐르는 것을 막는다. 수확 시약이 초기에 샘플 주입 라인 및 샘플 주입 챔버를 충전하는 정도는 밸브(822)의 폐쇄에 의해 제한된다. 도시된 바와 같이, 수확 시약은 제1 샘플 챔버의 일부분을 단지 부분적으로 충전한다. 샘플 챔버 내로 수확 시약의 흐름은 실제로 도면의 평면에서 확장되는 비아를 통하는 것이므로, 수확 시약으로 충전하는 샘플 챔버의 일면의 도시는 단지 예로서 제공된 것이다. 다른 실시 형태는 원한다면 수확 시약이 로딩 볼 내로 흐르는 것을 가능하게 할 수 있지만, 분리 밸브(840)의 폐쇄는 수확 시약이 로딩 볼 내로 흐르는 것을 방지한다.
미세유체 장치의 배열 부분 내로의 수확 시약 흐름으로 생성된 유체 압력은 밸브(822) 위로 샘플 주입 라인 및 샘플 챔버를 확장시킨다. 펌프 사이클은 샘플 챔버의 이러한 여압(pressurization)으로 개시된다. 하기에 기재된 바와 같이, 밸브(820)의 폐쇄 및 밸브(822)의 개방은, 가압된 수확 시약 및 반응 생성물이 미세유체 장치를 통하여 흐르는 동안 가압된 수확 시약 및 반응 생성물이 미세유체 장치에서 회수될 수 있게 할 것이다.
도 9d는 반응 생성물 수확 과정의 제2 단계에서 미세유체 장치의 일부분을 도시한다. 제2 단계는 도시되지만, 이는 제2 단계가 제1 단계 후에 즉시 일어남을 의미하는 것으로 의도되지 않는다. 하기에 기재된 바와 같이, 제2 단계는 통상적으로 확장 펌핑의 하나 이상 중간 단계로 제1 단계와 분리된다.
확장 펌핑(부피 용량(volumetric capacitive) 펌핑이라고도 알려짐)은 미세유체 장치의 모든 구성 요소를 통하여 정확하고, 낮은 속도, 낮은 부피 펌핑을 얻도록 적절하게 구성된 집적 유체 회로(integrated fluidic circuit)(미세유체 장치)를 작동하는 방법이다. 확장 펌핑은 엘라스토머 물질로 형성된 하나 이상의 채널 벽을 가지는 채널을 사용하는 미세유체 회로에 특유한 것이다. 예로서, 샘플 주입 라인 및 샘플 챔버를 통한 수확 시약의 흐름은 부피 용량 펌핑으로 간주된다. 펌핑은 밸브(822)의 폐쇄 및 밸브(820)의 개방으로 진행된다. 상기 논의된 바와 같이, 수확 시약 포트(도시되지 않음)는 가압되어, 채널로서 간주될 수 있는 최상부 샘플 주입 라인 및 샘플 챔버 내로 수확 시약을 도입한다. 엘라스토머 물질로 형성된 적어도 하나의 채널을 가진 미세유체 채널의 여압은, 영계수(Young's modulus), 및 채널의 길이와 단면적과 같은 엘라스토머 채널 벽 물질의 탄성 특성을 가지는 채널 내에서 유체 압력(또는 대안적인 실시 형태에서 기체 압력)에 비례하여 채널 부피가 증가하면서 채널에서 바깥으로 엘라스토머 벽(들)을 확장시킨다. 샘플 주입 라인 및 샘플 챔버는 가압될 수 있고, 그 다음 밸브(820)는 도 9d에 도시된 바와 같이 폐쇄된다. 밸브(820)의 폐쇄 후에, 밸브(822)는 개방된다. 압력이 방출되고 확장된 엘라스토머 채널 벽(들)이 이완할 수 있을 때 채널의 원래 부피를 압력에서 뺄 때 샘플 주입 라인 및 샘플 챔버를 통하여 펌핑된 부피는 채널의 확장된 부피와 동일하다. 확장 펌핑은 폐쇄(822), 개방(820), 샘플 주입 라인 및 샘플 챔버의 가압, 폐쇄(820), 및 개방(822)의 반복적인 사이클을 통하여 계속된다. 이러한 방식으로, 계속적인 또는 비연속적인 낮은 부피의 펌핑은 정확하게 조절된 유속에서 이루어질 수 있다.
이와 같이 실시 형태는 샘플 챔버 및 샘플 주입 포트(즉, 밸브(822)) 사이에 배치된 제1 밸브를 폐쇄하는 단계, 수확 포트 및 샘플 챔버(즉, 밸브(820)) 사이에 배치된 제2 밸브를 개방하는 단계, 제2 밸브를 폐쇄하는 단계, 제1 밸브를 개방하는 단계, 및 이러한 단계를 소정 횟수로 반복하는 단계를 포함하는 확장 펌핑의 방법을 제공한다. 제2 밸브를 개방하는 단계와 제2 밸브를 폐쇄하는 단계 사이에, 수확 시약이 샘플 주입 라인 및 샘플 챔버 내로 흘러, 상기 기재된 바와 같이 채널을 가압한다. 확장 펌핑 과정이 완료한 후, 수확 시약은 실질적으로 샘플 주입 라인 및 샘플 챔버를 충전하고(예컨대, 회수율 > 95%), 그렇게 함으로써 주어진 샘플이 초기에 분배되었던 샘플 주입 포트에서 주어진 샘플과 연관된 반응 생성물을 모은다.
확장 펌핑은 종래의 기술을 이용하여 통상적으로 이용가능하지 않은 이점을 제공한다. 예를 들어, 확장 펌핑은 미세유체 장치에서 반응 생성물의 느린 제거를 가능하게 한다. 예시적인 실시 형태에서, 반응 생성물은 시간당 100μl 미만의 유체 유속으로 회수된다. 이러한 예에서, 각각의 반응 생성물의 부피가 약 1.5μl이고, 약 30분의 기간동안 반응 생성물이 제거되는, 각각의 컬럼에서 반응 챔버 중에 분배된 48개의 반응 생성물은 유속이 72μl/hr(즉, 48 * 1.5 / 0.5시간)이 될 것이다. 다른 실시 형태에서, 반응 생성물의 제거 속도는 90μl/hr 미만, 80μl/hr, 70μl/hr, 60μl/hr, 50μl/hr, 40μl/hr, 30μl/hr, 20μl/hr, 10μl/hr, 9μl/hr, 8μl/hr 미만, 7μl/hr 미만, 6μl/hr 미만, 5μl/hr 미만, 4μl/hr 미만, 3μl/hr 미만, 2μl/hr 미만, 1μl/hr 미만, 또는 0.5μl/hr 미만의 속도로 실행된다.
확장 펌핑은 미세유체 장치에 존재하는 반응 생성물을 실질적으로 높은 백분율로 그리고 잠재적으로 모든 반응 생성물을 제거한다. 일부 실시 형태는 미세유체 장치의 반응 챔버(예컨대, 샘플 챔버)에 존재하는 반응 생성물의 75% 초과를 제거한다. 예로서, 일부 실시 형태는 반응 챔버에 존재하는 반응 생성물의 80%, 85%, 90%, 92 %, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 초과를 제거한다.
일부 실시 형태에서, 수확 밸브는 미세유체 장치에 제공되어 장치를 통한 수확 시약의 흐름을 방해한다. 수확 주입 포트에 압력 공급원의 적용은 수확 시약 주입 라인을 통하여 수확 밸브까지 수확 유체(예컨대, 수확 액체)를 흐르게 한다. 미세유체 장치를 제작하는데 사용되는 물질의 투과성은 이러한 수확 유체가 수확 시약 주입 라인을 충전할 수 있게 하여, 통상적으로 상기 라인에 초기에 존재하는 공기를 배출한다. 수확 밸브의 존재는 수확 밸브의 위치에서 수확 시약의 흐름을 방해할 것이다. 수확 밸브의 작동(즉, 개방)은 수확 밸브의 하류에 있는 수확 시약 주입 라인을 통하여 수확 유체가 흐르게 할 것이다. 다른 실시 형태에서, 수확 밸브는 특정 적용에 적절한 하나 이상의 다른 적합한 밸브로 대체된다. 예를 들어, 도 9a 내지 9d에 도시된 실시 형태에서, 밸브(820)는 확장 펌핑 과정이 시작할 때까지 수확 시약의 흐름을 방지하는 역할을 한다.
엘라스토머 물질을 사용한 제작 방법, 및 장치와 이의 성분의 고안을 위한 방법은 과학 문헌 및 특허문헌에 상세히 기재되어 있다. 예컨대, 문헌 [Unger et al. (2000) Science 288:113-116]; 미국 특허 제6,960,437호(미세유체 장치를 사용하는 핵산 증폭(Nucleic acid amplification utilizing microfluidic devices)); 제6,899,137호(미세제작 엘라스토머 밸브 및 펌프 시스템(Microfabricated elastomeric valve and pump systems)); 제6,767,706호(집적 활성 플럭스 미세유체 장치 및 방법(Integrated active flux microfluidic devices and methods)); 제6,752,922호(미세유체 크로마토그래피(Microfluidic chromatography)); 제6,408,878호(미세제작 엘라스토머 밸브 및 펌프 시스템(Microfabricated elastomeric valve and pump systems)); 제6,645,432호(3차원 배열 채널 네트워크를 포함하는 미세유체 시스템(Microfluidic systems including three-dimensionally arrayed channel networks)); 미국 특허출원공개 제2004/0115838호; 제2005/0072946호; 제2005/0000900호; 제2002/0127736호; 제2002/0109114호; 제2004/0115838호; 제2003/0138829호; 제2002/0164816호; 제2002/0127736호; 및 제2002/0109114호; PCT 공개 WO 제2005/084191호; WO 제05/030822A2호; 및 WO 제01/01025호; [Quake & Scherer, 2000, “From micro to nanofabrication with soft materials” Science 290: 1536-40]; [Unger et al., 2000, “Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography” Science 288:113-116]; [Thorsen et al., 2002, “Microfluidic large-scale integration” Science 298:580-584]; [Chou et al., 2000, “Microfabricated Rotary Pump” Biomedical Microdevices 3:323-330]; [Liu et al., 2003, “Solving the “world-to-chip” interface problem with a microfluidic matrix” Analytical Chemistry 75, 4718-23], [Hong et al, 2004, “A nanoliter-scale nucleic acid processor with parallel architecture” Nature Biotechnology 22:435-39]을 참조한다.
본원에 기재된 임의의 실시 형태에 따라서, 샘플을 얻고, 선택적으로 샘플을 사전증폭하며, 선택적으로 사전증폭된 샘플 또는 이의 분취액을 적절한 버퍼, 프라이머, 선택적인 프로브(들), 및 효소(들)를 포함하는 미세유체 장치의 반응 챔버 내로 분배하고, 이들 혼합물을 증폭시키고, 증폭된 표적 핵산의 존재에 대해 분취액에 질의(query)를 표시함으로써 하나 이상의 샘플으로부터 하나 이상의 표적 핵산의 검출 및/또는 정량화는 일반적으로 미세유체 장치에서 실행될 수 있다. 샘플 분취액은 부피가 1피코리터 미만, 또는 다양한 실시 형태에서, 약 1피코리터 내지 약 500나노리터의 범위로, 약 2피코리터 내지 약 50피코리터의 범위로, 약 5피코리터 내지 약 25피코리터의 범위로, 약 100피코리터 내지 약 20나노리터의 범위로, 약 1나노리터 내지 약 20나노리터의 범위로, 및 약 5나노리터 내지 약 15나노리터의 범위일 수 있다. 다양한 실시 형태에서, 샘플 분취액은 증폭 혼합물의 대부분의 부피를 차지한다. 따라서, 증폭 혼합물은 부피가 1피코리터 미만, 또는 다양한 실시 형태에서, 약 2피코리터, 약 5피코리터, 약 7피코리터, 약 10피코리터, 약 15파코리터, 약 20피코리터, 약 25피코리터, 약 50피코리터, 약 100피코리터, 약 250피코리터, 약 500피코리터, 및 약 750피코리터; 또는 약 1나노리터, 약 2나노리터, 약 5나노리터, 약 7나노리터, 약 15나노리터, 약 20나노리터, 약 25나노리터, 약 50나노리터, 약 250나노리터, 및 약 500나노리터 미만일 수 있다. 증폭 혼합물은 또한 임의의 이러한 값으로 한정된 임의의 범위(예컨대, 약 2피코리터 내지 약 50피코리터) 내의 부피를 가질 수 있다.
일정 실시 형태에서, 복합 검출은 개별적인 증폭 혼합물에서, 예컨대 단일 배열에서 분석될 수 있는 샘플 및/또는 표적의 수를 추가로 증가시키는데, 또는 비교 유전체학적 혼성화반응(comparative genomic hybridization, CGH)과 같은 비교 방법을 실행하는데 사용될 수 있는 미세유체 장치의 개별적인 반응 챔버에서 실행된다. 다양한 실시형태에서, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 50, 100, 500, 1000, 5000, 10000 또는 그 이상의 증폭 반응까지 각각의 개별적인 반응 챔버에서 실행된다.
특이적인 실시 형태에서, 분석은 보통 적어도 103의 동적 범위, 보다 종종 적어도 104, 적어도 105, 적어도 106, 적어도 107, 또는 적어도 108의 동적 범위를 가진다.
정량화 실시간 PCR 및 다른 검출 및 정량화 방법
핵산의 검출 및/또는 정량화의 임의의 방법이 증폭 생성물을 검출하는 본 발명에 사용될 수 있다. 하나의 실시 형태에서, PCR(중합효소 연쇄 반응)은 표적 핵산을 증폭하고/증폭하거나 정량화하는데 사용된다. 다른 실시 형태에서, 예컨대, 미국 특허 제7,118,910호(증폭/검출 시스템의 기재를 위하여 전체적으로 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 시스템 및 Invader assays(PE BioSystems)와 같은, 다른 증폭 시스템 또는 검출 시스템이 사용된다. 특정 실시 형태에서, 실시간 정량화 방법이 사용된다. 예를 들어, “정량화 실시간 PCR”방법은 증폭 과정 동안 형성된 증폭 생성물의 양을 측정함으로써 샘플에 존재하는 표적 핵산의 양을 측정하는데 사용될 수 있다.
형광성 뉴클레아제 분석은 본원에 기재된 방법에서 성공적으로 사용될 수 있는 실시간 정량화 방법의 하나의 특정 예이다. 증폭 생성물의 형성을 모니터링하는 이러한 방법은, 자주 “TaqMan® 방법”으로서 문헌에 지칭되어 있는 접근법인 이중 표지 형광성 올리고뉴클레오티드 프로브(dual-labeled fluorogenic oligonucleotide probe)를 사용하여 PCR 생성물 축적의 연속적인 측정을 수반한다. 미국 특허 제5,723,591호; 문헌 [Heid et al., 1996, Real-time quantitative PCR Genome Res. 6:986-94](이들은 각각 형광성 뉴클레아제 분석의 기재를 위하여 전체적으로 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. “TaqMan® 프로브”가 qPCR에 가장 널리 사용되지만, 본 발명은 이러한 프로의 사용에 한정되지 않으며, 임의의 적합한 프로브가 사용될 수 있음을 인식할 것이다.
본 발명에 이용될 수 있는 다른 검출/정량화 방법은 FRET 및 주형 연장 반응(template extension reaction), 분자 비콘 검출(molecular beacon detection), 스콜피온 검출(Scorpion detection), 인베이더 검출(Invader detection), 및 패드락 프로브 검출(padlock probe detection)을 포함한다.
FRET 및 주형 연장 반응은 공여체/수용체 쌍의 하나의 구성원으로 표지된 프라이머 및 공여체/수용체 쌍의 다른 구성원으로 표지된 뉴클레오티드를 사용한다. 주형 의존성 연장 반응(template-dependent extension reaction) 동안에 프라이머 내로 표지된 뉴클레오티드의 포함 이전에, 공여체 및 수용체는 충분히 떨어져서 거리를 두어 에너지 이동이 일어날 수 없다. 그러나, 표지된 뉴클레오티드가 프라이머 내로 포함되고 공간이 충분히 가까워지면, 그 다음 에너지 이동이 일어나고 검출될 수 있다. 이러한 방법은 특히 단일 뉴클레오티드 다형체의 검출에서 단일 염기쌍 연장 반응을 수행하는데 유용하며 미국 특허 제5,945,283호 및 PCT 공개 WO 제97/22719호에 기재되어 있다.
분자 비콘을 이용하여, 증폭된 생성물의 상보적인 부분에 혼성화하면서 프로브의 형태에서의 변화는 검출가능한 신호를 생성한다. 프로브 자체는 2 부분, 즉 5' 말단에 하나의 부분, 3' 말단에 다른 부분을 포함한다. 이러한 부분은 프로브 결합 부위에 어닐링하는 프로브의 부분의 측면에 위치하고 서로 상보적이다. 하나의 말단 부분은 통상적으로 리포터 염료에 부착되고 다른 말단 부분은 보통 소광제 염료에 부착된다. 용액에서, 2개의 말단 부분은 서로 혼성화하여 헤어핀 루프(hairpin loop)를 형성할 수 있다. 이러한 형태에서, 리포터 염료 및 소광제 염료는 충분히 아주 근접하게 있어 리포터 염료로부터의 형광이 소광제 염료에 의해 효과적으로 소광된다. 반대로, 혼성화된 프로브는 소광 정도가 감소되는 선형화된 형태로 된다. 따라서, 2개의 염료에 대한 방출 변화를 모니터리함으로써, 증폭 생성물의 형성을 간접적으로 모니터링하는 것이 가능하다. 이러한 유형의 프로브 및 이의 사용 방법은, 예를 들어 문헌 [Piatek et al., 1998, Nat. Biotechnol. 16:359-63]; [Tyagi, 및 Kramer, 1996, Nat. Biotechnology 14:303-308]; 및 [Tyagi, et al., 1998, Nat. Biotechnol. 16:49-53 (1998)]에 추가적으로 기재되어 있다.
스콜피온 검출 방법은, 예를 들어 문헌 [Thelwell et al. 2000, Nucleic Acids Research, 28:3752-3761] 및 [Solinas et al., 2001, “Duplex Scorpion primers in SNP analysis and FRET applications” Nucleic Acids Research29:20]에 기재되어 있다. 스콜피온 프라이머는 PCR 스토퍼(PCR stopper)를 통하여 5' 말단에 부착되는 프로브 요소를 가지는 형광성 PCR 프라이머이다. 스콜피온 프라이머는 균질 용액에서 PCR 생성물의 실시간 앰플리콘 특이적 검출에 사용된다. 2가지의 상이한 포맷, 즉 “스템 루프(stem-loop)” 포맷 및 “이중 나선(duplex)” 포맷이 가능하다. 두가지 경우 모두에서, 탐침 메커니즘은 분자 내이다. 모든 포맷에서 스콜피온의 기본 요소는 (i) PCR 프라이머; (ii) 프로브 요소의 PCR 통독(read-through)을 방지하는 PCR 스토퍼; (iii) 특이적인 프로브 서열; 및 (iv) 적어도 하나의 형광단 및 소광제를 포함하는 형광 검출 시스템이다. 스콜피온 프라이머의 PCR 연장 후, 생성되는 앰플리콘은 프로브에 상보적인 서열을 포함하며, 이는 각각의 PCR 사이클의 변성 단계 동안에 단일 가닥으로 된다. 냉각 동안, 소광제가 더 이상 형광단의 부근에 없을 때, 프로브는 이러한 상보적인 서열에 자유롭게 결합하여, 형광이 증가하게 한다. PCR 스토퍼는 Taq DNA 중합효소에 의한 프로브의 원하지 않는 통독을 방지한다.
인베이더 분석(Third Wave Technologies, Madison, WI)은 특히 SNP 유전자형분석(SNP genotyping)에 사용되고, 표적 핵산(DNA 또는 RNA) 또는 다형체 부위에 상보적인, 신호 프로브로 지정된 올리고뉴클레오티드를 사용한다. Invader Oligo로 지정된 제2 올리고뉴클레오티드는 동일한 5' 뉴클레오티드 서열을 포함하지만, 3' 뉴클레오티드 서열은 뉴클레오티드 다형체를 포함한다. Invader Oligo는 표적 핵산으로의 신호 프로브 결합을 방해하여 신호 프로브의 5' 말단은 다형체를 포함하는 뉴클레오티드에서 “플랩(flap)”을 형성한다. 이러한 복합체는 Cleavase 효소라고 불리는 구조 특이적 엔도뉴클레아제로 인식된다. Cleavase는 뉴클레오티드의 5' 플랩을 절단한다. 방출된 플랩은 FRET 표지를 가지는 제3 프로브와 결합하여, Cleavase 효소로 인식되는 다른 이중 나선 구조를 형성한다. 이 때, Cleavase 효소는 소광제에서 형광단을 절단하고 형광 신호를 생성한다. SNP 유전자형분석에 대하여, 신호 프로브는 참조(야생형) 대립유전자 또는 변형(돌연변이) 대립유전자와 혼성화되도록 고안될 것이다. PCR과 달리, 핵산의 증폭이 없는 신호의 선형 증폭이 있다. 또한, 당업자에게 안내하기에 충분한 상세 내용이 예를 들어 문헌 [Neri, B.P., et al., Advances in Nucleic Acid and Protein Analysis 3826:117-125, 2000] 및 미국 특허 제6,706,471호에 의해 제공된다.
