JP5479661B2 - 幹細胞の分化を誘導する方法 - Google Patents

Description

本発明は、幹細胞の分化を誘導する方法に関する。特に、本発明は、胚性幹細胞の筋細胞または血管内皮細胞への分化を誘導する方法に関する。本発明は、また、本発明の方法で用いられる細胞、細胞株、試験モデルおよび培養システム、およびそこから生成された分化した細胞にも関する。本発明は、また、治療の目的で、本発明の分化細胞を用いる方法も提供する。

幹細胞は、一連の成熟機能細胞を発生させることができる未分化細胞である。胚幹（ＥＳ）細胞は、胚に由来し、多能性である、すなわち、任意の器官、細胞型または組織型に発生する能力を有する。幹細胞における分化のプロセスは、未成熟細胞の、運命決定され、充分に成熟した種々の系列の細胞への選択的発生を含む。そのような系列の派生物は、筋細胞、神経細胞、骨格細胞、血液（造血）細胞、内皮細胞および外皮細胞を含む。幹細胞の分化は、種々の成長因子および調節分子により誘発されることが知られている。

分化している間、幹細胞特異的遺伝子およびマーカーの発現が失われ、細胞は、体細胞またはそれらの前駆体の遺伝子発現プロフィールを獲得する。場合によっては、分化と自己再生との相関を制御する「マスター」遺伝子が記載される。

一部の系列特異的幹細胞の分化をある程度の確実性で誘導することができるが、多能性幹細胞の集合の分化の結果はあまり予想できない。特異的細胞型を誘導する条件下に細胞を置くことが、分化の結果を調節する試みの一つであった。これらの条件は、細胞を高密度または低密度に増殖させる、培地を変える、サイトカイン、ホルモンおよび成長因子を導入または除去する、および、適当な基質を提供することのような特定の細胞型への分化に適した環境を作ることを含む。

通常、幹細胞培地の分化を誘導する場合、分化した集合を、遺伝子の発現、マーカーまたは表現型により特別の細胞型について分析する。いずれの場合にも、それぞれの細胞型を選択的に培養して、それらの集合の割合を高め、その結果、単一の細胞型および培養物を得ることができる。

特定の分化した細胞型の誘導は、移植またはインビトロでの薬剤スクリーニングおよび薬剤発見に有用となり得る。幹細胞およびそれから生成された筋細胞中で分化を誘導する方法を用いて、組織発生の細胞的および分子的生物学を研究し、組織発生および再生において役割を果たす分化因子のような遺伝子およびタンパク質を発見することができる。

特に、幹細胞の筋細胞への分化の誘導は、筋肉の移植および治療の目的に有用であり、培養中での潜在的ヒト疾患モデルを提供する（例えば、薬剤試験）のに有用である。幹細胞において心筋細胞分化を誘導することは、心臓疾患および異常心臓症状のための治療法および治療製品を開発するのに特に有用である。しかしながら、発生中に胚性幹細胞から筋細胞のような特定の細胞型を特定化し最終的に分化させる分子経路は、完全には明らかでない。

従って、筋細胞または内皮細胞のような特定の細胞型への幹細胞の分化を誘導する効果的方法を提供する必要性が依然としてある。

本発明の一つの態様において、幹細胞の分化を誘導する方法であって、幹細胞の分化を誘導する条件下、胚細胞および／または胚細胞の細胞外培地の存在下に、幹細胞を培養することを含む方法が提供される。

好ましくは、幹細胞は、胚性ヒト幹細胞である。より好ましくは、幹細胞が、筋細胞、血管内皮細胞または造血細胞に分化するよう誘導される。前述したような本発明の方法において、胚細胞は、好ましくは、胚性内胚葉または外胚葉に由来する。より好ましくは、胚細胞は、胚体外組織に由来する。

本発明の方法において、幹細胞は、好ましくは、胚性内胚葉細胞および／または胚性内胚葉細胞の細胞外調整培地の存在下に増殖させて、幹細胞の、心筋細胞または造血細胞への分化を誘導する。より好ましくは、幹細胞は、胚細胞の存在下に共培養される。本発明の方法において、幹細胞は、好ましくは、胚細胞の集密性単層上に培養され、培地中で増殖され、幹細胞の分化を誘導する。

また、幹細胞が、胚性外胚葉細胞および／または胚性外胚葉細胞の細胞外培地の存在下に増殖され、幹細胞の骨格筋細胞への分化を誘導する。

さらにもう一つの好ましい実施形態において、幹細胞が、胚性外胚葉および／または内胚葉細胞、および／または、胚性外胚葉および／または内胚葉細胞の細胞外培地の存在下に増殖され、幹細胞の血管内皮細胞への分化を誘導する。

本発明の好ましい態様において、幹細胞の筋細胞分化を誘導する方法であって、幹細胞の筋細胞への分化を誘導する条件下、胚細胞および／または胚細胞の細胞外培地の存在下に幹細胞を培養することを含む方法が提供される。

好ましくは、幹細胞が、胚性内胚葉細胞および／または胚性内胚葉細胞の細胞外培地の存在下に増殖され、幹細胞の心筋細胞への分化を誘導する。より好ましくは、胚細胞は胚体外由来である。胚細胞は、好ましくは、内臓内胚葉に由来し、内臓内胚葉様特性を有する細胞であるまたは内臓内胚葉の特性を有する胚細胞株に由来する。より好ましくは、幹細胞は、胚細胞の存在下に共培養される。

また、幹細胞が、胚性外胚葉細胞および／または胚性外胚葉細胞の細胞外培地の存在下に増殖され、幹細胞の骨格筋細胞への分化を誘導する。より好ましくは、胚細胞は、胚体外組織に由来する。

本発明のもう一つの態様は、本発明の方法で用いるための胚細胞である。好ましくは、胚細胞は、胚性または胚体外の内胚葉または外胚葉に由来する。好ましくは、胚細胞は、内臓内胚葉に由来するかまたは、内臓内胚葉様特性を有する細胞である。より好ましくは、胚細胞は、ＥＮＤ−２細胞株（Ｍｕｍｍｅｒｙら著、１９８５年、Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ．第１０９巻：４０２〜４１０頁）のような内臓内胚葉の特性を有する細胞株に由来する。

本発明のさらに好ましい態様において、幹細胞の分化を誘導する方法であって、幹細胞の分化する条件下、胚細胞または胚細胞の細胞外培地に由来する因子の存在下に幹細胞を培養することを含む方法が提供される。

本発明は、さらに、幹細胞の分化を誘導する方法において用いるための、本発明により細胞外培地から単離されたまたは胚細胞から分泌された、単離された因子を提供する。

本発明のさらにもう一つの態様において、前述のように本方法により生成された分化された細胞が提供される。好ましくは、分化細胞は、心筋細胞、骨格筋細胞、血管内皮細胞または造血細胞である。本発明は、また、移植、細胞治療または遺伝子治療に用いることができる、本発明の方法により生成された、分化された細胞も提供する。好ましくは、本発明は、心臓疾患または症状を患っている被験者において心臓機能を回復する方法におけるように、治療目的で用いることができる、本発明の方法により生成された、分化された細胞を提供する。

本発明のもう一つの態様は、心臓疾患または症状を治療または予防する方法であって、前記方法は、単離された心筋細胞および／または心筋細胞に分化することができる細胞を、被験者の心臓組織中に導入することを含む方法である。

好ましくは、前述のような方法により幹細胞を分化させることにより心筋細胞が生成される。被験者は、心臓疾患または症状を患っていることが好ましい。本発明の方法において、単離された心筋細胞が、好ましくは、被験者の損傷した心筋組織中に移植される。より好ましくは、この方法により、被験者において心臓機能が回復される。

本発明のさらにもう一つの好ましい態様において、心臓組織を修復する方法であって、前記方法は、単離された心筋細胞および／または心筋細胞に分化することができる細胞を、被験者の損傷した心筋細胞中に導入することを含む方法が提供される。

好ましくは、心筋細胞は、前述の方法により幹細胞を分化することにより生成される。被験者が心臓疾患または症状を患っていることが好ましい。本発明の方法において、単離された心筋細胞は、好ましくは、被験者の損傷した心臓組織中に移植される。より好ましくは、この方法により、被験者の心臓機能が回復される。

本発明は、また、血管内皮細胞にまたは骨格筋細胞またはこれらの細胞の祖先に分化細胞を移植することにより、血管疾患および筋肉疾患を治療する方法も提供する。

本発明は、好ましくは、心筋細胞に分化した幹細胞が心臓機能を回復する性能を試験するための心筋モデルも提供する。

本発明は、さらに、本発明の方法により生成された分化細胞、およびキャリアを含む細胞組成物を提供する。

本発明の一つの態様において、幹細胞の分化を誘導する方法であって、前記方法は、幹細胞の分化を誘導する条件下、胚細胞および／または胚細胞の細胞外培地の存在下に幹細胞を培養することを含む方法が提供される。

幹細胞は、通常、その未分化状態を維持するために、線維芽細胞供給層と共培養することが必要である。この状態を適切に維持しない供給層は、未分化特性により表現型を不明瞭にする幹細胞を提供する。出願人は、胚細胞と共に幹細胞を培養すると、培地中の分化細胞の分化方向の決定因子が提供され得ることを見つけた。この制御は、線維芽細胞を用いて見られることは無かった。

本明細書で用いられる「幹細胞の分化を誘導する」という用語は、幹細胞への直接的または意図的な影響の結果として、幹細胞を特定の分化細胞型に発生させることと理解される。幹細胞における分化を誘導し得る影響因子は、細胞性パラメーター、例えばイオン流入、ｐＨ変化および／または細胞外因子、例えば、分泌されたタンパク質、例えば限定はされないが分化を調節および引き起こすサイトカインおよび成長因子を含み得る。これは、細胞を集密性まで培養することを含み、細胞密度により影響され得る。

本発明の方法において、幹細胞は、培養前は未分化であるが、分化することができる任意の細胞である。幹細胞は、限定はされないが、胚性幹細胞、多能性幹細胞、造血幹細胞、全能幹細胞、間葉幹細胞、神経幹細胞および成人幹細胞を含む群より選択することができる。

