JP7175326B2 - 標的核酸増幅方法及び標的核酸増幅用組成物 - Google Patents
標的核酸増幅方法及び標的核酸増幅用組成物 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7175326B2 JP7175326B2 JP2020549530A JP2020549530A JP7175326B2 JP 7175326 B2 JP7175326 B2 JP 7175326B2 JP 2020549530 A JP2020549530 A JP 2020549530A JP 2020549530 A JP2020549530 A JP 2020549530A JP 7175326 B2 JP7175326 B2 JP 7175326B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- target nucleic
- primer
- target
- surrogate
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
- C12Q2525/10—Modifications characterised by
- C12Q2525/107—Modifications characterised by incorporating a peptide nucleic acid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
- C12Q2525/10—Modifications characterised by
- C12Q2525/113—Modifications characterised by incorporating modified backbone
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
- C12Q2525/10—Modifications characterised by
- C12Q2525/179—Modifications characterised by incorporating arbitrary or random nucleotide sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
- C12Q2525/10—Modifications characterised by
- C12Q2525/186—Modifications characterised by incorporating a non-extendable or blocking moiety
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
- C12Q2525/10—Modifications characterised by
- C12Q2525/197—Modifications characterised by incorporating a spacer/coupling moiety
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
- C12Q2525/10—Modifications characterised by
- C12Q2525/204—Modifications characterised by specific length of the oligonucleotides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2531/00—Reactions of nucleic acids characterised by
- C12Q2531/10—Reactions of nucleic acids characterised by the purpose being amplify/increase the copy number of target nucleic acid
- C12Q2531/113—PCR
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
- C12Q2563/107—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties fluorescence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
- C12Q2563/173—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties staining/intercalating agent, e.g. ethidium bromide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
- C12Q2565/10—Detection mode being characterised by the assay principle