패드락 프로브(PLP)는 긴(예컨대, 약 100개의 염기) 선형 올리고뉴클레오티드이다. 프로브의 3' 및 5' 말단에서의 서열은 표적 핵산에서 인접한 서열에 상보적이다. PLP의 중심 비상보적인 부분에, 특이적인 PLP를 식별하는데 사용될 수 있는 “태그” 서열이 있다. 태그 서열은 보편적인 시작 부위(priming site)의 측면에 위치하며, 태그의 PCR 증폭을 가능하게 한다. 표적에 혼성화시, PLP 올리고뉴클레오티드의 2개의 말단은 매우 근접하게 되어 효소 결찰로 연결될 수 있다. 생성된 생성물은 표적 DNA 가닥에 연쇄되는 원형 프로브 분자이다. 임의의 결찰되지 않은 프로브(즉, 표적과 혼성화하지 않은 프로브)는 엑소뉴클레아제의 작용으로 제거된다. PLP의 혼성화 및 결찰은 양쪽 말단 부분이 표적 서열을 인식하는 것을 필요로 한다. 이러한 방식으로, PLP는 극도로 특이적인 표적 인식을 제공한다.
그 다음 원형화된 PLP의 태그 부위는 증폭되고 생성된 앰플리콘은 검출될 수 있다. 예를 들어, TaqMan® 실시간 PCR을 실행하여 앰플리콘을 검출하고 정량화할 수 있다. 앰플리콘의 존재 및 양은 샘플에서 표적 서열의 존재 및 양과 연관될 수 있다. PLP의 기재에 대하여, 예컨대 문헌 [Landegren et al., 2003, Padlock and proximity probes for in situ and array-based analyses: tools for the post-genomic era, Comparative and Functional Genomics 4:525-30]; [Nilsson et al., 2006, Analyzing genes using closing and replicating circles Trends Biotechnol. 24:83-8]; [Nilsson et al., 1994, Padlock probes: circularizing oligonucleotides for localized DNA detection, Science 265:2085-8]을 참조한다.
특정 실시 형태에서, 프로브에 대하여 검출가능한 표지로서 사용될 수 있는 형광단은 이로 한정되지 않지만, 로다민, 시아닌 3(Cy 3), 시아닌 5(Cy 5), 플루오레세인, Vic™, Liz™., Tamra™, 5-Fam™, 6-Fam™, 및 Texas Red(Molecular Probes)를 포함한다(Vic™, Liz™, Tamra™, 5-Fam™, 6-Fam™은 모두 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 Applied Biosystems에서 입수가능함).
형광 지시자(indicator)를 포함하는 조성물을 이용하여 열순환 반응을 실행하고 특정 파장의 광속(light beam)을 발하며, 형광 염료의 강도를 판독하고, 각각의 사이클 후에 형광 강도를 나타낼 수 있는 장치가 개발되었다. 열순환기, 광속 방사체(light beam emitter) 및 형광 신호 검출기를 포함하는 장치는 예컨대 미국 특허 제5,928,907호, 제6,015,674호 및 제6,174,670호에 기재되어 있다.
일부 실시 형태에서, 각각의 이러한 기능은 별도의 장치로 실행될 수 있다. 예를 들어, 증폭을 위한 Q-베타 레플리카제 반응을 이용한다면, 반응은 열순환기에서 일어날 수 없으나, 특정 파장에서 발하는 광속, 형광 신호의 검출, 및 증폭 생성물의 양의 계산 및 표시를 포함할 수 있다.
특정 실시 형태에서, 결합된 열순환 및 형광 검출 장치는 표적 핵산의 정확한 정량화에 사용될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 형광 신호는 하나 이상의 열순환 동안 및/후에 검출되거나 표시되어, 따라서 반응이 “실시간”으로 일어나는 동안 증폭 생성물의 모니터링을 허용할 수 있다. 일정 실시 형태에서, 증폭 전에 샘플에 얼마나 많은 표적 핵산 서열이 있는지를 계산하는데 증폭 생성물의 양 및 증폭 사이클의 수를 사용할 수 있다.
일부 실시 형태에 따라서, 샘플에서 표적 핵산 서열의 존재를 나타내기에 충분한 예정된 수의 사이클 후에 증폭 생성물의 양을 단순히 모니터링할 수 있다. 당업자는 주어진 샘플 유형, 프라이머 서열, 및 반응 조건에 대하여, 얼마나 많은 사이클이 주어진 표적 핵산의 존재를 결정하기에 충분한지 용이하게 결정할 수 있다.
일정 실시 형태에 따라서, 형광 신호로 지시되는 증폭 생성물을 정량화하는 내부 표준을 이용할 수 있다. 예컨대, 미국 특허 제5,736,333호를 참조한다.
다양한 실시 형태에서, 사전증폭을 이용하면 사전증폭 사이클의 수는 표적 뉴클레오티드 서열에 하나 이상의 뉴클레오티드 태그를 첨가하는데 충분하므로 태깅된 표적 뉴클레오티드 서열의 상대적인 복제 수는 샘플에서 표적 핵산의 상대적인 복제 수의 실질적으로 나타낸다. 예를 들어, 사전증폭은 샘플 특이적 또는 세트 특이적 뉴클레오티드 태그를 도입하기 위하여 2~20사이클 동안 수행될 수 있다. 다른 실시 형태에서, 검출은 기하급수적인 증폭의 끝, 즉 “안정기(plateau)” 상태 동안에 실행되고, 또는 종말점 PCR이 실행된다. 이 예에서, 사전증폭은 표적 및 샘플에 대하여 앰플리콘 복제 수를 표준화할 것이다. 다양한 실시 형태에서, 사전증폭 및/또는 증폭은 약 2, 4, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40사이클 동안 또는 임의의 이러한 값으로 한정된 임의의 범위 내에 들어가는 사이클 수 동안 실행될 수 있다.
표지화 전략
임의의 적합한 표지화 전략이 본 발명의 방법에서 이용될 수 있다. 분석물 혼합물이 분취될 경우, 각각의 분취액은 단일 증폭 생성물의 존재에 대하여 분석되고, 보편적인 검출 프로브는 증폭 혼합물에서 이용될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 실시간 PCR 검출은 보편적인 qPCR 프로브를 사용하여 실행될 수 있다. 적합한 보편적 qPCR 프로브는 SYBR Green, Pico Green(Molecular Probes, Inc., Eugene, OR), Eva Green(Biotinum), 에티디움브로마이드 등(문헌 [Zhu et al., 1994, Anal. Chem. 66:1941-48]을 참조)과 같은 이중 가닥 DNA 염료를 포함한다. 적합한 보편적 qPCR 프로브는 또한 모든 증폭 생성물에 존재하는 뉴클레오티드 서열에 결합하는 서열 특이적 프로브를 포함한다. 이러한 프로브에 대한 결합 부위는 증폭 동안 태그된 표적 핵산 내로 편리하게 도입될 수 있다.
대안적으로, 하나 이상의 표적 특이적 qPCR 프로브(즉, 검출되는 표적 뉴클레오티드 서열에 대하여 특이적임)는 증폭 혼합물에 이용되어 증폭 생성물을 검출한다. 표적 특이적 프로브는 예컨대 오직 소수의 표적 핵산이 다수의 샘플에서 검출될 때, 유용할 수 있다. 예를 들어, 오직 3개의 표적이 검출된다면, 각각의 표적에 대하여 상이한 형광 표지를 가지는 표적 특이적 프로브가 이용될 수 있다. 표지의 신중한 선택으로, 상이한 표지가 단일 반응에서의 상이한 파장에서 여기 및/또는 검출되어 분석이 수행될 수 있다. 예컨대, 문헌 [Fluorescence Spectroscopy (Pesce et al., Eds.) Marcel Dekker, New York, (1971)]; [White et al., Fluorescence Analysis: A Practical Approach, Marcel Dekker, New York, (1970)]; [Berlman, Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, 2nd ed., Academic Press, New York, (1971)]; [Griffiths, Colour and Constitution of Organic Molecules, Academic Press, New York, (1976)]; [Indicators (Bishop, Ed.). Pergamon Press, Oxford, 19723]; 및 [Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Eugene (1992)]을 참조한다.
원하지 않는 반응 성분의 제거
많은 반응 단계가 이용되는 핵산의 복합체 혼합물을 수반하는 반응은 다양한 비포함 반응 성분을 야기할 수 있고, 임의의 다양한 정화(clean-up) 절차에 의하여 이러한 비포함 반응 성분의 제거, 또는 농도의 감소는 이후에 일어나는 반응의 효율성 및 특이성을 개선시킬 수 있음이 인식될 것이다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서 본원에 기재된 증폭 단계를 실행하기 전에 사전증폭 프라이머의 농도를 제거하거나 또는 감소하는 것이 바람직할 수 있다.
일정 실시 형태에서, 원하지 않는 성분의 농도는 단순 희석으로 감소될 수 있다. 예를 들어, 사전증폭된 샘플은 이후 증폭 단계의 특이성을 개선시키는 증폭 이전에 약 2배, 5배, 10배, 50배, 100배, 500배, 1000배로 희석될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 원하지 않는 성분은 다양한 효소 수단으로 제거될 수 있다. 대안적으로, 또는 상기 기재된 방법에 추가적으로, 원하지 않는 성분은 정제로 제거될 수 있다. 예를 들어, 정제 태그는 임의의 상기 기재된 프라이머 내로(예컨대, 바코드 뉴클레오티드 서열 내로) 포함되어 태그된 표적 뉴클레오티드의 정제를 용이하게 할 수 있다.
특정 실시 형태에서, 정화는 원하는 핵산의 선택적인 고정화를 포함한다. 예를 들어, 원하는 핵산은 고체 지지체 상에 차별적으로 고정화될 수 있다. 예시적인 실시 형태에서, 비오틴(예컨대, 포토비오틴(photo-biotin))과 같은 친화성 모이어티(affinity moiety)가 원하는 핵산에 부착되고, 고체 지지체 상에 고정화된 생성된 비오틴 표지된 핵산은 스트렙타비딘과 같은 친화성 모이어티-바인더(affinity moiety-binder)를 포함할 수 있다. 고정화된 핵산은 프로브로 의문을 표시할 수 있고, 비혼성화 및/또는 비결찰된 프로브는 세척으로 제거될 수 있다(예컨대, 공개된 PCT 출원 WO 제03/00667호 및 USSN 제09/931,285호를 참조). 대안적으로, 고정화된 핵산은 세척되어 다른 성분을 제거할 수 있고 그 다음에 추가 분석을 위하여 고체 지지체로부터 방출될 수 있다. 이러한 접근법은, 예를 들어 DNA 염기서열분석을 위한 프라이머 결합 부위의 첨가 후에 증폭 혼합물로부터 표적 앰플리콘을 회수하는 것에 사용될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 증폭이 친화성 모이어티 표지된(예컨대, 비오틴 표지) 앰플리콘을 생성하도록, 비오틴과 같은 친화성 모이어티는 증폭 프라이머에 부착될 수 있다. 따라서, 예를 들어 3개의 프라이머가 이용되어 표적 뉴클레오티드 서열에 바코드 및 뉴클레오티드 태그 요소를 첨가할 경우, 상기 기재된 바와 같이 적어도 하나의 바코드 또는 역방향 프라이머(reverse primer)는 친화성 모이어티를 포함할 수 있다. 4개의 프라이머(2개의 내부 프라이머 및 2개의 외부 프라이머)가 이용되어 표적 뉴클레오티드 서열에 원하는 요소를 첨가할 경우, 적어도 하나의 외부 프라이머는 친화성 모이어티를 포함할 수 있다.
데이터 출력 및 분석
일정 실시 형태에서, 본 발명의 방법이 매트릭스 유형 미세유체 장치에서 실행될 때, 데이터는 열 매트릭스(또한 “히트맵(heat map)”으로 지칭됨)로서 산출될 수 있다. 열 매트릭스에서, DA 매트릭스 상에 반응 챔버를 나타내는 각각의 사각형은 그레이스케일로 나타낼 수 있지만, 보다 통상적으로 색깔로 나타내어지는, 색깔 값을 할당하였다. 그레이스케일에서, 검정 사각형은 어떠한 증폭 생성물도 검출되지 않았음을 나타내지만, 반면에 흰색 사각형은 증폭 생성물의 가장 높은 수준을 나타내고, 회색 음영은 그 사이의 증폭 생성물의 수준을 나타낸다. 추가적인 측면에서, 소프트웨어 프로그램은 열 매트릭스에서 생성되는 데이터를 판독기가 보다 사용하기 편한 포맷으로 컴파일링하는데 사용될 수 있다.
적용
본 발명의 방법은 핵산 샘플에서 하나 이상의 표적 핵산의 존재 또는 양을 검출하는 것을 목표로 하는 임의의 기술에 적용가능하다. 따라서, 예를 들어, 이러한 방법은 특정 다형체(예를 들어, SNP), 대립유전자, 단상형, 또는 예를 들어 증폭, 결실 또는 염색체 이수성과 같은 염색체 이상의 존재를 식별하는데 적용가능하다. 상기 방법은 유전자형분석에 이용될 수 있으며, 이는 유전적 질병 또는 장애의 진단, 약물유전체학(맞춤 약학), 농업에서의 품질 조절(예컨대, 종자 또는 가축에 대하여), 식물 또는 동물의 개체수의 연구 및 관리(예컨대, 양식업 또는 어업 관리 또는 개체수 다양성의 측정에서), 또는 친자(paternity) 또는 법과학적(forensic) 식별을 포함한 다수의 상황에서 실행될 수 있다. 본 발명의 방법은 생물학적 또는 환경 샘플에서 특정 병태 또는 생물체를 나타내는 서열의 식별에 적용될 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 예를 들어 바이러스, 박테리아, 및 균류와 같은 병원체를 식별하는 분석에서 사용될 수 있다. 상기 방법은 또한 환경 또는 미세환경을 특성화하는 것, 예컨대 인간 내장에서의 미생물종을 특성화하는 것을 목표로 하는 연구에서 사용될 수 있다.
이러한 방법은 또한 DNA 또는 RNA 복제 수의 측정에 이용될 수 있다. 유전체 DNA에서 비정상적인 DNA 복제 수의 측정은 예를 들어 유전적 결함 및 암과 같은 질병의 진단 및/또는 예후에서 유용하다. RNA “복제 수”, 즉 발현 수준의 측정은, 예컨대 상이한 조건(예컨대, 상이한 외부 자극 또는 질병 상태) 하에서 및/또는 상이한 발전 단계에서 상이한 개체, 조직, 또는 세포에서 관심의 유전자의 발현 모니터링에 유용하다.
추가적으로, 상기 방법은 추가적인 분석, 예컨대 DNA 염기서열분석과 같은 핵산 샘플을 제조하는데 이용될 수 있다.
최종적으로, 핵산 샘플은 이후의 분석 전에 제1 단계로서 태깅되어 샘플의 잘못된 표지화 또는 교차오염이 결과를 나쁘게 할 위험성을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 의사 사무실, 실험실, 또는 병원은 수집 후에 즉시 샘플을 태그할 수 있고, 태그는 분석시에 확인될 수 있다. 유사하게, 범죄 현장에서 수집된 핵산을 포함하는 샘플은 실행가능 하자마자 태깅되어 샘플이 태그로 잘못된 표지화 또는 간섭될 수 없음을 보장할 수 있다. 하나의 집단에서 다른 집단으로 샘플을 각각 이동할 시 태그의 검출은 샘플의 관리 연속성을 수립하는데 사용될 수 있다.
키트
본 발명에 따른 키트는 본 발명의 하나 이상의 분석 방법을 실행하는데 유용한 하나 이상의 시약을 포함한다. 키트는 하나 이상의 별도의 조성물로서, 또는 선택적으로 시약의 호환성이 가능할 경우 혼합물로서, 일반적으로 시약(들)(예컨대, 프라이머 및/또는 프로브(들))을 수용하는 하나 이상의 용기를 가지는 패키지를 포함한다. 키트는 또한 예를 들어 버퍼(들), 희석제(들), 표준(들), 및/또는 샘플 처리, 세척 또는 분석의 임의의 다른 단계를 수행하는데 유용한 임의의 다른 물질과 같은 사용자 견지에서 바람직할 수 있는 다른 물질(들)을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 키트는 일반적으로 본 발명의 하나 이상의 방법을 실행하기 위한 지침을 포함한다. 본 발명의 키트에 포함된 지침은 포장재에 부착될 수 있고 또는 패키지 삽입물로서 포함될 수 있다. 지침은 통상적으로 필기 또는 인쇄된 문헌이지만, 이로 한정되지 않는다. 이러한 지침을 저장할 수 있고 최종 수요자에게 지침을 전달할 수 있는 임의의 매체가 본 발명에 의하여 고려된다. 이러한 매체는 이로 한정되지 않지만 전자 저장 매체(예컨대, 자기 디스크, 테이프, 카트리지, 칩), 광학 매체(예컨대, CD ROM), RF 태그 등을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 “지침”은 지침을 제공하는 인터넷 사이트의 주소를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 실시예 및 실시 형태는 예시적인 목적만을 위해서이고 이를 고려하여 다양한 변경 또는 변형이 당업자에게 제안될 것이며 이는 본 출원의 정신 및 영역 및 첨부된 청구항의 범위 내에 포함됨이 이해된다.
추가적으로, 본원에 인용된 모든 다른 간행물, 특허 및 특허 출원은 모든 목적을 위하여 전체적으로 본원에 참조로 포함된다.
실시예
실시예 1
DNA 염기서열분석을 위한 제조에서 표적 핵산의 바코딩을 위한 멀티 프라이머 증폭 방법
유전체 DNA 샘플(BioChain, USA)을 100ng/ml 및 0ng/ml(음성 대조 [“NTC”])로 프라이머 당 200nM로 다음의 프라이머 쌍을 가지는 7900HT Fast Real-Time PCR System(Applied Biosystems, USA)에서 25 사이클 동안 증폭하였다: 1) 454개 테일(tail); 2) A5 특이적 프라이머; 및 3) 도 10에 나타낸 3개의 프라이머. PCR은 FastStart TaqMan® Probe Master(Roche Diagnostics, USA) 7.5μl를 포함하는 15μl 반응 부피, DA 샘플 로딩 시약(Fluidigm Corp, USA) 0.75μl 및 샘플 6.75μl에서 실행되었다. 열순환 조건은 50℃에서 2분 동안 그리고 94℃에서 10분 동안의 초기 핫스타트(hot start), 그 후 94℃에서 15초 동안, 70℃에서 5초 동안, 60℃에서 30초 동안 그리고 72℃에서 90초 동안으로 25사이클을 포함하였다. 생성된 증폭 생성물은 레인당 8μl의 반응 혼합물을 사용하고 제조자 지침에 따라서 전기영동겔(Invitrogen, USA)에서 실행되었다. 3개 프라이머 방법이 수집 크기의 앰플리콘을 생성한 것을 나타내는 도 11을 참조한다. PCR 증폭에서 생성된 앰플리콘은 Ampure Beads®를 사용하여 정제하였고, 그 다음 454개 테일 프라이머(tail primer)를 이용하여 PCR 플레이트에서 재증폭하였으며, 그 후 어느 하나의 454개 테일 프라이머를 이용하여 Sanger 염기서열분석을 하였고, 이는 3개 프라이머 방법이 올바른 서열을 가지는 앰플리콘을 생성하였음을 나타내었다.