幹細胞は、好ましくは、胚に由来するまたは、胚性幹細胞の培養から直接に由来するヒト胚性幹細胞である。例えば、幹細胞は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）細胞（Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆら著、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．第１６巻：３９９〜４０４頁、２０００年）のような細胞培養から得ることができる。幹細胞は他の動物に由来することができるが、これらは、最も好ましくはヒト胚性幹細胞である。幹細胞は、胚細胞株または胚組織に由来することができる。胚性幹細胞は、培養され未分化状態に維持されている細胞であり得る。そのような細胞が、ＰＣＴ／ＡＵ９９／００９９０、ＰＣＴ／ＡＵ００／０１５１０、ＰＣＴ／ＡＵ０１／００７３５およびＰＣＴ／ＡＵ０１／００２７８に開示されており、その内容を参照することにより本明細書に取り込む。

本方法で用いるのに適した幹細胞は、患者自身の組織に由来することができる。これは、幹細胞に由来する分化組織グラフトと、患者との適合性を高めるであろう。幹細胞は、胚細胞または胚細胞からの細胞外培地にさらす前、さらしている間またはその後に、分化の状態を制御し得る遺伝子の導入により、使用前に遺伝子的に改変することができる。これらは、Ｏｃｔ−４のような幹細胞特異的プロモーターの制御下に選択可能なマーカーを発現するベクターを導入することにより遺伝子的に改変することができる。幹細胞は、マーカーが任意の培養段階において保持されるように、任意の段階でマーカーを用いて遺伝子的に改変することができる。マーカーは、任意の培養段階において分化または未分化幹細胞集合を精製するために用いることができる。

幹細胞を、筋細胞、血管内皮細胞のような内皮細胞、上皮細胞、血液細胞（造血細胞）または神経細胞を含む群から選択される細胞型に分化するように誘導することができる。好ましくは、幹細胞を、筋細胞または血管内皮細胞に分化するように誘導する。より好ましくは、幹細胞を、心筋細胞または骨格筋細胞に分化するように誘導する。

本発明の好ましい実施形態において、幹細胞の分化を誘導する方法であって、幹細胞の分化を誘導する条件下、胚細胞の存在下に幹細胞を培養することを含む方法が提供される。

本方法で用いられる胚細胞は、胚に由来する胚細胞または胚体外組織に由来する細胞を含む。「胚」という用語は、哺乳動物における受胎後２週間までの任意の受精後段階と定義される。これは、細胞の繰り返し***から起こり、外部栄養外胚葉および内部細胞塊（ＩＣＭ）を含む胚盤胞段階の段階を含む。胚はインビトロで受精胚であってもよく、または胚は、好ましくはヒトまたは非ヒト起源の摘出された卵母細胞中に体細胞または細胞核を移して得られる胚であってもよい。胚体外組織は、胎盤を作る胚により生成される細胞を含む。

本発明の好ましい実施形態において、胚細胞は、胚性、好ましくは胚体外性の内胚葉または外胚葉に由来する。より好ましくは、胚細胞は、胚から単離された内臓内胚葉様組織または内臓内胚葉組織に由来する。好ましくは、内臓内胚葉は、マウス胚（Ｅ７．５）のような初期の原腸形成後胚から単離することができる。内臓内胚葉または内臓内胚葉様組織は、Ｒｏｅｌｅｎら著、１９９４年、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．第１６６巻：７１６〜７２８頁に記載のように単離することができる。特徴的なことに、内臓内胚葉は、αフェトプロテインおよびサイトケラチンＥＮＤＯ−Ａの発現により確認することができる。胚細胞は、胎児性癌細胞、好ましくは内臓内胚葉特性を有する細胞であってよい。

胚細胞は、培養中の細胞株または細胞に由来することができる。胚細胞は、胚細胞株、好ましくは、ＥＮＤ−２細胞株（Ｍｕｍｍｅｒｙら著、１９８５年、Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ．第１０９巻：４０２〜４１０頁）のような内臓内胚葉の特性を有する細胞株に由来することができる。ＥＮＤ−２細胞株は、懸濁液中においてレチン酸で凝集体（胚様体）として処理されたＰ１９ＥＣ細胞の培養からクローニングすることにより得られ、次に、再び平板培養した（Ｍｕｍｍｅｒｙら著、１９８５年、Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ．第１０９巻：４０２〜４１０頁）。ＥＮＤ−２細胞株は、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）および細胞骨格タンパク質ＥＮＤＯ−Ａを発現している内臓内胚葉（ＶＥ）の特徴を有する。従って、胚細胞がＥＮＤ−２細胞株に由来することが最も好ましい。これらの細胞は、ヒト幹細胞の心筋細胞への分化を誘導するのに特に有用であると分かった。

胚細胞は、Ｒｏｅｌｅｎら著、１９９４年、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．第１６６巻：７１６〜７２８頁に記載の方法に従って単離することができる外胚葉細胞であってよい。外胚葉細胞は、ｏｃｔ−４を発現することが知られており、アルカリホスファターゼ活性を有し、それらの細胞表面上にＳＳＥＡ−１も有する。従って、外胚葉細胞は、前記特性に基づいて同定し単離することができる。外胚葉細胞は、骨格筋または内臓内皮細胞への分化を誘導する（成長）因子を分泌することができる。外胚葉細胞が、Ｅ７．５胚性マウス組織に由来することが好ましい。

従って、本発明のもう一つの態様において、本発明の方法で用いるために胚細胞が提供される。好ましくは、胚細胞は、前述のように胚性内胚葉または外胚葉に由来する。

本発明および先に記載の方法において、幹細胞および胚細胞が培養されて、特定の細胞型への分化が誘導される。好ましくは、幹細胞および胚細胞が、インビトロで共培養される。これは、典型的には、培養中において胚細胞を増幅することにより生成される胚細胞単層に幹細胞を導入することを含む。好ましくは、胚細胞単層は増殖して実質的集密性になり、幹細胞は、胚細胞の細胞外培地の存在下に、幹細胞から特定の細胞型への分化を誘導するのに充分な時間培養される。また、胚細胞の細胞外培地を含むが胚細胞は存在しない培地において幹細胞を増殖させることができる。胚細胞と幹細胞とは、フィルターまたは、寒天のような非細胞質マトリクスにより互いに分離することができる。

本発明の方法において、幹細胞が、好ましくは、胚細胞の単層上に培養され、幹細胞の分化を誘導するように培地中で増殖される。より好ましくは、単層は集密性であり、有糸***誘導不活性である。

分化胚細胞を得るための条件は、幹細胞の再生には許容できない条件であるが、幹細胞を殺さないまたは、幹細胞を排他的に胚体外系列に分化させる。幹細胞成長用の最適条件を徐々に外すことは、幹細胞から特定細胞型への分化に好ましい。好適な培養条件は、分化速度および／または効率を増加させ得る共培地中にＤＭＳＯ、レチン酸、ＦＧＦまたはＢＭＰを添加することを含む。

胚細胞層の細胞密度は、その安定性および性能に影響を与える。胚細胞は、好ましくは、集密性となるべきである。より好ましくは、胚細胞が成長して集密性となり、次に、マイトマイシンＣのような細胞のさらなる細胞***を防止する試薬に曝される。胚単層は、幹細胞の添加の２日前に達成されるのが好ましい。幹細胞は、好ましくは、解離され、次に、胚細胞の単層に導入される。より好ましくは、幹細胞および胚細胞が、幹細胞の実質的部分が分化するまで、２〜３週間共培養される。好ましくは、幹細胞は、心筋細胞および骨格筋細胞、血管内胚葉細胞または造血細胞を含む筋細胞（筋肉細胞）に分化するように誘導される。胚細胞が胚体外組織に由来することが好ましく、より好ましくは、胚性内胚葉または外胚葉に由来する。

本発明のもう一つの好ましい実施形態において、幹細胞の分化を誘導する方法であって、前記方法は、幹細胞の分化を誘導する条件下、胚細胞の細胞外培地の存在下に幹細胞を培養することを含む方法が提供される。

本明細書で用いられる「胚細胞の細胞外培地」という用語は、本明細書に記載のような胚細胞を、所定の時間、培地中において増殖させることにより生成される調整（コンディション）培地であって、それにより、胚細胞により生成された分泌タンパク質のような細胞外因子が調整培地中に存在するような調整培地を意味すると解される。この培地は、細胞の成長を促進する成分、例えば、ダルベッコ最少必須培地、ハムＦ１２または胎児ウシ血清のような基本培地を含むことができる。

本発明のさらに好ましい態様において、幹細胞の分化を誘導する方法であって、前記方法は、幹細胞の分化を誘導する条件下、胚細胞または胚細胞の細胞外培地に由来する因子の存在下に幹細胞を培養することを含む方法が提供される。

細胞外培地は、好ましくは、細胞因子、例えば、幹細胞の分化を誘導することができる分泌タンパク質を含む。そのような分泌タンパク質は、典型的には、細胞表面上に受容体を結合させて、細胞の分化を始めることができる細胞内経路を促す。適当な細胞外因子の例は、Ｄｙｅｒら著、２００１年、Ｄｅｖ．第１２８巻：１７１７〜１７３０頁に記載のようなｌｈｈおよびＢＭＰ２を含む。

本発明のもう一つの態様において、幹細胞の分化を誘導する方法において用いるための、本発明により細胞外培地から単離されたまたは胚細胞から分泌された単離された因子が提供される。適当な単離された因子は、幹細胞の分化を誘導するその性能により選択することができる。例えば、幹細胞の分化を誘導することができる特定因子およびタンパク質フラクションを確認するために培養細胞アッセイ系を用いることができる。この因子は、胚細胞の細胞外培地中に存在する分泌されたタンパク質を含み得る。適当なタンパク質は、当業者に知られている従来法により抽出および精製することができる。

本発明のもう一つの好ましい態様において、幹細胞の筋細胞分化を誘導する方法であって、幹細胞の筋細胞への分化を誘導する条件下、胚細胞および／または胚細胞の細胞外培地の存在下に幹細胞を培養することを含む方法が提供される。

好ましい実施形態において、幹細胞の心筋細胞への分化が誘導される。出願人は、幹細胞を胚性、好ましくは胚体外性内胚葉細胞と一緒に培養すると、特定の細胞型への、特に筋細胞への分化が選択的に誘導されることを発見した。幹細胞と胚性内胚葉細胞とのこの組み合わせが、心筋細胞への分化を誘導することが最も好ましい。幹細胞がヒト由来、好ましくはヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）であることが好ましい。より好ましくは、幹細胞は、胚細胞と共培養される。これは、典型的には、解離した幹細胞を、適当な胚細胞の単層を有する培養培地に導入することにより達成される。より好ましくは、単層は、集密性胚細胞からなる。

本発明のさらに好ましい実施形態において、胚細胞は、内臓内胚葉に由来する内胚葉細胞であるまたは、内臓内胚葉特性を有する胚細胞である。より好ましくは、内臓内胚葉細胞は、Ｅ７．５マウス胚に由来する。胚細胞は、胎児性癌細胞、好ましくは、内臓内胚葉特性を有する細胞であってよい。より好ましくは、胚細胞は、培養中の細胞株または細胞に由来する。胚細胞は、胚細胞株、好ましくは、ＥＮＤ−２細胞株（Ｍｕｍｍｅｒｙら著、１９８５年、Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ．第１０９巻：４０２〜４１０頁）のような内臓内胚葉の特性を有する細胞株に由来することができる。より好ましくは、胚細胞は胚体外組織に由来し、より好ましくは、内臓内胚葉に由来する。内胚葉細胞は、典型的には、脊椎動物の心臓形成部位に隣接する。内胚葉分化が欠損または存在していない個体において、心臓は異常に発生する。

幹細胞の心筋細胞への分化を誘導するために、培地中の胚体外内胚葉細胞単層に幹細胞を導入することが好ましい。単層は、胚性内胚葉、より好ましくは胚体外性内胚葉に由来する胚細胞の増殖により生成される。胚性内胚葉は、好ましくは、胚体外内臓内胚葉である。より好ましくは、細胞単層は、ＥＮＤ−２細胞により生成される。胚細胞を培養し継代させてから、成長させて単層を形成することが好ましい。単層は、好ましくは、ＤＭＥＭまたはＭ１６培地のような適当な培地中で集密性まで成長する。次に、単層を特定の試薬で処理して、細胞のさらなる細胞***を防止することができる。例えば、単層をマイトマイシンで処理することができ、次に、幹細胞を、有糸***誘導不活性の単層上に培養ことができる。

幹細胞を、内胚葉細胞の細胞外培地の存在下に、幹細胞の心筋細胞への、最も好ましくは収縮細胞への分化を、誘導するのに充分な時間、増殖させる。最も好ましくは、共培養は約２〜３週間行われ、培地は、好ましくは、５〜６日毎のように定期的に新しい培地と取り替えられる。

また、幹細胞を、内胚葉細胞の細胞外培地を含むが内胚葉細胞が存在しない培養中で成長させることができる。従って、幹細胞を、胚性内胚葉細胞の細胞外培地の存在下に成長させて、幹細胞の、心筋細胞のような筋細胞への分化を誘導させることができる。

本発明の方法において、生成される心筋細胞は好ましくは収縮細胞である。心筋細胞は、幹細胞に由来する分化した細胞型である。心筋細胞を含む筋細胞を固定して、αアクチニン抗体で染色して、筋肉表現型を確認することができる。α−トロポニン、α−トロポマイシンおよびα−ＭＨＣ抗体も、特徴的な筋肉染色を与える。好ましくは、心筋細胞は、当業者に知られている方法に従って固定される。より好ましくは、心筋細胞は、パラホルムアルデヒドで、好ましくは約２％〜約４％のパラホルムアルデヒドで固定される。筋細胞のイオンチャンネル特性および活動電位は、パッチクランプ、電気生理学およびＲＴ−ＰＣＲにより決めることができる。

心筋細胞の由来となる幹細胞は、例えばイオンチャンネルにおける突然変異（これは、ヒトの突然死を引き起こす）を有するように遺伝子的に改変することができる。すなわち、これらの修飾幹細胞に由来する心筋細胞は、異常であり、欠損イオンチャンネルに関わる心臓疾患用の培養モデルを提供する。これは、基礎研究および試験医薬に有用である。同様に、他の遺伝子に基づく心臓疾患のための培地におけるモデルを作ることができる。本方法において生成された心筋細胞も、移植および心臓機能の回復に用いることができる。

例えば、虚血性心臓疾患は、西洋世界における罹患率および死亡率の主要な原因である。酸素剥奪およびその後の酸素再灌流により引き起こされる心臓虚血は、不可逆的細胞損傷を引き起こし、結局、広範囲の細胞死および機能損失につながる。心筋細胞移植により損傷心臓組織を再生する方法は、梗塞後心不全を予防または制限する。幹細胞の心筋細胞への分化を誘導する方法は、前述したように、そのような心臓疾患の治療に有用である。本方法により生成された心筋細胞は、心臓機能の回復の性能を試験するための心筋梗塞モデルにおいても有用でありえる。

本発明は、好ましくは、心筋細胞に分化した幹細胞が心臓機能を回復する性能を試験するための心筋モデルを提供する。インビボでの心筋細胞移植の有効性を試験するために、心臓機能の測定可能のパラメーターを有する再生可能な動物モデルを有することが重要である。用いられるパラメーターは、対照動物と実験動物とを明らかに識別して（例えば、Ｐａｌｍｅｎら著、（２００１年）、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．第５０巻、５１６〜５２４頁）、移植の効果を適切に決めることができるべきである。ＰＶ関係は、心臓のポンプ性能の尺度であり、移植後の変化した心臓機能を読み出すために用いることができる。

限定はされないが免疫不全マウスのような宿主動物を、種々の供給源からの心筋細胞の「普遍的アクセプター(universal acceptor)」として用いることができる。好ましくは、心筋細胞は本発明の方法により生成される。

本発明の心筋モデルは、好ましくは、適当な宿主動物に心筋細胞またはその適当な祖先細胞を移植した後の心臓修復の程度を評価するように設計される。より好ましくは、宿主動物は、分化した心筋細胞の普遍的アクセプターとして用いられる、梗塞後の心筋変性のモデルとして作られる免疫不全動物である。この動物は、ネズミ、ヒツジ、ウシ、イヌ、ブタおよび非ヒト霊長類を含む任意の種であり得るが、これらに限定されない。これらの動物における心臓修復を測定するために用いられるパラメーターには、心臓組織または種々の心臓機能の電気生理学的特性があるが、これらに限定されない。例えば、収縮機能を、心臓における体積および圧力変化として評価することができる。好ましくは、心室収縮機能が査定される。心臓機能および心臓組織特性を査定する方法は、当業者にも知られている技術を含む。

本発明のもう一つの態様において、患者における心臓疾患または症状を治療または予防する方法であって、心筋細胞および／または心筋細胞祖先細胞あるいは心筋細胞に分化することができる細胞を、患者の心筋組織に導入することを含む方法を提供する。

本明細書で用いられる「治療または予防」という用語は、治療または予防すべき症状の兆候を緩和または低減することを意味する。

好ましくは、心筋細胞は、前述のような方法に従って幹細胞を分化することにより生成される。被験者が心臓疾患または症状を患っていることが好ましい。本発明の方法において、単離された心筋細胞は、好ましくは、被験者の損傷した心臓組織中に移植される。より好ましくは、この方法により、被験者の心臓機能が回復される。

「心筋細胞に分化することができる細胞」または心筋細胞祖先細胞は、内臓内胚葉および／または内臓内胚葉の細胞外培地と共培養されたが、心筋細胞に完全には分化していない幹細胞を含み得る。

適当な心臓疾患は、限定はされないが心筋梗塞または心臓肥大を含み得る。

本発明のさらにもう一つの態様において、損傷した心臓組織を修復する方法であって、心筋細胞および／または心筋細胞祖先細胞あるいは心筋細胞に分化することができる細胞を、被験者の損傷した心臓組織に導入することを含む方法を提供する。

好ましくは、前述のような方法に従って幹細胞を分化することにより心筋細胞を生成する。被験者が心臓疾患または症状を患っていることが好ましい。本発明の方法において、単離された心筋細胞は、好ましくは、被験者の損傷した心臓組織中に移植される。より好ましくは、この方法により、被験者の心臓機能が回復される。

損傷された骨格筋組織は、筋ジストロフィーから生じる。

さらにもう一つの好ましい態様において、幹細胞の骨格筋細胞への分化を誘導する方法であって、前記方法は、幹細胞の骨格筋細胞への分化を誘導する条件下、胚性外胚葉組織および／または胚性外胚葉組織の細胞外培地の存在下に幹細胞を培養することを含む方法が提供される。

外胚葉細胞は、Ｒｏｅｌｅｎら著、１９９４年、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．第１６６巻：７１６〜７２８頁に記載の方法に従って単離することができる。外胚葉細胞はｏｃｔ−４を発現しアルカリホスファターゼ活性を有することが知られており、これらは、その細胞表面上にＳＳＥＡ−１も有する。従って、外胚葉細胞は、前記特性に基づいて同定および単離することができる。外胚葉細胞は、骨格筋への分化を誘導する分泌（成長）因子を分泌することができる。外胚葉細胞は、Ｅ７．５胚性マウス組織に由来することが好ましい。より好ましくは、外胚葉細胞は、先に記載したものと類似の方法を用いて幹細胞と共培養される。外胚葉単層は、好ましくは、培養中で形成され、好ましくは、解離した幹細胞が、幹細胞の骨格筋細胞への分化を誘導するのに充分な時間、培養に導入される。

骨格筋細胞は、典型的には、「攣縮」すると共にＭＦ２０を発現する長い多核細胞である。骨格筋細胞をαアクチニンで染色すると、これらは、通常、縞状染色パターンを作る。本発明の方法により生成された骨格筋細胞は、筋肉疾患の治療における移植のために用いることができる。

本発明のもう一つの態様において、患者における筋肉疾患を治療または予防する方法であって、前記方法は、胚性外胚葉細胞および／または胚性外胚葉細胞の細胞外培地の存在下に共培養された骨格筋細胞および／または骨格筋細胞祖先を患者の筋肉に導入することを含む方法が提供される。

好ましくは、骨格筋細胞は、前述の条件下に共培養した幹細胞から分化されたものである。

筋肉疾患は、筋ジストロフィーに起因し得る。しかしながら、この治療法は、筋細胞の再生および回復を必要とするいかなる症状にも適用することができる。

さらにもう一つの好ましい態様において、幹細胞の血管内皮細胞への分化を誘導する方法であって、前記方法は、胚性外胚葉および／または内胚葉細胞、および／または、胚性外胚葉および／または内胚葉細胞の細胞外培地の存在下に幹細胞を培養して、幹細胞から血管内皮細胞への分化を誘導させることを含む方法が提供される。

より好ましくは、胚細胞は、胚体外外胚葉および／または内胚葉組織に由来する。好ましくは、胚細胞は、胚性Ｅ７．５マウスに由来する。胚性外胚葉または内胚葉細胞を、前述のようにして得ることができる。卵黄嚢の中の内臓胚体外内胚葉に隣接して、胚内第１血管ネットワークが形成され、これが、内皮細胞様ＴＧＦβおよびＶＥＧＦに影響を与える因子を生成する。従って、より好ましくは、前述の方法で用いられる胚細胞は、内臓胚体外内胚葉に由来するまたは、内臓細胞様特性を有する細胞である。胚性内胚葉および／または外胚葉細胞は、好ましくは、前述の方法を用いて、幹細胞と共培養される。しかしながら、ＶＥＧＦを培養培地に添加して、培地中での血管内皮細胞成長を促進することができる。

本発明の方法により生成される血管内皮細胞は、血液を含んでいることがある血管ネットワークを形成することができることにより確認することができる。血管内皮細胞は、典型的に、ＰＥ−ＣＡＭ、ＶＥ−ＣＡＭおよびフォン−ウィルブラント因子用の染剤であるＶＥＧＦ用の受容体を発現する。本発明の方法により生成される血管内皮細胞は、遺伝子に基づく血管疾患のモデルとして有用であろう。例は、患者がＴＧＦ−β受容体において突然変異を有し慢性出血症候群を有する、ヒト遺伝的毛細血管拡張症であり得る。病因を理解するために、この疾患を有する患者から長寿命細胞を単離し維持することは困難である。従って、血管内皮細胞への分化が誘導された遺伝子的に改変された幹細胞は、有用な培養モデルを提供することができる。さらに、本方法により生成された血管内皮細胞を、移植のためおよび／または遺伝子治療の配達のための経路として用いることができる。

本発明のもう一つの態様において、血管組織における血管疾患を治療または予防する方法であって、前記方法は、胚性外胚葉および／または内胚葉細胞、および／または、胚性外胚葉および／または内胚葉細胞の細胞外培地の存在下に共培養した血管内皮細胞および／または血管内皮祖先細胞を血管組織に導入することを含む方法が提供される。

好ましくは、血管内皮細胞は、前述の条件下に共培養された幹細胞から分化されたものである。

好ましくは、血管疾患は、遺伝性出血性毛細血管拡張症および、糖尿病または喫煙の結果としての血管劣化のいずれか一つにより引き起こされる。

本発明のさらにもう一つの態様において、前述のような方法に従って生成された分化細胞が提供される。好ましくは、分化細胞は、心筋細胞、骨格筋細胞、血管内皮細胞または造血細胞である。本発明は、移植、細胞治療または遺伝子治療のために用いることができる、本発明の方法により生成された分化細胞も提供する。好ましくは、本発明は、心臓疾患または症状を患っている被験者における心臓機能を回復する方法におけるような治療目的で用いることができる本発明の方法により生成された分化細胞を提供する。

分化細胞は、限定はされないが成長因子、分化因子または組織再生を制御する因子を含む新規遺伝子産物の単離または同定のための供給源として用いることができるまたは、これらを、新規エピトープに対する抗体の発生のために用いることができる。

本発明の方法により生成された分化細胞は、クローン的に増幅することができる。特定の分化細胞型を、他の細胞型の混合物から選択的に培養し、続いて増殖させることができる。クローン的に増幅した特定の分化細胞型は、移植治療用の充分な細胞の生成、遺伝子発見研究用の充分なＲＮＡの生成、等のような種々の用途に有用であり得る。分化細胞は、従来法に従って細胞株を作るのに用いることができる。

本発明の方法により生成された分化細胞を、遺伝子的に改変することができる。例えば、遺伝子構築物を、培養の任意の段階において、分化細胞に挿入することができる。移植後、遺伝子的に改変した細胞を用いて、遺伝子治療中の標的器官に遺伝子を運び発現させることができる。

本発明の方法により生成された分化細胞は、生物学的材料の貯蔵に適した任意の方法により保蔵または維持することができる。分化細胞の効果的保存は、将来の種々の用途のために細胞を連続的に貯蔵させることができるので高度に重要である。細胞株の凍結保存に一般的に用いられている伝統的緩慢凍結法を用いて分化細胞を凍結保存することができる。

本発明は、本発明の方法により生成された分化細胞およびキャリアを含む細胞組成物をさらに提供する。キャリアは、細胞を維持する任意の生理学的に許容できるキャリアであってよい。これは、ＰＢＳまたは、当業者に知られている他の最少必須培地であってよい。本発明の細胞組成物は、移植のような医療的目的または生物学的分析のために用いることができる。

本発明の細胞組成物は、心臓疾患または組織損傷が起こっているような疾患または症状を修復または治療する方法において用いることができる。治療には、患者に細胞または細胞組成物（部分的または完全に分化したもの）を投与することがあるが、これに限定されない。これらの細胞または細胞組成物は、動物モデルの使用を通して先に開示したような機能を回復することにより症状を元に戻す。

本明細書の記載および請求の範囲を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、および「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、他の添加物、成分、完全体(integer)またはステップを排除することを意図していない。

文献、事実、材料、装置、物品等の記載は、本発明の内容を説明する目的のみで、本明細書中に含まれる。これらの事項のいずれもまたは全てが、従来技術の基礎の一部を形成し、本出願の各請求項の優先日以前にオーストラリアに存在する本出願に関する分野の一般的知識であると言っているのではない。

本発明を、添付の実施例および図面を参照して、より詳細に説明する。しかしながら、以下の記載は説明をするのみであり、決して前記本発明の普遍性を制限するものと解すべきでない。

［ヒト胚幹（ｈＥＳ）細胞の心筋細胞への分化］
（ａ）ｈＥＳ細胞とＥＮＤ−２細胞との共培養
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ細胞）（Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆら著、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．第１６巻：３９９〜４０４頁）を、ＥＮＤ−２細胞（Ｍｕｍｍｅｒｙら著、１９８５年、Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ．第１０９巻：４０２〜４１０頁）と共培養した。１：１比のダルベッコ最少必須培地（ＤＭＥＭ）とハムＦ１２培地（ＤＦ）（ＦＣＳ７．５％含む）とにおいてＥＮＤ−２細胞を増殖させた。次に、細胞を、１：５のトリプシン／ＥＤＴＡ（０．１２５％ｗ／ｖ；５０ｍＭ ｒｅｓｐ）中で１週間に２回、継代培養した。ｈＥＳ細胞を、ＤＭＥＭにおいて、２０％のＦＣＳ、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１％の非必須アミノ酸、２ｍＭのグルタミン＋抗生物質（ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）と共に、マイトマイシン（１０μｇ／ｍｌ）処理胚のフィーダー細胞上で培養した。ＨＥＳを、ジスパーゼ（ｄｉｓｐａｓｅ）で処理し、個々のコロニーを６〜１０枚の断片に機械的にスライスし、続いて断片を新しいフィーダー細胞に移すことにより二次培養した。

共培養を始めるために、ＥＮＤ−２細胞の集密性培地を、まず、７．５％ＦＣＳを含むＤＭＥＭにおけるゼラチン被覆ガラスオーバースリップまたは組織培養プラスチックウェル上で１：１０に継代培養し、集密性になるまで３日間成長させた。次に、単層を、１０μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣで３時間処理し、Ｃａ²⁺およびＭｇ²⁺を含まないリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で３回洗い、ｈＥＳ培地を添加した。次に、ｈＥＳ細胞を１０ｍｇ／ｍｌジスパーゼを用いて３〜５分間解離させ、続いてピペット中で穏やかに攪拌して、約１０〜５０細胞の小さな細胞塊を含む懸濁液を得た。これらの懸濁液を、次に、ｈＥＳ完全培地において有糸***不活性ＥＮＤ−２単層上で２〜３週間培養した。培地を、５〜６日毎に新鮮なｈＥＳ培地に置換した。

（ｂ）ｈＥＳ細胞と内臓内胚葉細胞との共培養
内臓内胚葉細胞を、ジスパーゼを用いて前述のようにＥ７．５（Ｅ０．５は、膣栓の日正午である）にて、原腸形成しているマウス胚の３つの胚葉から単離した（Ｒｏｅｌｅｎら著、１９９４年、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．第１６６巻：７１６〜７２８頁）。分離した胚葉を、Ｍ１６培地におけるポリ−Ｌ−リシン被覆培養皿上に乗せ、一晩付着させた。翌日、Ｍ１６をｈＥＳ完全培地に置換し、胚細胞単離後３日目に、未分化細胞塊「移植片」を、マウス胚からの付着した内胚葉および外胚葉細胞上で培養した。次に、培地を２〜３週間増殖させ、培地を５〜６日毎に新しくした。

（ｃ）共培養実験（ａ）および（ｂ）の分析
前記（ａ）および（ｂ）に記載した培養を、１０日後の収縮筋の領域の存在について評価した。

（ｉ）免疫蛍光
次に、収縮筋の領域が明らかになった後、培養を、２％パラホルムアルデヒド中で３０分間固定し、３回洗い、使用するまでＰＢＳ中に貯蔵した。次に、培地を、α−アクチニン抗体（モノクローナル抗体−α−アクチニン（筋節）クローンＥＡ−５３、１：１０００希釈、Ｓｉｇｍａ製；二次抗体：ヤギ抗マウス−ＩｇＧ−Ｃｙ３）を用いて、筋肉表現型を確認するために染色した。