- C12Q2565/101—Interaction between at least two labels
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
- C12Q2565/10—Detection mode being characterised by the assay principle
- C12Q2565/101—Interaction between at least two labels
- C12Q2565/1015—Interaction between at least two labels labels being on the same oligonucleotide
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
1)‘標的核酸増幅段階’であり、前記探索プライマーと補助プライマーが対をなして主な合成反応を導く段階;及び
2)‘融合増幅産物増幅段階’であり、前記探索プライマー及び代理標的、増幅プライマーが作用して融合増幅産物が主に増幅されるように誘導する段階。
1.1 プライマー、代理標的及びプローブの作製
ヒトEGFR遺伝子は体内信号伝達体系において機能する膜タンパク質及び受容体タンパク質を暗号化しており、EGFR遺伝子に突然変異が起きると癌につながることがあると知られている(Zhang,H.et al.,J.Clin.Invest.2007.117:2051-2058)。
約10,000個(copy)の標的核酸が存在する条件で前記意図した融合増幅産物を形成するように、1.5pmoleの探索プライマー1と30pmoleの増幅プライマー1、10fmoleの代理標的1、2pmoleのプローブ1を含む重合酵素連鎖反応(PCR)用組成物を製造した。前記重合酵素連鎖反応用組成物には、一般に重合酵素連鎖反応に用いられる核酸重合酵素(DNA polymerase)に加えて、バッファー(buffer)、デオキシリボヌクレオチド-5-トリホスフェート(dNTP)、ポタシウムクロリド(KCl)、マグネシウムクロリド(MgCl2)、界面活性剤(detergent)などの要素が含まれた。
2.1 補助プライマー合成
上述したヒトEGFR遺伝子を本発明の標的核酸増幅方法によって高敏感度で検出するために、前記探索プライマー1、代理標的1、増幅プライマー1、プローブ1に加えて、EGFR遺伝子に特異的に混成化し得る補助プライマー1を設計及び製造した(Integrated DNA Technologies,Inc.,USA)。各プライマー、代理標的及びプローブの塩基配列を表3及び表4に開示する。
約10~10,000個(copy)の標的核酸が存在する条件で前記意図した融合増幅産物を形成するように、1.5pmoleの探索プライマー1と30pmoleの増幅プライマー1、0.5pmoleの補助プライマー1、10fmoleの代理標的1、2pmoleのプローブ1を含む重合酵素連鎖反応(PCR)用組成物を製造した。前記重合酵素連鎖反応用組成物には、一般に重合酵素連鎖反応に使用される核酸重合酵素に加えて、バッファー(buffer)、デオキシリボヌクレオチド-5-トリホスフェート(dNTP)、ポタシウムクロリド(KCl)、マグネシウムクロリド(MgCl2)、界面活性剤(detergent)などの要素が含まれた。
3.1 プライマー、代理標的及びプローブの作製
上述したヒトEGFR遺伝子を様々な形態の代理標的を用いて効果的に増幅し検出するために、EGFR遺伝子のexon 20、codon 790の近隣部位に特異的に混成化し得る探索プライマー2、代理標的1、代理標的2、代理標的3、補助プライマー1を設計し、また、前記代理標的1又は2に混成化可能であり、前記代理標的3の一部の塩基配列と同じ塩基配列の増幅プライマー1を設計して製造した(Integrated DNA Technologies,Inc.,USA)。また、設計されたプライマー及び代理標的を用いて生成及び増幅される融合増幅産物を検出できるようにプローブ2を設計して製造した(PANAGENE Inc.,South Korea)。各プライマー、代理標的及びプローブの塩基配列を表5及び表6に開示する。
約100個(copy)の標的核酸が存在する条件で前記意図した融合増幅産物を形成するように、1.5pmoleの探索プライマー2と30pmoleの増幅プライマー1、4pmoleのプローブ2を含む重合酵素連鎖反応(PCR)用組成物を製造し、追加として代理標的1、代理標的2、代理標的3の中から一つを選択して10fmoleを注入するか、或いは代理標的2と3を10fmoleずつ共に注入した。前記重合酵素連鎖反応用組成物には、一般に重合酵素連鎖反応に使用される核酸重合酵素(DNA polymerase)に加えて、バッファー(buffer)、デオキシリボヌクレオチド-5-トリホスフェート(dNTP)、ポタシウムクロリド(KCl)、マグネシウムクロリド(MgCl2)、界面活性剤(detergent)などの要素が含まれた。
4.1 プライマー、代理標的及びプローブの作製