실시예 2
DNA 염기서열분석을 위한 제조에서 표적 핵산의 정량화를 위한 멀티 프라이머 증폭 방법
다양한 DNA를 종래의 DNA 염기서열분석 방법을 사용하여 염기서열분석을 위한 유전체 DNA를 제조하는 프라이머는 하기와 같다:
ShotGun 정방향: 5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTC-3' (서열번호 1)
ShotGun 역방향: 5'-CCTATCCCCTGTGTGCCTTG-3' (서열번호 2)
ShotGun UPR 정방향: 5'-GGCGGCGACCATCTCATCCCTGCGTGTC-3' (서열번호 3)
MID 정방향: 5'-GCCTCCCTCGCGCCATCAG-3' (서열번호 4)
MID 역방향: 5'-GCCTTGCCAGCCCGCTCAG-3' (서열번호 5)
MID UPR 정방향: 5'-GGCGGCGAGCCTCCCTCGCGCCATCAG-3' (서열번호 6)
Solexa 정방향: 5'-ACACTCTTTCCCTACACGA-3' (서열번호 7)
Solexa 역방향: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATA-3' (서열번호 8)
Solexa UPR 정방향: 5'-GGCGGCGAACACTCTTTCCCTACACGA-3' (서열번호 9)
Solid 정방향: 5'-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATG-3' (서열번호 10)
Solid 역방향: 5'-CTGCCCCGGGTTCCTCATTCT-3' (서열번호 11)
Solid UPR 정방향: 5'-GGCGGCGACCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATG-3' (서열번호 12)
454 티타늄 정방향: 5'-CCATCTCATCCCTGCGTG-3' (서열번호 13)
454 티타늄 역방향: 5'-CCTATCCCCTGTGTGCCTTG-3' (서열번호 14)
454 티타늄 UPR 정방향: 5'-GGCGGCGACCATCTCATCCCTGCGTG-3' (서열번호 15)
Solexa smRNA 정방향: 5'-TAATGATACGGCGACCACC-3' (서열번호 16)
Solexa smRNA 역방향: 5'-ACAAGCAGAAGACGGCATAC-3' (서열번호 17)
Solexa smRNA UPL 정방향: 5'-GGCGGCGATAATGATACGGCGACCAC-3' (서열번호 18)
이들 프라이머의 특성은 하기 표 1에 나타내었다.
454 표준 (ShotGun) 프라이머 길이(nt) CG% Tm(℃) 프라이머-다이머
　 ShotGun 정방향: 20 60 68.4 셀프/교차(self/cross) 다이머 없음, Tm에서 1.5℃ 차이
　 ShotGun 역방향: 20 60 66.9 　
　 ShotGun UPR 정방향: 28 67.8 84.8 　
454-MID 　 　
　 MID 정방향: 19 73.6 74.9 4개 염기의 셀프 다이머(F.UPL) & 교차 다이머(F./UPL , R/UPL)
　 MID 역방향: 19 73.6 74.9 높은 GC
　 MID UPR 정방향: 27 77.7 88.5 　
Solexa 　 　
　 Solexa 정방향: 19 47.3 57.8 다이머 없음, Tm에서 2.1℃ 차이
　 Solexa 역방향: 18 50 60.6 낮은 GC
　 Solexa UPR 정방향: 27 59.2 78.4 　
Solid 　 　
　 Solid 정방향: 28 57.1 74.7 강한 셀프 다이머 & 교차 다이머
　 Solid 역방향: 21 61.9 72.5 다양한 GC & Tm
　 Solid UPR 정방향: 36 63.8 85.6 　
프라이머 서열을 포함하는 유전체 DNA의 증폭에 사용되는 반응 혼합물은 하기 표 2에 주어져 있다.
건조한 프로브 튜브 내로 Vμl의 TE를 첨가
100μM 원액 V= 건조한 프로브 * 10의 “총 nmol” 값
10X Fluidigm Assay
100μMol
정방향: 4 2000nM
UPR 정방향: 4 2000nM
역방향: 8 4000nM
TE: 184
합계: 200
실시예 3
454 DNA 염기서열분석을 위한 제조에서 표적 핵산의 바코딩을 위한 추가적이고 예시적인 프라이머
하기 표 3 및 4는 454 DNA 염기서열분석을 위한 제조에서 표적 핵산의 바코딩을 위한 추가적이고 예시적인 프라이머를 나타낸다. “454F”는 454 정방향 프라이머 결합 부위를 지칭하고, “454R”은 454 역방향 프라이머 결합 부위를 지칭한다. “BC”는 뉴클레오티드 바코드를 지칭한다. “TAG”는 뉴클레오티드 태그를 지칭한다. “P53”은 표적 특이적 프라이머 서열을 지칭한다.
서열 명칭 서열 서열번호
454F-BC1-TAG8 GCCTCCCTCGCGCCATCAGGCATGCACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 19)
454F-BC2-TAG8 GCCTCCCTCGCGCCATCAGCGTACGACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 20)
454F-BC3-TAG8 GCCTCCCTCGCGCCATCAGGTCAGCACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 21)
454F-BC4-TAG8 GCCTCCCTCGCGCCATCAGAGCTGCACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 22)
454F-BC5-TAG8 GCCTCCCTCGCGCCATCAGTGCATCACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 23)
454F-BC6-TAG8 GCCTCCCTCGCGCCATCAGCTGATGACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 24)
454F-BC7-TAG8 GCCTCCCTCGCGCCATCAGGTAGTCACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 25)
454F-BC8-TAG8 GCCTCCCTCGCGCCATCAGGTCGATACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 26)
454F-BC9-TAG8 GCCTCCCTCGCGCCATCAGGATACGACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 27)
454F-BC10-TAG8 GCCTCCCTCGCGCCATCAGTGATGCACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 28)
454F-BC11-TAG8 GCCTCCCTCGCGCCATCAGAGCTGAACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 29)
454F-BC12-TAG8 GCCTCCCTCGCGCCATCAGACTGTAACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 30)
454F-BC13-TAG8 GCCTCCCTCGCGCCATCAGTGCATGACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 31)
454F-BC14-TAG8 GCCTCCCTCGCGCCATCAGAGTCTAACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 32)
454F-BC15-TAG8 GCCTCCCTCGCGCCATCAGTGTCTGACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 33)
454F-BC16-TAG8 GCCTCCCTCGCGCCATCAGGCTAGCACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 34)
454F-BC17-TAG8 GCCTCCCTCGCGCCATCAGGATAGCACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 35)
454F-BC18-TAG8 GCCTCCCTCGCGCCATCAGGCTACTACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 36)
454F-BC19-TAG8 GCCTCCCTCGCGCCATCAGCTATGCACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 37)
454F-BC20-TAG8 GCCTCCCTCGCGCCATCAGGCTATGACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 38)
454F-BC21-TAG8 GCCTCCCTCGCGCCATCAGCGTGCAACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 39)
454F-BC22-TAG8 GCCTCCCTCGCGCCATCAGATAGCTACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 40)
454F-BC23-TAG8 GCCTCCCTCGCGCCATCAGTGTAGCACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 41)
454F-BC24-TAG8 GCCTCCCTCGCGCCATCAGGTGCTAACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 42)
454F-BC25-TAG8 GCCTCCCTCGCGCCATCAGGTCATGACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 43)
454F-BC26-TAG8 GCCTCCCTCGCGCCATCAGATCGTGACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 44)
454F-BC27-TAG8 GCCTCCCTCGCGCCATCAGTGTACGACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 45)
454F-BC28-TAG8 GCCTCCCTCGCGCCATCAGAGTGTAACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 46)
454F-BC29-TAG8 GCCTCCCTCGCGCCATCAGTGACAGACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 47)
454F-BC30-TAG8 GCCTCCCTCGCGCCATCAGGATCACACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 48)
454F-BC31-TAG8 GCCTCCCTCGCGCCATCAGCTAGAGACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 49)
454F-BC32-TAG8 GCCTCCCTCGCGCCATCAGCTAGTCACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 50)
454F-BC33-TAG8 GCCTCCCTCGCGCCATCAGAGCTAGACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 51)
454F-BC34-TAG8 GCCTCCCTCGCGCCATCAGTGACTGACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 52)
454F-BC35-TAG8 GCCTCCCTCGCGCCATCAGTGATAGACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 53)
454F-BC36-TAG8 GCCTCCCTCGCGCCATCAGCGTATCACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 54)
454F-BC37-TAG8 GCCTCCCTCGCGCCATCAGGTCTGAACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 55)
454F-BC38-TAG8 GCCTCCCTCGCGCCATCAGCATGACACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 56)
454F-BC39-TAG8 GCCTCCCTCGCGCCATCAGCGATGAACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 57)
454F-BC40-TAG8 GCCTCCCTCGCGCCATCAGGCTGATACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 58)
454F-BC41-TAG8 GCCTCCCTCGCGCCATCAGCAGTACACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 59)
454F-BC42-TAG8 GCCTCCCTCGCGCCATCAGGCGACTACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 60)
454F-BC43-TAG8 GCCTCCCTCGCGCCATCAGGTACGAACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 61)
454F-BC44-TAG8 GCCTCCCTCGCGCCATCAGACGCTAACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 62)
454F-BC45-TAG8 GCCTCCCTCGCGCCATCAGAGCATCACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 63)
454F-BC46-TAG8 GCCTCCCTCGCGCCATCAGGATGCTACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 64)
454F-BC47-TAG8 GCCTCCCTCGCGCCATCAGGTCTGCACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 65)
454F-BC48-TAG8 GCCTCCCTCGCGCCATCAGATGCGAACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 66)
서열 명칭 서열 서열번호
TAG8-P53-1+ ACACTGACGACATGGTTCTACAACTGTCCAGCTTTGTGCC (서열번호 67)
TAG8-P53-2+ ACACTGACGACATGGTTCTACAGATCATCATAGGAGTTGCATTGTTG (서열번호 68)
TAG8-P53-3+ ACACTGACGACATGGTTCTACACGGACCTTTGTCCTTCCT (서열번호 69)
TAG8-P53-4+ ACACTGACGACATGGTTCTACAATGCAAACCTCAATCCCTCC (서열번호 70)
TAG8-P53-5+ ACACTGACGACATGGTTCTACAAGTTTCTTCCCATGCACCTG (서열번호 71)
TAG8-P53-6+ ACACTGACGACATGGTTCTACAGTGAATCCCCGTCTCTACTAAAA (서열번호 72)
TAG8-P53-7+ ACACTGACGACATGGTTCTACATGTTTCCCATTTGCGGTTATGA (서열번호 73)
TAG8-P53-8+ ACACTGACGACATGGTTCTACAAGTTGTGGGACTGCTTTATACATT (서열번호74)
454R-P53-1- GCCTTGCCAGCCCGCTCAGTCCTCTGCCTAGGCGTT (서열번호 75)
454R-P53-2- GCCTTGCCAGCCCGCTCAGGAAATGTAAATGTGGAGCCAAACA (서열번호 76)
454R-P53-3- GCCTTGCCAGCCCGCTCAGACTCATTCTTGAAAATACCTCCGG (서열번호 77)
454R-P53-4- GCCTTGCCAGCCCGCTCAGAAATGCCACCTCGATTTAGGAAA (서열번호 78)
454R-P53-5- GCCTTGCCAGCCCGCTCAGTCACCCTCCCGAATAGCT (서열번호 79)
454R-P53-6- GCCTTGCCAGCCCGCTCAGAGTGTAAAATGGTACAACCGCT (서열번호 80)
454R-P53-7- GCCTTGCCAGCCCGCTCAGCCTCTTAAGATACTGTAAACTCTGTAAAGC (서열번호 81)
454R-P53-8- GCCTTGCCAGCCCGCTCAGATTGTGCCATTGTACTCTAGCC (서열번호 82)
TAG8-P53-9+ ACACTGACGACATGGTTCTACACTTCCTTTCTCTACTGAATGCTTTTAATTT (서열번호 83)
TAG8-P53-10+ ACACTGACGACATGGTTCTACATCTTACACAAACTCTTCAGAAAACAGA (서열번호 84)
TAG8-P53-11+ ACACTGACGACATGGTTCTACAGTACCAAAACCAAACAAGGACAT (서열번호 85)
TAG8-P53-12+ ACACTGACGACATGGTTCTACAGGTGAAACGCCATCTCTACTAA (서열번호 86)
TAG8-P53-13+ ACACTGACGACATGGTTCTACATCATGATTGTAGCTGATTCAACATTCA (서열번호 87)
TAG8-P53-14+ ACACTGACGACATGGTTCTACAACTAGCATGCTGAAACCCC (서열번호 88)
TAG8-P53-15+ ACACTGACGACATGGTTCTACATCAGGAGATCGAGACCATCC (서열번호 89)
TAG8-P53-16+ ACACTGACGACATGGTTCTACATCATGCCTGTAATCCCAGC (서열번호 90)
454R-P53-9- GCCTTGCCAGCCCGCTCAGACCTCAAATGATCCCCTGC (서열번호 91)
454R-P53-10- GCCTTGCCAGCCCGCTCAGATTACAGGCGTGAGCCAC (서열번호 92)
454R-P53-11- GCCTTGCCAGCCCGCTCAGTTTTGAGATGAAGTCTTGCTCTGT (서열번호 93)
454R-P53-12- GCCTTGCCAGCCCGCTCAGTAAAGACCAGTCTGACTATGTTGC (서열번호 94)
454R-P53-13- GCCTTGCCAGCCCGCTCAGACCATGCCCGGCTAATTTT (서열번호 95)
454R-P53-14- GCCTTGCCAGCCCGCTCAGAGTTCACGCCATTCTCCTG (서열번호 96)
454R-P53-15- GCCTTGCCAGCCCGCTCAGCACTACGCCCGGCTAATTTT (서열번호 97)
454R-P53-16- GCCTTGCCAGCCCGCTCAGTGGCCCCATTAGGACATGTAT (서열번호 98)
TAG8-P53-17+ ACACTGACGACATGGTTCTACATTGTCCCATTGCACTCCAG (서열번호 99)
TAG8-P53-18+ ACACTGACGACATGGTTCTACATGGGCAACAAGAGTGAAACT (서열번호 100)
TAG8-P53-19+ ACACTGACGACATGGTTCTACAAAATAAATATAGCAGGGTTGCAGGT (서열번호 101)
TAG8-P53-20+ ACACTGACGACATGGTTCTACATGCATTTCTCTTGGCTCCC (서열번호 102)
TAG8-P53-21+ ACACTGACGACATGGTTCTACAACTTTCCTCAACTCTACATTTCCC (서열번호 103)
TAG8-P53-22+ ACACTGACGACATGGTTCTACATCAGTGCAAACAACAGAAAAGTG (서열번호 104)
TAG8-P53-23+ ACACTGACGACATGGTTCTACACATGTTTCTTAGCAAATCTGATGACA (서열번호 105)
TAG8-P53-24+ ACACTGACGACATGGTTCTACATCTGTGGTCCCAGCTACT (서열번호 106)
454R-P53-17- GCCTTGCCAGCCCGCTCAGTTTCACCATGTTAGGTTGGTCTC (서열번호 107)
454R-P53-18- GCCTTGCCAGCCCGCTCAGTGTAGGTTAAATCCAAATACTATACCGTC (서열번호 108)
454R-P53-19- GCCTTGCCAGCCCGCTCAGTCTCAAATCTTCAGTAGCAACTAAAATCT (서열번호 109)
454R-P53-20- GCCTTGCCAGCCCGCTCAGTCCCGACCTCAGGTGATC (서열번호 110)
454R-P53-21- GCCTTGCCAGCCCGCTCAGTGGTCTTGAACTCCCAACTTC (서열번호 111)
454R-P53-22- GCCTTGCCAGCCCGCTCAGCCTCCGACTCCCAAAGTG (서열번호 112)
454R-P53-23- GCCTTGCCAGCCCGCTCAGACTACAGCCTCGGACTCC (서열번호 113)
454R-P53-24- GCCTTGCCAGCCCGCTCAGATCTTGCACGAAGTTATGCAACTA (서열번호 114)
TAG8-P53-25+ ACACTGACGACATGGTTCTACAACCACTGCACTCCAGC (서열번호 115)
TAG8-P53-26+ ACACTGACGACATGGTTCTACAACAAGGAAAAGTATCAGACAATGTAAGT (서열번호 116)
TAG8-P53-27+ ACACTGACGACATGGTTCTACAACGGTAGCTCACACCTGTAAT (서열번호 117)
TAG8-P53-28+ ACACTGACGACATGGTTCTACATGGAAGTCCCTCTCTGATTGT (서열번호 118)
TAG8-P53-29+ ACACTGACGACATGGTTCTACAACTGACTTTCTGCTCTTGTCTTTC (서열번호 119)
TAG8-P53-30+ ACACTGACGACATGGTTCTACAATTCTGGGACAGCCAAGTC (서열번호 120)
TAG8-P53-31+ ACACTGACGACATGGTTCTACAAGGAGTTCAAGACCAGCCT (서열번호 121)
TAG8-P53-32+ ACACTGACGACATGGTTCTACATCTGTCTCCTTCCTCTTCCTAC (서열번호 122)
454R-P53-25- GCCTTGCCAGCCCGCTCAGCCTCTTCCCCAAAAGCTCT (서열번호 123)
454R-P53-26- GCCTTGCCAGCCCGCTCAGTCTCGAACTCCTTACTTCAGGT (서열번호 124)
454R-P53-27- GCCTTGCCAGCCCGCTCAGCCCAACACCATGCCAGTG (서열번호 125)
454R-P53-28- GCCTTGCCAGCCCGCTCAGTCCCCAGCCCTCCAG (서열번호 126)
454R-P53-29- GCCTTGCCAGCCCGCTCAGATTGAAGTCTCATGGAAGCCAG (서열번호 127)
454R-P53-30- GCCTTGCCAGCCCGCTCAGTCAAGTGATCTTCCCACCTCA (서열번호 128)
454R-P53-31- GCCTTGCCAGCCCGCTCAGACAACCTCCGTCATGTGC (서열번호 129)
454R-P53-32- GCCTTGCCAGCCCGCTCAGACCCATTTACTTTGCACATCTCA (서열번호 130)
TAG8-P53-33+ ACACTGACGACATGGTTCTACATTAAGGGTGGTTGTCAGTGG (서열번호 131)
TAG8-P53-34+ ACACTGACGACATGGTTCTACATTGCAGTGAGCTGAGATCAC (서열번호 132)
TAG8-P53-35+ ACACTGACGACATGGTTCTACAATCTCCTTACTGCTCCCACT (서열번호 133)
TAG8-P53-36+ ACACTGACGACATGGTTCTACATTTTATCACCTTTCCTTGCCTCTT (서열번호 134)
TAG8-P53-37+ ACACTGACGACATGGTTCTACAACTCGTCGTAAGTTGAAAATATTGTAAGT (서열번호 135)
TAG8-P53-38+ ACACTGACGACATGGTTCTACATCCCAAAGTGCTGGGATTAC (서열번호 136)
TAG8-P53-39+ ACACTGACGACATGGTTCTACATCCATCCTCCCAGCTCAG (서열번호 137)
TAG8-P53-40+ ACACTGACGACATGGTTCTACAATCTCAGCTCACTGCAGC (서열번호 138)
454R-P53-33- GCCTTGCCAGCCCGCTCAGAGCCAACCTAGGAGATAACACA (서열번호 139)
454R-P53-34- GCCTTGCCAGCCCGCTCAGAGGCTCCATCTACTCCCAA (서열번호 140)
454R-P53-35- GCCTTGCCAGCCCGCTCAGTTGATAAGAGGTCCCAAGACTTAGTA (서열번호 141)
454R-P53-36- GCCTTGCCAGCCCGCTCAGTGGGTGACAGAGTGAGACT (서열번호 142)
454R-P53-37- GCCTTGCCAGCCCGCTCAGACATCACTGTAATCCAGCCTG (서열번호 143)
454R-P53-38- GCCTTGCCAGCCCGCTCAGAGATCATGCCACTGCACTC (서열번호 144)
454R-P53-39- GCCTTGCCAGCCCGCTCAGGGCATGTGCCTGTAGTCC (서열번호 145)
454R-P53-40- GCCTTGCCAGCCCGCTCAGTGGTCTTGAACTCCTGACCT (서열번호 146)
TAG8-P53-41+ ACACTGACGACATGGTTCTACAAAACAGCATGGTTGCATGAAAG (서열번호 147)
TAG8-P53-42+ ACACTGACGACATGGTTCTACAAGTCGCATGCACATGTAGTC (서열번호 148)
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TAG8-P53-48+ ACACTGACGACATGGTTCTACATGGATCCACCAAGACTTGTTTTAT (서열번호 154)
454R-P53-41- GCCTTGCCAGCCCGCTCAGGATTACAGGTGTGAGCCACT (서열번호 155)
454R-P53-42- GCCTTGCCAGCCCGCTCAGACAGTACCTGAGTTAAAAGATGGTTC (서열번호 156)
454R-P53-43- GCCTTGCCAGCCCGCTCAGTGAGACCCTCCAGCTCTG (서열번호 157)
454R-P53-44- GCCTTGCCAGCCCGCTCAGATCTTCCCTTACCCCATTTTACTTTATT (서열번호 158)
454R-P53-45- GCCTTGCCAGCCCGCTCAGTTCAAAGACCCAAAACCCAAAATG (서열번호 159)
454R-P53-46- GCCTTGCCAGCCCGCTCAGGTCAAGTTCTAGACCCCATGTAATA (서열번호 160)
454R-P53-47- GCCTTGCCAGCCCGCTCAGTGTGGTCCCAGCTACTCC (서열번호 161)
454R-P53-48- GCCTTGCCAGCCCGCTCAGAGCAAAGTTTTATTGTAAAATAAGAGATCGAT (서열번호 162)
실시예 4
증폭 생성물의 회수를 허용하는 미세유체 장치를 사용하여 454 DNA 염기서열분석을 위한 제조에서 표적 핵산의 4개 프라이머 바코딩
표적 특이적 프라이머는 전립선압과 연관된 48개의 유전체 부분을 위하여 고안되었다. 표적 특이적 부분에 더하여, 프라이머는 5' 말단에 추가 태그 서열을 포함하도록 고안되었다. 정방향 프라이머는 서열 ACACTGACGACATGGTTCTACA(서열번호 163)을 포함하였다. 역방향 프라이머는 서열 TACGGTAGCAGAGACTTGGTCT(서열번호 164)를 포함하였다. 태그 서열과 표적 특이적 부위를 모두 포함하는 프라이머의 서열은 표 5에 열거되어 있다.
