KR101760766B1

KR101760766B1 - 신규한 락토바실러스 쿠르바투스 gfc-aj6 균주, 상기 균주를 이용한 폴리아민 함유 유산균 발효물 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR101760766B1
Application number: KR1020160179858A
Authority: KR
Inventors: 강희철
Original assignee: 강희철
Priority date: 2016-12-27
Filing date: 2016-12-27
Publication date: 2017-07-24

Abstract

본 발명은 신규한 락토바실러스 쿠르바투스 GFC-AJ6 균주, 상기 균주를 이용한 폴리아민 함유 유산균 발효물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명으로부터 제공되는 신규한 락토바실러스 쿠르바투스 GFC-AJ6(Lactobacillus curvatus GFC-AJ6) 균주(기탁번호: KCCM11932P)를 이용하여 기질인 아르기닌(Arginine)으로부터 생물전환(Bioconvesion)을 통해 생성된 폴리아민류인 푸트레신(Putrescine), 스페르미딘(Spermidine) 및 스퍼민(Spermine)을 함유한 유산균 발효물을 제조할 경우, 피부 미백 또는 주름 개선 효과가 우수하기 때문에, 상기 폴리아민 함유 유산균 발효물을 유효 성분으로 화장료 베이스에 적용하였을 때 화장료 조성물로서의 효과가 우수하다.

Description

신규한 락토바실러스 쿠르바투스 GFC-AJ6 균주, 상기 균주를 이용한 폴리아민 함유 유산균 발효물 및 이의 제조방법{Novel Lactobacillus curvatus GFC-AJ6, Lactic Acid Bacteria Fermented Product Comprising Polyamines Using Lactobacillus curvatus GFC-AJ6 and Producing Method Thereof}

본 발명은 신규한 락토바실러스 쿠르바투스 GFC-AJ6(Lactobacillus curvatus GFC-AJ6) 균주, 상기 균주를 이용한 폴리아민 함유 유산균 발효물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

폴리아민(Polyamine)은 체내에서 아미노산으로부터 합성되는 2개 이상의 아미노기를 가진 물질의 총칭으로 모든 동·식물과 인간의 세포 내에서 성장기에 왕성하게 합성되고, 동물, 식물 및 미생물에 존재하며 성장조절물질로 알려져 있다(Liu, Ran, et al., Talanta. 2011).

또한, 식품과 음료 중의 폴리아민은 원재료의 효소작용과 미생물의 아미노산 탈탄산 작용으로 생성된다. 이러한 아미노산의 종류는 다양하지만 그 중에서도 폴리아민류에 속하는 푸트레신(Putrescine), 스페르미딘(Spermidine) 및 스퍼민(Spermine)은 모든 생체 세포의 필수 불가결한 구성성분이다(Romain et al., Pediatric Res. 1992; Bardoocz et al., J. Nutr. Biochem.1993). 이와 같은 폴리아민은 장의 기능과 면역체계의 대사작용을 높게 유지하기 위한 필수적인 성분이다.

상기와 같이 폴리아민 중 대표적인 성분은 푸트레신, 스페르미딘 및 스퍼민 3종류이며, 푸트레신은 아르기닌(Arginine)과 오르니틴(Ornithine)으로부터 유래되어 스페르미딘의 전구체가 되며 스퍼민은 스페르미딘에서 합성된다(Coleman, C. S, et al., Biochemical Journal. 2004). 또한, 폴리아민은 체내 pH에서 양이온으로 존재하여 전기적으로 DNA, RNA, 산, 인지질, 단백질과 같은 음이온성 화학종과 반응할 수 있다. 따라서, 핵산의 안정화 및 조절 작용을 함으로써 세포의 생장과 증식 및 막 안정성에 필수 인자로 알려져 있다(Pegg, A. E, IUBMB life. 2009).

폴리아민의 생성은 원핵생물과 진핵생물에서의 현재 다양한 경로로 생성이 되고 있다고 보고되었으며, 육류 및 발효식품에서 많이 발견되고 있다(Iyer, Ramaswamy K. et al., Molecular genetics and metabolism. 2002).