ヒトHRAS遺伝子は細胞内信号伝達体系に関与するタンパク質を暗号化し、HRAS遺伝子のコドン(codon)12、13、61に該当する部位の突然変異(mutation)は様々な癌発生と関連していると知られている(Rajasekharan,S.K.and Raman,T.Cent.Eur.J.Biol.2013.8:609-624)。
約25ngの抽出されたヒト遺伝体DNAが存在する条件で前記意図した融合増幅産物を形成するように、1.5pmoleの探索プライマー3と30pmoleの増幅プライマー2、0.5pmoleの補助プライマー2、10fmoleの代理標的4、4pmoleのプローブ3を含む重合酵素連鎖反応用組成物を製造した。前記重合酵素連鎖反応用組成物には、一般に重合酵素連鎖反応に使用される核酸重合酵素に加えて、バッファー(buffer)、デオキシリボヌクレオチド-5-トリホスフェート(dNTP)、ポタシウムクロリド(KCl)、マグネシウムクロリド(MgCl2)、界面活性剤(detergent)などの要素が含まれた。
5.1 プライマー、代理標的及びプローブの作製
グアニン/シトシンの割合(G/C content)が高いため通常の重合酵素連鎖反応(PCR)方法では増幅及び検出がし難いヒトHRAS遺伝子のexon 2のcodon12、13部位を、本発明の新規な標的核酸増幅方法を用いて効果的に増幅し検出するために、HRAS遺伝子に特異的に混成化し得る探索プライマー3、代理標的5、代理標的6、補助プライマー2を設計し、また前記代理標的5及び代理標的6に混成化し得る増幅プライマー1を設計して製造した(Integrated DNA Technologies,Inc.,USA)。また、設計されたプライマー及び代理標的を用いて生成及び増幅される融合増幅産物を検出できるようにプローブ3を設計して製造した(PANAGENE Inc.,South Korea)。各プライマー、代理標的及びプローブの塩基配列を、表10及び表11に開示する。
約25ngの抽出されたヒト遺伝体DNAが存在する条件で前記意図した融合増幅産物を形成するように、1.5pmoleの探索プライマー3と30pmoleの増幅プライマー1、0.5pmoleの補助プライマー2、50fmoleの代理標的5又は代理標的6、4pmoleのプローブ3を含む重合酵素連鎖反応用組成物を製造した。前記重合酵素連鎖反応用組成物には、一般に重合酵素連鎖反応に使用される核酸重合酵素に加えて、バッファー(buffer)、デオキシリボヌクレオチド-5-トリホスフェート(dNTP)、ポタシウムクロリド(KCl)、マグネシウムクロリド(MgCl2)、界面活性剤(detergent)などの要素が含まれた。
6.1 プライマー、代理標的及びプローブの作製
上述したヒトEGFR遺伝子を本発明の標的核酸増幅方法を用いて検出するものの、増幅効率への影響を最小化しながら敏感度を任意に調整するために、EGFR遺伝子に特異的に混成化し得る探索プライマー4、代理標的7、補助プライマー1に加えて、前記代理標的7に特異的に混成化し得る増幅プライマー3、及び前記代理標的7の塩基配列の一部を含んで生成される融合増幅産物に特異的に混成化し得るプローブ2を設計及び製造した(プライマー及び代理標的メーカー:Integrated DNA Technologies,Inc.,USA、プローブメーカー:PANAGENE Inc.,South Korea)。各プライマー、代理標的及びプローブの塩基配列を表13及び表14に開示する。
約1,000,000個(copy)の標的核酸が存在する条件で前記意図した融合増幅産物を形成するものの、Ct値に代表される標的核酸検出敏感度が調整されるように、1.5pmoleの探索プライマー4と30pmoleの増幅プライマー3、0.5pmoleの補助プライマー1、4pmoleのプローブ2を含む重合酵素連鎖反応(PCR)用組成物に0.01~10fmoleのそれぞれ異なる量の代理標的7が注入されるように製造した。すなわち、本来には10fmoleの量で注入された前記代理標的7を、1倍、0.1倍、0.01倍、0.001倍に希釈してそれぞれ10fmole、1fmole、0.1fmole、0.01fmoleが注入されるように製造した。前記重合酵素連鎖反応用組成物には、一般に重合酵素連鎖反応に使用される核酸重合酵素に加えて、バッファー(buffer)、デオキシリボヌクレオチド-5-トリホスフェート(dNTP)、ポタシウムクロリド(KCl)、マグネシウムクロリド(MgCl2)、界面活性剤(detergent)などの要素が含まれた。
7.1プライマー、代理標的及びプローブの作製