분석번호 분석명 태깅된 정방향 프라이머 서열 태깅된 역방향 프라이머 서열 앰플리콘 위치 앰플리콘 크기(태그 없음) 서열번호
1 MSMB-1 ACACTGACGACATGGTTCTACAGTGGTTGCCCTCTCCAGTA TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTGCACACGCATATTAAAATAGGAA chr10:51219512+51219668 157 (서열번호 165)
2 MSMB-2 ACACTGACGACATGGTTCTACATCATTCTCCACCCTGACCTT TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTTTCATCTGCAGACAGGTCCA chr10:51225703+51225910 208 (서열번호 166)
3 MSMB-3 ACACTGACGACATGGTTCTACAAGGCCTTGTTCTCATTGCAT TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTCCAGCACTGGCTTGAGACTT chr10:51226702+51226884 183 (서열번호 167)
4 MSMB-4 ACACTGACGACATGGTTCTACAGGGTCCTTTCTCTTCTAACAGG TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTAGGCCAGAGGAGAATGAGG chr10:51232232+51232460 229 (서열번호 168)
5 HNF1B-1 ACACTGACGACATGGTTCTACACAGAGGGTGATGGTGTGGA TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTATGACCCTGCCAAATGACAC chr17:33121423+33121560 138 (서열번호 169)
6 HNF1B-5 ACACTGACGACATGGTTCTACATGCTTCCCATTCTTCTTCTCC TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTTGGAAACTGCTCTTTGTGGTC chr17:33138980+33139231 252 (서열번호 170)
7 HNF1B-6 ACACTGACGACATGGTTCTACATGCCTCTTATCTTATCAGCTCCA TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTTGGTGGCACTAATGTTCCCTA chr17:33144574+33144827 254 (서열번호 171)
8 HNF1B-7 ACACTGACGACATGGTTCTACATAAGATCCGTGGCAAGAACC TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTGAGGTCCGTGTCTACAACTGG chr17:33165634+33165867 234 (서열번호 172)
9 HNF1B-8 ACACTGACGACATGGTTCTACAGTCCATGGCCAGCTTTTG TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTCCCCTCACTCACCATCTCC chr17:33165796+33165970 175 (서열번호 173)
10 HNF1B-9 ACACTGACGACATGGTTCTACAAGGGTTCCTGGGTCTGTGTA TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTAGTCCGATGATGCCTGCT chr17:33167605+33167819 215 (서열번호 174)
11 HNF1B-10 ACACTGACGACATGGTTCTACACTTCTTGTTGGTGGGCTCAG TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTTGAGTGAAGGCTACAGACCCTA chr17:33167782+33167975 194 (서열번호 175)
12 HNF1B-11 ACACTGACGACATGGTTCTACATGAGAGGGCAAAGGTCACTT TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTAGAGGGAGGTGGTCGATGT chr17:33173490+33173681 192 (서열번호 176)
13 HNF1B-12 ACACTGACGACATGGTTCTACAGTTGAGATGCTGGGAGAGGT TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTTCTCCCACTAGTACCCTAACCATC chr17:33173623+33173782 160 (서열번호 177)
14 MYC-1 ACACTGACGACATGGTTCTACAGACCCGCTTCTCTGAAAGG TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTGCATTCGACTCATCTCAGCA chr8:128817980+128818121 142 (서열번호 1781)
15 MYC-2 ACACTGACGACATGGTTCTACACAGGTTTCCGCACCAAGA TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTCAGCAGCTCGAATTTCTTCC chr8:128819612+128819858 247 (서열번호 179)
16 MYC-6 ACACTGACGACATGGTTCTACAAACCTTGCTAAAGGAGTGATTTCT TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTCCTCTTGGCAGCAGGATAGT chr8:128821784+128822038 255 (서열번호 180)
17 MYC-7 ACACTGACGACATGGTTCTACAACGTCTCCACACATCAGCAC TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTAACTCCGGGATCTGGTCAC chr8:128821968+128822217 250 (서열번호 181)
18 MYC-8 ACACTGACGACATGGTTCTACACCAGAGGAGGAACGAGCTAA TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTTTCTGTTAGAAGGAATCGTTTTCC chr8:128822158+128822420 263 (서열번호 182)
19 JAZF1-2 ACACTGACGACATGGTTCTACATTCCATGTGGTTATGCCAAG TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTCTCCTGACAGTCCTTGCACTT chr7:27846803+27847046 244 (서열번호 183)
20 JAZF1-4 ACACTGACGACATGGTTCTACACAATAAGCAGCAGATATAAGGTTGTT TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTCTTTGTGTTAGGTAGCCTCATATATTC chr7:27998002+27998196 195 (서열번호 184)
21 NCOA4-1 ACACTGACGACATGGTTCTACATTCAAAGGTGGTTTTTGGTTG TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTGCCCTGTGTCAAGAGTCCAG chr10:51249073+51249337 265 (서열번호 185)
22 NCOA4-2 ACACTGACGACATGGTTCTACATTGGGAAACATCATTCTTTGG TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTACCAGAAGCCATGCTCAAAC chr10:51250503+51250748 246 (서열번호 186)
23 NCOA4-3 ACACTGACGACATGGTTCTACATGGTGTCATTGTGGCTAGTTG TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTTGATCTTATCCTAGCAACACAGAAG chr10:51250847+51251096 250 (서열번호 187)
24 NCOA4-4 ACACTGACGACATGGTTCTACATGAAGTTGATGAAACAGATATTCCTT TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTAGAAGTGCCCAGTGAAGCAT chr10:51251218+51251418 201 (서열번호 188)
25 NCOA4-5 ACACTGACGACATGGTTCTACATTGGCAGCATAGCATAAATAACA TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTCCCAAAGGAAGTATAAGCCAAG chr10:51252141+51252337 197 (서열번호 189)
26 NCOA4-6 ACACTGACGACATGGTTCTACACTGCATTTGACATTCCTTGTTT TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTTCCACCTACTGCTGTGTCTACTG chr10:51252768+51252994 227 (서열번호 190)
27 NCOA4-7 ACACTGACGACATGGTTCTACAGCAGACAGAATCTCCAAAGCA TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTTCTGATAGGTCCATCTCATCTTGA chr10:51254556+51254815 260 (서열번호 191)
28 NCOA4-8 ACACTGACGACATGGTTCTACAGGTTGGAGATCAAGAGCTTCCT TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTTGGTCATTCAGGCACTTCAG chr10:51254768+51255022 255 (서열번호 192)
29 NCOA4-9 ACACTGACGACATGGTTCTACAGAAACCAGCCCAAAGGTGT TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTCCTTCTTTCTTCAGAAGCCACT chr10:51254962+51255214 253 (서열번호 193)
30 NCOA4-10 ACACTGACGACATGGTTCTACAGAATTGTGAGAAGGAGGCTCTG TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTTGGGACTTCCTTCTTTGTATGG chr10:51255167+51255432 266 (서열번호 194)
31 NCOA4-11 ACACTGACGACATGGTTCTACACCTTGTCGGAGTGGCTTATC TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTCCAGTGCTATTTTGATGTTTATGC chr10:51255385+51255633 249 (서열번호 195)
32 NCOA4-13 ACACTGACGACATGGTTCTACAGGAGCTTTAAGGCAGGGAAA TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTTTGGCAAGCTGCAGTCAC chr10:51259156+51259310 155 (서열번호 196)
33 NUDT11-1 ACACTGACGACATGGTTCTACAAGCGAGGCAGACAAATAGAAG TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTGTACTGACTGTCACGGAGCTG chrX:51255496+51255748 253 (서열번호 197)
34 SLC22A3-4 ACACTGACGACATGGTTCTACATCTGCATTCTGGCATGTCTC TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTTCCCCGTATTAATGCATGGTAT chr6:160738955+160739163 209 (서열번호 198)
35 SLC22A3-5 ACACTGACGACATGGTTCTACAAAGGTGAGCTCTTTTCCTGTCTT TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTTTGTTGGCTATCTGGCCCTA chr6:160748030+160748274 245 (서열번호 199)
36 SLC22A3-6 ACACTGACGACATGGTTCTACATGCTTCTGTGACCTCTTGTGT TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTGTCTGTTTGGAGTCTAATTTCTGC chr6:160749740+160750007 268 (서열번호 200)
37 SLC22A3-7 ACACTGACGACATGGTTCTACACATAACTCACAACAGCCTCCTTC TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTAATCAATTCACCAGCTTTAGCAA chr6:160751720+160751920 201 (서열번호 201)
38 SLC22A3-10 ACACTGACGACATGGTTCTACAGTGGTGGAACTGCCAGGA TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTGGCTCCCTATACTTGATTGTGG chr6:160778107+160778308 202 (서열번호 202)
39 SLC22A3-11 ACACTGACGACATGGTTCTACACCTCCCTTTCAAACTTTCTGTG TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTCGCTGGTCTACAGAGTTACTTAGGA chr6:160783754+160783942 189 (서열번호 203)
40 SLC22A3-12 ACACTGACGACATGGTTCTACATGATTATCTTGAAGTCACTTGTTGAA TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTTGAAGGCTCTTAAGAATAGCAAATG chr6:160784591+160784798 208 (서열번호 204)
41 SLC22A3-13 ACACTGACGACATGGTTCTACAGTGTCTTCCTGGAGCGGTAA TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTTTCCCTGTGGATATTCAATTTTCT chr6:160788700+160788934 235 (서열번호 205)
42 SLC22A3-14 ACACTGACGACATGGTTCTACATCTTTCCTAAAGACTTTCTCCTTTG TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTATCTCTGCAAGGCACAGCTT chr6:160791984+160792152 169 (서열번호 206)
43 KLK3-1 ACACTGACGACATGGTTCTACAAGTCCTGGGGAATGAAGGTT TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTGGAAAGAGCCTCAGCTTGAC chr19:56049936+56050140 205 (서열번호 207)
44 KLK3-2 ACACTGACGACATGGTTCTACAGTTCCTCCTGTCAACCCTGA TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTCCTCTGGGACACAGACACCT chr19:56051260+56051515 256 (서열번호 208)
45 KLK3-3 ACACTGACGACATGGTTCTACA TCCTTATCATCCTCGCTCCT TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTTTCACAGCATCCGTGAGC chr19:56053051+56053300 250 (서열번호 209)
46 KLK3-4 ACACTGACGACATGGTTCTACAACTCCAGCCACGACCTCAT TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTCCCTCAGACCCAGGCATC chr19:56053237+56053436 200 (서열번호 210)
47 KLK3-5 ACACTGACGACATGGTTCTACAGGTCCAGCCCACAACAGT TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTCCCAGCCCAGAATTAAGGT chr19:56053490+56053729 240 (서열번호 211)
48 KLK3-8 ACACTGACGACATGGTTCTACATCTTCCAAAGCTGGGAACTG TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTGGGCACATGGTTCACTGC chr19:56054924+56055115 192 (서열번호 212)
반응 혼합물의 제조
프라이머를 10nmol 규모에서 IDT로 합성하였고, 100μM 농도로 물에 재현탁하여 제공하였다. 표 5에서 각각의 부분에 대한 정방향 및 역방향 프라이머는 96웰 PCR 플레이트(USA scientific)내 별도의 웰에서 0.05% Tween-20을 포함하는 PCR-품질수(PCR-quality water)(Teknova)에서 각각의 프라이머의 최종 농도가 1μM이도록 결합하였다.
HapMap 샘플 수집으로부터의 48개 인간 유전체 DNA 샘플을 낮은 EDTA TE 버퍼(Teknova)에서 50ng/μl로 재현탁하였고, 다음과 같이 PCR용으로 제조하였다.
사전샘플 혼합물은 다음과 같이 제조하였다.
사전샘플 혼합물 샘플 당 부피(μl) 64개 샘플에 대한 부피(μl)
MgCl2를 이용한 패스트스타트 고정확도 반응 버퍼 0.5 32
DMSO 0.1 6.4
PCR 등급 뉴클레오티드 혼합물 0.1 6.4
패스트스타트 고정확도 효소 블렌드(Roche 04 738 292 001) 0.05 3.2
20x Access Array 로딩 시약(PN: 100-0883) 0.25 16
20x Evagreen(Biotium-31000) 0.25 16
20x ROX 염료(Invitrogen 12223-012) 0.25 16
PCR 등급수 0.5 32
합계 2 128
각각의 샘플에 대하여, 정방향 및 역방향 바코드 프라이머, 유전체 DNA 및 사전샘플 혼합물을 포함하는 샘플 혼합물을 96웰 PCR 플레이트 내 개별적인 웰에서 제조하였다.
샘플 혼합물 부피(μl)
사전샘플 혼합물 2
2μM 정방향 바코드 프라이머 0.5
2μM 역방향 바코드 프라이머 0.5
유전체 DNA(50ng/μl) 1
PCR 등급수 1
각각의 샘플을 표 8에서 선택된 한쌍의 바코드 프라이머와 혼합하였다.
역방향 바코드 프라이머(454B-BC#-CS1) 역방향 바코드 프라이머 서열번호 정방향 바코드 프라이머(454A-BC#-CS2) 정방향 바코드 프라이머 서열번호
1 GCCTTGCCAGCCCGCTCAGGCATGCTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 213) GCCTCCCTCGCGCCATCAGGCATGCACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 214)
2 GCCTTGCCAGCCCGCTCAGCGTACGTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 215) GCCTCCCTCGCGCCATCAGCGTACGACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 216)
3 GCCTTGCCAGCCCGCTCAGGTCAGCTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 217) GCCTCCCTCGCGCCATCAGGTCAGCACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 218)
4 GCCTTGCCAGCCCGCTCAGAGCTGCTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 219) GCCTCCCTCGCGCCATCAGAGCTGCACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 2)
5 GCCTTGCCAGCCCGCTCAGTGCATCTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 221) GCCTCCCTCGCGCCATCAGTGCATCACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 222)
6 GCCTTGCCAGCCCGCTCAGCTGATGTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 223) GCCTCCCTCGCGCCATCAGCTGATGACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 224)
7 GCCTTGCCAGCCCGCTCAGGTAGTCTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 225) GCCTCCCTCGCGCCATCAGGTAGTCACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 226)
8 GCCTTGCCAGCCCGCTCAGGTCGATTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 227) GCCTCCCTCGCGCCATCAGGTCGATACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 228)
9 GCCTTGCCAGCCCGCTCAGGATACGTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 229) GCCTCCCTCGCGCCATCAGGATACGACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 230)
10 GCCTTGCCAGCCCGCTCAGTGATGCTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 231) GCCTCCCTCGCGCCATCAGTGATGCACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 232)
11 GCCTTGCCAGCCCGCTCAGAGCTGATACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 233) GCCTCCCTCGCGCCATCAGAGCTGAACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 234)
12 GCCTTGCCAGCCCGCTCAGACTGTATACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 235) GCCTCCCTCGCGCCATCAGACTGTAACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 236)
13 GCCTTGCCAGCCCGCTCAGTGCATGTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 237) GCCTCCCTCGCGCCATCAGTGCATGACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 238)
14 GCCTTGCCAGCCCGCTCAGAGTCTATACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 239) GCCTCCCTCGCGCCATCAGAGTCTAACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 240)
15 GCCTTGCCAGCCCGCTCAGTGTCTGTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 241) GCCTCCCTCGCGCCATCAGTGTCTGACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 242)
16 GCCTTGCCAGCCCGCTCAGGCTAGCTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 243) GCCTCCCTCGCGCCATCAGGCTAGCACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 244)
17 GCCTTGCCAGCCCGCTCAGGATAGCTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 245) GCCTCCCTCGCGCCATCAGGATAGCACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 246)
18 GCCTTGCCAGCCCGCTCAGGCTACTTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 247) GCCTCCCTCGCGCCATCAGGCTACTACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 248)
19 GCCTTGCCAGCCCGCTCAGCTATGCTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 249) GCCTCCCTCGCGCCATCAGCTATGCACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 23)
20 GCCTTGCCAGCCCGCTCAGGCTATGTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 251) GCCTCCCTCGCGCCATCAGGCTATGACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 252)
21 GCCTTGCCAGCCCGCTCAGCGTGCATACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 253) GCCTCCCTCGCGCCATCAGCGTGCAACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 254)
22 GCCTTGCCAGCCCGCTCAGATAGCTTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 255) GCCTCCCTCGCGCCATCAGATAGCTACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 256)
23 GCCTTGCCAGCCCGCTCAGTGTAGCTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 257) GCCTCCCTCGCGCCATCAGTGTAGCACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 258)
24 GCCTTGCCAGCCCGCTCAGGTGCTATACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 259) GCCTCCCTCGCGCCATCAGGTGCTAACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 260)
25 GCCTTGCCAGCCCGCTCAGGTCATGTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 261) GCCTCCCTCGCGCCATCAGGTCATGACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 262)
26 GCCTTGCCAGCCCGCTCAGATCGTGTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 263) GCCTCCCTCGCGCCATCAGATCGTGACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 264)
27 GCCTTGCCAGCCCGCTCAGTGTACGTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 265) GCCTCCCTCGCGCCATCAGTGTACGACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 266)
28 GCCTTGCCAGCCCGCTCAGAGTGTATACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 267) GCCTCCCTCGCGCCATCAGAGTGTAACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 268)
29 GCCTTGCCAGCCCGCTCAGTGACAGTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 269) GCCTCCCTCGCGCCATCAGTGACAGACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 270)
30 GCCTTGCCAGCCCGCTCAGGATCACTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 271) GCCTCCCTCGCGCCATCAGGATCACACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 272)
31 GCCTTGCCAGCCCGCTCAGCTAGAGTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 273) GCCTCCCTCGCGCCATCAGCTAGAGACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 274)
32 GCCTTGCCAGCCCGCTCAGCTAGTCTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 275) GCCTCCCTCGCGCCATCAGCTAGTCACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 276)
33 GCCTTGCCAGCCCGCTCAGAGCTAGTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 277) GCCTCCCTCGCGCCATCAGAGCTAGACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 278)
34 GCCTTGCCAGCCCGCTCAGTGACTGTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 279) GCCTCCCTCGCGCCATCAGTGACTGACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 280)
35 GCCTTGCCAGCCCGCTCAGTGATAGTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 4) GCCTCCCTCGCGCCATCAGTGATAGACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 282)
36 GCCTTGCCAGCCCGCTCAGCGTATCTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 283) GCCTCCCTCGCGCCATCAGCGTATCACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 284)
37 GCCTTGCCAGCCCGCTCAGGTCTGATACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 285) GCCTCCCTCGCGCCATCAGGTCTGAACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 286)
38 GCCTTGCCAGCCCGCTCAGCATGACTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 287) GCCTCCCTCGCGCCATCAGCATGACACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 288)
39 GCCTTGCCAGCCCGCTCAGCGATGATACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 289) GCCTCCCTCGCGCCATCAGCGATGAACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 290)
40 GCCTTGCCAGCCCGCTCAGGCTGATTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 291) GCCTCCCTCGCGCCATCAGGCTGATACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 292)
41 GCCTTGCCAGCCCGCTCAGCAGTACTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 293) GCCTCCCTCGCGCCATCAGCAGTACACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 294)
42 GCCTTGCCAGCCCGCTCAGGCGACTTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 295) GCCTCCCTCGCGCCATCAGGCGACTACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 296)
43 GCCTTGCCAGCCCGCTCAGGTACGATACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 297) GCCTCCCTCGCGCCATCAGGTACGAACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 298)
44 GCCTTGCCAGCCCGCTCAGACGCTATACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 299) GCCTCCCTCGCGCCATCAGACGCTAACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 300)
45 GCCTTGCCAGCCCGCTCAGAGCATCTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 301) GCCTCCCTCGCGCCATCAGAGCATCACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 302)
46 GCCTTGCCAGCCCGCTCAGGATGCTTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 303) GCCTCCCTCGCGCCATCAGGATGCTACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 304)
47 GCCTTGCCAGCCCGCTCAGGTCTGCTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 305) GCCTCCCTCGCGCCATCAGGTCTGCACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 306)
48 GCCTTGCCAGCCCGCTCAGATGCGATACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 307) GCCTCCCTCGCGCCATCAGATGCGAACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 308)
Access Array IFC의 실행
차단 및 인터페이스 어큐뮬레이터 저장소는 제어 라인 유체(Fluidigm PN 89000020) 300μl로 충전하고 H1~H4 시약 웰은 Access Array IFC 로딩 이전에 PCR 등급수 내 0.05% Tween-20 500μl를 이용하여 로딩하였다. 각각의 샘플 혼합물 5μl를 샘플 포트 내로 로딩하고, 각각의 프라이머 혼합물 5μl를 Access Array IFC의 프라이머 주입구 내로 로딩하였다.