또한, 폴리아민을 생성하는 미생물로는 바실러스(Bacillus), 락토바실러스(Lactobacillus), 페디오코커스(Pediococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus) 등 이 있으며, 이는 다양한 발효식품 내에 존재하는 미생물이다.

최근 폴리아민은 유익한 효능을 부여하는 화장품 소재로 주목받고 있으나, 미생물이 생산하는 폴리아민의 이용에 대한 기술은 국내의 경우 대한민국 등록특허공보 제10-1485970호「신규한 락토바실러스 속 АＭＬ 2-1 균주, 이를 이용한 폴리아민과 감마 아미노 부티르산의 제조방법 및 폴리아민과 감마 아미노 부티르산의 용도」, 대한민국 등록특허공보 제10-1373224호「폴리아민을 생산하는 신규한 락토바실러스 속 ＡＭＬ 15균주 및 그 배양액을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물」 외에 거의 보고 되지 않았으며, 피부세포에서의 폴리아민의 기능적 특성 및 생리활성에 대한 연구 또한 미비한 실정이다.

이에, 본 발명자들은 우리나라 전통발효 식품인 순무김치로부터 분리되는 폴리아민류 생산능이 우수한 락토바실러스 쿠르바투스 GFC-AJ6(Lactobacillus curvatus GFC-AJ6) 균주(기탁번호: KCCM11932P)를 선발하였고, 이를 이용하여 Polyamine synthesis pathway 초기 전구체인 아르기닌(Arginine)으로부터 생물전환(Bioconvesion)을 통해 생성된 폴리아민류인 푸트레신(Putrescine), 스페르미딘(Spermidine) 및 스퍼민(Spermine)을 함유한 유산균 발효물을 제조할 경우, 피부 미백 또는 주름 개선 효과를 부여할 수 있다는 사실을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

대한민국 등록특허공보 제10-1485970호 대한민국 등록특허공보 제10-1373224호

본 발명의 목적은 폴리아민류 생산능을 갖는 락토바실러스 쿠르바투스 GFC-AJ6(Lactobacillus curvatus GFC-AJ6) 균주(기탁번호: KCCM11932P)를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 아르기닌(Arginine)이 첨가되는 배지에서 락토바실러스 쿠르바투스 GFC-AJ6(Lactobacillus curvatus GFC-AJ6) 균주(기탁번호: KCCM11932P)를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리아민 함유 유산균 발효물의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리아민 함유 유산균 발효물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백 또는 주름 개선용 화장료 조성물을 제공하는 데 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 폴리아민류 생산능을 갖는 락토바실러스 쿠르바투스 GFC-AJ6(Lactobacillus curvatus GFC-AJ6) 균주(기탁번호: KCCM11932P)를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 균주는 순무김치 유래인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 폴리아민류는 푸트레신(Putrescine), 스페르미딘(Spermidine) 및 스퍼민(Spermine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 종 이상인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 아르기닌(Arginine)이 첨가되는 배지에서 락토바실러스 쿠르바투스 GFC-AJ6(Lactobacillus curvatus GFC-AJ6) 균주(기탁번호: KCCM11932P)를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리아민 함유 유산균 발효물의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 배지는 아르기닌(Arginine)이 0.5 ~ 1.0 중량% 함유된 MRS 배지인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 배양은 30 ~ 37 ℃에서 3 ~ 5 일 동안 수행되는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기와 같은 제조방법을 통해 제조된 폴리아민 함유 유산균 발효물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 폴리아민 함유 유산균 발효물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 폴리아민 함유 유산균 발효물을 유효성분으로 함유하는 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명으로부터 제공되는 신규한 락토바실러스 쿠르바투스 GFC-AJ6(Lactobacillus curvatus-GFC GFC-AJ6) 균주(기탁번호: KCCM11932P)에 Polyamine synthesis pathway 초기 전구체인 아르기닌(Arginine) 기질을 첨가하여 생물전환을 통해 폴리아민류인 푸트레신(Putrescine), 스페르미딘(Spermidine) 및 스퍼민(Spermine)을 생성할 수 있는 폴리아민 함유 유산균 발효물을 제조할 수 있으며, 이를 유효 성분으로 화장료 베이스에 적용하였을 때 피부 미백 또는 주름 개선 효과가 우수하기 때문에 화장료 조성물로서의 효과가 우수하다.