上述したヒトEGFR遺伝子とHRAS遺伝子を効果的に同時増幅及び検出するために、EGFR遺伝子のexon 20、codon 790の近隣部位に特異的に混成化し得る探索プライマー2、代理標的2、代理標的3、補助プライマー1を設計し、また前記代理標的2に混成化可能であり、代理標的3の一部の塩基配列と同じ塩基配列の増幅プライマー1を設計して製造した(Integrated DNA Technologies,Inc.,USA)。また、設計されたプライマー及び代理標的によって生成及び増幅される融合増幅産物を検出できるようにプローブ2を設計して製造した(PANAGENE Inc.,South Korea)。そして、HRAS遺伝子のexon 2のcodon 12、13部位に特異的に混成化し得る探索プライマー5、代理標的8、代理標的9、補助プライマー2を設計し、また前記代理標的8に混成化可能であり、代理標的9の一部の塩基配列と同じ塩基配列の増幅プライマー1を設計して製造した(Integrated DNA Technologies,Inc.,USA)。また、設計されたプライマー及び代理標的によって生成及び増幅される融合増幅産物を検出できるようにプローブ3を設計して製造した(PANAGENE Inc.,South Korea)。各プライマー、代理標的及びプローブの塩基配列を表15及び表16に開示する。
約1,000,000個(copy)のヒトEGFR遺伝子標的と10個、100個、1,000個、10,000個、又は100,000個のヒトHRAS遺伝子標的を混合したり、或いは約1,000,000個のヒトHRAS遺伝子標的と10個、100個、1,000個、10,000個、又は100,000個のヒトHRAS標的を混合した条件で前記意図した融合増幅産物の形成を用いてEGFR遺伝子標的とHRAS遺伝子標的を同時検出できるように、1.5pmoleの探索プライマー2、1.5pmoleの探索プライマー5、30pmoleの増幅プライマー1、0.5pmoleの補助プライマー1、0.5pmoleの補助プライマー2、10fmoleの代理標的2、10fmoleの代理標的3、10fmoleの代理標的8、10fmoleの代理標的9、4pmoleのプローブ2、4pmoleのプローブ3を含む重合酵素連鎖反応用組成物を製造した。前記重合酵素連鎖反応用組成物には、一般に重合酵素連鎖反応に使用される核酸重合酵素に加えて、バッファー(buffer)、デオキシリボヌクレオチド-5-トリホスフェート(dNTP)、ポタシウムクロリド(KCl)、マグネシウムクロリド(MgCl2)、界面活性剤(detergent)などの要素が含まれた。
Claims (19)
- (a)検体試料から核酸を分離する段階;
(b)i)標的核酸と混成化(hybridization)できる1個以上の探索プライマー(primer);ii)前記探索プライマーが結合しない標的核酸部位と結合する配列及び標的核酸に結合しない任意の配列を含む1個以上の代理標的(surrogate target);及びiii)前記代理標的が増幅できる1個以上の増幅プライマー;を注入して重合酵素連鎖反応(PCR)を行う段階;及び
(c)融合増幅産物の存在有無を判別する段階;を含み、
ここで、
前記探索プライマーは前記標的核酸のいずれかの一鎖に相補的であり、
前記代理標的は、その一部が前記探索プライマーと相補的な前記標的核酸と同じ鎖または反対鎖に相補的であり、別の一部が前記標的核酸と相補的でない任意の配列を有し、
前記代理標的の5'側の一部が前記探索プライマーと相補的な前記標的核酸と同じ鎖に相補的でありながら、3'側の一部が前記標的核酸と相補的でない任意の配列を有する、又は前記代理標的の3'側の一部が前記探索プライマーと相補的な標的核酸の反対鎖に相補的でありながら、5'側の一部が前記標的核酸と相補的でない任意の配列を有し、前記代理標的の長さは20~150個の塩基配列長を持って、
前記探索プライマーが混成化する前記標的核酸と同じ鎖または反対鎖に混成化し、
前記探索プライマーが結合しない前記標的核酸部位に結合するものであり、
前記探索プライマーが結合しない前記標的核酸部位は、前記探索プライマーのダウンストリーム(downstream)に存在し、前記探索プライマーのダウンストリームは、前記探索プライマーが前記標的核酸と結合した後、PCRによって伸張(extension)される方向であり、
前記増幅プライマーは、前記代理標的が前記探索プライマーが混成化する前記標的核酸と同じ鎖に混成化する場合には前記代理標的の前記標的核酸と相補的でない任意の配列の一部に相補的である、または、前記代理標的が前記探索プライマーが混成化する前記標的核酸と反対の鎖に混成化する場合には、前記代理標的の前記標的核酸と相補的でない任意の配列の一部と同じであり、探索プライマーと比較して増幅プライマーの量が多く、探索プライマーと増幅プライマーが対になってPCRが行われることを特徴とする標的核酸増幅方法。 - 前記代理標的は、3’末端に核酸重合が抑制される官能基又は塩基をさらに含むことを特徴とする、請求項1に記載の標的核酸増幅方法。
- 前記核酸重合が抑制される官能基又は塩基は、アミン基(amine group)、リン酸基(phosphate group)、アルキル基(alkyl group)、アルカンジオール(alkane-diol)、ホスホロチオエート(phophorothioate)、ビオチン(biotin)、非塩基性リンカー(non-nucleotide linker)、C3~18スぺーサー(C3-18 spacer)、ジデオキシヌクレオチドトリホスフェート(di-deoxynucleotide triphosphate,ddNTP)、逆方向デオキシヌクレオチドトリホスフェート(inverted deoxynucleotide triphosphate,inverted dNTP)、及び逆方向ジデオキシヌクレオチドトリホスフェート(inverted di-deoxynucleotide triphosphate,inverted ddNTP)から構成された群から選ばれる1種以上であることを特徴とする、請求項2に記載の標的核酸増幅方法。