Access Array IFC는 열순환되었고 Fluidigm Corporation이 제조한 BioMark TM Real-Time PCR 시스템을 사용하여 이미지화하였다. Access Array IFC 열순환 프로토콜은 열혼합 단계[50℃에서 2분, 70℃에서 20분], 핫스타트 단계[95℃에서 10분], 35사이클의 터치다운 PCR 전략[95℃에서 15초 그리고 63℃에서 1분의 2사이클, 95℃에서 15초 그리고 62℃에서 1분의 2사이클, 95℃에서 15초 그리고 61℃에서 1분의 2사이클, 95℃에서 15초 그리고 60℃에서 1분의 2사이클, 95℃에서 15초 그리고 58℃에서 1분의 2사이클, 95℃에서 15초 그리고 72℃에서 1분의 25사이클], 및 연장 단계[72℃에서 3분]를 포함한다. 실시간 데이터는 Fluidigm Real-Time PCR 분석 소프트웨어로 분석하여 각각의 반응 챔버에 대한 CT 값을 얻었다.
증폭 후, PCR 생성물은 Post-PCR IFC Loader AX를 사용하여 Access Array IFC에서 수확하였다. 수확 전에, 각각의 샘플 포트는 0.05% Tween-20 2μl로 충전되었다. 잔여 용액은 H1~H4 시약 웰에서 제거하였고, 1X Access Array 수확 시약(0.05% tween-20) 600μl로 다시 충전하였다. 수확 후에, 각각의 샘플 포트는 48가지의 모인 PCR생성물 10μl(± 10%)를 포함한 PCR 생성물 배출구가 되었다. 모인 PCR 생성물은 Access Array IFC에서 제거하여 4℃에서 미세적정 플레이트에 저장하였다.
각각의 샘플에 대한 각각의 PCR 생성물 풀(pool) 1μl를 취하여 Agilent 1K Bioanalyzer 칩 상으로 로딩하였다. 도 12는 48개 개별적인 생성물 풀 각각으로부터의 전기영동도를 나타낸다. 도 13은 단일 생성물 풀 내의 생성물 크기의 분포를 나타낸다. 모든 생성물이 예상 크기 범위 내에 속하며, 임의의 작은 크기의 PCR 부산물의 증거는 없었다.
각각의 샘플에 대한 PCR 생성물은 Agilent Bioanalyzer 추적으로 계산된 농도에 기초하여 모았다. 생성물 풀은 제조자 지침에 따라서 AMPure 비드(Agencourt)를 사용하여 정제하였다.
정제된 생성물 풀은 에멀젼 PCR을 실시하고 제조자의 지침에 따라서 454 FLX 염기서열분석기(Roche Analytical Sciences) 상에서 파이로시퀀싱을 하였다. 그 다음 염기서열분석기에 의하여 산출된 서열 파일은 바코딩된 PCR 생성물의 존재에 대하여 분석되었다.
각각의 바코드에 대하여 획득한 서열의 수를 계수하고, 도표로 나타내었다(도 14a). 평균적으로 약 3400개의 서열이 각각의 바코드에 대하여 계수되었다. 모든 샘플은 평균의 >50%, 평균의 < 2배로 나타났다.
그 다음 각각의 샘플에서 각각의 개별적 PCR 생성물에 대하여 계수된 서열의 수를 분석하였다(도 14b). 2304개의 PCR 생성물 중 단지 하나만 염기서열분석기에서 관찰되지 않았다. 대부분의 서열이 평균의 >50%, 평균의 < 2배로 존재하였다. 2303/2304의 생성물은 >5배로 계수되었다. 도 14c는 Access Array IFC에서 모든 2304개의 PCR 반응으로부터의 PCR 생성물의 분포를 나타낸다. 서열의 >95%가 평균 범위의 50% 내지 2배 사이로 측정되었다. 서열의 >99%가 평균 범위의 50% 내지 2배 사이로 측정되었다.
실시예 5
프라이머 결합 부위 및 뉴클레오티드 태그의 상이한 결합을 가진 4개의 외부 프라이머를 사용한 멀티 프라이머 증폭
프라이머 쌍의 세트를 EGFR 및 MET 유전자에서 특이적 부분을 증폭하도록 고안하였다. 그 다음 이를 Access Array IFC에서 인간 유전체 DNA 및 4개의 외부 프라이머와 결합하였다(도 15).
반응 혼합물의 제조
프라이머를 10nmol 규모에서 Eurofins MWG 오페론으로 합성하여 100μM 농도로 물에 재현탁하여 제공하였다. 표 9에서 각각의 부분에 대한 정방향 및 역방향 프라이머는 96웰 PCR 플레이트(USA scientific)내 별도의 웰에서 0.05% Tween-20을 포함하는 PCR-품질수(PCR-quality water)(Teknova)에서 각각의 프라이머의 최종 농도가 1μM이도록 결합하였다.
분석 정방향 프라이머 정방향 프라이머 서열 번호 역방향 프라이머 역방향 프라이머 서열 번호
EGFR_Exon3 ACACTGACGACATGGTTCTACATTCTTAGACCATCCAGGAGGTG (서열번호 309) TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTCCAGCCTCTCACCCTGTAAA (서열번호 310)
EGFR_Exon4 ACACTGACGACATGGTTCTACAAGCTGGAAAGAGTGCTCACC (서열번호 311) TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTTAGGAGCTGGAGGCAGAGAT (서열번호 312)
EGFR_Exon5 ACACTGACGACATGGTTCTACAGCGTCATCAGTTTCTCATCATT (서열번호 313) TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTACATGGGTCTGAGGCTGTTC (서열번호 314)
EGFR_Exon6 ACACTGACGACATGGTTCTACACCCTGGGAAATGATCCTACC (서열번호 315) TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTTCTTACCAGGCAGTCGCTCT (서열번호 316)
EGFR_Exon7 ACACTGACGACATGGTTCTACACCAGCGTGTCCTCTCTCCT (서열번호 317) TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTGACAAGGATGCCTGACCAGT (서열번호 318)
EGFR_Exon8 ACACTGACGACATGGTTCTACACAAAGGAGGATGGAGCCTTTC (서열번호 319) TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTGATGTGTTCCTTTGGAGGTGG (서열번호 320)
EGFR_Exon9 ACACTGACGACATGGTTCTACATCCAACAAATGTGAACGGAAT (서열번호 321) TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTCAAGCAACTGAACCTGTGACTC (서열번호 322)
EGFR_Exon10 ACACTGACGACATGGTTCTACAGATCAATAATCACCCTGTTGTTTG (서열번호 323) TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTTTCCAAGGGAACAGGAAATATG (서열번호 324)
EGFR_Exon11 ACACTGACGACATGGTTCTACATCCTACGTGGTGTGTGTCTGA (서열번호 325) TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTGCTTTGGCTGTGGTCAACTT (서열번호 326)
EGFR_Exon12 ACACTGACGACATGGTTCTACACCACATGATTTTTCTTCTCTCCA (서열번호 327) TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTCGGTGACTTACTGCAGCTGTT (서열번호 328)
EGFR_Exon13 ACACTGACGACATGGTTCTACAGCTCTGTCACTGACTGCTGTG (서열번호 329) TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTGCTATAACAACAACCTGGAGCCT (서열번호 330)
EGFR_Exon14 ACACTGACGACATGGTTCTACAGCTGACGGGTTTCCTCTTC (서열번호 331) TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTGACGTGGATAGCAGCAAGG (서열번호 332)
EGFR_Exon15 ACACTGACGACATGGTTCTACAGCATGAACATTTTTCTCCACCT (서열번호 333) TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTTTCTGTTCTCCTTCACTTTCCAC (서열번호 334)
EGFR_Exon16 ACACTGACGACATGGTTCTACATTTCTCTTTCACTTCCTACAGATGC (서열번호 335) TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTCCACAGCAGTGTGGTCATTC (서열번호 336)
EGFR_Exon17 ACACTGACGACATGGTTCTACATGGAATCTGTCAGCAACCTC (서열번호 337) TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTCCCAGGACTGGCACTCA (서열번호 338)
EGFR_Exon18 ACACTGACGACATGGTTCTACAGCTGAGGTGACCCTTGTCTC (서열번호 339) TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTCCCACCAGACCATGAGAGG (서열번호 340)
EGFR_Exon19 ACACTGACGACATGGTTCTACATCACAATTGCCAGTTAACGTCT (서열번호 341) TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTCCACACAGCAAAGCAGAAAC (서열번호 342)
EGFR_Exon20 ACACTGACGACATGGTTCTACACCACACTGACGTGCCTCTC (서열번호 343) TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTCCGTATCTCCCTTCCCTGAT (서열번호 344)
EGFR_Exon21 ACACTGACGACATGGTTCTACACCTCACAGCAGGGTCTTCTC (서열번호 345) TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTCTGACCTAAAGCCACCTCCTT (서열번호 346)
EGFR_Exon22 ACACTGACGACATGGTTCTACACACTGCCTCATCTCTCACCA (서열번호 347) TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTCCAGCTTGGCCTCAGTACA (서열번호 348)
EGFR_Exon23 ACACTGACGACATGGTTCTACACATGATCCCACTGCCTTCTT (서열번호 349) TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTAGTGTGGACAGACCCACCA (서열번호 350)
EGFR_Exon24 ACACTGACGACATGGTTCTACATTCCAGTGTTCTAATTGCACTGTT (서열번호 351) TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTGAGGGACTCTTCCCAATGGA (서열번호 352)
EGFR_Exon25 ACACTGACGACATGGTTCTACACTAATAGCCTCAAAATCTCTGCAC (서열번호 353) TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTTTTGTTCAAATGAGTAGACACAGC (서열번호 354)
EGFR_Exon26 ACACTGACGACATGGTTCTACACATTCCATGGGCAACTTCTC (서열번호 355) TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTTTCTGGCTTATAAGGTGTTCATACA (서열번호 356)
EGFR_Exon27 ACACTGACGACATGGTTCTACACCTTCCCTCATTTCCTCCTG (서열번호 357) TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTTCCAGACAAGCCACTCACC (서열번호 358)
EGFR_Exon28-1 ACACTGACGACATGGTTCTACAcctctgatttctttccactttca (서열번호 359) TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTCTAATTTGGTGGCTGCCTTT (서열번호 360)
EGFR_Exon28-2 ACACTGACGACATGGTTCTACATGTCAACAGCACATTCGACAG (서열번호 361) TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTGGTCCTGGGTATCGAAAGAGT (서열번호 362)
EGFR_Exon2 ACACTGACGACATGGTTCTACATTTCTTCCAGTTTGCCAAGG (서열번호 363) TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTAGGAAAATCAAAGTCACCAACC (서열번호 364)
MET_Exon1-1 ACACTGACGACATGGTTCTACACTCTCGCCTTGAACCTGTTT (서열번호 365) TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTCAGCACAGGCCCAGTCTT (서열번호 366)
MET_Exon1-2 ACACTGACGACATGGTTCTACATTCCTTGGTGCCACTAACTACA (서열번호 367) TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTGGGAGAATATGCAGTGAACCTC (서열번호 368)
MET_Exon2 ACACTGACGACATGGTTCTACATGGATTCACATTAACTCTATGACCA (서열번호 369) TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTTTGCACAATACCAGATAGAACAGAC (서열번호 370)
MET_Exon3 ACACTGACGACATGGTTCTACATGAGCTTGTTGGAATAAGGATG (서열번호 371) TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTCGTCTATGGAAATTCCCTGTG (서열번호 372)
MET_Exon4 ACACTGACGACATGGTTCTACAGAAGCTCTTTCCACCCCTTC (서열번호 373) TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTTGCCAGCTGTTAGAGATTCCT (서열번호 374)
MET_Exon5 ACACTGACGACATGGTTCTACATGTCCTTGTAGGTTTTCCCAAA (서열번호 375) TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTCCCCAGCAAAGCATTTTAAG (서열번호 376)
MET_Exon6 ACACTGACGACATGGTTCTACAGAAAATTCCTTGGATTTGTCATG (서열번호 377) TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTCATGATAGGATAGAATCTTCCTTACCA (서열번호 378)
MET_Exon7 ACACTGACGACATGGTTCTACAGTTTTGTTTTTATCTCCCCTCCA (서열번호 379) TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTTTCAAATTGACAGATGCAACAA (서열번호 380)
MET_Exon8 ACACTGACGACATGGTTCTACAGGAACCATTGAGTTATATCCTTTTG (서열번호 381) TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTTTGTTTTCTTATACCCATCAGAAGC (서열번호 382)
MET_Exon9 ACACTGACGACATGGTTCTACATTGGTGGAAAGAACCTCTCAA (서열번호 383) TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTCAGGTACCATGAAAGCCACA (서열번호 384)
MET_Exon10 ACACTGACGACATGGTTCTACATGTTGCCAAGCTGTATTCTGTT (서열번호 385) TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTTTTGAGCTGATGATTTAAGACAGTG (서열번호 386)
MET_Exon12 ACACTGACGACATGGTTCTACAGGACCCAAAGTGCTACAACC (서열번호 387) TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTCAAGAATCGACGACAATCTTAAAC (서열번호 388)
MET_Exon13 ACACTGACGACATGGTTCTACAGCCCATGATAGCCGTCTTTA (서열번호 389) TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTCAACAATGTCACAACCCACTG (서열번호 390)
MET_Exon14 ACACTGACGACATGGTTCTACACCTTCATCTTACAGATCAGTTTCCT (서열번호 391) TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTGCTTACTGGAAAATCGTATTTAACAAA (서열번호 392)
MET_Exon15 ACACTGACGACATGGTTCTACAACGCAGTGCTAACCAAGTTCT (서열번호 393) TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTTCCACAAGGGGAAAGTGTAAA (서열번호 394)
MET_Exon16 ACACTGACGACATGGTTCTACATGTCTCCACCACTGGATTTCT (서열번호 395) TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTGGCTTACAGCTAGTTTGCCAGT (서열번호 396)
MET_Exon17 ACACTGACGACATGGTTCTACATGCTTTTCTAACTCTCTTTGACTGC (서열번호 397) TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTTCCTCCTTGTCACTTAATTTGGA (서열번호 398)
MET_Exon18 ACACTGACGACATGGTTCTACATTCTATTTCAGCCACGGGTAA (서열번호 399) TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTAGAGGAGAAACTCAGAGATAACCAA (서열번호 400)
MET_Exon19 ACACTGACGACATGGTTCTACACTCACCTCATCTGTCCTGTTTCT (서열번호 401) TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTGGCATTTCTGTAAAAGTAAAGAACG (서열번호 402)
MET_Exon20 ACACTGACGACATGGTTCTACACCTGCCTTCAAAGGGTCTCT (서열번호 403) TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTGTGTGGACTGTTGCTTTGACA (서열번호 404)
단일 인간 유전체 DNA 샘플(Coriell NA10830)을 낮은 EDTA TE 버퍼(Teknova)에서 50ng/μl로 재현탁하였고, 다음과 같이 PCR용으로 제조하였다.
사전샘플 혼합물은 다음과 같이 제조하였다.
사전샘플 혼합물 샘플 당 부피(μl) 64개 샘플에 대한 부피(μl)
MgCl2를 이용한 패스트스타트 고정확도 반응 버퍼 0.5 32
DMSO 0.1 6.4
PCR 등급 뉴클레오티드 혼합물 0.1 6.4
패스트스타트 고정확도 효소 블렌드(Roche 04 738 292 001) 0.05 3.2
20x Access Array 로딩 시약(PN: 100-0883) 0.25 16
PCR 등급수 0.5 32
합계 2.5 160
각각의 샘플 복제물에 대하여, 정방향 및 역방향 바코드 프라이머, 유전체 DNA 및 사전샘플 혼합물을 포함하는 샘플 혼합물을 96웰 PCR 플레이트 내 개별적인 웰에서 제조하였다.
샘플 혼합물 부피(μl)
사전샘플 혼합물 2
4μM 정방향 바코드 프라이머 0.5
4μM 역방향 바코드 프라이머 0.5
유전체 DNA(50ng/μl) 1
PCR 등급수 1
4개의 복제물 샘플을 표 12에서 선택된 한쌍의 바코드 프라이머와 각각의 샘플을 혼합하여 제조하였다.
역방향 바코드 프라이머(454B-BC#-CS1) 역방향 바코드 프라이머 서열번호 정방향 바코드 프라이머(454A-BC#-CS2) 정방향 바코드 프라이머 서열번호
1 GCCTTGCCAGCCCGCTCAGGCATGCTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 405) GCCTCCCTCGCGCCATCAGGCATGCACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 406)
2 GCCTTGCCAGCCCGCTCAGCGTACGTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 407) GCCTCCCTCGCGCCATCAGCGTACGACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 408)
3 GCCTTGCCAGCCCGCTCAGGTCAGCTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 409) GCCTCCCTCGCGCCATCAGGTCAGCACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 410)
4 GCCTTGCCAGCCCGCTCAGAGCTGCTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 411) GCCTCCCTCGCGCCATCAGAGCTGCACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 412)
5 GCCTTGCCAGCCCGCTCAGTGCATCTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 413) GCCTCCCTCGCGCCATCAGTGCATCACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 414)
6 GCCTTGCCAGCCCGCTCAGCTGATGTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 415) GCCTCCCTCGCGCCATCAGCTGATGACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 416)
7 GCCTTGCCAGCCCGCTCAGGTAGTCTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 417) GCCTCCCTCGCGCCATCAGGTAGTCACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 418)
8 GCCTTGCCAGCCCGCTCAGGTCGATTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 419) GCCTCCCTCGCGCCATCAGGTCGATACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 420)
9 GCCTTGCCAGCCCGCTCAGGATACGTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 421) GCCTCCCTCGCGCCATCAGGATACGACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 422)
10 GCCTTGCCAGCCCGCTCAGTGATGCTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 423) GCCTCCCTCGCGCCATCAGTGATGCACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 424)
11 GCCTTGCCAGCCCGCTCAGAGCTGATACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 425) GCCTCCCTCGCGCCATCAGAGCTGAACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 426)
12 GCCTTGCCAGCCCGCTCAGACTGTATACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 427) GCCTCCCTCGCGCCATCAGACTGTAACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 428)
13 GCCTTGCCAGCCCGCTCAGTGCATGTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 429) GCCTCCCTCGCGCCATCAGTGCATGACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 430)
14 GCCTTGCCAGCCCGCTCAGAGTCTATACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 431) GCCTCCCTCGCGCCATCAGAGTCTAACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 432)
15 GCCTTGCCAGCCCGCTCAGTGTCTGTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 433) GCCTCCCTCGCGCCATCAGTGTCTGACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 434)
16 GCCTTGCCAGCCCGCTCAGGCTAGCTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 435) GCCTCCCTCGCGCCATCAGGCTAGCACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 436)
Access Array IFC의 실행
차단 및 인터페이스 어큐뮬레이터 저장소는 제어 라인 유체(Fluidigm PN 89000020) 300μl로 채우고 H1~H4 시약 웰은 Access Array IFC 로딩 이전에 PCR 등급수 내 0.05% Tween-20 500μl를 이용하여 로딩하였다. 각각의 샘플 혼합물 5μl를 샘플 포트 내로 로딩하고, 각각의 프라이머 혼합물 5μl를 Access Array IFC의 프라이머 주입구 내로 로딩하였다.