（ｄ）共培養実験（ａ）および（ｂ）の結果
（ｉ）ｈＥＳ−ＥＮＤ−２共培養
共培養の最初の週の間、細胞の塊を徐々に広げ分化させて、混合形状を有するが上皮様細胞の割合が比較的高い細胞を得る。第２週までに、これらは膨張して流体を満たした嚢胞になる（図１Ａ参照）。これらの間に、細胞の異なるパッチが明らかになり、数日後に収縮するようになる。１２〜２１日の間に、これらの収縮しているパッチが次第に多く現れる。ガラス基質と組織培養基質との間に明らかな相違はなく、いずれも収縮している筋肉を産生し、これは、３つの独立した実験において示され、収縮筋肉の１または２以上の領域を含むウェルが１５〜２０％あることが示される。収縮速度は１分当たり約６０回であり、高度に温度感受性である。これらの細胞は、α−アクチニンで陽性に染まり、実際に筋細胞であることが確認される（図２）。

（ｉｉ）ｈＥＳ−Ｅ７．５内胚葉共培養
培養の第１週中、ｈＥＳ断片を内胚葉の上で培養し、これは徐々に広がり平らになり、１２日目に、収縮している筋細胞の第１の領域が明らかになる。これは、ＥＮＤ−２共培養において観察される強度の嚢胞形成を伴わないが、血管内皮細胞ネットワークに似ている領域は、培養の端部に現れない。

［ヒト胚幹（ｈＥＳ）細胞の骨格筋細胞への分化］
実施例１で用いたヒト幹細胞（ｈＥＳ）を、Ｅ７．５日胚（Ｅ０．５は栓の日）から単離された外胚葉上に乗せた。鋭いピンセットとタングステン針を用いて、脱落膜から胚を取り出し、１０％ＦＣＳを含むＨＥＰＥＳ緩衝ＤＭＥＭ中で氷上に維持した。ライヘルト膜を除去した後、受胎産物の胚と胚体外部分を、タングステン針で分離した。結節と原始線条を取り出し、胚部分を、氷上のＰＢＳ中の２．５％パンクレアチンおよび０．５％トリプシン中で８分間インキュベートした。インキュベーション後、胚を、氷上の１０％ＦＣＳを含むＨＥＰＥＳ緩衝ＤＭＥＭに移した。次に、外胚葉、内胚葉および中胚葉を、タングステン針を用いてきれいに単離することができた。

ｈＥＳ細胞は、最初は、内胚葉上のものに似ているが、１８日目までに、骨格筋細胞に似ているかなり長い攣縮している細胞の領域ができる。血管ネットワーク（血管内皮細胞）は明らかであるが、収縮心筋を暗示する領域は無い。

［ヒト胚幹（ｈＥＳ）細胞の血管内皮細胞への分化］
実施例１で用いたヒト幹細胞（ｈＥＳ）を、外胚葉および／または内胚葉細胞上に乗せた。外胚葉または内胚葉とのｈＥＳの共培養条件は前述と同じであった。ネットワークにおける血管内皮細胞は、他の体細胞型への分化を伴った。

［内臓内胚葉細胞およびｈＥＳおよび分化心筋細胞の共培養］
ａ）共培養
ＥＮＤ−２細胞、Ｐ１９ＥＣ、ｈＥＣおよびｈＥＳ細胞を、前述のように培養した（Ｍｕｍｍｅｒｙら著、１９８５年、１９９１年；ｖａｎｄｅｎ Ｅｉｊｎｄｅｎ−ｖａｎ Ｒａａｉｊら著、１９９１年；Ｓｌａｇｅｒら著、１９９３年；Ｒｅｕｂｉｎｏｆら著、２０００年）。全ての実験において、ＥＳＩ（Ｒｅｕｂｉｎｏｆら著、２０００年）からのｈＥＳ２細胞株を用いた。共培養を開始するために、実施例１に記載のようにマイトマイシンＣ（１０μｇ／ｍｌ）で１時間処理した有糸***不活性のＥＮＤ−２細胞培養で、ｈＥＣ、ｍＥＳおよびｈＥＳ用のフィーダーであるマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）を置き換えた。フィーダーに依存しないＰ１９ＥＣとの共培養を、先に記載（Ｍｕｍｍｅｒｙら著、１９９１年）のように開始し維持した。次に、培地を２〜３週間成長させ、５日目からの収縮筋肉の領域の存在について評価した。

（ｂ）一次ヒト成人心臓細胞の単離
手術生検からのヒト心房細胞が、抗体染色、電気生理学およびＲＴ−ＰＣＲによるイオンチャンネルの特徴付け用の対照として使用された。心臓手術を受ける患者からの同意を得た心臓組織を得た。手術中に定法で除去された心房付属器を、直ちに、氷冷クレープス−リンガー（ＫＲ）食塩水に移した。過剰結合組織および脂肪組織を切り取り、滅菌ＫＲ溶液で２回洗った。心筋組織を、滅菌鋏で切り刻み、次に、公開された方法（Ｐｅｅｔｅｒｓら著、（１９９５年）、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．第２６８巻、Ｈ１７５７〜Ｈ１７６４）を用いて３段階酵素的単離手順により分離して個々の細胞を放出した。第１の段階は、３７℃で４．０Ｕ／ｍＬプロテアーゼ型ＸＸＩＶ（Ｓｉｇｍａ製、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を用いて１５分間インキュベートすることを含む。次に、組織を、１．０ｍｇ／ｍＬコラーゲナーゼおよび０．５ｍｇ／ｍＬヒアルロニダーゼを含む溶液に移し、続いて、コラーゲナーゼ（１．０ｍｇ／ｍＬ）を用いてさらに３回、各々３７℃で２０分間インキュベートした。組織抽出物を一緒にし、カルシウム濃度を１．７９ｍｍｏｌ／Ｌに回復させた。心筋細胞を、１０％のＦＢＳ、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）、２．０ｍｍｏｌ／ＬのＬ−カルニチン、５．０ｍｍｏｌ／のクレアチン、５．０ｍｍｏｌ／Ｌのタウリンを加えた組織培養培地Ｍ１９９に移し、５０μｇ／ｍＬのポリＬ−リシンを被覆したガラスカバースリップ上に直接接種し、一晩培養した。

（ｃ）免疫細胞化学
付着した一次心筋細胞、ｍＥＳ（Ｅ１４およびＲ１）およびｈＥＳ誘導心筋細胞を、Ｃａ²⁺およびＭｇ²⁺を含むＰＢＳ中の３．０％パラホルムアルデヒドで室温にて３０分間固定し、次に、ＰＢＳ中の０．１％トライトンＸ１００で４分間透過性にした。α−アクチニンおよびトロポミオシン（Ｓｉｇｍａ製）を含む筋節タンパク質に対するモノクローナル抗体を用いて標準的方法により免疫細胞化学を実施した。ミオシン軽鎖（ＭＬＣ２ａ／２ｖ）のアイソフォームに特異的な抗体を用いて、心房細胞と心室細胞（Ｄｒ Ｋｅｎ Ｃｈｉｅｎから戴いた）とを区別した（表１）。二次抗体は、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得た。培養した心臓線維芽細胞は、筋節タンパク質用のネガティブコントロールとして役立ち、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ １３５Ｍエピ蛍光顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ製、Ｊｅｎａ ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて細胞を可視化した。画像処理ソフトウェアを用いて画像を擬似着色した。

（ｄ）イオンチャンネル発現のための半定量的ＲＴ−ＰＣＲ
１％ジメチルスルホキシド（ＲｕｄｎｉｃｋｉおよびＭｃＢｕｒｎｅｙ著、１９８７年）の存在下、凝集プロトコールによりＰ１９ＥＣ細胞を収縮筋に分化させた。これらの培養条件で１６日後、収縮心房を切除し、ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｇｉｂｃｏ製）を用いて単離し、Ｍ−ＭＬＶ−ＲＴ（Ｇｉｂｃｏ製）を用いて逆転写した。心臓アクチン（Ｌａｎｓｏｎら著、（１９９２年）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、第８５巻、１８３５〜１８４１頁）、ＭＬＣ２ｖ（Ｍｅｙｅｒら著、（２０００年）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ，第４７８巻、１５１〜１５８頁）、ＥＲＧ（Ｌｅｅｓ−Ｍｉｌｌｅｒら著、（１９９７年）、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．第８１巻、７１９〜７２６頁）およびＫｉｒ２．１（Ｖａｎｄｏｒｐｅら著、（１９９８年）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７３巻、２１５４２〜２１５３３頁）用のプライマーを、前述のように用いた。マウスＬ型カルシウムチャンネルサブユニットα１ｃ（センス５−ＣＣＡＧＡＴＧＡＧＡＣＣＣＧＣＡＧＣＧＴＡＡ（配列番号１）；アンチセンス５'−ＧＴＣＴＧＣＧＧＣＧＴＴＣＴＣＣＡＴＣＴＣ（配列番号２）；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ０１７７６；生成物寸法７４５ｂｐ）、Ｓｃｎ５ａ（センス５'−ＣＴＴＧＧＣＣＡＡＧＡＴＣＡＡＣＣＴＧＣＴＣＴ（配列番号３）；アンチセンス５'−ＣＧＧＡＣＡＧＧＧＣＣＡＡＡＴＡＣＴＣＡＡＴＧ（配列番号４）；ＡＪ２７１４７７、７７０ｂｐ）およびβ−チューブリン（センス５−ＴＣＡＣＴＧＴＧＣＣＴＧＡＡＣＴＴＡＣＣ（配列番号５）；アンチセンス５'−ＧＡＡＣＡＴＡＧＣＣＧＴＡＡＡＣＴＧＣ（配列番号６）；Ｘ０４６６３、３１９ｂｐ）用のプライマーを、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩソフトウェア（ＩｎｆｏｒＭａｘ製、Ｎｏｒｔｈ Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、ＵＳＡ）を用いて設計した。

（ｅ）パッチクランプ電気生理学
パッチ−クランプ技術の全細胞電圧クランプ構造を用いて３３℃で実験を行った。封鎖達成後、電流固定式に活動電位を測定した。Ａｘｏｐａｔｃｈ ２００Ｂ増幅器（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．製、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて、自発収縮領域における細胞からのデータを記録した。出力信号を、ＡＤ／ＤＡＣ ＬＡＢ ＰＣ＋収集ボード（ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｂｏａｒｄ）（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製、Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）を備えたペンティアム（登録商標）ＩＩＩを用いて２ｋＨｚでデジタル化した。抵抗２〜４ＭΩのパッチピペットを用いた。浴槽培地の組成は、１４０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ_２、１０ｍＭのＨＥＰＥＳであり、ＮａＯＨでｐＨ７．４５に調節されている。ピペット組成：１４５ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ_２、１０ｍＭのＥＧＴＡ、２ｍＭのＭｇＣｌ_２、１０ｍＭのＨＥＰＥＳであり、ＫＯＨによりｐＨ７．３０に調節されている。

（ｆ）共培養の結果
（ｉ）ｍＥＣ−ＥＮＤ−２共培養
ＥＮＤ−２細胞との共培養の開始から２日後に、Ｐ１９ＥＣ細胞は自然に凝集し、７〜１０日後、凝集塊の多くが、先に記載（Ｍｕｍｍｅｒｙら著、１９９１年）のように収縮細胞の領域を含んでいた（図３ａ）。電気生理学およびＲＴ−ＰＣＲは、胚心筋細胞の機能的イオンチャンネル特性がこれらの細胞において発現されたことを示した（図４、表２）。

［表２］
半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより決められる心臓マーカーとイオンチャンネルｍＲＮＡ発現との相対水準。示された遺伝子産物について、未分化Ｐ１９（ＥＣ）、分化Ｐ１９心筋細胞（ＣＭＣ）および成体マウス心臓（心臓）の同一量のｃＤＮＡをＰＣＲ増幅した。各産物についての相対水準を示す。

（ｉｉ）ｍＥＳ−ＥＮＤ−２共培養
２つの独立したマウスＥＳ細胞株（Ｅ１４およびＲ１）を、それらの共培養条件への反応について試験した。培養は単一細胞懸濁液として開始されなかったが、３日以内に、最初に接種したよりも大きな凝集塊が、両方の細胞株について明らかとなった（図３ｂ、ｃ）。殆ど同時に、自発的収縮心筋細胞の著しい領域がＲ１ＥＳ細胞培地において明らかとなったが、僅か７日後には、収縮筋肉の（より小さな）領域がＥ１４ＥＳ細胞中において見つかった。収縮領域中の細胞は、α−アクチニンで染色した場合に、筋細胞の特徴的筋節バンドパターンを示した（図６ｄ参照）。

（ｉｉｉ）ｈＥＣ−およびＥＮＤ−２共培養
ヒトＥＣ細胞株ＧＣＴ２７Ｘは、フィーダーに依存する全能ＥＣ細胞株であり、ヒトＥＳ細胞（Ｐｅｒａら著、（１９８９年）、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ、第４２巻、１０〜２３頁）に類似の特徴を有する。ＥＮＤ−２細胞との共培養において、大きな凝集塊の形成が観察された（図３ｄ）。しかしながら、３週間後でも、収縮筋肉の証拠は無かった。

（ｉｖ）ｈＥＳ−ＥＮＤ−２共培養
共培養の第１週中に、細胞の小さな塊が徐々に広がり分化して、混合形状を有するが上皮様細胞の割合が比較的高い細胞を得る。第２週までに、これらは膨張して流体を満たした嚢胞になる（図示せず）。これらの間に、細胞の異なる区画が明らかになり、数日後に収縮するようになる。１２〜２１日の間に、これらの収縮している区画が次第に多く現れる（例えば、図３ｅ）。全体では、１５〜２０％のウェルが収縮筋肉の１または２以上の領域を含む。収縮速度は１分当たり約６０回であり、マウスＥＳ誘導心筋細胞と比べて高度に温度感受性である。これらの細胞は、α−アクチニンで陽性に染まり、その筋肉表現型が確認される（図６ｅ）。しかしながら、ｍＥＳおよびＰ１９ＥＣ誘導心筋細胞と対照的に、筋節バンドパターンはあまり定まらないが、培養中で２日しか増殖していない一次ヒト心筋細胞と充分に匹敵している（図５および６ａ〜ｃ）。一次ヒト心筋細胞は初期に筋節構造を維持するが、標準的培養条件により、劣化が迅速になることが明らかである（図５）。ｈＥＳ培養条件は、心筋細胞に最適ではなく、そのために、ｈＥＳ誘導心筋細胞はその特徴的表現型において同様に劣化を示すことが推定される。培地中の幹細胞から充分に機能的な心筋細胞を得るために、これらの条件を最適化することが必要である。筋節構造における劣化にも拘わらず、ｈＥＳ誘導心筋細胞は数週間にわたって周期的に収縮を続け、活動電位は、図４（ｃ）に示すように電極を凝集塊に導入することにより行われる電流固定電気生理学により検出することができる（図４ｂ）。しかしながら、このように電気生理学を行う、すなわち、単一細胞よりも凝集塊において電気生理学を行うことにより、細胞の群の蓄積された結果である活動電位が得られる。従って、これらは理解が困難であり、心室細胞、心房細胞またはペースメーカー細胞のいずれに帰することが困難である。単一細胞について決めるために凝集塊を分離し再培養する作業が現在進行中である。

（ｖ）幹細胞分化中の心臓イオンチャンネル発現
心臓発育中に、成体活動電位のその後の相の原因となるイオン電流が生じる順番が、電気生理学的研究において確立された（Ｄｖｉｅｓら著、（１９９６年）、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．第７８巻、１５〜２５頁）。内向きＬ型Ｃａ²⁺電流は、初期心臓胚形成において重要な役割を果たすが、内向きＮａ²⁺電流は、出産直前にしか上昇しない（Ｄａｖｉｅｓら著、１９９６年）。マウスＥＳおよびＰ１９ＥＣ細胞は、イオン電流発現において同様のタイミングを示す（Ｗｏｂｕｓら著、（１９９４年）、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅ．Ｂｉｏｌ．第３０Ａ巻、４２５〜４３４頁）。Ｐ１９ＥＣ細胞の分化中の分子水準でのイオンチャンネル発現の順序を解明するために、我々は、未分化かつ１６日齢の、−４０〜−６０ｍＶの比較的陽性の膜電位（ＩＫ１が無いまたは少し）であるＰ１９誘導心筋細胞の収縮塊から単離されたＲＮＡについてＲＴ−ＰＣＲを行った。これらの結果は、ｍＥＳ誘導心筋細胞について先に記載（Ｄｏｅｖｅｎｄａｎｓら著、（１９９８年）、ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．第３９巻、３４〜３９頁）したように、１６日齢のＰ１９心筋細胞がイオンチャンネル発現に関して胎児心筋細胞に似ていることを示している。

本明細書に記載の作業の結果は、ＶＥ様細胞が、多能性細胞の心筋細胞への分化を誘導／促進することを示している。これらの細胞は、胚における心臓発育の領域に通常隣接するものに類似の細胞に由来する誘導因子に反応することが始めて示された多能性マウスＥＣ細胞、マウスＥＳおよびヒトＥＳ細胞を含む。

［内臓内胚葉様細胞との共培養により誘導されるヒト胚性幹細胞の心筋細胞分化］
（ａ）方法
ｉ）細胞培養
ＥＮＤ−２細胞およびｈＥＳを、実施例１に記載のように培養した。全ての実験において、ＥＳ Ｃｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｔｅ ＬｔｄからのｈＥＳ２細胞株を用いた。共培養を開始するために、マイトマイシンＣ（１０μｇ／ｍｌ）で１時間処理した有糸***不活性のＥＮＤ−２細胞培養で、ｈＥＣ細胞用のフィーダーとして、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）を置き換えた。次に、共培地を６週間まで成長させ、５日目からの収縮筋肉の領域の存在について評価した。肝臓実質細胞に似ている癌細胞株であるＨｅｐＧ２細胞（Ｋｎｏｗｌｅｓら著、（１９８０年）Ｓｃｉｅｎｃｅ第２９巻：４９７〜９頁）を、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中で培養し、１週間に２回継代培養した。ＥＮＤ−２細胞のように共培養を開始したが、ＨｅｐＧ２は集密性単層として成長せず、ｈＥＳ細胞がＨｅｐＧ２に選択的に付着した。Ｐ１９ＥＣ細胞の懸滴培養を開始し、先に記載（Ｍｕｍｍｅｒｙら著、１９９１年）のように通常のＦＣＳを用いて、ＤＭＥＭ／ハムＦ１２（１：１）中に維持し、一方、ノーザンブロット用のＲＮＡを単離するためのＥＮＤ−２調整培地の存在または不存在下におけるＰ１９胚体のバルク生成を、前述（Ｍｕｍｍｅｒｙら著、１９９１年）のように活性炭処理したＦＣＳの存在下に行って、ＦＣＳ中にレチノイド様活性を有する可能性のある親油性物質により引き起こされる心筋細胞分化の背景水準を低下させた。電気生理学のために、コラーゲナーゼを用いて収縮性凝集塊を分解し、ゼラチン被覆オーバースリップ上に乗せた。

ｉｉ）免疫組織化学
付着した一次心筋細胞ｈＥＳ誘導心筋細胞を、Ｃａ²⁺およびＭｇ²⁺を含むＰＢＳ中の３．０％パラホルムアルデヒドで室温にて３０分間固定し、次に、ＰＢＳ中の０．１％トライトンＸ１００で４分間透過性にした。α−アクチニンおよびトロポミオシン（Ｓｉｇｍａ製）を含む筋節タンパク質に対するモノクローナル抗体を用いて標準的方法により免疫細胞化学を実施した。ミオシン軽鎖（ＭＬＣ２ａ／２ｖ）のアイソフォームに特異的な抗体を用いて、心房細胞と心室細胞（Ｄｒ Ｋｅｎ Ｃｈｉｅｎから戴いた）とを区別した。Ｏｃｔ−４およびα１ｃ抗体はＳｉｇｍａ製である。二次抗体は、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ．製である。

ｉｉｉ）一次成体および胎児心筋細胞の培養
一次組織は、標準的インフォームドコンセント手順に従いＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｒｅ，Ｕｔｒｅｃｈｔの倫理委員会の承認を受けた患者から得た。成体心筋細胞を前述（Ｍｕｍｍｅｒｙら著、（２００２年）、Ｊ．Ａｎａｔ．第２００巻：２３３〜２４２頁）のように単離し、培養した。胎児心筋細胞を、Ｌａｎｇｅｎｄｏｒｆｆにより灌流された胎児心臓から単離し、穏やかに遠心分離した後に残っている上澄みが、ラミニン被覆オーバースリップに付着した生活力のある心筋細胞を主要量で含んでいたことを除いて同様の方法で培養した。電気生理学のために、細胞を、低カルシウム含量のタイロード緩衝液（Ｓｉｐｉｄｏら著、１９９８年、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．第３７巻：４７８〜８８頁）中に集め、ガラスウェル中で直接パッチクランプを置換した。

ｉｖ）（半定量的）ＲＴ−ＰＣＲ
ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｇｉｂｃｏ製）を用いて単離し、Ｍ−ＭＬＶ−ＲＴ（Ｇｉｂｃｏ製）を用いて逆転写した。α１ｃ（Ｖａｎ Ｇｅｌｄｅｒら著、１９９９年）、Ｋｖ４．３（Ｃａｌｍｅｌｓら著、２００１年、Ｒｅｆ）およびＡＮＦ（Ｋｅｈａｔら著、２００１年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．第１０８巻、４０７〜４１４頁）様のプライマーは前述の如くである。ヒトＫｖＬＱＴ１（センス５'−ＴＴＣＴＴＧＧＣＴＣＧＧＧＧＴＴＴＧＣＣ（配列番号７）；アンチセンス５'−ＴＧＴＴＧＣＴＧＣＣＧＣＧＡＴＣＣＴＴＧ（配列番号８）；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０００５７１；生成物寸法７２３ｂｐ）およびβ−チューブリン（センス５'−ＴＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣＣＴＣＴＣＡＣＣＡ（配列番号９）；アンチセンス５'−ＣＧＧＣＧＧＡＡＣＡＴＧＧＣＡＧＴＧＡＡ（配列番号１０）；ＡＦ１４１３４９、３６９ｂｐ）用のプライマーを、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩソフトウェア（ＩｎｆｏｒＭａｘ製、Ｎｏｒｔｈ Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、ＵＳＡ）を用いて設計した。アニーリング温度および増幅サイクル数：ＡＮＦ、５８℃、３５サイクル；α１ｃ、５６℃、３８サイクル；Ｋｖ４．３、５５℃、３５サイクル；ＫｖＬＱＴ１、５８℃、３２サイクル；β−チューブリン、６１℃、３０サイクル。エチジウムブロミド１．５％染色アガロースゲル上で生成物を分析した。

ｖ）ノーザンブロット
ＲＮＡは、先に記載（Ｍｕｍｍｅｒｙら著、１９９０年、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．第１４２巻：４０６〜４１３頁）のようにＰ１９凝集塊から単離され、ポリＡ＋ＲＮＡが選択された。

ｖｉ）電気生理学
パッチ−クランプ技術の全細胞電圧クランプ構造を用いて３３℃で実験を行った。封鎖達成後、電流固定式に活動電位を測定した。Ａｘｏｐａｔｃｈ ２００Ｂ増幅器（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．製、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて、自発収縮領域における細胞からのデータを記録した。出力信号を、ＡＤ／ＤＡＣ ＬＡＢ ＰＣ＋収集ボード（ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｂｏａｒｄ）（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製、Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）を備えたペンティアム（登録商標）ＩＩＩを用いて２ｋＨｚでデジタル化した。抵抗２〜４ＭΩのパッチピペットを用いた。浴槽培地の組成は、１４０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ_２、１０ｍＭのＨＥＰＥＳであり、ＮａＯＨでｐＨ７．４５に調節されている。ピペット組成：１４５ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ_２、１０ｍＭのＥＧＴＡ、２ｍＭのＭｇＣｌ_２、１０ｍＭのＨＥＰＥＳであり、ＫＯＨによりｐＨ７．３０に調節されている。

（ｂ）ヒトＥＳ細胞の心筋細胞分化
本明細書で記載の実験の大部分は、ｈＥＳ２細胞株（Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆら著、２０００年）を用いて行った。細胞を、前述（Ｍｕｍｍｅｒｙら著、２００２年）のように血清含有培地においてマイトマイシンＣ処理ＭＥＦ「フィーダー細胞」と共培養することにより未分化状態に維持した。これらの条件下において、培養の塊中の全ての細胞が、ｏｃｔ−４について核染色を示すが、培養の端部における平坦細胞は陰性であった。Ｏｃｔ−４発現は、未分化細胞の表現型特性に関連する。未分化細胞の小さい塊を、新しいマイトマイシンＣ処理ＭＥＦに、またはマイトマイシンＣ処理ＥＮＤ−２細胞の集密性培養に移すことによりｈＥＳを二次培養した。これらの条件下で約５日後、上皮細胞が明白になり、次の数日で、流体で満たされた嚢胞になった（図１Ａ）。これらはαフェトプロテインを染色し、胚体外内臓内胚葉であることが分かる。さらに、１０日までに、より固体の凝集塊中で周期的に収縮している種々の全体形状（図１Ｂ、３ｅ）の細胞の領域が明らかになった（図１Ａ、３ｅ）。１２ウェルプレートのウェルの１６〜３５％が収縮領域を含み、各々を分解し置き換えることにより、３次元構造よりも２次元構造を有する収縮細胞の１２個までの新しいコロニーが産生され；これにより、パッチ−クランプ電気生理学によるさらなる特徴付けのために細胞に接触することが容易になる（図４、図９；以下参照）。分解の前後において、ｈＥＳ誘導心筋細胞は１分当たり４５〜６０回収縮し、時には不規則に収縮し；収縮は、カルバコール、イソプレナリンおよびフェニレフリンのような薬理学的作動薬に反応してアップレギュレーションされる。

心筋細胞をさらに特徴付けるために、多くの筋節タンパク質について免疫蛍光染色を行い、筋節についての生体染色のためにＢＩＤＯＰＹ−リオナジンを使用し、イオンチャンネルの発現をＲＴ−ＰＣＲにより分析した（図８）。各々の場合、一次ヒト胎児（１７週）および成体心房および／または心室組織を、制御された参照として用いた。データは、ｈＥＳ誘導心筋細胞が、α−アクチニンで染色し、別々の束に構成した場合、筋節線条を呈することを示した（図２）。これらは、胎児心筋細胞で観察された束を暗示するが、個々の筋節はあまり良好に構成されておらず、成体ヒト心臓の生検からの心室細胞において観察される高度に構成された平行束と全く異なる。

（ｃ）ｈＥＳ／ＥＮＤ−２共培養における心臓イオンチャンネルおよび幹細胞／筋節マーカーの発現
心臓特異的イオンチャンネルの発現を、未分化ｈＥＳ細胞および、ＥＮＤ−２細胞との共培養の９日および１４日後の分化細胞において判定した（図８）。先に他で示されている（Ｋｅｈａｔら著、２００１年）ように、収縮しているｈＥＳに由来する心筋細胞の領域はＡＮＦを発現する。心臓特異的Ｌ型カルシウムチャンネル（α１ｃ）および一時的外向きカルシウムチャンネル（Ｋｖ４．３）のα−サブユニットの発現も検出され、Ｋｖ４．３の発現は、収縮の開始より数日間早い。遅延整流カリウムチャンネルＫｖＬＱＴ１用のＲＮＡは、未分化細胞において見られ、これは、初期分解中に消滅し、やや後の段階において再び現れる。

（ｄ）電気生理学
ｈＥＳ心筋細胞の解離し再培養した凝集塊のパッチクランプ電気生理学は、胎児起源の一次ヒト心筋細胞（図９Ｂ）に匹敵する範囲の（電気的）表現型が培養中に存在する（図９Ａ）ことを示した。心室様活動電位が主要であった（３１決定のうち２８）が、心房細胞とペースメーカー様細胞の両方共が存在した（それぞれ、３１決定のうち２および１）。注目すべきは、比較的遅い上昇速度（７．０＋／−０．８Ｖ／ｓ）および低い膜電位（図９Ａ）であり、これは、細胞が、妊娠１７週の胎児ヒト心筋細胞と比較しても比較的未熟であったことを示している。細胞が収縮していないが収縮領域から区別できない形状を有する共培養の領域において、電流注入は、繰り返し活動電位および持続する規則的収縮を誘導するのに充分であった。さらに、ｈＥＳ細胞とＨｅｐＧ２細胞との共培養により、ｈＥＳ−ＥＮＤ−２共培養におけるものと類似の活動電位を有する心筋細胞が得られた。

収縮しているｈＥＳ心筋細胞の群におけるカルシウム過渡電流も、Ｆｕｒａ−２を用いて実時間で決めることができ、蛍光放射スペクトルは、細胞内カルシウム濃度に依存する。図９Ｂは、繰り返しＣａ²⁺過渡電流がｈＥＳ心筋細胞において発生し、明らかな電気伝導度測定セルの不存在下に収縮する性能を反映していることを示している。

（ｅ）ＥＮＤ−２調整培地の、Ｐ１９ＥＣ細胞の凝集塊への効果
我々は、先に（Ｍｕｍｍｅｒｙら著、１９９１年）、ＥＮＤ−２細胞により２４時間調節した培地が、その分化を誘導することができ、それにより、懸滴が収縮筋を含むので、３日間成長後の殆ど全ての凝集塊が１０日以内に再び培養されることを示した。正規ＦＣＳの存在下に、分化が、背景水準を越えて著しく高められる。背景分化水準は、ＦＣＳが活性炭カラム（ＤＣＣ−ＦＣＳ）上を通過して残留レチノイドが除去される場合、実質的に０に低下し；さらに、アクチビンにより分化が阻害される（ｖａｎ ｄｅｎ Ｅｉｊｎｄｅｎ−ｖａｎ Ｒａａｉｊら著、１９９１年、Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．第３３巻：１５７〜１６６頁）。ＥＮＤ−２ＣＭを、ＭＥＦ上で培養したｈＥＳ細胞とｍＥＳ細胞の両方について試験した（ＭＥＦがないと、細胞は間接的に死ぬ／分化する）が、ＭＥＦにより分泌された分化阻害活性を超えることはできなかった。Ｐ１９ＥＣはアッセイ系が好ましい、それは、これらの細胞が、未分化成長についてフィーダーに依存しないからである。これらの実験は、Ｐ１９ＥＣ細胞の２つの独立したクローンにおいて、再培養した凝集塊における心筋細胞の外観の促進において投与量依存的効果を有することを示している（図１０Ａ）。より重要なことは、効果が、発生期の中胚葉の分化への初期の効果に関連すると思われ；ノーザンブロット分析は、最初の３日間の凝集相における初期中胚葉マーカーＢｒａｃｈｙｕｒｙ Ｔ（Ｈｅｒｍａｎｎ著、１９９１年）をＥＮＤ−２ ＣＭがアップレギュレーションし（図１０Ｂ）、その水準が培養直後は維持されるが、９日後には、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ Ｔがもはや検出不可能であることを示している。さらに、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ Ｔの誘導が、アクチビンのさらなる存在により阻害（図１０Ｂ）、これは、凝集塊中の収縮筋肉の形成を阻害する性能に一致している。Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ Ｔの一時的発現が、マウス胚の原腸形成中の初期の中胚葉分化中に発見される発現に類似している。

ヒト胚幹（ｈＥＳ）細胞が細胞移植治療による病気の治療における性能を得るべき場合、維持成長の制御および特定の分化経路を誘導する性能が必須である。

従って、マウスからの内臓内胚葉様細胞と共にｈＥＳ細胞を共培養すると、分化プログラムが始まり、収縮筋細胞が形成されることが示されている。筋節マーカータンパク質およびイオンチャンネルの発現は、これらの細胞が心筋細胞であることを示しており、単一細胞についてのパッチ−クランプ電気生理学は、大部分が心室の表現型であることを示している。この系は、通常達成が困難である、培地におけるヒト心筋細胞の研究のためのモデルを提供し、虚血性心臓疾患において失われた心室細胞の置換が心臓機能の回復を補助すると想像される場合の心筋細胞移植治療の可能性を提供する。これは、体細胞系への自発的分化を起こさないｈＥＳ細胞株における心筋細胞分化の誘導を始めて示すものである。

［マウスにおける心筋梗塞モデル］
幹細胞誘導心筋細胞が心臓機能を回復する性能を試験するために、マウスにおいてＭＩモデルを開発した。ペントバルビタール麻酔した成体マウスにおいて、胸部を胸骨中央から開く。前下降枝を確認し結さつする。首尾良い手順により、遠位心筋の変色を誘導する。胸部を、３回の縫合により閉じ、動物を回復させる。合計で、１７匹の動物を手術した。７匹は、縫合の位置決めを含む偽手順を行い、１０匹は結さつした。ＭＩの４週間後、同じ薬剤を用いて腹腔内注射によりマウスを再び麻酔した。血行力学的研究のために、動物をインキュベートし、げっ歯類の人工呼吸器に接続した（Ｈｕｇｏ Ｓａｃｈｓ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ、Ｍａｒｃｈ−Ｈｕｇｓｔｅｔｔｅｎ Ｇｅｒｍａｎｙ）。機器を使用して胸部を閉じてカテーテルを頸静脈に導入した。

１．４フレンチコンダクタンス−ミクロマノメーター（Ｍｉｌｌａｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ、ＵＳＡ）を、頸動脈を通して左心室に入れた。Ｓｉｇｍａ ＳＡ電子装置（ＣＤＬｅｙｃｏｍ、Ｚｏｅｔｅｒｍｅｅｒ、ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて圧力およびコンダクタンスを測定し、オフライン分析のために貯蔵した。正常心臓において記録された典型的圧力体積（ＰＶ）ループを図７（ａ）に示す。ＰＶ−ループから、収縮末期ＰＶ関係（ＥＳＰＶＲ）および前負荷漸増拍出仕事量（ＰＲＳＷ）を含む多くの血行力学的パラメーターを推測することができる。

最後に、前述の発明は、特定した以外の変化、修飾および／または付加を設けることができ、本発明は全てのそのような変化、修飾および／または付加を含むと解され、種々の他の修飾および／または付加が前述の説明の範囲に入ると解される。

図１Ａは、１３日後のＥＮＤ−２細胞と共培養したヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）の位相差顕微鏡写真を示す図である。分化した幹細胞は、混合形状を有するが、上皮様細胞の割合が比較的高い。上皮細胞は膨張して流体充填嚢胞になり、これらの細胞の間に心筋細胞のパッチがある。示されるコロニーの断面は約２ｍｍ（対物レンズ４０×）である。目盛り棒＝１００μｍ。 図１Ｂは、２〜３週間後のＥＮＤ−２細胞と共培養したヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）の位相差顕微鏡写真を示す図である。収縮心筋細胞（心筋細胞；ｂｍ）のパッチの増加がある。観察された収縮速度は、１分当たり約６０回収縮である（対物レンズ２０×）である。目盛り棒＝１００μｍ。 α−アクチニンで陽性染色された細胞を示し、本当の筋細胞であることを確認する図である。目盛り棒＝１００μｍ。 マウス内臓内胚葉様細胞系ＥＮＤ−２と幹細胞との共培養を示す図である。（ａ）正常単層培地におけるＰ１９ＥＣ、ＥＮＤ−２細胞との共培養の開始から３日後および、収縮筋肉（Ｂ．Ｍ．）が明らかな場合には１０日後。（ｂ）正常「フィーダー」細胞上の単層におけるｍＥＳ細胞株Ｒ１（ＳＮＬ）、共培養の開始から３日後および、収縮筋肉が明らかな場合には２日後。（ｃ）は凝集から７日後にＢ．Ｍ．が明らかであることを除いて（ｂ）と同様。（ｄ）マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）供給細胞上のＧＣＴ２７ＸヒトＥＣ細胞株、共培養の開始から３日後および、１６日後。収縮筋肉が存在しない。（ｅ）ＭＥＦフィーダー上のｈＥＳ細胞、ＥＮＤ−２共培養の開始から３日後および、１１日後に収縮筋肉が形成。 幹細胞からの心筋細胞の電気生理学的特性を示す図である。自発的に収縮している領域から記録された繰り返し活動電位。（ａ）マウスＰ１９ＥＣ細胞誘導心筋細胞。（ｂ）ｈＥＳ誘導心筋細胞の凝集塊。（ｃ）（ｂ）に示す記録が由来するｈＥＳ培地の収縮領域の位相差像。（収縮領域が配される突起構造の高さに注目、対物レンズ２０×）。 単離心筋細胞を示す図である。（ａ）２日間培養した細胞と比較して鋭い端部および良好に形成された筋節を示す。（ｂ）筋節パターンを崩した。（ａ）は単離および固定後の複数細胞の位相差像。（ｂ）は、（ａ）と比べて２倍にデジタル的に拡大した単一細胞。 成人ヒト一次心房心筋細胞および幹細胞誘導心筋細胞についての免疫細胞化学を示す図である。一次心房心筋細胞は、（緑色）αアクチン、（赤色）ｍｌｃ−２ａ（ａ）およびトロポミオシン（ｂ）を含む筋節タンパク質について陽性に染色された。細胞ＤＮＡを、Ｈｏｅｃｈｓｔで（青色に）染色して、正常細胞とアポトーシス細胞とを区別した。２日間培養した細胞は、崩れたトロポミオシン筋節パターニングおよび散漫な抗体染色を示した（ｃ）。ｍＥＳ誘導心筋細胞も、αアクチンで染色した場合に鋭いバンドを示す（ｄ）が、ｈＥＳ誘導心筋細胞では、α−アクチニンが散漫で、あまりバンド形成していない（図示せず）。（ｅ）は、低倍率で、ｈＥＳ誘導心筋細胞における全体としての強度のα−アクチニン染色を示す。 マウスにおける左心室機能の血行力学的査定を示す図である。（ａ）正常ループは、マウス心臓における体積変化と圧力変化との間の関係を表し、収縮および弛緩の１サイクル中の弁に関する事項および段階が示される。（ｂ）心筋梗塞の４週間後の圧力体積関係：ループの形状の相違、および収縮と弛緩とにおける変化に注目。 ＲＴ−ＰＣＲによるｈＥＳとＥＮＤ−２細胞の共培養における心筋細胞マーカーｍＲＮＡの発現を示す図である。 Ａ．パッチクランプ電気生理学による活動電位およびイオンチャンネルおよびＢ．Ｃａ²⁺の実時間分析の分析を示す図である。 Ｐ１９胎児性癌細胞へのＥＮＤ−２調整培地の効果を示す図である。Ａ．Ｐ１９ＥＣ凝集塊における収縮筋肉の誘導。７日目および８日目における２つの独立クローン（Ｐ１９ＥＣおよびＰ１９クローン６ＥＣ）からの結果を示す。全ての凝集塊は、１０日目にＤＭＳＯの存在下に収縮する。Ｂ．Ｐ１９ＥＣ凝集塊におけるＥＮＤ−２調節培地によるＢｒａｃｈｙｕｒｙ Ｔの誘導を示すノーザンブロット。ＤＭＳＯは心筋細胞分化も誘導し、対照として示される。ＥＮＤ−２ＣＭとＤＭＳＯの両方が誘導したＢｒａｃｈｙｕｒｙ Ｔ発現はアクチビンにより阻害される。

Claims (6)

1. 未分化のｈＥＳ細胞を心筋細胞へと分化させる方法であって、
   ｈＥＳ細胞の未成熟心筋細胞への分化を誘導するために、マウス胚に由来する内胚葉細胞又は内胚葉様ＥＮＤ−２細胞の存在下に、ｈＥＳ細胞を培養すること
   を含む方法。
2. 未成熟心筋細胞を含む細胞集団を得る方法であって、前記未成熟心筋細胞は細胞集団における未分化のｈＥＳ細胞に由来するものであり、前記方法は、請求項１の未分化ｈＥＳ細胞の分化を誘導することを含む、方法。
3. 前記内胚葉細胞が、マウス原腸形成胚に由来する請求項１の方法。
4. 前記内胚葉細胞が、マウス７．５日胚に由来する請求項１〜３のいずれか１項の方法。
5. マウス胚に由来する内胚葉細胞又は内胚葉様ＥＮＤ−２細胞を実質的に集密な単層にまで予備培養することと、
   前記マウス胚に由来する内胚葉細胞の単層又は前記内胚葉様ＥＮＤ−２細胞の単層の存在下で、ｈＥＳ細胞を共培養することと
   をさらに含む請求項１〜４のいずれか１項の方法。
6. 細胞集団が未成熟心筋細胞からなる請求項２〜５のいずれか１項の方法。

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