- 前記探索プライマー、代理標的及び増幅プライマーは、オリゴヌクレオチド(oligonucleotide)、LNA(locked nucleic acid)及びPNA(peptide nucleic acid)のいずれか一つ又はそれらの混合からなることを特徴とする、請求項1に記載の標的核酸増幅方法。
- 前記代理標的は、20~150個の塩基配列長に作製された一本鎖(single strand)オリゴヌクレオチド(oligonucleotide)であることを特徴とする、請求項4に記載の標的核酸増幅方法。
- 前記代理標的は、1~100個の塩基配列長に作製された一本鎖(single strand)オリゴヌクレオチド(oligonucleotide)であるスぺーサー(spacer)をさらに含むことを特徴とする、請求項4に記載の標的核酸増幅方法。
- 前記代理標的は、2~20個の塩基配列長に作製された一本鎖(single strand)オリゴヌクレオチド(oligonucleotide)であるスぺーサー(spacer)をさらに含むことを特徴とする、請求項4に記載の標的核酸増幅方法。
- 前記スぺーサーのGC割合は30%以下であることを特徴とする、請求項6に記載の標的核酸増幅方法。
- 前記融合増幅産物の長さは50bp~1kbpであり、GC割合は35~65%であることを特徴とする、請求項1に記載の標的核酸増幅方法。
- 前記(c)段階の融合増幅産物の存在有無を判別する段階は、前記融合増幅産物に結合できる核酸結合染料(nucleic acids-binding dye)又はプローブ(probe)を使用することを特徴とする、請求項1に記載の標的核酸増幅方法。
- 前記核酸結合染料は、臭化エチジウム(Ethidium bromide)、サイバーグリーン1(SYBR(登録商標) Green I)、サイバーグリーンゴールド(SYBR(登録商標) Gold)、エバーグリーン(EvaGreen)、ヨウプロ-1(YO-PRO-1)、サイト(SYTO)、BEBO(BEBO)及びベクスト(BEXTO)から構成された群から選ばれることを特徴とする、請求項10に記載の標的核酸増幅方法。
- 前記融合増幅産物に結合できるプローブは、オリゴヌクレオチド、LNA、PNA及びそれらの混合から構成された群から選ばれることを特徴とする、請求項10に記載の標的核酸増幅方法。
- 前記融合増幅産物に結合できるプローブは、代理標的の任意の配列に結合することを特徴とする、請求項12に記載の標的核酸増幅方法。
- 前記融合増幅産物に結合できるプローブは、両末端にレポーター(reporter)と消光子(quencher)が連結されていることを特徴とする、請求項12に記載の標的核酸増幅方法。
- 前記レポーターは、フルオレセイン(fluorescein)、フルオレセインクロロトリアジニル(fluorescein chlorotriazinyl)、ロダミングリーン(rhodamine green)、ロダミンレッド(rhodamine red)、テトラメチルロダミン(tetramethylrhodamine)、FITC、オレゴングリーン(Oregon green)、アレクサフルオル(Alexa Fluor)、FAM、JOE、ROX、HEX、テキサスレッド(Texas Red)、TET、TRITC、TAMRA、シアニン(Cyanine)系染料及びチアジカルボシアニン(thiadicarbocyanine)染料から構成された群から選ばれる一つ以上の蛍光物質であることを特徴とする、請求項14に記載の標的核酸増幅方法。
- 前記消光子は、ダブシル(Dabcyl)、タムラ(TAMRA)、エクリプス(Eclipse)、DDQ、QSY、ブラックベリークエンチャー(Blackberry Quencher)、ブラックホールクエンチャー(Black Hole Quencher)、Qxl、アイオワブラック(Iowa black)FQ、アイオワブラックRQ及びIRDye QC-1から構成された群から選ばれる一つ以上であることを特徴とする、請求項14に記載の標的核酸増幅方法。
- 前記(b)段階は、探索プライマーが混成化する標的核酸鎖の反対鎖と混成化する補助プライマーをさらに注入し、探索プライマーと増幅プライマー、そして探索プライマーと 補助プライマーがそれぞれ対になってPCRが行われることを特徴とする、請求項1に記載の標的核酸増幅方法。
- i)標的核酸と混成化(hybridization)できる1個以上の探索プライマー(primer);
ii)前記探索プライマーが結合しない標的核酸部位と結合する配列及び標的核酸に結合しない任意の配列を含む1個以上の代理標的(surrogate target);及び
iii)前記代理標的を増幅できる1個以上の増幅プライマー;
を含み、
ここで、
前記探索プライマーは前記標的核酸のいずれかの一鎖に相補的であり、