Access Array IFC는 열순환하였고 IFC Stand-Alone 열순환기(Fluidigm Corporation)를 사용하여 이미지화하였다. 열순환 프로토콜은 열혼합 단계[50℃에서 2분, 70℃에서 20분], 핫스타트 단계[95℃에서 10분], 35사이클의 PCR 전략[95℃에서 15초 그리고 60℃에서 4분의 2사이클, 95℃에서 15초, 60℃에서 15초 그리고 72℃에서 1분의 33사이클], 및 연장 단계[72℃에서 3분]를 포함한다.
증폭 후, PCR 생성물은 Post-PCR IFC Loader AX를 사용하여 Access Array IFC에서 수확하였다. 수확 전에, 각각의 샘플 포트는 0.05% Tween-20 2μl로 채웠다. 잔여 용액은 H1~H4 시약 웰에서 제거하였고, 1X Access Array 수확 시약(0.05% tween-20) 600μl로 다시 채웠다. 수확 후에, 각각의 샘플 포트는 48가지의 모인 PCR생성물 10μl(± 10%)를 포함한 PCR 생성물 배출구가 되었다. 모인 PCR 생성물은 Access Array IFC에서 제거하여 4℃에서 미세적정 플레이트에 저장하였다.
각각의 샘플에 대한 PCR 생성물은 Agilent Bioanalyzer 추적으로 계산된 농도에 기초하여 모았다. 정제된 생성물 풀은 에멀젼 PCR을 실시하고 제조자의 지침에 따라서 454 FLX 염기서열분석기(Roche Analytical Sciences) 상에서 파이로시퀀싱을 하였다. 에멀젼 PCR 반응은 부착된 A 및 B 프라이머 서열 모두를 포함하는 비드를 이용하여 실행하여, 앰플리콘의 양쪽 가닥에 대하여 서열 판독이 가능하게 하였다.
각각의 샘플에서 각각의 개별적 PCR 생성물에 대하여 계수된 서열의 수를 분석하여 도 15에 나타낸 PCR 생성물이 나타내는 것을 입증하였다. 서열은 에멀젼 A로부터의 태그 5개 서열과 에멀젼 B로부터의 태그 8개 서열을 합함으로써(도 16a) 또는 에멀젼 B로부터의 태그 5개 서열과 에멀젼 A로부터의 태그 8개 서열을 합함으로써 도 15B에 나타낸 각각의 앰플리콘에 대하여 계수될 수 있다. 도 16은 모든 앰플리콘의 표시가 주로 평균 범위의 2x 내지 0.5x에 있다는 것을 나타낸다. 또한, 도 16b에 나타낸 앰플리콘은 샘플 내에서 더 적은 변화를 나타내지만, 각각의 프라이머 쌍에 대한 앰플리콘 모두의 표시는 매우 유사하다.
실시예 6
증폭 생성물의 회수를 허용하는 미세유체 장치를 사용하여 Illumina DNA 염기서열분석을 위한 표적 핵산의 4개 프라이머 바코딩
Illumina Genome Analyzer II에서 사용되는 4개 프라이머 태깅 계획을 위하여 고안된 서열은 표 13 및 14에 나타내었다. 태그 서열은 내부 프라이머 서열이다.
내부 프라이머
태그 서열 표적 특이적 서열(정방향) 올리고뉴클레오티드 서열
ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
(서열번호 437)		 ACTGTCCAGCTTTGTGCC
(서열번호 438)		 ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTACTGTCCAGCTTTGTGCC
(서열번호 439)
ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
(서열번호 440)		 GATCATCATAGGAGTTGCATTGTTG
(서열번호 441)		 ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGATCATCATAGGAGTTGCATTGTTG
(서열번호 442)
태그 서열 표적 특이적 서열(역방향) 올리고뉴클레오티드 서열
CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT
(서열번호 443)		 TCCTCTGCCTAGGCGTT
(서열번호 444)		 CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTTCCTCTGCCTAGGCGTT
(서열번호 445
CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT
(서열번호 446)		 GAAATGTAAATGTGGAGCCAAACA
(서열번호 447)		 CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTGAAATGTAAATGTGGAGCCAAACA
(서열번호 448)
바코드 프라이머 방향
ILMN_PE1sh_F
 정방향 AATGATACGGCGACCAC CGAGATC TACACTCTTTCCCTACACGA
(서열번호 449)
ILMN_PE2sh_R
 역방향 CAAGCAGAAGACGGCATA CGAGATC GGTCTCGGCATTCCTGCTGAAC
(서열번호 450)
Illumina GA II 염기서열분석기에서의 사용을 위하여 고안된 4개 프라이머 전략을 사용한 PCT 생성물의 성공적인 증폭을 도 17에 나타내었다.
실시예 7
454 FLX 염기서열분석기(Roche Analytical Sciences)에서의 티타늄 화학성질을 위한 표적 핵산의 바코딩
표 15는 454 FLX 염기서열분석기(Roche Analytical Sciences)에서의 티타늄 화학성질을 가지고 사용하기 위한 정방향 바코드 서열을 나타낸다. 표 16은 454 FLX 염기서열분석기(Roche Analytical Sciences)에서의 티타늄 화학성질을 가지고 사용하기 위한 역방향 바코드 서열을 나타낸다.
웰 바코드 정방향 올리고 명칭 정방향 올리고 서열 서열번호
A1 TI-MID1 TI-F-MID1-TAG8 CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGACGAGTGCGTACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 451)
B1 TI-MID2 TI-F-MID2-TAG8 CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGACGCTCGACAACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 452)
C1 TI-MID3 TI-F-MID3-TAG8 CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGAGACGCACTCACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 453)
D1 TI-MID67 TI-F-MID67-TAG8 CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGTCGATAGTGAACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 454)
E1 TI-MID5 TI-F-MID5-TAG8 CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGATCAGACACGACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 455)
F1 TI-MID6 TI-F-MID6-TAG8 CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGATATCGCGAGACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 456)
G1 TI-MID7 TI-F-MID7-TAG8 CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGCGTGTCTCTAACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 457)
H1 TI-MID8 TI-F-MID8-TAG8 CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGCTCGCGTGTCACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 458)
A2 TI-MID10 TI-F-MID10-TAG8 CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGTCTCTATGCGACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 459)
B2 TI-MID11 TI-F-MID11-TAG8 CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGTGATACGTCTACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 460)
C2 TI-MID13 TI-F-MID13-TAG8 CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGCATAGTAGTGACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 461)
D2 TI-MID14 TI-F-MID14-TAG8 CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGCGAGAGATACACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 462)
E2 TI-MID15 TI-F-MID15-TAG8 CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGATACGACGTAACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 463)
F2 TI-MID16 TI-F-MID16-TAG8 CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGTCACGTACTAACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 464)
G2 TI-MID17 TI-F-MID17-TAG8 CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGCGTCTAGTACACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 465)
H2 TI-MID18 TI-F-MID18-TAG8 CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGTCTACGTAGCACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 466)
A3 TI-MID19 TI-F-MID19-TAG8 CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGTGTACTACTCACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 467)
B3 TI-MID20 TI-F-MID20-TAG8 CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGACGACTACAGACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 468)
C3 TI-MID21 TI-F-MID21-TAG8 CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGCGTAGACTAGACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 469)
D3 TI-MID22 TI-F-MID22-TAG8 CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGTACGAGTATGACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 470)
E3 TI-MID23 TI-F-MID23-TAG8 CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGTACTCTCGTGACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 471)
F3 TI-MID24 TI-F-MID24-TAG8 CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGTAGAGACGAGACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 472)
G3 TI-MID25 TI-F-MID25-TAG8 CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGTCGTCGCTCGACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 473)
H3 TI-MID26 TI-F-MID26-TAG8 CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGACATACGCGTACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 474)
A4 TI-MID27 TI-F-MID27-TAG8 CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGACGCGAGTATACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 475)
B4 TI-MID28 TI-F-MID28-TAG8 CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGACTACTATGTACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 476)
C4 TI-MID68 TI-F-MID68-TAG8 CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGTCGCTGCGTAACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 477)
D4 TI-MID30 TI-F-MID30-TAG8 CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGAGACTATACTACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 478)
E4 TI-MID31 TI-F-MID31-TAG8 CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGAGCGTCGTCTACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 479)
F4 TI-MID32 TI-F-MID32-TAG8 CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGAGTACGCTATACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 480)
G4 TI-MID33 TI-F-MID33-TAG8 CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGATAGAGTACTACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 481)
H4 TI-MID34 TI-F-MID34-TAG8 CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGCACGCTACGTACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 482)
A5 TI-MID35 TI-F-MID35-TAG8 CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGCAGTAGACGTACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 483)
B5 TI-MID36 TI-F-MID36-TAG8 CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGCGACGTGACTACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 484)
C5 TI-MID37 TI-F-MID37-TAG8 CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGTACACACACTACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 485)
D5 TI-MID38 TI-F-MID38-TAG8 CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGTACACGTGATACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 486)
E5 TI-MID39 TI-F-MID39-TAG8 CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGTACAGATCGTACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 487)
F5 TI-MID40 TI-F-MID40-TAG8 CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGTACGCTGTCTACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 488)
G5 TI-MID69 TI-F-MID69-TAG8 CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGTCTGACGTCAACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 489)
H5 TI-MID42 TI-F-MID42-TAG8 CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGTCGATCACGTACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 490)
A6 TI-MID43 TI-F-MID43-TAG8 CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGTCGCACTAGTACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 491)
B6 TI-MID44 TI-F-MID44-TAG8 CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGTCTAGCGACTACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 492)
C6 TI-MID45 TI-F-MID45-TAG8 CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGTCTATACTATACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 493)
D6 TI-MID46 TI-F-MID46-TAG8 CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGTGACGTATGTACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 494)
E6 TI-MID47 TI-F-MID47-TAG8 CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGTGTGAGTAGTACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 495)
F6 TI-MID48 TI-F-MID48-TAG8 CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGACAGTATATAACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 496)
G6 TI-MID49 TI-F-MID49-TAG8 CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGACGCGATCGAACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 497)
H6 TI-MID50 TI-F-MID50-TAG8 CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGACTAGCAGTAACACTGACGACATGGTTCTACA (서열번호 498)
웰 바코드 역방향 올리고 명칭 역방향 올리고 서열 서열번호
A1 TI-MID1 TI-R-MID1-TAG5 CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGACGAGTGCGTTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 499)
B1 TI-MID2 TI-R-MID2-TAG5 CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGACGCTCGACATACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 500)
C1 TI-MID3 TI-R-MID3-TAG5 CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGAGACGCACTCTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 501)
D1 TI-MID67 TI-R-MID67-TAG5 CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGTCGATAGTGATACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 502)
E1 TI-MID5 TI-R-MID5-TAG5 CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGATCAGACACGTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 503)
F1 TI-MID6 TI-R-MID6-TAG5 CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGATATCGCGAGTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호504)
G1 TI-MID7 TI-R-MID7-TAG5 CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGCGTGTCTCTATACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 505)
H1 TI-MID8 TI-R-MID8-TAG5 CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGCTCGCGTGTCTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 506)
A2 TI-MID10 TI-R-MID10-TAG5 CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGTCTCTATGCGTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 507)
B2 TI-MID11 TI-R-MID11-TAG5 CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGTGATACGTCTTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 508)
C2 TI-MID13 TI-R-MID13-TAG5 CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGCATAGTAGTGTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 509)
D2 TI-MID14 TI-R-MID14-TAG5 CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGCGAGAGATACTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 510)
E2 TI-MID15 TI-R-MID15-TAG5 CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGATACGACGTATACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 511)
F2 TI-MID16 TI-R-MID16-TAG5 CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGTCACGTACTATACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 512)
G2 TI-MID17 TI-R-MID17-TAG5 CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGCGTCTAGTACTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 513)
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A3 TI-MID19 TI-R-MID19-TAG5 CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGTGTACTACTCTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 515)
B3 TI-MID20 TI-R-MID20-TAG5 CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGACGACTACAGTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 516)
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H4 TI-MID34 TI-R-MID34-TAG5 CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGCACGCTACGTTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 530)
A5 TI-MID35 TI-R-MID35-TAG5 CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGCAGTAGACGTTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 531)
B5 TI-MID36 TI-R-MID36-TAG5 CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGCGACGTGACTTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 532)
C5 TI-MID37 TI-R-MID37-TAG5 CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGTACACACACTTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 533)
D5 TI-MID38 TI-R-MID38-TAG5 CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGTACACGTGATTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 534)
E5 TI-MID39 TI-R-MID39-TAG5 CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGTACAGATCGTTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 535)
F5 TI-MID40 TI-R-MID40-TAG5 CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGTACGCTGTCTTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 536)
G5 TI-MID69 TI-R-MID69-TAG5 CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGTCTGACGTCATACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 537)
H5 TI-MID42 TI-R-MID42-TAG5 CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGTCGATCACGTTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 538)
A6 TI-MID43 TI-R-MID43-TAG5 CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGTCGCACTAGTTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 539)
B6 TI-MID44 TI-R-MID44-TAG5 CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGTCTAGCGACTTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 540)
C6 TI-MID45 TI-R-MID45-TAG5 CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGTCTATACTATTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 541)
D6 TI-MID46 TI-R-MID46-TAG5 CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGTGACGTATGTTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 542)
E6 TI-MID47 TI-R-MID47-TAG5 CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGTGTGAGTAGTTACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 543)
F6 TI-MID48 TI-R-MID48-TAG5 CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGACAGTATATATACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 544)
G6 TI-MID49 TI-R-MID49-TAG5 CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGACGCGATCGATACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 545)
H6 TI-MID50 TI-R-MID50-TAG5 CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGACTAGCAGTATACGGTAGCAGAGACTTGGTCT (서열번호 546)
실시예 8
표적 핵산의 복합 바코딩
10개 프라이머의 3개 풀을 표 9에 열거된 프라이머로부터 집합시켰다. PCR 조건은 프라이머 농도를 변화시킨 것을 제외하고 실시예 4에 열거된 것과 동일하였다. 도 18은 PCR 반응을 오직 주형 특이적 프라이머에 대해서 4개 프라이머 방식으로 실행하였을 때 PCR 프라이머의 10개 세트의 3개 풀(A, B, C)의 PCR 반응의 결과를 나타낸다. 4개 프라이머 전략에서 더 높은 분자량 생성물의 존재는 성공적인 4개 프라이머 집합체를 입증한다.
SEQUENCE LISTING <110> FLUIDIGM CORPORATION <120> MULTI-PRIMER AMPLIFICATION METHOD FOR BARCODING OF TARGET NUCLEIC ACIDS <130> FLUDP007WO <140> PCT/US2010/029854 <141> 2010-04-02 <150> 61/305,907 <151> 2010-02-18 <150> 61/186,327 <151> 2009-06-11 <150> 61/166,181 <151> 2009-04-02 <150> 61/166,105 <151> 2009-04-02 <160> 594 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 1 ccatctcatc cctgcgtgtc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 2 cctatcccct gtgtgccttg 20 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 3 ggcggcgacc atctcatccc tgcgtgtc 28 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 4 gcctccctcg cgccatcag 19 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 5 gccttgccag cccgctcag 19 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 6 ggcggcgagc ctccctcgcg ccatcag 27 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 7 acactctttc cctacacga 19 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 8 caagcagaag acggcata 18 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 9 ggcggcgaac actctttccc tacacga 27 <210> 10 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 10 ccactacgcc tccgctttcc tctctatg 28 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 11 ctgccccggg ttcctcattc t 21 <210> 12 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 12 ggcggcgacc actacgcctc cgctttcctc tctatg 36 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 13 ccatctcatc cctgcgtg 18 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 14 cctatcccct gtgtgccttg 20 <210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 15 ggcggcgacc atctcatccc tgcgtg 26 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 16 taatgatacg gcgaccacc 19 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 17 acaagcagaa gacggcatac 20 <210> 18 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 18 ggcggcgata atgatacggc gaccac 26 <210> 19 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 19 gcctccctcg cgccatcagg catgcacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 20 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 20 gcctccctcg cgccatcagc gtacgacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 21 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 21 gcctccctcg cgccatcagg tcagcacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 22 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 22 gcctccctcg cgccatcaga gctgcacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 23 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 23 gcctccctcg cgccatcagt gcatcacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 24 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 24 gcctccctcg cgccatcagc tgatgacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 25 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 25 gcctccctcg cgccatcagg tagtcacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 26 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 26 gcctccctcg cgccatcagg tcgatacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 27 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 27 gcctccctcg cgccatcagg atacgacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 28 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 28 gcctccctcg cgccatcagt gatgcacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 29 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 29 gcctccctcg cgccatcaga gctgaacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 30 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 30 gcctccctcg cgccatcaga ctgtaacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 31 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 31 gcctccctcg cgccatcagt gcatgacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 32 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 32 gcctccctcg cgccatcaga gtctaacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 33 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 33 gcctccctcg cgccatcagt gtctgacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 34 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 34 gcctccctcg cgccatcagg ctagcacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 35 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 35 gcctccctcg cgccatcagg atagcacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 36 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 36 gcctccctcg cgccatcagg ctactacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 37 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 37 gcctccctcg cgccatcagc tatgcacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 38 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 38 gcctccctcg cgccatcagg ctatgacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 39 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 39 gcctccctcg cgccatcagc gtgcaacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 40 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 40 gcctccctcg cgccatcaga tagctacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 41 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 41 gcctccctcg cgccatcagt gtagcacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 42 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 42 gcctccctcg cgccatcagg tgctaacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 43 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 43 gcctccctcg cgccatcagg tcatgacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 44 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 44 gcctccctcg cgccatcaga tcgtgacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 45 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 45 gcctccctcg cgccatcagt gtacgacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 46 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 46 gcctccctcg cgccatcaga gtgtaacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 47 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 47 gcctccctcg cgccatcagt gacagacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 48 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 48 gcctccctcg cgccatcagg atcacacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 49 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 49 gcctccctcg cgccatcagc tagagacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 50 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 50 gcctccctcg cgccatcagc tagtcacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 51 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 51 gcctccctcg cgccatcaga gctagacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 52 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 52 gcctccctcg cgccatcagt gactgacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 53 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 53 gcctccctcg cgccatcagt gatagacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 54 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 54 gcctccctcg cgccatcagc gtatcacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 55 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 55 gcctccctcg cgccatcagg tctgaacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 56 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 56 gcctccctcg cgccatcagc atgacacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 57 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 57 gcctccctcg cgccatcagc gatgaacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 58 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 58 gcctccctcg cgccatcagg ctgatacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 59 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 59 gcctccctcg cgccatcagc agtacacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 60 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 60 gcctccctcg cgccatcagg cgactacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 61 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 61 gcctccctcg cgccatcagg tacgaacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 62 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 62 gcctccctcg cgccatcaga cgctaacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 63 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 63 gcctccctcg cgccatcaga gcatcacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 64 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 64 gcctccctcg cgccatcagg atgctacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 65 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 65 gcctccctcg cgccatcagg tctgcacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 66 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 66 gcctccctcg cgccatcaga tgcgaacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 67 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 67 acactgacga catggttcta caactgtcca gctttgtgcc 40 <210> 68 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 68 acactgacga catggttcta cagatcatca taggagttgc attgttg 47 <210> 69 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 69 acactgacga catggttcta cacggacctt tgtccttcct 40 <210> 70 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 70 acactgacga catggttcta caatgcaaac ctcaatccct cc 42 <210> 71 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 71 acactgacga catggttcta caagtttctt cccatgcacc tg 42 <210> 72 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 72 acactgacga catggttcta cagtgaatcc ccgtctctac taaaa 