KR101812820B1 - 전달 시스템 - Google Patents

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KR101812820B1
KR101812820B1 KR1020127020050A KR20127020050A KR101812820B1 KR 101812820 B1 KR101812820 B1 KR 101812820B1 KR 1020127020050 A KR1020127020050 A KR 1020127020050A KR 20127020050 A KR20127020050 A KR 20127020050A KR 101812820 B1 KR101812820 B1 KR 101812820B1
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카일 더블유. 바인더
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타오 수
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Abstract

본원에서는, (a) 신체 표면의 지도를 생성하기 위해 유용한 데이터를 검출하도록 구성된 광학 센서; 및 (b) 상기 광학 센서와 작동적으로 연관되고 상기 데이터 또는 상기 지도를 기초로 하여 상기 신체 표면에 조성물 (임의로는 세포 포함)을 전달하도록 구성된 프린터를 포함하는 전달 시스템이 제공된다. 신체 표면 상에서의 조직의 형성이 필요한 환자의 신체 표면 상에서 조직을 형성하는 방법과 함께, 신체 표면 데이터를 처리하기 위해 유용한 방법, 시스템, 및 컴퓨터 프로그램 제품이 또한 제공된다.

Description

전달 시스템 {DELIVERY SYSTEM}
관련 출원
본 출원은 35 U.S.C §119(e)하에서 2010년 1월 8일 출원된 미국 가특허 출원 일련 번호 61/293,481 (상기 출원의 개시내용은 그 전문이 본 원에 참고로 포함된다)에 대한 우선권 주장을 청구한다.
정부 지원의 진술
본 연구는 미군 재생의학 연구소 (Armed Forces Institute for Regenerative Medicine)로부터의 인가 W81XWH-08-2-0032에 의해 지원을 받았다. 미국 정부는 본 발명에 특정 권리를 갖고 있다.
본 발명은 대상체 상으로의 생존 세포의 상피내 전달에 관한 것이다.
미국에서, 화상의 치사율 비율은 약 4.9%이고, 화상을 입은 총 신체 표면적(TBSA)이 증가함에 따라 극적으로 증가하고 있다. 처리의 황금 표준은 부분층 자가 이식이지만, 이 기술은 하나 이상의 손상되지 않은 피부 부위에 상처를 입히는 것이 필요하다. 다른 치료 기술은 은 술파디아진, 인테그라(INTEGRA)® (존슨 앤드 존슨(Johnson and Johnson), 독일 함부르그; 인테그라 라이프 사이언시스 코포레이션(Integra Life Sciences Corporation), 미국 뉴저지), 바이오브랜(BIOBRANE)® (다우 힉캠(Dow Hickam)/버테크 파마슈티칼스 (Bertek Pharmaceuticals), 미국 텍사스, 슈가랜드), 트랜스시트(TRANSCYTE)® (어드밴스드 티슈 사이언시스 인코포레이티드(Advanced Tissue Sciences), 미국 캘리포니아, 라졸라) 및 동종 세포를 포함한다.
대규모 제조 방법은 표준 크기의 피부 대체물의 제조를 요구하지만, 이러한 표준 크기 제품은 불규칙한 상처를 적절하게 도포할 수 없다. 추가로, 이러한 기술의 거의 모두가 다수의 외과적 절차를 필요로 하고, 큰 신체 표면적 화상에는 이상적이지 못하다.
동종 세포 치료법은 자가 조직 세포 배양액의 필요를 없앨 수 있다. 현재의 전달 기술은 세포를 환자에게 분무하거나 이식 전에 골격에 세포를 접종하는 것을 포함한다. 자가 조직 섬유모세포 및 각질세포로 화상을 치료하기 위해서 세포 분무가 사용되어 왔지만, 현재의 분무 기술의 전달 정확성은 낮다.
이상적인 피부 대체물은 다음과 같은 품질을 갖고 있다: (1) 특히 불규칙한 표면을 위하여, 상처 층에 긴밀하게 부착된다; (2) 비-항원성 미생물 장벽을 제공한다; (3) 정상적인 숙주 복구 메카니즘에 참여한다; (4) 탄성 및 장기간 내구성을 유지한다; (5) 부분층 자가 이식에 필적하는 장-기간 기계적 및 미용 기능을 나타낸다; (6) 1회의 외과적 절차를 요구한다; (7) 값이 저렴하다; (8) 무한의 저장 수명을 갖는다; (9) 최소의 보관 요건을 갖는다.
화상 상처 환자 뿐만 아니라 다른 상처 및 조직 손상 또는 질환을 가진 환자의 요구를 더욱 우수하게 해결하는 새로운 치료법이 요구되고 있다.
발명의 요약
본원에서는, (a) 신체 표면의 지도를 만들기 위해 사용되는 데이터를 검출하도록 배열된 광학 센서; 및 (b) 광학 센서와 작동적으로 연관되고 지도를 기초로 하여 세포 및/또는 조성물을 신체 표면에 전달하도록 구성된 프린터를 포함하는, 전달 시스템이 제공된다. 센서 및 프린터는 공통 지지체 또는 프레임에 각각 연결됨으로써 서로 결합될 수도 있는데, 대상체의 신체 표면의 스캐닝을 위한 위치에 대상체를 배치하기 위하여 여기에 대상체 지지체 (예, 침대)를 연결할 수도 있다. 일부 실시양태에서, 광학 센서는 3차원 스캐너를 포함한다. 일부 실시양태에서, 광학 센서는 적외선 검출기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 광학 센서는 레이저 스캐너이다.
일부 실시양태에서, 시스템은 (c) 광학 센서와 작동적으로 연결된 3차원 플로터; 및 (d) 프린터와 작동적으로 연결된 조절장치를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 프린터는 조성물 (예, 세포, 지지체 화합물, 성장 인자, 이들의 조합 등을 포함하는 조성물)이 부하된 카트리지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 카트리지는 다수의 프린트헤드를 포함하고, 카트리지는 다수의 프린트헤드와 유체 소통 상태이다. 일부 실시양태에서, 프린트헤드는 세포 및/또는 조성물의 압력-기반 전달을 위해 구성된 노즐을 포함한다.
또한, (a) 신체 표면을 스캐닝하여 그의 3차원 좌표를 얻고; (b) 이 좌표를 기초로 하여 환자의 신체 표면 상에 생존 세포를 프린팅하여 조직을 형성하는 것을 포함하는, 신체 표면 상에의 조직의 형성이 필요한 환자의 신체 표면에 조직을 형성하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 프린팅 단계는 다수의 층을 가진 조직을 만들기 위해 연속하여 2회 이상으로 실행된다.
또한, 3차원 광학 검출기로부터의 신체 표면 데이터를 해석하여 신체 표면의 모델을 형성하는 단계; 모델을 신체 표면의 음각 몰드로 변형하고, 여기서 몰드를 다수의 Z-축 층으로 분할하고, 이 때 이 층들은 하나 이상의 조직 층에 상응하는 것인 단계; 각각의 조직 층을 신체 표면을 덮는 일련의 선과 겹쳐놓고, 여기서 상기 선들이 프린터를 위한 경로를 제공하는 것인 단계를 포함하는, 3차원 광학 검출기에 작동적으로 연관된 프린터에 경로를 제공하기 위하여, 상기 광학 검출기로부터 수득된 신체 표면 데이터를 처리하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 3차원 광학 센서로 스캐닝함으로써 신체 표면 데이터를 수득하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 신체 표면 데이터는 상처 표면 데이터 (예, 피부 상처 표면 데이터)이다.
신체 표면의 모델을 형성하기 위해 3차원 광학 검출기로부터 신체 표면 데이터를 해석하기 위한 수단; 상기 모델을 신체 표면의 음각 몰드로 변형하기 위한 수단이며, 여기서 상기 몰드가 다수의 Z-축 층으로 분할되고, 여기서 상기 층은 하나 이상의 조직 층에 상응하는 것인 수단; 및 상기 조직 층의 각각을 신체 표면을 덮는 일련의 선과 겹치기 위한 수단이며, 여기서 상기 선이 프린터를 위한 경로를 제공하는 것인 수단을 포함하는, 3차원 광학 검출기에 작동적으로 연관된 프린터에 경로를 제공하기 위하여 상기 광학 검출기로부터 수득된 신체 표면의 데이터를 처리하기 위한 시스템이 또한 제공된다. 일부 실시양태는 신체 표면 데이터를 수득하기 위한 수단을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 신체 표면 데이터는 상처 표면 데이터이다 (예, 피부 상처 표면 데이터).
또한, 3차원 광학 검출기에 작동적으로 연관된 프린터에 경로를 제공하기 위하여 상기 광학 검출기로부터 수득된 신체 표면의 데이터를 처리하기 위한 컴퓨터 프로그램 제품이며, 이 컴퓨터 프로그램 제품은 매체 안에서 실현되는 컴퓨터 판독가능한 프로그램 코드를 가진 컴퓨터 판독가능한 매체를 포함하고, 여기서 컴퓨터 판독가능한 프로그램 코드가 신체 표면의 모델을 형성하기 위해 상기 광학 검출기로부터 신체 표면 데이터를 해석하는 컴퓨터 판독가능한 프로그램 코드; 상기 모델을 신체 표면의 음각 몰드로 변형시키고, 여기서 상기 몰드가 다수의 Z-축 층으로 분할되고, 여기서 상기 층이 하나 이상의 조직 층에 상응하는 것인, 컴퓨터 판독가능한 프로그램 코드; 및 상기 조직 층 각각을 신체 표면을 덮는 일련의 선과 겹치게 하고, 여기서 상기 선이 프린터를 위한 경로를 제공하는 것인, 컴퓨터 판독가능한 프로그램 코드를 포함하는 것인, 컴퓨터 프로그램 제품이 또한 제공된다. 일부 실시양태에서, 신체 표면 데이터는 상처 표면 데이터 (예, 피부 상처 표면 데이터)이다.
본 발명의 상기 및 기타 목적 및 측면을 도면 및 하기 상세한 설명에서 더욱 상세히 설명한다.
본 명세서에 포함되고 일부를 구성하는 첨부된 도면은 본 발명의 실시양태를 예증하고, 상세한 설명과 함께 본 발명의 원리를 설명하는 역할을 한다.
도 1. 프린터 지지체 (10)를 가진 전달 시스템 (5)의 사시도. 이 휴대용 실시양태는 바퀴 (24)를 갖고, 침대 (35)를 가진 테이블 (30) 위에 누운 대상체 위에 배치된다. 프린터 지지체는 프린터 지지체 (10)가 Z축 (부재 23), X축 (부재 22) 및 Y축 (부재 21)에 대해 이동될 수 있도록 구성된 부재 (23, 22, 21)에 작동적으로 연결된다.
도 2. 광학 센서 (11) 및 다수의 프린트헤드 (12)를 가진 프린터 지지체 (10)의 저면도이다.
도 3. 부착된 컴퓨터 (40)를 갖고 테이블 (30)위에 누운 대상체 위에 배치된 휴대용 전달 시스템 (5)의 대안적인 실시양태이다.
도 4. 부착된 조명 (50)을 갖고 테이블 (30) 위에 누운 대상체 위에 배치된 휴대용 전달 시스템 (5)의 대안적인 실시양태이다.
도 5. 테이블 (30) 위에 누운 대상체 위에 배치되어 있으며, 프린터 지지체 (10) 위에 부착된 컴퓨터 (40) 및 커버 (60)를 갖는, 휴대용 전달 시스템 (5)의 대안적인 실시양태.
도 6. 프린터 지지체 (10) 위에 부착된 컴퓨터 (40) 및 커버 (60)를 가진 전달 시스템 (5)의 대안적인 실시양태. 시스템 (5)은 테이블 (30)에 부착된다.
도 7. 카메라 (11), 적외선 센서 (15) 및 다수의 프린터 카트리지 (14)를 가진 프린터 지지체 (10)의 단면도.
도 8. 프린터 카트리지 (14)의 분해조립도.
도 9. 바이오프린팅을 사용한 피부 복구는 상해 후 1주 내지 4주 사이에 상처 크기의 상당한 차이를 나타낸다(p<0.05).
세포 및 조직을 그것을 필요로 하는 대상체에게 전달하기 위해 유용한 시스템, 조성물, 장치 및 방법이 본 명세서에 제공되고 하기에 상세히 설명된다. 일부 실시양태에서, 프린터가 스캐너와 작동적으로 연관되어 있는, 프린터를 포함하는, 카트리지 기반 세포 전달 시스템이 제공된다.
모든 미국 특허 참고문헌의 개시내용은, 본 명세서에 개시된 개시내용과 일치하는 정도까지 본원에 참고로 포함된다. 본 발명의 상세한 설명 및 청구의 범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태는 달리 명백히 나타내지 않은 이상 복수 형태를 또한 포함하는 것으로 해석된다. 또한, 여기에서 사용된 용어 "약" 및 "대략"은, 화합물, 투여량, 시간, 온도 등의 양과 같은 측정가능한 수치를 언급할 때, 규정된 양의 20%, 10%, 5%, 1%, 0.5% 또는 심지어 0.1%의 편차를 포함하는 것을 의미한다. 또한, 여기에서 사용된 "및/또는" 또는 "/"는 하나 이상의 관련된 항목의 어떠한 모든 가능한 조합 뿐만 아니라 양자택일 ("또는")로 해석될 때 조합의 결여를 지칭하며 이들을 포함한다.
달리 정의되지 않는 한, 여기에서 사용된 모든 용어 (기술적 및 과학적 용어 포함)는 관련 기술의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 사용되는 사전에서 정의된 것과 같은 용어는 명세서 및 관련 기술의 내용에 있는 의미와 일치되는 의미를 갖는 것으로 해석되어야 하고, 여기에 달리 정의되지 않는 한 이상화되거나 과하게 형식적인 의미로 해석되어서는 안되는 것으로 이해된다. 잘 알려진 기능 또는 구성은 간편성 및/또는 명확성을 위하여 상세히 설명되지 않을 수도 있다.
본 발명은 부분적으로 본 발명의 실시양태에 따른 방법, 장치 (시스템) 및 컴퓨터 프로그램 제품의 순서도 및/또는 블록 다이어그램을 참조하여 설명된다. 순서도 및/또는 블록 다이어그램의 각각의 블록, 및 순서도 및/또는 블록 다이어그램의 블록의 조합은 컴퓨터 프로그램 명령에 의해 실행될 수 있는 것으로 이해된다. 이러한 컴퓨터 프로그램 명령은 기계를 만들기 위해 일반 목적 컴퓨터, 특수 목적 컴퓨터, 또는 다른 프로그램가능한 데이터 처리 장치의 프로세서에 제공될 수도 있고, 그 결과 컴퓨터 또는 다른 프로그램가능한 데이터 처리 장치의 프로세서를 통해 실행하는 명령이 순서도 및/또는 블록 다이어그램 블록 또는 블록들에 규정된 기능/작동을 실행하기 위한 수단을 형성한다.
도 1에 나타낸 것과 같이, 일부 실시양태에서, 그 위에 프린터 지지체 (10)를 포함하는 전달 시스템 (5)이 제공된다. 일부 실시양태에서, 전달 시스템이 휴대성을 위해 바퀴 (24) 위에 제공될 수도 있다. 전달 시스템 (5)은 사용시 침대 (35)를 가진 테이블 (30) 위에 누운 대상체 위에 배치될 수 있다. 일부 실시양태에서, 테이블 (30) 또는 침대 (35)에 대해 제 위치에 전달 시스템 (5)을 고정하기 위하여 고정 메카니즘이 제공될 수도 있다.
일부 실시양태에 따른 프린터 지지체 (10)는 프린터 지지체 (10)가 Z축 (부재 23), X축 (부재 22) 및 Y축 (부재 21)에 대해 이동가능하도록 구성된 부재 (23, 22, 21)에 작동적으로 연결된다.
도 2에 나타낸 것과 같이, 일부 실시양태에서, 프린터 지지체 (10)는 광학 센서 (11) 및 다수의 프린트헤드 (12)를 포함한다. 다른 실시양태에서, 프린터 지지체는 다수의 프린트헤드 (12)를 포함하지만, 광학 센서 (11)가 별도의 지지체 (표시되지 않음)에 제공된다.
전달 시스템 (5)의 일부 대안적인 실시양태가 도 3 내지 6에 도시된다. 도 3은, 테이블 (30)에 누워있는 대상체 위에 배치된, 부착된 컴퓨터 (40)를 가진 전달 시스템의 실시양태를 도시한다. 도 4는 다른 실시양태를 도시하고, 테이블 (30) 위에 누워있는 대상체 위에 배치된 부착된 조명 (50)을 포함한다. 도 5는, 테이블 (30) 위에 누워있는 대상체 위에 배치된, 프린터 지지체 (10) 위의 부착된 컴퓨터 (40) 및 커버 (60)를 가진 실시양태를 도시한다. 도 6은 프린터 지지체 (10) 위에 부착된 컴퓨터 (40) 및 커버 (60)를 가진 전달 시스템 (5)의 실시양태를 도시한다. 시스템 (5)은 테이블 (30)에 부착되어 있다.
도 7은 카메라 (11), 적외선 센서 (15), 및 다수의 프린터 카트리지 (14)를 가진 프린터 지지체 (10)의 실시양태를 도시한다.
본 발명의 측면은, 세포 및/또는 조성물을 상처를 치료하기에 효과적인 양으로 적용하는, 상처의 치료가 필요한 대상체에서 상처 (예, 화상, 찰과상, 열상, 절개, 욕창, 찔린 상처, 관통상, 탄환에 의한 상처, 압궤 손상 등)의 치료 방법이다.
본 발명으로 치료될 수 있는 상처의 예는 화상 상처를 포함한다. 화상 상처는 열, 화학약품, 태양광, 전기, 방사선 등으로부터 비롯될 수 있는 조직 손상이다. 열에 의해 유발된 화상 또는 열적 화상이 가장 일반적이다. 화학적 화상은 열적 화상과 유사하다. 화상이 피부 위에서 가장 빈번히 일어나는 경향이 있긴 하지만, 다른 신체 구조물이 영향을 받을 수도 있다. 예를 들어, 심각한 화상이 지방, 근육 또는 골에까지 침투될 수도 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 조직에 상응하는 세포가 예를 들어 천연 조직을 모방한 층상 적용으로 상처 부위로 전달될 수도 있다.
상처는 당업계에 공지된 바와 같이 상해의 깊이를 특징으로 할 수도 있다. 예를 들어, 화상 정도는 손상된 조직의 깊이에 의존하여 1도, 2도 또는 3도로 특징화된다. 1도 화상에서, 단지 피부의 상층 (표피층) 만이 손상된다. 2도 화상에서, 피부의 중간 층 (진피)이 손상된다. 마지막으로, 가장 심각한 유형인 3도 화상에서 손상은 피부의 내부 (지방) 층에 영향을 줄 정도로 충분히 깊다. 유사하게, 피부의 욕창은 단계 I (적색, 비파괴 피부, 압력이 없어져도 홍반이 사라지지 않는다), 단계 II (붕괴된 표피, 종종 진피 내로 침범), 단계 III (진피의 손상) 및 단계 IV (피하 조직이 노출됨)로 특징화된다.
욕창 상처에서, 국소 모세관의 압력-유발 수축에 의하여 환부 피부에서 허혈이 일어난다. 유사하게, 화상 상처는 관련된 모세관 혈전증에 기인한 허혈이다. 당뇨병성 궤양은 불량하게 관류된 상처의 다른 예이다. 상처 치유의 정상적인 과정을 돕는데 있어 혈액이 쉽게 이용될 수 없는 유형의 상처의 경우, 본원에 제공된 세포의 적용에 앞서서 일부 실시양태에서는 죽고/죽거나 손상된 조직을 제거한다 (괴사조직절제술).
일부 실시양태에서, 조성물은 감염 위험을 저하시키기 위한 항균제를 포함할 수도 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 통증 경감을 위한 진통제 또는 마취제, 계면활성제, 항염증제 등을 포함할 수도 있다. 예를 들어 미국 특허 번호 6,562,326 (Miller) 참조. 한랭 (예, 냉수, 얼음 등)으로의 처리 및 환부를 올리는 것과 같이, 팽윤을 줄이는 방법이 사용될 수도 있다.
일부 실시양태에 따르면, 상기 장치가 개방 상처 및 폐쇄 상처 둘 모두를 위하여 장치가 사용될 수도 있다. 폐쇄 상처의 경우에, 내시경 절차를 포함한 수술 수단을 통해 스캐너 및/또는 전달 장치를 상처 부위로 접근시키는 것이 가능하다.
일부 실시양태에서, 개시된 세포 및/또는 조성물의 재적용을 필요에 따라 수행할 수도 있다. 박테리아를 제거하기 위한 세정 및 괴사 파편을 제거하기 위한 괴사조직절제술이 치료 과정 동안에 정당화될 수도 있다. 괴사조직절제술을 돕기 위하여 상처 딱지를 부드럽게 하기 위해 보습 크림 또는 연고의 적용이 사용될 수도 있다.
A. 프린터
일부 실시양태에서, 세포, 단백질, 지지체 물질, 이들의 조합 등이 프린터와 함께 전달된다. 여기에서 사용된 "프린팅"이란 세포 및/또는 조성물의 소적을 소적 당 작은 부피, 예를 들어 0.5 내지 500 마이크로리터, 또는 5 내지 100 마이크로리터, 또는 10 내지 75 마이크로리터로 전달하는 것을 가리킨다. 일부 실시양태에서, 소적은 소적 당 0.5 내지 500 피코리터, 또는 5 내지 100 피코리터, 또는 10 내지 75 피코리터 범위의 부피를 갖는다. 예를 들어 여기에 기재된 바와 같이 변형된 프린트 헤드를 가진 표준 프린터를 사용하여 프린팅을 수행할 수도 있다. "프린트헤드"는 소적을 분무하는 잉크젯 프린터 내의 장치 (예, 잉크, 또는 본원에서 사용된 바와 같이 세포 및/또는 조성물)이다.
일부 실시양태에서, 프린팅은 약 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 또는 200 ㎛의 해상도로 세포를 정확히 전달할 수 있다. 또한, 프린팅은 층상 조립을 사용하여 특정한 표적 부위로 특정한 세포를 전달할 수 있다. 이러한 층상 조립은 치료를 필요로 하는 대상체에서 상피내 수행될 수 있고, 정확하게 배열된 다수의 세포 유형을 포함한다. 이것은 세포를 큰 면적 위에 무작위로 적용하는 세포 시딩 또는 분무 기법과는 대조적이다.
여기에서 사용된 "카트리지"란 세포 및/또는 조성물이 유지될 수 있는 용기 또는 저장소를 가리키고, 이것은 하나 이상의 프린트헤드에서 하나 이상의 노즐과 유체 소통 상태에 있다. 카트리지는 전통적인 잉크젯 카트리지에서와 같이 단일 장치에 저장 및 전달 메카니즘을 포함할 수도 있거나, 또는 저장소 및 전달 메카니즘은 별도의 장치에 존재할 수도 있지만 유체 소통 상태가 되도록 연결될 수도 있다 (예를 들어, 관의 사용을 통해서).
일부 실시양태에서, 하나 이상의 세포 유형 및/또는 조성물을 개개의 카트리지에 부하한다. "조성물"은 세포, 담체, 지지체 물질, 거대분자, 예컨대 단백질, 시토카인, 성장 인자 등, 또는 이들의 조합을 포함할 수도 있다. 조성물은 또한 산소 발생 바이오물질을 포함할 수도 있다. PCT 공개 WO 2008/124126 참조.
일부 실시양태에서, 하나의 프린트헤드가 하나의 카트리지에 연결되는 표준 잉크젯 프린팅과 대조적으로, 각각의 카트리지가 다수의 노즐 및/또는 프린트헤드에 연결되도록 구성된다. 이것은 처리의 요구에 순응할 수 있는 임의의 프린트헤드 구성을 가능하게 한다. 이것은 또한 시스템의 출력량을 증가시키고, 프린트헤드에 세정 유체의 카트리지를 부착함으로써 빠른 멸균 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 프린트헤드는 압력-기반 노즐을 함유한다. 일부 실시양태에 따른 압력-기반 전달 시스템은 프린터가 환자 위에서 안전한 거리를 유지할 수 있도록 하고 다양한 신체 유형을 수용할 수 있도록 한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "압력-기반" 전달 시스템은 3개의 구성성분을 사용한다: 압력 공급원, 물질 저장소, 및 전달 메카니즘. 일부 실시양태에서, 전달 메카니즘은 일련의 전압 작동 잉크젯 밸브이다. 압력 공급원은 저장소에 작동적으로 연결되고, 이 저장소는 전달 메카니즘과 유체 소통 상태에 있다. 일부 실시양태에서, 기체 (예, 공기, 공기 + 5% CO2, 등)를 압력 공급원에 의하여 저장소의 빈 공간 내로 펌핑하고, 이는 이번에는 저장소 내의 물질 (세포 및/또는 조성물)을 전달 메카니즘으로 보낸다.
일부 실시양태에서, 이러한 압력-기반 시스템은 저장소 및 전달 메카니즘을 분리하기 때문에, 상피내 프린팅의 상황에서 잉크젯 카트리지에 비하여 바람직할 수도 있다. 전통적인 잉크젯 카트리지는 단일 장치에 저장소 및 전달 메카니즘을 포함한다. 저장소 또는 전달 메카니즘이 실패한다면, 전체 장치도 실패한다. 또한, 잉크젯 카트리지는 프린팅 전에 충전되고 밀봉되어야 한다. 잉크젯 카트리지가 세포로 충전된다면, 카트리지의 실패는 그 카트리지에 함유된 모든 세포의 손실을 의미한다. 압력-기반 전달 시스템은 이러한 문제를 모두를 해결한다. 저장소 및 전달 메카니즘은 어느 하나의 성분이 실패한 경우 개별적으로 대체될 수 있다. 필요할 때 전달 메카니즘에 물질만을 펌핑해 넣고, 그에 따라 전달 메카니즘의 실패으로 인해 저장소 내의 모든 물질이 손실되지 않는다.
추가로, 일부 실시양태에서, 압력-기반 시스템은 막힌 밸브를 검출하고 원활하게 하는 방법을 제공할 수 있다. 밸브의 끝에 압력 센서를 배치함으로써, 전달 압력을 적용된 압력과 비교할 수 있다. 2개의 압력 사이의 차이가 특정한 역치보다 크다면, 밸브가 막힌 것이다. 밸브를 시도하고 원활하게 하기 위하여, 밸브의 배출물을 폐기물 저장소로 다시 보내고 급작스런 큰 압력을 적용할 수 있다. 원활화 공정이 실패한다면, 시스템이 이것을 검출할 것이고 그 밸브를 사용하지 않은 채로 프린팅을 계속할 수 있다.
일부 실시양태에서, 프린터는 2차원 (X-Y) 또는 3차원 (X-Y-Z) 플로터 (예를 들어, 스텝 모터에 의해 구동됨)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프린트 헤드에 DC 솔레노이드 잉크젯 밸브를 장착한다. 일부 실시양태에서, 세포를 부하하기 위해 하나 이상, 또는 몇 개의 저장소를 잉크젯 밸브에 연결한다. 일부 실시양태에서, 세포 및/또는 조성물을 공기압에 의하여 저장소로부터 밸브 또는 노즐로 공급할 수도 있다. 일부 실시양태에서, 프린트 헤드를 X-Y-Z 플로터 위에 장착하여 골격 위에 세포의 정확한 침착을 가능하게 할 수도 있다. 조절장치를 통하여 프린트 헤드 아래에서 XYZ 플로터의 배치를 조절할 수도 있다. 일부 실시양태에서, 조절장치는 컴퓨터에 부하된 소프트웨어로부터 배치 정보를 얻는다. 일부 실시양태에서, 소프트웨어는 표적 이미지를 4-바이트 프로토콜로 전환시키고, 이것을 사용하여 특정한 잉크젯 밸브를 활성화하고 X-Y-Z 위치를 조정한다.
담체를 함유하는 조성물의 형태로 세포를 프린팅할 수 있다. 세포는 현탁액, 용액 또는 다른 적절한 형태로 제공될 수도 있다. 담체는 고체 또는 액체일 수도 있거나 둘 모두 (예, 겔)일 수도 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 세포의 응집을 감소시키기 위해 담체 중의 현탁액으로서 제공된다. 지지체 화합물, 성장 인자 등이 세포를 가진 조성물에 포함될 수도 있고/있거나, 원한다면 세포를 갖지 않은 (그러나, 적절한 담체를 포함할 수도 있는) 조성물에 포함될 수도 있다.
적절한 겔은, 이에 한정되지 않지만 한천, 콜라겐, 피브린, 히알루론산, 히드로겔 등을 포함한다. 겔 이외에도, 다른 지지체 화합물이 본 발명에서 사용될 수도 있다. 예를 들어, 세포외 기질 유사체는 겔을 최적화하거나 관능화하기 위하여 지지체 겔과 조합될 수도 있다. 하나 이상의 성장 인자가 또한 포함될 수도 있다. 일부 실시양태에서, 온도 민감성 겔이 사용될 수도 있다. 온도 민감성 겔의 예는 온도민감성 히드로겔 및 온도민감성 중합체 겔을 포함한다 (예, 플루로닉 (Pluronic)® F-127 (바스프 코포레이션(BASF corporation), 미국 뉴저지주 몬트 올리브)과 같은 폴록사머). 미국 특허 번호 6,201,065, 6,482,435 참조.
적절한 액체 담체의 예는 이에 한정되지 않지만 물, 이온성 완충 용액 (예, 포스페이트 완충 용액, 시트레이트 완충 용액 등), 액체 배지 (예, 변형 이글 배지 ("MEM"), 행크스 밸런스 염 등) 등을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 조성물에서 액체 또는 겔 담체의 사용은 적절한 수화를 보장하고 프린팅 후에 세포의 증발을 최소화할 수 있다.
또한, 세포를 관심 물질로 (예를 들어 특정한 유전자로) 트랜스펙션할 수도 있다. 유용한 유전자 물질은 예를 들어 숙주에서 면역 반응을 감소시키거나 제거할 수 있는 유전자 서열일 수도 있다. 예를 들어, 부류 I 및 부류 II 조직적합성 항원과 같은 세포 표면 항원의 발현이 억제될 수 있다. 이것은 이식된 세포가 숙주에 의한 감소된 거부 가능성을 갖도록 한다. 또한, 세포를 하나 이상의 성장 인자를 코딩하는 유전자로 트랜스펙션할 수도 있다. 일부 실시양태에 따르면, 프린팅 공정 동안에 세포를 트랜스펙션할 수 있다. PCT 공개 WO 2008/153968 (Xu et al.) 참조.
본 발명은 세포와 지지체 물질, 또는 바람직하게는 적절한 지지체 화합물 또는 화합물들과 함께, 임의로 하나 이상의 적절한 성장 인자와 함께 일반적인 조직에서 전형적으로 발견되는 2개 또는 3개 또는 그 이상의 상이한 세포 유형의 적절한 조합에 의한 조직의 프린팅을 포함한다. 세포, 지지체 화합물 및 성장 인자는, 형성되는 특정한 조직 (또는 조직 대체물)에 의존하여, 별도의 노즐로부터 또는 동일한 노즐을 통하여 공통 조성물 중에서 프린팅될 수도 있다. 프린팅은 동시에 일어나거나 순차적이거나 또는 이들의 조합일 수도 있다. 일부 성분들은 첫 번째 패턴 (예, 부식가능하거나 분해가능한 지지체 물질)의 형태로 프린팅될 수도 있고, 일부 성분들은 두 번째 패턴 (예, 지지체와 상이한 패턴의 세포, 또는 상이한 패턴에서 2개의 상이한 세포 유형)의 형태로 프린팅될 수도 있다. 다시, 특별한 조합 및 프린팅 방식은 요구하는 특정한 조직 구조물에 의존될 것이다.
전달 정확성의 증가가 요구되는 대안적인 실시양태에서, 프린터는 전달 정확성의 증가를 위해 열 또는 압전 프린트헤드 및/또는 잉크젯 카트리지를 사용한다. 생존 세포의 잉크젯 프린팅을 위한 방법 및 조성물이 공지되어 있고, 예를 들어 미국 특허 번호 7,051,654 (Boland et al.) 및 문헌 [Wilson et al. (2003) The Anatomical Record Part A 272A: 491-496]에 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 변형된 잉크젯 프린터로 세포/조성물을 프린팅한다. 변형은, 이에 한정되지 않지만, 예를 들어 프린터 드라이버 소프트웨어 및/또는 프린터의 물리적 구조의 변형에 의하여 온도, 습도, 전단력, 프린팅 속도 및 점화 빈도를 조절하기 위한 수단을 포함할 수도 있다. 예를 들어 문헌 [Pardo et al. (2003) Langmuir 19: 1462-1466]; 미국 특허 번호 7,051,654 (Boland et al.) 참조. 당업자라면 이해할 수 있듯이, 참고문헌에 제안된 모든 변형이 주어진 출원에 적절한 것은 아니다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 프린터는 수평 지지체를 부가하고, 회로 내의 트랜지스터를 더 높은 증폭을 가진 것으로 바꾸고, 수평 위치 인코더를 재도입함으로써 더욱 근소한 허용오차를 가진 새로운 기어 마운트 기둥을 사용하는 것에 의해 변형되지 않는다. 또한, 일부 실시양태에서, 37℃ 초과의 용액의 가열을 피하기 위해 저항 전압을 낮추도록 프린터 소프트웨어가 변형되지 않는다.
일부 실시양태에서, 프린터 (예, 시판 프린터 HP695C 및 HP550C)를 다음과 같이 변형할 수도 있다. 프린터 상부 커버를 제거할 수도 있고 커버를 위한 센서를 불능화시킬 수도 있다. 고체 기재 (예, 골격) 위로 세포의 프린팅이 가능하도록 종이 공급 메카니즘을 불능화할 수도 있다. 잉크 흡수 패드 (HP695C 및 HP550C 프린터의 오른쪽에 있음)가 제거될 수도 있다 (예를 들어, 프린팅 공정 동안에 프린트 카트리지의 하부를 오염시키는 패드를 피하기 위하여). 3D 구조물을 프린팅하는 프린터의 능력을 제공하기 위하여, 조절된 엘레베이터 챔버를 가진 맞춤형 Z-축 모듈이 부가될 수도 있다.
일부 실시양태에서, 프린터는 열 거품 잉크젯 프린터이다. 일반적으로, 열 거품 잉크젯 프린터에서, 레지스터는 프린트 헤드에서 열을 생성시키고, 이것은 잉크를 기화시켜 거품을 만든다. 거품이 팽창될 때, 일부 잉크가 노즐에서 종이 위로 나온다. 거품이 붕괴될 때 진공이 발생하고, 카트리지로부터 프린트 헤드로 더 많은 잉크가 모인다. 본 발명에서, 잉크를 예를 들어 관심 세포 및/또는 조성물로 대체하고 (예, 액체 담체 중의 세포), 종이를 적절한 기재, 예를 들어 한천 또는 콜라겐 코팅된 기재, 또는 적절한 골격으로 대체한다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,537,567 (Niklasen et al.) 참조.
다른 실시양태에서, 압전 결정 진동 프린트 헤드를 사용하여 세포를 프린팅한다. 일반적으로, 압전 결정은 그것의 진동을 유발하는 전기 전하를 수용하고, 노즐 밖으로 잉크를 내보내고 더 많은 잉크를 저장소에 모은다. 본 발명에서, 잉크를 예를 들어 관심 세포 및/또는 조성물로 대체한다. 열 잉크젯 프린팅에 비하여, 압-기반 잉크젯 프린팅은 보통 더 많은 전력 및 더 높은 진동 주파수를 필요로 한다. 전형적인 시판 압-프린터는 30 kHz 이하의 주파수 및 12 내지 100 와트 범위의 전력 공급원을 사용한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 1, 5, 10 또는 15, 내지 20, 25, 30 또는 35 또는 그 이상의 kHz의 진동 주파수 및 5, 10, 20, 50, 100, 120 또는 150 내지 200, 250, 300, 350 또는 375 또는 그 이상의 와트의 전력 공급원을 가진 압전 결정 진동 프린트 헤드가 사용된다.
세포를 미국 특허 번호 6,986,739 (Warren et al.)에 기재된 생존 세포의 침착에 의해 3차원 구조를 형성하기 위한 다른 수단, 예컨대 방법 및 조성물에 의해 프린팅할 수도 있다.
일부 실시양태에서, 프린트 헤드 노즐은 각각 독립적으로 0.05 내지 200 ㎛ 직경, 또는 0.5 내지 100 ㎛ 직경, 또는 10 내지 70 ㎛, 또는 20 내지 60 ㎛ 직경이다. 추가의 실시양태에서, 노즐은 각각 독립적으로 약 40 또는 50 ㎛ 직경이다. 또 다른 실시양태에서, 노즐은 각각 독립적으로 0.1 또는 0.5 내지 2 또는 3 mm 이다. 동일하거나 상이한 직경을 가진 다수의 노즐이 제공될 수도 있다. 더 많은 좁은 노즐은 더욱 큰 정확한 전달을 제공할 수 있지만 출력이 적고, 그 역도 성립한다. 이들은 원하는 세포 유형 및/또는 정밀도에 따라 제공될 수도 있다. 일부 실시양태에서 노즐이 원형 구멍을 갖지만, 본 발명의 취지에서 벗어나지 않으면서 예를 들어 타원형, 정사각형, 직사각형 등의 다른 적절한 형태가 사용될 수도 있다.
일부 실시양태에서, 프린팅 시에 캡슐화된 형태를 제공하기 위해 세포/조성물을 제제화한다. 투과가능한 캡슐 내에서의 세포의 캡슐화가 알려져 있고, 예를 들어 미국 특허 번호 6,783,964에 기재되어 있다. 예를 들어, 반투과성 막에 의해 둘러싸인 폴리사카라이드 검의 내부 셀-함유 코어를 포함하는 50 또는 100 ㎛ 내지 1 또는 2 mm 직경의 마이크로캡슐에 세포를 캡슐화할 수도 있다; 마이크로캡슐은 폴리리신, 폴리오르니틴 및 이들의 조합과 함께 알기네이트를 포함한다. 다른 적절한 캡슐화 물질은 이에 한정되지 않지만 미국 특허 번호 5,702,444에 기재된 것을 포함한다.
"캡슐화된" 세포는 산소 및 다른 필요한 대사산물의 통과를 가능하게 하고, 특정한 세포 분비물 (예, 인슐린)을 방출하지만 면역 거부를 막기 위해 숙주의 더욱 큰 면역 체계 인자의 전달을 제한하는 선택적인 막 라미네이트에 의해 둘러싸인 세포 또는 세포나 조직의 작은 덩어리이다. 캡슐화는 예를 들어 숙주에서 면역 거부의 위험을 감소시키면서 이종 또는 동종 세포를 함유하는 세포 및/또는 조직의 전달을 위해 유용할 수도 있다. 이것은 예를 들어 분비 세포 기능의 부적절하거나 손실에 기인한 질병, 또는 특정한 분비 세포의 첨가로부터 이익을 얻는 병을 치료하기 위해 유용할 수도 있다. 세포의 "마이크로캡슐화"는 1, 2, 3 또는 여러 개의 세포가 캡슐화되는 경우이다. 일부 실시양태에서, 각각의 막이 프린팅된 세포의 적어도 50, 70, 80, 90 또는 95% 또는 그 이상의 10개 이하의 세포, 바람직하게는 5개 이하의 세포를 캡슐화한다.
일부 실시양태에서, 2 이상의 층이 따로따로 적용될 수도 있는데, 여기서 후속한 층이 이전의 층의 상부 표면에 적용된다. 하나의 실시양태에서, 층은 융합될 수 있거나 또는 그렇지 않으면 적용 후에 조합될 수 있거나, 또는 대안적으로는 대상체에게 적용 후에 실질적으로 별도로 나뉘어진 채로 유지될 수 있다.
프린팅된 층 (예, 세포 층, 지지체 층 등)의 두께는 일반적으로 원하는 적용에 의존하여 다양할 수도 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 세포를 함유하는 층의 두께는 약 2 마이크로미터 내지 약 3 밀리미터이고, 일부 실시양태에서 약 20 마이크로미터 내지 약 100 마이크로미터이다. 또한, 상기 나타낸 것과 같이, 프린팅된 세포의 생존을 촉진하기 위하여, 겔과 같은 지지체 화합물이 사용될 수도 있다.
조성물에 포함될 수도 있는 "지지체 화합물"은 프린팅되는 특정한 조직을 위해 적절한 천연 또는 합성 지지체 화합물, 또는 이들의 조합일 수도 있다. 일반적으로, 지지체 화합물은 바람직하게는 생리학적으로 허용가능하거나 생체적합성이다. 적절한 예는 이에 한정되지 않지만 알기네이트, 콜라겐 (콜라겐 VI 포함), 엘라스틴, 케라틴, 피브로넥틴, 프로테오글리칸, 당단백질, 폴리락티드, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리카프로락톤, 폴리콜리드, 폴리디옥사논, 폴리아크릴레이트, 폴리술폰, 펩티드 연쇄, 단백질 및 유도체, 올리고펩티드, 젤라틴, 엘라스틴, 피브린, 라미닌, 폴리메타크릴레이트, 폴리아세테이트, 폴리에스테르, 폴리아미드, 폴리카르보네이트, 폴리안히드라이드, 폴리아미노산 탄수화물, 폴리사카라이드 및 변형 폴리사카라이드, 및 이들의 유도체 및 공중합체 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,991,652 및 6,969,480 참조) 뿐만 아니라 생물활성 유리와 같은 유리, 세라믹, 실리카, 알루미나, 칼사이트, 히드록시아파타이트, 인산칼슘, 골 및 이들의 조합과 같은 무기 물질을 포함한다.
특정한 유형의 2차원 또는 3차원 조직 또는 그의 일부를 프린팅할 때, 임의의 후속 세포 성장을 미리 정의된 영역으로 실질적으로 제한하는 것이 때때로 요망된다. 따라서, 미리 정의된 영역 밖으로 세포 성장을 억제하기 위하여, 화합물을 프린팅할 수도 있거나, 또는 세포 성장을 억제하고 그에 따라 프린팅된 패턴을 위한 경계를 형성하는 프린트 부위에 적용할 수도 있다. 이러한 목적을 위해 적절한 화합물의 다른 예는, 이에 한정되지 않지만 아가로스, 폴리(이소프로필 N-폴리아크릴아미드) 겔 등을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 예를 들어, 혈관과 같은 세포의 다층 3차원 관을 형성하기 위하여 이러한 "경계 기법"이 사용될 수도 있다. 예를 들어, 세포 현탁액을 하나의 노즐에서 첫 번째 겔 ("겔 A")과 혼합할 수도 있는 반면, 두 번째 겔 ("겔 B")은 다른 노즐에 부하된다. 겔 A는 세포 부착 및 성장을 유도하는 반면, 겔 B는 세포 성장을 억제한다. 관을 형성하기 위하여, 겔 A 및 세포 현탁액을 관의 직경 및 벽 두께에 상응하는 직경 및 폭, 예를 들어 약 3 내지 약 10 밀리미터 직경 및 약 0.5 내지 약 3 밀리미터 벽 두께를 가진 원형 패턴으로 프린팅한다. 내부 및 외부 패턴은 세포 성장의 경계를 한정하는 겔 B에 의해 채워진다. 예를 들어, 겔 A 및 "CHO" 세포를 함유하는 시린지 및 겔 B를 함유하는 시린지를 노즐에 연결할 수도 있다. 겔 B를 먼저 프린팅하고 약 1 내지 5분 동안 냉각시킨다. 이어서 겔 A 및 CHO 세포를 아가로스 기재 위에 프린팅한다. 이 공정을 각각의 층에 대해 반복할 수도 있다.
B. 광학 검출기.
일부 실시양태에서, 관심 부위의 2차원 및/또는 3차원 지도를 결정하기 위하여 세포 및/또는 조성물이 전달되어지는 관심 부위 또는 부위들을 광학 검출기 장치에 의해 검출한다. 광학 검출기는 일부 실시양태에서 부착된 세포 전달 장치와 작동적으로 연관되고, 그에 따라 이러한 지도를 기초로 하여 세포 전달 패턴이 세포 및/또는 조성물의 상피내 전달을 위해 최적화될 수 있게 된다.
본원에서 사용된 "지도"란 2- 및/또는 3차원 표면 측정, 좌표 및/또는 관심 부위 (예를 들어 상처)의 2- 및/또는 3차원 표면을 나타낼 수도 있는 임의의 다른 데이터를 가리킨다. 지도는 어느 때라도 및/또는 세포 및/또는 조성물의 전달 동안에 실시간에 스캐닝에 의해 갱신될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "광학 검출기"는 다양한 파장, 예를 들어 가시광, 적외선, 자외선, 이들의 조합 등에서 광을 검출하는 하나 이상의 검출기를 포함할 수도 있다. 일부 실시양태에서, 가시광 및 적외선 광 둘 모두가 검출된다.
일부 실시양태에서, 관심 부위의 표면 측정과 일치하는 영상을 포착하기 위하여 카메라와 같은 광학 검출기가 사용될 수도 있다. 일부 실시양태에서, 객체로부터 반사된 광을 모으고 객체의 영상을 발생시키기 위하여 영상 센서가 사용된다. 영상 센서 위로 객체에 의해 반사된 광을 집광하기 위하여 거울 및 렌즈 시스템을 영상화 장치와 조합할 수도 있다. 본 발명이 이에 한정되지는 않지만, 영상 센서는 전형적으로 부위 어레이에 배열된 전하 결합 소자 (CCD) 및 상보성 금속 산화물 반도체 (CMOS)의 하나일 수도 있다. 각각 화소 ("화면 요소"에 대한 약기)를 나타내는 센서의 수는 취해진 영상의 해상도를 결정한다. 화소는 디지털 영상을 이루는 가장 작은 단위이고, 영상 일부의 그림자 및/또는 색을 나타낼 수도 있다. 일련의 영상 센서의 출력은 디지털 영상을 만들기 위한 일련의 화소로 코딩될 수도 있다. 디지털 영상은 예컨대 jpeg, tiff 및/또는 gif 포맷과 같은 압축 포맷으로 저장될 수도 있다. 영상은 디지털 저장 장치에 저장될 수도 있고, 디스플레이 적용에 의하여 모니터 위에서 표시될 수도 있다.
일부 실시양태에서, 광학 검출기는 미국 특허 번호 6,856,407 (Knighton et al.) (참고로 본원에 포함됨)에 기재된 것과 같은 3차원 스캐너이고, 여기에서 3차원 객체에 대한 깊이 데이터는 영상 감지 어레이 (ISA)의 단일 화소에서 표면 위의 위치에서의 강도를 포착하는 객체 위에 투사된 강도 구배로부터 얻어진 강도 차이로부터 계산될 수도 있다. 강도는 ISA의 다른 화소로부터의 데이터와 무관하게 및 위치로부터 단일 화소로 반사된 광의 비행 시간과 독립적으로 기준점에 대한 위치까지의 거리 측정으로 전환될 수도 있다. 불균일 환경 또는 표면을 보상하기 위해, 상이한 조건 하에서 해당 위치에서 강도의 다수 회의 포착을 비교할 수도 있다.
일부 실시양태에서, 광학 검출기는 미국 특허출원 공개 번호 2005/0237581 (Knighton et al.) (참고로 본원에 포함됨)에 기재된 3차원 스캐너이다. 관심 부위의 3차원 표시를 발생하기 위해 스캐닝 장치를 사용할 수도 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 3차원 표시는 스캐닝된 객체의 3차원 영상을 생성하고 저장하기 위한 깊이 지도, 다각형 메쉬, 파라메트릭 솔리드, 포인트 클라우드 및 유사한 데이터 구조를 이용할 수 있는 어떠한 유형의 디지털 모델링, 추상화 및/또는 유사한 기법이 될 수 있다. 스캐너는 하나 이상의 영상 감지 어레이 (ISA)에 광을 집광시키는 렌즈 또는 렌즈의 세트를 포함할 수도 있다. 일부 실시양태에서, ISA는 전하 결합 소자(CCD), 상보성 금속 산화물 반도체 (CMOS) 센서, 또는 유사한 영상화 어레이일 수도 있다. 일부 실시양태에서, 렌즈를 반사기, 광 유도기 및/또는 유사한 물품으로 대체하고/하거나 보충할 수도 있다. 초점 설정을 변경시킴으로써, 객체의 입체감의 다양한 양상을 ISA에 집중시킬 수도 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 광학 요소를 가진 광학 시스템은 각각이 표적에 대해 다양한 초점 범위를 갖는 다수의 ISA에 표적의 동일한 영상을 분포시킨다.
스테레오비젼이 또한 사용될 수도 있다. 전통적인 스테레오비젼 방법은 화소의 공간적 조화를 한 쌍의 입체 영상으로 설정함으로써 형태를 추정한다. 입체적 영상을 시간적 영역으로 대응시킴으로써 발전한 시공간 입체라고 불리는 새로운 개념이 발전하였다. 공간적 및 시간적 외형 변형 둘 모두를 사용함으로써, 대응에서의 불명확함을 감소시킬 수 있고 정확성을 증가시킬 수 있는 것으로 나타났다. 시공간 입체 또는 다른 입체 영상화 방법의 결점은, 입체 영상의 대응이 시간-소모적이라는 것이고, 따라서 입체 영상으로부터 고-해상도 3D 형태를 실시간으로 재구축하는 것이 어렵다.
표면 지도화 기법에 기초한 또 다른 영상은 다양한 코딩 방법을 포함하고 다양한 수의 코딩된 패턴을 사용한 구조형 광을 사용할 수 있을 것이다. 스테레오비젼 방법과 달리, 구조형 광 방법은 보통 훨씬 더 단순한 처리 알고리즘을 사용한다. 따라서, 실시간 성능, 즉 측정 및 재구성을 달성하는 것이 가능해진다. 실시간 형태 측정을 위하여, 기본적으로 2개의 접근법이 존재한다. 첫 번째 접근법은 단일 패턴, 전형적으로 컬러 패턴을 사용하는 것이다. 이러한 접근법의 사용은 고속 3D 표면 윤곽 검색을 위해 컬러-코딩 무어(Moire) 기법을 사용한다. 다른 기법은 고속 3D 영상을 위해 레인보우 3D 카메라를 사용한다. 또 다른 것은 이동하는 객체의 고속 스캔을 위해 컬러 구조형 광 기술을 사용한다. 이러한 방법들은 패턴을 코딩하기 위해 컬러를 사용하기 때문에, 형태 측정 결과가 객체 표면의 컬러의 변형에 의하여 다양한 정도로 영향을 받는다. 일반적으로, 더 많은 패턴을 사용함으로써 더욱 우수한 정확성이 얻어진다.
실시간 형태 측정을 위해 다른 구조형 광 접근법은, 단시간에 포착될 수 있도록 이들 사이에서 빠른 스위칭과 함께 다수의 코딩 패턴을 사용하는 것이다. 이러한 접근법이 사용되어 왔으며, 선형 바운더리 코드로 코딩된 4개의 패턴을 사용하는 실시간 3D 모델 측정 시스템을 개발한다. 일부 실시양태는 약 15 fps의 획득 속도를 제공할 수도 있고, 이것은 느리게 이동하는 객체를 스캐닝하기 위해 충분하다. 그러나, 다른 이원-코딩 방법과 유사하게, 선 폭이 하나의 화소보다 커야 하기 때문에 이러한 방법의 공간적 해상도는 비교적 낮다. 또한, 프로젝터에 패턴을 반복적으로 부하함으로써 패턴을 스위칭하는 것은 패턴의 스위칭 속도를 제한할 수도 있고 따라서 형태 측정의 속도를 제한할 수도 있다.
광학 검출기의 다른 예는 미국 특허 번호 6,788,210 및 6,438,272 (참고로 본원에 포함됨)에서 찾아볼 수 있으며, 이것은 3D 표면 지도 및 상기 곡선의 틱 마크와 같은 위치 표시 및 처리 부위를 나타내는 곡선의 지도의 빠른 업데이트를 제공하는 충분한 능력과 함께 실시간 및 고속 3D 형태 측정을 위한 영상 시스템을 제공한다. 이러한 방식으로, 센서는 본 발명의 자동화 괴사조직 절제술 시스템 조절 루프를 폐쇄하는 역할을 하고, 처리 레이저 빔의 실제 위치와 바람직한 위치 사이의 오차가 선택된 (프로그램화된) 역치보다 클 때 처리 레이저 빔을 차단함으로써 시스템의 안전한 작동을 제공하기 위한 수단으로서 역할을 한다. 이러한 방법은 빠른 상-변위 기법을 기초로 한다. 이러한 기술은 화소 수준의 해상도를 제공하기 위해 3개의 상-변위 시뉴소이달 그레이스케일 프린지(sinusoidal grayscale fringe) 패턴을 사용한다. 패턴은 240 fps의 스위칭 속도로 객체에 투사된다. 이러한 시스템은 3개의 코딩된 프린지 패턴의 빠른 스위칭을 위하여 단일-칩 DLP 기술의 장점을 충분히 이용한다. 3개의 상이한 패턴으로 코딩된 적색, 녹색 및 청색 채널을 가진 컬러 프린지 패턴이 PC에 의해 생성된다. 이러한 패턴이 단일-칩 DLP 프로젝터로 보내질 때, 프로젝터가 3개의 컬러 채널을 반복적으로 빠르게 연속하여 투사한다. 컬러의 효과를 없애기 위하여, 프로젝터의 컬러 휠 위의 컬러 필터가 제거된다. 그 결과, 투사된 프린지 패턴이 모두 그레이스케일이다. 객체 표면의 3D 정보가 검색된 각각의 컬러 채널의 영상을 포착하기 위하여, 적절히 동기화된 고속 B/W CCD 카메라가 사용된다. 텍스쳐 지도화를 위해 26.7 fps의 프레임 속도로 객체의 2D 컬러 영상을 얻기 위하여, 프로젝터와 동기화되고 B/W 카메라와 함께 정렬된 컬러 CCD 카메라가 또한 사용된다. 고속 3D 재구성 알고리즘 및 병렬 처리 소프트웨어로, 40 fps 이하의 프레임 속도 및 프레임 당 532×500 포인트의 해상도에서 고-해상도에서 실시간 3D 형태 측정이 구현된다. 당업계에 공지된 3D 형태 측정을 위한 다른 시스템, 예컨대, 미국 매사츄세츠 노르우드에 위치한 블루 힐 옵티칼 테크놀로지스 (Blue Hill Optical Technologies) 또는 미국 N.H. 윈드햄의 넛필드 테크놀로지 (Nutfield Technology)로부터 상업적으로 입수가능한 것이 또한 본 발명의 시스템 및 방법에서 사용될 수 있다.
컴퓨터에 의해 생성된 패턴의 투사를 위하여, 디지털 광 스위칭 기술에 기초한 영상을 생성하는 단일 칩 DLP 프로젝터가 사용된다. 이 시스템으로 본 발명의 자동화 레이저 괴사조직절제술 및 처리 시스템 등을 위해 뛰어난 속도 및 해상도를 제공하면서, 복잡한 얼굴 표면이 40 fps (시스템의 정확도는 0.1 × 0.1 × 0.1 mm 이다)의 속도로 지도화되었다.
컬러 영상은 적색, 녹색 및 청색 채널을 고속으로 순차적으로 반복하여 투사함으로써 생성된다. 이어서 3개의 컬러 채널은 총천연색 영상으로 통합된다. 단일-칩 DLP 프로젝터의 투사 메카니즘을 이용하기 위하여, 적색, 녹색 및 청색 채널의 3개 패턴의 조합인 컬러 패턴이 생성된다. 프로젝터는 단색 작동 모드를 위한 컬러 필터를 갖지 않는다. 그 결과, 컬러 패턴이 프로젝터에 보내질 때, 프로젝터는 240 fps의 속도로 채널과 채널을 빠르게 스위칭하면서 3개의 그레이스케일 패턴으로 투사된다. 실시간 3D 형태 측정을 위해 3개의 패턴을 빨리 포착하기 위하여, 프로젝터와 동기화된 고속 B/W 카메라가 사용된다. 텍스쳐 지도화를 위한 영상을 포착하기 위하여 추가의 컬러 카메라가 사용된다. 3D 지도 및 컬러 정보를 동시에 얻기 위하여, 2개의 카메라가 독립적으로 작동하고 영상 포착 시간이 단지 외부 개시신호에 의해서만 결정되도록 보장하기 위하여 멀티-스레딩(multi-threading) 프로그램화가 사용된다.
객체 표면을 더욱 실제적으로 표현하기 위하여, 시뉴소이달 상-변위 방법에 기초한 컬러 텍스쳐 지도화 방법이 사용될 수도 있다. 이 방법에서, 3개의 프린지 패턴은 이웃한 패턴과 2π/3의 상 변위를 갖는다. 3개 프린지 패턴의 평균이 프린지를 없애기 때문에, 컬러 카메라의 노출 시간을 하나의 투사 주기 또는 12.5 ms로 설정함으로써 프린지 없는 컬러 이미지가 수득될 수 있다.
이러한 시스템은 3개의 코딩 패턴을 빠르게 투사하고 포착하는 능력을 제공한다. 사용된 고속 3-단계 상-변위 방법은 실시간 3D 재구축 속도 및 0.1×0.1×0.1 mm 정도의 높은 측정 정확도를 제공한다. 다양한 축적에서 객체의 3D 형태를 측정하기 위한 광학 도량학에서 시뉴소이달 상-변위 방법이 광범위하게 사용되었다. 이 방법에서, 일련의 상-변위 시뉴소이달 프린지 패턴이 기록되며, 그로부터 모든 화소에서 상 정보가 수득된다. 이러한 상 정보는 영상 필드와 투사 필드 사이의 일치성을 결정하는데 도움이 된다. 일단 이러한 일치가 결정되면, 삼각 측량을 기초로 하여 객체의 3D 좌표 정보를 얻을 수 있다. 다수의 상이한 시뉴소이달 상-변위 알고리즘이 이용될 수 있다. 종래의 3-단계 알고리즘에 유사한 3-단계 상-변위 알고리즘이 사용될 수도 있고, 이것은 3개의 상-변위 영상을 요구한다.
일부 실시양태에서, 광학 검출기 및 프린터 둘 모두가 휴대용 X-Y-Z 플로팅 시스템에 장착된다.
C. 세포 및 조직.
이에 한정되지는 않지만, 체세포, 줄기 세포, 선조 세포 및 분화 세포를 포함한 포유동물 세포 (마우스, 래트, 개, 고양이, 원숭이 및 인간 세포 포함)를 포함하는 어떠한 유형의 세포라도 본원에 기재된 방법을 사용하여 프린팅될 수 있다. 줄기 세포는 다수의 집단 배가 (예, 적어도 60-80)을 통해, 일부 경우에는 본질적으로 무한으로 복제되는 능력을 갖고, 또한 다수의 세포 유형으로 분화되는 능력을 갖고 있다 (예를 들어, 만능성 또는 다능성). 세포가 관심 화합물로 트랜스펙션되는 것이 가능하고, 그 결과 세포가 불멸화된다 (즉, 50회 이상 배가될 수 있다). 예를 들어, 텔로머라제 역전사효소 (hTERT)로의 포유동물 세포 트랜스펙션은 신경 선조 세포를 불멸화할 수 있는 것으로 보고되었다 (미국 특허 번호 7,150,989 (Goldman et al.) 참조).
본원에서 사용된 "배아 줄기 세포"는 배반포의 내부 세포 덩어리로부터 유래되고 만능성인 세포를 가리킨다.
본원에서 사용된 "양수 줄기 세포"는 (a) 포유동물 양수, 포유동물 융모막성 융모 및/또는 포유동물 태반 조직, 또는 포유동물 공여체로부터의 다른 적절한 조직 또는 유체에서 발견되거나 그로부터 수집되고, (b) 만능성이고; (c) 실질적인 증식 잠재력을 갖고, (d) 임의로, 그러나 바람직하게는 시험관내에서 성장하는 공급 세포 층을 필요로 하지 않고/않거나, (e) 임의로, 그러나 바람직하게는, c-kit 항체에 특이적으로 결합하는 (특히, 수집 시에, 세포가 시험관내에서 성장될 때 c-kit 항체를 결합하는 세포의 능력이 시간에 걸쳐 소실될 수도 있기 때문에) 세포 또는 세포의 자손을 가리킨다.
본원에서 사용된 "만능성"은 완전한 분화 다능, 예를 들어 임의의 동물 세포 유형으로 성장하는 능력을 가진 세포를 가리킨다. 만능성 세포는 자기-재생가능하고, 무활동성 또는 휴지상태로 조직과 함께 유지될 수 있다. 전능성 세포 (예를 들어, 수정된 이배체 난세포)와는 달리, 만능성 세포는 보통 새로운 배반포를 형성할 수 없다.
본원에서 사용된 "다능성"은 상응하는 동물 세포 유형의 하위집합으로 성장하는 능력을 가진 세포를 가리킨다. 만능성 세포와는 달리, 다능성 세포는 상응하는 동물의 모든 세포 유형을 형성하는 능력을 갖고 있지 않다.
세포는 자가 이식 (즉, 이들이 적용되는 바로 그 대상체로부터), 동계 (즉, 조직 이식 거부를 최소화하기 위하여, 유전적으로 동일하거나 밀접하게 관련됨), 동종이계 (즉, 동일한 종의 유전적으로 동일하지 않은 구성원으로부터) 또는 이종 (즉, 상이한 종의 구성원으로부터)일 수도 있다. 동계 세포는 자가 (즉, 처리되는 대상체로부터) 및 동형 (즉, 유전적으로 동일하지만 다른 대상체로부터, 예를 들어 동일한 쌍둥이로부터)인 것을 포함한다. 세포는 예를 들어 공여체 (생체 또는 시체)로부터 얻어질 수 있거나, 확립된 세포 계통 또는 세포주로부터 유래될 수도 있다. 예를 들어, 세포는 당업계에 공지된 표준 생검 기법을 사용하여 공여체로부터 수거될 수도 있다.
일부 실시양태에 따르면, 세포의 적어도 일부가 프린팅된 후에도 생존가능하다. "생존 세포"는 배양 접시 또는 다른 기재에 부착되고/되거나 생존 (예, 증식)가능한 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 전체 부하 세포의 적어도 30, 40 또는 50%가 생존가능하고, 추가의 실시양태에서, 전체 부하 세포의 적어도 60, 70, 80 또는 90% 또는 그 이상이 프린팅 후에 생존가능하다. 세포 생존 능력은 통상적인 수단, 예를 들어 MTS 검정에 의해 측정될 수도 있고, 프린팅 후 적당한 시기, 예를 들어 프린팅 완료 후 1일에 측정될 수도 있다. 생존력은 존재하는 특정한 세포 유형의 생존을 위해 최적인 것으로 당업계에 공지된 조건 하에서 인큐베이션시에 측정된다. 예를 들어, 다수의 진핵 세포 유형은 전형적으로 5% 이산화탄소 (95% 대기 공기) 및 37℃에서 적절한 배지에서 인큐베이션된다.
프린팅 동안 및/또는 후에 세포의 생존을 촉진하기 위하여 다양한 메카니즘이 사용될 수도 있다. 특별하게는, 수화, 영양소, 및/또는 구조적 지지체를 제공함으로써 프린팅된 세포를 지지하는 화합물이 사용될 수도 있다. 통상적인 기법을 사용하여, 예컨대 손으로, 세척하거나 욕조에서, 증착 (예를 들어, 물리적 또는 화학적 증착) 등을 통해 화합물을 기재에 적용할 수도 있다. 또한, 프린팅 전 및/또는 동안에 이러한 화합물을 세포 및/또는 조성물과 조합할 수도 있거나, 또는 세포 층 아래, 위 및/또는 사이에서 별도의 층으로서 기재에 프린팅하거나 달리 적용 (예를 들어 코팅)할 수도 있다. 예를 들어, 하나의 그러한 지지체 화합물은 프린팅 조건 하에서 프린트 헤드의 노즐을 통해 통과하기에 충분히 낮은 점도를 갖고 프린팅 동안 및/또는 후에 안정한 형태로 겔화될 수 있는 겔이다. 이러한 점도는 전형적으로 약 0.5 내지 약 50 센티포이즈, 일부 실시양태에서 약 1 내지 약 20 센티포이즈, 및 일부 실시양태에서 약 1 내지 약 10 센티포이즈의 범위 내이다. 본 발명에서 사용될 수 있는 적절한 겔의 일부 예는 이에 한정되지 않지만 한천, 콜라겐, 히드로겔 등을 포함한다.
히드로겔을 위해 사용되는 다른 중합체는 해초로부터 추출된 천연 폴리사카라이드인 알기네이트이다. 알기네이트 용액의 한가지 특징은 2가 양이온 (예, Mg++, Ca++, Sr++, Ba++)의 존재 하에서의 그들의 겔화 성질이다.
겔 이외에도, 다른 지지체 화합물이 또한 본 발명에서 사용될 수도 있다. 예를 들어, 겔을 최적화하거나 관능화하기 위하여 세포외 기질 유사체가 지지체 겔과 조합될 수도 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 성장 인자를 프린팅된 어레이로 도입할 수도 있다. 예를 들어, 다양한 농도 및 순서로 하나 이상의 성장 인자를 함유하는 서방성 마이크로스피어가 세포 및/또는 조성물과 조합될 수도 있다. 다른 적절한 지지체 화합물은 발전하는 구조의 아폽토시스 및 괴사를 피하는데 도움이 되는 것을 포함할 수도 있다. 예를 들어, 생존 인자 (예, 염기성 섬유모세포 성장 인자)가 첨가될 수도 있다. 추가로, 항아폽토시스 (예, bcl-2 및 텔로머라제) 및/또는 차단 경로를 가진 세포의 일시적 유전자 변형이 프린팅된 조성물에 포함될 수도 있다. 프린팅 후에 세포의 생존을 돕기 위해 접착제가 사용될 수도 있다. 예를 들어, 미성숙 구조물이 층의 프린팅 후에 씻겨지거나 이동되는 것을 억제하기 위하여 연조직 접착제, 예컨대 시아노아크릴레이트 에스테르, 피브린 밀봉제 및/또는 젤라틴-레조르시놀-포름알데히드 아교가 사용될 수도 있다. 추가로, 아르기닌-글리신-아스파르트산 (RGD) 리간드와 같은 접착제가 겔화 중합체 또는 다른 지지체 화합물로의 세포의 접착성을 증진시킬 수도 있다. 세포외 단백질, 세포외 단백질 유사체 등이 또한 사용될 수도 있다.
"성장 인자"는 이들의 조합을 포함하여 프린팅되는 특정한 조직 또는 어레이에 적절한 천연 또는 합성 성장 인자일 수도 있다. 다수의 성장 인자가 알려져 있다. 그의 예는 이에 한정되지 않지만 인슐린-유사 성장 인자 (예, IGF-1), 형질전환 성장 인자-베타 (TGF-베타), 골 형성 단백질, 섬유모세포 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 연결 조직 성장 인자 (CTGF), 염기성 섬유모세포 성장 인자 (bFGF), 표피 성장 인자, 섬유모세포 성장 인자 (FGF) (번호 1, 2 및 3), 오스테오폰틴, 골 형성 단백질-2, 성장 호르몬, 예컨대 소마토트로핀, 세포 유인제 및 부착제 등, 및 이들의 혼합물을 포함한다. 미국 특허 번호 7,019,192; 6,995,013; 및 6,923,833 참조. 예를 들어, 성장 인자 단백질은 프린팅된 조성물에 제공될 수도 있고/있거나 트랜스펙션된 플라스미드에 의해 프린팅된 세포 내로 코딩될 수도 있다.
일부 실시양태에서, 세포, 조성물, 지지체 화합물 및/또는 성장 인자는, 형성되는 특정한 조직 (또는 조직 대체물)에 의존하여, 별도의 노즐로부터 또는 공통적인 조성물에서 동일한 노즐로부터 프린팅될 수도 있다. 프린팅은 동시, 순차 또는 이들의 조합일 수도 있다. 성분들의 일부가 첫 번째 패턴 (예, 부식성 또는 분해성 지지체 물질)의 형태로 프린팅될 수도 있고, 성분들의 일부가 두 번째 패턴 (예, 지지체와는 상이한 패턴의 세포, 또는 상이한 패턴의 2개의 상이한 세포 유형)에 프린팅될 수도 있다. 특정한 조합 및 프린팅 방식은 프린팅되는 특정한 조직에 의존할 것이다.
일부 실시양태에서, 세포/조성물은 기재, 예를 들어 생체적합성 골격에 프린팅되고, 이어서 이것을 필요로 하는 대상체에게 이식하거나 그라프팅할 수도 있다. 다른 실시양태에서, 세포가 부착될 수도 있는 이전의 기재 적용 (예를 들어, 피브린의 층)과 함께 또는 없이, 관심 세포/조성물을 신체 내에서 생체 조직에 직접적으로 상피내 프린팅한다.
일부 실시양태에서, 세포를 관심 조직으로부터 단리하거나 당업계에 공지된 기법으로 배양할 수도 있다. 본원에서 사용된 "단리된"은 세포가 그의 자연 환경 이외의 조건에 놓여 있음을 의미한다. 대상체, 예를 들어 일차 외식편으로부터 초기에 단리될 때 조직 또는 세포를 "수거"한다.
"일차 배양물"은 배양 용기에 분해된 세포 또는 일차 외식편을 시딩한 후에 확립되어지는 첫 번째 배양액이다. 본원에서 사용된 "확장하는" 또는 "확장"이란 생존 세포의 수의 증가를 가리킨다. 확장은 예를 들어 하나 이상의 세포 주기를 통해 세포를 "성장"시킴으로써 달성될 수도 있고, 여기에서 세포의 적어도 일부가 분열하여 추가의 세포를 생성한다. 본원에서 사용된 "성장하는"은 세포가 생존상태로 유지되고 세포의 확장 및/또는 분화를 포함하거나 포함하지 않을 수도 있는 세포의 배양액을 포함한다.
"시험관내 계대배양된" 또는 "계대배양된"이란, 증식 속도에 의존하여 통상 기계적 또는 효소적 분해의 실행, 재시딩 및 2개 이상의 자손 배양액으로의 분열에 의하여, 세포 배양액을 두 번째 배양 용기에 전달 또는 2차배양하는 것을 가리킨다. 집단이 특정한 유전형 또는 표현형을 위해 선택된다면, 배양액은 2차배양 시에 "세포 주"가 되고, 다시 말해서 배양액이 균일하며 바람직한 특징 (예, 특정한 단백질 또는 마커를 발현하는 능력)을 갖는다.
단백질 또는 다른 생물학적 마커의 "발현하다" 또는 "발현"은, 동일한 전구체를 코딩하는 유전자가 전사되고 바람직하게는 번역되는 것을 의미한다. 전형적으로, 본 발명에 따르면, 유전자의 코딩 영역의 발현에 의하여 코딩된 폴리펩티드가 생성될 것이고, 그 결과 세포가 단백질 또는 다른 하류 생물학적 마커에 대해 "양성"이 된다.
"피부 세포"는 피부에서 보통 발견되는 세포를 포함하고, 표피 세포 (예, 각질세포, 멜라닌세포, 메르켈 세포, 랑게르한스 세포 등 및 이들의 임의의 조합) 및 피부 세포 (예, 섬유모세포, 지방세포, 비만 세포, 마크로파지 및 이들의 조합)을 포함한다. 멜라닌세포 및 모유두 세포의 포함에 의하여 천연 피부를 모방하기 위해 피부 조직이 형성될 수도 있다. 본 발명의 방법에 의해 생성된 피부 조직은 예를 들어 화상 및 절개, 열상 및 압궤 손상 (예, 수술후 상처 및 외상후 상처, 하지궤양, 당뇨병성 족부 궤양 등)과 같은 기타 상처의 치료를 위하여 대상체 내에 또는 상에 이식하기에 유용하다.
"근육 세포"는 평활근 세포, 심장근 세포, 골격근 세포 (예, 근육 섬유 또는 근세포, 근모세포, 근관, 등) 및 이들의 조합을 포함하여 근육 조직에서 보통 발견되는 세포를 포함한다. 본원에 기재된 방법에 의해 제조된 근육 세포/조직은, 다른 것들 중에서, 근육 조직에 영향을 주는 상해 또는 결함의 치료를 위해 유용하고/하거나 근육 치유를 촉진한다.
"연골 세포(cartilage cell)"는 연골에서 보통 발견되는 세포를 포함하고, 이 세포는 연골세포(chondrocyte)를 포함한다. "연골세포"는 예를 들어 콜라겐 및 프로테오글리칸을 생성함으로써 연골의 세포외 기질을 생성하고 유지한다. 연골은 신체에서 발견되는 매우 특수한 연결 조직이고, 그의 주된 기능은 주위 조직을 위한 구조적 지지체를 제공하거나 (예를 들어, 귀 및 코에서) 또는 완충하는 (예를 들어 기관 및 관절에서) 것이다. 연골의 유형은 유리질 연골 (관절, 코, 기관, 추간판 (NP), 연골 단판), 탄성 연골 (건 삽입 부, 인대 삽입 부, 관절반달, 추간판 (AP)), 늑연골 (갈비, 성장판) 및 섬유연골 (귀)을 포함한다. 연골은 매우 제한된 복구 능력을 갖고 있기 때문에, 대상체에서 연골의 손실이 문제가 될 수 있다. "중간엽 줄기 세포" 또는 "MSC"는 연골세포의 선조세포이다. MSC는 또한 골모세포로 분화될 수 있다. 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 연골 세포/조직은 다른 것들 중에서, 연골 손상 또는 질병을 치료하기 위하여 대상체로 이식하기에 유용하다.
"골 세포"는 보통 골에서 발견되는 세포를 포함하고, 골모세포, 파골세포, 골세포 및 이들의 임의의 조합을 포함한다. 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 골 세포/조직은, 다른 것들 중에서 골절 또는 골 결함을 치료하기 위해 대상체에게 이식하기에 유용하고/하거나 골 치유를 촉진한다.
"신경계 세포" 또는 "신경 세포"는 뉴런 및 신경교세포를 포함하여 말초 신경계에서 보통 발견되는 세포를 포함한다.
"혈관 세포"는 혈관을 포함하여 포유동물 혈관계에서 보통 발견되는 세포를 포함하고, 내피세포, 평활근 세포 및 섬유모세포를 포함한다.
일부 실시양태에서, 잉크젯 프린팅에 의하여 줄기 세포를 기재 상에 프린팅한다. 줄기 세포는 단독으로 프린팅될 수도 있거나 (전형적으로 지지체 화합물 또는 화합물들과 조합하여), 또는 하나 이상의 추가의 세포와의 조합으로 (예를 들어, 상기 기재된 조직을 생성하기 위해 선택된 조합으로) 프린팅될 수도 있다. 일부 실시양태에서, 줄기 세포는 관심 세포로 분화된다.
본원에서 사용된 "분화" 및 "분화하는"은 (a) 기재 상으로의 프린트에 앞서서치료에 대한 반응으로 세포의 분화 및 분화 완결을 유도하기 위한 세포의 처리, (b) 분화를 유도하기 위한 세포의 처리, 이어서 기재 상에서 세포의 프린팅, 이어서 프린팅 후에 이러한 처리에 대한 반응에서 세포의 분화, (c) 세포가 프린팅된 후에 분화를 유도하는 분화 인자(들)과 동시에 또는 순차적으로 세포의 프린팅, (d) 프린팅 후에 분화 인자 또는 배지 등으로의 세포의 접촉, 및 전술한 것 모두의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 기재된 것과 유사한 방법으로 세포에 적절한 인자 또는 인자들을 접촉시킴으로써 분화를 조절하거나 지연시킬 수도 있다. 일부 실시양태에서, 적절한 분화 인자는 상기 기재된 하나 이상의 성장 인자이다. 분화 및 분화의 조절은 공지된 기법, 예를 들어 미국 특허 번호 6,589,728 또는 미국 특허출원 공개 번호 2006006018 (내인성 복구 인자 생성 촉진인자); 20060013804 (카스파제-3 활성의 조절에 의한 줄기 세포 분화의 조절); 20050266553 (줄기 세포에서 분화의 조절 방법); 20050227353 (줄기 세포의 분화 유도 방법); 20050202428 (만능성 줄기 세포); 20050153941 (세포 분화 억제제, 이를 사용한 세포 배양 방법, 배양 배지 및 배양된 세포주); 20050131212 (뉴런 재생 펩티드 및 뇌 손상의 치료에서 그의 사용 방법); 20040241856 (줄기 세포의 조절을 위한 방법 및 조성물); 20040214319 (줄기 세포에서 분화의 조절 방법); 20040161412 (세포-기반 VEGF 전달); 20040115810 (줄기 세포 분화-유도 프로모터); 20040053869 (줄기 세포 분화); 또는 당업자에게 명백한 상기 또는 하기 변형에 기재된 것과 같은 기법에 따라 수행될 수 있다.
"대상체"는 일반적으로 인간 대상체이고, 이에 한정되지 않지만 "환자"를 포함한다. 대상체는 남성 또는 여성일 수도 있고, 이에 한정되지 않지만 백인, 아프리카계 미국인, 아프리카인, 아시아인, 히스패닉, 인도인 등을 포함하여 어느 인종 또는 민족일 수도 있다. 대상체는 신생아, 1개월 이하의 신생아, 유아, 소아, 청년, 성인 및 노인 대상체를 포함하여 어느 연령일 수도 있다.
대상체는 동물 대상체, 특히 척추동물 대상체, 예를 들어 포유동물 대상체, 예컨대 예를 들어 척추동물 의약 및/또는 연구 또는 실험 목적을 위한 개, 고양이, 소, 염소, 말, 양, 돼지, 설치류 (예, 래트 및 마우스), 토끼목 포유류(lagomorph), 비-인간 영장류 등, 또는 어류 또는 조류 대상체를 포함할 수도 있다.
"치료한다"는 대상체, 예를 들어 외상 또는 질병을 앓고 있는 환자에게 유익을 부여하는 임의 유형의 치료를 가리킨다. 치료는 환자의 상태를 개선하기 위한 목적에서 취해지는 행동 및 삼가는 행동을 포함한다 (예를 들어, 하나 이상의 증상의 경감을 위해 이를 필요로 하는 환자에서 치유의 촉진 및/또는 조직의 형성, 등). 일부 실시양태에서, 치료는 세포 및/또는 조직을 치료를 필요로 하는 대상체에 직접 프린팅함으로써 피부 조직 (예를 들어, 상해 또는 질병에 의하여 조직이 손상되거나 소실되는 경우)의 재구축을 포함한다.
본 발명은 세포 및 지지체 물질, 또는 일반적인 조직 (예, 피부 조직)에서 전형적으로 발견되는 2 또는 3 또는 그 이상의 상이한 세포 유형의 적절한 조합에 의해 조직의 프린팅을 제공한다. 형성되는 특정한 조직 (또는 조직 대체물)에 의존하여, 세포, 지지체 화합물, 및 성장 인자를 별도의 노즐로부터 또는 공통 조성물에서 동일한 노즐을 통해 프린팅할 수도 있다. 프린팅은 동시, 순차 또는 이들의 조합일 수도 있다. 일부 성분들은 첫 번째 패턴의 형태로 프린팅될 수도 있고 (예를 들어, 부식성 또는 분해성 지지체 물질), 일부 성분은 두 번째 패턴의 형태로 프린팅될 수도 있다 (예를 들어, 지지체와는 상이한 패턴의 세포, 또는 상이한 패턴에 있는 2개의 상이한 세포 유형). 또한, 특정한 조합 및 프린팅 방식은 특정한 조직에 의존될 것이다. 특정한 조직 또는 조직 대체물을 위해 프린팅되는 물질을 이하에서 더욱 설명한다.
피부. 대표적인 실시양태에서, 표피-유사 피부 조직을 생성하기 위해 다음이 프린팅된다:
(a) 적어도 하나의 세포 유형, 및 바람직하게는 적어도 2개 또는 일부 실시양태에서 3개 또는 4개의 상이한 표피 세포 유형 (예, 각질세포, 멜라닌세포, 메르켈 세포, 랑게르한스 세포, 등 및 이들의 조합); 및/또는
(b) 상기 기재된 것과 같은 적어도 하나의 지지체 화합물 (예, 콜라겐, 엘라스틴, 케라틴 등, 및 이들의 조합); 및/또는
(c) 상기 기재된 것과 같은 적어도 하나의 성장 인자 (예, 염기성 섬유모세포 성장 인자 (bFGF), 인슐린-유사 성장 인자 1, 표피 성장 인자 (EGF) 등 및 이들의 조합).
일부 실시양태에서, 상기 기재된 바와 같이 프린팅된 표피 세포, 지지체 화합물 및/또는 성장 인자 ("표피" 유형 층을 형성함)가 미리 형성된 (예, 프린팅되거나 잉크-젯 프린팅된) "피부" 유형 층 위에 프린팅되고, 미리 프린팅된 피부 층은 (a) 1, 2, 3 또는 4개 상이한 피부 세포 (섬유모세포, 지방세포, 비만세포 및/또는 마크로파지), (b) 상기 기재된 것과 같은 적어도 하나의 지지체 화합물; 및/또는 (c) 상기 기재된 것과 같은 적어도 하나의 성장 인자를 포함한다.
본 발명의 방법에 의해 생성된 피부 조직은 예를 들어 화상, 및 기타 상처, 예컨대 절개, 열상 및 압궤 손상 (예, 수술후 상처 및 외상후 상처, 하지궤양, 당뇨병성 족부 궤양 등)의 치료에 유용하다.
골. 특별한 실시양태에서, 골 조직을 생성하기 위하여 다음을 프린팅한다:
(a) 적어도 하나의 골 세포 유형, 및 바람직하게는 적어도 2개 또는 3개의 상이한 골 세포 유형 (예, 골모세포, 파골세포, 골세포 및 이들의 조합, 일부 실시양태에서는 적어도 골모세포 및 파골세포, 및 일부 실시양태에서는 3개 모두); 및/또는
(b) 상기 기재된 것과 같은 적어도 하나의 지지체 화합물 (예, 콜라겐, 히드록시아파타이트, 칼사이트, 실리카, 세라믹, 프로테오글리칸, 당단백질 등, 및 이들의 조합); 및/또는
(c) 적어도 하나의 성장 인자 (예, 골 형성 단백질, 형질전환 성장 인자, 섬유모세포 성장 인자, 혈소판-유래 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자 등 및 이들의 조합).
본 발명에 기재된 방법에 의해 제조된 골 조직은 다른 것들 중에서 골절 또는 골 결함을 치료하고/하거나 골 치유를 촉진하기 위해 대상체에게 이식하기에 유용하다.
신경. 대표적인 실시양태에서, 신경 조직을 생성하기 위하여 다음을 프린팅한다:
(a) 적어도 1, 2 또는 3개의 세포 유형, 및 바람직하게는 (i) 말초 신경 세포 및/또는 (ii) 적어도 하나의 신경교 세포 유형 및 (iii) 이들의 임의의 조합 (예, 적어도 하나의 신경 세포 및 적어도 하나의 신경교 세포의 조합); 및/또는
(b) 상기 기재된 것과 같은 적어도 하나의 지지체 화합물; (예, 라미닌, 콜라겐 유형 IV, 피브로넥틴 등 및 이들의 임의의 조합); 및/또는
(c) 적어도 하나의 성장 인자 (예, NGF, 뇌-유래 신경영양 인자, 인슐린-유사 성장 인자-I, 섬유모세포 성장 인자 등 또는 이들의 임의의 조합); 및
상기의 임의의 조합.
본원에 기재된 방법에 의해 제조된 신경 조직은, 다른 것들 중에서, 말초 신경계를 침범하는 신경 손상 또는 변성 질병을 치료하는데 유용하다.
근육. 대표적인 실시양태에서, 근육 조직을 생성하기 위하여, 다음을 프린팅한다.
(a) 적어도 하나의 근육 세포 유형; 및/또는
(b) 상기 기재된 것과 같은 적어도 하나의 지지체 화합물 (예, 라미닌, 콜라겐 유형 IV, 피브로넥틴 등 및 이들의 조합); 및/또는
(c) 적어도 하나의 성장 인자 (예, 혈관 내피 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자 (IGF) 등, 또는 이들의 임의의 조합); 및 전술한 것의 임의의 조합.
본원에 기재된 방법에 의해 제조되는 근육 조직은, 다른 것들 중에서 평활근, 골격근 또는 심장근 손상 또는 이러한 조직을 침범하는 질병을 치료하기 위해 유용하다.
혈관 조직. 대표적인 실시양태에서, 혈관 조직을 생성하기 위하여 다음을 프린팅한다.
(a) 적어도 하나의 혈관 세포 유형, 및 바람직하게는 적어도 2개 또는 3개의 상이한 혈관 세포 유형 (예, 내피 세포, 평활근 세포, 섬유모세포 및 이들의 임의의 조합, 일부 실시양태에서 적어도 내피 세포, 평활근 세포, 및 일부 실시양태에서는 3개 모두); 및/또는
(b) 상기 기재된 것과 같은 적어도 하나의 지지체 화합물 (예, 라미닌, 콜라겐 유형 IV, 피브로넥틴 등 및 이들의 임의의 조합); 및/또는
(c) 적어도 하나의 성장 인자 (예, 혈관 내피 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자 (IGF), 등, 또는 이들의 임의의 조합) 및 전술한 것의 임의의 조합.
본원에 기재된 방법에 의해 제조된 혈관 조직은, 다른 것들 중에서 혈관 망을 형성하고/하거나 이러한 조직을 침범하는 상해 또는 질병을 치료하기 위해 유용하다.
일부 실시양태에서, 조직은 "순서대로" 층상으로 생성되고, 프린팅된 층(A), 이어서 프린팅된 층(B), 등으로 연속하여, 예컨대 층 A, B, C, D … 로 필요에 따라 생성된다.
각각의 층은 필요하거나 원하는 대로 조직을 구축하기 위하여 세포, 지지체 화합물, 성장 인자, 이들의 조합 등을 포함할 수도 있다.
일부 실시양태에서, 세포는 첫 번째 층, 이어서 지지체 물질의 두 번째 층, 예컨대 겔, 임의로 이어서 세포의 세 번째 층으로 프린팅될 수도 있다. 예를 들어, 다층 피부 조직을 섬유모세포를 포함하는 층, 이어서 겔을 포함하는 층 (예, 피브린, 피브리노겐, 콜라겐 등 포함), 이어서 각질세포를 포함하는 층으로서 프린팅할 수도 있다. 또한, 추가의 층을 필요에 따라 제공할 수도 있다. 원한다면, 트롬빈이 하나 이상의 층과 함께 또는 그 위에 프린팅될 수도 있다.
일부 실시양태에서, 피부 세포 및/또는 그의 층이 프린팅될 수도 있고 (예, 섬유모세포, 각질세포, 멜라닌세포 등), 그 위에 또는 그와 함께 별도의 단위 및/또는 패턴으로 추가의 피부 세포가 프린팅된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서 모낭을 형성하는 모유두 세포는 특정한 위치 및/또는 밀도로 프린팅될 수 있고 (모간 두께 및 길이는 적어도 부분적으로 모유두 세포 수 및 부피에 의해 결정되고, 세포 수가 증가함에 따라 모발이 더 길어진다), 이것은 상이한 신체 위치, 연령 군, 성별 등에 대해 천연 피부 조직과 매우 밀접하게 비슷한 모발을 생성할 수 있다. 원한다면, 외부 뿌리 세포가 피부 모유두 세포와 함께 프린팅될 수도 있다. 멜라닌세포가 특정한 위치 및/또는 밀도로 프린팅될 수도 있는데, 예를 들어, (예를 들어, 주근깨를 가진) 인접한 피부에 더욱 잘 일치하기 위하여 그렇게 한다.
일부 실시양태에서, 이러한 세포 프린팅 패턴의 사용은 이미 흉터를 가진 오래된 상처의 재생에 도움이 될 수도 있고, 흉터를 더욱 자연스럽게 보이는 피부로 대체한다.
D. 데이터 처리 방법, 컴퓨터 프로그램 및 시스템.
일부 실시양태에서, 광학 검출기로부터 수득된 데이터를 함께 연결하여 관심 신체 표면 (예, 상처 표면)의 모델을 형성한다. 신체 표면은 손, 발, 팔, 다리, 몸통, 가슴, 복부, 등, 머리, 얼굴, 그의 일부 및/또는 이들의 조합 등을 포함하여, 그 위에 상처 부위를 포함하는 어떠한 신체 부분일 수도 있다.
일부 실시양태에서, 표면을 이어서 표면의 몰드로 변형시킨다. 본원에서 사용된 "몰드"는 관심 신체 표면의 3차원 표시이고, 일부 실시양태에서 시각적으로 표시될 수도 있고, 3차원 지도 좌표에 추가로, 특히 색 및/또는 적외선 복사선 강도와 같은 정보를 또한 포함할 수도 있다. 일부 실시양태에 따른 몰드를 층이 역전되는 "음각" 몰드로 해석하고, 필요에 따라 관련된 프린터를 유도하기 위하여 어떠한 층(예, 피부 조직의 진피 및 표피 층)이 천연 조직 층에 상응하는지를 결정하기 위하여 이것을 Z축 위에서 층으로 더욱 분할할 수도 있다.
일부 실시양태에서, 각각의 층을 검출되는 부분의 적어도 일부를 덮는 일련의 선으로 겹친다 (즉, 층 표시 또는 몰드에 선을 추가한다). 프린터를 위한 경로를 결정하기 위하여 이러한 선들을 사용할 수도 있다 (예를 들어, 제어 소프트웨어에 의하여). 프린터는 각각의 층을 위한 일련의 선을 따라 프린팅될 수도 있고, 그에 따라 층상 방식으로 조직을 형성한다.
일부 실시양태에서, 사용자는 각각의 비-흑색 화소가 셀 드롭에 상응하는 일련의 비트맵 영상을 한정할 수도 있고, 화소의 색은 프린팅되는 세포 유형에 상응한다. 이것은 사용자가 다양한 세포 유형 및/또는 다양한 배열을 사용하여 복잡한 구조를 형성할 수 있도록 한다.
일부 실시양태에 따른 시스템 및/또는 부품 작동을 컴퓨터 프로그램 명령에 의해 실행할 수도 있다. 이러한 컴퓨터 프로그램 명령을 일반 목적 컴퓨터, 특수 목적 컴퓨터 및/또는 기계를 생성하기 위해 기타 프로그램가능한 데이터 처리 장치의 프로세서에 제공할 수도 있는데, 그 결과 컴퓨터 및/또는 기타 프로그램가능한 데이터 처리 장치의 프로세서를 통해 실행되는 명령은 원하는 작업을 실행하기 위한 수단을 형성한다.
또한, 이러한 컴퓨터 프로그램 명령은 특정한 방식으로 작동하도록 컴퓨터 또는 기타 프로그램가능한 데이터 처리 장치를 지시할 수 있는 컴퓨터-판독가능한 메모리에 저장될 수도 있는데, 그 결과 컴퓨터-판독가능한 메모리에 저장된 명령은 작업을 실행하는 명령을 포함하는 제조 물품을 생성한다.
또한, 컴퓨터 또는 다른 프로그램가능한 장치에서 일련의 작업 단계가 실행될 수 있도록 컴퓨터 프로그램 명령을 컴퓨터 또는 다른 프로그램가능한 데이터 처리 장치에 부하할 수도 있는데, 그 결과 컴퓨터 또는 기타 프로그램가능한 장치에서 실행되는 명령은 작업을 실행하기 위한 단계를 제공한다.
따라서, 본 발명은 하드웨어 및/또는 소프트웨어 (펌웨어, 상주 소프트웨어, 마이크로코드 등)에서 구현될 수 있다. 또한, 본 발명의 실시양태는 명령 실행 시스템에 의하여 또는 그와 관련하여 사용하기 위해 매체에서 구현되는 컴퓨터-사용가능 또는 컴퓨터-판독가능 프로그램 코드를 가진 컴퓨터-사용가능 및/또는 컴퓨터-판독가능 저장 매체에서 컴퓨터 프로그램 제품의 형태를 취할 수도 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 컴퓨터-사용가능 또는 컴퓨터-판독가능한 매체는 명령 실행 시스템, 장치 또는 기구에 의하여 또는 그와 관련하여 사용하기 위한 프로그램을 함유할 수 있거나 저장할 수 있는 어떠한 매체일 수도 있다.
컴퓨터-사용가능 및/또는 컴퓨터-판독가능 매체는 예를 들어 이에 한정되지 않지만 전자, 자기, 광학, 전자기, 적외선 또는 반도체 시스템, 장치 또는 기구일 수도 있다. 컴퓨터 판독가능한 매체의 더욱 특별한 예 (전체 목록이 아님)는 다음을 포함한다: 휴대용 컴퓨터 디스켓, 랜덤 엑세스 메모리 (RAM), 판독-전용 메모리 (ROM), 지울 수 있는 프로그램가능한 판독-전용 메모리 (EPROM 또는 플래시 메모리) 및 휴대용 콤팩트 디스크 판독-전용 메모리 (CD-ROM).
일부 실시양태에서, 소프트웨어는 3-타이어드(3-tiered) 구조 디자인을 사용한다. 3-타이어드 구조는 3개 통신 영역을 취급한다: 사용자와 소프트웨어 사이; 소프트웨어 부품들 중; 및 소프트웨어와 파일 시스템 사이. 이러한 디자인 구조는 다른 부품에 영향을 주지 않으면서 필요에 따라서 각각의 부품들이 빠르고 쉽게 변경될 수 있도록 한다.
일부 실시양태에서, 광학 검출기로부터 모은 데이터는 객체로서 표시된다 (예를 들어, 피부 객체). 각각의 객체는 조직의 하나 이상의 층을 포함할 수도 있고, 각각의 층은 검출기로부터 각각의 선을 둘러싼 격자 내로 파괴될 수도 있다. 컴퓨터가 이후의 조각을 분석하는 동안 전달 시스템이 격자의 하나의 조각으로부터의 점을 프린팅할 수 있게 함으로써, 이러한 표시는 피부에 전달하기에 필요한 시간을 상당히 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 객체로부터의 점은 일반적인 형식으로 전달 시스템으로 보내지고, 이 곳에서 프린트헤드에 있는 상이한 세포 유형의 위치를 포함시키는 방식으로 프린팅을 위해 분석된다. 이러한 실행은 사용자가 스캐닝된 데이터에 대한 보강을 빠르게 정의하여 조직의 다른 성분을 포함할 수 있도록 한다 (예, 멜라닌세포 및 피부 조직을 위한 모낭과 같은 피부 성분).
피부 전달 시스템은 3-타이어드 구조 디자인을 사용하는 소프트웨어에 의해 조절될 수도 있다. 일부 실시양태에서, 구조는 마이크로소프트.NET 프레임워크 2.0 (마이크로소프트 코포레이션, 미국 WA 레드몬드)을 기초로 할 수도 있다. 이러한 실시양태는, 소프트웨어가 다른 것들 중에서 예를 들어 C++와 같은 객체-지향 프로그램화 언어를 포함하여 프로그램화 언어의 어느 하나 또는 조합으로 씌여질 수도 있다는 것을 제공한다. 3-타이어드 구조는 3개 통신 분야를 취급하도록 구성될 수도 있다: 사용자와 소프트웨어 사이; 소프트웨어 부품들 사이; 및 소프트웨어와 파일 시스템 사이. 이러한 디자인 구조는 다른 부품들에 영향을 미치지 않으면서 모든 부품이 빠르고 쉽게 필요에 따라 변경될 수 있도록 한다. 또한, 소프트웨어가 예를 들어 MATLAB®와 같은 독점 시스템을 기초로 하지 않기 때문에, 이것은 가동되는 .NET 프레임워크 2.0을 가능하게 하는 어떠한 컴퓨터에 사용될 수 있다.
본 발명은 하기 비-제한적 실시예에서 더욱 상세히 설명된다.
실시예 1
이 실시예는 피부의 상피내 바이오프린팅을 위한 신규의 전달 시스템의 디자인 및 용도를 설명한다. 여기에 제시된 카트리지 기반 시스템은 환자로부터 환자로 쉽게 전달될 수 있고 정상 피부를 모방한 피부 구조물을 쉽게 프린팅할 수 있다. 이 장치는, 상처의 크기, 형태 및 깊이를 결정하는 방법을 피부 세포의 상피내 표적 상처 부위로의 조절 전달과 통합하여, 화상 상처의 빠른 제자리 관리를 가능하게 한다. 이러한 통합은, 시스템이 정상적인 피부 구조를 재구축하면서, 큰 상해의 치료를 효과적으로 관리할 수 있게 한다. 섬유모세포 및 각질세포를 하기 기재된 큰 피부 상처의 마우스 모델에 상피내 전달하는 것을 사용하는, 개념-증명 실험이 그의 효능을 증명한다.
물질 및 방법
이러한 일례의 시스템을 위한 하드웨어 디자인을 설계하기 위하여 하기 기준을 설정하였다:
1. 시스템은 휴대가능해야 하고, 상처를 입은 개인에게 빠르게 운반될 수 있어야 하며, 상이한 요구를 가진 상이한 환자에서 사용하기 위해 쉽게 전환될 수 있어야 한다. 예를 들어, 시스템은 병원 문 및 복도를 통과하기에 적합해야 하고, 용이한 운반을 위해 경량 물질로 구축되어야 한다.
2. 시스템은 용이한 멸균이 가능해야 한다.
3. 시스템은 환자의 특별한 요구에 세포 요법을 맞출 수 있어야 한다.
4. 시스템은 넓은 범위의 신체 유형에 적합해야 한다.
5. 시스템은 반복된 사용이 가능해야 한다.
6. 시스템의 유지가 비교적 쉽고 저렴해야 한다.
본 발명자들은, 둘 모두 이동식 XYZ 플로팅 시스템 (도 1) 상에 장착된, 카트리지 기반 전달 시스템 및 레이저 스캐닝 시스템을 사용함으로써 이러한 목표를 달성하였다. 카트리지 시스템은 전통적인 잉크젯 프린트에서 사용되는 것과 유사하고, 그 결과 상이한 색 잉크가 상이한 카트리지에 함유되는 것과 동일한 방식으로 각각의 세포 유형이 개별적인 카트리지에 부하된다. 그러나, 표준 잉크젯 프린트는 하나의 프린트헤드를 하나의 카트리지에 연결하는 반면, 피부 전달 시스템은 각각의 카트리지를 다수의 프린트헤드에 연결할 수 있다. 이러한 유형의 구성은, 각각의 환자의 특별한 요구에 맞출 수 있는 임의적 프린트헤드 구성을 가능하게 한다. 또한, 이것은 시스템의 출력량을 증가시키고, 세정 유체의 카트리지를 프린트헤드에 부착함으로써 신속한 멸균 방법을 제공한다.
신규 장치에서 프린트헤드는 전통적인 잉크젯 프린터에서 사용되는 열 또는 압전 미세유체 전달 장치 대신에 압력-기반 노즐을 사용한다. 압력-기반 전달 시스템은 다양한 신체 유형을 수용하기 위해 프린터를 환자 위쪽의 안전한 거리에 유지하도록 한다.
각각의 환자에게 세포 요법을 맞추는 것은, 상처에 대한 길이, 폭 및 깊이 정보를 필요로 한다. 이러한 시스템은 환자 위쪽에 장착된 3차원 레이저 스캐너 (넥스트엔진 인코포레이티드(NextEngine Inc., 미국 캘리포니아주 산타 모니카)를 포함한다. 이 스캐너는 신체 상의 다양한 위치로 이동될 수 있고, 상처에 관한 정보가 대략 127 ㎛의 정확도로 수집된다.
카트리지, 프린트헤드 및 스캐너를 100 ㎛ 이동가능한 벨트-구동 플로팅 시스템 (도 1)의 Z축에 장착한다. Y축은 X축을 이동시키고, X축은 다시 Z축을 이동시킨다. X 및 Y축이 시스템 중량의 대다수를 차지하기 때문에, 이러한 구성은 시스템이 넓은 범위의 신체 유형을 수용할 수 있도록 하면서 축이 고정상태로 유지되도록 한다.
플로팅 시스템은 이동가능한 프레임 상에 설치된다. 큰 화상을 입은 환자는 이송이 어렵고, 인테그라(INTEGRA)® 및 자가 각질세포 배양액을 포함한 일부 현행 치료법이 다수의 절차를 필요로 한다. 다수의 절차는 유약한 환자가 침대와 수술실 사이를 여러 번 이동하게 만든다. 이러한 프레임은 시스템이 환자의 침대와 수술실에 빠르게 이동할 수 있도록 함으로써 운반 염려를 경감시키도록 고안되어 있다.
소프트웨어
피부 전달 시스템은 마이크로소프트.NET 프레임워크 2.0 (미국 WA, 레드몬드, 마이크로소프트 코포레이션)을 기초로 한 3-타이어드 구조 디자인을 사용하는 소프트웨어에 의하여 조절되고 이것은 C++로 씌어졌다. 3-타이어드 구조는 3개의 통신 부위를 취급한다: 사용자와 소프트웨어 사이, 소프트웨어 부품들 중, 그리고 소프트웨어와 파일 시스템 사이. 이러한 디자인 구조는 다른 성분에 영향을 미치지 않으면서 필요에 따라 모든 성분이 빠르고 쉽게 변경될 수 있도록 한다. 또한, 소프트웨어가 MATLAB®와 같은 사유 시스템을 기초로 하지 않기 때문에, 이것이 .NET 프레임워크 2.0을 시행할 수 있는 임의의 컴퓨터에 사용될 수 있다.
레이저 스캐너로부터 수득된 데이터를 함께 이어 맞춰서 상처 표면의 모델을 형성한다. 어떠한 층이 진피 및 표피에 상응하는지를 결정하기 위하여 이 표면을 상처의 음각 몰드로 변형시키고, 이 음각 몰드는 Z축 위에서 층으로 분할된다. 각각의 층을 전체 상처 부위를 덮는 일련의 선으로 겹쳐 놓는다. 프린터를 위한 경로를 결정하기 위해 이러한 선을 제어 소프트웨어에 의해 사용한다.
소프트웨어의 더 작은 부품의 각각은 전체 구조와 유사한 디자인 패턴을 따른다. 레이저 스캐너로부터 모아진 데이터를 피부 객체로서 표시한다. 각각의 피부 객체는 피부 층으로 이루어지고, 각각의 층이 스캐너로부터 각각의 선을 둘러싼 격자로 파괴된다. 컴퓨터가 이후의 조각을 분석하는 동안 전달 시스템이 격자의 하나의 조각으로부터의 점을 프린팅할 수 있게 함으로써, 이러한 표시는 피부에 전달하기에 필요한 시간을 상당히 감소시킨다. 피부 객체로부터의 점이 일반적인 형식으로 전달 시스템에 보내지고, 이곳에서 프린트헤드에 있는 상이한 세포 유형의 위치를 포함시키는 방식으로 프린팅을 위해 분석된다. 이러한 실행은 사용자가 스캐닝된 데이터에 대한 보강을 신속히 정의하여 멜라닌세포 및 모낭과 같은 중요한 피부 성분을 포함할 수 있도록 한다.
동물 모델 및 시험
웨이크 포리스트 유니버시티 헬스 사이언시즈 애니멀 케어 앤드 유스 커미티(Wake Forest University Health Sciences Animal Care and Use Committee)에 의해 승인된 프로토콜에 따라서 모든 동물 절차를 수행하였다. 6마리의 암컷 이교계 무흉선 누드 (Nu/nu) 마우스 (챨스 리버 래보러토리즈, 미국 NC 롤리)의 등에 3 × 2.5 cm (L × W) 전체층 피부 결함을 만듬으로써 피부 전달 시스템 원형을 평가하였다. 이러한 결함은 약 50% TBSA 상처를 나타낸다. 3마리의 마우스를 비처리하고, 다른 것들을 세포 프린팅에 의해 처리하였다. 인간 섬유모세포를 인간 포피로부터 얻고 5% 태아 소 혈청 및 1% 항생제를 가진 고 글루코스 둘베코 변형 이글 배지 (깁코-BRL(Gibco-BRL), 미국 NY 그랜드 아일랜드)에서 배양하였다. 인간 각질세포를 사이언셀(ScienCell) (미국 CA 칼스배드)로부터 수득하고, 1% 항생제를 가진 각질세포 무혈청 배지 (깁코-BRL)에서 배양하였다. 충분한 세포 수에 도달했을 때, 세포를 5분 동안 트립신처리하고, 포스페이트-완충 염수에서 25 mg/mL 피브리노겐 및 1.1 mg/mL I형 콜라겐의 혼합물에 현탁하였다. 섬유모세포 (계대 6)의 하나의 층을 250,000 세포 cm-2에서 프린팅하고, 이어서 동일한 양의 20 IU/mL 트롬빈을 프린팅하였다. 트롬빈을 15분 동안 반응시킨 후, 각질세포 (계대 5)의 층을 500,000 세포 cm-2에서 프린팅한 다음 트롬빈을 프린팅하였다. 각각의 상처에 항생제 크림을 바르고, 마우스에 의해 제거되는 것을 막기 위하여 수술 테이프로 감싼 멸균 면 거즈로 덮었다. 상처 덮개를 1주에 바꾸고 수술 후 2주에 제거하였다. 하나의 마우스에 주어진 섬유모세포 및 각질세포를 형광 염료 PKH26 (적색) 및 PKH67 (녹색) (시그마-알드리치, 미국 CO 세인트 루이스)로 예비표지하고, 상처 부위의 회복을 위한 제1주에 하나의 비처리 마우스와 함께 이 마우스를 희생시켜, 표지된 세포가 구조물에 존재하는지를 결정하였다. 개념 증명을 위하여, 표지된 세포로의 실험을 위한 상처 크기는 1.5×2 cm (L×W)이었다. 다른 2마리 마우스의 경우, 상처의 크기 및 흉터 정도를 결정하기 위하여 각각의 3 × 2.5 cm 상처를 3주 동안 매주 평가하였다. 3주 후에 조직학적 평가를 위하여 흉터 조직을 절제하였다.
결과
피부 전달 시스템은 피부 세포를 누드 마우스 위에서 전체층 결함 상에 직접적으로 프린팅할 수 있다. 형광 예비표지 세포로 프린팅되고 1주일 후에 회복된 피부 구조물은, 상처 층 내의 표지된 세포의 존재를 나타내었다 (데이터는 나타내지 않음). 제2주에 상처의 거의 완전한 폐쇄가 일어나고 제3주에 완전한 상처 폐쇄가 일어난 바 (데이터는 나타내지 않음), 이 세포는 치유 과정에 참여하는 것으로 보였다. 제3주에 피부 구조물의 H & E 염색은, 각질세포가 표피 층으로, 그리고 섬유모세포가 진피로 조직화되는 것과 함께, 정상 피부와의 구조적 유사성을 나타내었다 (데이터는 나타내지 않음). 비처리 마우스는 동일한 시기에 상처 치유를 나타내었지만 프린팅된 마우스에서 보이는 것과 같이 완벽한 상처 폐쇄를 나타내지 않았다. 추가로, 비처리 상처의 중심부는 제3주에 염증 및 딱지를 나타내는 반면, 덮인 상처는 주위 피부로의 세포 통합을 나타낸다. 결과를 도 9에 나타낸다.
검토
본 발명의 피부 전달 시스템은 환자-특이적 상처 도포의 빠른 생성을 가능하게 함과 동시에, 특수 제조 설비 및 화상 보호 센터에서의 세포 배양 물질에 대한 요구를 제거한다. 또한, 화상 도포를 위한 동종 피부 세포의 사전 사용에 의해 증명되는 바와 같이, 본 전달 시스템은 이상적인 피부 대체물의 많은 기준을 충족한다. 본 전달 시스템을 사용하여 프린팅된 세포는 상처난 층으로 밀접하게 부착되고, 비-항원성 미생물 장벽을 제공하고, 정상적인 숙주 복구 메카니즘에 참여하고, 탄성 및 장기간 내구성을 유지하고, 부분층 자가 이식편에 필적하는 장기간의 기계적 및 미용 기능을 나타내고, 단일 작업을 필요로 하고, 저렴하고, 최소의 저장 요건을 갖는다. 이 시스템에 의해 충족되지 않는 유일한 이상적인 피부 대체물 특징은 무한한 저장의 요건이고, 이것은 어떠한 살아있는 피부 대체물에 의해서도 사실상 달성될 수 없다. 그러나, 본 카트리지 시스템은 동종 세포가 화상 센터로 포장 및 운반될 수 있도록 하고, 이는 이어서 환자가 안정되고 상처가 괴사조직 절제를 받자마자 상처의 치료를 가능하게 한다. 이와 대조적으로, 전형적인 자가 조직 이식편은 배양액에서 성장하기에 2 내지 5주가 필요하다.
본 발명자들은 섬유모세포 및 각질세포로 이루어진 2-층 피부 구조물을 누드 마우스 상의 전체층 피부 결함에 직접적으로 프린팅함으로써 개념 증명을 입증하였다. 이 프린팅은 특정 세포를 특정 표적 부위에 전달함으로써 수행되었다.
본 발명자들은 2가지 이유에서 피브리노겐 및 I형 콜라겐의 기재 내에 세포를 끼워넣었다. 먼저, 피브리노겐과 트롬빈의 반응으로부터 피브린의 형성은 강력한 겔을 제공하고, 이것은 세포가 마우스가 이동할 때조차도 마우스 상의 위치를 유지할 수 있도록 한다. 두 번째로, 피브린 및 I형 콜라겐이 피부 구조물을 형성하기 위하여 이미 사용되었다. 프린팅 후에, 예비표지된 섬유모세포 및 각질세포가 프린팅 후 제1주에 구조물에서 가시적이었고, 이것은 상처 부위에 세포가 유지됨을 나타낸다. 3주에 걸쳐 상처 부위의 평가는 비처리 마우스에 비하여 처리된 마우스에서 상처의 빠른 폐쇄를 나타내었다. 수술 후 제2주에 프린팅된 군에서 남아있는 개방 상처는, 가장 큰 신체 만곡부 부위에서 상처의 중심에서만 개방되었다. 이것은 프린팅된 세포 소적이 만곡부에서 굴러 떨어졌을 가능성에 기인할 수 있다. 이것을 보정하는 한가지 방법은, 피브린을 재빨리 형성하기 위하여 트롬빈 전달 시스템을 분무기로 대체하는 것일 수 있다.
프린팅된 구조물의 H&E 염색은 세포가 정상 피부와 유사한 구조로 조직화됨을 나타내었다. 표피는 프린팅된 구조물과 정상 조직 둘 모두에서 동일한 두께였다. 진피-표피 이음부에서 경계가 존재하고, 프린팅된 구조물에서의 진피는 정상 조직과 조성이 유사한 것으로 나타났다. 이것은 정상 피부 구조를 모방하는 조직을 프린팅하는 피부 전달 시스템의 능력을 나타낸다.
이 연구가 피부 프린팅에서 섬유모세포 및 각질세포의 사용만을 조사한 반면, 이 시스템의 설계는 추가의 세포 유형의 정확한 전달을 가능하게 한다. 이들은, 이에 한정되지 않지만, 여포 세포, 멜라닌세포 및 내피 세포를 포함한다. 이러한 추가의 세포 유형을 포함시킬 경우 정상 피부 구조를 더욱 모방할 수 있고, 현재의 치료 기법에 비하여, 특히 색소침착 및 혈관형성의 측면에서 기능적 및 미용상 개선을 제공한다. 또한, 피부 구조물의 기능을 개선하는 것을 돕는 인자를 포함하도록 프린트 카트리지를 설계할 수 있다. 이들에는, 무흉터 치유 시약, 성장 인자, 및 다른 시약의 수명을 유지하기 위한 프로테아제 억제제가 포함된다. 세포 유형 또는 시약이 카트리지에 포장될 수 있다면, 본 발명의 시스템은 상기 세포 또는 시약을 환자의 특정 위치에 빠르게 전달할 수 있다. 이러한 성질은, 환자 이식에 앞서서 이식편 구조물에서 배양 세포 및 시약의 필요성을 없애기 때문에, 이에 따라 본 발명의 시스템은 대부분의 현재 화상 치료에 비해 뛰어나게 된다.
상기 내용은 본 발명을 예증하지만, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 발명은 하기 청구의 범위에 의해 한정되며, 청구의 범위의 등가물은 본 발명에 포함된다.

Claims (43)

  1. (a) 신체 표면의 3차원 지도를 만들기 위해 유용한 데이터를 검출하도록 구성된 광학 검출기; 및
    (b) 상기 광학 검출기와 작동적으로 연관되고 상기 데이터 또는 상기 3차원 지도를 기초로 하여 상기 신체 표면에 세포 및 조성물 중 어느 하나 또는 모두를 전달하도록 구성된 프린터를 포함하는 전달 시스템이며,
    상기 광학 검출기는 상기 신체 표면의 실시간 3차원 지도를 검출하도록 구성되고, 상기 프린터는 상기 실시간 3차원 지도 또는 실시간 데이터에 기초하여 상기 신체 표면에 세포 및 조성물 중 어느 하나 또는 모두를 전달하도록 구성되며,
    상기 전달 시스템은 상기 프린터에 의해 세포 및 조성물 중 어느 하나 또는 모두가 전달되는 동안 실시간으로 데이터 또는 3차원 지도를 갱신하도록 구성되는, 전달 시스템.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 광학 검출기가 적외선 검출기를 포함하는 시스템.
  4. 제1항에 있어서,
    (c) 상기 검출기와 작동적으로 연결된 3차원 플로터(plotter); 및
    (d) 상기 프린터와 작동적으로 연결된 조절장치
    를 추가로 포함하는 시스템.
  5. 제1항에 있어서, 상기 검출기가 레이저 스캐너인 시스템.
  6. 제1항 및 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프린터가 다수의 카트리지를 포함하는 시스템.
  7. 제6항에 있어서, 하나 이상의 상기 카트리지가 조성물로 로딩(load)되고, 상기 조성물이 선택적으로는 세포를 포함하는 시스템.
  8. 제7항에 있어서, 상기 프린터가 조성물의 압력-기반 전달을 위해 구성된 노즐을 포함하는 것인 시스템.
  9. 제7항에 있어서, 상기 조성물이 세포를 포함하는 것인 시스템.
  10. 제9항에 있어서, 상기 세포가 연골 세포, 골 세포, 근육 세포, 혈관 세포 및 피부 세포로 이루어진 군에서 선택되는 시스템.
  11. 제9항에 있어서, 상기 세포가 양수 줄기 세포인 시스템.
  12. 제1항에 있어서, 프린터 지지체를 더 포함하는 시스템.
  13. 제12항에 있어서, 상기 프린터 지지체는, 상기 프린터 지지체가 Z 축, X 축 및 Y 축에 대해 이동가능하도록 구성되는 부재에 작동적으로 연결되는 시스템.
  14. 제12항에 있어서, 상기 프린터 지지체가 휴대성을 위한 바퀴를 포함하는 시스템.
  15. 제14항에 있어서, 상기 시스템이 테이블 또는 침대에 대해 제 위치에 전달 시스템을 고정하는 고정 메카니즘을 포함하는 시스템.
  16. 삭제
  17. (a) 신체 표면의 실시간 3차원 좌표를 얻기 위해 신체 표면을 스캐닝하는 수단; 및
    (b) 상기 좌표를 기초로 하여, 대상의 신체 표면 상에 생존 세포 및 조성물 중 어느 하나 또는 모두를 프린팅하여 상기 세포 및 조성물 중 어느 하나 또는 모두를 전달하는 프린팅 수단을 포함하고,
    상기 프린팅 수단은 세포 및 조성물 중 어느 하나 또는 모두가 전달되는 동안 실시간으로 좌표를 갱신하도록 구성되는,
    세포 및 조성물 중 어느 하나 또는 모두를 필요로 하는 대상의 신체 표면에 세포 및 조성물 중 어느 하나 또는 모두를 전달하는 장치.
  18. 제17항에 있어서, 상기 프린팅 수단은 상기 대상의 신체 표면 상에 하나 이상의 조직 층을 형성하는 장치.
  19. 제17항에 있어서, 상기 프린팅 수단은 상기 대상의 신체 표면 상에 조직을 형성하는 장치.
  20. 제19항에 있어서, 상기 프린팅 수단은 순서대로 2회 이상 수행되고, 상기 세포 및 조성물 중 어느 하나 또는 모두는 다수의 층을 가진 조직을 형성하기 위해 전달되는 장치.
  21. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 액체 또는 겔 담체에 제공되거나 그 위에 프린팅되는 장치.
  22. 제21항에 있어서, 상기 세포가 연골 세포, 골 세포, 근육 세포, 혈관 세포 및 피부 세포로 이루어진 군에서 선택되는 장치.
  23. 제21항에 있어서, 상기 세포가 양수 줄기 세포인 장치.
  24. 신체 표면의 모델을 형성하기 위해 3차원 광학 검출기로부터의 신체 표면 데이터를 해석하는 단계;
    신체 표면 데이터를 해석하는 단계에 의해 형성된 상기 모델을 신체 표면의 음각 몰드로 변형하는 단계로서, 상기 몰드가 다수의 Z-축 층으로 분할되는, 상기 변형 단계; 및
    각각의 상기 층을 신체 표면의 커버리지(coverage)를 나타내는 일련의 선과 겹쳐놓는 단계로서, 상기 선이 프린터를 위한 경로를 제공하는, 상기 겹쳐놓는 단계를 포함하며,
    신체 표면 데이터는 상처 표면 데이터인,
    3차원 광학 검출기에 작동적으로 연관된 프린터에 경로를 제공하기 위해 상기 광학 검출기로부터 수득된 신체 표면 데이터를 처리하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 Z-축 층이 하나 이상의 조직 층에 대응하는 방법.
  26. 제24항에 있어서, 3차원 광학 검출기로 스캐닝함으로써 신체 표면 데이터를 수득하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  27. 삭제
  28. 제25항에 있어서, 신체 표면 데이터가 피부 상처 표면 데이터이고, 조직 층이 진피 및 표피 조직 층 중 어느 하나 또는 모두를 포함하는 것인 방법.
  29. 제24항 내지 제26항 및 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 신체 표면 데이터가 층을 포함한 객체로서 표시되고, 각각의 층이 일련의 선을 포함하는 격자로 표시되는 것인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 프린터에 의하여 프린팅되는 상이한 세포 및 조성물 중 어느 하나 또는 모두의 위치를 포함시키는 방식으로 객체를 분석하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  31. 신체 표면의 모델을 형성하기 위해 3차원 광학 검출기로부터의 신체 표면 데이터를 해석하기 위한 수단;
    신체 표면 데이터를 해석하는 수단에 의해 형성된 상기 모델을 신체 표면의 음각 몰드로 변형하기 위한 수단으로서, 상기 몰드가 다수의 Z-축 층으로 분할되는, 상기 변형하기 위한 수단; 및
    상기 층의 각각을 신체 표면의 커버리지(coverage)를 나타내는 일련의 선과 겹쳐놓기 위한 수단으로서, 상기 선이 프린터를 위한 경로를 제공하는, 상기 겹쳐놓기 위한 수단을 포함하며,
    신체 표면 데이터는 상처 표면 데이터이고,
    상기 데이터는 세포 및 조성물 중 어느 하나 또는 모두가 전달되는 동안 실시간으로 갱신되는, 3차원 광학 검출기에 작동적으로 연관된 프린터에 경로를 제공하기 위하여 상기 광학 검출기로부터 수득된 신체 표면의 데이터를 처리하기 위한 시스템.
  32. 제31항에 있어서, 상기 Z-축 층이 하나 이상이 조직 층에 대응하는 시스템.
  33. 제31항에 있어서, 신체 표면 데이터를 수득하기 위한 수단을 추가로 포함하는 시스템.
  34. 삭제
  35. 제31항에 있어서, 신체 표면 데이터가 피부 상처 표면 데이터이고, 층이 진피 및 표피 조직 층 중 어느 하나 또는 모두를 포함하는 것인 시스템.
  36. 제31항 내지 제33항 및 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 신체 표면 데이터가 층을 포함한 객체로서 표시되고; 각각의 층이 일련의 선을 포함하는 격자로 표시되는 시스템.
  37. 제36항에 있어서, 프린터에 의해 프린팅되는 상이한 세포 및 조성물 중 어느 하나 또는 모두의 위치를 포함시키는 방식으로 객체를 분석하기 위한 수단을 추가로 포함하는 시스템.
  38. 컴퓨터 판독가능한 프로그램 코드를 구비한 컴퓨터 판독가능한 매체이며,
    신체 표면의 모델을 형성하기 위해 광학 검출기로부터의 신체 표면 데이터를 해석하는 컴퓨터 판독가능한 프로그램 코드;
    신체 표면 데이터를 해석하는 컴퓨터 판독가능한 프로그램 코드에 의해 형성된 상기 모델을 신체 표면의 음각 몰드로 변형하는 컴퓨터 판독가능한 프로그램코드로서, 상기 몰드가 다수의 Z-축 층으로 분할되는, 상기 변형하는 컴퓨터 판독가능한 프로그램 코드; 및
    상기 층 각각을 신체 표면의 커버리지(coverage)를 나타내는 일련의 선과 겹쳐놓는 컴퓨터 판독가능한 프로그램 코드로서, 상기 선이 프린터를 위한 경로를 제공하여 상기 데이터를 기초로 세포 및 조성물 중 어느 하나 또는 모두를 상기 신체 표면으로 전달하는, 상기 겹쳐놓는 컴퓨터 판독가능한 프로그램 코드를 포함하며,
    신체 표면 데이터는 상처 표면 데이터이고,
    상기 데이터는 상기 프린터에 의해 세포 및 조성물 중 어느 하나 또는 모두가 전달되는 동안 실시간으로 갱신되는, 컴퓨터 판독가능한 매체.
  39. 제38항에 있어서, 상기 Z-축 층이 하나 이상의 조직 층에 대응하는 컴퓨터 판독가능한 매체.
  40. 삭제
  41. 제39항에 있어서, 상기 신체 표면이 피부 상처 표면 데이터이고, 조직 층이 진피 및 표피 조직 층 중 어느 하나 또는 모두를 포함하는 것인 컴퓨터 판독가능한 매체.
  42. 제38항, 제39항 및 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 신체 표면 데이터가 층을 포함한 객체로서 표시되고, 층의 각각이 일련의 선을 포함하는 격자로 표시되는, 컴퓨터 판독가능한 매체.
  43. 제42항에 있어서, 프린터에 의해 프린팅되는 상이한 조성물의 위치를 포함시키는 방식으로 객체를 분석하는 컴퓨터 판독가능한 프로그램 코드를 추가로 포함하는, 컴퓨터 판독가능한 매체.
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