前記代理標的の5'側の一部が前記探索プライマーと相補的な前記標的核酸と同じ鎖に相補的でありながら、3'側の一部が前記標的核酸と相補的でない任意の配列を有する、又は前記代理標的の3'側の一部が前記探索プライマーと相補的な標的核酸の反対鎖に相補的でありながら、5'側の一部が前記標的核酸と相補的でない任意の配列を有し、前記代理標的の長さは20~150個の塩基配列長を持って、
前記探索プライマーが混成化する前記標的核酸と同じ鎖または反対鎖に混成化し、
前記探索プライマーが結合しない前記標的核酸部位に結合するものであり、
前記探索プライマーが結合しない前記標的核酸部位は、前記探索プライマーのダウンストリーム(downstream)に存在し、前記探索プライマーのダウンストリームは、前記探索プライマーが前記標的核酸と結合した後、PCRによって伸張(extension)される方向であり、
前記増幅プライマーは、前記代理標的が前記探索プライマーが混成化する前記標的核酸と同じ鎖に混成化する場合には前記代理標的の前記標的核酸と相補的でない任意の配列の一部に相補的である、または、前記代理標的が前記探索プライマーが混成化する前記標的核酸と反対の鎖に混成化する場合には、前記代理標的の前記標的核酸と相補的でない任意の配列の一部と同じであり、探索プライマーと比較して増幅プライマーの量が多く、探索プライマーと増幅プライマーが対になってPCRが行われることを特徴とする標的核酸増幅用PCR組成物。 - 前記組成物は、探索プライマーが混成化する標的核酸鎖と反対側の鎖と混成化する補助プライマーをさらに含み、探索プライマーと増幅プライマー、そして探索プライマーと補助プライマーがそれぞれ対になってPCRが行われることを特徴とする、請求項18に記載の標的核酸増幅用PCR組成物。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR20170161453 | 2017-11-29 | ||
KR10-2017-0161453 | 2017-11-29 | ||
PCT/KR2018/014776 WO2019107893A2 (ko) | 2017-11-29 | 2018-11-28 | 표적핵산 증폭방법 및 표적핵산 증폭용 조성물 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2021509821A JP2021509821A (ja) | 2021-04-08 |
JP7175326B2 true JP7175326B2 (ja) | 2022-11-18 |
Family
ID=66665754
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2020549530A Active JP7175326B2 (ja) | 2017-11-29 | 2018-11-28 | 標的核酸増幅方法及び標的核酸増幅用組成物 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US11634760B2 (ja) |
EP (1) | EP3719142A4 (ja) |
JP (1) | JP7175326B2 (ja) |
KR (1) | KR102371222B1 (ja) |
CN (1) | CN111511925B (ja) |
WO (1) | WO2019107893A2 (ja) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2023542064A (ja) * | 2020-06-23 | 2023-10-05 | ハイムバイオテック インコーポレイテッド | 逐次ポリメラーゼ連鎖反応用組成物及びそれを用いた遺伝子増幅方法 |
KR102543156B1 (ko) * | 2020-11-24 | 2023-06-14 | 주식회사 파나진 | 높은 특이도의 표적핵산 증폭방법 및 이를 이용한 표적핵산 증폭용 조성물 |
KR102575618B1 (ko) * | 2021-03-22 | 2023-09-07 | 에이치엘비파나진 주식회사 | 가이드 프로브 및 클램핑 프로브를 이용한 표적핵산 증폭방법 및 이를 포함하는 표적핵산 증폭용 조성물 |
WO2023125552A1 (zh) * | 2021-12-27 | 2023-07-06 | 迈克生物股份有限公司 | 对靶标核酸进行检测的方法 |
CN114807334A (zh) * | 2022-05-31 | 2022-07-29 | 深圳联合医学科技有限公司 | 目标基因的检测方法、引物组、试剂盒及应用 |
