CN107614684A - 用于基因测序和其它应用的条形编码***及方法 - Google Patents

用于基因测序和其它应用的条形编码***及方法 Download PDF

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J·海曼
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Abstract

本发明总体上涉及微流体和标记的核酸。在一个方面，本发明总体涉及一种方法，所述方法包括提供包含颗粒的多个液滴，所述颗粒包含寡核苷酸，以及将核酸序列附着到所述寡核苷酸上。某些实施方案总体涉及用于将液滴分成两个或更多个液滴的***和方法。某些实施方案总体涉及用于分选液体中的流体液滴的***和方法。

Description

用于基因测序和其它应用的条形编码***及方法
相关申请
本申请要求由Weitz等于2015年4月17日提交的标题为“Barcoding Systems andMethods for Gene Sequencing and Other Applications”的美国临时专利申请序列号62/149,361的权益，所述美国临时专利申请通过引用并入本文。
政府资助
本发明是在国家科学基金会授予的第DMR-1310266号和第DMR-1420570号拨款以及由国立卫生研究院授予的第P01HL120839号拨款下借助政府资助完成的。政府对本发明享有一定的权利。
领域
本发明总体涉及微流体和标记的核酸。
背景
随着高通量测序技术的发展，研究人员已经产生了大量的基因组和表观遗传学数据。已从患者中提取疾病相关基因，并将序列信息用于临床诊断和治疗。
高通量测序通常依赖于进行大量的个体反应，得到核酸序列的数百个碱基。例如，Illumina HiSeq测序仪(HiSeq 2500Rapid Run Mode)的一次“运行”需要27个小时，产生约12亿个配对的末端读数(反应)，给出约150个碱基的序列。对于许多实验来说，这种大量的序列信息大大超过单个样本所需要的信息。
因此，至少就此问题而言，所期望的是在测序之前标记(“条形编码”)样本的能力，使得可在单次测序运行中分析许多样本。一个实例是单细胞转录分析。研究人员可能想分析数百个细胞的数百个基因的表达水平。如果在测序之前遗传标记(条形化)来自单个细胞的RNA，则这可在单个HiSeq运行中进行。
概述
本发明总体上涉及微流体和标记的核酸。在一些情况下，本发明的主题涉及针对特定问题的相关产品、替代解决方案和/或一个或多个***和/或制品的多个不同用途。
一方面，本发明总体上涉及方法。在一组实施方案中，所述方法包括提供包含颗粒的多个液滴，使得至少约90％的液滴包含一个颗粒或不包含颗粒(所述颗粒包含寡核苷酸)，并将核酸序列附接至所述寡核苷酸。在一些情况下，所述寡核苷酸包含条形码序列，第一条形码选自预先确定的第一条形码池，第二条形码选自预先确定的第二条形码池，例如，使得基本上每个颗粒包含可区分的条形码序列。
根据另一组实施方案，所述方法包括提供包含颗粒的多个液滴，使得至少约90％的液滴包含一个颗粒或不包含颗粒，所述颗粒包含寡核苷酸，所述寡核苷酸包含条形码序列第一条形码和第二条形码(第一条形码选自预先确定的第一条形码池，第二条形码选自预先确定的第二条形码池)，以及衔接子序列，使得基本上每个所述颗粒包含可区分的条形码序列；将衔接子序列暴露于包含互补衔接子序列和引物的序列；将引物暴露于包含引物的靶标的核酸序列；并进行扩增以产生包含第一条形码、第二条形码和核酸序列的寡核苷酸。
在另一组实施方案中，所述方法包括提供附接有寡核苷酸的多个颗粒，所述寡核苷酸包含选自预先确定的第一条形码池的第一条形码、选自预先确定的第二条形码池的第二条形码，以及衔接子序列；并通过该衔接子序列将核酸序列附接至寡核苷酸。
根据另一组实施方案，所述方法包括将多个细胞和多个颗粒包封在多个微流体液滴内，基本上每个颗粒包含寡核苷酸和与其共价键合的核酸序列，使得至少10,000个的多个液滴的每个液滴含有与所述多个液滴的其它液滴中所含的寡核苷酸可区分的一个或多个寡核苷酸；裂解所述液滴内的至少一些细胞以从所述细胞释放核酸，其中所述核酸序列包含能够与至少一些所述释放的核酸相互作用的部分；以及选择性扩增液滴内所释放核酸的部分以产生包含扩增部分和寡核苷酸的序列。
在另一组实施方案中，该方法包括提供至少10,000个含有细胞的多个微流体液滴，至少约90％的所述多个液滴含有一个细胞或不含细胞；裂解所述多个微流体液滴内的细胞以从细胞释放核酸；以及在与寡核苷酸结合的液滴内产生选择性扩增的核酸。在一些情况下，对于至少约90％的液滴，液滴内的寡核苷酸可与多个液滴中的其它液滴内的寡核苷酸区分开。
在另一组实施方案中，所述方法包括提供至少约10,000个含有细胞的多个微流体液滴，使得不超过10％的液滴含有两个或更多个细胞，裂解所述多个液滴内的细胞以从细胞释放核酸，以及选择性扩增液滴内所释放核酸的部分以产生包含扩增部分和液滴特异性条形码的序列。
在另一组实施方案中，所述方法包括提供含有细胞的液滴，使得不超过10％的液滴含有两个或更多个细胞，裂解所述多个液滴内的细胞以从细胞释放核酸，以及选择性扩增液滴内所释放核酸的部分以产生包含扩增部分和选自至少10,000个可区分条形码的池的条形码的序列。
在另一方面，本发明包括制造本文所述的一个或多个实施方案的方法。在另一方面，本发明包括使用在本文所述的一个或多个实施方案的方法。
当结合附图考虑时，本发明的其它有利方面和新颖特征将从以下对本发明的各种非限制性实施方案的详细描述中变得显而易见。在本说明书和通过引用并入的文献包括矛盾和/或不一致的公开内容的情况下，以本说明书为准。如果通过引用并入的两篇或更多篇文献包括相互矛盾和/或不一致的公开内容，则以具有较晚生效日期的文件为准。
附图简述
本发明的非限制性实施方案将参照附图进行举例说明，所述附图是示意性的而不是按比例绘制的。在附图中，所示的每个相同或几乎相同的组件通常由单个数字表示。为了清楚起见，未在每个附图中标记每个组件，在图示对于使本领域普通技术人员理解本发明并不必需的情形下，也未显示本发明的每个实施方案的每个组件。在图中：
图1A-1B举例说明一组实施方案中产生标记的核酸的实例；
图2举例说明某些实施方案中产生标记的核酸的另一个实例；
图3举例说明某些实施方案中产生标记的核酸的又一个实例；
图4举例说明本发明的一些实施方案中含有可光切割的间隔子或连接子的部分；以及
图5举例说明根据本发明的实施方案从细胞确定基因型。
详述
本发明总体上涉及微流体和标记的核酸。例如，某些方面总体上涉及用于在微流体液滴或其它区室(例如，从细胞产生的)内标记核酸的***和方法。在一组实施方案中，可制备包含例如附接于颗粒的表面的寡核苷酸的颗粒，所述寡核苷酸可用于测定靶核酸。寡核苷酸可包括可用于区分液滴中的核酸与另一个液滴中的核酸的“条形码”或独特序列，例如，甚至在将核酸汇集在一起或从液滴取出后。本发明的某些实施方案总体上涉及用于将另外的或任意的序列(例如，可用于选择性确定或扩增怀疑存在于液滴中的所需序列的识别序列)附接至微流体液滴或其它区室内的核酸的***和方法。例如，这样的***可以在各种应用诸如高通量测序应用中用于选择性扩增。
本发明的一些方面总体上涉及用于在微流体液滴或其它合适的区室(例如，微孔板的微孔、载玻片或其它表面上的单个斑点)内包含或包封核酸与寡核苷酸的***和方法。在一些情况下，所述核酸和寡核苷酸可以被连接或附接在一起。核酸可由液滴内的裂解细胞或其它物质产生。液滴内的寡核苷酸可与例如多个液滴或液滴群内的其它液滴中的寡核苷酸区分开。例如，所述寡核苷酸可含有在各种液滴之间不同的一个或多个独特序列或“条形码”。因此，通过确定与核酸相关的条形码，可以唯一地鉴定每个液滴内的核酸。例如，如果液滴“破碎”或破裂并且随后将来自不同液滴的核酸组合或混合在一起，例如用于测序或其它分析，则这可能是重要的。
在一些实施方案中，通过首先将寡核苷酸附接至颗粒(例如，水凝胶或聚合物颗粒)，随后在已将颗粒掺入液滴后从颗粒释放寡核苷酸，来将寡核苷酸引入至液滴中。参见，例如，2014年10月30日提交的美国专利申请序列第62/072,944号或2015年4月17日提交的标题为“Systems and Methods for Barcoding Nucleic Acids”的PCT申请序列号第PCT/US2015/026443号，每篇申请通过引用并入本文。例如，在某些实施方案中，所述寡核苷酸还可含有可切割的序列或连接子(例如，如图4所示的)，或者可以以其它方式从颗粒释放。
在一些情况下可以制备颗粒，使得大部分或全部颗粒相对于具有其它可区分的寡核苷酸的其它颗粒具有独特地可区分的寡核苷酸。如果颗粒以1个颗粒/液滴(或更少)的密度存在于液滴内，则一旦寡核苷酸从颗粒中释放，则大部分或全部液滴将包含一个独特的寡核苷酸(或无独特的寡核苷酸)，从而允许每个液滴(和包含在其中的核酸)被独特地鉴定。
现在参照图1描述本发明的一个实施方案的一个实例。如下面将更详细论述的，在其它实施方案中，也可以使用其它配置。图1A显示颗粒(例如，水凝胶颗粒)、一个或多个条形码和“通用序列”或可用于将任何另外的所需序列附接于寡核苷酸或包括任何另外的所需序列(例如，可用于识别另一实体的识别序列，例如，互补序列)的衔接子序列。这些可在总相中或液滴诸如微流体液滴内存在或于其中制备。另外，其它元件，诸如启动子或增强子，也可存在于寡核苷酸内，例如，如图1所示的。在一些实施方案中，例如，从两个(或更多个)分开的条形码元件的“池”形成寡核苷酸序列内使用的可能的条形码，然后如下文中所述，例如使用拆分和合并法(split-and-pool approach)将这些条形码元件连接在一起以产生最终的条形码序列。在一些情况下，这可允许在寡核苷酸中使用非常大量的可能的条形码，例如超过104或105个潜在的条形码。
在一些实施方案中，可将衔接子序列暴露于包含与接头互补的序列的互补序列。也可存在其它序列，例如引物、启动子等。本文讨论了引物、启动子等的实例。互补序列有可能能够结合衔接子序列的至少一部分或以其它方式与衔接子序列的至少一部分缔合，诸如如图1A所示的。相对于衔接子序列，互补序列可以完全互补或包含一个、两个、三个或更多个错配。衔接子序列(及其互补序列)可具有任何合适的长度，例如4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个或更多个核苷酸。
例如，如图1A所示，互补序列可包括引物诸如基因特异性内部正向引物或基因特异性反向引物序列，或本文论述的其它序列。例如，这些可用于促进所需或任意序列的随后扩增或将所需或任意序列掺入所述寡核苷酸(例如附接至颗粒)中。在图1A中，这是“模板”链。引物可以是能够与模板例如特异性(诸如利用基因特异性内部正向引物)或非特异性相互作用的引物。如图1A所示，随后的扩增或掺入可用于将模板的序列(或其至少一部分)掺入附接至颗粒的寡核苷酸，从而产生包含含有一个或多个条形码序列以及对应于模板的至少一部分的序列的寡核苷酸的颗粒。
在一些实施方案中，可将颗粒包封在液滴诸如微流体液滴中。本领域普通技术人员了解将颗粒包封在微流体液滴内的技术；参见，例如，美国专利第7,708,949号、第8,337,778号、第8,765,485号或国际专利申请公布第WO 2004/091763号和第WO 2006/096571号，各自通过引用并入本文。在一些情况下，可以以少于1个颗粒/液滴(并且在一些情况下，远小于1个颗粒/液滴)的密度包封颗粒，以确保大部分或全部液滴仅有零个或一个颗粒存在于其中。
在一些实施方案中，含有寡核苷酸(其可被附接至颗粒的表面，或者以其它方式包含于或掺入颗粒内等)的颗粒可用于确定从细胞(或其它样品)产生的核酸，或对所述核酸进行测序，或者用于其它应用。例如，在图1B的非限制性实例中，需要分析细胞群体10，例如通过对它们的DNA进行测序，通过鉴定可能怀疑存在于至少一些细胞中的某些蛋白质或基因，通过测定它们的mRNA或转录组，等等。尽管在本实例中使用细胞作为核酸材料的来源，但是这是作为实例，在其它实施方案中，可将核酸从其它来源引入至液滴中，或者使用其它技术。
例如，可使用本领域普通技术人员已知的技术首先将细胞封装在微流体液滴40内。在一些情况下可以以少于1个细胞/液滴(并且在一些情况下，远少于1个细胞/液滴)的密度包封细胞，以确保大部分或全部液滴仅有零个或一个细胞存在于其中。因此，如图1B所示，液滴41、42、43...中的每一个有零个或一个细胞存在于其中。
在液滴中也包封有存在于颗粒30上的寡核苷酸20。如上所述，颗粒30可以是例如微颗粒，并且可以是水凝胶或聚合物颗粒，或其它类型的颗粒，例如本文所述的那些颗粒。可同时或可以以任何合适的顺序依次地将颗粒和细胞包封在液滴内。在一组实施方案中，每个颗粒含有独特的寡核苷酸，尽管颗粒上可存在多个拷贝的寡核苷酸。例如，每个寡核苷酸可具有一个或多个条形码。因此，例如，颗粒31仅包含寡核苷酸21的拷贝，颗粒32仅包含寡核苷酸22的拷贝，颗粒33仅包含寡核苷酸33的拷贝等。
应当指出的是，根据本发明的某些实施方案，首先将寡核苷酸附接至颗粒上以便于将仅一个独特的寡核苷酸引入每个液滴，如图1B所示。(然而，在其它实施方案中，多个寡核苷酸和/或颗粒可以存在于液滴中，例如含有相同的独特条形码)。例如，如果颗粒以少于1个颗粒/液滴的密度存在于液滴中，则大部分或全部液滴将各自仅具有单个颗粒，并因此而仅存在单一类型的寡核苷酸。因此，如图1B所示，寡核苷酸可被切割或以其它方式从颗粒中释放，例如使得每个液滴41、42、43，...含有独特的寡核苷酸21、22、23，...所述寡核苷酸与另外的液滴中可能存在的另外的寡核苷酸不同。因此，存在于液滴内的每个寡核苷酸与另外的液滴中存在的寡核苷酸可区分开。尽管在图1B中使用光(hv)来从所述颗粒切割寡核苷酸，但应当理解，这仅仅是举例而已，并且也可使用其它切割或释放方法，例如，如本文中所述。例如，在一组实施方案中，可使用含有(例如，在物理上)寡核苷酸的琼脂糖颗粒，并且可通过加热琼脂糖直至例如琼脂糖至少部分地液化或软化来释放寡核苷酸。
在一些情况下，裂解细胞以从细胞释放核酸或其它物质51、52、53...。例如，细胞可使用化学物质或超声波来裂解。细胞可以释放例如DNA、RNA、mRNA、蛋白质、酶等。在一些情况下，释放的核酸可以任选地进行扩增，例如通过包含特异于扩增方法的合适的试剂。本领域普通技术人员已知的扩增方法的实例包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)、逆转录酶(RT)PCR扩增、体外转录扩增(IVT)、多重置换扩增(MDA)或定量实时PCR(qPCR)。
核酸或其它材料51、52、53，...中的一些或全部可以例如通过共价键合而与存在于液滴中的寡核苷酸缔合。例如，可将核酸或其它物质51、52、53连接或酶促附接至存在于液滴中的寡核苷酸。因此，如图1B所示，液滴41显示附接至寡核苷酸21的核酸51，液滴42显示附接至寡核苷酸22的核酸52，液滴43显示附接至寡核苷酸23的核酸53等。因此，每个液滴内的核酸可通过寡核苷酸(其在本实例中对于每个液滴是独特的)而与所述多个液滴50中的其它液滴中的核酸区分开。
还应该理解的是，尽管图1B描绘了从颗粒切割寡核苷酸，然后裂解细胞，但在其它实施方案中，这些不一定按照该顺序发生。例如，细胞裂解可能在切割后发生，或两者可能同时发生。
然后，液滴41、42、43，...可在某些情况下被“爆裂”或“破碎”以释放其内容物，并且在一些情况下，每个液滴中存在的核酸可以被组合或混合在一起，如图1B中所示。然而，由于核酸被不同的寡核苷酸标记，所以仍然可使用寡核苷酸(例如，通过确定寡核苷酸上的条形码)来区分来自一个液滴(即，来自一个细胞)的核酸与来自其它液滴(或其它细胞)的核酸。因此，可进行核酸组合池的后续分析(例如，测序)，并且可通过测定所述不同的寡核苷酸来确定每种核酸(例如，单个细胞)的来源。
因此，例如，可以以这种方式分析正常细胞和癌细胞的群体(例如，从组织样品或活组织检查产生的)，并且癌细胞可被鉴定为具有异常DNA，即使其存在于大的正常细胞池中。例如，由于能够使用所述寡核苷酸在细胞水平上追踪DNA，所以异常DNA即使在数量上远远不如大量的正常DNA，其仍然可被鉴定出来。作为其它非限制性实例，可从正常细胞中分离干细胞，或者可在目标群体中分离稀有细胞类型。
图2举例说明产生含有例如附接至表面或以其它方式并入颗粒内的寡核苷酸的颗粒的另一示例性方法。类似于图1A，图2显示了在其上附接有一个或多个条形码的颗粒。任选地，寡核苷酸还可以含有可切割的连接子，诸如可光切割的连接子。其它序列也可以存在，例如引物诸如PE1。在图2中，突出区域(例如，在本实例中包含胸苷)可以与含有互补突出区域(例如，包含腺苷)的序列匹配。突出区域可含有任何合适数量的核苷酸，例如1个、2个、3个、4个5个等。
可以例如在液滴内或在总溶液(bulk solution)中分别扩增合适的序列，以产生多个“扩增子”序列，然后可以例如使用突出区域将其附接至寡核苷酸。例如，这样的***可以是有用的，使得将扩增子序列主要附接至寡核苷酸(由于突出区域的存在)，而不是彼此附接或附接至已包含扩增子序列的寡核苷酸(即，因为突出区域已被扩增子序列占据)。合适的序列可以是例如单链或双链的，并且可使用PCR或任何其它合适的技术(包括本文描述的技术)进行扩增。例如，在一些情况下，可使用各种技术扩增序列，例如在微流体液滴内扩增，如图2所示的。参见，例如，美国专利申请序列第61/981,108号、第62/072,944号或第62/133,140号(各自通过引用整体并入本文)。
这样，可以制备含有一个或多个寡核苷酸(例如，含有标记诸如条形码、启动子、引物等)的颗粒，并且可将寡核苷酸附接至所需的或任意的序列(例如，从由模板产生的)，例如用于随后的使用。如图1A所示，这可用于包含含有一个或多个条形码序列和对应于模板的至少一部分的序列的寡核苷酸的颗粒。
在一些实施方案中，如在图2的实例中所示，可将颗粒包含(例如，以小于1个颗粒/液滴的密度，以确保大部分或全部液滴仅有零个或一个颗粒存在于其中，尽管这在所有实施方案中都不是必需的)在第一多个液滴内，并且可将扩增子包含在第二多个液滴内。如果使用液滴，则可以例如使用已知技术(参见，例如美国专利申请公布第2006/0163385号、第2007/0003442号或第2010/0172803号，每一个专利申请公布通过引用并入本文)将液滴合并在一起。类似地，可以例如，使用已知的技术诸如皮可注射或标题为“Fluid Injection”的国际专利申请公布第WO 2010/151776号(通过引用并入本文)中论述的其它方法将总溶液(包含扩增子)直接注射至液滴中。
在汇集在一起之后，核酸可以例如通过引物延伸，通过连接等与寡核苷酸共价键合。可使用众多不同技术中的任何技术，并且本领域普通技术人员将了解许多这样的技术。所使用的确切连接技术不一定是关键的，并且可在不同实施方案之间变化。非限制性实例包括连接酶或其它合适的技术，诸如美国专利申请序列第61/981,123号(通过引用并入本文)中论述的那些技术。
图3举例说明与图2类似的用于产生含有寡核苷酸的颗粒的另一个***。如上所述，可例如使用PCR或其它合适的技术分开扩增合适的序列以产生多个“扩增子”序列，然后将所述扩增子序列附接至寡核苷酸。在该实例中，可使用限制性内切酶制备突出区域，所述限制性内切酶可用于切割或裂解核酸和寡核苷酸的末端以产生可被连接在一起以产生最终寡核苷酸的互补突出区域。核酸和寡核苷酸中的每一个因此可被设计成含有可被限制性内切核酸酶识别和切割的合适的限制性位点。限制性内切核酸酶的非限制性实例包括EcoRI、EcoRII、BamHI、HindIII、TaqI、EcoP15和SmaI。许多限制性内切核酸酶是可商购的。另外，在一些实施方案中，可以使用可以切割并连接片段在一起的酶，例如Type IIs(LifeTechnologies)。
因此，本发明的某些方面总体上涉及用于将核酸附接至寡核苷酸的***和方法，所述寡核苷酸附接于颗粒或以其它方式与颗粒结合。核酸可以是任何合适的核酸序列，并且在一些情况下可以是任意的。例如，在一些实施方案中，可制备含有寡核苷酸的颗粒并将其送在使用者，使用者然后例如使用技术(诸如本文所述的技术)将所需的核酸添加至附接在颗粒上的寡核苷酸。
在一组实施方案中，例如，待附接至寡核苷酸的核酸可包括靶序列或模板，和/或包括能够识别所需核酸序列的识别序列。在某些情况下，识别序列可以能够识别基因组DNA，诸如人基因组DNA或特定部分，诸如基因。识别序列也可以能够与RNA序列(例如，mRNA序列)结合。识别序列可与靶序列互补，或者包含许多错配，例如1、2、3或4个或更多个错配。在一些情况下，识别序列可以与靶序列具有至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或至少约97％的互补性。
在一些实施方案中，核酸还可包括其它序列，诸如引物、启动子等。例如，可以存在引物以允许核酸的扩增、测序等，例如如本文中所论述的。非限制性实例包括基因特异性内部正向引物或基因特异性反向引物序列或本文论述的其它序列。
如上所述，在一些实施方案中，可在与寡核苷酸缔合之前扩增所述核酸。可使用任何合适的扩增技术，例如PCR、装配PCR、聚合酶循环装配、逆转录酶(RT)PCR扩增、体外转录扩增(IVT)、多重置换扩增(MDA)或定量实时PCR(qPCR)等。可在液滴内(参见，例如，美国专利申请公布第2010/0136544号、第2014/0199730号或第2014/0199731号)或总溶液中扩增靶序列或模板。
在一组实施方案中，可将核酸附接至寡核苷酸。如下面所论述的，可将寡核苷酸附接至或以其它方式并入或包含在颗粒内。在一组实施方案中，可使用连接酶或其它合适的酶将核酸添加至寡核苷酸，所述酶可将核酸直接附接至寡核苷酸，例如附接至寡核苷酸的游离末端。参见，例如，2014年10月30日提交的美国专利申请序列第第62/072,944号或2015年4月17日提交的标题为“Systems and Methods for Barcoding Nucleic Acids”的PCT/US2015/026443(各自通过引用和并入本文)。
连接酶的非限制性例子包括DNA连接酶诸如DNA连接酶I、DNA连接酶II、DNA连接酶III、DNA连接酶IV、T4DNA连接酶、T7DNA连接酶、T3DNA连接酶、大肠杆菌DNA连接酶、Taq DNA连接酶等。许多这样的连接酶可商购获得。另外，在一些实施方案中，可使用退火或引物延伸方法将两个或更多个核酸连接在一起。另外，在一些情况下，可以例如使用转座子等将核酸添加至寡核苷酸的内部。参见，例如，美国专利申请序列第62/072,950号，其通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，核酸和寡核苷酸可具有直末端或“粘性”末端(例如含有可能互补的未配对核苷酸突出)。非限制性实例包括在图2和3中描述的那些实例。在一些情况下，例如如图3所示，可使用限制性酶来制备核酸的末端，然后连接。
因此，例如，核酸可含有未配对核苷酸的一部分，并且寡核苷酸可含有未配对核苷酸的互补部分。作为非限制性实例，突出可以是A并且互补链可以是T。突出区域可包含任何合适数目的核苷酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个核苷酸等。突出区域可以仅包含单一核苷酸(例如，A、AA、AAA等)或者随机或任何其它合适的核苷酸序列。在一些情况下，可使用合适的酶(例如，限制性内切核酸酶或逆转录酶)产生突出。
例如，在一个非限制性实施方案中，条形码化的引物的3'末端以poly-T序列终止，其可用于捕获细胞mRNA以用于全转录组表征。可以任选地使用基于PCR的方法或使用基于杂交捕获的方法(诸如Agilent SureSelect)富集组合所有细胞的所得文库，以例如允许仅对目标基因的亚组进行测序。在另一个实施方案中，条形码化的引物的3'末端可用随机DNA序列终止，其可用于捕获细胞中的RNA。在另一个实施方案中，条形码化的引物的3'末端可用特定DNA序列终止，所述特定DNA序列例如可用于捕获目标DNA或RNA种类(“基因”)，或与除了颗粒或微球以外例如与酶试剂一起被递送至液滴内的DNA探针杂交。在另一个实施方案中，颗粒或微球体可携带许多不同的引物以靶向几个目标基因。另一个实施方案涉及优化液滴的尺寸和液滴条形编码所需的反应组分的浓度。
在另一组实施方案中，可使用与寡核苷酸上的衔接子序列互补的序列将核酸附接至寡核苷酸，其中所述互补序列含有可用于扩增所需或任意序列(例如，模板)或将所述序列掺入寡核苷酸的引物，例如如图1A中所论述的。
例如，在一些实施方案中，可将模板引入液滴中并在液滴内扩增。如果液滴含有寡核苷酸，那么扩增过程也可用于将模板附接至寡核苷酸，例如通过含有能够识别模板的至少一部分的引物的互补序列。例如，寡核苷酸可含有“通用”或衔接子序列，其与包含与衔接子序列互补的部分的互补序列互补并且含有能够识别模板的至少一部分的引物。在液滴内扩增后，寡核苷酸由此可被延伸，例如以包含模板。因此，在扩增后，模板序列可被掺入寡核苷酸中，例如，如图1所示，引物可用于促进模板链或其它序列的扩增或连接至寡核苷酸。例如，可使用引物诸如互补序列内的基因特异性引物(正向或反向)来促进该过程。
与核酸连接的寡核苷酸可含有例如条形码序列、识别序列、可切割的连键、随机序列或其它序列诸如本文所论述的任何序列。例如，在一组实施方案中，可将核酸附接至特定的寡核苷酸(例如条形码)，所述寡核苷酸可用于区分来自一个来源(例如，来自包含在液滴内的细胞)的核酸与来自其它来源(例如，来自其它细胞)的核酸。寡核苷酸上可存在一个或不止一个条形码。
在一些实施方案中，寡核苷酸可包含“条形码”或独特的序列。可以选择序列以使得一些或大部分所述寡核苷酸(例如，存在于颗粒上和/或液滴中)具有独特的序列(或独特的序列组合)，但是其它寡核苷酸(例如，在其它颗粒或液滴上)不具有该独特的序列或序列组合。因此，例如，所述序列可用于独特地鉴定或区分液滴或从所述液滴产生的(例如，来自裂解的细胞)包含的核酸与其它液滴或从其它液滴产生的(例如，从其它细胞释放的)其它核酸。
序列可具有任何合适的长度。条形码序列的长度不是至关重要的，并且可具有足以区分该条形码序列与其它条形码序列的任何长度。如上所述，一个、两个或更多个“条形码”序列可以存在于寡核苷酸中。条形码序列的长度可以是5nt、6nt、7nt、8nt、9nt、10nt、11nt、12nt、13nt、14nt、15nt、16nt、17nt、18nt、19nt、20nt、21nt、22nt、23nt、24nt或25nt。在一些情况下也可能存在超过25个核苷酸。
在一些情况下，所述独特或条形码序列可取自潜在的条形码序列的“池”。如果寡核苷酸中存在不止一个条形码序列，则条形码序列可取自相同或不同的潜在条形码序列池。序列池可使用任何合适的技术来选择，例如随机地选择，或者使得序列允许错误检测和/或校正，例如通过被分开一定的距离(例如，汉明距离)，使得可以检测到条形码序列读取中的错误，并且在某些情况下可以校正所述错误。该池可具有任何数量的潜在的条形码序列，例如至少100个、至少300个、至少500个、至少1,000个、至少3,000个、至少5,000个、至少10,000个、至少30,000个、至少50,000个、至少100,000个、至少300,000个、至少500,000个或至少1,000,000个条形码序列。
因此，本发明的一些实施方案总体涉及附接至颗粒或微球体的条形码化核酸。例如，一组实施方案总体上涉及携带核酸片段(各自编码条形码、引物和/或可能用于核酸的捕获、扩增和/或测序的其它序列)的颗粒或微球体。微球体可以指尺寸为1至500微米或其它尺寸(诸如本文所述的尺寸)的水凝胶颗粒(聚丙烯酰胺、琼脂糖等)或胶体颗粒(聚苯乙烯、磁性或聚合物颗粒等)。在一些实施方案中，微球体可以是多孔的。本文中更详细地论述了可使用的其它合适的颗粒或微球体。
在一些情况下，颗粒或微球体的制备可依赖于共价附接或其它技术，所述其它技术将初始DNA寡核苷酸掺入颗粒或微球体中，随后通过从一个预先确定的池中例如随机选择的一个或多个条形码对每个寡核苷酸进行酶促延伸。可能的独特条形码的最终数量在某些情况下可能取决于预先确定的条形码池的大小和/或延伸步骤的数量。例如，使用由384个预先确定的条形码的池和2个延伸步骤，每个颗粒或微球体携带3842＝147,456个可能条形码中的一个；使用3个延伸步骤，每个颗粒或微球体携带38433＝56,623,104个可能的条形码中的一个；依此类推。在某些情况下也可以使用其它数量的步骤；另外，每个池可具有不同数量的预先确定的条形码(不仅仅是384个)，并且池可以具有相同或不同数量的预先确定的条形码。所述池可包括相同和/或不同的序列。
因此，在一些实施方案中，所使用的可能的条形码从条形码要素的一个或多个单独的“池”形成，然后例如使用拆分和合并方法将这些条形码要素连接在一起以产生最终的条形码。一个池可以包含例如至少约300个，至少约500个，至少约1,000个，至少约3,000个，至少约5,000个或至少约10,000个可区分的条形码。例如，第一池可包含x1个要素，第二个池可包含x2个要素；形成包含来自第一池的要素和来自第二池的要素的条形码可以产生例如x1x2个可以使用的可能的条形码。应该指出的是，x1和x2可以相等也可以不相等。该过程可以重复任意次数；例如，条形码可包括来自第一池、第二池和第三池的要素(例如，产生x1x2x3个可能的条形码)，或者来自第一池、第二池、第三池和第四池的要素(例如，产生x1x2x3x4个可能的条形码)等。也可有5、6、7、8个或任何其它合适数量的池。因此，由于潜在的组合数量，即使是相对少量的条形码要素也可用来产生大得多的数量的可区分条形码。
在一些情况下，可组合地使用多个池的此类用途来产生大量可用的条形码，而不必单个地分开制备和合成大量的条形码。例如，在许多现有技术***中，需要100或1,000个条形码将需要单独合成100或1,000个条形码。然而，如果需要更大数量的条形码，例如要研究更大数量的细胞，则需要合成相应更大数量的条形码。这样的***在更大数量(诸如10,000、100,000或1,000,000个条形码)上变得不切实际和不可行。然而，通过使用条形码的分开的“池”，可以实现更大数量的条形码，而不需要单独合成每个条形码。作为非限制性实例，可以合成1,000个可区分的条形码(或任何其它合适的数量)的第一池和1,000个可区分的条形码的第二池，需要合成2,000个条形码(或者如果在每个池中重新使用条形码，则仅需合成1,000个)，然而可将它们组合以产生1,000x 1,000＝1,000,000个可区分的条形码，例如，其中每个可区分的条形码包含取自第一池的第一条形码和取自第二池的第二条形码。使用3个、4个或更多个池来组装条形码可产生甚至更多数量的可被制备的条形码，而不会显著增加需要合成的可区分条形码的总数。
寡核苷酸可具有任何合适的长度或者包含任何合适数量的核苷酸。寡核苷酸可包含DNA、RNA和/或其它核酸诸如PNA，和/或这些和/或其它核酸的组合。在一些情况下，寡核苷酸是单链的，尽管在其它情况下其可能是双链的。例如，寡核苷酸可具有至少约10nt，至少约30nt，至少约50nt，至少约100nt，至少约300nt，至少约500nt，至少约1000nt，至少约3000nt，至少约5000nt，至少约10,000nt等的长度。在一些情况下，寡核苷酸可具有不超过约10,000nt，不超过约5000nt，不超过约3000nt，不超过约1000nt，不超过约500nt，不超过约300nt，不超过约100nt，不超过约50nt等的长度。任何这些的组合也是可能的，例如，寡核苷酸可在约10nt与约100nt之间。寡核苷酸的长度不是至关重要的，并且在各种实施方案中可使用各种长度。
寡核苷酸也可含有多种序列。例如，寡核苷酸可包含一个或多个引物序列，如本文讨论的一个或多个独特的序列或“条形码”序列，一个或多个启动子序列，一个或多个间隔区序列等。在一些实施方案中，寡核苷酸还可含有一个或多个可切割的间隔子，例如光可切割的连接子。在一些实施方案中，可将寡核苷酸化学地(例如，经由接头)或物理地(例如，不一定需要接头)附接至颗粒，例如使得寡核苷酸可通过切割从颗粒中移出。其它实例包括可用于增加(例如，使用特定序列或无义序列)寡核苷酸的大小(或长度)以有利于处理的部分(例如，寡核苷酸可包括poly-A尾巴)，以增加结合的选择性(例如，如下所述)，有利于酶(例如，合适的连接酶)的识别，以有利于鉴定等。这些和/或其它序列的实例在本文中进一步详细描述。
在一些情况下，寡核苷酸可含有一个或多个启动子序列，例如以允许产生寡核苷酸，以允许酶扩增等。本领域普通技术人员将了解引物序列，例如P5或P7。许多这样的引物序列是商购可得的。启动子的实例包括但不限于T7启动子、T3启动子或SP6启动子。
在一些情况下，寡核苷酸可含有一个或多个引物序列。通常，引物是用作核酸合成的起始点的单链或部分双链核酸(例如DNA)，其允许聚合酶诸如核酸聚合酶延伸引物并复制互补链。引物可以与靶核酸互补并杂交。在一些实施方案中，引物是合成引物。在一些实施方案中，引物是非天然存在的引物。引物通常具有10至50个核苷酸的长度。例如，引物可具有10至40个、10至30个、10至20个、25至50个、15至40个、15至30个、20至50个、20至40或20至30个核苷酸的长度。在一些实施方案中，引物具有18至24个核苷酸的长度。引物的实例包括但不限于P5引物、P7引物、PE1引物、PE2引物、A19引物或本文论述的其它引物。
在一些情况下，寡核苷酸可含有无义或随机序列，例如以增加寡核苷酸的质量或大小。随机序列可具有任何合适的长度，并且可以存在一个或不止一个随机序列。作为非限制性实例，所述随机序列可具有10至40个、10至30个、10至20个、25至50个、15至40个、15至30个、20至50个、20至40个或20至30个核苷酸的长度。
在一些情况下，寡核苷酸可包含一个或多个能够特异性结合基因或其它实体的序列。例如，在一组实施方案中，寡核苷酸可包含能够识别mRNA的序列，例如含有poly-T序列(例如，具有连续的数个T，例如4、5、6、7、8个或更多个T)的序列。
在一组实施方案中，寡核苷酸可含有一个或多个可切割的连接子，例如，可以在施加合适的刺激时被切割的连接子。例如，可切割的序列可以是可光切割的连接子，其可通过施加光或合适的化学物质或酶来切割。在图4中可以看到可光切割的连接子的非限制性实例。在一些情况下，例如，可制备多个颗粒(在其表面上含有寡核苷酸)并将其添加至液滴中，例如使得平均每个液滴包含一个颗粒，或者在一些情况下更少(或更多)。在被添加至液滴中后，可以例如使用光或其它合适的切割技术将寡核苷酸从颗粒切割下来，以允许寡核苷酸存在于溶液中，即在液滴内部。以这种方式，可通过以下过程容易地将寡核苷酸加载至液滴中：将颗粒加载至液滴中，然后切割下来以允许寡核苷酸处于溶液中，例如与核苷酸或其它种类(诸如本文所论述的种类)相互作用。
可使用各种技术来制备寡核苷酸，诸如本文所论述的寡核苷酸。可在总体溶液中和/或在一个或多个液滴(诸如微流体液滴)中制备这些寡核苷酸。在一些情况下，可以在液滴中制备寡核苷酸，例如以确保每个液滴内的条形码和/或寡核苷酸是独特的。另外，在一些实施方案中，可在分开的液滴中制备含有寡核苷酸和各种条形码的颗粒，然后可将该颗粒给予或销售给使用者，然后使用者例如如上所述将核酸添加至寡核苷酸。
在一些情况下，可将包含DNA和/或其它核酸的寡核苷酸附接至颗粒上并递送到液滴。在一些情况下，将寡核苷酸附接至颗粒以控制其至液滴中的递送，例如使得液滴通常将在其中具有至多一个颗粒。在一些情况下，在递送至液滴中时，可以例如通过裂解，通过降解颗粒等将寡核苷酸从颗粒中移出。然而，应当理解，在其它实施方案中，液滴可含有2个、3个或任何其它数量的颗粒，所述颗粒可具有相同或不同的寡核苷酸。
在另一方面，本发明提供了用于确定或鉴定来自大量细胞的DNA或RNA，例如基因组DNA、特定基因、特定mRNA序列等的***和方法。在一些实施方案中，本发明提供了用于平行捕获和条形编码来自大量细胞的DNA或RNA(例如用于表征细胞群的目的或其它目的，诸如本文所述的目的)的***和方法。在一些实施方案中，这依赖于条形码化的核酸或其它合适的寡核苷酸(例如，附接于颗粒或微球体(例如，水凝胶或聚合物微球体))与细胞和/或可用于RNA和/或DNA捕获和/或扩增的其它试剂一起的包封。
在一组实施方案中，可以例如利用独特的条形码(其可以是随机确定的，或如本文论述的那样确定的)来标记从基本上每个个体细胞产生的内容物，这在一些情况下可允许在单个实验中对数百、数千、数万或甚至数十万或更多的不同细胞进行条形编码或以其它方式进行标记，例如以测定或定义群体中细胞之间的异质性或用于筛选细胞群体等。本文中已经描述了其它目的。
在一组实施方案中，例如在单个反应容器中，使用微流体***来将单个细胞捕获至单个液滴(例如，50pL至10nL体积)中。可裂解每一个细胞，并且例如通过酶促反应，通过连接等用液滴特异性条形码对其RNA和/或DNA进行独特地条形编码或标记。本文中还提供了微流体***的实例，包括具有除这些以外的尺寸的微流体***。在一些实施方案中，还可能使用一些实施方案来与RNA或DNA平行地定量单个细胞中的蛋白质丰度，例如通过首先用DNA-标记的抗体处理细胞，在这种情况下，可以类似地用液滴特异性条形码对DNA标签进行条形编码。一旦液滴中的细胞组分被条形编码，则可破坏或破裂液滴，并且可以例如在总液体中处理样品，以用于高通量测序或其它应用。测序后，可根据DNA条形码分拆或以其它方式分析数据。
为了在单个细胞中对DNA、RNA和/或DNA-抗体标签进行平行条带编码，根据一组实施方案，可将单个水凝胶或聚合物颗粒或微球体与生物或化学试剂和细胞一起封装至每个液滴中。携带高浓度(例如，1至100微摩尔浓度)DNA片段(在下文中称为“引物”)的颗粒或微球体可编码(a)从例如至少10,000个条形码(或至少30,000个条形码，至少100,000个条形码，至少300,000个条形码，或至少1,000,000个条形码等)的池中随机选择的条形码序列，其中相同的条形码存在于所述颗粒或微球上的所有核酸片段上；和/或编码(b)用于DNA或RNA杂交和捕获的一个或多个引物序列。为了减少两个或更多个细胞占据不同的具有携带相同条形码的颗粒或微球体的液滴的可能性，不同条形码的数目可以是待捕获的细胞的数量的至少10倍，在一些情况下至少100倍。例如，对于150,000个条形码和1,000个细胞，平均只有3个细胞将获得重复的条形码(从而导致997个检测到的条形码)。
在一些实施方案中，选择包封条件，使得液滴包含一个颗粒(或微球体)和一个细胞。具有单个颗粒但没有细胞的一个和/或多个空液滴和/或具有细胞但没有颗粒的液滴的存在可能不会显著影响性能。然而，在一个液滴中存在两个或更多个颗粒或者两个或更多个细胞可导致难以控制的错误，因此在一些情况下使这种事件的发生率保持最小，例如小于约10％或少于约5％。除细胞和颗粒外，其它生物和化学试剂可在液滴间均匀地分布。可根据特定应用的目的收集和处理共包封的细胞和颗粒。例如，在一个特定的实施方案中，通过随颗粒引入的引物捕获单个细胞的DNA或RNA，然后可通过逆转录或其它DNA聚合反应将其转化为条形码化的互补DNA。
在纯化和任选的DNA扩增后，可以例如通过测序或其它技术来确定细胞核酸的碱基组成和条形码身份。或者，在一些实施方案中，随颗粒或微球体引入的引物可用于扩增来自基因组的特定核酸序列。
在一些实施方案中，可通过例如光，化学，酶促或其它技术从其切割使用颗粒或微球体引入的条形码化引物，例如以提高在液滴中引发酶促反应的效率。然而，引物的切割可在任何步骤或点进行，并且在一些情况下可由用户确定。这样的切割在某些情况和/或条件下可以是特别重要的；例如，单个细胞中RNA和DNA分子的一部分可能非常大，或者可能与复合物结合，从而不会高效地扩散至颗粒或微球体的表面或内部。然而，在其它实施方案中，切割不是必需的。
诸如这些的技术可用于分析例如基因组、单核苷酸多态性、特定基因表达水平、非编码RNA、整个转录组(或其部分)、整个基因或其部分等。然而，本发明不应仅限于这些应用。
在一个非限制性实施方案中，条形码化的引物的3'末端用poly-T序列终止，其可用于捕获细胞mRNA以用于全转录组表征。可任选地使用基于PCR的方法或使用基于杂交捕获的方法(诸如Agilent SureSelect)来富集组合所有细胞的所得文库，例如以允许仅对目标基因的亚组进行测序。在另一个实施方案中，条形码化的引物的3'末端可用随机DNA序列终止，其可用于捕获细胞中的RNA。在另一个实施方案中，条形码化的引物的3'末端可用特定的DNA序列(例如可用于捕获目标DNA或RNA种类(“基因”)，或者与除了颗粒或微球以外例如与酶试剂一起被递送至液滴内的DNA探针杂交的DNA序列)终止。在另一个实施方案中，颗粒或微球体可携带许多不同的引物以靶向几种目标基因。另一个实施方案涉及优化液滴的尺寸和进行液滴条形编码所需的反应组分浓度。
可将寡核苷酸附接至颗粒，例如，如本文所论述的。在一些实施方案中，颗粒可以仅包含一个寡核苷酸，尽管多个拷贝的寡核苷酸可以存在于颗粒上；其它颗粒可包含可以例如使用本文所述的条形码序列区分的不同寡核苷酸。
可使用任何合适的方法将寡核苷酸附接至颗粒。附接的确切方法并不是至关重要的，其可以是例如化学或物理性的。例如，可通过生物素-链霉抗生物素蛋白连键、氨基连键或丙烯酸亚磷酰胺连键将寡核苷酸共价键合至颗粒。关于丙烯酸亚磷酰胺连键的实例，参见例如图20A。在另一组实施方案中，可将寡核苷酸物理性地掺入颗粒中，其中寡核苷酸可以通过改变颗粒来释放。因此，在一些情况下，寡核苷酸不必具有可切割的连键。例如，在一组实施方案中，在形成颗粒时，可将寡核苷酸掺入颗粒诸如琼脂糖颗粒中。当颗粒降解(例如，通过加热颗粒直至其开始软化、降解或液化)时，寡核苷酸可从颗粒中释放。
颗粒在本发明的某些方面是微颗粒。颗粒可以是多种类型中的任何一种；如所论述的，颗粒可用于将特定的寡核苷酸导入液滴中，并且可使用可与寡核苷酸结合(例如，物理或化学地)的任何合适的颗粒。颗粒的确切形式不是至关重要的。颗粒可以是球形或非球形的，并且可由任何合适的材料形成。在一些情况下，使用具有基本上相同的组成和/或基本上相同的平均直径的多个颗粒。多个或一系列颗粒的“平均直径”是每个颗粒的平均直径的算术平均值。本领域普通技术人员将能够例如使用激光散射、显微镜检查或其它已知技术来确定多个或一系列颗粒的平均直径(或其它特征尺寸)。非球形颗粒中单个颗粒的平均直径是与该非球形颗粒具有相同体积的完美球体的直径。颗粒(和/或多个或一系列颗粒)的平均直径在一些情况下可以例如小于约1mm，小于约500微米，小于约200微米，小于约100微米，小于约75微米，小于约50微米，小于约25微米，小于约10微米或小于约5微米。平均直径在某些情况下也可以为至少约1微米，至少约2微米，至少约3微米，至少约5微米，至少约10微米，至少约15微米或至少约20微米。
在一组实施方案中，颗粒可以是水凝胶颗粒。关于水凝胶颗粒(包括含有DNA的水凝胶颗粒)的实例，参见例如标题为“Assay and other reactions involving droplets”的美国专利申请公布WO 2008/109176(通过引用并入本文)。水凝胶的实例包括但不限于基于琼脂糖或丙烯酰胺(诸如聚丙烯酰胺、聚-N-异丙基丙烯酰胺或聚N-异丙基聚丙烯酰胺)的凝胶。例如，单体的水溶液可分散在液滴中，然后聚合，例如形成凝胶。另一个实例是水凝胶，诸如可通过加入钙离子而胶凝化的海藻酸。在一些情况下，可以例如通过与水相共流动，通过油相的共流动或通过两种不同液滴的聚结而将胶凝化引发剂(用于丙烯酰胺的过硫酸铵和TEMED，或用于藻酸盐的Ca2+)添加至液滴，如由Link等于2006年2月23日提交的标题为“Electronic Control of Fluidic Species”的美国专利申请序列第11/360,845号(于2007年1月4日公布为美国专利申请公布第2007/000342号)；或由Ahn等于2007年1月24日提交的题为“Fluidic Droplet Coalescence”的美国专利申请序列第11/698,298号(每篇均通过引用整体并入本文)中论述的。
在另一组实施方案中，颗粒可以包含一种或多种聚合物。示例性聚合物包括但不限于聚苯乙烯(PS)、聚己内酯(PCL)、聚异戊二烯(PIP)、聚(乳酸)、聚乙烯、聚丙烯、聚丙烯腈、聚酰亚胺、聚酰胺和/或这些聚合物和/或其它聚合物的混合物和/或共聚物。另外，在一些情况下，颗粒可以是磁性的，这可以允许磁性操作所述颗粒。例如，颗粒可包含铁或其它磁性材料。颗粒还可以被官能化，使得它们可以具有附接的其它分子，诸如蛋白质、核酸或小分子。因此，本发明的一些实施方案涉及定义例如核酸、蛋白质、小分子或其它种类(诸如本文所述的种类)的文库的一组颗粒。在一些实施方案中，颗粒可具有荧光。
在一些方面，可将颗粒(诸如本文论述的含有寡核苷酸的那些颗粒)包含在液滴内，并且寡核苷酸从颗粒释放至液滴内部。液滴还可含有可与寡核苷酸结合或被寡核苷酸识别的核酸(例如，通过裂解细胞产生的)。可在液滴形成过程中和/或之后将颗粒和细胞引入液滴内，并且可同时或顺序地(以任何合适的顺序)添加颗粒和细胞。如上所述，在一些实施方案中，可将颗粒和细胞置于液滴内，使得液滴通常平均含有不多于一个颗粒和不多于一个细胞。
在一组实施方案中，形成含有细胞或其它核酸来源以及例如包含如上所述的寡核苷酸的颗粒的液滴。可选择任何合适的方法来产生液滴，并且用于形成液滴的各种不同的技术对于本领域的普通技术人员来说是已知的。例如，可使用通道的接合部来产生液滴。该接合可以是例如T型接合、Y型接合、通道内通道接合(例如，以同轴排列方式，或者包括内部通道和围绕至少部分内部通道的外部通道)、交叉(或“X”)接合、流动聚焦接合或用于产生液滴的任何其它合适的接合。参见例如，由Link等于2004年4月9日提交的材料题为“Formation and Control of Fluidic Species”的国际专利申请第PCT/US2004/010903号(于2004年10月28日公布为WO 2004/091763)，或由Stone等于2003年6月30日提交的标题为“Method and Apparatus for Fluid Dispers ion”的国际专利申请第PCT/US2003/020542号(于2004年1月8日公布为WO 2004/002627)，其每一篇通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，接合可被构造和配置成产生基本上单分散的液滴。还可在流体装置上产生液滴，和/或可分别产生液滴，然后将其带至装置。
如果使用细胞，则细胞可来自任何合适的来源。例如，细胞可以是需要对来自细胞的核酸进行研究或测序等的任何细胞，并且可包括一种或不止一种细胞类型。细胞可以例如来自特定细胞群体，诸如来自特定器官或组织(例如，心脏细胞、免疫细胞、肌细胞、癌细胞等)，来自特定个体或物种的细胞(例如，人细胞、小鼠细胞、细菌等)，来自不同生物体的细胞，来自天然存在的样品(例如，池塘水、土壤等)的细胞等。在一些情况下，可从组织离解细胞。
另外，本发明的某些实施方案涉及使用液滴或其它离散的区室，例如微孔板的微孔、载玻片或其它表面上的单个斑点等。在一些情况下，每个区室可位于特定的位置，其不会与其它区室意外混合。在一些情况下，区室可以相对地小，例如，每个区室的体积可小于约1ml，小于约300微升，小于约100微升，小于约30微升，小于约10微升，小于约3微升，小于约1微升，小于约500nl，小于约300nl，小于约100nl，小于约50nl，小于约30nl或小于约10nl。
在一组实施方案中，加载液滴(或其它区室)，使得每个液滴在其中平均具有小于1个颗粒。例如，平均加载率可以小于约1个颗粒/液滴，小于约0.9个颗粒/液滴，小于约0.8个颗粒/液滴，小于约0.7个颗粒/液滴，小于约0.6个颗粒/液滴，小于约0.5个颗粒/液滴，小于约0.4个颗粒/液滴，小于约0.3个颗粒/液滴，小于约0.2个颗粒/液滴，小于约0.1个颗粒/液滴，小于约0.05个颗粒/液滴，小于约0.03个颗粒/液滴，小于约0.02个颗粒/液滴或小于约0.01个颗粒/液滴。在一些情况下，可选择较低的颗粒加载率以使得产生在其中具有两个或更多个颗粒的液滴的概率最小化。因此，例如，至少约50％，至少约60％，至少约70％，至少约80％，至少约90％，至少约95％，至少约97％，至少约98％或至少约99％的液滴可以不含颗粒或仅含有一个颗粒。
类似地，在一些实施方案中，加载液滴(或其它区室)，使得平均每个液滴在其中具有少于1个细胞。例如，平均加载率可小于约1个细胞/液滴，小于约0.9个细胞/液滴，小于约0.8个细胞/液滴，小于约0.7个细胞/液滴，小于约0.6个细胞/液滴，小于约0.5个细胞/液滴，小于约0.4个细胞/液滴，小于约0.3个细胞/液滴，小于约0.2个细胞/液滴，小于约0.1个细胞/液滴，小于约0.05个细胞/液滴，小于约0.03个细胞/液滴，小于约0.02个细胞/液滴或小于约0.01个细胞/液滴。在一些情况下，可选择较低的细胞加载率以使得产生在其中具有两个或更多个细胞的液滴的概率最小化。因此，例如，至少约50％，至少约60％，至少约70％，至少约80％，至少约90％，至少约95％，至少约97％，至少约98％或至少约99％的液滴可以不含细胞或仅含有一个细胞。另外，应该注意的是，液滴内的平均颗粒加载率和平均细胞加载率可以相同或不同。
在一些情况下，可以产生相对大量的液滴，例如至少约10个，至少约30个，至少约50个，至少约100个，至少约300个，至少约500个，至少约1,000个，至少约3,000个，至少约5,000个个，至少约10,000，至少约30,000个，至少约50,000个，至少约100,000个液滴等。在一些情况下，如前所述，一些或全部液滴可以例如基于至少一些液滴中存在的寡核苷酸(例如，其可包含一个或多个独特的序列或条形码)来区分。在一些情况下，至少约50％，至少约60％，至少约70％，至少约80％，至少约90％，至少约95％，至少约97％，至少约98％，或者至少约99％的液滴可以是可区分的。
在将粒子和细胞加载至液滴中后，根据本发明的某些方面，可从颗粒释放或切割寡核苷酸。如上所述，可使用任何合适的技术，诸如光(例如，如果寡核苷酸包括可光切割的连接子)、化学物质或酶等，从液滴释放寡核苷酸。如果使用化学物质或酶，可在形成液滴之后例如通过皮可注射或其它方法(诸如标题为“Fluid Injection”的国际专利申请公布第WO 2010/151776号(通过引用并入本文)中论述的那些方法)，通过液滴与含有所述化学物质或酶的液滴的融合，或通过本领域普通技术人员已知的其它技术而将化学物质或酶引入液滴。
如所论述的，在某些方面，含有寡核苷酸的颗粒可用于分析例如从细胞产生的核酸或来自其它合适来源的核酸。在一组实施方案中，如果存在细胞，则可在液滴内裂解细胞，例如以从细胞释放DNA和/或RNA，和/或在液滴内产生细胞裂解物。例如，可通过暴露于裂解化学试剂或细胞裂解试剂(例如，表面活性剂诸如Triton-X或SDS，酶诸如溶菌酶、溶葡萄球菌素、消解酶、纤维素酶、变溶菌素、聚糖酶、蛋白酶、甘露聚糖酶、蛋白酶K等)或物理条件(例如，超声波、紫外线、机械搅拌等)来裂解细胞。如果使用裂解性的化学物质，则可在形成液滴后，例如通过皮可注射或其它方法(诸如2011年12月21日提交的标题为“FluidInjection,”的美国专利申请序列第13/379,782号(于2012年5月31日公布为美国专利申请公布第2012/0132288号)(通过引用整体并入本文)中论述的那些方法)，通过液滴与含有所述化学物质或酶的液滴的融合，或通过本领域普通技术人员已知的其它技术将裂解性的化学物质引入液滴。细胞的裂解可在寡核苷酸从颗粒释放之前、期间或之后发生。在一些情况下，裂解细胞将导致细胞释放其内容物，例如细胞核酸、蛋白质、酶、糖类等。在一些实施方案中，还可将一些细胞核酸连接至液滴内包含的一个或多个寡核苷酸，例如如本文所论述的。例如，在一组实施方案中，可将通常在细胞内产生的RNA转录物释放，然后与寡核苷酸连接。
在一些实施方案中，一旦释放，则从细胞释放的核酸(例如DNA和/或RNA)可以例如通过引物延伸、通过连接等与寡核苷酸共价键合。可使用众多不同的技术中的任何技术，并且本领域普通技术人员将了解许多这样的技术。所使用的确切连接技术不一定是至关重要的，并且在不同实施方案之间可以变化。
例如，在某些实施方案中，可使用连接酶将核酸与寡核苷酸连接。连接酶的非限制性例子包括DNA连接酶诸如DNA连接酶I、DNA连接酶II、DNA连接酶III、DNA连接酶IV、T4DNA连接酶、T7DNA连接酶、T3DNA连接酶、大肠杆菌(E.coli)DNA连接酶、Taq DNA连接酶等。许多这样的连接酶可商购获得。作为另外的实例，在一些实施方案中，可使用退火或引物延伸方法将两个或更多个核酸连接在一起。
在另一组实施方案中，可将核酸与寡核苷酸连接和/或使用PCR(聚合酶链式反应)或其它合适的扩增技术扩增所述核酸，所述扩增技术包括本文所述的任何扩增技术。通常，在PCR反应中，加热核酸以使核酸解离成单链，并使用热稳定性DNA聚合酶(诸如Taq聚合酶)来扩增核酸。通常重复该过程多次以扩增核酸。
在一组实施方案中，可在液滴内进行PCR或核酸扩增。例如，液滴可包含聚合酶(诸如Taq聚合酶)和DNA核苷酸，并且可以处理(例，如通过重复加热和冷却)液滴以扩增液滴内的核酸。可在任何合适的点，例如，在编码各种条件的各种核酸被添加至液滴之前、期间或之后添加聚合酶和核苷酸。例如，液滴可含有聚合酶和DNA核苷酸，其与液滴融合以允许发生扩增。本领域普通技术人员将了解合适的PCR技术和变型，诸如组装PCR或聚合酶循环组装，其可在一些实施方案中用于产生扩增的核酸。这样的方法的非限制性实例也在下文中论述。另外，在一些情况下，可使用合适的引物(例如P5和P7，或本领域普通技术人员已知的其它引物)来引发聚合。在一些实施方案中，可将引物添加至液滴中，或者引物可存在于液滴内的一种或多种核酸上。本领域普通技术人员将了解合适的引物，其中许多可容易地商购获得。
在一些情况下，液滴可以爆裂、破坏或以其它方式破裂。本领域普通技术人员可使用各种各样的“破坏”或“爆裂”液滴的方法，并且选择的确切方法并不是至关重要的。例如，可使用诸如机械破坏或超声波的技术破坏携带流体中包含的液滴。也可使用化学试剂或表面活性剂，例如1H,1H,2H,2H-全氟辛醇来破裂液滴。
然后可将来自不同液滴的核酸(用寡核苷酸标记的)混合或组合在一起，或对其进行分析，例如测序，扩增等。然而，由于在破裂之前存在于各液滴中的不同寡核苷酸(例如，含有不同的条形码)的存在，来自不同液滴的核酸可保持可区分。
例如，可使用PCR(聚合酶链式反应)或其它扩增技术来扩增核酸。通常，在PCR反应中，加热核酸以使核酸离解成单链，并使用热稳定性DNA聚合酶(诸如Taq聚合酶)来扩增核酸。通常重复该过程多次以扩增核酸。
在一组实施方案中，PCR可用于扩增核酸。本领域普通技术人员将了解合适的PCR技术和变型，诸如组装PCR或聚合酶循环组装，其可在一些实施方案中用于产生扩增的核酸。这样的过程的非限制性实例也在下文中进行论述。另外，在一些情况下，可使用合适的引物(例如P5和P7，或本领域普通技术人员已知的其它引物)来引发聚合。本领域普通技术人员将了解合适的引物，其中许多可容易地商购获得。
可使用的本领域普通技术人员已知的扩增方法的其它非限制性实例包括但不限于逆转录酶(RT)PCR扩增、体外转录扩增(IVT)、多重置换扩增(MDA)或定量实时PCR(qPCR)。
在一些实施方案中，可使用多种技术和仪器对核酸进行测序，其中许多技术和工具可容易地商购获得。此类技术的实例包括但不限于链终止测序、杂交测序、Maxam-Gilbert测序、染料终止子测序、链终止方法、大规模平行信号测序(Massively ParallelSignature Sequencing)(Lynx Therapeutics)、聚合酶克隆测序(polony sequencing)、焦磷酸测序、连接测序、离子半导体测序、DNA纳米球测序、单分子实时测序、纳米孔测序、微流体Sanger测序、数字RNA测序(“数字RNA-seq”)等。确切的测序方法不是至关重要的。
另外，在一些情况下，液滴还可以含有一种或多种DNA-标记的抗体，例如以例如通过用DNA进行适当地标记来确定细胞中的蛋白质。因此，例如，可使用DNA标记的特异于蛋白质的抗体，如本文所论述的，在多个细胞中检测蛋白质。
关于根据本发明各个方面的用于操控微流体***中的液滴例如以确定液滴(或液滴内的物质)、分选液滴等的***和方法的附加细节参见下文。例如，在由Link等于2006年2月23日提交的标题为“Electronic Control of Fluidic Species”的美国专利申请序列第11/360,845号(于2007年1月4日公布为美国专利申请公布第2007/000342号)(通过引用并入本文)中描述了用于筛选和/或分选液滴的各种***和方法。作为非限制性实例，通过施加(或移除)第一电场(或其部分)，可将液滴引导至第一区域或通道；通过将第二电场施加至(或移除)装置(或其部分)，可将液滴引导至第二区域或通道；通过将第三电场施加至装置(或其部分)，可将液滴引导至第三区域或通道等，其中各电场可能会在一些方面例如在强度、方向、频率、持续时间等上有所不同。
在本发明的某些实施方案中，提供了可以以允许测定流体性液滴的一个或多个特征的方式，感测和/或确定流体性液滴的一个或多个特征，和/或含有流体性液滴的流体***(例如，围绕流体性液滴的液体)的一部分的特征的传感器。本领域普通技术人员可鉴定关于液滴的可确定的并且可用于本发明的特征。此类特征的非限制性实例包括物质诸如生物物质(例如，蛋白质、核酸等)等的荧光、光谱学(例如，光学、红外、紫外线等)、放射性、质量、体积、密度、温度、粘度、pH、浓度。
在一些情况下，可将传感器连接至处理器，所述处理器又使得能够在流体性液滴上进行操作，例如通过分选液滴，添加电荷或从液滴去除电荷，将液滴与另一个液滴融合，***液滴，使得在液滴内发生混合等(例如，如先前所述的)。例如，响应于流体性液滴的传感器测量，处理器可使流体性液滴***，与第二流体性液滴合并等。
可将一个或多个传感器和/或处理器放置成与流体性液滴传感通信。如本文中所用，“传感通信”意指可将传感器置于任何位置，只要使得流体***内(例如，通道内)的流体性液滴和/或包含流体性液滴的流体***的一部分可被感测和/或以某种方式确定即可。例如，传感器可以以流体、光学或可视、热、气动、电子等方式与流体性液滴和/或包含流体性液滴的流体***的一部分传感通信。可将传感器置于流体***附近，例如嵌入通道的壁内或整体连接至通道的壁，或者与流体***分开放置，但与流体***物理、电和/或光学通信，以便能够感测和/或确定流体性液滴和/或包含流体性液滴的流体***的一部分(例如，通道或微通道，包含流体性液滴的液体等)。例如，传感器可以与包含液滴的通道没有任何物理连接，但可将其放置成检测由液滴或流体***产生的电磁辐射，诸如红外线、紫外线或可见光。电磁辐射可由液滴产生，和/或可从流体***的其它部分(或流体***的外部)产生，并且以例如通过吸收、反射、衍射、折射、荧光、磷光、极性变化、相变、相对于时间的变化等来指示流体性液滴的一个或多个特性的方式，与流体性液滴和/或包含流体性液滴的流体***的部分相互作用。作为实例，可将激光导向流体性液滴和/或围绕流体性液滴的液体，并且可测定流体性液滴和/或周围液体的荧光。如本文中所用，“感测通信”也可以是直接或间接的。作为实例，可将来自流体性液滴的光导向传感器，或首先引导通过光纤***、波导等，然后导向传感器。
可用于本发明的传感器的非限制性实例包括光学或基于电磁的***。例如，传感器可以是荧光传感器(例如，通过激光激发的)、显微镜检查***(其可包括照相机或其它记录装置)等。作为另一个实例，传感器可以是电子传感器，例如能够测定电场或其它电特性的传感器。例如，传感器可检测流体性液滴和/或包含流体性液滴的流体***的部分的电容、电感(inductance)等。
如本文所使用的，“处理器”或“微处理器”是能够例如通过使用数学公式或者电子或计算电路而从一个或多个传感器接收信号、存储信号和/或引导一个或多个响应(例如，如上所述的)的任何组件或设备。信号可以是指示由传感器测定的环境因素的任何合适的信号，例如气动信号、电子信号、光学信号、机械信号等。
在一组实施方案中，可以通过在液滴上产生电荷和/或电偶极子、并且使用施加的电场操控液滴来引导流体性液滴，所述电场可以是交流电场、直流电场等。作为实例，可根据需要选择性施加和去除电场(或者可以施加不同的电场，例如反向电场)以将流体性液滴引导至特定区域。在一些实施方案中，可以根据需要选择性施加和去除电场，而基本上不改变含有流体性液滴的液体的流动。例如，液体可以以基本稳态的基础(即，含有流体性液滴的液体的平均流速偏离稳态流动或液体相对于时间的预期流动值小于20％或小于15％，以及在一些情况下，平均流速可偏离小于10％或小于5％)或其它预定的基础流动通过本发明的流体***(例如，通过通道或微通道)，并且可以例如使用电场将包含在液体内的流体性液滴引导至各个区域，而基本上不改变液体通过流体***的流动。
在一些实施方案中，可通过改变含有液滴的液体的流动来在本发明的流体***内筛选或分选流体性液滴。例如，在一组实施方案中，可通过将围绕流体性液滴的液体引导至第一通道、第二通道等中来操控或分选流体性液滴。
在另一组实施方案中，可控制流体***内例如不同通道内或通道的不同部分内的压力来引导流体性液滴的流动。例如，可将液滴引导至通道接合部，包括用于流动的进一步引导的多个选项(例如，引导至界定任选的下游流动通道的通道中的分支或分叉)。可控制一个或多个任选的下游流动通道内的压力以将液滴选择性地引导至通道之一中，并且可以以连续液滴到达接合部所需的时间的顺序实现压力的变化，使得每个连续液滴的下游流动路径可被独立地控制。在一种安排中，可将液体储存器的膨胀和/或收缩用于例如通过引起包含流体性液滴的液体的定向移动来将流体性液滴操控或分选至通道中。可这样放置液体储存器，使得当被激活时，由激活的储存器引起的液体的移动导致液体以优选的方向流动，从而在该优选的方向上运送流体性液滴。例如，液体储存器的膨胀可使液体流向储存器，而液体储存器的收缩可使液体流离储存器。在一些情况下，可将液体储存器的膨胀和/或收缩与其它流量控制装置和方法组合，例如，如本文所述的。能够引起液体储存器的膨胀和/或收缩的装置的非限制性实例包括活塞和压电部件。在一些情况下，压电部件由于其相对快的响应时间(例如，在对电信号的响应中)而可以是特别有用的。在一些实施方案中，流体性液滴可被分选至多于两个通道中。
如所提及的，某些实施方案总体上涉及用于分选液体中的流体性液滴的***和方法，在一些情况下，以相对高的速率进行所述分选。例如，可以以某种方式(例如，如本文进一步描述的)感测和/或确定液滴的性质，然后可将液滴引导至装置的特定区域，诸如微流体通道，例如以用于分选目的。在一些情况下，高分选速度是可使用本发明的某些***和方法来实现的。例如，在一些情况下可确定和/或分选每秒至少约10个液滴，在其它情况下，可确定和/或分选每秒至少约20个液滴，每秒至少约30个液滴，每秒至少约100个液滴，每秒至少约200个液滴，每秒至少约300个液滴，每秒至少约500个液滴，每秒至少约750个液滴，每秒至少约1,000个液滴，每秒至少约1,500个液滴，至少每秒约2,000个液滴，每秒至少约3,000个液滴，每秒至少约5,000个液滴，每秒至少约7,500个液滴，每秒至少约10,000个液滴，每秒至少约15,000个液滴，至少约20,000个液滴，每秒至少约30,000个液滴，每秒至少约50,000个液滴，每秒至少约75,000个液滴，每秒至少约100,000个液滴，每秒至少约150,000个液滴，每秒约200,000个液滴，每秒至少约300,000个液滴，每秒至少约500,000个液滴，每秒至少约750,000个液滴，每秒至少约1,000,000个液滴，每秒至少约1,500,000个液滴，每秒至少约2,000,000个或更多个液滴，或者每秒至少约3,000,000个或更多个液滴。
在一些方面，可以使用相对小的液滴的群体。在某些实施方案中，作为非限制性实例，液滴的平均直径在某些情况下可以小于约1mm，小于约500微米，小于约300微米，小于约200微米，小于约100微米，小于约75微米，小于约50微米，小于约30微米，小于约25微米，小于约20微米，小于约15微米，小于约10微米，小于约5微米，小于约3微米，小于约2微米，小于约1微米，小于约500nm，小于约300nm，小于约100nm或小于约50nm。液滴的平均直径也可以是至少约30nm，至少约50nm，至少约100nm，至少约300nm，至少约500nm，至少约1微米，至少约2微米，至少约3微米，至少约5微米，至少约10微米，至少约15微米或至少约20微米。液滴群体的“平均直径”是液滴直径的算术平均值。
在一些实施方案中，取决于特定的应用，液滴可具有基本上相同的形状和/或尺寸(即，“单分散”)或不同的形状和/或尺寸。在一些情况下，液滴可具有均匀的横截面直径分布，即，液滴可具有这样的直径分布，使得不超过约5％，不超过约2％或不超过约1％的液滴的直径小于约90％(或小于约95％，或小于约99％)和/或大于约110％(或大于约105％，或大于约101％)的所述多个液滴的总体平均直径。在由Link等于2004年4月9日提交的标题为“Formation and Control of Fluidic Species”的国际专利申请第PCT/US2004/010903号(在2004年10月28日公布为WO 2004/091763)(通过引用并入本文)中公开了用于产生液滴横截面直径均匀分布的一些技术。
本领域普通技术人员将能够例如使用激光散射或其它已知技术来测定液滴群体的平均直径。如此形成的液滴可以是球形的或在某些情况下可以是非球形的。在非球形液滴中，液滴的直径可以被视为与所述非球形液滴具有相同体积的完美数学球体的直径。
在一些实施方案中，可通过在由液体围绕的流体上产生电荷来在通道内产生一个或多个液滴，这可使流体在液体内分离成单个的液滴。在一些实施方案中，可将电场施加至流体以使液滴形成发生。流体可作为一系列单独带电和/或可电诱导的液滴存在于液体内。可使用任何合适的技术，例如通过将流体置于电场(可以是交流、直流电场等)内，和/或引起使流体具有电荷的反应发生来在液体内的流体中产生电荷。
在一些实施方案中，从电场发生器(即能够产生可施加至流体的电场的装置或***)产生电场。电场发生器可产生交流电场(即，相对于时间周期性(正弦波状地、锯齿波状地、正方形状地等)变化的电场)、直流电场(即，相对于时间恒定的电场)、脉冲电场等。用于产生合适的电场(其可以是交流电场、直流电场等)的技术是本领域普通技术人员已知的。例如，在一个实施方案中，通过对一对电极施加电压来产生电场，可将所述电极置于通道附近，使得电场的至少一部分与通道相互作用。电极可由本领域普通技术人员已知的任何合适的电极材料制成，包括但不限于银、金、铜、碳、铂、铜、钨、锡、镉、镍、铟氧化锡(indiumtin oxide,“ITO”)等，以及其组合。
在另一组实施方案中，可通过以能够诱导流体形成单个液滴的方式改变通道尺寸，从通道内的被液体围绕的流体产生流体的液滴。通道例如可以是相对于流动方向扩展，例如使得流体不附着至通道壁并相反地形成单个液滴的通道，或者可以是相对于流动方向变窄，例如使得流体被迫融合成单个液滴的通道。在一些情况下，可以以使单个液滴形成发生的方式相对于时间改变(例如，机械地或机电地、气动地等)通道尺寸。例如，可机械地收缩(“挤压”)通道以引起液滴形成，或者可以例如通过使用移动挡板、旋转叶片等机械地破裂流体流以引起液滴形成。其他产生液滴的技术包括例如流体的混合或涡旋。
某些实施方案总体上涉及用于将液滴***成两个或更多个液滴的***和方法。例如，可使用施加的电场来***液滴。液滴可具有比周围液体更大的电导率，并且在一些情况下，可使液滴呈电中性。在某些实施方案中，在施加的电场中，可促使电荷从液滴的内部迁移至待分布在其上的表面，这由此可消除液滴内部所经受的电场。在一些实施方案中，液滴表面上的电荷还可能由于所施加的电场而经受力，这导致具有相反极性的电荷以相反的方向迁移。在一些情况下，电荷迁移可导致液滴被拉分离成两个分离的液滴。
本发明的一些实施方案总体上涉及用于将两个或更多个液滴融合或聚结成一个液滴的***和方法，例如，其中两个或更多个液滴由于例如组成、表面张力、液滴尺寸、表面活性剂的存在或不存在等而通常不能融合或聚结。在某些情况下，相对于液滴的尺寸，液滴的表面张力也可防止液滴发生融合或聚结。
作为非限制性实例，两个液滴可被赋予相反的电荷(即，正电荷和负电荷，不一定具有相同的量值)，这可以增加两个液滴的电相互作用，使得液滴的融合或聚结由于其相反的电荷而发生。例如，可对液滴施用电场，使液滴通过电容器，化学反应可使液滴带电等。在一些情况下，即使施加表面活性剂以降低液滴的表面张力，液滴可能也不能融合。然而，如果液滴带有相反的电荷(其可具有但不一定具有相同的量级)，则液滴可能能够融合或聚结。作为另一个实例，液滴可能不一定被赋予相反的电荷(并且在一些情况下，可能不被赋予任何电荷)，从而通过使用在液滴中诱导的偶极子(其使得液滴聚结)来进行融合。此外，被允许聚结的所述两个或更多个液滴不一定需要满足“正面接触”(head-on)。只要液滴的至少一些融合最初发生，则任何角度的接触都是足够的。还参见例如由Ahn等在2007年1月24日提交的标题为“Fluidic Droplet Coalescence”的美国专利申请序列第11/698,298号(于2007年8月23日公布为美国专利申请公布第2007/0195127号)(通过引用整体并入本文)。
在一组实施方案中，可将流体注射至液滴中。在一些情况下，可以例如使用微针或其它这样的装置将流体显微注射至液滴中。在其它情况下，当液滴与流体通道接触时，可使用流体通道将流体直接注射至液滴中。在例如由Weitz等于2010年6月25日提交的标题为“Fluid Injection”的国际专利申请第PCT/US2010/040006号(于2010年12月29日公布为WO2010/151776)，或由Weitz等于2009年12月18日提交的标题为“Particle-AssistedNucleic Acid Sequencing”的国际专利申请第PCT/US2009/006649号(于2010年7月15日公布为WO 2010/080134)(每个专利申请通过引用整体并入本文)中公开了流体注射的其它技术。
根据本发明的某些方面，可使用各种材料和方法来形成制品或部件，诸如本文描述的那些制品或部件，例如通道诸如微流体通道、腔室等。例如，各种制品或部件可由固体材料形成，其中通道可通过显微机械加工、薄膜沉积工艺诸如旋涂和化学气相沉积、激光制造、光刻技术，蚀刻方法(包括湿化学或等离子体工艺)等形成。参见例如ScientificAmerican,248:44-55,1983(Angell等)。
在一组实施方案中，本文所述制品的各种结构或部件可由聚合物形成，例如弹性体聚合物诸如聚二甲基硅氧烷(“PDMS”)、聚四氟乙烯(“PTFE”或)等。例如，根据一个实施方案，微流体通道可通过使用PDMS或其它软光刻技术分别制造流体***来实现(在由Younan Xia和George M.Whitesides发表在Annual Review of Material Science,1998，第28卷，第153-184页中的标题为“Soft Lithography”的参考文献，和由GeorgeM.Whitesides,Emanuele Ostuni,Shuichi Takayama,Xingyu Jiang和Donald E.Ingber发表在Annual Review of Biomedical Engineering,2001，第3卷，第335-373页中的“SoftLithography in Biology and Biochemistry”的参考文献(这些参考文献的每一篇通过引用并入本文)中论述了适用于该实施方案的软光刻技术的细节)。
潜在合适的聚合物的其它实例包括但不限于聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、环烯烃共聚物(COC)、聚四氟乙烯、氟化聚合物、聚硅酮诸如聚二甲基硅氧烷、聚偏二氯乙烯，双-苯并环丁烯(“BCB”)、聚酰亚胺、聚酰亚胺的氟化衍生物等。还设想了涉及包括上述那些聚合物的聚合物的组合、共聚物或掺混物。所述装置也可由复合材料，例如聚合物和半导体材料的复合物形成。
在一些实施方案中，制品的各种结构或部件由聚合物和/或柔性和/或弹性体材料制造，并且可以方便地由可硬化流体形成，有利于通过模制(例如，复制模制、注射模制、浇铸模制等)制造。可硬化的流体可以是可被诱导而固化或自发固化成固体的基本上任何流体，所述固体能够包含和/或运输设想用于流体网络中以及与流体网络一起使用的流体。在一个实施方案中，可硬化的流体包含聚合物液体或液体聚合物前体(即“预聚物”)。合适的聚合物液体可包括例如加热至其熔点以上的热塑性聚合物、热固性聚合物、蜡、金属或其混合物或复合物。作为另一个实例，合适的聚合物液体可包括一种或多种聚合物在合适溶剂中的溶液，该溶液例如通过蒸发除去溶剂后形成固体聚合物材料。这种可从例如熔融状态或通过溶剂蒸发而固化的聚合物材料是本领域普通技术人员所熟知的。对于其中模具母版之一或两者由弹性体材料构成的实施方案，多种聚合物材料(其中许多是弹性体的)是合适的，并且也适用于形成模具或模具母版。这样的聚合物的实例的非限制性列表包括一般种类的硅酮聚合物、环氧聚合物和丙烯酸酯聚合物的聚合物。环氧聚合物的特征在于存在通常被称为环氧基、1,2-环氧化物或环氧乙烷的三元环醚基团。例如，除了基于芳族胺、三嗪和环脂族主链的化合物以外，还可使用双酚A的二缩水甘油醚。另一个实例包括众所周知的酚醛清漆(Novolac)聚合物。适合于根据本发明使用的硅酮弹性体的非限制性实例包括由前体(包括氯硅烷诸如甲基氯硅烷、乙基氯硅烷、苯基氯硅烷、十二烷基三氯硅烷等)形成的硅酮弹性体。
在某些实施方案中使用硅酮聚合物，例如硅酮弹性体聚二甲基硅氧烷。PDMS聚合物的非限制性实例包括由Dow Chemical Co.,Midland,MI以商标名Sylgard销售的那些聚合物，特别是Sylgard 182、Sylgard184和Sylgard 186。包括PDMS的硅酮聚合物具有简化本发明各种结构的制造的几种有益性质。例如，此类材料便宜，容易获得，并且可通过加热固化而从预聚合液体固化。例如，PDMS通常可通过将预聚合液体暴露于例如约65℃至约75℃的温度，持续例如约1小时的暴露时间来固化。此外，硅酮聚合物诸如PDMS可以是弹性体的，因此可用于形成本发明的某些实施方案中所必需的具有相对高的长宽比的非常小的部件。在这方面，柔性(例如，弹性体的)模具或母模可能是有利的。
从硅酮聚合物诸如PDMS形成结构诸如微流体结构或通道的一个有利方面是，例如通过暴露于含氧等离子体诸如空气等离子体来氧化这样的聚合物(使得氧化的结构在其表面含有能够与其它氧化的硅酮聚合物表面或多种其它聚合和非聚合材料的氧化表面交联的化学基团)的能力。因此，不需要单独的粘合剂或其它密封手段，就可以制造结构，然后将其氧化并基本上不可逆地密封至其它硅酮聚合物表面，或与氧化的硅酮聚合物表面反应的其它基底表面。在大多数情况下，密封可以简单地通过将氧化的硅酮表面与另一表面接触来完成，而不需要施加辅助压力来形成密封。也就是说，预先氧化的硅酮表面起着针对合适的配合表面的接触粘合剂的作用。具体而言，除了可对其本身不可逆地密封以外，氧化的硅酮诸如氧化的PDMS也可被不可逆地密封至除本身外的一系列氧化材料，包括例如玻璃、硅、氧化硅、石英、氮化硅、聚乙烯、聚苯乙烯、玻璃碳和环氧聚合物，已以类似于PDMS表面的方式对所述氧化材料进行了氧化(例如，通过暴露于含氧等离子体)。在本领域中，例如在标题为“Rapid Prototyping of Microfluidic Systems and Polydimethylsiloxane”，Anal.Chem.,70:474-480,1998(Duffy等)的论文(通过引用并入本文)中描述了可用于本发明中的氧化和密封方法以及整体模塑技术。
因此，在某些实施方案中，通过例如使用相对公知的软光刻和其它技术诸如本文所述的那些技术，制品的设计和/或制造可以是相对简单的。另外，在一些实施方案中，例如就几何形状而言，制品的快速和/或定制设计是可能的。在一组实施方案中，例如，在其中将制品与具有放射性、毒性、有毒、反应性、生物危害性等的物质一起使用和/或其中物质的特征(例如，毒理学特征、放射性特征等)未知的实施方案中，制品可以被制造成一次性的。从氧化的硅酮聚合物形成通道或其他结构(或内部的流体接触表面)的另一个有利方面是这些表面可以比典型的弹性体聚合物(其中需要亲水内表面)的表面更加亲水。这样的亲水性通道表面因此可以比由典型的未氧化弹性体聚合物或其它疏水性材料构成的结构更容易地用水溶液填充和润湿。
为了所有目的，将下面的文献各自通过引用整体并入本文：Weitz等的标题为“Methods and Systems for Droplet Tagging and Amplification”的美国专利申请序列第61/980,541号；Bernstein等的标题为“Systems and Methods for Droplet Tagging”的美国专利申请序列第61/981,123号；Link等的标题为“Formation and Control ofFluidic Species”的国际专利申请公布第WO 2004/091763号；Stone等的标题为“Methodand Apparatus for Fluid Dispersion”的国际专利申请公布第WO 2004/002627号；Weitz等的标题为“Method and Apparatus for Forming Multiple Emulsions”的国际专利申请公布第WO 2006/096571号；Link等的标题为“Electronic Control of Fluidic Species”的国际专利申请公布第WO 2005/021151号；Weitz等的标题为“Droplet CreationTechniques”的国际专利申请公布第WO 2011/056546号；Weitz等的标题为“Creation ofLibraries of Droplets and Related Species”的国际专利申请公布第WO 2010/033200号；Weitz等的标题为“Fluid Injection”的美国专利申请公布第2012-0132288号；Agresti等的标题为“Assay And Other Reactions InvolvingPoloplets”的国际专利申请公布第WO 2008/109176号；Weitz等的标题为“Fluid Injection”的国际专利申请公布第WO 2010/151776号；以及Weitz等的标题为“Systems and Methods for Barcoding Nucleic Acids”的美国专利申请序列第62/072,944号。
另外，以下文献通过引用整体并入本文：2014年4月17日提交的美国专利申请序列第61/981,123号；2015年4月17日提交的标题为“Systems and Methods for DropletTagging”的PCT专利申请序列第PCT/US2015/026338号；2014年4月17日提交的美国专利申请序列第61/981,108号；2015年4月17日提交的标题为“Methods and Systems forDroplet Tagging and Amplification”的PCT申请；2014年10月30日提交的美国专利申请序列第62/072,944号；以及2015年4月17日提交的标题为“Systems and Methods forBarcoding Nucleic Acids”的PCT专利申请序列第PCT/US2015/026443号。
以下实施例旨在举例说明本发明的某些实施方案，但并不举例说明本发明的全部范围。
实施例1
以下实例描述使用通用条形编码在液滴内进行高通量测序的各种***和方法。
Weitz等的标题为“Systems and Methods for Barcoding Nucleic Acids”的PCT申请，即专利申请序列第PCT/US2015/026443号(通过引用整体并入本文)一般性地描述了液滴微流体和条形码化的水凝胶。在某些实施方案中，可产生含有许多拷贝的含有条形码和poly-dT序列的DNA的聚丙烯酰胺水凝胶，以及包含一个条形编码珠、单个细胞、用于细胞裂解和逆转录的缓冲液以及逆转录酶的纳升液滴。可在液滴中进行单细胞逆转录，使得可将mRNA转录物转化为条形码化的cDNA。该cDNA可被制备成用于高通量测序。因为cDNA可能含有条形码以识别其来源细胞，所以可以例如在单个HiSeq运行中进行测序分析。这允许在单个实验中在精确度、成本和时间方面以前所未有的效率水平对数千个个体细胞进行转录分析。
本实例举例说明了通用条形编码珠的产生和用途。这些条形编码珠包含可接受靶特异性DNA寡核苷酸或特定PCR产物的通用衔接子。这样，一组通用的条形码可以适合于特异性识别任何目标核酸序列。这对方法的总体效用有重大影响，并可简化条形编码技术的商业化。例如，通过这种修改，可以以高质量控制来进行条形编码珠制造的技术上困难的部分，即具有附接的条形码的珠粒的合成。然后客户可进行直接的步骤来生成目标特异性试剂。
以下实施例举例说明了将携带DNA条形码的珠粒的文库与单个的模板(细胞、分子细胞器或细胞核，或其它离散模板)一起以及还与基因特异性引物一起包封的一般策略。通常如美国专利申请序列第62/072,944号中所述合成条形码化的珠粒。基因特异性引物允许扩增目标基因座，而珠粒递送的条形码化引物鉴定扩增子的模板来源。
实施例2
涉及扩增子条形码化的一个示例性方法如下。也参见图1。
在本实施例中，制备珠粒的池，其携带许多拷贝的具有单个条形码的引物，但整个珠粒池中具有至少100,000个不同的条形码。通常如美国专利申请序列第62/072,944中所述合成珠粒。然而，珠粒上条形码化的引物的3'末端可用通用扩增序列替换。将珠粒与单个的模板(例如，细胞、分子细胞器，或细胞核或其它离散模板)一起包封在具有基因特异性反向引物和基因特异性内部正向引物的皮升大小的液滴中。基因特异性内部正向引物可在其5'末端含有可与DNA条形码上的通用扩增序列互补的序列。
在液滴中进行两阶段PCR。使用由基因特异性内部正向引物和基因特异性反向引物组成的基因特异性对生成基因特异性扩增子。基因特异性内部正向引物的浓度可以低于基因特异性反向引物的浓度以确保其在扩增期间被基本上消耗。在PCR过程中产生的扩增子的正向末端的5'末端将包含通用扩增序列。然后，在PCR的第二阶段，条形码DNA可用作通用外部正向引物，并且可使用由珠粒固定的DNA和基因特异性反向引物组成的引物对进一步扩增扩增子。该过程将条形码序列整合至扩增子中。
第二阶段PCR的退火温度可以高于第一阶段PCR所用的退火温度。这可增加较长的附着于珠粒的DNA在第二阶段PCR中作为正向引物的使用。
然后将液滴破裂以取出条形码化的扩增子，并且可以进行PCR以添加Illumina测序所需的碱基。然后可执行测序，例如深度测序。
实施例3
本实施例举例说明了扩增子条形码化的另一种方法。也参见图2和3。在前面的实施例中，通过PCR将DNA条形码添加至目标扩增子。在本实施例中，可通过例如连接而将PCR扩增子的一端连接至条形编码珠。在本实施例中，在液滴中产生连接就绪的扩增子，然后将这些液滴合并以形成携带具有通用序列的DNA条形码的珠粒的文库，还可通过液滴合并方案来产生所述珠粒文库。
首先制备条形编码珠。制备珠粒的池，其携带许多拷贝的具有单个条形码的引物，但珠粒池中具有至少100,000个不同的条形码。基本上如美国专利申请序列第62/072,944号中所述合成珠粒。然而，可构建条形编码DNA分子，使得它们可有效地连接至目标PCR扩增子。
珠粒固定的条形编码DNA的游离末端可以是至少部分双链的，并且可在一条链的3'末端包含突出胸苷(T)。该修饰产生可以有效地连接至具有单个突出腺苷(A)的PCR扩增子的末端。
珠粒固定的条形编码DNA的游离末端可以是至少部分双链的，并且包含产生特异性“粘性末端”的突出序列。该粘性末端可以有效地连接至含有相应“互补”粘性末端的DNA片段。例如，用于生成靶特异性扩增子的PCR引物可包括编码特定限制性酶切位点的序列。用这些引物生成的扩增子可用限制性内切酶切割，以留下可与条固定的条形码(bar-immobilized barcode)上的粘性末端相容的末端。
珠粒固定的条形编码DNA的游离末端可以是至少部分单链的，并含有有效连接至具有特异性“粘性末端”的PCR产物或具有单个突出碱基的PCR产物的序列。
多种酶(包括但不限于连接酶、拓扑异构酶和重组酶)可用于将PCR扩增子连接至核酸条形码。多种酶(包括但不限于激酶、限制酶、II型S限制酶和单链切口酶)可用于制备条形编码DNA和PCR扩增子的末端以用于有效连接。一些策略可以生成粘性端端，使得条形码优先连接至扩增子，扩增子不连接至扩增子，并且条形码不连接至条形码。可组合各种分子生物学酶和方法以确保这些优选的组合。
可将模板(例如，单个分子或细胞)与模板特异性引物和PCR试剂一起包封至液滴(例如，皮升大小的液滴)。然后可以在液滴内进行PCR。反向引物可在其5'末端含有另外的序列，其编码用于测序的衔接子，例如Illumina测序引物。另外，可选择PCR引物和PCR条件以确保所生成的扩增子能够被有效地连接至核酸条形码。
例如，如果珠粒固定的DNA条形码的游离末端在一条链的3'末端包含突出胸苷(T)，则一个扩增子特异性引物可包含磷酸化的5'末端。另外，PCR酶和条件可将单个非模板化(突出)A附加至扩增子的3'末端。这样，扩增子和模板可使用例如T4DNA连接酶来共价连接。该连接的“顶链”可用作用于PCR的模板。可将珠粒固定的DNA的游离末端的5'链去磷酸化以确保扩增子的指定末端连接至条形编码的DNA。
作为另一个实例，如果珠粒固定的条形编码DNA的游离末端含有产生特定“粘性末端”的突出序列，则可用引物进行PCR，所述引物附加可被修饰以生成互补粘性末端的DNA。例如，PCR引物可添加被特定限制酶识别和切割、留下可与条形编码DNA的末端互补的DNA末端的序列。
在液滴中进行扩增反应后，可以例如通过皮可注射(参见，由Weitz等于2010年12月29日公布的标题为“Fluid Injection”的国际专利申请公布第WO 2010/151776号，通过引用整体并入本文)或其他合适的技术，将条形编码的水凝胶珠添加至含有PCR扩增子的液滴中。注射也可添加试剂以将扩增子连接至DNA条形码。例如，连接酶(或拓扑异构酶或类似的酶)可将A加尾的PCR扩增子连接至T加尾的条形编码DNA；如果扩增子末端需要修饰，则可添加连接酶和适当的限制酶(或切口酶)；和/或激酶或去磷酸化酶可用于分子生物学操作。
可孵育合并的液滴以允许扩增子与条形编码的DNA连接。然后，可破裂液滴，并进行另一轮PCR来生成全长衔接子。
在一些情况下，为了进一步提高对低拷贝模板的检测，可使用多种线性(低偏差)扩增方法。例如，条形码DNA可含有T7启动子序列以促进使用T7RNA聚合酶的线性扩增方法。
实施例4
在本实施例中，图1A所示的方法被用来显示单细胞靶向基因条形编码测序。选择两种细胞系。一个细胞系具有EGFR外显子21L858R突变，另一个具有EGFR外显子19缺失。通过以1:1、1:10、1:50和0:100的比率混合两种细胞系来制备一系列细胞混合物。使用微流体液滴制备器将单个细胞和裂解缓冲液共包封成50微米液滴。然后，使用微流体液体注射器来添加含有用于两个外显子区域的引物的PCR混合物，随后进行热循环。
为了对来自单个细胞的扩增子进行条形码化，使用了微流体珠粒注射器，其具有四个入口：上游的两个用于含有PCR扩增子和间隔油的液滴，下游的另外两个用于珠粒和PCR混合物的注射。将含有扩增子的液滴流入装置并使用具有1％w/w表面活性剂的HFE7500油将其分隔成单个纵行(file)。在装置的下游部分，通过电聚结将条形码化的珠粒和PCR混合物注入至液滴中。选择用于注射液滴的流速来确保一个条形码凝胶与含有gDNA的液滴融合。选择PCR混合物的流速以确保在聚结时以～1:1的比率添加缓冲液。收集液滴，进行第二轮滴内PCR，然后破裂液滴，并通过批量PCR(in-bulk PCR)向各个样品添加独特的指标，这使得样品一起被测序。
测序后，进行数据分析以确定来自每个单个细胞的基因型。结果示于图5中。在携带外显子19缺失的细胞系中，显示增加的比例。但在没有外显子21突变的细胞系中，使得当其与携带外显子21突变的细胞系混合时，突变外显子21的比率下降。
虽然本文已经描述和举例说明了本发明的几个实施方案，但本领域普通技术人员将容易地设想出用于执行功能和/或获得本文所述的结果和/或一个或多个有利方面的各种其它手段和/或结构，并且此类变化和/或修改中的每一个被认为在本发明的范围内。更一般地，本领域技术人员将容易理解，本文所述的所有参数、尺寸、材料和配置均是示例性的，并且实际参数、尺寸、材料和/或配置将取决于本发明的教导所应用的一种或多种具体应用。本领域技术人员将认识到或能够使用不超过常规实验来确定本文所述的本发明具体实施方案的许多等效方案。因此，应当理解，前述实施方案仅作为实例来提供，并且在所附权利要求及其等同物的范围内，本发明可以以不同于具体描述和要求保护的方式实施。本发明涉及本文所述的各个特征、***、制品、材料、试剂盒和/或方法。另外，如果此类特征、***、制品、材料、试剂盒和/或方法不相互矛盾，则两个或更多个这样的特征、***、制品、材料、试剂盒和/或方法的任何组合都包括在本发明的范围内。
所有定义，如本文中定义和使用的，应理解为优先于词典定义、通过引用并入的文献中的定义和/或定义的术语的普通含义。
如在本说明书和权利要求中所用，不定冠词“一个/种(a)”和“一个/种(an)”除非明确指出有相反含义，否则应理解为“至少一个/种”。
如在本说明书和权利要求书中所用，短语“和/或”应当理解为是指所连接的元素中的“任一者或两者”，即在某些情况下结合存在以及其它情况下分开存在的元素。通过“和/或”列出的多个元素应以相同的方式来解释，即所连接的“一个或多个”元素。除由“和/或”从句明确指定的元素之外的其它元素，无论与明确指定的元素是否相关，可任选地存在。因此，作为非限制性示例，当结合诸如“包含”的开放式语言使用时，提及“A和/或B”时可在一个实施例中仅指A(任选地包括除B外的元素)；在另一个实施方案中仅指B(任选地包括除A外的元素)；在又一个实施方案中，指A和B二者(任选地包括其它元素)；等等。
如本说明书和权利要求中所使用，“或”应理解为具有与上述定义的“和/或”相同的含义。例如，当分隔列表中的项目时，“或”或“和/或”将被解释为包容性的，即，包括许多元素或元素列表中的至少一个，但也可包括不止一个，并且任选地，还可包括另外的未列表的项。只有明确指出相反的项，否则诸如“其中只有一个”或“其中正好一个”，或在权利要求中使用时，“由...组成”，将指许多元素或元素列表中正好一个元素的包信。一般地，如本文中所用，当前置排他性术语诸如“任一”、“其中之一”、“其中只有一个”或“其中正好一个”时，术语“或”应当仅被解释为指示排他性供选方案(即“一个或另一个但不是两者”)。当在权利要求中使用时，“基本上由...组成”具有在专利法领域中使用的普通含义。
如本说明书和权利要求书中所用，短语“至少一个”对于一个或多个元素的列表应当被理解为意指从元素列表中的任一个或多个元素选择的至少一个元素，但不一定包括在元素列表中具体列出的每个和每一个元素中的至少一个元素，并且不排除元素列表中的元素的任何组合。该定义还允许除了在短语“至少一个”所指的元素列表中具体指定的元素以外的元素可任选地存在，而无论与明确指定的那些元素是否相关。因此，作为非限制性实例，“A和B中的至少一个”(或等效地，“A或B中的至少一个”，或等效地“A和/或B中的至少一个”)可在一个实施方案中指至少一个，任选地包括不止一个A，但不存在B(和任选地包括除B外的元素)；在另一个实施方案中，指至少一个，任选地包括不止一个B，但不存在A(和任选地包括除A外的元素)；在另一个实施方案中，指至少一个，任选地包括不止一个A，任选地包括不止一个B(和任选地包括其它元素)；等等。
当单词“约”在本文中用于指数量时，应当理解，本发明的另一个实施方案发包括不被“约”这个词的存在修饰的那个数字。
还应当理解，除非明确地指出相反，否则在本文所要求保护的包括不止一个步骤或动作的任何方法中，方法的步骤或动作的顺序不一定限于其中引述该方法的步骤或动作的顺序。
在权利要求以及上述说明书中，所有过渡性短语如“包含”、“包含”、“携带”、“具有”、“含有”、“涉及”、“持有”、“包括”等应理解为是开放式的，即意味着包括但不限于此。只有“由...组成”和“基本上由...组成”的过渡性短语分别是“美国专利局专利审查程序手册”第2111.03节中规定的封闭或半封闭的过渡词。
序列表
<110> PRESIDENT AND FELLOWS OF HARVARD COLLEGE
<120> 用于基因测序和其它应用的条形编码***及方法
<130> H0498.70542WO00
<140> Not Yet Assigned
<141> Concurrently Herewith
<150> US 62/149,361
<151> 2015-04-17
<160> 13
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 1
acactctttc cctacacgac gctcttccga tct 33
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 2
gtctcggcat tcctgctgaa c 21
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 3
gcctctgttc gtctcg 16
<210> 4
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 4
gcctctgttc gtctcgtaga ggcagtcatc gcagtg 36
<210> 5
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 5
gtctcggcat tcctgctgaa cgacctacca atcccattcc tt 42
<210> 6
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 6
tcggtcattc a 11
<210> 7
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 7
tcggcagcgt cagatgtgta taagagacag t 31
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 8
ctgtctctta tacacatctg acgctgccga 30
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> 被硫代磷酸酯键所修饰
<400> 9
tagaggcagt catcgcagtg 20
<210> 10
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(23)
<223> n 是 a, c, g, 或t
<400> 10
tcggcagcgt cagatgtgnn nnngagacc 29
<210> 11
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(11)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<400> 11
ggtctcnnnn ncacatctga cgctgccga 29
<210> 12
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(23)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<400> 12
tcggcagcgt cagatgtgnn nnngagacct agaggcagtc atcgcagtg 49
<210> 13
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 13
cgatgacgta atacgactca ctatagggat accaccatgg ctctttccct acacgacgct 60
cttc 64

Claims (96)

1.一种方法，其包括：
提供包含颗粒的多个液滴，使得至少约90％的所述液滴包含一个颗粒或不包含颗粒，所述颗粒包含寡核苷酸，所述寡核苷酸包含条形码序列：选自预先确定的第一条形码池的第一条形码和选自预先确定的第二条形码池的第二条形码，使得基本上每个所述颗粒包括可区分的条形码序列；以及
将核酸序列附接至所述寡核苷酸。
2.权利要求1的方法，其中所述颗粒包含水凝胶颗粒。
3.权利要求1或2中任一项的方法，其中所述多个液滴包括微流体液滴。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述预先确定的第一条形码池包含至少约300个可区分的条形码。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述预先确定的第一条形码池包含至少约1,000个可区分的条形码。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述预先确定的第一条形码池包含至少约3,000个可区分的条形码。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述预先确定的第二条形码池包含至少约300个可区分的条形码。
8.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述预先确定的的第二条形码池包含至少约1,000个可区分的条形码。
9.权利要求1至8中任一项的方法，其中所述预先确定的第二条形码池包括至少约3,000个可区分的条形码。
10.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述可区分的条形码序列包含至少10,000个可区分的条形码序列。
11.权利要求1-10中任一项的方法，其中所述可区分的条形码序列包含至少100,000个可区分的条形码序列。
12.权利要求1-11中任一项的方法，其中所述核酸序列被配置成与基因组DNA结合。
13.权利要求12所述的方法，其中所述基因组DNA包含人基因组DNA。
14.权利要求1-13中任一项的方法，其中所述核酸序列被配置成与基因结合。
15.权利要求1-14中任一项的方法，其中将至少一些所述寡核苷酸附接至所述颗粒的表面。
16.权利要求1-15中任一项的方法，其中将至少一些所述寡核苷酸共价键合至所述颗粒。
17.权利要求16的方法，其中至少一些所述寡核苷酸通过丙烯酸亚磷酰胺连键共价键合至所述颗粒。
18.权利要求16或17中任一项的方法，其中至少一些所述寡核苷酸中通过氨基连键共价键合至所述颗粒。
19.权利要求1-18中任一项的方法，其中至少一些所述寡核苷酸通过生物素-链霉抗生物素蛋白连键共价键合至所述颗粒。
20.权利要求1-19中任一项的方法，其中至少一些所述寡核苷酸包含可切割的连接子。
21.权利要求20的方法，其中所述可切割的连接子是光可切割的连接子。
22.权利要求20的方法，其中所述可切割连接子是化学可切割的连接子。
23.权利要求20的方法，其中所述可切割的连接子是酶可切割的连接子。
24.权利要求1-23中任一项的方法，其还包括从所述颗粒中释放至少一些所述寡核苷酸。
25.权利要求1-24中任一项的方法，其中至少约95％的所述液滴包含一个水凝胶颗粒或不包含水凝胶颗粒。
26.权利要求1-25中任一项的方法，其中以不超过约1个颗粒/液滴将所述颗粒包含在所述液滴内。
27.权利要求1-26中任一项的方法，其中以不超过约0.1个颗粒/液滴将所述颗粒包含在所述液滴内。
28.权利要求1-27中任一项的方法，其中以不超过约0.01个颗粒/液滴将所述颗粒包含在所述液滴内。
29.权利要求1-28中任一项的方法，其中所述多个颗粒具有不超过约500微米的平均直径。
30.权利要求1至29中任一项的方法，其中所述多个颗粒具有至少约1微米的平均直径。
31.权利要求1至30中任一项的方法，其还包括将附接至所述寡核苷酸的所述核酸序列暴露于从多个细胞产生的核酸。
32.权利要求31的方法，其中所述多个细胞存在于所述多个液滴中的至少一些中。
33.权利要求31或32中任一项的方法，其中所述多个细胞以不超过1个细胞/液滴存在于所述多个液滴中。
34.权利要求31-33中任一项的方法，其中所述多个细胞以不超过0.1个细胞/液滴存在于所述多个液滴中。
35.权利要求31-34中任一项的方法，其中所述多个细胞以不超过0.01个细胞/液滴存在于所述多个液滴中。
36.权利要求31-35中任一项的方法，其中至少约90％的所述液滴包含一个细胞或不包含细胞。
37.权利要求31-36中任一项的方法，其还包括裂解所述液滴内的至少一些所述细胞。
38.权利要求37的方法，其包括使用细胞裂解试剂裂解所述液滴内的至少一些细胞。
39.权利要求31-38中任一项的方法，其中至少一些所述细胞是人细胞。
40.权利要求31-39中任一项的方法，其中所述核酸序列疑似识别至少一些从所述细胞产生的所述核酸。
41.权利要求40的方法，其中所述核酸序列疑似识别存在于从所述细胞产生的至少一些核酸中的基因。
42.权利要求1至41中任一项的方法，其中将核酸序列附接至所述寡核苷酸包括：
将所述衔接子序列暴露于包含互补衔接子序列的序列和引物；
将所述引物暴露于包含所述引物的靶标的核酸序列；以及
应用扩增以产生包含所述第一条形码、所述第二条形码和所述核酸序列的寡核苷酸。
43.权利要求1-42中任一项的方法，其中将核酸序列附接至所述寡核苷酸包括将核酸序列直接附接至所述寡核苷酸。
44.权利要求1-43中任一项的方法，其中将核酸序列附接至所述寡核苷酸包括将核酸序列酶促附接至所述寡核苷酸。
45.权利要求1-44中任一项的方法，其中将核酸序列附接至所述寡核苷酸包括将核酸序列与所述寡核苷酸连接。
46.一种方法，其包括：
提供包含颗粒的多个液滴，使得至少约90％的所述液滴包含一个颗粒或不包含颗粒，所述颗粒包含寡核苷酸，所述寡核苷酸包含条形码序列：选自预先确定的第一条形码池的第一条形码和选自预先确定的第二条形码池的第二条形码，以及衔接子序列，使得基本上每个所述颗粒包含可区分的条形码序列；
将所述衔接子序列暴露于包含互补衔接子序列的序列和引物；
将所述引物暴露于包含所述引物的靶标的核酸序列；以及
应用扩增以产生包含所述第一条形码、所述第二条形码和所述核酸序列的寡核苷酸。
47.权利要求46的方法，其还包括扩增所述液滴内的所述核酸序列。
48.权利要求47的方法，其包括扩增所述液滴内的所述核酸序列，然后应用扩增以产生包含所述第一条形码、所述第二条形码和所述核酸序列的寡核苷酸。
49.权利要求46-48中任一项的方法，其中所述衔接子序列包含不多于10个核苷酸。
50.权利要求46-49中任一项的方法，其中所述衔接子序列包含至少5个核苷酸。
51.权利要求46-50中任一项的方法，其中所述引物包含基因特异性引物。
52.权利要求46-51中任一项的方法，其中所述核酸序列被配置成与基因组DNA结合。
53.权利要求52的方法，其中所述基因组DNA包含人基因组DNA。
54.权利要求46至53中任一项的方法，其中所述核酸序列被配置成与基因结合。
55.权利要求46-54中任一项的方法，其中所述颗粒包含水凝胶颗粒。
56.权利要求46-55中任一项的方法，其中所述多个液滴包括微流体液滴。
57.权利要求46-56中任一项的方法，其中所述预先确定的第一条形码池包括至少约300个可区分的条形码。
58.权利要求46-57中任一项的方法，其中所述预先确定的第一条形码池包括至少约1,000个可区分的条形码。
59.权利要求46-58中任一项的方法，其中所述预先确定的第一条形码池包括至少约3,000个可区分的条形码。
60.权利要求46-59中任一项的方法，其中所述预先确定的第二条形码池包括至少约300个可区分的条形码。
61.权利要求46-60中任一项的方法，其中所述预先确定的第二条形码池包括至少约1,000个可区分的条形码。
62.权利要求46-61中任一项的方法，其中所述预先确定的第二条形码池包含至少约3,000个可区分的条形码。
63.权利要求46-62中任一项的方法，其中所述可区分的条形码序列包含至少10,000个可区分的条形码序列。
64.权利要求46-63中任一项的方法，其中所述可区分的条形码序列包含至少100,000个可区分的条形码序列。
65.权利要求46-64中任一项的方法，其中将至少一些所述寡核苷酸附接于所述颗粒的表面。
66.权利要求46-65中任一项的方法，其中至少一些所述寡核苷酸共价键合至所述颗粒。
67.权利要求66所述的方法，其中至少一些所述寡核苷酸通过丙烯酸亚磷酰胺连键共价键合至所述颗粒。
68.权利要求66或67中任一项的方法，其中至少一些所述寡核苷酸中通过氨基连键共价键合至所述颗粒。
69.权利要求46-68中任一项的方法，其中至少一些所述寡核苷酸通过生物素-链霉抗生物素蛋白连键共价键合至所述颗粒。
70.权利要求46-69中任一项的方法，其中至少一些所述寡核苷酸包含可切割的连接子。
71.权利要求70所述的方法，其中所述可切割的连接子是可光切割的连接子。
72.权利要求70的方法，其中所述可切割的连接子是可化学切割的连接子。
73.权利要求70的方法，其中所述可切割的连接子是可酶促切割的连接子。
74.权利要求46-73中任一项的方法，其还包括从所述颗粒释放至少一些所述寡核苷酸。
75.权利要求46-74中任一项的方法，其中至少约95％的所述液滴包含一个水凝胶颗粒或不包含水凝胶颗粒。
76.权利要求46-75中任一项的方法，其中以不超过约1个颗粒/液滴将所述颗粒包含在所述液滴内。
77.权利要求46-76中任一项的方法，其中以不超过约0.1个颗粒/液滴将所述颗粒包含在所述液滴内。
78.权利要求46-77中任一项的方法，其中以不超过约0.01个颗粒/液滴将所述颗粒包含在所述液滴内。
79.权利要求46-78中任一项的方法，其中所述多个颗粒具有不超过约500微米的平均直径。
80.权利要求46-79中任一项的方法，其中所述多个颗粒具有至少约1微米的平均直径。
81.权利要求46至80中任一项的方法，其还包括将附接至所述寡核苷酸的所述核酸序列暴露于从多个细胞产生的核酸。
82.权利要求81的方法，其中所述多个细胞存在于所述多个液滴中的至少一些中。
83.权利要求81或82中任一项的方法，其中所述多个细胞以不超过1个细胞/液滴存在于所述多个液滴中。
84.权利要求81-83中任一项的方法，其中所述多个细胞以不超过0.1个细胞/液滴存在于所述多个液滴中。
85.权利要求81-84中任一项的方法，其中所述多个细胞以不超过0.01个细胞/液滴存在于所述多个液滴中。
86.权利要求81-85中任一项的方法，其中至少约90％的所述液滴包含一个细胞或不包含细胞。
87.权利要求81-86中任一项的方法，其还包括裂解所述液滴内的至少一些所述细胞。
88.权利要求87的方法，其包括使用细胞裂解试剂裂解所述液滴内的至少一些所述细胞。
89.权利要求81-88中任一项的方法，其中至少一些所述细胞是人细胞。
90.权利要求81-89中任一项的方法，其中所述核酸序列疑似识别至少一些由所述细胞产生的所述核酸。
91.权利要求90的方法，其中所述核酸序列疑似识别从所述细胞产生的所述核酸中的至少一些中存在的基因。
92.一种方法，其包括：
提供附接有寡核苷酸的多个颗粒，所述寡核苷酸包含选自预先确定的第一条形码池的第一条形码、选自预先确定的第二条形码池的第二条形码和衔接子序列；以及
通过所述衔接子序列将核酸序列附接至所述寡核苷酸。
93.一种方法，其包括：
将多个细胞和多个颗粒包封在多个微流体液滴内，基本上每个所述颗粒包含寡核苷酸和与其共价键合的核酸序列，使得至少10,000个所述多个液滴中的每个液滴含有与包含在所述多个液滴的其它液滴中的寡核苷酸可区分的一个或多个寡核苷酸；
裂解所述液滴内的至少一些所述细胞以从所述细胞释放核酸，其中所述核酸序列包含能够与至少一些所述释放的核酸相互作用的部分；以及
选择性扩增所述液滴内的所述释放核酸的部分以产生包含所述扩增部分和所述寡核苷酸的序列。
94.一种方法，其包括：
提供多个至少10,000个含有细胞的微流体液滴，至少约90％的所述多个液滴含有一个细胞或不含细胞；
裂解所述多个微流体液滴内的所述细胞以从所述细胞释放核酸；以及
在与寡核苷酸结合的所述液滴内选择性产生扩增的核酸，其中对于至少约90％的所述液滴，所述液滴内的所述寡核苷酸与所述多个液滴中的其它液滴内的寡核苷酸可区分。
95.一种方法，其包括：
提供多个至少约10,000个含有细胞的微流体液滴，使得不超过10％的所述液滴含有两个或更多个细胞；
裂解所述多个液滴内的细胞以从所述细胞释放核酸；以及
选择性扩增所述液滴内的所述释放核酸的部分以产生包含所述扩增部分和液滴特异性条形码的序列。
96.一种方法，其包括：
提供包含细胞的液滴，使得不超过10％的所述液滴含有两个或更多个细胞；
裂解所述多个液滴内的细胞以从所述细胞释放核酸；以及
在所述液滴内选择性扩增所述释放核酸的部分，以产生包含所述扩增部分和选自至少10,000个可区分条形码的池内的条形码的序列。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110249214A (zh) * 2019-04-29 2019-09-17 京东方科技集团股份有限公司 细胞检测方法和细胞检测装置

Families Citing this family (82)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013134261A1 (en) 2012-03-05 2013-09-12 President And Fellows Of Harvard College Systems and methods for epigenetic sequencing
US9388465B2 (en) 2013-02-08 2016-07-12 10X Genomics, Inc. Polynucleotide barcode generation
US10400280B2 (en) 2012-08-14 2019-09-03 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US9701998B2 (en) 2012-12-14 2017-07-11 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US11591637B2 (en) 2012-08-14 2023-02-28 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
US10752949B2 (en) 2012-08-14 2020-08-25 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10323279B2 (en) 2012-08-14 2019-06-18 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US9951386B2 (en) 2014-06-26 2018-04-24 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10533221B2 (en) 2012-12-14 2020-01-14 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
CA2894694C (en) 2012-12-14 2023-04-25 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US9824068B2 (en) 2013-12-16 2017-11-21 10X Genomics, Inc. Methods and apparatus for sorting data
US20150298091A1 (en) 2014-04-21 2015-10-22 President And Fellows Of Harvard College Systems and methods for barcoding nucleic acids
EP3889325A1 (en) 2014-06-26 2021-10-06 10X Genomics, Inc. Methods of analyzing nucleic acids from individual cells or cell populations
EP3244992B1 (en) 2015-01-12 2023-03-08 10X Genomics, Inc. Processes for barcoding nucleic acids
EP4286516A3 (en) 2015-02-24 2024-03-06 10X Genomics, Inc. Partition processing methods and systems
AU2016248995B2 (en) 2015-04-17 2022-04-28 President And Fellows Of Harvard College Barcoding systems and methods for gene sequencing and other applications
US11225689B2 (en) 2016-08-17 2022-01-18 The Broad Institute, Inc. Method for determination and identification of cell signatures and cell markers
CA3043489A1 (en) 2016-11-21 2018-05-24 Nanostring Technologies, Inc. Chemical compositions and methods of using same
US10815525B2 (en) 2016-12-22 2020-10-27 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10550429B2 (en) 2016-12-22 2020-02-04 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
GB201622222D0 (en) 2016-12-23 2017-02-08 Cs Genetics Ltd Reagents and methods for molecular barcoding of nucleic acids of single cells
EP4029939B1 (en) 2017-01-30 2023-06-28 10X Genomics, Inc. Methods and systems for droplet-based single cell barcoding
WO2018183908A1 (en) 2017-03-31 2018-10-04 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Compositions and methods for treating ovarian tumors
WO2018183921A1 (en) 2017-04-01 2018-10-04 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for detecting and modulating an immunotherapy resistance gene signature in cancer
WO2018191553A1 (en) 2017-04-12 2018-10-18 Massachusetts Eye And Ear Infirmary Tumor signature for metastasis, compositions of matter methods of use thereof
US11072816B2 (en) 2017-05-03 2021-07-27 The Broad Institute, Inc. Single-cell proteomic assay using aptamers
US10544413B2 (en) 2017-05-18 2020-01-28 10X Genomics, Inc. Methods and systems for sorting droplets and beads
CN110945139B (zh) 2017-05-18 2023-09-05 10X基因组学有限公司 用于分选液滴和珠的方法和***
MA49352A (fr) * 2017-05-26 2020-04-08 Abvitro Llc Séquençage de bibliothèque de polynucléotides à haut rendement et analyse de transcriptome
US10844372B2 (en) 2017-05-26 2020-11-24 10X Genomics, Inc. Single cell analysis of transposase accessible chromatin
CN116064732A (zh) 2017-05-26 2023-05-05 10X基因组学有限公司 转座酶可接近性染色质的单细胞分析
WO2018232195A1 (en) 2017-06-14 2018-12-20 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods targeting complement component 3 for inhibiting tumor growth
US20190064173A1 (en) 2017-08-22 2019-02-28 10X Genomics, Inc. Methods of producing droplets including a particle and an analyte
EP3692152A4 (en) 2017-10-04 2021-12-01 The Broad Institute, Inc. PROCESSES AND COMPOSITIONS FOR MODIFYING THE FUNCTION AND STRUCTURE OF CHROMATIN LOOPS AND / OR DOMAINS
US10837047B2 (en) 2017-10-04 2020-11-17 10X Genomics, Inc. Compositions, methods, and systems for bead formation using improved polymers
WO2019079362A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 Massachusetts Institute Of Technology HOST-PATHOGENIC INTERACTION OF MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
WO2019084055A1 (en) 2017-10-23 2019-05-02 Massachusetts Institute Of Technology CLASSIFICATION OF GENETIC VARIATION FROM UNICELLULAR TRANSCRIPTOMS
WO2019083852A1 (en) 2017-10-26 2019-05-02 10X Genomics, Inc. MICROFLUIDIC CHANNEL NETWORKS FOR PARTITIONING
EP3625361A1 (en) * 2017-11-15 2020-03-25 10X Genomics, Inc. Functionalized gel beads
US10829815B2 (en) 2017-11-17 2020-11-10 10X Genomics, Inc. Methods and systems for associating physical and genetic properties of biological particles
WO2019113506A1 (en) 2017-12-07 2019-06-13 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for multiplexing single cell and single nuclei sequencing
US11994512B2 (en) 2018-01-04 2024-05-28 Massachusetts Institute Of Technology Single-cell genomic methods to generate ex vivo cell systems that recapitulate in vivo biology with improved fidelity
EP3752832A1 (en) 2018-02-12 2020-12-23 10X Genomics, Inc. Methods characterizing multiple analytes from individual cells or cell populations
US11639928B2 (en) 2018-02-22 2023-05-02 10X Genomics, Inc. Methods and systems for characterizing analytes from individual cells or cell populations
US11841371B2 (en) 2018-03-13 2023-12-12 The Broad Institute, Inc. Proteomics and spatial patterning using antenna networks
WO2019195166A1 (en) 2018-04-06 2019-10-10 10X Genomics, Inc. Systems and methods for quality control in single cell processing
US11957695B2 (en) 2018-04-26 2024-04-16 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions targeting glucocorticoid signaling for modulating immune responses
WO2019213660A2 (en) 2018-05-04 2019-11-07 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for modulating cgrp signaling to regulate innate lymphoid cell inflammatory responses
EP3794146A1 (en) 2018-05-14 2021-03-24 Nanostring Technologies, Inc. Chemical compositions and methods of using same
US11414701B2 (en) 2018-05-24 2022-08-16 The Broad Institute, Inc. Multimodal readouts for quantifying and sequencing nucleic acids in single cells
US20210371932A1 (en) 2018-06-01 2021-12-02 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for detecting and modulating microenvironment gene signatures from the csf of metastasis patients
US11932899B2 (en) 2018-06-07 2024-03-19 10X Genomics, Inc. Methods and systems for characterizing nucleic acid molecules
WO2019241273A1 (en) 2018-06-11 2019-12-19 The Broad Institute, Inc. Lineage tracing using mitochondrial genome mutations and single cell genomics
US11703427B2 (en) 2018-06-25 2023-07-18 10X Genomics, Inc. Methods and systems for cell and bead processing
US20200032335A1 (en) 2018-07-27 2020-01-30 10X Genomics, Inc. Systems and methods for metabolome analysis
US20220401460A1 (en) 2018-10-10 2022-12-22 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Modulating resistance to bcl-2 inhibitors
WO2020077236A1 (en) 2018-10-12 2020-04-16 The Broad Institute, Inc. Method for extracting nuclei or whole cells from formalin-fixed paraffin-embedded tissues
US20210379057A1 (en) 2018-10-16 2021-12-09 Massachusetts Institute Of Technology Nutlin-3a for use in treating a mycobacterium tuberculosis infection
EP3894593A2 (en) 2018-12-13 2021-10-20 DNA Script Direct oligonucleotide synthesis on cells and biomolecules
US11845983B1 (en) 2019-01-09 2023-12-19 10X Genomics, Inc. Methods and systems for multiplexing of droplet based assays
US20220119871A1 (en) 2019-01-28 2022-04-21 The Broad Institute, Inc. In-situ spatial transcriptomics
US11851683B1 (en) 2019-02-12 2023-12-26 10X Genomics, Inc. Methods and systems for selective analysis of cellular samples
WO2020172343A2 (en) 2019-02-19 2020-08-27 Massachusetts Institute Of Technology Methods for treating injuries
US11655499B1 (en) 2019-02-25 2023-05-23 10X Genomics, Inc. Detection of sequence elements in nucleic acid molecules
EP3938537A1 (en) 2019-03-11 2022-01-19 10X Genomics, Inc. Systems and methods for processing optically tagged beads
WO2020186101A1 (en) 2019-03-12 2020-09-17 The Broad Institute, Inc. Detection means, compositions and methods for modulating synovial sarcoma cells
EP3937969A1 (en) 2019-03-14 2022-01-19 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for modulating cgrp signaling to regulate intestinal innate lymphoid cells
EP3942023A1 (en) 2019-03-18 2022-01-26 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for modulating metabolic regulators of t cell pathogenicity
US20220152148A1 (en) 2019-03-18 2022-05-19 The Broad Institute, Inc. Modulation of type 2 immunity by targeting clec-2 signaling
US20220282333A1 (en) 2019-08-13 2022-09-08 The General Hospital Corporation Methods for predicting outcomes of checkpoint inhibition and treatment thereof
US11981922B2 (en) 2019-10-03 2024-05-14 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods and compositions for the modulation of cell interactions and signaling in the tumor microenvironment
US11793787B2 (en) 2019-10-07 2023-10-24 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for enhancing anti-tumor immunity by targeting steroidogenesis
KR20220097404A (ko) 2019-10-10 2022-07-07 1859, 인크. 미세유체 스크리닝을 위한 방법 및 시스템
US11844800B2 (en) 2019-10-30 2023-12-19 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for predicting and preventing relapse of acute lymphoblastic leukemia
WO2021127610A1 (en) 2019-12-20 2021-06-24 EDWARD Via COLLEGE OF OSTEOPATHIC MEDICINE Cancer signatures, methods of generating cancer signatures, and uses thereof
EP4090740A4 (en) * 2020-01-14 2024-01-03 Harvard College DEVICES AND METHODS FOR DETERMINING NUCLEIC ACIDS USING DROPLET DIGITAL PCR AND RELATED TECHNIQUES
US11851700B1 (en) 2020-05-13 2023-12-26 10X Genomics, Inc. Methods, kits, and compositions for processing extracellular molecules
WO2022061161A1 (en) * 2020-09-18 2022-03-24 Reopen Diagnostics, LLC Methods and compositions for rapid and high throughput diagnosis
AU2022227563A1 (en) 2021-02-23 2023-08-24 10X Genomics, Inc. Probe-based analysis of nucleic acids and proteins
US20240150453A1 (en) 2021-03-09 2024-05-09 Massachusetts Institute Of Technology Methods of predicting response to anti-tnf blockade in inflammatory bowel disease
WO2024073375A2 (en) * 2022-09-26 2024-04-04 President And Fellows Of Harvard College Systems and methods for screening of large gene libraries
WO2024076728A1 (en) 2022-10-06 2024-04-11 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Cyclic nucleotides and uses thereof

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110033854A1 (en) * 2007-12-05 2011-02-10 Complete Genomics, Inc. Methods and compositions for long fragment read sequencing
CN103717749A (zh) * 2011-04-25 2014-04-09 伯乐生命医学产品有限公司 用于核酸分析的方法和组合物
WO2014210353A2 (en) * 2013-06-27 2014-12-31 10X Technologies, Inc. Compositions and methods for sample processing
US20150051117A1 (en) * 2013-08-16 2015-02-19 President And Fellows Of Harvard College Assembly of Nucleic Acid Sequences in Emulsions
US20150057163A1 (en) * 2012-03-05 2015-02-26 The General Hospital Corporation Systems and methods for epigenetic sequencing

Family Cites Families (120)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6013445A (en) 1996-06-06 2000-01-11 Lynx Therapeutics, Inc. Massively parallel signature sequencing by ligation of encoded adaptors
US5750346A (en) 1995-08-07 1998-05-12 The Perkin-Elmer Corporation Host organism capture
US6825047B1 (en) 1996-04-03 2004-11-30 Applera Corporation Device and method for multiple analyte detection
US6750016B2 (en) 1996-07-29 2004-06-15 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
US6054278A (en) 1997-05-05 2000-04-25 The Perkin-Elmer Corporation Ribosomal RNA gene polymorphism based microorganism identification
US6974669B2 (en) 2000-03-28 2005-12-13 Nanosphere, Inc. Bio-barcodes based on oligonucleotide-modified nanoparticles
US6777210B1 (en) 1998-09-24 2004-08-17 Ambion, Inc. Method and reagents for inactivating ribonucleases RNase A, RNase I and RNase T1
US6312911B1 (en) 1999-05-06 2001-11-06 Frank Carter Bancroft DNA-based steganography
EP1190100B1 (en) 1999-05-20 2012-07-25 Illumina, Inc. Combinatorial decoding of random nucleic acid arrays
US6696022B1 (en) 1999-08-13 2004-02-24 U.S. Genomics, Inc. Methods and apparatuses for stretching polymers
JP2001149081A (ja) 1999-11-29 2001-06-05 Cyclex Co Ltd 脱アセチル化酵素の活性測定方法、並びにこれら酵素の阻害剤もしくは促進剤のスクリーニング方法
SE0201738D0 (sv) 2002-06-07 2002-06-07 Aamic Ab Micro-fluid structures
JP2006507921A (ja) 2002-06-28 2006-03-09 プレジデント・アンド・フェロウズ・オブ・ハーバード・カレッジ 流体分散のための方法および装置
EP2359689B1 (en) 2002-09-27 2015-08-26 The General Hospital Corporation Microfluidic device for cell separation and use thereof
US20100022414A1 (en) 2008-07-18 2010-01-28 Raindance Technologies, Inc. Droplet Libraries
GB0307403D0 (en) 2003-03-31 2003-05-07 Medical Res Council Selection by compartmentalised screening
WO2004091763A2 (en) 2003-04-10 2004-10-28 President And Fellows Of Harvard College Formation and control of fluidic species
CN104069784B (zh) 2003-08-27 2017-01-11 哈佛大学 流体物种的电子控制
WO2005049787A2 (en) 2003-11-24 2005-06-02 Yeda Research And Development Co.Ltd. Compositions and methods for in vitro sorting of molecular and cellular libraries
WO2005062982A2 (en) 2003-12-23 2005-07-14 Xing-Xiang Li Signal amplification methods for analyte detection
US20100216151A1 (en) 2004-02-27 2010-08-26 Helicos Biosciences Corporation Methods for detecting fetal nucleic acids and diagnosing fetal abnormalities
MX2007007613A (es) 2004-12-22 2007-08-03 Schering Corp Formulaciones farmaceuticas.
US7682817B2 (en) 2004-12-23 2010-03-23 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Microfluidic assay devices
JP2008535644A (ja) 2005-03-04 2008-09-04 プレジデント・アンド・フエローズ・オブ・ハーバード・カレツジ 多重エマルジョンの形成のための方法および装置
JP2006349060A (ja) 2005-06-16 2006-12-28 Ntn Corp ボールねじ
US20070031865A1 (en) 2005-07-07 2007-02-08 David Willoughby Novel Process for Construction of a DNA Library
US7556776B2 (en) 2005-09-08 2009-07-07 President And Fellows Of Harvard College Microfluidic manipulation of fluids and reactions
CN101523156A (zh) 2005-09-16 2009-09-02 加利福尼亚大学董事会 用于分析物检测的比色生物条形码扩增测定
WO2007089541A2 (en) 2006-01-27 2007-08-09 President And Fellows Of Harvard College Fluidic droplet coalescence
WO2007114794A1 (en) 2006-03-31 2007-10-11 Nam Trung Nguyen Active control for droplet-based microfluidics
WO2008000090A1 (en) * 2006-06-30 2008-01-03 University Of Guelph Dna barcode sequence classification
EP2129803A4 (en) 2007-02-27 2010-11-03 Univ Northwestern FIXING MOLECULES TO NANOPARTICLES
WO2008109176A2 (en) 2007-03-07 2008-09-12 President And Fellows Of Harvard College Assays and other reactions involving droplets
US20090105959A1 (en) 2007-06-01 2009-04-23 Braverman Michael S System and method for identification of individual samples from a multiplex mixture
WO2009011808A1 (en) 2007-07-13 2009-01-22 President And Fellows Of Harvard College Droplet-based selection
US8454906B2 (en) 2007-07-24 2013-06-04 The Regents Of The University Of California Microfabricated droplet generator for single molecule/cell genetic analysis in engineered monodispersed emulsions
US8268564B2 (en) 2007-09-26 2012-09-18 President And Fellows Of Harvard College Methods and applications for stitched DNA barcodes
US8518640B2 (en) 2007-10-29 2013-08-27 Complete Genomics, Inc. Nucleic acid sequencing and process
EP2217925A4 (en) 2007-12-13 2011-01-19 Beckman Coulter Inc DEVICE AND METHOD FOR DETECTING A TARGET CELL
CN101946010B (zh) 2007-12-21 2014-08-20 哈佛大学 用于核酸测序的***和方法
WO2012044847A1 (en) 2010-10-01 2012-04-05 Life Technologies Corporation Nucleic acid adaptors and uses thereof
US20090181375A1 (en) 2008-01-11 2009-07-16 Peter Brian J Method for detection of nucleic acid barcodes
US8367370B2 (en) 2008-02-11 2013-02-05 Wheeler Aaron R Droplet-based cell culture and cell assays using digital microfluidics
US20100120097A1 (en) 2008-05-30 2010-05-13 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for nucleic acid sequencing
WO2010005593A1 (en) 2008-07-11 2010-01-14 President And Fellows Of Harvard College Systems and methods of droplet-based selection
US8808986B2 (en) 2008-08-27 2014-08-19 Gen9, Inc. Methods and devices for high fidelity polynucleotide synthesis
US20110218123A1 (en) 2008-09-19 2011-09-08 President And Fellows Of Harvard College Creation of libraries of droplets and related species
US20140141436A1 (en) 2008-10-03 2014-05-22 Roche Molecular Systems, Inc. Methods and Compositions for Very High Resolution Genotyping of HLA
EP2373812B1 (en) 2008-12-19 2016-11-09 President and Fellows of Harvard College Particle-assisted nucleic acid sequencing
WO2010086622A1 (en) 2009-01-30 2010-08-05 Oxford Nanopore Technologies Limited Adaptors for nucleic acid constructs in transmembrane sequencing
US20100323348A1 (en) * 2009-01-31 2010-12-23 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Methods and Compositions for Using Error-Detecting and/or Error-Correcting Barcodes in Nucleic Acid Amplification Process
JP5457222B2 (ja) 2009-02-25 2014-04-02 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 小型化ハイスループット核酸分析
EP3998346A1 (en) 2009-03-30 2022-05-18 Illumina, Inc. Gene expression analysis in single cells
CA3018687C (en) 2009-04-02 2021-07-13 Fluidigm Corporation Multi-primer amplification method for barcoding of target nucleic acids
WO2010117456A2 (en) 2009-04-08 2010-10-14 Applied Biosystems, Llc Column enrichment of pcr beads comprising tethered amplicons
SG184592A1 (en) 2011-03-18 2012-10-30 Univ Singapore Isolating target cells from a biological fluid
EP2443236B1 (en) 2009-06-15 2015-05-13 Complete Genomics, Inc. Methods and compositions for long fragment read sequencing
WO2010148115A1 (en) 2009-06-18 2010-12-23 The Penn State Research Foundation Methods, systems and kits for detecting protein-nucleic acid interactions
EP2446278B1 (en) 2009-06-26 2021-11-17 President and Fellows of Harvard College Fluid injection
EP2473263B1 (en) 2009-09-02 2022-11-02 President and Fellows of Harvard College Multiple emulsions created using jetting and other techniques
EP2493619B1 (en) 2009-10-27 2018-12-19 President and Fellows of Harvard College Droplet creation techniques
US8293535B2 (en) 2009-11-02 2012-10-23 Lawrence Livermore National Security, Llc Bio-threat microparticle simulants
US9023650B2 (en) 2009-11-02 2015-05-05 Lawrence Livermore National Security, Llc DNA tagged microparticles
US9023769B2 (en) 2009-11-30 2015-05-05 Complete Genomics, Inc. cDNA library for nucleic acid sequencing
WO2011140510A2 (en) 2010-05-06 2011-11-10 Bioo Scientific Corporation Oligonucleotide ligation, barcoding and methods and compositions for improving data quality and throughput using massively parallel sequencing
US20130123120A1 (en) * 2010-05-18 2013-05-16 Natera, Inc. Highly Multiplex PCR Methods and Compositions
CA2802000C (en) 2010-06-18 2016-08-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Dna polymerases with increased 3'-mismatch discrimination
US8586301B2 (en) 2010-06-30 2013-11-19 Stratos Genomics, Inc. Multiplexed identification of nucleic acid sequences
US9422517B2 (en) 2010-07-30 2016-08-23 The General Hospital Corporation Microscale and nanoscale structures for manipulating particles
US9044458B2 (en) 2010-08-09 2015-06-02 The Johns Hopkins University Inhibition of tat activating regulatory DNA-binding protein 43
WO2012019765A1 (en) 2010-08-10 2012-02-16 European Molecular Biology Laboratory (Embl) Methods and systems for tracking samples and sample combinations
CA2810931C (en) 2010-09-24 2018-04-17 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Direct capture, amplification and sequencing of target dna using immobilized primers
EP2622103B2 (en) 2010-09-30 2022-11-16 Bio-Rad Laboratories, Inc. Sandwich assays in droplets
EP2625320B1 (en) 2010-10-08 2019-03-27 President and Fellows of Harvard College High-throughput single cell barcoding
ES2730951T3 (es) 2010-10-08 2019-11-13 Harvard College Secuenciación inmune de alto rendimiento
US10024796B2 (en) 2010-10-29 2018-07-17 President And Fellows Of Harvard College Nucleic acid nanostructure barcode probes
US8829171B2 (en) 2011-02-10 2014-09-09 Illumina, Inc. Linking sequence reads using paired code tags
US20140057799A1 (en) 2010-12-16 2014-02-27 Gigagen System and Methods for Massively Parallel Analysis of Nucleic Acids in Single Cells
CN103889556A (zh) 2011-01-06 2014-06-25 Gpb科学有限责任公司 在引入亲和性和大小两者的微流体芯片上的循环肿瘤细胞捕获
US9115353B2 (en) 2011-01-31 2015-08-25 Illumina, Inc. Method for nucleotide detection
EP2675819B1 (en) * 2011-02-18 2020-04-08 Bio-Rad Laboratories, Inc. Compositions and methods for molecular labeling
US20160194694A1 (en) 2011-04-28 2016-07-07 Life Technologies Corporation Multiplex transcriptome analysis
US20150344938A1 (en) 2011-04-28 2015-12-03 Life Technologies Corporation Multiplex transcriptome analysis
US9487825B2 (en) 2011-05-13 2016-11-08 Mount Sinai School Of Medicine Pooled adapter strategy for reducing bias in small RNA characterization
CN103890245B (zh) * 2011-05-20 2020-11-17 富鲁达公司 核酸编码反应
US8841071B2 (en) 2011-06-02 2014-09-23 Raindance Technologies, Inc. Sample multiplexing
US10294519B2 (en) 2011-07-19 2019-05-21 Hitachi High-Technologies Corporation Method and apparatus for nucleic acid analysis
US9469874B2 (en) * 2011-10-18 2016-10-18 The Regents Of The University Of California Long-range barcode labeling-sequencing
US10837879B2 (en) 2011-11-02 2020-11-17 Complete Genomics, Inc. Treatment for stabilizing nucleic acid arrays
US10222391B2 (en) 2011-12-07 2019-03-05 The Johns Hopkins University System and method for screening a library of samples
WO2013116698A2 (en) 2012-02-02 2013-08-08 Invenra, Inc. High throughput screen for biologically active polypeptides
IN2014DN06644A (zh) 2012-02-08 2015-05-22 Harvard College
US10202628B2 (en) 2012-02-17 2019-02-12 President And Fellows Of Harvard College Assembly of nucleic acid sequences in emulsions
US9176031B2 (en) 2012-02-24 2015-11-03 Raindance Technologies, Inc. Labeling and sample preparation for sequencing
ES2774165T3 (es) 2012-06-15 2020-07-17 Univ Texas Secuenciación de alto rendimiento de múltiples transcritos de una única célula
JP6525872B2 (ja) 2012-08-08 2019-06-05 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 細胞中の複数のエピトープを同定するためのダイナミックレンジを高めること
US9388465B2 (en) 2013-02-08 2016-07-12 10X Genomics, Inc. Polynucleotide barcode generation
US10323279B2 (en) 2012-08-14 2019-06-18 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US9701998B2 (en) 2012-12-14 2017-07-11 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
BR112015003354A8 (pt) 2012-08-14 2018-01-16 10X Genomics Inc métodos e composições de microcápsula
US20140378345A1 (en) 2012-08-14 2014-12-25 10X Technologies, Inc. Compositions and methods for sample processing
WO2014047561A1 (en) 2012-09-21 2014-03-27 The Broad Institute Inc. Compositions and methods for labeling of agents
CA2894694C (en) 2012-12-14 2023-04-25 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US9683230B2 (en) 2013-01-09 2017-06-20 Illumina Cambridge Limited Sample preparation on a solid support
EP2971159B1 (en) 2013-03-14 2019-05-08 Molecular Loop Biosolutions, LLC Methods for analyzing nucleic acids
US10105702B2 (en) 2013-03-15 2018-10-23 Lariat Biosciences, Inc. Microfluidic methods for manipulating DNA
US20140274729A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Nugen Technologies, Inc. Methods, compositions and kits for generation of stranded rna or dna libraries
SG10201806890VA (en) 2013-08-28 2018-09-27 Cellular Res Inc Massively parallel single cell analysis
AU2014362322B2 (en) 2013-12-11 2021-05-27 The Regents For Of The University Of California Methods for labeling DNA fragments to recontruct physical linkage and phase
US9580736B2 (en) 2013-12-30 2017-02-28 Atreca, Inc. Analysis of nucleic acids associated with single cells using nucleic acid barcodes
WO2015157567A1 (en) 2014-04-10 2015-10-15 10X Genomics, Inc. Fluidic devices, systems, and methods for encapsulating and partitioning reagents, and applications of same
WO2015160919A1 (en) 2014-04-16 2015-10-22 President And Fellows Of Harvard College Systems and methods for producing droplet emulsions with relatively thin shells
JP2017513525A (ja) 2014-04-17 2017-06-01 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 液滴タグ化のためのシステムおよび方法
AU2015247462A1 (en) 2014-04-17 2016-11-03 President And Fellows Of Harvard College Methods and systems for droplet tagging and amplification
US20150298091A1 (en) 2014-04-21 2015-10-22 President And Fellows Of Harvard College Systems and methods for barcoding nucleic acids
DK3134536T3 (da) * 2014-04-21 2020-02-03 Harvard College Systemer og fremgangsmåder til at stregkodemarkere nukleinsyrer
WO2015200541A1 (en) 2014-06-24 2015-12-30 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital pcr barcoding
CN107873054B (zh) 2014-09-09 2022-07-12 博德研究所 用于复合单细胞核酸分析的基于微滴的方法和设备
AU2016248995B2 (en) 2015-04-17 2022-04-28 President And Fellows Of Harvard College Barcoding systems and methods for gene sequencing and other applications
EP3752832A1 (en) 2018-02-12 2020-12-23 10X Genomics, Inc. Methods characterizing multiple analytes from individual cells or cell populations

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110033854A1 (en) * 2007-12-05 2011-02-10 Complete Genomics, Inc. Methods and compositions for long fragment read sequencing
CN103717749A (zh) * 2011-04-25 2014-04-09 伯乐生命医学产品有限公司 用于核酸分析的方法和组合物
US20150057163A1 (en) * 2012-03-05 2015-02-26 The General Hospital Corporation Systems and methods for epigenetic sequencing
WO2014210353A2 (en) * 2013-06-27 2014-12-31 10X Technologies, Inc. Compositions and methods for sample processing
US20150051117A1 (en) * 2013-08-16 2015-02-19 President And Fellows Of Harvard College Assembly of Nucleic Acid Sequences in Emulsions

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110249214A (zh) * 2019-04-29 2019-09-17 京东方科技集团股份有限公司 细胞检测方法和细胞检测装置
WO2020220205A1 (zh) * 2019-04-29 2020-11-05 京东方科技集团股份有限公司 细胞检测方法和细胞检测装置
US11499918B2 (en) 2019-04-29 2022-11-15 Beijing Boe Optoelectronics Technology Co., Ltd. Cell detection method and cell detection device

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