도 1은 강화도 순무김치로부터 분리된 유산균을 아르기닌을 포함한 MRS 배지에 배양하여 오르니틴 생성능을 확인한 TLC 분석 결과이다.
도 2는 실시예 1의 폴리아민 함유 유산균 발효물로부터 폴리아민 성분(Putrescine, Spermidine 및 Spermine)을 검출한 TLC 분석결과를 나타낸 사진이다.
도 3은 실시예 1의 폴리아민 함유 유산균 발효물로부터 폴리아민을 HPLC 정량 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 실시예 1의 락토바실러스 쿠르바투스 GFC-AJ6(Lactobacillus curvatus GFC-AJ6) 균주의 계통수 분석을 나타낸 것이다.
도 5는 실시예 1의 폴리아민 함유 유산균 발효물의 세포독성 평가를 나타낸 그래프이다.
도 6은 실시예 1의 폴리아민 함유 유산균 발효물의 DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) 소거 활성 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 실시예 1의 폴리아민 함유 유산균 발효물의 세포내·외 멜라닌 활성 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 실시예 1의 폴리아민 함유 유산균 발효물의 Procollagen type I 생성 촉진 및 COL1A1 유전자 발현 증가 결과를 나타낸 그래프이다.

본 발명자들은 최근 화장품 유효성분으로 주목받고 있는 폴리아민류의 생산능을 갖는 새로운 균주를 개발하고자 하였다.

이에, 본 발명에서는 폴리아민류 생산능을 갖는 신규한 균주를 개발하기 위해 순무김치로부터 락토바실러스 쿠르바투스 GFC-AJ6(Lactobacillus curvatus GFC-GFC-AJ6) 균주(기탁번호: KCCM11932P)를 분리하였고, 상기 균주를 이용하여 Polyamine synthesis pathway 초기 전구체인 아르기닌(Arginine)으로부터 생물전환을 통해 생성된 폴리아민류인 푸트레신(Putrescine), 스페르미딘(Spermidine) 및 스퍼민(Spermine)을 함유한 유산균 발효물을 제조하였다. 상기 폴리아민 함유 유산균 발효물로부터 항산화, 피부 미백, 주름 개선 효능을 평가한 결과 화장료 조성물로서의 우수한 효과를 부여할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 순무김치로부터 유래된 폴리아민류 생산능을 갖는 GRAS(Generally Recognized As Safe)급의 락토바실러스 쿠르바투스 GFC-AJ6(Lactobacillus curvatus GFC-AJ6) 균주(기탁번호: KCCM11932P)에 관한 것이다.

이때, 상기 폴리아민류는 푸트레신(Putrescine), 스페르미딘(Spermidine) 및 스퍼민(Spermine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 종 이상인 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 아르기닌(Arginine)이 첨가되는 배지에서 락토바실러스 쿠르바투스 GFC-AJ6(Lactobacillus curvatus GFC-AJ6) 균주(기탁번호: KCCM11932P)를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리아민 함유 유산균 발효물의 제조방법을 제공한다. 즉, 순무김치로부터 분리한 락토바실러스 쿠르바투스 GFC-AJ6(Lactobacillus curvatus GFC-AJ6) 균주(기탁번호: KCCM11932P)를 이용하여 Polyamine synthesis pathway 초기 전구체인 아르기닌(Arginine) 기질로부터 생물전환을 통해 폴리아민류인 푸트레신(Putrescine), 스페르미딘(Spermidine) 및 스퍼민(Spermine)을 생성하게 된다.

상기 배지는 아르기닌(Arginine)이 0.5 ~ 1 중량% 함유된 MRS 배지인 것일 수 있다. 만일, 아르기닌(Arginine)을 0.5 중량% 미만으로 첨가할 경우에는 함량이 미미하여 유산균 발효물 내에 폴리아민 생성이 안될 수 있으며, 1 중량%를 초과하여 첨가할 경우에는 발효균주 증식에 영향을 주어 배양이 안될 수 있기 때문에 바람직하지 않다.

또한, 상기 배양은 30 ~ 37 ℃에서 3 ~ 5 일 동안 수행되는 것을 특징으로 한다. 만일, 배양 온도 및 시간이 상기 범위를 벗어날 경우에는 발효균주의 배양조건이 맞지 않아 폴리아민 생성 및 균주 증식이 되지 않기 때문에 바람직하지 않다.

상기한 바와 같이, 신규한 락토바실러스 쿠르바투스 GFC-AJ6(Lactobacillus curvatus GFC-AJ6) 균주(기탁번호: KCCM11932P)를 이용하여 아르기닌으로부터 생물전환을 통해 생성된 폴리아민류인 푸트레신(Putrescine), 스페르미딘(Spermidine) 및 스퍼민(Spermine)을 함유한 유산균 발효물을 제조할 경우, 피부 미백 또는 주름 개선 효과가 우수하다.

따라서, 본 발명은 상기 폴리아민 함유 유산균 발효물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 폴리아민 함유 유산균 발효물을 유효성분으로 함유하는 주름 개선용 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 피부 미백 또는 주름 개선용 화장료 조성물은 피부외용연고, 크림, 유연화장수, 영양화장수, 팩, 에센스, 헤어토닉, 샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 트리트먼트, 젤, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 마사지 크림, 영양크림, 아이크림, 모이스처 크림, 핸드 크림, 파운데이션, 영양에센스, 선스크린, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디 로션 및 바디 클렌저로 이루어지는 군으로부터 선택된 제형을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들 각 제형의 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 당업자에 의해 용이하게 선정될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르 등이 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 피부 미백 또는 주름 개선용 화장료 조성물에서, 상기 피부 미백 또는 주름 개선용 화장료 조성물은 상기 폴리아민 함유 유산균 발효물을 상기 조성물의 총 중량을 기준으로 0.01 내지 99% 함유되어 있을 수 있고, 바람직하게는 7.0 내지 15% 함유되어 있을 수 있으나, 바람직한 피부 미백 또는 주름 개선 효과를 제공할 수 있는 유효량을 포함한다면 이에 제한되지 않는다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1> 폴리아민류 생성 균주의 분리동정

1. 오르니틴(Ornithine) 생성균주 선발

순무김치 시료로부터 오르니틴 생성능이 있는 유산균을 분리하기 위해 먼저 강화도 순무김치 시료를 적당한 농도로 희석한 후 Bromopurple blue를 첨가한 MRS 배지(Proteose peptone No. 3. 10g, Beef extract 10g, Yeast extract 5.0 g, Dextrose 20g, Polysorbate 80 1g, Ammonium citrate 2g, Sodium acetate. 5g, Magnesium sulfate 0.1g, Manganese sulfate 0.05g, Dipotassium phosphate 2g / 1L, Difco, USA)에 도말하여, 주변에 노란색 환을 형성하는 Colony를 유산균 속 후보군으로 분리시켰다. 분리된 균주는 오르니틴 생성 확인을 위해 아르기닌 기질을 1.0, 3.0, 5.0 중량%으로 저농도에서 고농도로 첨가한 MRS 배지에 배양하여 상등액을 회수한 후 TLC를 이용하여 오르니틴 생성능을 확인하였다. 오르니틴 생성은 Silica gel plate F254에 0.5cm 간격으로 점적한 후 Butanol : Acetic acid: : Water = 5:2:2(v/v/v) 용매로 전개시킨 다음, Ninhydrin reagent를 분무하여 발색시킨 후 Spot을 관찰하였으며, 표준물질 Spot과 비교하여 오르니틴 생성 후보균주 GFC-AJ1~16를 분리하였다. 그 결과, 도 1과 같이 배양 전 아르기닌이 배양 후 오르니틴으로 생성된 Spot이 확인되었으며, 1.0중량%에서 오르니틴이 생성 하는 것으로 최종 확인하였다.