45 <210> 73 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 73 acactgacga catggttcta catgtttccc atttgcggtt atga 44 <210> 74 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 74 acactgacga catggttcta caagttgtgg gactgcttta tacatt 46 <210> 75 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 75 gccttgccag cccgctcagt cctctgccta ggcgtt 36 <210> 76 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 76 gccttgccag cccgctcagg aaatgtaaat gtggagccaa aca 43 <210> 77 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 77 gccttgccag cccgctcaga ctcattcttg aaaatacctc cgg 43 <210> 78 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 78 gccttgccag cccgctcaga aatgccacct cgatttagga aa 42 <210> 79 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 79 gccttgccag cccgctcagt caccctcccg aatagct 37 <210> 80 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 80 gccttgccag cccgctcaga gtgtaaaatg gtacaaccgc t 41 <210> 81 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 81 gccttgccag cccgctcagc ctcttaagat actgtaaact ctgtaaagc 49 <210> 82 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 82 gccttgccag cccgctcaga ttgtgccatt gtactctagc c 41 <210> 83 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 83 acactgacga catggttcta cacttccttt ctctactgaa tgcttttaat tt 52 <210> 84 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 84 acactgacga catggttcta catcttacac aaactcttca gaaaacaga 49 <210> 85 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 85 acactgacga catggttcta cagtaccaaa accaaacaag gacat 45 <210> 86 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 86 acactgacga catggttcta caggtgaaac gccatctcta ctaa 44 <210> 87 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 87 acactgacga catggttcta catcatgatt gtagctgatt caacattca 49 <210> 88 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 88 acactgacga catggttcta caactagcat gctgaaaccc c 41 <210> 89 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 89 acactgacga catggttcta catcaggaga tcgagaccat cc 42 <210> 90 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 90 acactgacga catggttcta catcatgcct gtaatcccag c 41 <210> 91 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 91 gccttgccag cccgctcaga cctcaaatga tcccctgc 38 <210> 92 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 92 gccttgccag cccgctcaga ttacaggcgt gagccac 37 <210> 93 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 93 gccttgccag cccgctcagt tttgagatga agtcttgctc tgt 43 <210> 94 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 94 gccttgccag cccgctcagt aaagaccagt ctgactatgt tgc 43 <210> 95 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 95 gccttgccag cccgctcaga ccatgcccgg ctaatttt 38 <210> 96 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 96 gccttgccag cccgctcaga gttcacgcca ttctcctg 38 <210> 97 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 97 gccttgccag cccgctcagc actacgcccg gctaatttt 39 <210> 98 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 98 gccttgccag cccgctcagt ggccccatta ggacatgtat 40 <210> 99 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 99 acactgacga catggttcta cattgtccca ttgcactcca g 41 <210> 100 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 100 acactgacga catggttcta catgggcaac aagagtgaaa ct 42 <210> 101 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 101 acactgacga catggttcta caaaataaat atagcagggt tgcaggt 47 <210> 102 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 102 acactgacga catggttcta catgcatttc tcttggctcc c 41 <210> 103 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 103 acactgacga catggttcta caactttcct caactctaca tttccc 46 <210> 104 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 104 acactgacga catggttcta catcagtgca aacaacagaa aagtg 45 <210> 105 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 105 acactgacga catggttcta cacatgtttc ttagcaaatc tgatgaca 48 <210> 106 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 106 acactgacga catggttcta catctgtggt cccagctact 40 <210> 107 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 107 gccttgccag cccgctcagt ttcaccatgt taggttggtc tc 42 <210> 108 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 108 gccttgccag cccgctcagt gtaggttaaa tccaaatact ataccgtc 48 <210> 109 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 109 gccttgccag cccgctcagt ctcaaatctt cagtagcaac taaaatct 48 <210> 110 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 110 gccttgccag cccgctcagt cccgacctca ggtgatc 37 <210> 111 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 111 gccttgccag cccgctcagt ggtcttgaac tcccaacttc 40 <210> 112 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 112 gccttgccag cccgctcagc ctccgactcc caaagtg 37 <210> 113 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 113 gccttgccag cccgctcaga ctacagcctc ggactcc 37 <210> 114 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 114 gccttgccag cccgctcaga tcttgcacga agttatgcaa cta 43 <210> 115 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 115 acactgacga catggttcta caaccactgc actccagc 38 <210> 116 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 116 acactgacga catggttcta caacaaggaa aagtatcaga caatgtaagt 50 <210> 117 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 117 acactgacga catggttcta caacggtagc tcacacctgt aat 43 <210> 118 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 118 acactgacga catggttcta catggaagtc cctctctgat tgt 43 <210> 119 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 119 acactgacga catggttcta caactgactt tctgctcttg tctttc 46 <210> 120 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 120 acactgacga catggttcta caattctggg acagccaagt c 41 <210> 121 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 121 acactgacga catggttcta caaggagttc aagaccagcc t 41 <210> 122 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 122 acactgacga catggttcta catctgtctc cttcctcttc ctac 44 <210> 123 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 123 gccttgccag cccgctcagc ctcttcccca aaagctct 38 <210> 124 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 124 gccttgccag cccgctcagt ctcgaactcc ttacttcagg t 41 <210> 125 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 125 gccttgccag cccgctcagc ccaacaccat gccagtg 37 <210> 126 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 126 gccttgccag cccgctcagt ccccagccct ccag 34 <210> 127 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 127 gccttgccag cccgctcaga ttgaagtctc atggaagcca g 41 <210> 128 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 128 gccttgccag cccgctcagt caagtgatct tcccacctca 40 <210> 129 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 129 gccttgccag cccgctcaga caacctccgt catgtgc 37 <210> 130 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 130 gccttgccag cccgctcaga cccatttact ttgcacatct ca 42 <210> 131 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 131 acactgacga catggttcta cattaagggt ggttgtcagt gg 42 <210> 132 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 132 acactgacga catggttcta cattgcagtg agctgagatc ac 42 <210> 133 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 133 acactgacga catggttcta caatctcctt actgctccca ct 42 <210> 134 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 134 acactgacga catggttcta cattttatca cctttccttg cctctt 46 <210> 135 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 135 acactgacga catggttcta caactcgtcg taagttgaaa atattgtaag t 51 <210> 136 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 136 acactgacga catggttcta catcccaaag tgctgggatt ac 42 <210> 137 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 137 acactgacga catggttcta catccatcct cccagctcag 40 <210> 138 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 138 acactgacga catggttcta caatctcagc tcactgcagc 40 <210> 139 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 139 gccttgccag cccgctcaga gccaacctag gagataacac a 41 <210> 140 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 140 gccttgccag cccgctcaga ggctccatct actcccaa 38 <210> 141 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 141 gccttgccag cccgctcagt tgataagagg tcccaagact tagta 45 <210> 142 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 142 gccttgccag cccgctcagt gggtgacaga gtgagact 38 <210> 143 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 143 gccttgccag cccgctcaga catcactgta atccagcctg 40 <210> 144 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 144 gccttgccag cccgctcaga gatcatgcca ctgcactc 38 <210> 145 <211> 37 <212> DNA <213> 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acactgacga catggttcta cacctcagtg tatccacaga aca 43 <210> 151 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 151 acactgacga catggttcta caatgcatgc ctgtaatccc ag 42 <210> 152 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 152 acactgacga catggttcta caaactcatg ttcaagacag aaggg 45 <210> 153 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 153 acactgacga catggttcta caattttctc taacttcaag gcccatat 48 <210> 154 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 154 acactgacga catggttcta catggatcca ccaagacttg ttttat 46 <210> 155 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 155 gccttgccag cccgctcagg attacaggtg tgagccact 39 <210> 156 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 156 gccttgccag cccgctcaga cagtacctga gttaaaagat ggttc 45 <210> 157 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 157 gccttgccag cccgctcagt gagaccctcc agctctg 37 <210> 158 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 158 gccttgccag cccgctcaga tcttccctta ccccatttta ctttatt 47 <210> 159 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 159 gccttgccag cccgctcagt tcaaagaccc aaaacccaaa atg 43 <210> 160 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 160 gccttgccag cccgctcagg tcaagttcta gaccccatgt aata 44 <210> 161 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 161 gccttgccag cccgctcagt gtggtcccag ctactcc 37 <210> 162 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 162 gccttgccag cccgctcaga gcaaagtttt attgtaaaat aagagatcga t 51 <210> 163 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 163 acactgacga catggttcta ca 22 <210> 164 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 164 tacggtagca gagacttggt ct 22 <210> 165 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 165 tacggtagca gagacttggt ctgcacacgc atattaaaat aggaa 45 <210> 166 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 166 tacggtagca gagacttggt ctttcatctg cagacaggtc ca 42 <210> 167 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 167 tacggtagca gagacttggt ctccagcact ggcttgagac tt 42 <210> 168 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 168 tacggtagca gagacttggt ctaggccaga ggagaatgag g 41 <210> 169 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 169 tacggtagca gagacttggt ctatgaccct gccaaatgac ac 42 <210> 170 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 170 tacggtagca gagacttggt cttggaaact gctctttgtg gtc 43 <210> 171 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 171 tacggtagca gagacttggt cttggtggca ctaatgttcc cta 43 <210> 172 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 172 tacggtagca gagacttggt ctgaggtccg tgtctacaac tgg 43 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Sequence: Synthetic primer <400> 178 tacggtagca gagacttggt ctgcattcga ctcatctcag ca 42 <210> 179 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 179 tacggtagca gagacttggt ctcagcagct cgaatttctt cc 42 <210> 180 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 180 tacggtagca gagacttggt ctcctcttgg cagcaggata gt 42 <210> 181 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 181 tacggtagca gagacttggt ctaactccgg gatctggtca c 41 <210> 182 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 182 tacggtagca gagacttggt ctttctgtta gaaggaatcg ttttcc 46 <210> 183 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 183 tacggtagca gagacttggt ctctcctgac agtccttgca ctt 43 <210> 184 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Sequence: Synthetic primer <400> 189 tacggtagca gagacttggt ctcccaaagg aagtataagc caag 44 <210> 190 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 190 tacggtagca gagacttggt cttccaccta ctgctgtgtc tactg 45 <210> 191 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 191 tacggtagca gagacttggt cttctgatag gtccatctca tcttga 46 <210> 192 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 192 tacggtagca gagacttggt cttggtcatt caggcacttc ag 42 <210> 193 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 193 tacggtagca gagacttggt ctccttcttt cttcagaagc cact 44 <210> 194 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 194 tacggtagca gagacttggt cttgggactt ccttctttgt atgg 44 <210> 195 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 195 tacggtagca gagacttggt ctccagtgct attttgatgt ttatgc 46 <210> 196 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 196 tacggtagca gagacttggt ctttggcaag ctgcagtcac 40 <210> 197 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 197 tacggtagca gagacttggt ctgtactgac tgtcacggag ctg 43 <210> 198 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 198 tacggtagca gagacttggt cttccccgta ttaatgcatg gtat 44 <210> 199 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 199 tacggtagca gagacttggt ctttgttggc tatctggccc ta 42 <210> 200 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 200 tacggtagca gagacttggt ctgtctgttt ggagtctaat ttctgc 46 <210> 201 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 201 tacggtagca gagacttggt ctaatcaatt caccagcttt agcaa 45 <210> 202 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 202 tacggtagca gagacttggt ctggctccct atacttgatt gtgg 44 <210> 203 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 203 tacggtagca gagacttggt ctcgctggtc tacagagtta cttagga 47 <210> 204 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 204 tacggtagca gagacttggt cttgaaggct cttaagaata gcaaatg 47 <210> 205 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 205 tacggtagca gagacttggt ctttccctgt ggatattcaa 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Sequence: Synthetic primer <400> 211 tacggtagca gagacttggt ctcccagccc agaattaagg t 41 <210> 212 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 212 tacggtagca gagacttggt ctgggcacat ggttcactgc 40 <210> 213 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 213 gccttgccag cccgctcagg catgctacgg tagcagagac ttggtct 47 <210> 214 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 214 gcctccctcg cgccatcagg catgcacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 215 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 215 gccttgccag cccgctcagc gtacgtacgg tagcagagac ttggtct 47 <210> 216 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 216 gcctccctcg cgccatcagc gtacgacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 217 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 217 gccttgccag cccgctcagg tcagctacgg tagcagagac ttggtct 47 <210> 218 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 218 gcctccctcg cgccatcagg tcagcacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 219 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 219 gccttgccag cccgctcaga gctgctacgg tagcagagac ttggtct 47 <210> 220 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 220 gcctccctcg cgccatcaga gctgcacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 221 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 221 gccttgccag cccgctcagt gcatctacgg tagcagagac ttggtct 47 <210> 222 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 222 gcctccctcg cgccatcagt gcatcacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 223 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 223 gccttgccag cccgctcagc tgatgtacgg tagcagagac ttggtct 47 <210> 224 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 224 gcctccctcg cgccatcagc tgatgacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 225 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 225 gccttgccag cccgctcagg tagtctacgg tagcagagac ttggtct 47 <210> 226 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 226 gcctccctcg cgccatcagg tagtcacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 227 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 227 gccttgccag cccgctcagg tcgattacgg tagcagagac ttggtct 47 <210> 228 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 228 gcctccctcg cgccatcagg tcgatacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 229 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 229 gccttgccag cccgctcagg atacgtacgg tagcagagac ttggtct 47 <210> 230 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 230 gcctccctcg cgccatcagg atacgacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 231 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 231 gccttgccag cccgctcagt gatgctacgg tagcagagac ttggtct 47 <210> 232 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 232 gcctccctcg cgccatcagt gatgcacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 233 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 233 gccttgccag cccgctcaga gctgatacgg tagcagagac ttggtct 47 <210> 234 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 234 gcctccctcg cgccatcaga gctgaacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 235 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 235 gccttgccag cccgctcaga ctgtatacgg tagcagagac ttggtct 47 <210> 236 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 236 gcctccctcg cgccatcaga ctgtaacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 237 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 237 gccttgccag cccgctcagt gcatgtacgg tagcagagac ttggtct 47 <210> 238 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 238 gcctccctcg cgccatcagt gcatgacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 239 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 239 gccttgccag cccgctcaga gtctatacgg tagcagagac ttggtct 47 <210> 240 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 240 gcctccctcg cgccatcaga gtctaacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 241 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 241 gccttgccag cccgctcagt gtctgtacgg tagcagagac ttggtct 47 <210> 242 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 242 gcctccctcg cgccatcagt gtctgacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 243 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 243 gccttgccag cccgctcagg ctagctacgg tagcagagac ttggtct 47 <210> 244 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 244 gcctccctcg cgccatcagg ctagcacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 245 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 245 gccttgccag cccgctcagg atagctacgg tagcagagac ttggtct 47 <210> 246 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 246 gcctccctcg cgccatcagg atagcacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 247 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 247 gccttgccag cccgctcagg ctacttacgg tagcagagac ttggtct 47 <210> 248 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 248 gcctccctcg cgccatcagg ctactacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 249 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 249 gccttgccag cccgctcagc tatgctacgg tagcagagac ttggtct 47 <210> 250 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 250 gcctccctcg cgccatcagc tatgcacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 251 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 251 gccttgccag cccgctcagg ctatgtacgg tagcagagac ttggtct 47 <210> 252 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 252 gcctccctcg cgccatcagg ctatgacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 253 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 253 gccttgccag cccgctcagc gtgcatacgg tagcagagac ttggtct 47 <210> 254 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 254 gcctccctcg cgccatcagc gtgcaacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 255 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 255 gccttgccag cccgctcaga tagcttacgg tagcagagac ttggtct 47 <210> 256 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 256 gcctccctcg cgccatcaga tagctacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 257 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 257 gccttgccag cccgctcagt gtagctacgg tagcagagac ttggtct 47 <210> 258 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 258 gcctccctcg cgccatcagt gtagcacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 259 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 259 gccttgccag cccgctcagg tgctatacgg tagcagagac ttggtct 47 <210> 260 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 260 gcctccctcg cgccatcagg tgctaacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 261 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 261 gccttgccag cccgctcagg tcatgtacgg tagcagagac ttggtct 47 <210> 262 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 262 gcctccctcg cgccatcagg tcatgacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 263 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 263 gccttgccag cccgctcaga tcgtgtacgg tagcagagac ttggtct 47 <210> 264 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 264 gcctccctcg cgccatcaga tcgtgacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 265 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 265 gccttgccag cccgctcagt gtacgtacgg tagcagagac ttggtct 47 <210> 266 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 266 gcctccctcg cgccatcagt gtacgacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 267 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 267 gccttgccag cccgctcaga gtgtatacgg tagcagagac ttggtct 47 <210> 268 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 268 gcctccctcg cgccatcaga gtgtaacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 269 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 269 gccttgccag cccgctcagt gacagtacgg tagcagagac ttggtct 47 <210> 270 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 270 gcctccctcg cgccatcagt gacagacact 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Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 276 gcctccctcg cgccatcagc tagtcacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 277 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 277 gccttgccag cccgctcaga gctagtacgg tagcagagac ttggtct 47 <210> 278 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 278 gcctccctcg cgccatcaga gctagacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 279 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 279 gccttgccag cccgctcagt gactgtacgg tagcagagac ttggtct 47 <210> 280 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 280 gcctccctcg cgccatcagt gactgacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 281 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 281 gccttgccag cccgctcagt gatagtacgg tagcagagac ttggtct 47 <210> 282 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 282 gcctccctcg cgccatcagt gatagacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 283 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 283 gccttgccag cccgctcagc gtatctacgg tagcagagac ttggtct 47 <210> 284 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 284 gcctccctcg cgccatcagc gtatcacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 285 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 285 gccttgccag cccgctcagg tctgatacgg tagcagagac ttggtct 47 <210> 286 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 286 gcctccctcg cgccatcagg tctgaacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 287 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 287 gccttgccag cccgctcagc atgactacgg tagcagagac ttggtct 47 <210> 288 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 288 gcctccctcg cgccatcagc atgacacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 289 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 289 gccttgccag cccgctcagc gatgatacgg tagcagagac ttggtct 47 <210> 290 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 290 gcctccctcg cgccatcagc gatgaacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 291 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 291 gccttgccag cccgctcagg ctgattacgg tagcagagac ttggtct 47 <210> 292 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 292 gcctccctcg cgccatcagg ctgatacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 293 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 293 gccttgccag cccgctcagc agtactacgg tagcagagac ttggtct 47 <210> 294 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 294 gcctccctcg cgccatcagc agtacacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 295 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 295 gccttgccag cccgctcagg cgacttacgg tagcagagac ttggtct 47 <210> 296 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 296 gcctccctcg cgccatcagg cgactacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 297 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 297 gccttgccag cccgctcagg tacgatacgg tagcagagac ttggtct 47 <210> 298 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 298 gcctccctcg cgccatcagg tacgaacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 299 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 299 gccttgccag cccgctcaga cgctatacgg tagcagagac ttggtct 47 <210> 300 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 300 gcctccctcg cgccatcaga cgctaacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 301 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 301 gccttgccag cccgctcaga gcatctacgg tagcagagac ttggtct 47 <210> 302 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 302 gcctccctcg cgccatcaga gcatcacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 303 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 303 gccttgccag cccgctcagg atgcttacgg tagcagagac ttggtct 47 <210> 304 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 304 gcctccctcg cgccatcagg atgctacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 305 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 305 gccttgccag cccgctcagg tctgctacgg tagcagagac ttggtct 47 <210> 306 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 306 gcctccctcg cgccatcagg tctgcacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 307 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 307 gccttgccag cccgctcaga tgcgatacgg tagcagagac ttggtct 47 <210> 308 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 308 gcctccctcg cgccatcaga tgcgaacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 309 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 309 acactgacga catggttcta cattcttaga ccatccagga ggtg 44 <210> 310 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 310 tacggtagca gagacttggt ctccagcctc tcaccctgta aa 42 <210> 311 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 311 acactgacga catggttcta caagctggaa agagtgctca cc 42 <210> 312 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 312 tacggtagca gagacttggt cttaggagct ggaggcagag at 42 <210> 313 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 313 acactgacga catggttcta cagcgtcatc agtttctcat catt 44 <210> 314 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 314 tacggtagca gagacttggt ctacatgggt ctgaggctgt tc 42 <210> 315 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 315 acactgacga catggttcta caccctggga aatgatccta cc 42 <210> 316 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 316 tacggtagca gagacttggt cttcttacca ggcagtcgct ct 42 <210> 317 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 317 acactgacga catggttcta caccagcgtg tcctctctcc t 41 <210> 318 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 318 tacggtagca gagacttggt ctgacaagga tgcctgacca gt 42 <210> 319 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 319 acactgacga catggttcta cacaaaggag gatggagcct ttc 43 <210> 320 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 320 tacggtagca gagacttggt ctgatgtgtt cctttggagg tgg 43 <210> 321 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 321 acactgacga catggttcta catccaacaa atgtgaacgg aat 43 <210> 322 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 322 tacggtagca gagacttggt ctcaagcaac tgaacctgtg actc 44 <210> 323 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 323 acactgacga catggttcta cagatcaata atcaccctgt tgtttg 46 <210> 324 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 324 tacggtagca gagacttggt ctttccaagg gaacaggaaa tatg 44 <210> 325 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Synthetic primer <400> 330 tacggtagca gagacttggt ctgctataac aacaacctgg agcct 45 <210> 331 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 331 acactgacga catggttcta cagctgacgg gtttcctctt c 41 <210> 332 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 332 tacggtagca gagacttggt ctgacgtgga tagcagcaag g 41 <210> 333 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 333 acactgacga catggttcta cagcatgaac atttttctcc acct 44 <210> 334 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 334 tacggtagca gagacttggt ctttctgttc tccttcactt tccac 45 <210> 335 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 335 acactgacga catggttcta catttctctt tcacttccta cagatgc 47 <210> 336 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 336 tacggtagca gagacttggt ctccacagca gtgtggtcat tc 42 <210> 337 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 337 acactgacga catggttcta catggaatct gtcagcaacc tc 42 <210> 338 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 338 tacggtagca gagacttggt ctcccaggac tggcactca 39 <210> 339 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 339 acactgacga catggttcta cagctgaggt gacccttgtc tc 42 <210> 340 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 340 tacggtagca gagacttggt ctcccaccag accatgagag g 41 <210> 341 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 341 acactgacga catggttcta catcacaatt gccagttaac gtct 44 <210> 342 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 342 tacggtagca gagacttggt ctccacacag caaagcagaa ac 42 <210> 343 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 343 acactgacga catggttcta caccacactg acgtgcctct c 41 <210> 344 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 344 tacggtagca gagacttggt ctccgtatct cccttccctg at 42 <210> 345 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 345 acactgacga catggttcta cacctcacag cagggtcttc tc 42 <210> 346 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 346 tacggtagca gagacttggt ctctgaccta aagccacctc ctt 43 <210> 347 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 347 acactgacga catggttcta cacactgcct catctctcac ca 42 <210> 348 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 348 tacggtagca gagacttggt ctccagcttg gcctcagtac a 41 <210> 349 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 349 acactgacga catggttcta cacatgatcc cactgccttc tt 42 <210> 350 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 350 tacggtagca gagacttggt ctagtgtgga cagacccacc a 41 <210> 351 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 351 acactgacga catggttcta cattccagtg ttctaattgc actgtt 46 <210> 352 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 352 tacggtagca gagacttggt ctgagggact cttcccaatg ga 42 <210> 353 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 353 acactgacga catggttcta cactaatagc ctcaaaatct ctgcac 46 <210> 354 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 354 tacggtagca gagacttggt cttttgttca aatgagtaga cacagc 46 <210> 355 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 355 acactgacga catggttcta cacattccat gggcaacttc tc 42 <210> 356 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 356 tacggtagca gagacttggt ctttctggct tataaggtgt tcataca 47 <210> 357 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 357 acactgacga catggttcta caccttccct catttcctcc tg 42 <210> 358 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 358 tacggtagca gagacttggt cttccagaca agccactcac c 41 <210> 359 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 359 acactgacga catggttcta cacctctgat ttctttccac tttca 45 <210> 360 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 360 tacggtagca gagacttggt ctctaatttg gtggctgcct tt 42 <210> 361 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 361 acactgacga catggttcta catgtcaaca gcacattcga cag 43 <210> 362 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 362 tacggtagca gagacttggt ctggtcctgg gtatcgaaag agt 43 <210> 363 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 363 acactgacga catggttcta catttcttcc agtttgccaa gg 42 <210> 364 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 364 tacggtagca gagacttggt ctaggaaaat caaagtcacc aacc 44 <210> 365 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 365 acactgacga catggttcta cactctcgcc ttgaacctgt tt 42 <210> 366 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 366 tacggtagca gagacttggt ctcagcacag gcccagtctt 40 <210> 367 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 367 acactgacga catggttcta cattccttgg tgccactaac taca 44 <210> 368 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 368 tacggtagca gagacttggt ctgggagaat atgcagtgaa cctc 44 <210> 369 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 369 acactgacga catggttcta catggattca cattaactct atgacca 47 <210> 370 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 370 tacggtagca gagacttggt ctttgcacaa taccagatag aacagac 47 <210> 371 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 371 acactgacga catggttcta catgagcttg ttggaataag gatg 44 <210> 372 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 372 tacggtagca gagacttggt ctcgtctatg gaaattccct gtg 43 <210> 373 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 373 acactgacga catggttcta cagaagctct ttccacccct tc 42 <210> 374 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 374 tacggtagca gagacttggt cttgccagct gttagagatt cct 43 <210> 375 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 375 acactgacga catggttcta catgtccttg taggttttcc caaa 44 <210> 376 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 376 tacggtagca gagacttggt ctccccagca aagcatttta ag 42 <210> 377 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 377 acactgacga catggttcta cagaaaattc cttggatttg tcatg 45 <210> 378 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 378 tacggtagca gagacttggt ctcatgatag gatagaatct tccttacca 49 <210> 379 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 379 acactgacga catggttcta cagttttgtt tttatctccc ctcca 45 <210> 380 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 380 tacggtagca gagacttggt ctttcaaatt gacagatgca acaa 44 <210> 381 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 381 acactgacga catggttcta caggaaccat tgagttatat ccttttg 47 <210> 382 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 382 tacggtagca gagacttggt ctttgttttc ttatacccat cagaagc 47 <210> 383 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 383 acactgacga catggttcta cattggtgga aagaacctct caa 43 <210> 384 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 384 tacggtagca gagacttggt ctcaggtacc atgaaagcca ca 42 <210> 385 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 385 acactgacga catggttcta catgttgcca agctgtattc tgtt 44 <210> 386 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 386 tacggtagca gagacttggt cttttgagct gatgatttaa gacagtg 47 <210> 387 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 387 acactgacga catggttcta caggacccaa agtgctacaa cc 42 <210> 388 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 388 tacggtagca gagacttggt ctcaagaatc gacgacaatc ttaaac 46 <210> 389 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 389 acactgacga catggttcta cagcccatga tagccgtctt ta 42 <210> 390 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 390 tacggtagca gagacttggt ctcaacaatg tcacaaccca ctg 43 <210> 391 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 391 acactgacga catggttcta caccttcatc ttacagatca gtttcct 47 <210> 392 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 392 tacggtagca gagacttggt ctgcttactg gaaaatcgta tttaacaaa 49 <210> 393 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 393 acactgacga catggttcta caacgcagtg ctaaccaagt tct 43 <210> 394 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 394 tacggtagca gagacttggt cttccacaag gggaaagtgt aaa 43 <210> 395 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 395 acactgacga catggttcta catgtctcca ccactggatt tct 43 <210> 396 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 396 tacggtagca gagacttggt ctggcttaca gctagtttgc cagt 44 <210> 397 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 397 acactgacga catggttcta catgcttttc taactctctt tgactgc 47 <210> 398 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 398 tacggtagca gagacttggt cttcctcctt gtcacttaat ttgga 45 <210> 399 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 399 acactgacga catggttcta cattctattt cagccacggg taa 43 <210> 400 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 400 tacggtagca gagacttggt ctagaggaga aactcagaga taaccaa 47 <210> 401 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 401 acactgacga catggttcta cactcacctc atctgtcctg tttct 45 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Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 407 gccttgccag cccgctcagc gtacgtacgg tagcagagac ttggtct 47 <210> 408 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 408 gcctccctcg cgccatcagc gtacgacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 409 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 409 gccttgccag cccgctcagg tcagctacgg tagcagagac ttggtct 47 <210> 410 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 410 gcctccctcg cgccatcagg tcagcacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 411 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 411 gccttgccag cccgctcaga gctgctacgg tagcagagac ttggtct 47 <210> 412 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 412 gcctccctcg cgccatcaga 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 418 gcctccctcg cgccatcagg tagtcacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 419 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 419 gccttgccag cccgctcagg tcgattacgg tagcagagac ttggtct 47 <210> 420 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 420 gcctccctcg cgccatcagg tcgatacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 421 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 421 gccttgccag cccgctcagg atacgtacgg tagcagagac ttggtct 47 <210> 422 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 422 gcctccctcg cgccatcagg atacgacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 423 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 423 gccttgccag cccgctcagt gatgctacgg tagcagagac ttggtct 47 <210> 424 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 424 gcctccctcg cgccatcagt gatgcacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 425 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 425 gccttgccag cccgctcaga gctgatacgg tagcagagac ttggtct 47 <210> 426 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 426 gcctccctcg cgccatcaga gctgaacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 427 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 427 gccttgccag cccgctcaga ctgtatacgg tagcagagac ttggtct 47 <210> 428 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 428 gcctccctcg cgccatcaga ctgtaacact gacgacatgg 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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 434 gcctccctcg cgccatcagt gtctgacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 435 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 435 gccttgccag cccgctcagg ctagctacgg tagcagagac ttggtct 47 <210> 436 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 436 gcctccctcg cgccatcagg ctagcacact gacgacatgg ttctaca 47 <210> 437 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 437 acactctttc cctacacgac gctcttccga tct 33 <210> 438 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 438 actgtccagc tttgtgcc 18 <210> 439 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 439 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctactgtcc 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ctcggcattc ctgctgaacc gctcttccga tcttcctctg cctaggcgtt 50 <210> 446 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 446 ctcggcattc ctgctgaacc gctcttccga tct 33 <210> 447 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 447 gaaatgtaaa tgtggagcca aaca 24 <210> 448 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 448 ctcggcattc ctgctgaacc gctcttccga tctgaaatgt aaatgtggag ccaaaca 57 <210> 449 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 449 aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acga 44 <210> 450 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 450 caagcagaag acggcatacg agatcggtct cggcattcct gctgaac 47 <210> 451 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 451 cgtatcgcct ccctcgcgcc atcagacgag tgcgtacact gacgacatgg ttctaca 57 <210> 452 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 452 cgtatcgcct ccctcgcgcc atcagacgct cgacaacact gacgacatgg ttctaca 57 <210> 453 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 453 cgtatcgcct ccctcgcgcc atcagagacg cactcacact gacgacatgg ttctaca 57 <210> 454 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 454 cgtatcgcct ccctcgcgcc atcagtcgat agtgaacact gacgacatgg ttctaca 57 <210> 455 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 455 cgtatcgcct ccctcgcgcc atcagatcag acacgacact gacgacatgg ttctaca 57 <210> 456 <211> 57 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ttctaca 57 <210> 461 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 461 cgtatcgcct ccctcgcgcc atcagcatag tagtgacact gacgacatgg ttctaca 57 <210> 462 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 462 cgtatcgcct ccctcgcgcc atcagcgaga gatacacact gacgacatgg ttctaca 57 <210> 463 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 463 cgtatcgcct ccctcgcgcc atcagatacg acgtaacact gacgacatgg ttctaca 57 <210> 464 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 464 cgtatcgcct ccctcgcgcc atcagtcacg tactaacact gacgacatgg ttctaca 57 <210> 465 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 465 cgtatcgcct ccctcgcgcc 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470 cgtatcgcct ccctcgcgcc atcagtacga gtatgacact gacgacatgg ttctaca 57 <210> 471 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 471 cgtatcgcct ccctcgcgcc atcagtactc tcgtgacact gacgacatgg ttctaca 57 <210> 472 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 472 cgtatcgcct ccctcgcgcc atcagtagag acgagacact gacgacatgg ttctaca 57 <210> 473 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 473 cgtatcgcct ccctcgcgcc atcagtcgtc gctcgacact gacgacatgg ttctaca 57 <210> 474 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 474 cgtatcgcct ccctcgcgcc atcagacata cgcgtacact gacgacatgg ttctaca 57 <210> 475 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 475 cgtatcgcct ccctcgcgcc atcagacgcg agtatacact gacgacatgg ttctaca 57 <210> 476 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 476 cgtatcgcct ccctcgcgcc atcagactac tatgtacact gacgacatgg ttctaca 57 <210> 477 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 477 cgtatcgcct ccctcgcgcc atcagtcgct gcgtaacact gacgacatgg ttctaca 57 <210> 478 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 478 cgtatcgcct ccctcgcgcc atcagagact atactacact gacgacatgg ttctaca 57 <210> 479 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 479 cgtatcgcct ccctcgcgcc atcagagcgt cgtctacact gacgacatgg ttctaca 57 <210> 480 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 480 cgtatcgcct ccctcgcgcc atcagagtac gctatacact gacgacatgg ttctaca 57 <210> 481 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 481 cgtatcgcct ccctcgcgcc atcagataga gtactacact gacgacatgg ttctaca 57 <210> 482 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 482 cgtatcgcct ccctcgcgcc atcagcacgc tacgtacact gacgacatgg ttctaca 57 <210> 483 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 483 cgtatcgcct ccctcgcgcc atcagcagta gacgtacact gacgacatgg ttctaca 57 <210> 484 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 484 cgtatcgcct ccctcgcgcc atcagcgacg tgactacact gacgacatgg ttctaca 57 <210> 485 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence 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oligonucleotide <400> 509 ctatgcgcct tgccagcccg ctcagcatag tagtgtacgg tagcagagac ttggtct 57 <210> 510 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 510 ctatgcgcct tgccagcccg ctcagcgaga gatactacgg tagcagagac ttggtct 57 <210> 511 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 511 ctatgcgcct tgccagcccg ctcagatacg acgtatacgg tagcagagac ttggtct 57 <210> 512 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 512 ctatgcgcct tgccagcccg ctcagtcacg tactatacgg tagcagagac ttggtct 57 <210> 513 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 513 ctatgcgcct tgccagcccg ctcagcgtct agtactacgg tagcagagac ttggtct 57 <210> 514 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 514 ctatgcgcct tgccagcccg ctcagtctac gtagctacgg tagcagagac ttggtct 57 <210> 515 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 515 ctatgcgcct tgccagcccg ctcagtgtac tactctacgg tagcagagac ttggtct 57 <210> 516 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 516 ctatgcgcct tgccagcccg ctcagacgac tacagtacgg tagcagagac ttggtct 57 <210> 517 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 517 ctatgcgcct tgccagcccg ctcagcgtag actagtacgg tagcagagac ttggtct 57 <210> 518 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 518 ctatgcgcct tgccagcccg ctcagtacga gtatgtacgg tagcagagac ttggtct 57 <210> 519 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence 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oligonucleotide <400> 543 ctatgcgcct tgccagcccg ctcagtgtga gtagttacgg tagcagagac ttggtct 57 <210> 544 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 544 ctatgcgcct tgccagcccg ctcagacagt atatatacgg tagcagagac ttggtct 57 <210> 545 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 545 ctatgcgcct tgccagcccg ctcagacgcg atcgatacgg tagcagagac ttggtct 57 <210> 546 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 546 ctatgcgcct tgccagcccg ctcagactag cagtatacgg tagcagagac ttggtct 57 <210> 547 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 547 acactgacga catggttcta cagtggttgc cctctccagt a 41 <210> 548 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 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Claims (95)

  1. 각각의 표적 핵산에 대한 증폭 혼합물을 미세유체 장치에서 제조하는 단계;
    각각의 증폭 혼합물을 증폭하여 다수의 표적 뉴클레오티드 서열을 생성하는 단계; 및
    표적 뉴클레오티드 서열을 태깅하여, 표적 뉴클레오티드 서열의 측면에 위치하는 제1 또는 제2 뉴클레오티드 태그를 각각 포함하는 다수의 표적 앰플리콘을 생성하는 단계
    를 포함하는, 다수의 샘플에서 다수의 표적 핵산을 증폭시키는 방법으로서,
    미세유체 장치는 적어도 부분적으로 엘라스토머 물질로 제작되고;
    미세유체 장치는
    각각 한쪽 말단에 제1 주입구를 포함하는 다수의 제1 주입 라인,
    각각 한쪽 말단에 제2 주입구를 포함하는 다수의 제2 주입 라인,
    각각의 제2 주입 라인의 다른 말단과 각각 유체 연통하고, 수확 시약 주입구를 각각 포함하는 다수의 수확 시약 주입 라인,
    다수의 제1 주입 라인 중 하나와 각각 유체 연통하는 다수의 제1 챔버 세트,
    다수의 제2 주입 라인 중 하나 및 다수의 수확 시약 주입 라인 중 하나와 각각 유체 연통하는 다수의 제2 챔버 세트,
    제2 주입구와 제2 챔버 세트 사이의 다수의 제2 주입 라인 중 하나에 각각 배치되는 다수의 제1 확장 펌핑용 인접 밸브 세트, 및
    다수의 수확 시약 주입 라인 중 하나에 각각 배치되는 다수의 제2 확장 펌핑용 인접 밸브 세트
    를 포함하고;
    미세유체 장치는 확장 펌핑에 의해 반응 생성물의 풀(pool)의 회수를 가능하게 하고, 미세유체 장치에서 회수된 각각의 풀의 부피 또는 복제 수에 대한 변동성은 10% 미만이고;
    각각의 상기 증폭 혼합물은
    표적 특이적 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및
    표적 특이적 서열을 포함하는 역방향 프라이머
    를 포함하고;
    표적 앰플리콘은 DNA 서열분석 라이브러리를 포함하고, 다수의 표적 앰플리콘의 자동화된 서열분석을 수행하는 것은 서열분석 데이터를 얻게하고, 표적 앰플리콘의 적어도 50%는 표적 앰플리콘의 평균 복제 수의 50% 초과, 표적 앰플리콘의 평균 복제 수의 2배 미만으로 존재하는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 표적 앰플리콘의 적어도 70%는 표적 앰플리콘의 평균 복제 수의 50% 초과, 표적 앰플리콘의 평균 복제 수의 2배 미만으로 존재하는 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 표적 앰플리콘의 평균 길이는 적어도 25개 염기인 것인 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 표적 앰플리콘의 평균 길이는 적어도 50개 염기인 것인 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 표적 앰플리콘의 평균 길이는 적어도 100개 염기인 것인 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 표적 앰플리콘의 평균 길이는 적어도 200개 염기인 것인 방법.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 표적 앰플리콘의 평균 길이는 적어도 1킬로베이스인 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 표적 앰플리콘의 적어도 90%는 표적 앰플리콘의 평균 복제 수의 50% 초과, 표적 앰플리콘의 평균 복제 수의 2배 미만으로 존재하는 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 증폭 혼합물의 부피는 1피코리터 내지 50나노리터의 범위인 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 증폭 혼합물의 부피는 5피코리터 내지 25나노리터 범위인 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 증폭은 중합효소 연쇄 반응(PCR)으로 실행되는 것인 방법.
  12. 제1항, 제2항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 추가적으로 증폭 혼합물에서 표적 앰플리콘을 회수하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 추가적으로 적어도 하나의 표적 앰플리콘을 제1 및 제2 뉴클레오티드 태그에 특이적인 프라이머를 사용하여 증폭시켜 바코드 뉴클레오티드 서열이 없는 표적 앰플리콘을 생성하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 표적 핵산은 유전체 DNA를 포함하는 것인 방법.
  15. 제1항에 있어서, 제1 및 제2 뉴클레오티드 태그는 DNA 서열분석 프라이머에 의해 결합될 수 있는 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 추가적으로 적어도 하나의 표적 앰플리콘을 DNA 서열분석하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  17. 제1항에 있어서, 추가적으로 증폭 혼합물에서 표적 앰플리콘의 양을 정량화하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 정량화하는 단계는 표적 앰플리콘을 회수하는 단계 및 표적 앰플리콘을 디지털 증폭시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 디지털 증폭시키는 단계는
    별개의 반응 혼합물 내로 사전 증폭된 표적 앰플리콘을 분배하는 단계로서, 각각의 반응 혼합물은 평균적으로 반응 혼합물 당 하나 이하의 앰플리콘을 포함하는 것인 단계; 및
    반응 혼합물을 증폭시키는 단계;
    를 포함하는 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 디지털 증폭은 실시간 PCR을 포함하는 것인 방법.
  21. 제19항에 있어서, 상기 디지털 증폭은 종말점 PCR을 포함하는 것인 방법.
  22. 제19항에 있어서, 증폭 혼합물은 증폭 전에 미세유체 장치의 별도의 구획 내에서 형성되거나 또는 별도의 구획 내로 분배되는 것인 방법.
  23. 제1항에 있어서, 표적 앰플리콘의 존재는 정량적 실시간 중합효소 연쇄반응(qPCR)으로 측정되는 것인 방법.
  24. 제1항에 있어서, 보편적 qPCR 프로브가 증폭 혼합물에서 표적 앰플리콘을 검출하는데 이용되는 것인 방법.
  25. 제1항에 있어서, 하나 이상의 표적 특이적 qPCR 프로브가 증폭 혼합물에서 표적 앰플리콘을 검출하는데 이용되는 것인 방법.
  26. 제1항에 있어서, 표적 앰플리콘의 존재는 형광성 뉴클레아제 분석을 사용하여 검출되는 것인 방법.
  27. 제1항에 있어서, 표적 앰플리콘의 존재는 이중 표지화 형광성 가수분해 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 검출되는 것인 방법.
  28. 제1항에 있어서, 추가적으로 각각의 샘플에 존재하는 각각의 표적 핵산의 양을 측정하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  29. 제1항에 있어서, 방법은 각각의 샘플 내 표적 핵산의 복제 수를 측정하는 것에 실행되는 것인 방법.
  30. 제1항에 있어서, 방법은 표적 핵산에 해당하는 좌위에서 유전자형을 측정하는 것에 실행되는 것인 방법.
  31. 제1항에 있어서, 방법은 표적 핵산의 발현 수준을 측정하는 것에 실행되는 것인 방법.
  32. 제1항, 제2항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 서열분석을 위하여 표적 핵산을 제조하도록 실행되는 것인 방법.
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