WO2024080776A1 (ko) * | 2022-10-14 | 2024-04-18 | 고려대학교 산학협력단 | 비색 검출을 위한 황 함유 프로브 및 핵산 내 황 도입을 통한 효소 활성 가속화 방법 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2010514420A (ja) | 2006-12-21 | 2010-05-06 | ジェン−プロウブ インコーポレイテッド | 核酸増幅のための方法および組成物 |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DK0652973T3 (da) * | 1992-07-31 | 1997-09-15 | Behringwerke Ag | Fremgangsmåde til indføring af definerede sekvenser ved 3-enden af polynukleotider |
US6593086B2 (en) * | 1996-05-20 | 2003-07-15 | Mount Sinai School Of Medicine Of New York University | Nucleic acid amplification methods |
GB9819418D0 (en) * | 1998-09-07 | 1998-10-28 | Secr Defence | Amplification method |
ATE360095T1 (de) | 2000-02-07 | 2007-05-15 | Illumina Inc | Nukleinsäure nachweisverfahren mit universellem priming |
US20070059700A1 (en) * | 2003-05-09 | 2007-03-15 | Shengce Tao | Methods and compositions for optimizing multiplex pcr primers |
SG10201402770YA (en) | 2009-04-02 | 2014-08-28 | Fluidigm Corp | Multi-primer amplification method for barcoding of target nucleic acids |
CN102242211A (zh) * | 2011-07-08 | 2011-11-16 | 无锡锐奇基因生物科技有限公司 | 检测突变核酸序列的方法及试剂盒 |
EP2943590A4 (en) * | 2013-01-13 | 2017-02-15 | Unitaq Bio | Methods and compositions for pcr using blocked and universal primers |
KR101491129B1 (ko) | 2013-01-21 | 2015-02-10 | 한일이화 주식회사 | 경량성 다층 구조물 및 그 제조방법 |
KR101830700B1 (ko) | 2013-11-11 | 2018-02-21 | 주식회사 파나진 | 클램핑 프로브 및 검출 프로브를 이용한 다중 표적핵산 검출방법 |
-
2018
- 2018-11-28 EP EP18883596.1A patent/EP3719142A4/en active Pending
- 2018-11-28 CN CN201880084282.4A patent/CN111511925B/zh active Active
- 2018-11-28 US US16/768,356 patent/US11634760B2/en active Active
- 2018-11-28 JP JP2020549530A patent/JP7175326B2/ja active Active
- 2018-11-28 KR KR1020207015112A patent/KR102371222B1/ko active IP Right Grant
- 2018-11-28 WO PCT/KR2018/014776 patent/WO2019107893A2/ko unknown
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2010514420A (ja) | 2006-12-21 | 2010-05-06 | ジェン−プロウブ インコーポレイテッド | 核酸増幅のための方法および組成物 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2019107893A2 (ko) | 2019-06-06 |
CN111511925B (zh) | 2023-11-14 |
EP3719142A4 (en) | 2021-08-25 |
US11634760B2 (en) | 2023-04-25 |
JP2021509821A (ja) | 2021-04-08 |
CN111511925A (zh) | 2020-08-07 |
KR20200068738A (ko) | 2020-06-15 |
WO2019107893A3 (ko) | 2019-07-18 |
US20210002696A1 (en) | 2021-01-07 |
KR102371222B1 (ko) | 2022-03-07 |
EP3719142A2 (en) | 2020-10-07 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7175326B2 (ja) | 標的核酸増幅方法及び標的核酸増幅用組成物 | |