2. 폴리아민 함유 유산균 발효물 제조

MRS 액체배지에 아르기닌 기질을 1.0 중량% 첨가하여 아르기닌 함유 MRS 액체배지를 제조한 다음, 멸균시킨 후 활성화된 상기 후보균주를 접종하여 37℃에서 3 일간 정치배양하여 활성화시켜 폴리아민 함유 유산균 발효물을 제조하였다. 배양 후 유산균 발효물은 14,000rpm에서 15분간 원심분리한 후 상등액을 분석 시료로써 이용하였다.

3. 유산균 발효물 내의 폴리아민 확인 및 정량분석

폴리아민은 흡광을 나타내지 않기 때문에 유산균 발효물 내의 폴리아민을 확인하기 위한 방법으로 Dansylation 및 Benzoylation 유도체화 하여 정성 및 정량분석을 진행하였다.

폴리아민 표준물질과 발효물 1ml에 5% Perchloric acid를 첨가하고 흔들어 14,000rpm에서 5분간 원심분리한 후 50㎕ 상등액에 100㎕ Saturated sodium carbonate 용액을 가했다. Dansyl chloride 용액(10㎍/mL)을 10㎕ 넣어 잘 섞은 후 60℃ 항온수저에서 암상태로 1시간 방치시켰다. 이후, Dansyl chloride를 제거하기 위해 반응 혼합액에 50㎕ Proline(100mg/ml)을 첨가하여 60℃에서 30분간 방치시켰다, 이후 Speed vac으로 Acetone을 제거하고 400㎕ Toluene을 첨가하여 섞은 다음 원심분리시킨 후, Toluene 층을 회수하여 Speed vac으로 용매를 증발시킨 후 Methanol 1ml에 용해하여 TLC 분석을 진행하였다. Silica gel plate F254에 0.5cm 간격으로 점적한 후 Chloroform : triethylamine = 5:1(v/v) 용매로 전개하여 365nm 파장에서 표준물질 Spot를 확인 및 비교하여 발효물 내에 폴리아민 생성여부를 TLC상에서 확인 하였다.(도 2)

Benzoylation은 폴리아민 표준물질과 상등액 1ml에 6M NaOH 3ml을 가하여 알카리성으로 하였다. Benzoyl chloride 5㎕를 가하고 진탕한 후 30분간 방치하고 Saturated NaCl 1ml과 Chloroform 1ml를 가한 후 3,000rpm에서 10분간 원심분리 하였다. Chloroform 층을 회수하여 Speed vac에서 용매를 증발 시킨 후 Methanol 1ml에 용해하여 HPLC 분석 진행하였다. YL9100 HPLC system(Younglin, Korea)을 이용하여 분석 진행 하였으며 Ccolumn은 Kinetex C18(25cm x 4.6mm, 5㎛)을 사용 하였으며, UV detector를 이용하여 245nm로 분석하였다. Mobile phase은 Water : Acetonitrile, 60:40 (v/v)를 Flow rate 1.0mL/min 조건하에 시료 20㎕을 주입하여 분석하였다. 폴리아민 함량은 표준물질의 농도에 대한 피크의 표준 정량 곡선으로부터 계산하였다.

그 결과, 도 3에서 확인할 수 있듯이 Putrescine, Spermidine 및 Spermine의 Retention time은 각각 4.64분, 7.21분, 11.46분으로 12분 이내에 완전히 분리되었다. 다른 후보 균주들의 경우 Putrescine은 생성하나 Spermidine와 Spermine은 전혀 생성하지 못했으나, 후보균주 GFC-AJ6을 이용한 유산균 발효물에서는 푸트레신(Putrescine), 스페르미딘(Spermidine) 및 스퍼민(Spermine) 폴리아민이 확인되었으며, 정량 결과 푸트레신(Putrescine) 23.14㎍/㎖, 스페르미딘(Spermidine) 4.17㎍/㎖, 스퍼민(Spermine) 2.13㎍/㎖을 함유하였다. 발효물 내에 폴리아민 3종을 정성 및 정량 분석을 완료하였으며 이를 통해, 유산균 발효를 통해 발효물 내에 유효물질인 폴리아민을 함유하고 있음을 최종 확인하였다.

4. 선발균주 16s rRNA 염기서열 분석

최종 선발된 폴리아민 생성균주 GFC-AJ6의 동정은 16S rRNA sequence 분석을 수행하였다. Chromosomal DNA extraction을 실시하여 얻어진 gDNA로부터 Universal primer 인 서열번호 1: 27F(5' AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG 3')와 서열번호 2: 1492R(5' TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACTT 3')을 이용하여 PCR을 수행하여 염기서열을 분석하였다. 16s rRNA sequencing을 수행하여 얻어진 결과를 바탕으로 상동성 검사는 NCBI에서 제공하는 BLAST search를 통하여 수행하였다. 염기서열을 통해 동정한 결과 분리 균주는 락토바실러스(Lactobacillus) 속(genus)에 속하는 락토바실러스 쿠르바투스(Lactobacillus curvatus)와 99.71%의 유사성을 나타내었으며, 얻어진 결과를 바탕으로 락토바실러스 쿠르바투스 GFC-AJ6(Lactobacillus curvatus GFC-AJ6)로 명명하엿으며, 국제미생물특허 기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 2016년 11월 16일자로 기탁하였으며, 기탁번호 KCCM11932P를 부여받았다.

MEGA 6.0(Megasoftware, USA) program을 사용하여 Neighbor-joining법으로 계통도를 작성하였다.(도 4)

<실시예 2> 세포독성 시험: WST assay

B16-F10 멜라노마 세포(ATCC^ⓡ CRL 6475™)는 96 well plate(Corning 3590)에 5*10³ / well로 배양하고 hFF(Human Foreskin Fibroblast,CCD-986Sk)(ATCC^ⓡ CRL-1947™)는 3*10³ / well로 배양하였다. 발효물을 농도별로 처리하고 48시간 이후에 DMEM media에 10% EZ-Cytox (대일, 99-EZ3000)을 혼합하여 시료 처리한 media를 suction 후 1 well당 100ul씩 분주하였다. 2시간 배양 후 마이크로플레이트 리더기(Microplate reader; Biotek, Synergy HT)로 450nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율은 시료를 처리하지 않은 처리군(무처리군)과 비교하여 다음과 같이 계산하였다.

세포 생존율 (%) = (시료를 처리군의 흡광도 / 무처리군의 흡광도) * 100

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 4% 처리 농도까지 B16/F10, hFF 세포에 대한 독성이 나타나지 않아 화장품에 안전한 소재로 사용이 가능함을 확인하였다.

<실시예 3> 항산화 효능 검증 시험 : DPPH radical 소거 활성

프리라디칼 구조를 갖는 활성산소가 체내에 과량 존재하면 정상세포를 공격하여 노화를 촉진시키고 면역반응을 유도하는 병리적 인자로 작용하게 되므로 항산화능 평가를 위해 DPPH 자유라디칼 소거능을 측정하였다.

먼저, 폴리아민 함유 유산균 발효물을 농도별로 희석하고 대조군으로 증류수를 사용하였다. 희석한 각 시료 50㎕, 에탄올 200㎕, 0.1mM DPPH 250㎕을 섞은 후 빛을 차단한 상태에서 30분간 4℃에서 반응 후 520nm에서 흡광도 측정 하여 계산하였으며, Positive control로 Ascorbic acid를 사용하였다.

Free radical scavenging(%) = 100-(시험물질 첨가군 흡광도/대조군 흡광도X 100)

그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이 IC₅₀ 값은 1.46%으로 확인하였으며, 폴리아민 함유 유산균 발효물의 농도 의존적으로 항산화 증가를 보였다. 최대농도 4%에서는 약 64%로 대조군으로 사용한 Ascorbic acid(3㎍/㎖) 보다 우수한 항산화 활성을 확인하였다.

< 실시예 7> 미백 효능 검증 시험 : 세포내 ·외 멜라닌 분석

B16-F10 멜라노마 세포는 6well에 1.2*10⁵/well로 배양하였다. 배양 24시간 이후, 멜라닌 분비를 유도하기 위해 α-MSH(Sigma M4135)를 50nM로 처리하였고 동시에 폴리아민 함유 유산균 발효물을 농도별로 세포에 처리하였다. 이때 멜라닌 분석을 위해 페놀이 없는 DMEM media(10% FBS, 페니실린(100 unit/ml), 스트렙토마이신(100㎍/㎖))를 사용하였다. 시료 처리 48~60시간 후 세포와 배양액을 15ml Conical tube에 옮긴 후 상온에서 3,000RPM에서 10분간 원심분리를 진행하였다. 세포외 멜라닌 분석을 위해 세포의 배양액을 96 well plate(corning 3595)에 1 well 당 100㎕씩 농도별로 총 4 well을 분주한 후 마이크로 플레이트 리더기로 450nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

세포내 멜라닌 분석을 위해 세포를 회수하여 1ml DPBS로 세척 해주고 100㎕의 1N NaOH(10% DMSO)를 첨가 후 60℃에서 60분간 반응시켰다. 반응 종료 후 17,000RPM 원심분리를 진행하였으며 상층액만 96 well plate에 세포외 멜라닌과 같은 방법으로 분주하였다. 마이크로플레이트 리더기로 450nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 세포외, 세포내 멜라닌 분석 모두 Negative control은 α-MSH 첨가하지 않았으며 Control은 α-MSH와 증류수를, Positive control은 β-arbutin을 사용하였다.

세포내, 세포외 멜라닌 contents (%) = (시료를 처리군의 흡광도 / control군의 흡광도) * 100

그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이 세포 내 Melanin contents IC₅₀ 값은 1.29%, 세포 외 Melanin contents IC₅₀ 값은 1.68%으로 확인하였으며, 폴리아민 함유 유산균 발효물의 농도 의존적으로 세포 내·외 멜라닌 분비가 감소되어 멜라닌 생성 저해능이 우수한 미백효과를 확인하였다. 최대농도 4%에서는 세포 내 약 73%, 세포 외 약 71% Melanin contents 억제율로 대조군으로 사용한 Arbutin(200ug/mL)과 비슷하거나 높은 미백 활성을 확인하였다.

<실시예 8> 주름개선 효능 검증 시험 : Procollagen type Ⅰ 생성 촉진 및 COL1A1 유전자 발현 변화

Procollagen type Ⅰ 생성 촉진 효과를 ELISA와 COL1A1 유전자를 대상으로 Real-time PCR을 사용하여 확인하였다. ELISA는 hFF 세포를 24well에서 1.2*10⁴ cell로 배양하여 24시간 후 Serum free DMEM으로 6시간 처리한 후 Serum free DMEM에 발효물을 농도별로 처리하고 48시간 처리하였다. 배양액을 회수 후 Procollagen ELISA (TAKARA MK101)를 실시하였으며, 양성대조군으로 TFG-β 5ng/ml로 처리하였다.

Real-time PCR은 hFF 세포를 24 well에서 1.2*10⁴ cell로 배양하여 24시간 후 Serum free DMEM으로 6시간 처리한 후 Serum free DMEM에 폴리아민 함유 유산균 발효물을 농도별로 처리하고 48시간 처리하였다. Nucelospin RNA kit(MN740955)를 이용해서 RNA를 추출 후 Take3(Bioteck)를 이용해서 RNA를 정량하였다. cDNA 합성 kit(Genedepot R5600)를 이용해서 cDNA를 합성 후 Sybr green(BR170-8884AP)과 cDNA, Primer를 넣고 Real-Time PCR(Biorad)을 진행하였다. Primer 및 Real-Time PCR condition은 다음 표 1와 같이 나타내었다. 분석 소프트웨어는 CFX manager(Biorad)를 사용하였으며, House keeping gene으로 β-actin을 사용하였다.

Primer		Real Time PCR condition
Procollagen	서열번호 3: F 5' - GACCTCAAGATGTGCCACTC - 3' 서열번호 4: R 5' - CCAGTCTCCATGTTGCAGAA - 3'	Pre-denaturation 95℃ Denaturation 94℃, 15s Annealing 58℃, 30s Extension 72℃, 30s 40 cycle
β-actin	서열번호 5: F 5' - CATGAAGTGTGACGTGGACA - 3' 서열번호 6: R 5' - CAGGGCAGTGATCTCCTTCT - 3'

그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이 ELISA assay 최대농도 4% 처리시 14%로 농도 의존적으로 Procollagen type Ⅰ을 증가시키는 결과를 보였다. Collagen 발현 변화는 COL1A1 유전자를 대상으로 Real-time PCR을 사용하여 확인하였다. 농도 의존적으로 COL1A1 전사량이 증가되는 것을 확인하였으며, 최대농도 4%에서 TGF-β 처리군과 비교시 28% COL1A1 발현을 더 촉진하여 높은 항주름 활성을 나타내었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

한국미생물보존센터(KCCM)

KCCM11932P

20161116

<110> KANG, Hee-Cheol <120> Novel Lactobacillus curvatus GFC-AJ6, Lactic Acid Bacteria Fermented Product Comprising Polyamines Using Lactobacillus curvatus GFC-AJ6 and Producing Method Thereof <130> P16222 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universal primer 27F <400> 1 agagtttgat cmtggctcag 20 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universal primer 1492R <400> 2 tacggytacc ttgttacgac tt 22 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Procollagen primer F <400> 3 gacctcaaga tgtgccactc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Procollagen primer R <400> 4 ccagtctcca tgttgcagaa 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin primer F <400> 5 catgaagtgt gacgtggaca 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta actin primer F <400> 6 cagggcagtg atctccttct 20

Claims

푸트레신(Putrescine), 스페르미딘(Spermidine) 및 스퍼민(Spermine)으로 구성된 3종의 폴리아민 생산능을 갖는 락토바실러스 쿠르바투스 GFC-AJ6(Lactobacillus curvatus GFC-AJ6) 균주(기탁번호: KCCM11932P).
제 1항에 있어서, 상기 균주는 순무김치 유래인 것을 특징으로 하는 락토바실러스 쿠르바투스 GFC-AJ6(Lactobacillus curvatus GFC-AJ6) 균주(기탁번호: KCCM11932P).
삭제
아르기닌(Arginine)이 첨가되는 배지에서 푸트레신(Putrescine), 스페르미딘(Spermidine) 및 스퍼민(Spermine)으로 구성된 3종의 폴리아민 생산능을 갖는 락토바실러스 쿠르바투스 GFC-AJ6(Lactobacillus curvatus GFC-AJ6) 균주(기탁번호: KCCM11932P)를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 푸트레신(Putrescine), 스페르미딘(Spermidine) 및 스퍼민(Spermine) 함유 유산균 발효물의 제조방법.
제 4항에 있어서, 상기 배지는 아르기닌(Arginine)이 0.5 ~ 1.0 중량% 함유된 MRS 배지인 것을 특징으로 하는 푸트레신(Putrescine), 스페르미딘(Spermidine) 및 스퍼민(Spermine) 함유 유산균 발효물의 제조방법.
제 4항에 있어서, 상기 배양은 30 ~ 37 ℃에서 3 ~ 5 일 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 푸트레신(Putrescine), 스페르미딘(Spermidine) 및 스퍼민(Spermine) 함유 유산균 발효물의 제조방법.
제4항 내지 제6항 중 어느 한 항의 제조방법을 통해 제조된 푸트레신(Putrescine), 스페르미딘(Spermidine) 및 스퍼민(Spermine) 함유 유산균 발효물.
제 7항의 푸트레신(Putrescine), 스페르미딘(Spermidine) 및 스퍼민(Spermine) 함유 유산균 발효물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물.
제 7항의 푸트레신(Putrescine), 스페르미딘(Spermidine) 및 스퍼민(Spermine) 함유 유산균 발효물을 유효성분으로 함유하는 주름 개선용 화장료 조성물.