JP5805064B2 (ja) | 対立遺伝子変種を検出するための方法、組成物、およびキット | |
KR102085119B1 (ko) | 핵산의 검출 | |
EP2756101B1 (en) | Probe: antiprobe compositions for high specificity dna or rna detection | |
US20210071245A1 (en) | Dna amplification technology | |
JP2008520245A (ja) | 切断−増幅法による核酸多様性の検出 | |
JP5709897B2 (ja) | 偽シグナルが排除されるターゲット核酸配列のリアルタイムマルチプレッキシング検出 | |
KR20140091944A (ko) | 내부컨트롤 및 리포터 및 소광자가 결합된 pna 프로브를 이용한 용융곡선 분석방법, 이를 이용한 표적핵산 검출방법 및 표적핵산 검출 키트 | |
EP3055430B1 (en) | Method for the detection of target nucleic acid sequences | |
US10669574B2 (en) | DNA amplification technology | |
US20210155979A1 (en) | Method of detecting target nucleic acid using rolling circle amplification and composition for detecting target nucleic acid | |
JP2019521716A (ja) | 多重増幅二重シグナル増幅によるターゲット核酸配列の検出方法 | |
Lamas et al. | Evaluation of the effect of outer primer structure, and inner primer linker sequences, in the performance of Loop-mediated isothermal amplification | |
KR20220078371A (ko) | 왕게 속(Paralithodes genus) 및 대게 속(Chionoecetes genus) 검출용 조성물 | |
KR102575618B1 (ko) | 가이드 프로브 및 클램핑 프로브를 이용한 표적핵산 증폭방법 및 이를 포함하는 표적핵산 증폭용 조성물 | |
KR102543156B1 (ko) | 높은 특이도의 표적핵산 증폭방법 및 이를 이용한 표적핵산 증폭용 조성물 | |
US20160273036A1 (en) | Photoinduced electron transfer (pet) primer for nucleic acid amplification | |
EP4198143A1 (en) | Modified primers for loop-mediated isothermal amplification and use thereof | |
JP6999645B2 (ja) | 核酸の増幅及び検出/定量の効率を改良するためのヘルパーオリゴヌクレオチド | |
KR101737313B1 (ko) | 전염성 근괴사증 바이러스 검출용 유전자 마커, 및 이를 이용한 바이러스의 검출 방법 | |
JP2024059627A (ja) | 核酸の増幅のための試薬、混合物、キット、および方法 | |
KR20220078362A (ko) | 두족류(Cephalopod) 검출용 조성물 | |
KR20230091008A (ko) | 고리매개 등온 증폭용 변형된 프라이머 및 이의 용도 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20200716 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20210824 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20211109 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220405 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220623 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20221011 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20221108 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7175326 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |