KR101789973B1 - 항-c5 항체 및 사용 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항-C5 항체 및 그를 사용하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 단리된 항-C5 항체는 산성 pH에서보다 중성 pH에서 더 높은 친화도하에 C5의 베타쇄 내의 에피토프에 결합한다. 본 발명은 또한 본 발명의 항-C5 항체를 암호화하는 단리된 핵산을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 본 발명은 또한 항체가 생성되도록 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 항체의 제조 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 C5의 베타쇄의 MG1-MG2 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 대해 동물을 면역화시키는 단계를 포함하는, 항-C5 항체의 제조 방법을 제공한다. 본 발명의 항-C5 항체는 약제로 사용하기 위한 것일 수 있다.

Description

항-C5 항체 및 사용 방법{ANTI-C5 ANTIBODIES AND METHODS OF USE}
본 발명은 항-C5 항체 및 그를 사용하는 방법에 관한 것이다.
보체 시스템은 면역 복합체의 제거에서 및 감염원, 외래 항원, 바이러스-감염된 세포 및 종양 세포에 대한 면역 반응에서 중심적인 역할을 한다. 혈장 단백질 및 막 보조인자의 복합 집합체로서 발견되는, 약 25 내지 30개의 보체 단백질들이 존재한다. 보체 성분들은 일련의 복잡한 효소 절단 및 막 결합 반응들에서 상호작용함으로써 그의 면역 방어 기능을 달성한다. 야기된 보체 연쇄반응은 옵소닌, 면역조절 및 세포용해 기능을 갖는 생성물의 생성을 유도한다.
현재, 보체 시스템이 3가지 별개의 경로들을 통해 활성화될 수 있다는 것이 널리 받아들여지고 있다: 고전적 경로, 렉틴 경로, 및 대체 경로. 상기 경로들은 많은 성분들을 공유하며, 상기 경로들은 그 초기 단계들에서는 상이하지만, 표적 세포들의 활성화 및 파괴를 담당하는 동일한 말단 보체 성분들(C5 내지 C9)에서 수렴되며 이들을 공유한다.
고전적 경로는 정상적으로 항원-항체 복합체의 형성에 의해 활성화된다. 독립적으로, 렉틴 경로의 활성화에서 제 1 단계는 만난-결합 렉틴(MBL), H-피콜린, M-피콜린, L-피콜린 및 C-형 렉틴 CL-11과 같은 특정 렉틴들의 결합이다. 대조적으로, 대체 경로는 낮은 수준의 대사회전 활성화가 자발적으로 일어나며, 상기 활성화는 외래 또는 다른 비정상적 표면들(세균, 효모, 바이러스 감염된 세포 또는 손상된 조직) 상에서 용이하게 증대될 수 있다. 상기 경로들은 보체 성분 C3이 활성 프로테아제에 의해 절단되어 C3a 및 C3b를 생성하는 지점에서 수렴된다.
C3a는 아나필라톡신이다. C3b는 세균 및 다른 세포들뿐 아니라 특정 바이러스 및 면역 복합체에 결합하고, 순환시 제거를 위해 이들을 표지화한다(옵소닌으로 알려진 역할). C3b는 또한 다른 성분들과 복합체를 형성하여, C5를 C5a 및 C5b로 절단하는 C5 전환효소를 생성한다.
C5는 정상 혈청에서 약 80 ㎍/ml(0.4 μM)로 발견되는 190 kDa의 단백질이다. C5는 글리코실화되는데, 이때 그 질량의 약 1.5 내지 3%가 탄수화물에 기인한다. 성숙한 C5는 75 kDa 베타쇄에 다이설파이드 결합된 115 kDa 알파쇄의 헤테로이량체이다. C5는 1676개 아미노산들의 단일쇄 전구체 단백질(프로-C5 전구체)로서 합성된다(예를 들면, PTL1 및 PTL2 참조). 프로-C5 전구체는 절단되어 아미노 말단 단편으로서 베타쇄 및 카복실 말단 단편으로서 알파쇄를 생성한다. 알파쇄 및 베타쇄 폴리펩티드 단편들은 다이설파이드 결합에 의해 서로에게 연결되어 성숙한 C5 단백질을 구성한다.
성숙한 C5는 보체 경로들의 활성화시 C5a 및 C5b 단편으로 절단된다. C5a는 C5 전환효소에 의해 C5의 알파쇄로부터 알파쇄의 처음 74개 아미노산을 포함하는 아미노 말단 단편으로서 절단된다. 성숙한 C5의 남은 부분은 베타쇄에 다이설파이드 결합된 알파쇄의 나머지를 함유하는 단편 C5b이다. C5a의 11 kDa 질량의 약 20%가 탄수화물에서 기인한다.
C5a는 또 다른 아나필라톡신이다. C5b는 C6, C7, C8 및 C9와 결합하여 표적 세포의 표면에서 막 공격 복합체(MAC, C5b-9, 말단 보체 복합체(TCC))를 형성한다. 충분한 수의 MAC가 표적 세포 막 내에 삽입될 때, MAC 기공들이 형성되어 표적 세포의 신속한 삼투압 용해를 매개한다.
상기 언급한 바와 같이, C3a 및 C5a는 아나필라톡신이다. 이들은 비만 세포 탈과립화를 유발할 수 있으며, 이것은 히스타민 및 다른 염증 매개체를 방출시켜, 평활근 수축, 증가된 혈관 투과성, 백혈구 활성화, 세포과다를 야기하는 세포 증식을 포함한 다른 염증 현상을 야기한다. C5a는 또한 호중구, 호산구, 호염기구 및 단핵구와 같은 과립구들을 보체 활성화 부위로 유인하는 역할을 하는 주화성 펩티드로서 작용한다.
C5a의 활성은, C5a로부터 카복시-말단 아르기닌을 제거하여 C5a-des-Arg 유도체를 생성하는 혈장 효소 카복시펩티다제 N에 의해 조절된다. C5a-des-Arg는 비변형 C5a의 아나필락시스 활성 및 다형핵 주화성 활성의 1% 만을 나타낸다.
적절하게 작용하는 보체 시스템은 감염 미생물에 대한 강력한 방어를 제공하지만, 보체의 부적절한 조절 또는 활성화는, 예를 들면, 다음을 포함한 다양한 질환의 발병에 연루되었다: 류마티스성 관절염(RA); 루프스 신염; 허혈-재관류 손상; 발작성 야간 헤모글로빈뇨(PNH); 비정형 용혈 요독 증후군(aHUS); 고밀도 침착병(DDD); 황반변성(예를 들면, 연령-관련 황반변성(AMD)); 용혈, 간효소 증가 및 저혈소판(HELLP) 증후군; 혈전성 혈소판감소성 자반증(TTP); 자연 유산; 저면역(Pauci-immune) 혈관염; 수포성 표피박리증; 재발성 유산; 다발성 경화증(MS); 외상성 뇌손상; 및 심근경색, 심폐 우회술 및 혈액투석에서 비롯된 손상(예를 들면, NPL 1 참조). 그러므로, 보체 연쇄반응의 과도하거나 통제되지 않는 활성화의 억제는 상기 질환들을 갖는 환자에게 임상적 유익을 제공할 수 있다.
발작성 야간 헤모글로빈뇨(PNH)는, 적혈구 세포가 약화되어 정상적인 적혈구 세포보다 더 신속하게 파괴되는 흔하지 않은 혈액 질환이다. PNH는 X 염색체 상에 위치한 PIG-A(포스파티딜이노시톨 글리칸 부류 A) 유전자에 체세포 돌연변이를 갖는 조혈 줄기 세포의 클론 확장으로부터 비롯된다. PIG-A에서의 돌연변이는 세포 표면에 많은 단백질의 고정에 필요한 분자인 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI)의 합성에서 조기 차단을 야기한다. 결과적으로, PNH 혈액 세포는 보체-조절 단백질 CD55 및 CD59를 포함하는 GPI-고정 단백질이 결핍된다. 정상적인 환경하에서, 상기 보체-조절 단백질들은 세포 표면상에 MAC의 형성을 차단함으로써 적혈구 용해를 방지한다. GPI-고정 단백질의 부재는 PNH에서 보체-매개 용혈을 야기한다.
PNH는 용혈성 빈혈(감소된 수의 적혈구 세포), 헤모글로빈뇨(소변중 헤모글로빈의 존재, 특히 수면후에 뚜렷함) 및 헤모글로빈혈증(혈류중 헤모글로빈의 존재)을 특징으로 한다. PNH에 걸린 개체들은 여기에서 진한색 소변의 발생으로 정의되는 발작을 갖는 것으로 알려져 있다. 용혈성 빈혈은 보체 성분에 의한 적혈구 세포의 혈관내 파괴에 기인한다. 다른 알려진 증상으로는 부전실어증, 피로, 발기부전, 혈전증 및 재발성 복통이 포함된다.
에쿨리주맙은 보체 단백질 C5에 대해 유도된 인간화 단일클론 항체이며, 발작성 야간 헤모글로빈뇨(PNH) 및 비정형 용혈 요독 증후군(aHUS)의 치료에 승인된 최초의 치료법이다(예를 들면, NPL 2 참조). 에쿨리주맙은 C5 전환효소에 의한 C5의 C5a 및 C5b로의 절단을 억제하고, 이에 의해 말단 보체 복합체 C5b-9의 생성이 방지된다. C5a 및 C5b-9는 둘 다 PHN 및 aHUS의 특징인 말단 보체-매개된 반응들을 야기한다(또한, PTL 3, PTL 4, PTL 5 및 PTL 6 참조).
여러 보고서들이 항-C5 항체를 기술하였다. 예를 들면, PTL 7은 C5의 알파쇄에 결합하지만 C5a에는 결합하지 않으며 C5의 활성화를 차단하는 항-C5 항체를 기술한 반면, PTL 8은 C5a 생성을 억제하는 항-C5 단일클론 항체를 기술하였다. 다른 한편으로, PTL 9는 C5의 알파쇄 상에서 C5 전환효소에 대한 단백질분해 부위를 인식하고 C5의 C5a 및 C5b로의 전환을 억제하는 항-C5 항체를 기술하였다. PTL 10은 적어도 1 x 107 M-1의 친화 상수를 갖는 항-C5 항체를 기술하였다.
항체(IgG)는 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 결합하며 긴 혈장 체류 시간을 갖는다. FcRn에 IgG의 결합은 전형적으로 산성 조건(예를 들면, pH 6.0) 하에서 관찰되며, 상기 결합은 중성 조건(예를 들면, pH 7.4) 하에서는 거의 관찰되지 않는다. 전형적으로, IgG는 세포내섭취(endocytosis)를 통해 세포내에 비특이적으로 혼입되고, 엔도좀에서 산성 조건하에 엔도좀 FcRn에 결합함으로써 세포 표면으로 복귀된다. 이어서, IgG는 혈장에서 중성 조건하에 FcRn으로부터 해리된다. FcRn에 결합하지 못한 IgG는 리소좀에서 분해된다. 산성 조건하에서의 IgG의 FcRn 결합 능력이 그 Fc 영역내에 돌연변이를 도입함으로써 배제될 때, IgG는 엔도좀으로부터 혈장내로 재순환되지 않으므로 IgG의 혈장 체류의 현저한 감소를 야기한다. IgG의 혈장 체류를 개선하기 위해, 산성 조건하에서의 그의 FcRn 결합을 증대시키는 방법이 보고되었다. 산성 조건하에서의 IgG의 FcRn 결합이 그 Fc 영역 내에 아미노산 치환을 도입함으로써 개선될 때, IgG는 엔도좀으로부터 혈장으로 보다 효과적으로 재순환됨으로써 개선된 혈장 체류를 나타낸다. 한편, 중성 조건하에서 증대된 FcRn 결합을 갖는 IgG는, 상기 IgG가 엔도좀에서 산성 조건하에 FcRn에 대한 그의 결합에 의해 세포 표면으로 복귀될 때조차 혈장에서 중성 조건하에 FcRn으로부터 해리되지 않으며, 결과적으로 그의 혈장 체류는 변화되지 않고 유지되거나 오히려 악화되는 것이 또한 보고되었다(예를 들면, NPL 3; NPL 4; NPL 5 참조).
최근에, pH-의존성 방식으로 항원에 결합하는 항체들이 보고되었다(예를 들면, PTL 11 및 PTL 12 참조). 상기 항체들은 혈장의 중성 조건하에서 항원에 강하게 결합하고 엔도좀의 산성 조건하에서 항원으로부터 해리된다. 항원으로부터 해리 후에, 항체들은 FcRn을 통해 혈장으로 재순환될 때 또 다시 항원에 결합할 수 있게 된다. 따라서, 단일 항체 분자가 여러 항원 분자들에 반복적으로 결합할 수 있다. 일반적으로, 항원의 혈장 체류는 상기 언급한 FcRn-매개된 재순환 메카니즘을 갖는 항체보다 훨씬 더 짧다. 그러므로, 항원이 항체에 결합될 때, 항원은 정상적으로 연장된 혈장 체류를 나타내어, 항원의 혈장 농도의 증가를 야기한다. 다른 한편으로, pH-의존성 방식으로 항원에 결합하는 전술한 항체들은, FcRn-매개된 재순환 과정동안 엔도좀 내에서 항원으로부터 해리되기 때문에, 전형적인 항체들보다 더 신속하게 혈장으로부터 항원을 제거한다. PTL 13은 또한 C5에 대해 유도된 pH-의존성 결합을 갖는 항체가 항원 녹다운(knockdown)을 연장시킬 수 있음을 보여주는 컴퓨터 모델링 분석을 기술하였다.
[인용문헌 목록]
특허 문헌
[PTL 1]
미국 특허 제 6,355,245 호
[PTL 2]
미국 특허 제 7,432,356 호
[PTL 3]
국제 특허 공개 제 2005/074607 호
[PTL 4]
국제 특허 공개 제 2007/106585 호
[PTL 5]
국제 특허 공개 제 2008/069889 호
[PTL 6]
국제 특허 공개 제 2010/054403 호
[PTL 7]
국제 특허 공개 제 95/29697 호
[PTL 8]
국제 특허 공개 제 02/30985 호
[PTL 9]
국제 특허 공개 제 2004/007553 호
[PTL 10]
국제 특허 공개 제 2010/015608 호
[PTL 11]
국제 특허 공개 제 2009/125825 호
[PTL 12]
국제 특허 공개 제 2011/122011 호
[PTL 13]
국제 특허 공개 제 2011/111007 호
비-특허 문헌
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문헌 [Datta-Mannan et al., J Biol. Chem. 282(3):1709-1717 (2007)]
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문헌 [Dall'Acqua et al., J. Immunol. 169(9):5171-5180 (2002)]
본 발명의 목적은 항-C5 항체 및 그를 사용하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 항-C5 항체 및 그를 사용하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 단리된 항-C5 항체는 C5의 베타쇄 내의 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 단리된 항-C5 항체는 C5의 베타쇄의 MG1-MG2 도메인 내의 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 단리된 항-C5 항체는 C5의 베타쇄(서열번호 40)의 아미노산 33 내지 124로 이루어진 단편 내의 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 단리된 항-C5 항체는 아미노산 47 내지 57, 70 내지 76, 및 107 내지 110으로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상의 단편을 포함하는 C5의 베타쇄(서열번호 40) 내의 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 단리된 항-C5 항체는 서열번호 40의 Glu48, Asp51, His70, His72, Lys109 및 His110으로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 C5의 베타쇄(서열번호 40)의 단편 내의 에피토프에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 항체는 산성 pH에서보다 중성 pH에서 더 높은 친화도하에 C5에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 항체는 pH 5.8에서보다 pH 7.4에서 더 높은 친화도하에 C5에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 단리된 항-C5 항체는 표 2에 기술된 항체와 동일한 에피토프에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 항체는 pH 5.8에서보다 pH 7.4에서 더 높은 친화도하에 표 2에 기술된 항체와 동일한 에피토프에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항-C5 항체는 표 7 또는 8에 기술된 항체와 동일한 에피토프에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 항체는 pH 5.8에서보다 pH 7.4에서 더 높은 친화도하에 표 7 또는 8에 기술된 항체와 동일한 에피토프에 결합한다.
특정한 실시양태에서, 본 발명의 항-C5 항체는 C5에 결합하는 데 있어서 다음에서 선택된 VH 및 VL 쌍을 포함하는 항체와 경쟁한다: (a) 서열번호 1의 VH 및 서열번호 11의 VL; (b) 서열번호 5의 VH 및 서열번호 15의 VL; (c) 서열번호 4의 VH 및 서열번호 14의 VL; (d) 서열번호 6의 VH 및 서열번호 16의 VL; (e) 서열번호 2의 VH 및 서열번호 12의 VL; (f) 서열번호 3의 VH 및 서열번호 13의 VL; (g) 서열번호 9의 VH 및 서열번호 19의 VL; (h) 서열번호 7의 VH 및 서열번호 17의 VL; (i) 서열번호 8의 VH 및 서열번호 18의 VL; 및 (j) 서열번호 10의 VH 및 서열번호 20의 VL. 또 다른 실시양태에서, 항-C5 항체는 산성 pH에서보다 중성 pH에서 더 높은 친화도하에 C5에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 항-C5 항체는 pH 5.8에서보다 pH 7.4에서 더 높은 친화도하에 C5에 결합한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 단리된 항-C5 항체는 다음으로 이루어진 군에서 선택된 특징을 갖는다: (a) 상기 항체는 C5(서열번호 39)의 아미노산 D51 및 K109와 접촉하거나; (b) C5(서열번호 39)에 대한 항체의 친화도가 서열번호 39의 E48A 치환으로 이루어진 C5 돌연변이체에 대한 항체의 친화도보다 크거나; (c) 상기 항체는 pH 7.4에서 서열번호 39의 아미노산 서열로 이루어진 C5 단백질에 결합하지만, pH 7.4에서 H72Y 치환을 갖는 서열번호 39의 아미노산 서열로 이루어진 C5 단백질에는 결합하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 상기 항체는 산성 pH에서보다 중성 pH에서 더 높은 친화도하에 C5에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 항체는 pH 5.8에서보다 pH 7.4에서 더 높은 친화도하에 C5에 결합한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 단리된 항-C5 항체는 C5의 활성화를 억제한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 단리된 항-C5 항체는 C5 변이체 R885H의 활성화를 억제한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 단리된 항-C5 항체는 단일클론 항체이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 단리된 항-C5 항체는 인간, 인간화 또는 키메라 항체이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 단리된 항-C5 항체는 C5에 결합하는 항체 단편이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 단리된 항-C5 항체는 전장 IgG1 또는 IgG4 항체이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 단리된 항-C5 항체는 (a) 아미노산 서열 DX1GYX2X3PTHAMX4X5(여기서, X1은 G 또는 A이고, X2는 V, Q 또는 D이고, X3은 T 또는 Y이고, X4는 Y 또는 H이고, X5는 L 또는 Y이다)(서열번호 128)를 포함하는 HVR-H3, (b) 아미노산 서열 QX1TX2VGSSYGNX3(여기서, X1은 S, C, N 또는 T이고, X2는 F 또는 K이고, X3은 A, T 또는 H이다)(서열번호 131)을 포함하는 HVR-L3, 및 (c) 아미노산 서열 X1IX2TGSGAX3YX4AX5WX6KG(여기서, X1은 C, A 또는 G이고, X2는 Y 또는 F이고, X3은 T, D 또는 E이고, X4는 Y, K 또는 Q이고, X5는 S, D 또는 E이고, X6은 A 또는 V이다)(서열번호 127)를 포함하는 HVR-H2를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 단리된 항-C5 항체는 (a) 아미노산 서열 SSYYX1X2(여기서, X1은 M 또는 V이고, X2는 C 또는 A이다)(서열번호 126)를 포함하는 HVR-H1, (b) 아미노산 서열 X1IX2TGSGAX3YX4AX5WX6KG(여기서, X1은 C, A 또는 G이고, X2는 Y 또는 F이고, X3은 T, D 또는 E이고, X4는 Y, K 또는 Q이고, X5는 S, D 또는 E이고, X6은 A 또는 V이다)(서열번호 127)를 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 아미노산 서열 DX1GYX2X3PTHAMX4X5(여기서, X1은 G 또는 A이고, X2는 V, Q 또는 D이고, X3은 T 또는 Y이고, X4는 Y 또는 H이고, X5는 L 또는 Y이다)(서열번호 128)를 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 항체는 (a) 아미노산 서열 X1ASQX2IX3SX4LA(여기서, X1은 Q 또는 R이고, X2는 N, Q 또는 G이고, X3은 G 또는 S이고, X4는 D, K 또는 S이다)(서열번호 129)를 포함하는 HVR-L1; (b) 아미노산 서열 GASX1X2X3S(여기서, X1은 K, E 또는 T이고, X2는 L 또는 T이고, X3은 A, H, E 또는 Q이다)(서열번호 130)를 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 아미노산 서열 QX1TX2VGSSYGNX3(여기서, X1은 S, C, N 또는 T이고, X2는 F 또는 K이고, X3은 A, T 또는 H이다)(서열번호 131)을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 단리된 항-C5 항체는 (a) 아미노산 서열 X1ASQX2IX3SX4LA(여기서, X1은 Q 또는 R이고, X2는 N, Q 또는 G이고, X3은 G 또는 S이고, X4는 D, K 또는 S이다)(서열번호 129)를 포함하는 HVR-L1; (b) 아미노산 서열 GASX1X2X3S(여기서, X1은 K, E 또는 T이고, X2는 L 또는 T이고, X3은 A, H, E 또는 Q이다)(서열번호 130)를 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 아미노산 서열 QX1TX2VGSSYGNX3(여기서, X1은 S, C, N 또는 T이고, X2는 F 또는 K이고, X3은 A, T 또는 H이다)(서열번호 131)을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 단리된 항-C5 항체는 서열번호 132 내지 134 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 프레임워크 FR1; 서열번호 135 및 136 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 FR2; 서열번호 137 내지 139 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 FR3; 및 서열번호 140 및 141 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 FR4를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 단리된 항-C5 항체는 서열번호 142 및 143 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 프레임워크 FR1; 서열번호 144 및 145 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 FR2; 서열번호 146 및 147 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 FR3; 및 서열번호 148의 아미노산 서열을 포함하는 FR4를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 단리된 항-C5 항체는 (a) 서열번호 10 및 106 내지 110 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VH 서열; (b) 서열번호 20 및 111 내지 113 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VL 서열; 또는 (c) (a)에서의 VH 서열 및 (b)에서의 VL 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호 10 및 106 내지 110 중 어느 하나의 VH 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호 20 및 111 내지 113 중 어느 하나의 VL 서열을 포함한다.
본 발명은 서열번호 10 및 106 내지 110 중 어느 하나의 VH 서열 및 서열번호 20 및 111 내지 113 중 어느 하나의 VL 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 항-C5 항체를 암호화하는 단리된 핵산을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 본 발명은 또한 항체가 생성되도록 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 항체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 항-C5 항체의 제조 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 C5의 베타쇄의 MG1-MG2 도메인(서열번호 43)을 포함하는 폴리펩티드에 대해 동물을 면역화시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 C5의 베타쇄(서열번호 40)의 위치 33 내지 124에서의 아미노산들에 상응하는 영역을 포함하는 폴리펩티드에 대해 동물을 면역화시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 C5의 베타쇄(서열번호 40)의 아미노산 47 내지 57, 70 내지 76 및 107 내지 110으로부터 선택된 1개 이상의 단편을 포함하는 폴리펩티드에 대해 동물을 면역화시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 Glu48, Asp51, His70, His72, Lys109 및 His110으로부터 선택된 1개 이상의 아미노산을 포함하는, C5의 베타쇄(서열번호 40)의 단편을 포함하는 폴리펩티드에 대해 동물을 면역화시키는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 항-C5 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 제형을 제공한다.
본 발명의 항-C5 항체는 약제로서 사용하기 위한 것일 수 있다. 본 발명의 항-C5 항체는 C5의 과도하거나 통제되지 않는 활성화를 수반하는 보체-매개 질환 또는 질병을 치료하는데 사용하기 위한 것일 수 있다. 본 발명의 항-C5 항체는 혈장으로부터 C5의 제거를 증진시키는데 사용하기 위한 것일 수 있다.
본 발명의 항-C5 항체는 약제의 제조에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 약제는 C5의 과도하거나 통제되지 않는 활성화를 수반하는 보체-매개 질환 또는 질병의 치료를 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 상기 약제는 혈장으로부터 C5의 제거를 증진시키기 위한 것이다.
본 발명은 또한 C5의 과도하거나 통제되지 않는 활성화를 수반하는 보체-매개 질환 또는 질병을 갖는 개체를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 치료 효과량의 본 발명의 항-C5 항체를 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 본 발명은 또한 개체에서 혈장으로부터 C5의 제거를 증진시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 혈장으로부터 C5의 제거를 증진시키기에 효과적인 양의 본 발명의 항-C5 항체를 개체에게 투여하는 것을 포함한다.
도 1은 실시예 2.2에 기술된 바와 같이, 항-C5 항체의 에피토프 비닝(epitope binning)을 예시하는 것이다. 동일한 에피토프 빈(epitopte bin)으로 분류된 항체들은 굵은 선으로 상자안에 나타내었다.
도 2a는 실시예 3.2에 기술된 바와 같이, pH-의존성을 평가하기 위한 pH 7.4(실선) 및 pH 5.8(파선)에서의 항-C5 항체들의 비아코어(BIACORE, 등록상표) 센서그램을 예시하는 것이다. CFA0305, CFA0307, CFA0366, CFA0501, CFA0538 및 CFA0599는 실시예 2.2에 기술된 바와 같이, 에피토프 C로 분류된 항체들이다.
도 2b는 실시예 3.2에 기술된 바와 같이, pH-의존성을 평가하기 위한 pH 7.4(실선) 및 pH 5.8(파선)에서의 항-C5 항체들의 비아코어(등록상표) 센서그램을 예시하는 것이다. 실시예 2.2에 기술된 바와 같이, CFA0666, CFA0672 및 CFA0675는 에피토프 A로 분류된 항체들이고, CFA0330 및 CFA0341은 에피토프 B로 분류된 항체들이다. 305LO5는 실시예 2.3에 기술된 바와 같이, CFA0305의 인간화 항체이다.
도 3은 실시예 4.1에 기술된 바와 같이, GST-태그에 융합된 C5 베타쇄-유래 단편들(서열번호 40의 아미노산 19 내지 180, 161 내지 340, 321 내지 500 및 481 내지 660)에 대한 웨스턴 블롯(Western Blot) 분석을 예시하는 것이다. CFA0305, CFA0307, CFA0366, CFA0501, CFA0538, CFA0599, CFA0666, CFA0672 및 CFA0675는 에피토프 C로 분류된 항체들이다. 항-GST 항체는 양성 대조군이다. GST-융합된 C5 단편들(46 내지 49 kDa)의 위치는 화살표로 표시되어 있다.
도 4는 실시예 4.3에 기술된 바와 같이, C5 베타쇄의 MG1-MG2 도메인에 대한 항-C5 항체의 비아코어(등록상표) 센서그램을 예시하는 것이다. 위쪽 패널은 CFA0305(실선), CFA0307(파선), CFA0366(쇄선) 및 에쿨리주맙(점선)의 결과들을 나타낸 것이다. 중간 패널은 CFA0501(실선), CFA0599(파선), CFA0538(쇄선) 및 에쿨리주맙(점선)의 결과들을 나타낸 것이다. 아래쪽 패널은 CFA0666(실선), CFA0672(파선), CFA0675(쇄선) 및 에쿨리주맙(점선)의 결과들을 나타낸 것이다. CFA0305, CFA0307, CFA0366, CFA0501, CFA0538, CFA0599, CFA0666, CFA0672 및 CFA0675는 에피토프 C로 분류된 항체들이다. 에쿨리주맙은 대조군 항-C5 항체이다.
도 5a는 실시예 4.4에 기술된 바와 같이, GST-태그에 융합된 MG1-MG2 도메인-유래 펩티드 단편들(서열번호 40의 아미노산 33 내지 124, 45 내지 124, 52 내지 124, 33 내지 111, 33 내지 108, 및 45 내지 111)에 대한 웨스턴 블롯 분석을 예시하는 것이다. 항-GST 항체는 반응용 항체로 사용된다. GST-융합된 C5 단편(35 내지 37 kDa)의 위치는 화살표로 표시되어 있다.
도 5b는 실시예 4.4에 기술된 바와 같이, GST-태그에 융합된 MG1-MG2 도메인-유래 펩티드 단편들(서열번호 40의 아미노산 33 내지 124, 45 내지 124, 52 내지 124, 33 내지 111, 33 내지 108, 및 45 내지 111)에 대한 웨스턴 블롯 분석을 예시하는 것이다. CFA0305가 반응용 항체로 사용된다.
도 5c는 실시예 4.4에 기술된 바와 같이, C5 베타쇄-유래 단편들에 대한 항-C5 항체들의 결합 반응을 요약한 것이다. 에피토프 C로 분류된 항-C5 항체들(CFA0305, CFA0307, CFA0366, CFA0501, CFA0538, CFA0599, CFA0666, CFA0672, 및 CFA0675)이 결합하는 단편들은 회색으로 나타내었고, 상기 항체들이 결합하지 않는 단편들은 흰색으로 나타내었다.
도 6은 실시예 4.5에 기술된 바와 같이, 베타쇄의 E48, D51 및 K109가 알라닌으로 치환된 C5 점 돌연변이체(각각 E48A, D51A 및 K109A)에 대한 웨스턴 블롯 분석을 예시하는 것이다. 왼쪽 패널에서는, 에쿨리주맙(항-C5 항체, 알파쇄 결합제)이 반응용 항체로 사용되고, C5의 알파쇄(약 113 kDa)의 위치는 화살표로 표시되어 있다. 오른쪽 패널에서는, CFA0305(에피토프 C로 분류됨, 베타쇄 결합제)가 반응용 항체로 사용되고, C5의 베타쇄(약 74kDa)의 위치는 화살표로 표시되어 있다.
도 7은 실시예 4.6에 기술된 바와 같이, 에쿨리주맙-F760G4(위쪽 패널) 또는 305LO5(아래쪽 패널)와 C5 돌연변이체의 상호작용을 보여주는 비아코어(등록상표) 센서그램을 나타낸 것이다. 센서그램은 에쿨리주맙-F760G4 또는 305LO5로 고정화된 센서 표면 위로, C5-wt(굵은 실선 곡선), C5-E48A(짧은-파선 곡선), C5-D51A(긴-파선 곡선), 및 C5-K109A(가는 실선 곡선) 각각의 주입에 의해 수득되었다. 에쿨리주맙은 대조군 항-C5 항체이다. 305LO5는 실시예 2.3에 기술된 바와 같이, CFA0305(에피토프 C로 분류됨)의 인간화 항체이다.
도 8은 실시예 4.7에 기술된 바와 같이, pH-의존성을 평가하기 위한, 305LO5와 C5 His 돌연변이체의 상호작용을 보여주는 비아코어(등록상표) 센서그램을 나타낸 것이다. 센서그램은 305LO5로 고정화된 센서 표면 위로, C5-wt(굵은 실선 곡선), C5-H70Y(긴-파선 곡선), C5-H72Y(짧은-파선 곡선), C5-H110Y(점선 곡선), 및 C5-H70Y+H110Y(가는 실선 곡선) 각각의 주입에 의해 수득되었다. 항체/항원 복합체들은 pH-의존성 상호작용을 평가하기 위해 pH 7.4에서 해리시킨 후에, pH 5.8에서(화살표로 나타냄) 추가로 해리시켰다.
도 9a는 실시예 5.1에 기술된 바와 같이, 항-C5 항체에 의한 보체-활성화된 리포좀 용해의 억제를 예시하는 것이다. 실시에 2.2에 기술된 바와 같이, 에피토프 C로 분류된 CFA0305, CFA0307, CFA0366, CFA0501, CFA0538, CFA0599, CFA0666, CFA0672, 및 CFA0675의 결과를 나타내었다.
도 9b는 실시예 5.1에 기술된 바와 같이, 항-C5 항체에 의한 보체-활성화된 리포좀 용해의 억제를 예시하는 것이다. 실시예 2.2에 기술된 바와 같이, 에피토프 B로 분류된 항체 CFA0330 및 CFA0341의 결과를 나타내었다.
도 10a는 실시예 5.2에 기술된 바와 같이, 항-C5 항체에 의한 C5a 생성의 억제를 예시하는 것이다. C5a 농도는 도 9a에 기술된 리포좀 용해 분석시 수득된 상등액에서 정량화하였다.
도 10b는 실시예 5.2에 기술된 바와 같이, 항-C5 항체에 의한 C5a 생성의 억제를 예시하는 것이다. C5a 농도는 도 9b에 기술된 리포좀 용해 분석시 수득된 상등액에서 정량화하였다.
도 11은 실시예 5.3에 기술된 바와 같이, 항-C5 항체에 의한 보체-활성화된 용혈의 억제를 예시하는 것이다. 보체는 고전적 경로를 통해 활성화되었다.
도 12는 실시예 5.4에 기술된 바와 같이, 항-C5 항체에 의한 보체-활성화된 용혈의 억제를 예시하는 것이다. 보체는 대체 경로를 통해 활성화되었다.
도 13은 실시예 6.2에 기술된 바와 같이, C5 제거를 평가하는 마우스에서 인간 C5 단독 또는 인간 C5 및 항-인간 C5 항체의 정맥내 투여후 혈장내 인간 C5 농도의 시간 경과를 예시하는 것이다. 실시예 2.2에 기술된 바와 같이, CFA0305, CFA0307, CFA0366, CFA0501, CFA0538, CFA0599, CFA0666, CFA0672, 및 CFA0675는 에피토프 C로 분류된 항체들이고, CFA0330 및 CFA0341은 에피토프 B로 분류된 항체이다.
도 14는 실시예 6.3에 기술된 바와 같이, 항체 약동학을 평가하는 마우스에서 인간 C5 및 항-인간 C5 항체의 정맥내 투여후 혈장내 항-인간 C5 항체 농도의 시간 경과를 예시하는 것이다. 실시예 2.2에 기술된 바와 같이, CFA0305, CFA0307, CFA0366, CFA0501, CFA0538, CFA0599, CFA0666, CFA0672, 및 CFA0675는 에피토프 C로 분류된 항체들이고, CFA0330 및 CFA0341은 에피토프 B로 분류된 항체들이다.
도 15는 실시예 9.1에 기술된 바와 같이, 항-C5 항체에 의한 보체-활성화된 리포좀 용해의 억제를 예시하는 것이다. 항체 305LO15-SG422, 305LO16-SG422, 305LO18-SG422, 305LO19-SG422, 305LO20-SG422, 및 305LO20-SG115의 결과를 나타내었다.
도 16은 실시예 9.1에 기술된 바와 같이, 항-C5 항체에 의한 보체-활성화된 리포좀 용해의 억제를 예시하는 것이다. 항체 305LO15-SG115 및 305LO23-SG429의 결과를 나타내었다.
도 17은 실시예 9.1에 기술된 바와 같이, 항-C5 항체에 의한 보체-활성화된 리포좀 용해의 억제를 예시하는 것이다. 항체 305LO22-SG115, 305LO22-SG422, 305LO23-SG115, 및 305LO23-SG422의 결과를 나타내었다.
도 18은 실시예 9.2에 기술된 바와 같이, 항-C5 항체에 의한 C5a 생성의 억제를 예시하는 것이다. C5a 농도는 도 15에 기술된 리포좀 용해 분석시 수득된 상등액 중에서 정량화되었다.
도 19는 실시예 9.2에 기술된 바와 같이, 항-C5 항체에 의한 C5a 생성의 억제를 예시하는 것이다. C5a 농도는 도 16에 기술된 리포좀 용해 분석시 수득된 상등액 중에서 정량화되었다.
도 20은 실시예 9.3에 기술된 바와 같이, 항-C5 항체에 의한 원숭이 혈장에서의 보체 활성의 억제를 예시하는 것이다. 항-C5 항체를 사이노몰구스(cynomolgus) 원숭이에게 투여하였으며, 원숭이의 혈장내에서의 보체 활성을 용혈 분석에서 측정하였다.
도 21은 실시예 9.4에 기술된 바와 같이, 항-C5 항체(에쿨리주맙)에 의한 야생형 C5(WT) 및 C5 변이체(V145I, R449G, V802I, R885H, R928Q, D966Y, S1310N, 및 E1437D)의 생물 활성의 억제를 예시하는 것이다.
도 22는 실시예 9.4에 기술된 바와 같이, 항-C5 항체(305 변이체)에 의한 야생형 C5(WT) 및 C5 변이체(V145I, R449G, V802I, R885H, R928Q, D966Y, S1310N, 및 E1437D)의 생물 활성의 억제를 예시하는 것이다.
도 23은 실시예 9.5에 기술된 바와 같이, 항-C5 항체(BNJ441 및 305 변이체)에 의한 보체-활성화된 리포좀 용혈의 억제를 예시하는 것이다.
도 24는 실시예 10.2에 기술된 바와 같이, C5 제거를 평가하는 사이노몰구스 원숭이에서 항-인간 C5 항체의 정맥내 투여후 혈장내 사이노몰구스 C5 농도의 시간 경과를 예시하는 것이다.
도 25는 실시예 10.3에 기술된 바와 같이, 항체 약동학을 평가하는 사이노몰구스 원숭이에서 항-인간 C5 항체의 정맥내 투여후 혈장내 항-인간 C5 농도의 시간 경과를 예시하는 것이다.
도 26a 및 26b는 실시예 11.6에 기술된 바와 같이, 인간 C5(hC5)-MG1 도메인에 결합된 305 Fab의 결정 구조를 예시하는 것이다. 도 26a는 비대칭 단위를 예시한다. MG1은 표면으로 표현되어 있고 305 Fab는 리본으로 도시되어 있다(진한 회색: 중쇄, 연한 회색: 경쇄). 도 26b는 겹쳐진 분자 1 및 2를 예시하는 것이다(진한 회색: 분자 1, 연한 회색: 분자 2).
도 27a는 실시예 11.6에 기술된 바와 같이, MG1 도메인 상의 305 Fab 접촉 영역의 에피토프를 예시하는 것이다. 도 27a는 MG1 아미노산 서열내 에피토프 맵핑을 예시하는 것이다(진한 회색: 3.0 Å(s)보다 가까움, 연한 회색: 4.5 Å(s)보다 가까움).
도 27b는 실시예 11.6에 기술된 바와 같이, MG1 도메인 상의 305 Fab 접촉 영역의 에피토프를 예시하는 것이다. 도 27b는 결정 구조내 에피토프 맵핑을 예시하는 것이다(진한 회색 구: 3.0 Å(s)보다 가까움, 연한 회색 막대: 4.5 Å(s)보다 가까움).
도 28a는 실시예 11.7에 기술된 바와 같이, E48, D51 및 K109(막대로 나타냄)와 305 Fab(표면으로 나타냄)의 상호작용의 확대도를 예시하는 것이다.
도 28b는 실시예 11.7에 기술된 바와 같이, E48과 그 환경 사이의 상호작용(진한 회색 점선: Fab와의 수소 결합, 연한 회색 점선: 수-매개 수소 결합)을 예시하는 것이다.
도 28c는 실시예 11.7에 기술된 바와 같이, D51과 그 환경 사이의 상호작용(진한 회색 점선: Fab와의 수소 결합)을 예시하는 것이다.
도 28d는 실시예 11.7에 기술된 바와 같이, K109와 그 환경 사이의 상호작용(진한 회색 점선: Fab와의 수소 결합, 연한 회색 점선: H-CDR3_D95와의 염 가교)을 예시하는 것이다.
도 29a는 도 28a와 동일한 배향으로, 실시예 11.8에 기술된 바와 같이, H70, H72 및 H110(막대로 나타냄)과 305 Fab(표면으로 나타냄)의 상호작용의 확대도를 예시하는 것이다.
도 29b는 실시예 11.8에 기술된 바와 같이, H70과 그 환경 사이의 상호작용을 예시하는 것이다. 상기 히스티딘 잔기는 막대 및 그물망으로 도시되어 있다. 수소 결합은 점선으로 나타내었다.
도 29c는 실시예 11.8에 기술된 바와 같이, H72와 그 환경 사이의 상호작용을 예시하는 것이다. 상기 히스티딘 잔기는 막대 및 그물망으로 나타내었다. 수소 결합은 점선으로 나타내었다.
도 29d는 실시예 11.8에 기술된 바와 같이, H110과 그 환경 사이의 상호작용을 예시하는 것이다. 상기 히스티딘 잔기는 막대 및 그물망으로 나타내었다. H110과 H-CDR3_H100c 사이의 거리는 점선으로 나타내었다.
본원에서 기술되거나 참조된 기술 및 절차들은 일반적으로 잘 인지되어 있으며, 예를 들면, 하기 문헌들에 기술된 널리 사용되는 방법과 같이, 당해 분야에 숙련된 자들에 의해 통상적인 방법을 이용하여 통상적으로 사용된다: 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3d edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., (2003)); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1987)); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney), ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); and Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993)].
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속한 분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 문헌 [Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994), and March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4th ed., John Wiley & Sons (New York, N.Y. 1992)]은 당해 분야에 숙련된 자에게 본원에서 사용된 용어들 중 대다수에 대한 일반적인 지침을 제공한다. 특허 출원 및 공개를 포함하여 본원에서 인용된 모든 참조문헌들은 전체로 참고로 인용된다.
본 명세서를 이해하기 위해, 하기의 정의들이 적용될 것이며, 적절하기만 하면, 단수형으로 사용된 용어들은 또한 복수형을 포함할 것이며, 그 반대도 마찬가지이다. 본원에서 사용된 용어는 특정한 실시양태들을 기술하기 위한 것일 뿐이며, 제한하려는 것이 아님을 이해해야 한다. 하기에 나타낸 임의의 정의가 본원에 참고로 인용된 임의의 문서와 모순되는 경우, 하기에 나타낸 정의는 조정되어야 한다.
본원의 경우 "수용체(acceptor) 인간 프레임워크"는, 하기에 정의되는 바와 같은 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크로부터 유래된 경쇄 가변 도메인(VL) 프레임워크 또는 중쇄 가변 도메인(VH) 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크"로부터 유래된" 수용체 인간 프레임워크는 그의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 상기 프레임워크는 아미노산 서열 변화를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 아미노산 변화의 수는 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하 또는 2개 이하이다. 일부 실시양태에서, VL 수용체 인간 프레임워크는 VL 인간 면역글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 공통 프레임워크 서열과 서열이 동일하다.
"친화도"는 분자(예, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 상대(예, 항원) 사이의 비공유적 상호작용의 총합의 강도를 말한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에서 사용된 바와 같이, "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원들(예를 들면, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 말한다. 분자 X의 그 상대 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수(Kd)로 나타낼 수 있다. 친화도는 본원에 기술된 것을 포함하여 당해 분야에 공지된 통상적인 방법들에 의해 측정할 수 있다. 친화도를 측정하기 위한 특정한 예시적이고 대표적인 실시양태들이 하기에서 기술된다.
"친화도 증진된" 항체는, 항원에 대한 항체의 친화도에 개선을 야기하는 변이를 갖지 않는 모 항체에 비해, 하나 이상의 초가변 영역(HVR)에 하나 이상의 변이를 갖는 항체를 말한다.
용어 "항-C5 항체" 및 "C5에 결합하는 항체"는, 항체가 C5를 표적화하는데 있어 진단 및/또는 치료제로서 유용하도록 하는 충분한 친화도하에 C5에 결합할 수 있는 항체를 말한다. 한 실시양태에서, 무관한 비-C5 단백질에 대한 항-C5 항체의 결합 정도는, 예를 들면, 방사성면역분석법(radioimmunoassay, RIA)으로 측정시 C5에 결합하는 항체의 약 10% 미만이다. 특정한 실시양태에서, C5에 결합하는 항체는 1 μM 이하, 100 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하, 0.1 nM 이하, 0.01 nM 이하, 또는 0.001 nM 이하(예를 들면, 10-8 M 이하, 예를 들면, 10-8 내지 10-13 M, 예를 들면, 10-9 내지 10-13 M)의 해리 상수(Kd)를 갖는다. 특정 실시양태에서, 항-C5 항체는 상이한 종들로부터의 C5 중에서 보존되는 C5의 에피토프에 결합한다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 광의로 사용되며, 단일클론 항체, 다중클론 항체, 다중특이성 항체(예를 들면, 이중특이성 항체), 및 목적하는 항원-결합 활성을 나타내는 경우의 항체 단편을 포함하여(이로 한정되지는 않는다), 다양한 항체 구조물을 포함한다.
"항체 단편"은 온전한(intact) 항체가 결합하는 항원과 결합하는 온전한 항체의 일부분을 포함하는 온전한 항체 이외의 다른 분자를 말한다. 항체 단편의 예로는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디(diabody); 선형 항체; 단일쇄 항체 분자(예, scFv); 및 항체 단편으로부터 생성된 다중특이성 항체가 포함되나 이로 한정되지는 않는다.
기준 항체와 "동일 에피토프에 결합하는 항체"는 경쟁 분석법에서 그 항원에 대한 기준 항체의 결합을 차단하는 항체를 말하며, 기준 항체는 경쟁 분석법에서 그 항원에 대한 항체의 결합을 차단한다. 대표적인 경쟁 분석법이 본원에 제공되어 있다.
용어 "키메라" 항체는, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 공급원 또는 종으로부터 유래되는 반면, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지 부분은 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래되는 항체를 말한다.
항체의 "부류"는 그 중쇄가 갖는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 말한다. 항체의 5개 주요 부류: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하며, 이들 중 여러개가 하위부류(이소타입(isotype)), 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 더 분류될 수 있다. 면역글로불린의 상이한 부류에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로 불린다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "세포독성 약제"는 세포 기능을 억제하거나 방해하고/하거나 세포 사멸 또는 파괴를 야기하는 물질을 말한다. 세포독성 약제로는 방사성 동위원소(예를 들면, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212, 및 Lu의 방사성 동위원소); 화학치료제 또는 화학치료 약물(예를 들면, 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 빈카 알칼로이드(빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 다른 인터칼레이트화제); 성장 억제제; 효소 및 그의 단편, 예를 들어, 핵산분해 효소; 항생물질; 그의 단편 및/또는 변이체를 포함하여, 독소, 예를 들어, 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 소분자 독소 또는 효소적으로 활성인 독소; 및 하기에 개시되는 다양한 항종양제 또는 항암제가 포함된다.
"효과기(effector) 기능"은 항체 이소타입에 따라 달라지는, 항체의 Fc 영역에 기인하는 생물 활성을 말한다. 항체 효과기 기능의 예로는 다음이 포함된다: C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성(CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC); 식균작용; 세포 표면 수용체(예, B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화.
약제, 예를 들면, 약학 제형의 "효과량"은 목적하는 치료 또는 예방 결과를 달성하기 위해 필요한 투여량으로 및 필요한 시간동안 효과적인 양을 말한다.
용어 "에피토프"는 항체에 의해 결합될 수 있는 임의의 결정인자(determinant)를 포함한다. 에피토프는 항원을 표적화하는 항체에 의해 결합되는 항원의 영역이며, 항체와 직접 접촉하는 특정 아미노산들을 포함한다. 에피토프 결정인자는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 또는 설포닐 기와 같은 분자들의 화학적으로 활성인 표면 기들을 포함할 수 있고, 특정한 3차원적 구조 특징 및/또는 특정한 전하 특징을 가질 수 있다. 일반적으로, 특정 표적 항원에 특이적인 항체는 단백질 및/또는 거대분자의 복합체 혼합물 중에서 표적 항원 상의 에피토프를 우선적으로 인식할 것이다.
용어 "Fc 영역"은 본원에서 불변 영역의 적어도 일부분을 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 사용된다. 상기 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226으로부터, 또는 Pro230으로부터 중쇄의 카복실-말단까지 이어진다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 라이신(Lys447) 또는 글리신-라이신(잔기 446 내지 447)은 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 본원에서 달리 명시되지 않는 한, Fc 영역 또는 불변 영역중 아미노산 잔기의 번호는, 문헌 [Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD 1991]에 기술된 바와 같이, EU 인덱스로도 불리는 EU 번호 체계에 따른다.
"프레임워크" 또는 "FR"은 초가변 영역(HVR) 잔기 이외의 다른 가변 도메인 잔기를 말한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인: FR1, FR2, FR3 및 FR4로 이루어진다. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH(또는 VL)에서 다음의 순서로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
용어 "전장 항체", "온전한 항체" 및 "전항체(whole antibody)"는 본원에서 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 가지거나 본원에 정의된 바와 같은 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 언급하기 위해 상호교환적으로 사용된다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"은 상호교환적으로 사용되며, 상기 세포들의 자손을 포함하여, 외인성 핵산이 도입된 세포를 말한다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환 세포"를 포함하며, 이들은 1차 형질전환된 세포, 및 계대 수에 관계없이 그로부터 유도된 자손을 포함한다. 자손은 핵산 함량에 있어서 모 세포와 완전히 동일하지 않을 수 있으며, 돌연변이를 함유할 수 있다. 원래 형질전환된 세포에서 선별되거나 선택된 바와 동일한 기능 또는 생물 활성을 갖는 돌연변이 자손이 본 발명에 포함된다.
"인간 항체"는, 인간 또는 인간 세포에 의해 생성되거나 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-암호화 서열을 사용하는 비-인간 공급원으로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 항체이다. 인간 항체의 상기 정의는 특히 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 배제한다.
"인간 공통 프레임워크"는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택에서 가장 흔히 존재하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은 가변 도메인 서열의 아군(subgroup)으로부터 이루어진다. 일반적으로, 서열의 상기 아군은 문헌 [Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3]에서와 같은 아군이다. 한 실시양태에서, VL의 경우, 상기 아군은 상기 카밧 등(Kabat et al.)의 문헌에서와 같은 아군 카파 I이다. 한 실시양태에서, VH의 경우, 상기 아군은 상기 카밧 등의 문헌에서와 같은 아군 III이다.
"인간화" 항체는 비-인간 HVR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 말한다. 특정 실시양태에서, 인간화 항체는 하나 이상, 및 전형적으로는 2개의 가변 도메인의 실질적으로 전부를 포함할 것이며, 여기서 HVR(예를 들면, CDR)의 전부 또는 거의 전부는 비-인간 항체에 상응하고, FR의 전부 또는 거의 전부는 인간 항체에 상응한다. 인간화 항체는 선택적으로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부분을 포함할 수 있다. 항체, 예를 들면, 비-인간 항체의 "인간화 형태"는 인간화가 일어난 항체를 말한다.
용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은, 본원에서 사용된 바와 같이, 서열에 있어서 초가변성("상보성 결정 영역" 또는 "CDR")이고/이거나 구조적으로 한정된 루프("초가변 루프")를 형성하고/하거나 항원-접촉 잔기("항원 접촉부")를 함유하는 항체 가변 도메인의 영역들 각각을 말한다. 일반적으로, 항체는 6개의 HVR: VH에 3개(H1, H2, H3) 및 VL에 3개(L1, L2, L3)를 포함한다. 본원에서 대표적인 HVR은 다음을 포함한다: (a) 아미노산 잔기 26-32(L1), 50-52(L2), 91-96(L3), 26-32(H1), 53-55(H2), 및 96-101(H3)에 존재하는 초가변 루프(문헌 [Chothia, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]); (b) 아미노산 잔기 24-34(L1), 50-56(L2), 89-97(L3), 31-35b(H1), 50-65(H2), 및 95-102(H3)에 존재하는 CDR(문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, NIH, Bethesda, MD (1991)]); (c) 아미노산 잔기 27c-36(L1), 46-55(L2), 89-96(L3), 30-35b(H1), 47-58(H2), 및 93-101(H3)에 존재하는 항원 접촉잔기(문헌 [MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)]); 및 (d) HVR 아미노산 잔기 46-56(L2), 47-56(L2), 48-56(L2), 49-56(L2), 26-35(H1), 26-35b(H1), 49-65(H2), 93-102(H3), 및 94-102(H3)을 포함하는, (a), (b) 및/또는 (c)의 조합.
달리 나타내지 않는 한, HVR 잔기, 및 가변 도메인내 다른 잔기들(예를 들면, FR 잔기)은 본원에서 상기 카밧 등의 문헌에 따라 번호가 붙여진다.
"면역접합체"는 세포독성 약제를 포함하나 이로 한정되지는 않는 하나 이상의 이종 분자(들)에 접합된 항체이다.
"개체" 또는 "대상"은 포유동물이다. 포유동물로는 가축(예, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류(예, 인간 및 비-인간 영장류, 예를 들어, 원숭이), 토끼 및 설치류(예, 마우스 및 래트)가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 개체 또는 대상은 인간이다.
"단리된" 항체는 그 천연 환경의 성분으로부터 분리된 것이다. 일부 실시양태에서, 항체는, 예를 들면, 전기영동(예를 들면, SDS-PAGE, 등전 초점(IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피(예를 들면, 이온 교환 또는 역상 HPLC) 방법에 의해 측정시, 95% 또는 99%보다 더 큰 순도로 정제된다. 항체 순도의 평가 방법에 대한 검토를 위해서는, 예를 들면, 문헌 [Flatman et al, J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)]을 참조하시오.
"단리된" 핵산은 그의 천연 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 말한다. 단리된 핵산은, 통상적으로 핵산 분자를 함유하는 세포에 함유된 핵산 분자를 포함하지만, 상기 핵산 분자는 염색체외에 또는 그의 천연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다.
"항-C5 항체를 암호화하는 단리된 핵산"은, 단일 벡터 또는 별개 벡터들 내의 핵산 분자(들) 및 숙주 세포내 하나 이상의 위치에 존재하는 상기 핵산 분자(들)를 포함하여, 항체 중쇄 및 경쇄(또는 그의 단편)를 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자를 말한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "단일클론 항체"는 실질적으로 동종 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 말한다. 즉, 상기 집단을 이루는 개개 항체들은, 예를 들면, 천연 돌연변이를 함유하거나 단일클론 항체 제제의 제조시 발생하는 가능한 변이체 항체(상기 변이체는 일반적으로 미량으로 존재한다)를 제외하고, 동일하고/하거나, 동일 에피토프에 결합한다. 전형적으로 상이한 결정인자(에피토프)에 대해 유도된 상이한 항체들을 포함하는 다중클론 항체 제제와 대조적으로, 단일클론 항체 제제의 각각의 단일클론 항체는 항원상의 단일 결정인자에 대해 유도된다. 따라서, 수식어 "단일클론"은 항체의 실질적으로 동종 집단으로부터 수득된 것으로서의 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 제조를 필요로 하는 것으로 이해하지 않아야 한다. 예를 들면, 본 발명에 따라 사용될 단일클론 항체는, 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법, 및 인간 면역글로불린 유전자좌 전체 또는 일부를 함유하는 유전자이식 동물을 이용하는 방법을 포함하여(이로 한정되지는 않는다) 다양한 기술에 의해 제조될 수 있으며, 단일클론 항체를 제조하기 위한 상기 방법 및 다른 대표적인 방법들이 본원에 기술되어 있다.
"네이키드(naked) 항체"는 이종 잔기(예를 들면, 세포독성 잔기) 또는 방사성표지에 접합되지 않는 항체를 말한다. 네이키드 항체는 약학 제형중에 존재할 수 있다.
"천연(native) 항체"는 다양한 구조를 갖는 천연 면역글로불린 분자를 말한다. 예를 들면, 천연 IgG 항체는 다이설파이드-결합된 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 이루어진, 약 150,000 달톤의 헤테로사량체성 당단백질이다. N-말단으로부터 C-말단까지, 각각의 중쇄는 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인으로도 불리는 가변 영역(VH)에 이어, 3개의 불변 도메인(CH1, CH2 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N-말단으로부터 C-말단까지, 각각의 경쇄는 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로도 불리는 가변 영역(VL)에 이어, 불변 경쇄(CL) 도메인을 갖는다. 항체의 경쇄는, 그 불변 도메인의 아미노산 서열에 근거하여, 카파(κ) 및 람다(λ)로 불리는 2개 유형 중 하나로 지정될 수 있다.
용어 "패키지 삽입물"은 치료 제품의 적응증, 사용법, 투여량, 투여법, 병용 치료, 금기사항 및/또는 사용에 관한 주의사항에 대한 정보를 포함하는, 치료 제품의 상업적 패키지에 통상적으로 포함되는 설명서를 말하기 위해 사용된다.
기준 폴리펩티드 서열과 관련하여 "퍼센트(%) 아미노산 서열 동일성"은, 필요한 경우, 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해, 서열을 정렬하고 갭(gap)을 도입한 후, 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로 간주하지 않고, 기준 폴리펩티드 서열중의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열내 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은, 예를 들면, BLAST, BLAST-2, ALIGN, 메갈린(Megalign)(DNASTAR) 소프트웨어, 또는 GENETYX(등록상표)(제네틱스 캄파니 리미티드(Genetyx Co., Ltd.))와 같은 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 이용하여, 당해 분야의 기술에 속하는 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 당해 분야에 숙련된 자라면, 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 서열을 정렬하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크 인코포레이티드(Genentech, Inc.)에 의해 제작되었으며, 소스 코드는 미국 워싱턴 D.C. 20559의 미국 저작권청(U.S. Copyright Office)에 사용자 문서와 함께 제출되었으며, 여기에 미국 저작권 등록 번호(U.S. Copyright Registration No.) TXU510087로 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코의 제넨테크 인코포레이티드로부터 공개적으로 이용가능하거나, 소스 코드로부터 컴파일링될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 포함하여, UNIX 운영 체계상에서 사용하기 위해 컴파일링되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되며 변하지 않는다.
ALIGN-2가 아미노산 서열 비교에 사용되는 상황에서, 주어진 아미노산 서열 B에 대해, 그와 비교해 또는 그에 대비해, 주어진 아미노산 서열 A의 % 아미노산 서열 동일성(양자택일적으로, 주어진 아미노산 서열 B에 대해, 그와 비교해 또는 그에 대비해 특정 % 아미노산 서열 동일성을 가지거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로서 표현될 수 있다)은 다음과 같이 산출된다: 100 x 분수 X/Y. 여기서, X는 A와 B의 상기 프로그램의 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일한 매치로 평가된 아미노산 잔기의 수이며, Y는 B 중의 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, B에 대한 A의 % 아미노산 서열 동일성은 A에 대한 B의 % 아미노산 서열 동일성과 같지 않을 것임을 인지할 것이다. 특별히 달리 언급하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 % 아미노산 서열 동일성 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 바로 앞 단락에서 기술한 바와 같이 수득된다.
용어 "약학 제형"은 그에 함유된 활성 성분의 생물 활성이 효과적이 되게 하기 위한 형태이면서, 제형이 투여될 대상에게 허용될 수 없을 정도로 독성인 추가 성분을 함유하지 않는 제제를 말한다.
"약학적으로 허용되는 담체"는 대상에게 무독성인, 활성 성분 이외의 다른, 약학 제형중의 성분을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 완충제, 부형제, 안정화제 또는 보존제가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다.
용어 "C5"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 영장류(예를 들면, 인간 및 원숭이) 및 설치류(예를 들면, 마우스 및 래트)와 같은 포유동물을 포함한 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 천연 C5를 포함한다. 달리 나타내지 않는 한, 용어 "C5"는 서열번호 39에 나타낸 아미노산 서열을 가지고 서열번호 40에 나타낸 베타쇄 서열을 함유하는 인간 C5 단백질을 말한다. 상기 용어는 "전장"의, 처리되지 않는 C5뿐 아니라, 세포에서의 처리로부터 야기되는 C5의 임의의 형태를 포함한다. 상기 용어는 또한 C5의 천연 변이체, 예를 들면, 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다. 대표적인 인간 C5의 아미노산 서열은 서열번호 39("야생형" 또는 "WT" C5)에 나타내었다. 인간 C5의 대표적인 베타쇄의 아미노산 서열은 서열번호 40에 나타내었다. 인간 C5의 베타쇄의 대표적인 MG1, MG2 및 MG1-MG2 도메인의 아미노산 서열들은 각각 서열번호 41, 42 및 43에 나타내었다. 대표적인 사이노몰구스 원숭이 및 뮤린 C5의 아미노산 서열들은 각각 서열번호 44 및 105에 나타내었다. 서열번호 39, 40, 43, 44 및 105의 아미노산 잔기 1 내지 19는 세포에서의 처리시 제거되어 상응하는 대표적인 아미노산 서열로부터 빠져 있는 신호 서열에 상응한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "치료"(및 "치료하다" 또는 "치료하는"과 같은 그의 문법적 변형)는 치료되는 개체의 자연적 과정을 변화시키기 위한 시도의 임상적 개입을 말하며, 예방을 위해 또는 임상 병리 과정동안 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과는 질환의 발생 또는 재발 방지, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접 또는 간접적 병리학적 결과의 경감, 전이 방지, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 관해 또는 개선된 예후를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 질환의 진전을 지연시키거나 질환의 진행을 늦추기 위해 사용된다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체를 항원에 결합시키는데 수반되는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 말한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인(각각 VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 이때 각각의 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역(FR) 및 3개의 초가변 영역(HVR)을 포함한다(예를 들면, 문헌 [Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)] 참조). 단일 VH 또는 VL 도메인이면 항원-결합 특이성을 제공하기에 충분할 수 있다. 또한, 특정 항원에 결합하는 항체는, 상보성 VL 또는 VH 도메인 각각의 라이브리러를 검색하기 위해, 상기 항원에 결합하는 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 이용하여 단리될 수 있다(예를 들면, 문헌 [Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991)] 참조).
용어 "벡터"는, 본원에서 사용되는 바와 같이, 연결되는 다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 말한다. 상기 용어는 자가-복제 핵산 구조물로서의 벡터 뿐 아니라 그것이 도입된 숙주 세포의 게놈내에 혼입된 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 그들이 작용가능하게 연결되는 핵산의 발현을 유도할 수 있다. 상기 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다.
조성물 및 방법
한 태양에서, 본 발명은, 부분적으로, 항-C5 항체 및 그의 용도를 기초로 한다. 특정 실시양태에서, C5에 결합하는 항체가 제공된다. 본 발명의 항체는, 예를 들면, C5의 과도하거나 통제되지 않는 활성화를 수반하는 보체-매개 질환 또는 질병의 진단 또는 치료에 유용하다.
A. 대표적인 항-C5 항체
한 태양에서, 본 발명은 C5에 결합하는 단리된 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 항-C5 항체는 C5의 베타쇄 내의 에피토프에 결합한다. 특정 실시양태에서, 상기 항-C5 항체는 C5의 베타쇄의 MG1-MG2 도메인 내의 에피토프에 결합한다. 특정 실시양태에서, 상기 항-C5 항체는 C5의 베타쇄의 아미노산 19 내지 180으로 이루어진 단편내의 에피토프에 결합한다. 특정 실시양태에서, 상기 항-C5 항체는 C5의 베타쇄의 MG1 도메인(서열번호 40의 아미노산 20 내지 124(서열번호 41)) 내의 에피토프에 결합한다. 특정 실시양태에서, 상기 항-C5 항체는 C5의 베타쇄(서열번호 40)의 아미노산 33 내지 124로 이루어진 단편 내의 에피토프에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 항체는 C5의 베타쇄의 아미노산 33 내지 124로 이루어진 단편보다 더 짧은 단편, 예를 들면, C5의 베타쇄(서열번호 40)의 아미노산 45 내지 124, 52 내지 124, 33 내지 111, 33 내지 108 또는 45 내지 111로 이루어진 단편에는 결합하지 않는다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 pH-의존성 결합 특성을 나타내는 항-C5 항체를 제공한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "pH-의존성 결합"이란 표현은 항체가 "중성 pH에서의 그의 결합에 비해 산성 pH에서 C5에 감소된 결합"을 나타내는 것을 의미한다(본 개시내용의 경우, 두가지 표현 모두 상호교환적으로 사용될 수 있다). 예를 들면, "pH-의존성 결합 특성을 갖는" 항체는 산성 pH에서보다 중성 pH에서 더 높은 친화도하에 C5에 결합하는 항체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 산성 pH에서보다 중성 pH에서 적어도 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 배 이상 더 높은 친화도하에 C5에 결합한다. 일부 실시양태에서, 상기 항체는 pH 5.8에서보다 pH 7.4에서 더 높은 친화도하에 C5에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 pH 5.8에서보다 pH 7.4에서 적어도 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 배 이상 더 높은 친화도하에 C5에 결합한다.
본 개시내용에 있어서, C5에 대한 항체의 "친화도"는 항체의 KD의 항으로 표현된다. 항체의 KD는 항체-항원 상호작용의 평형 해리 상수를 말한다. 항원에 대한 항체 결합에 있어서 KD 값이 클수록, 상기 특정 항원에 대해 그의 결합 친화도는 더 약하다. 따라서, 본원에서 사용된 바와 같이, "산성 pH에서보다 중성 pH에서 더 높은 친화도"(또는 등가의 표현 "pH-의존성 결합")란 표현은 산성 pH에서 C5에 대한 항체 결합에 대한 KD가 중성 pH에서 C5에 대한 항체 결합에 대한 KD보다 더 큰 것을 의미한다. 예를 들면, 본 발명의 맥락에서, 항체는, 산성 pH에서 C5에 대한 항체 결합의 KD가 중성 pH에서 C5에 대한 항체 결합의 KD보다 2배 이상 더 큰 경우, 산성 pH에서보다 중성 pH에서 더 높은 친화도하에 C5에 결합하는 것으로 간주된다. 따라서, 본 발명은 중성 pH에서 C5에 대한 항체 결합의 KD보다 적어도 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 배 이상 더 큰 KD하에 산성 pH에서 C5에 결합하는 항체를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 중성 pH에서의 항체의 KD 값은 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M, 10-12 M 이하일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 산성 pH에서의 항체의 KD 값은 10-9 M, 10-8 M, 10-7 M, 10-6 M 이상일 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 항체는, pH 5.8에서 C5에 대한 항체 결합의 KD가 pH 7.4에서 C5에 대한 항체 결합의 KD보다 2배 이상 더 큰 경우, 산성 pH에서보다 중성 pH에서 더 높은 친화도하에 C5에 결합하는 것으로 간주된다. 일부 실시양태에서, 제공된 항체는 pH 7.4에서 C5에 대한 항체 결합의 KD보다 적어도 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 배 이상 더 큰 KD 하에 pH 5.8에서 C5에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, pH 7.4에서 항체의 KD 값은 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M, 10-12 M 이하일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, pH 5.8에서의 항체의 KD 값은 10-9 M, 10-8 M, 10-7 M, 10-6 M 이상일 수 있다.
특정 항원에 대한 항체의 결합 성질은 또한 항체의 kd의 항으로 표현될 수 있다. 항체의 kd는 특정 항원과 관련한 항체의 해리 속도 상수를 말하며 초의 역수(즉, 초- 1)의 항으로 나타낸다. kd 값의 증가는 그 항원에 대한 항체의 더 약한 결합을 의미한다. 그러므로, 본 발명은 중성 pH에서보다 산성 pH에서 더 높은 kd 값 하에 C5에 결합하는 항체를 포함한다. 본 발명은 중성 pH에서 C5에 대한 항체 결합의 kd보다 적어도 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 배 이상 더 큰 kd 하에 산성 pH에서 C5에 결합하는 항체를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 중성 pH에서의 항체의 kd 값은 10-2 1/s, 10-3 1/s, 10-4 1/s, 10-5 1/s, 10-6 1/s 이하일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 산성 pH에서의 항체의 kd 값은 10-3 1/s, 10-2 1/s, 10-1 1/s 이상일 수 있다. 본 발명은 또한 pH 7.4에서보다 pH 5.8에서 더 높은 kd 값 하에 C5에 결합하는 항체를 포함한다. 본 발명은 pH 7.4에서 C5에 대한 항체 결합의 kd보다 적어도 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 배 이상 더 큰 kd 하에 pH 5.8에서 C5에 결합하는 항체를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, pH 7.4에서의 항체의 kd 값은 10-2 1/s, 10-3 1/s, 10-4 1/s, 10-5 1/s, 10-6 1/s 이하일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, pH 5.8에서의 항체의 kd 값은 10-3 1/s, 10-2 1/s, 10-1 1/s 이상일 수 있다.
특정한 경우에서, "중성 pH에서의 그의 결합에 비해 산성 pH에서 C5에 대한 감소된 결합"은 산성 pH에서의 C5에 대한 항체 결합의 KD 값 대 중성 pH에서 C5에 대한 항체 결합의 KD 값의 비(또는 그 반대도 가능)의 항으로 나타낸다. 예를 들면, 본 발명에 있어서, 항체가 2 이상의 산성/중성 KD 비를 나타내는 경우, 상기 항체는 "중성 pH에서의 그의 결합에 비해 산성 pH에서 C5에 대한 감소된 결합"을 나타내는 것으로 간주될 수 있다. 특정한 예시적 실시양태에서, 본 발명의 항체에 대한 pH 5.8/pH 7.4 KD 비는 2 이상이다. 특정한 예시적 실시양태에서, 본 발명의 항체에 대한 산성/중성 KD 비는 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 이상일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 중성 pH에서 항체의 KD 값은 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M, 10-12 M 이하일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 산성 pH에서의 항체의 KD 값은 10-9 M, 10-8 M, 10-7 M, 10-6 M 이상일 수 있다. 또 다른 경우에서, 본 발명에 있어서, 항체가 2 이상의 pH 5.8/pH 7.4 KD 비를 나타내는 경우, 상기 항체는 "중성 pH에서의 그의 결합에 비해 산성 pH에서 C5에 대한 감소된 결합"을 나타내는 것으로 간주될 수 있다. 특정한 예시적 실시양태에서, 본 발명의 항체에 대한 pH 5.8/pH 7.4 KD 비는 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 이상일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, pH 7.4에서 항체의 KD 값은 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M, 10-12 M 이하일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, pH 5.8에서의 항체의 KD 값은 10-9 M, 10-8 M, 10-7 M, 10-6 M 이상일 수 있다.
특정한 경우에서, "중성 pH에서의 그의 결합에 비해 산성 pH에서 C5에 대한 감소된 결합"은 산성 pH에서 C5에 대한 항체 결합의 kd 값 대 중성 pH에서 C5에 대한 항체 결합의 kd 값의 비(또는 그 반대도 가능)의 항으로 나타낸다. 예를 들면, 본 발명에 있어서, 항체가 2 이상의 산성/중성 kd 비를 나타내는 경우, 상기 항체는 "중성 pH에서의 그의 결합에 비해 산성 pH에서 C5에 대한 감소된 결합"을 나타내는 것으로 간주될 수 있다. 특정한 예시적 실시양태에서, 본 발명의 항체에 대한 pH 5.8/pH 7.4 kd 비는 2 이상이다. 특정한 예시적 실시양태에서, 본 발명의 항체에 대한 산성/중성 kd 비는 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 이상일 수 있다. 또 다른 예시적 실시양태에서, 본 발명의 항체에 대한 pH 5.8/pH 7.4 kd 비는 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 이상일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 중성 pH에서 항체의 kd 값은 10-2 1/s, 10-3 1/s, 10-4 1/s, 10-5 1/s, 10-6 1/s 이하일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, pH 7.4에서 항체의 kd 값은 10-2 1/s, 10-3 1/s, 10-4 1/s, 10-5 1/s, 10-6 1/s 이하일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 산성 pH에서 항체의 kd 값은 10-3 1/s, 10-2 1/s, 10-1 1/s 이상일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, pH 5.8에서 항체의 kd 값은 10-3 1/s, 10-2 1/s, 10-1 1/s 이상일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "산성 pH"란 표현은 4.0 내지 6.5의 pH를 의미한다. "산성 pH"란 표현은 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 및 6.5 중 어느 하나의 pH 값을 포함한다. 특정 태양에서, "산성 pH"는 5.8이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "중성 pH"란 표현은 6.7 내지 약 10.0의 pH를 의미한다. "중성 pH"란 표현은 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 및 10.0 중 어느 하나의 pH 값을 포함한다. 특정 태양에서, "중성 pH"는 7.4이다.
본원에서 나타낸 바와 같이, KD 값 및 kd 값은 항체-항원 상호작용을 특성화하기 위해 표면 플라즈몬 공명-기반 바이오센서를 사용하여 측정될 수 있다(예를 들면, 본원 실시예 3 참조). KD 값 및 kd 값은 25 ℃ 또는 37 ℃에서 측정될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 항-C5 항체는 MG1 도메인(서열번호 41)으로 이루어진 C5의 베타쇄 내의 에피토프에 결합한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 항-C5 항체는, 아미노산 47 내지 57, 70 내지 76, 및 107 내지 110으로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상의 단편을 포함하는 C5의 베타쇄(서열번호 40) 내의 에피토프에 결합한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 항-C5 항체는, Thr47, Glu48, Ala49, Phe50, Asp51, Ala52, Thr53, Lys57, His70, Val71, His72, Ser74, Glu76, Val107, Ser108, Lys109, 및 His110으로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상의 아미노산을 포함하는 C5의 베타쇄(서열번호 40)의 단편 내의 에피토프에 결합한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 항-C5 항체는, Glu48, Asp51, His70, His72, Lys109, 및 His110으로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상의 아미노산을 포함하는 C5의 베타쇄(서열번호 40)의 단편 내의 에피토프에 결합한다. 특정 실시양태에서, C5 돌연변이체에 대한 본 발명의 항-C5 항체의 결합은 야생형 C5에 대한 그의 결합에 비해 감소되며, 이때 상기 C5 돌연변이체는 Glu48, Asp51, His72, 및 Lys109로 이루어진 군에서 선택된 위치에서 1개 이상의 아미노산 치환을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, C5 돌연변이체에 대한 본 발명의 항-C5 항체의 pH-의존성 결합은 야생형 C5에 대한 그의 pH-의존성 결합에 비해 감소되며, 이때 상기 C5 돌연변이체는 His70, His72, 및 His110으로 이루어진 군에서 선택된 위치에서 1개 이상의 아미노산 치환을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, C5 돌연변이체에서, Glu48, Asp51, 및 Lys109로부터 선택된 위치에서의 아미노산은 알라닌으로 치환되고, His70, His72, 및 His110으로부터 선택된 위치에서의 아미노산은 티로신으로 치환된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 항-C5 항체는 C5에 결합하는 것에 있어서 다음으로부터 선택된 VH 및 VL을 포함하는 항체와 경쟁한다: (a) 서열번호 1의 VH 및 서열번호 11의 VL; (b) 서열번호 22의 VH 및 서열번호 26의 VL; (c) 서열번호 21의 VH 및 서열번호 25의 VL; (d) 서열번호 5의 VH 및 서열번호 15의 VL; (e) 서열번호 4의 VH 및 서열번호 14의 VL; (f) 서열번호 6의 VH 및 서열번호 16의 VL; (g) 서열번호 2의 VH 및 서열번호 12의 VL; (h) 서열번호 3의 VH 및 서열번호 13의 VL; (i) 서열번호 9의 VH 및 서열번호 19의 VL; (j) 서열번호 7의 VH 및 서열번호 17의 VL; (k) 서열번호 8의 VH 및 서열번호 18의 VL; (l) 서열번호 23의 VH 및 서열번호 27의 VL; 및 (m) 서열번호 10의 VH 및 서열번호 20의 VL.
특정 실시양태에서, 본 발명의 항-C5 항체는 C5에 결합하고 서열번호 39의 아미노산 Asp51(D51)과 접촉한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항-C5 항체는 C5에 결합하고 서열번호 39의 아미노산 Lys109(K109)와 접촉한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항-C5 항체는 C5에 결합하고 서열번호 39의 아미노산 Asp51(D51) 및 아미노산 Lys109(K109)와 접촉한다.
특정 실시양태에서, C5 돌연변이체에 대한 본 발명의 항-C5 항체의 결합은 야생형 C5에 대한 그의 결합에 비해 감소되며, 이때 상기 C5 돌연변이체는 서열번호 39의 Glu48Ala(E48A) 치환을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, C5 돌연변이체에 대한 본 발명의 항-C5 항체의 pH-의존성 결합은 야생형 C5에 대한 그의 pH-의존성 결합에 비해 감소되며, 이때 상기 C5 돌연변이체는 서열번호 39의 Glu48Ala(E48A) 치환을 갖는다.
또 다른 실시양태에서, 항-C5 항체는 서열번호 39의 아미노산 서열로 이루어진 C5 단백질에 결합하지만, H72Y 치환을 갖는 서열번호 39의 아미노산 서열로 이루어진 C5 단백질에는 결합하지 않고, 이때 상기 C5 단백질 및 H72Y 치환된 C5 단백질은 동일한 조건하에서 제조되고 선별된다. 또 다른 실시양태에서, 항-C5 항체는 pH 7.4에서 서열번호 39의 아미노산 서열로 이루어진 C5 단백질에 결합하지만, pH 7.4에서 H72Y 치환된 C5 단백질에는 결합하지 않는다.
특정 이론으로 제한시키지 않고, C5에 대한 항-C5 항체의 결합은 C5 상의 아미노산 잔기가 또 다른 아미노산 잔기로 치환될 때 감소(또는 거의 상실)되며, 이것은 C5 상의 아미노산 잔기가 항-C5 항체와 C5 사이의 상호작용에 결정적이며 상기 항체가 C5 상의 아미노산 잔기 주위의 에피토프를 인식할 수 있음을 의미하는 것으로 추측할 수 있다.
본 발명에서, 서로 경쟁하거나 동일 에피토프에 결합하는 일군의 항-C5 항체들이 pH-의존성 결합 특성을 나타낼 수 있음이 밝혀졌다. 아미노산들 중에서, 약 6.0 내지 6.5의 pKa 값을 갖는 히스티딘은 중성 및 산성 pH 사이에 상이한 양성자 해리 상태를 가질 수 있다. 그러므로, C5 상의 히스티딘 잔기는 항-C5 항체와 C5 사이의 pH-의존성 상호작용에 기여할 수 있다. 특정 이론으로 제한시키지 않고, 항-C5 항체는, pH에 따라 가변적인, C5 상의 히스티딘 잔기 주위의 입체형태 구조를 인식할 수 있는 것으로 추측할 수 있다. 상기 추측은 하기에 기술된 실험 결과와 일치할 수 있다: 항-C5 항체의 pH-의존성은 C5 상의 히스티딘 잔기가 또 다른 아미노산으로 치환될 때 감소(또는 거의 상실)된다(즉, pH-의존성 결합 특성을 갖는 항-C5 항체는 중성 pH에서 야생형 C5에 대해 유사한 친화도하에 C5의 히스티딘 돌연변이체에 결합하는 반면, 동일 항체가 산성 pH에서는 야생형 C5보다 더 높은 친화도하에 C5의 히스티딘 돌연변이체에 결합한다).
특정 실시양태에서, 본 발명의 항-C5 항체는 하나보다 많은 종으로부터의 C5에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 항-C5 항체는 인간 및 비-인간 동물로부터의 C5에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 항-C5 항체는 인간 및 원숭이(예를 들면, 사이노몰구스, 레서스 원숭이(rhesus macaque), 마모셋, 침팬지 또는 개코원숭이)로부터의 C5에 결합한다.
한 태양에서, 본 발명은 C5의 활성화를 억제하는 항-C5 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, C5a 및 C5b를 생성하는 C5의 절단을 방지하여, C5a와 연관된 아나필락시스 활성의 발생을 방지할 뿐 아니라 C5b와 연관된 C5b-9 막 공격 복합체(MAC)의 구성도 방지하는 항-C5 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, C5 전환효소에 의한 C5의 C5a 및 C5b로의 전환을 차단하는 항-C5 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, C5 상의 절단 부위로의 C5 전환효소의 접근을 차단하는 항-C5 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, C5의 활성화에 의해 야기된 용혈 활성을 차단하는 항-C5 항체가 제공된다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항-C5 항체는 고전적 경로 및/또는 대체 경로에 의해 C5의 활성화를 억제한다.
한 태양에서, 본 발명은 C5 변이체의 활성화를 억제하는 항-C5 항체를 제공한다. C5 변이체는 돌연변이, 다형성 또는 대립유전자 변이와 같은 유전자 변이에 기인하는 C5의 유전자 변이체를 의미한다. 유전자 변이는 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실, 치환 또는 삽입을 포함할 수 있다. C5 변이체는 C5에 하나 이상의 유전자 변이를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, C5 변이체는 야생형 C5와 유사한 생물 활성을 갖는다. 그러한 C5 변이체는 V145I, R449G, V802I, R885H, R928Q, D966Y, S1310N, 및 E1437D로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상의 변이를 포함할 수 있다. 여기에서, 예를 들면, R885H는 위치 885에서의 아르기닌이 히스티딘으로 치환된 유전자 변이를 의미한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 항-C5 항체는 야생형 C5, 및 V145I, R449G, V802I, R885H, R928Q, D966Y, S1310N 및 E1437D로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상의 C5 변이체 둘 다의 활성화를 억제한다.
한 태양에서, 본 발명은 (a) 서열번호 45 내지 54 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 55 내지 64 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 65 내지 74 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 75 내지 84 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 85 내지 94 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 95 내지 104 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 초가변 영역(HVR)을 포함하는 항-C5 항체를 제공한다.
한 태양에서, 본 발명은 (a) 서열번호 45 내지 54 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 55 내지 64 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열번호 65 내지 74 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상, 또는 3개의 VH HVR 서열 모두를 포함하는 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호 65 내지 74 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호 65 내지 74 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 및 서열번호 95 내지 104 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호 65 내지 74 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열번호 95 내지 104 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 및 서열번호 55 내지 64 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 항체는 (a) 서열번호 45 내지 54 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 55 내지 64 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열번호 65 내지 74 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 (a) 서열번호 75 내지 84 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호 85 내지 94 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 95 내지 104 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상, 또는 3개 VL HVR 서열 모두를 포함하는 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 항체는 (a) 서열번호 75 내지 84 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호 85 내지 94 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 95 내지 104 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 발명의 항체는 (a) (i) 서열번호 45 내지 54 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (ii) 서열번호 55 내지 64 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (iii) 서열번호 65 내지 74 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상 또는 3개의 VH HVR 서열 모두를 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 75 내지 84 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (ii) 서열번호 85 내지 94 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (iii) 서열번호 95 내지 104 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상 또는 3개의 VL HVR 서열 모두를 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 (a) 서열번호 45 내지 54 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 55 내지 64 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 65 내지 74 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 75 내지 84 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 85 내지 94 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 95 내지 104 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체를 제공한다.
한 태양에서, 본 발명은 (a) 서열번호 45, 54, 117 및 126 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 55, 64, 118 내지 120 및 127 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 65, 74, 121 및 128 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 75, 84, 122 및 129 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 85, 94, 123, 124 및 130 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 95, 104, 125 및 131 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-C5 항체를 제공한다.
한 태양에서, 본 발명은 (a) 서열번호 45, 54, 117 및 126 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 55, 64, 118 내지 120 및 127 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열번호 65, 74, 121 및 128 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상 또는 3개의 VH HVR 서열 모두를 포함하는 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호 65, 74, 121 및 128 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호 65, 74, 121 및 128 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 및 서열번호 95, 104, 125 및 131 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호 65, 74, 121 및 128 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열번호 95, 104, 125 및 131 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 및 서열번호 55, 64, 118 내지 120 및 127 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 항체는 (a) 서열번호 45, 54, 117 및 126 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 55, 64, 118 내지 120 및 127 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열번호 65, 74, 121 및 128 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 (a) 서열번호 75, 84, 122 및 129 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호 85, 94, 123, 124 및 130 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 95, 104, 125 및 131 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상 또는 3개의 VL HVR 서열 모두를 포함하는 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 항체는 (a) 서열번호 75, 84, 122 및 129 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호 85, 94, 123, 124 및 130 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 95, 104, 125 및 131 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 발명의 항체는 (a) (i) 서열번호 45, 54, 117 및 126 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (ii) 서열번호 55, 64, 118 내지 120 및 127 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (iii) 서열번호 65, 74, 121 및 128 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상 또는 3개의 VH HVR 서열 모두를 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 75, 84, 122 및 129 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (ii) 서열번호 85, 94, 123, 124 및 130 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (iii) 서열번호 95, 104, 125 및 131 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상 또는 3개의 VL HVR 서열 모두를 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 (a) 서열번호 45, 54, 117 및 126 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 55, 64, 118 내지 120 및 127 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 65, 74, 121 및 128 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 75, 84, 122 및 129 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 85, 94, 123, 124 및 130 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 95, 104, 125 및 131 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체를 제공한다.
특정 실시양태에서, 상기에 제공된 바와 같은 항-C5 항체의 임의의 하나 이상의 아미노산들은 하기의 HVR 위치에서 치환된다: (a) HVR-H1(서열번호 45)에서, 위치 5 및 6에서; (b) HVR-H2(서열번호 55)에서, 위치 1, 3, 9, 11, 13 및 15에서; (c) HVR-H3(서열번호 65)에서, 위치 2, 5, 6, 12 및 13에서; (d) HVR-L1(서열번호 75)에서, 위치 1, 5, 7 및 9에서; (e) HVR-L2(서열번호 85)에서, 위치 4, 5 및 6에서; 및 (f) HVR-L3(서열번호 95)에서, 위치 2, 4 및 12에서.
특정 실시양태에서, 상기 치환은 본원에 제공된 바와 같은 보존적 치환이다. 특정 실시양태에서, 하기 치환들 중 임의의 하나 이상이 임의의 조합으로 이루어질 수 있다: (a) HVR-H1(서열번호 45)에서, M5V 또는 C6A; (b) HVR-H2(서열번호 55)에서, C1A 또는 G, Y3F, T9D 또는 E, Y11K 또는 Q, S13D 또는 E, 또는 A15V; (c) HVR-H3(서열번호 65)에서, G2A, V5Q 또는 D, T6Y, Y12H, 또는 L13Y; (d) HVR-L1(서열번호 75)에서, Q1R, N5Q 또는 G, G7S, D9K 또는 S; (e) HVR-L2(서열번호 85)에서, K4T 또는 E, L5T, 또는 A6H, A6 E, 또는 A6Q; (f) HVR-L3(서열번호 95)에서, C2S, C2N, 또는 C2T, F4K 또는 A12T 또는 A12H.
상기 치환들의 모든 가능한 조합들은 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3에 대해 각각 서열번호 126, 127, 128, 129, 130 및 131의 공통 서열에 의해 포괄된다.
임의의 상기 실시양태에서, 항-C5 항체는 인간화된다. 한 실시양태에서, 항-C5 항체는 임의의 상기 실시양태에서와 같은 HVR을 포함하고, 또한 수용체 인간 프레임워크, 예를 들면, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항-C5 항체는 임의의 상기 실시양태에서와 같은 HVR을 포함하고, 또한 FR 서열을 포함하는 VH 또는 VL을 포함하며, 이때 상기 FR 서열은 다음과 같다. 중쇄 가변 도메인의 경우, FR1은 서열번호 132 내지 134 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고, FR2는 서열번호 135 및 136 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고, FR3은 서열번호 137 내지 139 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고, FR4는 서열번호 140 및 141 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 경쇄 가변 도메인의 경우, FR1은 서열번호 142 및 143 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고, FR2는 서열번호 144 및 145 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고, FR3은 서열번호 146 및 147 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고, FR4는 서열번호 148의 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 태양에서, 항-C5 항체는 서열번호 1 내지 10 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VH 서열은 기준 서열에 대해 치환(예를 들면, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-C5 항체는 C5에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시양태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열번호 1 내지 10 중 어느 하나에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 이외의 영역에서(즉, FR에서) 일어난다. 선택적으로, 항-C5 항체는, 서열의 번역후 변형을 포함하여, 서열번호 1 내지 10 중 어느 하나에 VH 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 (a) 서열번호 45 내지 54 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열번호 55 내지 64 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열번호 65 내지 74 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1개, 2개 또는 3개의 HVR을 포함한다. 번역후 변형은 중쇄 또는 경쇄의 N-말단내 글루타민 또는 글루타메이트의 피로글루타밀화에 의한 피로글루탐산으로의 변형을 포함하나 이로 한정되지는 않는다.
또 다른 태양에서, 서열번호 11 내지 20 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 항-C5 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VL 서열은 기준 서열에 대해 치환(예를 들면, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-C5 항체는 C5에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시양태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열번호 11 내지 20 중 어느 하나에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 이외의 영역에서(즉, FR에서) 일어난다. 선택적으로, 항-C5 항체는, 서열의 번역후 변형을 포함하여, 서열번호 11 내지 20 중 어느 하나에 VL 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 (a) 서열번호 75 내지 84 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열번호 85 내지 94 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열번호 95 내지 104 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1개, 2개 또는 3개의 HVR을 포함한다. 번역후 변형은 중쇄 또는 경쇄의 N-말단내 글루타민 또는 글루타메이트의 피로글루타밀화에 의한 피로글루탐산으로의 변형을 포함하나 이로 한정되지는 않는다.
또 다른 태양에서, 상기에 제공된 임의의 실시양태에서의 VH 및 상기에 제공된 임의의 실시양태에서의 VL을 포함하는 항-C5 항체가 제공된다. 한 실시양태에서, 상기 항체는, 서열들의 번역후 변형을 포함하여, 서열번호 1 내지 10 중 어느 하나 및 서열번호 11 내지 20 중 어느 하나 각각에 VH 및 VL 서열을 포함한다. 번역후 변형은 중쇄 또는 경쇄의 N-말단내 글루타민 또는 글루타메이트의 피로글루타밀화에 의한 피로글루탐산으로의 변형을 포함하나 이로 한정되지는 않는다.
또 다른 태양에서, 항-C5 항체는 서열번호 10 및 106 내지 110 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VH 서열은 기준 서열에 대해 치환(예를 들면, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-C5 항체는 C5에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시양태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열번호 10 및 106 내지 110 중 어느 하나에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 이외의 영역에서(즉, FR에서) 일어난다. 선택적으로, 항-C5 항체는, 서열의 번역후 변형을 포함하여, 서열번호 10 및 106 내지 110 중 어느 하나에 VH 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 (a) 서열번호 45, 54, 117 및 126 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열번호 55, 64, 118 내지 120 및 127 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열번호 65, 74, 121 및 128 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1개, 2개 또는 3개의 HVR을 포함한다. 번역후 변형은 중쇄 또는 경쇄의 N-말단내 글루타민 또는 글루타메이트의 피로글루타밀화에 의한 피로글루탐산으로의 변형을 포함하나 이로 한정되지는 않는다.
또 다른 태양에서, 항-C5 항체는 서열번호 10 및 106 내지 110 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VH 서열은 기준 서열에 대해 치환(예를 들면, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-C5 항체는 C5에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시양태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열번호 10 및 106 내지 110 중 어느 하나에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 이외의 영역에서(즉, FR에서) 일어난다. 선택적으로, 항-C5 항체는, 서열의 번역후 변형을 포함하여, 서열번호 10 및 106 내지 110 중 어느 하나에 VH 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 (a) 서열번호 45, 54, 117 및 126 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열번호 55, 64, 118 내지 120 및 127 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열번호 65, 74, 121 및 128 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1개, 2개 또는 3개의 HVR을 포함한다. 번역후 변형은 중쇄 또는 경쇄의 N-말단내 글루타민 또는 글루타메이트의 피로글루타밀화에 의한 피로글루탐산으로의 변형을 포함하나 이로 한정되지는 않는다.
또 다른 태양에서, 항-C5 항체는 서열번호 10의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH 서열은 서열번호 10의 아미노산 서열이다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VH 서열은 기준 서열에 대해 치환(예를 들면, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-C5 항체는 C5에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시양태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열번호 10에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 이외의 영역에서(즉, FR에서) 일어난다. 선택적으로, 항-C5 항체는, 서열의 번역후 변형을 포함하여, 서열번호 10에 VH 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 (a) 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1개, 2개 또는 3개의 HVR을 포함한다. 번역후 변형은 중쇄 또는 경쇄의 N-말단내 글루타민 또는 글루타메이트의 피로글루타밀화에 의한 피로글루탐산으로의 변형을 포함하나 이로 한정되지는 않는다.
또 다른 태양에서, 항-C5 항체는 서열번호 106의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH 서열은 서열번호 106의 아미노산 서열이다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VH 서열은 기준 서열에 대해 치환(예를 들면, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-C5 항체는 C5에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시양태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열번호 106에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 이외의 영역에서(즉, FR에서) 일어난다. 선택적으로, 항-C5 항체는, 서열의 번역후 변형을 포함하여, 서열번호 106에 VH 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 (a) 서열번호 117의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열번호 121의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1개, 2개 또는 3개의 HVR을 포함한다. 번역후 변형은 중쇄 또는 경쇄의 N-말단내 글루타민 또는 글루타메이트의 피로글루타밀화에 의한 피로글루탐산으로의 변형을 포함하나 이로 한정되지는 않는다.
또 다른 태양에서, 항-C5 항체는 서열번호 107의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 서열이다. 특정 실시양태에서, VH 서열은 서열번호 107의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VH 서열은 기준 서열에 대해 치환(예를 들면, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-C5 항체는 C5에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시양태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열번호 107에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 이외의 영역에서(즉, FR에서) 일어난다. 선택적으로, 항-C5 항체는, 서열의 번역후 변형을 포함하여, 서열번호 107에 VH 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 (a) 서열번호 117의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열번호 119의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열번호 121의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1개, 2개 또는 3개의 HVR을 포함한다. 번역후 변형은 중쇄 또는 경쇄의 N-말단내 글루타민 또는 글루타메이트의 피로글루타밀화에 의한 피로글루탐산으로의 변형을 포함하나 이로 한정되지는 않는다.
또 다른 태양에서, 항-C5 항체는 서열번호 108의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 서열이다. 특정 실시양태에서, VH 서열은 서열번호 108의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VH 서열은 기준 서열에 대해 치환(예를 들면, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-C5 항체는 C5에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시양태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열번호 108에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 이외의 영역에서(즉, FR에서) 일어난다. 선택적으로, 항-C5 항체는, 서열의 번역후 변형을 포함하여, 서열번호 108에 VH 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 (a) 서열번호 117의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열번호 121의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1개, 2개 또는 3개의 HVR을 포함한다. 번역후 변형은 중쇄 또는 경쇄의 N-말단내 글루타민 또는 글루타메이트의 피로글루타밀화에 의한 피로글루탐산으로의 변형을 포함하나 이로 한정되지는 않는다.
또 다른 태양에서, 항-C5 항체는 서열번호 109의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 서열이다. 특정 실시양태에서, VH 서열은 서열번호 109의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VH 서열은 기준 서열에 대해 치환(예를 들면, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-C5 항체는 C5에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시양태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열번호 109에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 이외의 영역에서(즉, FR에서) 일어난다. 선택적으로, 항-C5 항체는, 서열의 번역후 변형을 포함하여, 서열번호 109에 VH 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 (a) 서열번호 117의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열번호 121의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1개, 2개 또는 3개의 HVR을 포함한다. 번역후 변형은 중쇄 또는 경쇄의 N-말단내 글루타민 또는 글루타메이트의 피로글루타밀화에 의한 피로글루탐산으로의 변형을 포함하나 이로 한정되지는 않는다.
또 다른 태양에서, 항-C5 항체는 서열번호 110의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 서열이다. 특정 실시양태에서, VH 서열은 서열번호 110의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VH 서열은 기준 서열에 대해 치환(예를 들면, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-C5 항체는 C5에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시양태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열번호 110에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 이외의 영역에서(즉, FR에서) 일어난다. 선택적으로, 항-C5 항체는, 서열의 번역후 변형을 포함하여, 서열번호 110에 VH 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 (a) 서열번호 117의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열번호 120의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열번호 121의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1개, 2개 또는 3개의 HVR을 포함한다. 번역후 변형은 중쇄 또는 경쇄의 N-말단내 글루타민 또는 글루타메이트의 피로글루타밀화에 의한 피로글루탐산으로의 변형을 포함하나 이로 한정되지는 않는다.
또 다른 태양에서, 항-C5 항체는 서열번호 20 및 111 내지 113 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VL 서열은 기준 서열에 대해 치환(예를 들면, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-C5 항체는 C5에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시양태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열번호 20 및 111 내지 113 중 어느 하나에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 이외의 영역에서(즉, FR에서) 일어난다. 선택적으로, 항-C5 항체는, 서열의 번역후 변형을 포함하여, 서열번호 20 및 111 내지 113 중 어느 하나에 VL 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 (a) 서열번호 75, 84, 122 및 129 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호 85, 94, 123, 124 및 130 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 95, 104, 125 및 131 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1개, 2개 또는 3개의 HVR을 포함한다. 번역후 변형은 중쇄 또는 경쇄의 N-말단내 글루타민 또는 글루타메이트의 피로글루타밀화에 의한 피로글루탐산으로의 변형을 포함하나 이로 한정되지는 않는다.
또 다른 태양에서, 서열번호 20의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL을 포함하는 항-C5 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 상기 VL 서열은 서열번호 20의 아미노산 서열이다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VL 서열은 기준 서열에 대해 치환(예를 들면, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-C5 항체는 C5에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시양태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열번호 20에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 이외의 영역에서(즉, FR에서) 일어난다. 선택적으로, 항-C5 항체는, 서열의 번역후 변형을 포함하여, 서열번호 20에 VL 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 (a) 서열번호 84의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 104의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1개, 2개 또는 3개의 HVR을 포함한다. 번역후 변형은 중쇄 또는 경쇄의 N-말단내 글루타민 또는 글루타메이트의 피로글루타밀화에 의한 피로글루탐산으로의 변형을 포함하나 이로 한정되지는 않는다.
또 다른 태양에서, 서열번호 111의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL을 포함하는 항-C5 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 상기 VL 서열은 서열번호 111의 아미노산 서열이다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VL 서열은 기준 서열에 대해 치환(예를 들면, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-C5 항체는 C5에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시양태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열번호 111에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 이외의 영역에서(즉, FR에서) 일어난다. 선택적으로, 항-C5 항체는, 서열의 번역후 변형을 포함하여, 서열번호 111에 VL 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 (a) 서열번호 122의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호 123의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 125의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1개, 2개 또는 3개의 HVR을 포함한다. 번역후 변형은 중쇄 또는 경쇄의 N-말단내 글루타민 또는 글루타메이트의 피로글루타밀화에 의한 피로글루탐산으로의 변형을 포함하나 이로 한정되지는 않는다.
또 다른 태양에서, 서열번호 112의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL을 포함하는 항-C5 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 상기 VL 서열은 서열번호 112의 아미노산 서열이다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VL 서열은 기준 서열에 대해 치환(예를 들면, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-C5 항체는 C5에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시양태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열번호 112에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 이외의 영역에서(즉, FR에서) 일어난다. 선택적으로, 항-C5 항체는, 서열의 번역후 변형을 포함하여, 서열번호 112에 VL 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 (a) 서열번호 122의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호 123의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 125의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1개, 2개 또는 3개의 HVR을 포함한다. 번역후 변형은 중쇄 또는 경쇄의 N-말단내 글루타민 또는 글루타메이트의 피로글루타밀화에 의한 피로글루탐산으로의 변형을 포함하나 이로 한정되지는 않는다.
또 다른 태양에서, 서열번호 113의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL을 포함하는 항-C5 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 상기 VL 서열은 서열번호 113의 아미노산 서열이다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VL 서열은 기준 서열에 대해 치환(예를 들면, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-C5 항체는 C5에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시양태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열번호 113에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 이외의 영역에서(즉, FR에서) 일어난다. 선택적으로, 항-C5 항체는, 서열의 번역후 변형을 포함하여, 서열번호 113에 VL 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 (a) 서열번호 122의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호 124의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 125의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1개, 2개 또는 3개의 HVR을 포함한다. 번역후 변형은 중쇄 또는 경쇄의 N-말단내 글루타민 또는 글루타메이트의 피로글루타밀화에 의한 피로글루탐산으로의 변형을 포함하나 이로 한정되지는 않는다.
또 다른 태양에서, 상기에 제공된 임의의 실시양태에서의 VH 및 상기에 제공된 임의의 실시양태에서의 VL을 포함하는 항-C5 항체가 제공된다. 한 실시양태에서, 상기 항체는, 서열들의 번역후 변형을 포함하여, 서열번호 10 및 106 내지 110 중 어느 하나 및 서열번호 20 및 111 내지 113 중 어느 하나 각각에 VH 및 VL 서열을 포함한다. 번역후 변형은 중쇄 또는 경쇄의 N-말단내 글루타민 또는 글루타메이트의 피로글루타밀화에 의한 피로글루탐산으로의 변형을 포함하나 이로 한정되지는 않는다. 한 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호 10의 VH 서열 및 서열번호 20의 VL 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호 106의 VH 서열 및 서열번호 111의 VL 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호 107의 VH 서열 및 서열번호 111의 VL 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호 108의 VH 서열 및 서열번호 111의 VL 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호 109의 VH 서열 및 서열번호 111의 VL 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호 109의 VH 서열 및 서열번호 112의 VL 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호 109의 VH 서열 및 서열번호 113의 VL 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호 110의 VH 서열 및 서열번호 113의 VL 서열을 포함한다.
한 태양에서, (a) 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 함유하는 VH 서열; 및 (a) 서열번호 84의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열번호 104의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 함유하는 VL 서열을 포함하는 항-C5 항체가 제공된다.
또 다른 태양에서, (a) 서열번호 117의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열번호 121의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 함유하는 VH 서열; 및 (a) 서열번호 122의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열번호 123의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열번호 125의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 함유하는 VL 서열을 포함하는 항-C5 항체가 제공된다.
또 다른 태양에서, (a) 서열번호 117의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열번호 119의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열번호 121의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 함유하는 VH 서열; 및 (a) 서열번호 122의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열번호 123의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열번호 123의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 함유하는 VL 서열을 포함하는 항-C5 항체가 제공된다.
또 다른 태양에서, (a) 서열번호 117의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열번호 121의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 함유하는 VH 서열; 및 (a) 서열번호 122의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열번호 124의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열번호 125의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 함유하는 VL 서열을 포함하는 항-C5 항체가 제공된다.
또 다른 태양에서, (a) 서열번호 117의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열번호 120의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열번호 121의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 함유하는 VH 서열; 및 (a) 서열번호 122의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열번호 124의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열번호 125의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 함유하는 VL 서열을 포함하는 항-C5 항체가 제공된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 항-C5 항체는 상기에 제공된 임의의 실시양태에서의 VH 및 서열번호 33, 34, 35, 114, 115 및 116 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 항-C5 항체는 상기에 제공된 임의의 실시양태에서의 VL 및 서열번호 36, 37 및 38 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 본원에 제공된 항-C5 항체와 동일 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 예를 들면, 특정 실시양태에서, 표 2에 기술된 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 하기의 실시예에 의해 입증되듯이, 표 2에 기술된 모든 항-C5 항체들은 C5의 동일한 에피토프 빈으로 분류되고 pH-의존성 결합 특성을 나타낸다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 본원에 제공된 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 또 다른 태양에서, 본 발명은 표 7 또는 8에 기술된 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, C5의 베타쇄(서열번호 40)의 아미노산 33 내지 124로 이루어진 단편 내의 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 아미노산 47 내지 57, 70 내지 76 및 107 내지 110으로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상의 단편을 포함하는 C5의 베타쇄(서열번호 40) 내의 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, Thr47, Glu48, Ala49, Phe50, Asp51, Ala52, Thr53, Lys57, His70, Val71, His72, Ser74, Glu76, Val107, Ser108, Lys109, 및 His110으로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상의 아미노산을 포함하는 C5의 베타쇄(서열번호 40)의 단편 내의 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항-C5 항체의 에피토프는 입체형태 에피토프이다.
본 발명의 또 다른 태양에서, 임의의 상기 실시양태에 따른 항-C5 항체는 키메라, 인간화 또는 인간 항체를 포함하여 단일클론 항체이다. 한 실시양태에서, 항-C5 항체는 항체 단편, 예를 들면, Fv, Fab, Fab', scFv, 디아바디 또는 F(ab')2 단편이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 항체는 전장 항체, 예를 들면, 온전한 IgG1 또는 IgG4 항체 또는 본원에서 정의된 바와 같은 또 다른 항체 부류 또는 이소타입이다.
또 다른 태양에서, 임의의 상기 실시양태에 따른 항-C5 항체는 하기의 섹션 1 내지 7에 기술된 바와 같은 특징들 중 임의의 특징을 단독으로 또는 조합으로 포함할 수 있다.
1. 항체 친화도
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 1 μM 이하, 100 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하, 0.1 nM 이하, 0.01 nM 이하, 또는 0.001 nM 이하(예를 들면, 10-8 M 이하, 예를 들면, 10-8 내지 10-13 M, 예를 들면, 10-9 내지 10-13 M)의 해리 상수(Kd)를 갖는다.
한 실시양태에서, Kd는 방사성표지된 항원 결합 분석(RIA)에 의해 측정된다. 한 실시양태에서, RIA는 해당 항체의 Fab 버전 및 그의 항원을 사용하여 수행한다. 예를 들면, 항원에 대한 Fab의 용액 결합 친화도는, 비표지 항원의 연속 적정물의 존재하에서 최소 농도의 (125I)-표지된 항원으로 Fab를 평형화시킨 후, 결합된 항원을 항-Fab 항체-코팅된 플레이트로 포획함으로써 측정한다(예를 들면, 문헌 [Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)] 참조). 분석을 위한 조건을 설정하기 위해, 마이크로타이터(MICROTITER, 등록상표) 다중-웰 플레이트(써모 사이언티픽(Thermo Scientific))를 50 mM 탄산나트륨(pH 9.6) 중의 5 ㎍/ml의 포획 항-Fab 항체(카펠 랩스(Cappel Labs))로 밤새 코팅하고, 이어서 실온(약 23 ℃)에서 PBS 중의 2%(w/v) 소 혈청 알부민으로 2 내지 5 시간동안 차단시켰다. 비-흡착 플레이트(눈크(Nunc) #269620)에서, 100 pM 또는 26 pM의 [125I]-항원을 해당 Fab의 연속 희석물과 혼합한다(예를 들면, 문헌 [Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)]에서의 항-VEGF 항체, Fab-12의 평가와 일치하게). 이어서, 해당 Fab를 밤새 배양하지만, 상기 배양은 확실하게 평형이 달성되게 하기 위해 더 오랫동안(예를 들면, 약 65 시간) 지속될 수도 있다. 그 후에, 혼합물을 실온에서 배양을 위해(예를 들면, 약 1 시간동안) 포획 플레이트로 옮긴다. 이어서, 용액을 제거하고 플레이트를 PBS 중의 0.1% 폴리솔베이트 20(트윈(TWEEN)-20(등록상표))으로 8회 세척한다. 플레이트가 건조되면, 150 ㎕/웰의 섬광제(scintillant)(마이크로신트(MICROSCINT)-20™; 패커드(Packard))를 첨가하고, 플레이트를 10 분동안 탑카운트(TOPCOUNT)™ 감마 카운터(패커드) 상에서 계수한다. 최대 결합의 20% 이하를 제공하는 각각의 Fab의 농도를 경쟁 결합 분석에 사용하기 위해 선택한다.
또 다른 실시양태에 따라서, Kd는 비아코어(등록상표) 표면 플라즈몬 공명 분석법을 이용하여 측정한다. 예를 들면, 비아코어(등록상표)-2000 또는 비아코어(등록상표)-3000(비아코어(등록상표) 인코포레이티드, 미국 뉴저지주 피스카타웨이)을 이용한 분석을 25 ℃에서 약 10 반응 단위(response unit, RU)에서 고정화 항원 CM5 칩을 사용하여 수행한다. 한 실시양태에서, 카복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩(CM5, 비아코어(등록상표) 인코포레이티드)을 공급자의 지시에 따라서 N-에틸-N'-(3-다이메틸아미노프로필)-카보다이이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드(NHS)로 활성화시킨다. 항원을 10 mM 나트륨 아세테이트(pH 4.8)로 5 ㎍/ml(약 0.2 μM)로 희석한 후 5 ㎕/분의 유량으로 주입하여 약 10 반응 단위(RU)의 커플링된 단백질을 달성한다. 항원 주입 후에, 1 M 에탄올아민을 주입하여 미반응 기를 차단한다. 동역학 측정을 위해, Fab의 2배 연속 희석물(0.78 nM 내지 500 nM)을 25 ℃에서 약 25 ㎕/분의 유량으로 0.05% 폴리솔베이트 20(트윈-20™) 계면활성제를 함유한 PBS(PBST) 중에 주입하였다. 결합 속도(kon) 및 해리 속도(koff)는 결합 및 해리 센서그램을 동시에 적합화시켜 단순한 일-대-일 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델(비아코어(등록상표) 평가 소프트웨어(Evaluation Software) 버전 3.2)을 이용하여 산출한다. 평형 해리 상수(Kd)는 비 koff/kon으로서 산출한다(예를 들면, 문헌 [Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)] 참조). 상기의 표면 플라즈몬 공명 분석법에 의해 온-속도(on-rate)가 106 M-1s- 1를 초과하는 경우, 온-속도는, 분광계, 예를 들면, 정류기(stop-flow) 장착 분광광도계(아비브 인스트루먼츠(Aviv Instruments)) 또는 교반 큐벳을 갖는 8000-시리즈 SLM-AMINCO™ 분광광도계(써모스펙트로닉(ThermoSpectronic))에서 측정시 증가하는 농도의 항원의 존재하에서, PBS(pH 7.2) 중 20 nM 항-항원 항체(Fab 형태)의, 25 ℃에서의 형광 발광 강도(여기 = 295 nm; 발광 = 340 nm, 16 nm 통과대역)에서의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 소광 기술을 이용하여 측정할 수 있다.
2. 항체 단편
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 항체 단편이다. 항체 단편으로는 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv 및 scFv 단편, 및 하기에 기술되는 또 다른 단편들이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 특정 항체 단편에 대한 검토를 위해서는, 문헌 [Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)]을 참조하시오. scFv 단편에 대한 검토를 위해서는, 예를 들면, 문헌 [Plueckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)]; 또한 국제 특허 공개 제 93/16185 호; 및 미국 특허 제 5,571,894 호 및 제 5,587,458 호를 참조하시오. 재생 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편에 대한 고찰을 위해서는, 미국 특허 제 5,869,046 호를 참조하시오.
디아바디는 2가 또는 이중특이성일 수 있는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편이다(예를 들면, 유럽 특허 제 0 404 097 호; 국제 특허 공개 제 1993/01161 호; 문헌 [Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); and Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)] 참조). 트리아바디 및 테트라바디도 또한 문헌 [Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)]에 기술되어 있다.
단일-도메인 항체는 중쇄 가변 도메인 전체 또는 일부, 또는 항체의 경쇄 가변 도메인 전체 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 실시양태에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다(도만티스 인코포레이티드(Domantis, Inc.), 미국 매사추세츠주 월탐); 예를 들면, 미국 특허 제 6,248,516 B1 호 참조).
항체 단편은, 본원에 기술된 바와 같이, 온전한 항체의 단백질분해성 절단, 및 재조합 숙주 세포(예를 들면, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) 또는 파지)에 의한 생성을 포함하지만 이로 한정되지는 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.
3. 키메라 및 인간화 항체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 키메라 항체이다. 특정한 키메라 항체가, 예를 들면, 미국 특허 제 4,816,567 호; 및 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)]에 기술되어 있다. 한 예로, 키메라 항체는 비-인간 가변 영역(예를 들면, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 또는 원숭이와 같은 비-인간 영장류로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 또 다른 예에서, 키메라 항체는 부류 또는 하위부류가 모 항체로부터 변화된 "부류 전환된" 항체이다. 키메라 항체는 그의 항원-결합 단편을 포함한다.
특정 실시양태에서, 키메라 항체는 인간화 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는, 비-인간 모 항체의 특이성 및 친화도를 유지하면서 인간에 대한 면역원성을 감소시키기 위해 인간화된다. 일반적으로, 인간화 항체는 HVR, 예를 들면, CDR(또는 그의 일부)이 비-인간 항체로부터 유래되고 FR(또는 그의 일부)이 인간 항체 서열로부터 유래된 하나 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화 항체는 선택적으로 또한 인간 불변 영역의 적어도 일부분을 포함할 것이다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체중 일부 FR 잔기는, 예를 들면, 항체 특이성 또는 친화도를 회복시키거나 개선하기 위해 비-인간 항체(예를 들면, 그로부터 HVR 잔기가 유래되는 항체)로부터의 상응하는 잔기로 치환된다.
인간화 항체 및 그의 제조 방법은, 예를 들면, 문헌 [Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)]에 개관되어 있고, 예를 들면, 문헌 [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)]; 미국 특허 제 5,821,337 호, 제 7,527,791 호, 제 6,982,321 호 및 제 7,087,409 호; 문헌 [Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005)](특이성 결정 영역(SDR) 그라프팅을 기술하고 있음); 문헌 [Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991)]("재표면화"를 기술하고 있음); 문헌 [Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005)]("FR 셔플링"을 기술하고 있음); 및 문헌 [Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) and Klimka et al., Br. J. Cancer 83:252-260 (2000)](FR 셔플링에 대한 "유도 선택" 접근방법을 기술하고 있음)에 더 기술되어 있다.
인간화에 사용될 수 있는 인간 프레임워크 영역으로는 다음이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다: "최적합(best-fit)" 방법을 이용하여 선택된 프레임워크 영역(예를 들면, 문헌 [Sims et al., J. Immunol. 151:2296-2308 (1993)] 참조); 특정한 아군의 경쇄 또는 중쇄 가변 영역들의 인간 항체들의 공통 서열로부터 유래된 프레임워크 영역(예를 들면, 문헌 [Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285-4289 (1992); and Presta et al., J. Immunol. 151:2623-2632 (1993)] 참조); 인간 성숙 (체세포 돌연변이된) 프레임워크 영역 또는 인간 생식선 프레임워크 영역(예를 들면, 문헌 [Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)] 참조); 및 FR 라이브러리 검색으로부터 유도된 프레임워크 영역(예를 들면, 문헌 [Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) and Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)] 참조).
4. 인간 항체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 당해 분야에 공지된 다양한 기술을 이용하여 생성될 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 문헌 [van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharma. 5:368-74 (2001) and Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)]에 기술되어 있다.
인간 항체는, 항원 자극에 반응하여 온전한 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 갖는 온전한 항체를 생성하도록 변형된 유전자이식 동물에게 면역원을 투여함으로써 제조될 수 있다. 이러한 동물들은 전형적으로 인간 면역글로불린 유전자좌의 전체 또는 일부를 함유하며, 상기 유전자좌는 내인성 면역글로불린 유전자좌를 대체하거나 염색체외에 존재하거나 동물의 염색체내에 무작위적으로 통합된다. 상기 유전자이식 마우스에서, 내인성 면역글로불린 유전자좌는 일반적으로 불활성화되어 있다. 유전자이식 동물로부터 인간 항체를 수득하기 위한 방법에 대한 검토를 위해서는, 문헌 [Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)]을 참조하시오. 또한, 예를 들면, 제노마우스(XENOMOUSE)™ 기술을 기재하고 있는 미국 특허 제 6,075,181 호 및 제 6,150,584 호; 휴맙(HUMAB, 등록상표) 기술을 기재하고 있는 미국 특허 제 5,770,429 호; K-M 마우스(등록 상표) 기술을 기재하고 있는 미국 특허 제 7,041,870 호, 및 벨로시마우스(VELOCIMOUSE) 기술을 기재하고 있는 미국 특허 공개 제 2007/0061900 호를 참조하시오. 상기 동물들에 의해 생성된 온전한 항체들로부터의 인간 가변 영역은, 예를 들면, 상이한 인간 불변 영역과 결합됨으로써 더 변형될 수 있다.
인간 항체는 또한 하이브리도마-기반 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 단일클론 항체의 생성을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종(heteromyeloma) 세포주가 기술되었다(예를 들면, 문헌 [Kozbor, J. Immunol. 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Dekker, Inc., New York, 1987); and Boerner et al., J. Immunol. 147:86 (1991)] 참조). 인간 B-세포 하이브리도마 기술에 의해 생성된 인간 항체도 또한 문헌 [Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:3557-3562 (2006)]에 기술되어 있다. 또 다른 방법들로는, 예를 들면, 미국 특허 제 7,189,826 호(하이브리도마 세포주로부터 단일클론 인간 IgM 항체의 생성을 기술하고 있음) 및 문헌 [Ni, Xiandai Mianyixue 26(4):265-268 (2006)](인간-인간 하이브리도마를 기술하고 있음)에 기술된 방법들이 포함된다. 인간 하이브리도마 기술(트리오마(Trioma) 기술)도 또한 문헌 [Vollmers, Histology and Histopathology 20(3):927-937 (2005) and Vollmers, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27(3):185-191 (2005)]에 기술되어 있다.
인간 항체는 또한 인간-유래 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리함으로써 생성될 수 있다. 상기 가변 도메인 서열은 이어서 목적하는 인간 불변 도메인과 결합될 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선별하기 위한 기술은 하기에 설명되어 있다.
5. 라이브러리-유래 항체
본 발명의 항체는 목적하는 활성 또는 활성들을 갖는 항체에 대해 조합 라이브러리를 스크리닝함으로써 단리될 수 있다. 예를 들면, 파지 디스플레이 라이브러리를 제작하고 목적하는 결합 특성을 갖는 항체에 대해 상기 라이브러리를 스크리닝하기 위한 다양한 방법들이 당해 분야에 공지되어 있다. 상기 방법들은, 예를 들면, 문헌 [Hoogenboom et al., Methods in Molecular Biology 178:1-37 (2001)]에 개관되어 있으며, 예를 들면, 문헌 [McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1992); Marks, Meth.Mol. Biol. 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2):299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5):1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004); Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2):119-132 (2004)]에 더 기술되어 있다.
특정한 파지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자의 레퍼토리는 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 따로따로 클로닝되고 파지 라이브러리에서 무작위로 재조합되고, 이어서 문헌 [Winter et al., Ann. Rev. Immunol. 12:433-455 (1994)]에 기술된 바와 같이 항원-결합 파지에 대해 스크리닝될 수 있다. 파지는 전형적으로, 단일-쇄 Fv(scFv) 단편으로서든지 또는 Fab 단편으로서든지 항체 단편을 디스플레이한다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 구성할 필요없이 면역원에 대한 고-친화성 항체를 제공한다. 또는, 문헌 [Griffiths et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)]에 기술된 바와 같이, 나이브(naive) 레퍼토리를 클로닝하여(예를 들면, 인간으로부터) 임의의 면역화없이 광범위한 비-자가 및 또한 자가 항원에 대한 항체들의 단일 공급원을 제공할 수 있다. 마지막으로, 나이브 라이브러리는 또한, 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol. 227:381-388 (1992)]에 기술된 바와 같이, 줄기 세포로부터 비-재배열된 V-유전자 분절을 클로닝하고, 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용하여 고도로 가변성인 CDR3 영역을 암호화하고 시험관내에서 재배열을 달성함으로써 합성적으로 제조될 수 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 기술하고 있는 특허 공개로는, 예를 들면, 미국 특허 제 5,750,373 호 및 미국 특허 공개 제 2005/0079574 호, 제 2005/0119455 호, 제 2005/0266000 호, 제 2007/0117126 호, 제 2007/0160598 호, 제 2007/0237764 호, 제 2007/0292936 호 및 제 2009/0002360 호가 포함된다.
인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편들은 본원에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편들로 간주된다.
6. 다중특이성 항체
특정 실시양태에서, 본원에서 제공된 항체는 다중특이성 항체, 예를 들면, 이중특이성 항체이다. 다중특이성 항체는 2개 이상의 상이한 부위에 대해 결합 특이성을 갖는 단일클론 항체이다. 특정 실시양태에서, 결합 특이성 중 하나는 C5에 대한 것이고, 다른 하나는 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 특정 실시양태에서, 이중특이성 항체는 C5의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이중특이성 항체는 또한 세포독성 약제를, C5를 발현하는 세포로 국소화시키기 위해 사용될 수 있다. 이중특이성 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로 제조될 수 있다.
다중특이성 항체를 제조하기 위한 기술로는 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 동시-발현(문헌 [Milstein and Cuello, Nature 305:537-540 (1983)]; 국제 특허 공개 제 93/08829 호; 및 문헌 [Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659 (1991)] 참조), 및 "놉-인-홀(knob-in-hole)" 조작(예를 들면, 미국 특허 제 5,731,168 호 참조)이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 다중특이성 항체는 또한, 항체 Fc-헤테로이량체 분자를 제조하기 위한 정전 스티어링(steering) 효과를 조작함으로써(국제 특허 공개 제 2009/089004A1 호); 2개 이상의 항체 또는 단편을 가교결합시킴으로써(예를 들면, 미국 특허 제 4,676,980 호; 및 문헌 [Brennan et al., Science 229:81-83 (1985)] 참조); 류신 지퍼를 사용하여 이중특이성 항체를 생성함으로써(예를 들면, 문헌 [Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)] 참조); 이중특이성 항체 단편을 제조하기 위해 "디아바디" 기술을 이용함으로써(예를 들면, 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)] 참조); 및 단일쇄 Fv(sFv) 이량체를 사용함으로써(예를 들면, 문헌 [Gruber et al., J. Immunol. 152:5368-5374 (1994)] 참조); 및, 예를 들면, 문헌 [Tutt et al., J. Immunol. 147:60-69 (1991)]에 기술된 바와 같이 삼중특이성 항체를 제조함으로써 제조될 수 있다.
"옥토퍼스(Octopus) 항체"를 포함하여, 3개 이상의 기능성 항원 결합 부위를 갖는 조작된 항체도 또한 본원에 포함된다(예를 들면, 미국 특허 공개 제 2006/0025576 호 참조).
본원에서 상기 항체 또는 단편은 C5 뿐 아니라 다른 상이한 항원에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 "이중 작용 Fab" 또는 "DAF"를 또한 포함한다(예를 들면, 미국 특허 공개 제 2008/0069820 호 참조).
7. 항체 변이체
특정 실시양태에서, 본원에서 제공된 항체들의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 성질을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는, 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 내에 적절한 변형을 도입함으로써, 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 상기 변형은, 예를 들면, 항체의 아미노산 서열로부터의 잔기의 결실, 및/또는 상기 서열내로의 잔기의 삽입 및/또는 상기 서열내에서의 잔기의 치환을 포함한다. 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합을 수행하여 최종 구조물을 수득할 수 있으나, 최종 구조물은 목적하는 특성, 예를 들면, 항원-결합 특성을 소유해야 한다.
a. 치환, 삽입 및 결실 변이체
특정 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 치환적 돌연변이유발을 위한 해당 부위는 HVR 및 FR을 포함한다. 보존적 치환은 "바람직한 치환"이란 제목하에 표 1에 나타나 있다. 표 1에 "예시적 치환"이란 제목하에, 및 아미노산 측쇄 부류와 관련하여 하기에서 더 기술하는 바와 같이, 보다 실질적인 변화들이 제공되어 있다. 아미노산 치환은 해당 항체 내에 도입될 수 있으며, 생성물들은 목적하는 활성, 예를 들면, 유지/개선된 항원 결합 활성, 감소된 면역원성, 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 선별될 수 있다.
원래 잔기 예시적 치환 바람직한 치환
Ala(A) Val; Leu; Ile Val
Arg(R) Lys; Gln; Asn Lys
Asn(N) Gln; His; Asp, Lys; Arg Gln
Asp(D) Glu; Asn Glu
Cys(C) Ser; Ala Ser
Gln(Q) Asn; Glu Asn
Glu(E) Asp; Gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg
Ile(I) Leu; Val; Met; Ala; Phe; 노르류신 Leu
Leu(L) 노르류신; Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile
Lys(K) Arg; Gln; Asn Arg
Met(M) Leu; Phe; Ile Leu
Phe(F) Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val; Ser Ser
Trp(W) Tyr; Phe Tyr
Try(Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe
Val(V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala; 노르류신 Leu
아미노산은 통상적인 측쇄 성질에 따라 분류될 수 있다: (1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) 산성: Asp, Gln; (4) 염기성: His, Lys, Arg; (5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro; 및 (6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 치환은 상기 부류중 하나의 구성원을 다른 부류로 교환하는 것을 포함한다.
치환 변이체의 한 유형은 모 항체(예를 들면, 인간화 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기를 치환시키는 것을 포함한다. 일반적으로, 추가의 연구를 위해 선택된 생성된 변이체(들)는 모 항체에 비해 특정 생물학적 성질(예를 들면, 증가된 친화도, 감소된 면역원성)에서 변화(예를 들면, 개선)를 가질 것이고/이거나 모 항체의 특정 생물학적 성질을 실질적으로 유지할 것이다. 예시적인 치환 변이체는, 편리하게, 예를 들면, 본원에 기술된 바와 같은 파지 디스플레이-기반 친화도 증진 기술을 이용하여 생성될 수 있는 친화도 증진된 항체이다. 간략하게, 하나 이상의 HVR 잔기가 돌연변이되고 변이체 항체는 파지 상에 디스플레이되고 특정 생물 활성(예를 들면, 결합 친화도)에 대해 스크리닝된다.
예를 들면, 항체 친화도를 개선하기 위해, 변이(예를 들면, 치환)가 HVR에서 이루어질 수 있다. 상기 변이는 HVR "핫스팟(hotspot)", 즉, 체세포 성숙 과정동안 높은 빈도로 돌연변이가 일어나는 코돈에 의해 암호화되는 잔기(예를 들면, 문헌 [Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)] 참조), 및/또는 항원과 접촉하는 잔기에서 이루어질 수 있으며, 이때 생성된 변이체 VH 또는 VL은 결합 친화도에 대해 시험된다. 2차 라이브러리를 제작하고 그로부터 재선별하는 것에 의한 친화도 증진은, 예를 들면, 문헌 [Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (2002)]에 기술되어 있다. 친화도 증진의 일부 실시양태에서, 다양한 방법들 중 임의 방법(예를 들면, 실수유발(error-prone) PCR, 쇄 셔플링 또는 올리고뉴클레오티드-지향 돌연변이유발)에 의해 증진을 위해 선택된 가변 유전자 내에 변화가 도입된다. 이어서, 2차 라이브러리가 구축된다. 상기 라이브러리는 이어서 목적하는 친화도를 갖는 임의의 항체 변이체를 확인하기 위해 스크리닝된다. 변화를 도입하는 다른 방법은, 여러 HVR 잔기(예를 들면, 한번에 4 내지 6개 잔기)가 무작위선정되는 HVR-지향 접근방법을 포함한다. 항원 결합에 수반되는 HVR 잔기는, 예를 들면, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모델링을 이용하여 특이적으로 확인될 수 있다. CDR-H3 및 CDR-L3이 특히 종종 표적화된다.
특정 실시양태에서, 변이가 항원에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한 하나 이상의 HVR 내에서 치환, 삽입 또는 결실이 일어날 수 있다. 예를 들면, 결합 친화도를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변이(예를 들면, 본원에 제공된 바와 같은 보존적 치환)가 HVR에서 이루어질 수 있다. 상기 변이는 HVR 중 항원 접촉 잔기의 외부에서 일어날 수 있다. 상기에 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 특정 실시양태에서, 각각의 HVR은 변이되지 않거나, 1개, 2개 또는 3개 이하의 아미노산 치환을 함유한다.
돌연변이유발을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역의 확인에 유용한 방법은 문헌 [Cunningham, Science 244:1081-1085 (1989)]에 기술된 바와 같은 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"로 불린다. 상기 방법에서는, 항체의 항원과의 상호작용이 영향을 받는지를 측정하기 위해 표적 잔기들(예를 들면, arg, asp, his, lys 및 glu와 같은 하전된 잔기들)의 잔기 또는 기를 확인하고 중성 또는 음으로 하전된 아미노산(예를 들면, 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 치환시킨다. 초기 치환에 대해 기능적 민감성을 나타내는 아미노산 위치에 추가의 치환이 도입될 수 있다. 다르게는 또는 추가로, 항체와 항원 사이의 접촉점을 확인하기 위한 항원-항체 복합체의 결정 구조. 상기 접촉 잔기 및 인접 잔기들은 치환 후보로서 표적화되거나 제거될 수 있다. 변이체들이 목적하는 성질을 보유하는지를 결정하기 위해 변이체들을 스크리닝할 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 길이가 1개 잔기로부터 백개 이상 잔기를 함유하는 폴리펩티드까지의 범위인 아미노- 및/또는 카복실-말단 융합 뿐 아니라, 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예로는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체가 포함된다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체로는 효소(예를 들면, ADEPT) 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드에 대한 항체의 N- 또는 C-말단으로의 융합이 포함된다.
b. 글리코실화 변이체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는, 항체가 글리코실화되는 정도를 증가시키거나 감소시키기 위해 변이된다. 항체에 글리코실화 부위의 부가 또는 결실은 편리하게는 하나 이상의 글리코실화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변이시킴으로써 달성될 수 있다.
항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 그에 결합된 탄수화물이 변이될 수 있다. 포유동물 세포에 의해 생성된 천연 항체는 전형적으로, 일반적으로 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 N-결합에 의해 결합된, 분지된 바이안테너리(biantennary) 올리고사카라이드를 포함한다(예를 들면, 문헌 [Wright, TIBTECH 15:26-32 (1997)] 참조). 올리고사카라이드는 다양한 탄수화물, 예를 들면, 만노스, N-아세틸 글루코사민(GlcNAc), 갈락토스 및 시알산 뿐 아니라, 바이안테너리 올리고사카라이드 구조의 "줄기"에서 GlcNAc에 결합된 푸코스를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 특정한 개선된 성질을 갖는 항체 변이체를 생성하기 위해 본 발명의 항체에서 올리고사카라이드의 변형이 이루어질 수 있다.
한 태양에서, Fc 영역에 결합된(직접 또는 간접적으로) 푸코스가 결여된 탄수화물 구조를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 예를 들면, 상기 항체내 푸코스의 양은 1 내지 80%, 1 내지 65%, 5 내지 65%, 또는 20 내지 40%일 수 있다. 푸코스의 양은, 예를 들면, 국제 특허 공개 제 2008/077546 호에 기술된 바와 같이, MALDI-TOF 질량 분석법에 의해 측정시 Asn297에 결합된 모든 당구조물(glycostructure)(예를 들면, 복합체, 하이브리드 및 만노스 고함량 구조물)의 합에 대한, Asn297에서 당 쇄 내의 푸코스의 평균량을 산출함으로써 측정된다. Asn297은 Fc 영역에서 대략 위치 297에 위치한 아스파라긴 잔기를 말하지만(Fc 영역 잔기의 EU 번호체계); Asn297은 또한, 항체내 미미한 서열 변화로 인해, 위치 297의 약 +/-3개 아미노산의 상류 또는 하류에, 즉, 위치 294와 300 사이에 위치할 수도 있다. 상기 푸코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다(예를 들면, 미국 특허 공개 제 2003/0157108 호(프레스타, 엘.(Presta, L.)); 미국 특허 공개 제 2004/0093621 호(쿄와 하코 코교 캄파니 리미티드(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.)) 참조). "탈푸코실화" 또는 "푸코스-결핍" 항체 변이체에 관한 공개공보의 예로는 다음이 포함된다: 미국 특허 공개 제 2003/0157108 호; 국제 특허 공개 제 2000/61739 호; 국제 특허 공개 제 2001/29246 호; 미국 특허 공개 제 2003/0115614 호; 미국 특허 공개 제 2002/0164328 호; 미국 특허 공개 제 2004/0093621 호; 미국 특허 공개 제 2004/0132140 호; 미국 특허 공개 제 2004/0110704 호; 미국 특허 공개 제 2004/0110282 호; 미국 특허 공개 제 2004/0109865 호; 국제 특허 공개 제 2003/085119 호; 국제 특허 공개 제 2003/084570 호; 국제 특허 공개 제 2005/035586 호; 국제 특허 공개 제 2005/035778 호; 국제 특허 공개 제 2005/053742 호; 국제 특허 공개 제 2002/031140 호; 문헌 [Okazaki et al., J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87:614 (2004)]. 탈푸코실화 항체를 생성할 수 있는 세포주의 예로는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포(문헌 [Ripka et al., Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)]; 미국 특허 공개 제 2003/0157108 호, 프레스타 엘.; 및 국제 특허 공개 제　2004/056312 호, 아담스(Adams) 등, 특히 실시예 11), 및 녹아웃(knockout) 세포주, 예를 들면, 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포(예를 들면, 문헌 [Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87:614 (2004); Kanda et al., Biotechnol. Bioeng. 94:680-688 (2006)]; 및 국제 특허 공개 제 2003/085107 호 참조)가 포함된다.
예를 들면, 항체의 Fc 영역에 결합된 바이안테너리 올리고사카라이드가 GlcNAc에 의해 이등분된 이등분 올리고사카라이드를 갖는 항체 변이체가 또한 제공된다. 상기 항체 변이체는 감소된 푸코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 상기 항체 변이체들의 예는, 예를 들면, 국제 특허 공개 제 2003/011878 호(진-메어렛(Jean-Mairet) 등); 미국 특허 제 6,602,684 호(우마나(Umana) 등); 및 미국 특허 공개 제 2005/0123546 호(우마나 등)에 기술되어 있다. Fc 영역에 결합된 올리고사카라이드에 하나 이상의 갈락토스 잔기를 갖는 항체 변이체도 또한 제공된다. 상기 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 상기 항체 변이체는, 예를 들면, 국제 특허 공개 제 1997/30087 호(파텔(Patel) 등); 국제 특허 공개 제 1998/58964 호(라주 에스(Raju, S.)); 및 국제 특허 공개 제 1999/22764 호(라주 에스)에 기술되어 있다.
c. Fc 영역 변이체
특정 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 변형이 본원에 제공된 항체의 Fc 영역내에 도입됨으로써 Fc 영역 변이체를 생성할 수 있다. Fc 영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에 아미노산 변형(예를 들면, 치환)을 포함하는, 인간 Fc 영역 서열(예를 들면, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은, 생체내 항체의 반감기가 중요하지만 특정한 효과기 기능(예를 들면, 보체 및 ADCC)이 불필요하거나 유해한 용도에 바람직한 후보가 되게하는, 전부는 아니지만 일부의 효과기 기능을 갖는 항체 변이체를 고려한다. CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인하기 위해 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 분석을 수행할 수 있다. 예를 들면, 항체가 Fc 감마 R 결합이 결여(따라서 ADCC 활성이 결여되기 쉬운)되지만, FcRn 결합 능력은 보유하는 것을 보장하도록 Fc 수용체(FcR) 결합 분석을 수행할 수 있다. ADCC를 매개하기 위한 1차 세포인 NK 세포는 Fc 감마 RIII 만을 발현시키는 반면에, 단핵구는 Fc 감마 RI, Fc 감마 RII 및 Fc 감마 RIII를 발현시킨다. 조혈 세포상에서의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)]의 464 페이지 표 3에 요약되어 있다. 해당 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 분석의 비-제한 예는 미국 특허 제 5,500,362 호(예를 들면, 문헌 [Hellstrom et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986); and Hellstrom et al., Porc. Natl. Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)] 참조); 미국 특허 제 5,821,337 호(문헌 [Brueggemann et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)] 참조)에 기술되어 있다. 또는, 비-방사성 분석 방법을 이용할 수 있다(예를 들면, 유세포분석을 위한 ACTI™ 비-방사성 세포독성 분석(셀테크놀로지 인코포레이티드(CellTechnology, Inc.), 미국 캘리포니아주 마운틴뷰); 및 사이토톡스(CytoTox) 96(등록상표) 비-방사성 세포독성 분석(프로메가(Promega), 미국 위스콘신주 매디슨) 참조). 상기 분석법들에 유용한 효과기 세포로는 말초혈 단핵 세포(PBMC) 및 자연 살해(Natural Killer, NK) 세포가 포함된다. 다르게는 또는 추가로, 해당 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들면, 문헌 [Clynes et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)]에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 평가할 수 있다. 항체가 C1q와 결합할 수 없고 따라서 CDC 활성이 결여되는지를 확인하기 위해 C1q 결합 분석을 또한 수행할 수 있다(예를 들면, 국제 특허 공개 제 2006/029879 호 및 국제 특허 공개 제 2005/100402 호에서의 C1q 및 C3c 결합 ELISA 참조). 보체 활성화를 평가하기 위해, CDC 분석을 수행할 수 있다(예를 들면, 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163-171 (1996); Cragg et al., Blood 101:1045-1052 (2003); and Cragg et al., Blood 103:2738-2743 (2004)] 참조). FcRn 결합 및 생체내 제거/반감기 측정도 또한 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 수행할 수 있다(예를 들면, 문헌 [Petkova et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)] 참조).
감소된 효과기 기능을 갖는 항체는 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 치환을 갖는 항체를 포함한다(미국 특허 제 6,737,056 호). 상기 Fc 돌연변이체로는, 잔기 265 및 297의 알라닌으로의 치환을 갖는 소위 "DANA" Fc 돌연변이체를 포함하여, 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상에 치환을 갖는 Fc 돌연변이체가 포함된다(미국 특허 제 7,332,581 호).
FcR에 대해 개선되거나 감소된 결합을 갖는 특정 항체 변이체가 기술되어 있다(예를 들면, 미국 특허 제 6,737,056 호; 국제 특허 공개 제 2004/056312 호; 및 문헌 [Shields et al., J. Biol. Chem. 276:6591-6604 (2001)] 참조).
특정 실시양태에서, 항체 변이체는 ADCC를 개선시키는 1개 이상의 아미노산 치환, 예를 들면, Fc 영역의 위치 298, 333 및/또는 334(잔기들의 EU 번호체계)에서의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 예를 들면, 미국 특허 제 6,194,551 호, 국제 특허 공개 제 99/51642 호 및 문헌 [Idusogie et al., J. Immunol. 164:4178-4184 (2000)]에 기술된 바와 같이, 변이된(즉, 개선되거나 감소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC)을 야기하는 변이가 Fc 영역에서 이루어진다.
증가된 반감기, 및 태아에게 보체 IgG의 전달을 담당하는 신생아 Fc 수용체(FcRn)(문헌[Guyer et al., J. Immunol. 117:587-593 (1976); and Kim et al., J. Immunol. 24:2429-2434 (1994)])에 대한 개선된 결합을 갖는 항체가 미국 특허 공개 제 2005/0014934 호(힌튼(Hinton) 등)에 기술되어 있다. 상기 항체들은 그 중에 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합을 개선시키는 하나 이상의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 상기 Fc 변이체로는 Fc 영역 잔기: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 및 434 중 하나 이상에 치환, 예를 들면, Fc 영역 잔기 434의 치환을 갖는 변이체들이 포함된다(미국 특허 제 7,371,826 호).
Fc 영역 변이체의 다른 예에 관하여, 또한 문헌 [Duncan, Nature 332:738-740 (1988)]; 미국 특허 제 5,648,260 호; 미국 특허 제 5,624,821 호; 및 국제 특허 공개 제 94/29351 호를 참조하시오.
d. 시스테인 조작된 항체 변이체
특정 실시양태에서, 항체의 하나 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환된 시스테인 조작된 항체, 예를 들면, "티오MAb"를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 특정 실시양태에서, 치환된 잔기는 항체의 접근가능한 부위에 존재한다. 상기 잔기들을 시스테인으로 치환시킴으로써, 반응성 티올기가 항체의 접근가능한 부위에 위치하고, 항체를 다른 잔기, 예를 들면, 약물 잔기 또는 링커-약물 잔기에 접합시켜 본원에서 추가로 기술하는 바와 같은 면역접합체를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 하기 잔기들 중 임의의 하나 이상이 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205(카밧 번호체계); 중쇄의 A118(EU 번호체계); 및 중쇄 Fc 영역의 S400(EU 번호체계). 시스테인 조작된 항체는, 예를 들면, 미국 특허 제 7,521,541 호에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다.
e. 항체 유도체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 당해 분야에 공지되어 있고 용이하게 이용가능한 추가의 비단백성 잔기를 함유하도록 더 변형될 수 있다. 항체의 유도체화에 적합한 잔기는 수용성 중합체를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다. 수용성 중합체의 비-제한 예로는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-다이옥솔란, 폴리-1,3,6-트라이옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산(단독중합체 또는 랜덤 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올(예, 글리세롤), 폴리비닐 알콜 및 그의 혼합물이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데하이드는 그의 수중 안정성으로 인해 제조시 이점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량을 가질 수 있으며, 분지되거나 분지되지 않을 수 있다. 항체에 결합되는 중합체의 수는 달라질 수 있으며, 하나보다 많은 중합체가 결합되는 경우, 이들은 같거나 다른 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은, 개선될 항체의 특정한 성질 또는 기능, 항체 유도체가 정의된 조건하에서 치료에 사용될 것인지 여부 등을 포함하지만 이로 한정되지는 않는 고려사항들에 근거하여 결정될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 방사선에 노출됨으로써 선택적으로 가열될 수 있는 항체와 비단백성 잔기의 접합체가 제공된다. 한 실시양태에서, 비단백성 잔기는 탄소 나노튜브(nanotube)이다(문헌 [Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:11600-11605 (2005)].) 방사선은 임의의 파장을 가질 수 있으며, 정상 세포에 유해하지 않지만 항체-비단백성 잔기에 근접한 세포가 사멸되는 온도까지 비단백성 잔기를 가열시키는 파장을 포함하나, 이로 한정되지는 않는다.
B. 재조합 방법 및 조성물
항체는, 예를 들면, 미국 특허 제 4,816,567 호에 기술된 바와 같은 재조합 방법 및 조성물을 사용하여 제조할 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에 기술된 항-C5 항체를 암호화하는 단리된 핵산이 제공된다. 상기 핵산은 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열(예를 들면, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)을 암호화할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 상기 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터(예를 들면, 발현 벡터)가 제공된다. 또 다른 실시양태에서, 상기 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 한 상기 실시양태에서, 숙주 세포는 다음을 포함한다(예를 들면, 다음으로 형질전환되었다): (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 제 1 벡터 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 제 2 벡터. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵 세포, 예를 들면, 차이니즈 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary, CHO) 세포 또는 림프계 세포(예를 들면, Y0, NS0, Sp20 세포)이다. 한 실시양태에서, 상기 제공된 바와 같은 항체를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 항체의 발현에 적합한 조건하에서 배양하고, 선택적으로 항체를 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 회수하는 것을 포함하는, 항-C5 항체의 제조 방법이 제공된다.
항-C5 항체의 재조합 생성을 위해, 예를 들어, 전술한 바와 같은 항체를 암호화하는 핵산을 단리하고, 숙주 세포에서의 추가의 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터내에 삽입시킨다. 상기 핵산은 통상적인 절차를 이용하여(예를 들면, 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 단리하고 서열화할 수 있다.
항체-암호화 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포로는 본원에 기술된 원핵 또는 진핵 세포가 포함된다. 예를 들면, 항체는, 특히 글리코실화 및 Fc 효과기 기능이 필요하지 않은 경우, 세균에서 생성될 수 있다. 세균에서의 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해서는, 예를 들면, 미국 특허 제 5,648,237 호, 제 5,789,199 호 및 제 5,840,523 호를 참조하시오(또한 에스케리치아 콜라이에서 항체 단편의 발현을 기술하고 있는 문헌 [Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254] 참조). 발현 후에, 항체는 가용성 분획중 세균 세포 페이스트로부터 단리될 수 있으며 더 정제될 수 있다.
원핵세포 이외에, 글리코실화 경로가 "인간화"되어 부분적으로 또는 완전히 인간 글리코실화 패턴을 갖는 항체의 생성을 야기하는 진균 및 효모 균주를 포함하여, 사상균 또는 효모와 같은 진핵 미생물도 항체-암호화 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다(문헌 [Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004); and Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)] 참조).
글리코실화 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체(무척추동물 및 척추동물)로부터 유도된다. 무척추동물 세포의 예로는 식물 및 곤충 세포가 포함된다. 특히 스포도프테라 프루지페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해, 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는 많은 바큘로바이러스 균주가 동정되었다.
식물 세포 배양균도 또한 숙주로 사용될 수 있다(예를 들면, 미국 특허 제 5,959,177 호, 제 6,040,498 호, 제 6,420,548 호, 제 7,125,978 호 및 제 6,417,429 호(유전자이식 식물에서 항체를 생성하기 위한 플랜티바디즈(PLANTIBODIES™) 기술 설명) 참조).
척추동물 세포도 또한 숙주로 사용될 수 있다. 예를 들면, 현탁 상태로 성장하기에 적합한 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7); 인간 태아 신장 세포주(예를 들면, 문헌 [Graham et al., J. Gen Virol. 36:59-74 (1977)]에 기술된 바와 같은 293 또는 293 세포); 베이비 햄스터 신장 세포(BHK); 마우스 세르톨리(sertoli) 세포(예를 들면, 문헌 [Mather, Biol. Reprod. 23:243-252 (1980)]에 기술된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포(CV1); 아프리카 초록 원숭이 신장 세포(VERO-76); 인간 자궁경부암 세포(HELA); 개 신장 세포(MDCK); 버팔로 래트 간세포(BRL 3A); 인간 폐 세포(W138); 인간 간세포(Hep G2); 마우스 유방암 세포(MMT 060562); 예를 들면, 문헌 [Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)]에 기술된 바와 같은 TRI 세포; MRC5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주로는 DHFR_ CHO 세포(문헌 [Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220 (1980)])를 포함하여 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포; 및 골수종 세포주, 예를 들면, Y0, NS0 및 Sp2/0가 포함된다. 항체 생성에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해서는, 예를 들면, 문헌 [Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)]을 참조하시오.
다중클론 항체는 바람직하게는 관련 항원 및 보조제의 다중 피하(sc) 또는 복강내(ip) 주사에 의해 동물에서 증가된다. 이작용성 약제 또는 유도체화제, 예를 들면, 말레이미도벤조일 설포숙신이미드 에스터(시스테인 잔기를 통한 접합), N-하이드록시숙신이미드(라이신 잔기를 통해), 글루타르알데하이드, 숙신산 무수물, SOCl2 또는 R1N=C=NR(여기서, R 및 R1은 상이한 알킬기이다)을 사용하여, 면역화될 종에서 면역원성인 단백질, 예를 들면, 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린 또는 대두 트립신 억제제에 관련 항원을 접합시키는 것이 유용할 수 있다.
동물(통상적으로 비-인간 포유동물)은, 예를 들면, 100 ㎍ 또는 5 ㎍의 단백질 또는 접합체(각각 토끼 또는 마우스에 대해)를 3 부피의 프로인트(Freund) 완전 보조제와 혼합하고 상기 용액을 여러 부위에 피내 주사함으로써 항원, 면역원성 접합체 또는 유도체에 대해 면역화된다. 1 개월 후에, 여러 부위에서 피하 주사에 의해 프로인트 완전 보조제 중의 원래 양의 1/5 내지 1/10의 펩티드 또는 접합체로 동물들을 추가접종시킨다. 7일 내지 14일 후에 동물들을 출혈시키고 혈청을 항체 역가에 대해 분석한다. 동물들은 역가 안정기에 이를 때까지 추가접종시킨다. 바람직하게, 동물은 동일 항원의 접합체이지만 상이한 단백질에 접합되고/되거나 상이한 가교결합 시약을 통해 접합된 접합체로 추가접종시킨다. 접합체는 또한 재조합 세포 배양물 중에서 단백질 융합물로서 제조될 수 있다. 또한, 명반과 같은 응집제가 면역 반응을 증대시키기 위해 적절하게 사용된다.
단일클론 항체는 실질적으로 동종 항체들의 집단으로부터 수득된다. 즉, 상기 집단을 구성하는 개개 항체들은 미량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 돌연변이 및/또는 번역후 변형(예를 들면, 이성질체화, 아미드화)을 제외하고 동일하다. 따라서, 수식어 "단일클론"은 별개의 항체들의 혼합물이 아닌 것으로서 항체의 특성을 나타낸다.
예를 들면, 단일클론 항체는 문헌 [Kohler et al. Nature 256(5517):495-497 (1975)]에 처음 기술된 하이브리도마 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 하이브리도마 방법에서는, 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물, 예를 들어, 햄스터를 상기에서 기술된 바와 같이 면역화시켜 면역화에 사용된 단백질에 특이적으로 결합할 항체를 생성하거나 생성할 수 있는 림프구를 이끌어낸다. 또는, 림프구는 시험관내에서 면역화될 수 있다.
면역화제는 전형적으로 항원 단백질 또는 그의 융합 변이체를 포함할 것이다. 일반적으로, 인간 기원의 세포가 바람직한 경우 말초혈 림프구(PBL)가 사용되거나, 비-인간 포유동물 공급원이 바람직한 경우 비장 세포 또는 림프절 세포가 사용된다. 이어서, 림프구는 적합한 융합제, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 불멸화 세포주와 융합되어 하이브리도마 세포를 생성한다(문헌 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press (1986), pp. 59-103]).
불멸화 세포주는 통상적으로 형질전환된 포유동물 세포, 특히 설치류, 소 및 인간 기원의 골수종 세포이다. 통상적으로, 래트 또는 마우스 골수종 세포주가 사용된다. 상기와 같이 제조된 하이브리도마 세포는, 바람직하게는 융합되지 않은 모 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유하는 적절한 배양 배지중에 접종되고 성장된다. 예를 들면, 모 골수종 세포가 효소 하이포잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(HGPRT 또는 HPRT)가 결여된 경우, 하이브리도마용 배양 배지는 전형적으로, HGPRT-결핍 세포의 성장을 방지하는 물질들인 하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘((HAT 배지)을 포함할 것이다.
바람직한 불멸화 골수종 세포는, 효과적으로 융합되며 선택된 항체-생성 세포에 의한 항체의 안정한 고수준 생성을 촉진하고 HAT 배지와 같은 배지에 민감한 세포이다. 이들 중에서, 뮤린 골수종 세포주, 예를 들어, 미국 캘리포니아주 샌디에고의 솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터(Salk Institute Cell Distribution Center)로부터 이용가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양으로부터 유도된 세포주, 및 미국 버지니아주 매너서스의 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)으로부터 이용가능한 SP-2 세포(및 그의 유도체, 예를 들면, X63-Ag8-653)가 바람직하다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주도 또한 인간 단일클론 항체의 생성을 위해 기술되었다(문헌 [Kozbor et al., J Immunol. 133(6):3001-3005 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York (1987), pp. 51-63]).
하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지는 항원에 대해 유도된 단일클론 항체의 생성에 대해 분석된다. 바람직하게, 하이브리도마 세포에 의해 생성된 단일클론 항체의 결합 특이성은 면역침전법에 의해, 또는 방사성면역분석법(RIA) 또는 효소-결합 면역흡착 분석법(ELISA)과 같은 시험관내 결합 분석법에 의해 측정된다. 상기 기술 및 분석법들은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 결합 친화도는 문헌 [Munson, Anal Biochem. 107(1):220-239 (1980)]의 스캐차드(Scatchard) 분석에 의해 측정될 수 있다.
목적하는 특이성, 친화도 및/또는 활성을 갖는 항체를 생성하는 하이브리도마 세포가 확인된 후, 클론들은 제한 희석 절차에 의해 서브클로닝되고 표준 방법(상기 고딩(Goding)의 문헌)에 의해 성장될 수 있다. 상기 목적에 적합한 배양 배지로는, 예를 들면, D-MEM 또는 RPMI-1640 배지가 포함된다. 또한, 하이브리도마 세포는 포유동물에서 종양으로서 생체내에서 성장될 수 있다.
서브클론에 의해 분비된 단일클론 항체는, 예를 들면, 단백질 A-세파로스, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화 크로마토그래피와 같은 통상적인 면역글로불린 정제 절차에 의해 배양 배지, 복수 또는 혈청으로부터 적절하게 분리된다.
항체는 적절한 숙주 동물을 항원에 대해 면역화시킴으로써 생성될 수 있다. 한 실시양태에서, 항원은 전장 C5를 포함하는 폴리펩티드이다. 한 실시양태에서, 항원은 C5의 베타쇄(서열번호 40)를 포함하는 폴리펩티드이다. 한 실시양태에서, 항원은 C5의 베타쇄의 MG1-MG2 도메인(서열번호 43)을 포함하는 폴리펩티드이다. 한 실시양태에서, 항원은 C5의 베타쇄의 MG1 도메인(서열번호 41)을 포함하는 폴리펩티드이다. 한 실시양태에서, 항원은 C5의 베타쇄의 위치 19 내지 180에서의 아미노산에 상응하는 영역을 포함하는 폴리펩티드이다. 한 실시양태에서, 항원은 C5의 베타쇄의 위치 33 내지 124에서의 아미노산에 상응하는 영역을 포함하는 폴리펩티드이다. 한 실시양태에서, 항원은 C5의 베타쇄(서열번호 40)의 아미노산 47 내지 57, 70 내지 76, 및 107 내지 110으로부터 선택된 1개 이상의 단편을 포함하는 폴리펩티드이다. 한 실시양태에서, 항원은 Thr47, Glu48, Ala49, Phe50, Asp51, Ala52, Thr53, Lys57, His70, Val71, His72, Ser74, Glu76, Val107, Ser108, Lys109, 및 His110으로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상의 아미노산을 포함하는 C5의 베타쇄의 단편을 포함하는 폴리펩티드이다. 한 실시양태에서, 항원은 Glu48, Asp51, His70, His72, Lys109, 및 His110으로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상의 아미노산을 포함하는 C5의 베타쇄의 단편을 포함하는 폴리펩티드이다. 항원에 대해 동물을 면역화시킴으로써 생성된 항체도 또한 본 발명에 포함된다. 상기 항체는 상기 "대표적인 항-C5 항체"에서 기술된 바와 같은 임의의 특징을 단독으로 또는 조합으로 포함할 수 있다.
C. 분석법
본원에 제공된 항-C5 항체를 당해 분야에 공지된 다양한 분석법들에 의해 그의 물리/화학적 성질 및/또는 생물 활성을 확인하고, 그에 대해 스크리닝하거나 특성화할 수 있다.
1. 결합 분석법 및 기타 분석법
한 태양에서, 본 발명의 항체는, 예를 들면, ELISA, 웨스턴 블롯, 비아코어(등록상표) 등과 같은 공지된 방법에 의해 그의 항원 결합 활성에 대해 검사된다.
또 다른 태양에서, C5에 대한 결합에 있어서 본원에 기술된 항-C5 항체와 경쟁하는 항체를 확인하기 위해 경쟁 분석법이 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 경쟁 항체가 과량으로 존재하는 경우, 상기 항체는 C5에 대한 기준 항체의 결합을 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% 이상 차단한다(예를 들면, 감소시킨다). 일부 경우에서, 결합은 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 이상 억제된다. 특정 실시양태에서, 상기 경쟁 항체는 본원에 기술된 항-C5 항체에 의해 결합되는 동일 에피토프(예를 들면, 선형 또는 입체형태 에피토프)에 결합한다. 항체가 결합하는 에피토프를 맵핑하기 위한 상세한 예시적인 방법들은 문헌 [Morris, "Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ) (1996)]에 제공되어 있다.
예시적인 경쟁 분석법에서, C5에 결합하는 제 1 표지된 (기준) 항체, 및 C5에 대한 결합에 있어서 제 1 항체와 경쟁하는 그 능력에 대해 검사되는 제 2의 비표지 항체를 포함하는 용액중에서, 고정화된 C5를 배양한다. 상기 제 2 항체는 하이브리도마 상등액 중에 존재할 수 있다. 대조군으로서, 고정화된 C5를, 제 1 표지된 항체는 포함하지만 제 2의 비표지 항체는 포함하지 않는 용액 중에서 배양한다. C5에 대한 제 1 항체의 결합을 허용하는 조건하에서 배양한 후, 과량의 미결합 항체를 제거하고, 고정화된 C5와 결합된 표지의 양을 측정한다. 고정화된 C5와 결합된 표지의 양이 대조군 샘플에 비해 검사 샘플에서 실질적으로 감소된다면, 그것은 제 2 항체가 C5에 대한 결합에 있어서 제 1 항체와 경쟁하는 것을 나타낸다(문헌 [Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) (1988)] 참조).
또 다른 예시적인 경쟁 분석법에서는, 제 2 (기준) 항-C5 항체에 의한 C5에 대한 결합과 경쟁하는 검사 항-C5 항체의 능력을 측정하기 위해 비아코어(등록상표) 분석이 이용된다. 비아코어(등록상표) 기기(예를 들면, 비아코어(등록상표) 3000)를 제조사의 권장에 따라 운전하는 또 다른 태양에서, C5 단백질은 C5-코팅된 표면을 생성하기 위해 당해 분야에 공지된 표준 기술을 이용하여 CM5 비아코어(등록상표) 칩 상에 포획된다. 전형적으로 200 내지 800 공명 단위의 C5가 상기 칩에 커플링된다(용이하게 측정할 수 있는 수준의 결합을 제공하지만 사용되는 검사 항체의 농도에 의해 용이하게 포화될 수 있는 양). 서로 경쟁하는 그들의 능력에 대해 평가될 2개의 항체(즉, 검사 항체 및 기준 항체)를 적합한 완충액 중에서 1:1 몰비의 결합 부위에서 혼합하여 검사 혼합물을 생성하였다. 결합 부위 기준으로 농도를 계산할 때, 검사 항체 또는 기준 항체의 분자량은 상응하는 항체의 총 분자량을 항체상의 C-결합 부위의 수로 나눈 값으로 추정된다. 검사 혼합물 중 각 항체(즉, 검사 항체 및 기준 항체)의 농도는 비아코어(등록상표) 칩 상에 포획된 C5 분자 상의 상기 항체에 대한 결합 부위를 용이하게 포화시키기에 충분히 높아야 한다. 혼합물 중 검사 항체 및 기준 항체는 동일한 몰 농도(결합 기준으로), 전형적으로 1.00 내지 1.5 μM(결합 부위 기준)로 존재한다. 검사 항체만 함유하고 기준 항체만 함유하는 별개의 용액들도 또한 준비한다. 상기 용액들중 검사 항체 및 기준 항체는 검사 혼합물 중에서와 동일한 완충액 중에 및 동일한 농도 및 조건으로 존재해야 한다. 검사 항체 및 기준 항체를 함유하는 검사 혼합물을 C5-코팅된 비아코어(등록상표) 칩 위로 이동시키고 총 결합량을 기록한다. 이어서, 상기 칩을 칩-결합된 C5를 손상시키지 않으면서 결합된 검사 항체 또는 기준 항체를 제거하는 방식으로 처리한다. 전형적으로, 상기 처리는 칩을 30 mM HC1로 60 초 동안 처리함으로써 수행된다. 이어서, 검사 항체만의 용액을 C5-코팅된 표면 위로 이동시키고 결합량을 기록한다. 상기 칩을 다시 칩-결합된 C5는 손상시키지 않고 모든 결합된 항체를 제거하도록 처리한다. 이어서, 기준 항체만의 용액을 C5-코팅된 표면 위로 이동시키고 결합량을 기록한다. 다음으로, 검사 항체와 기준 항체의 혼합물의 최대 이론적 결합이 계산되며, 그 양은 C5 표면 위로만 이동될 때 각 항체(즉, 검사 항체 및 기준 항체)의 결합의 합이다. 혼합물의 실제 기록된 결합이 상기 이론적 최대값 미만인 경우, 검사 항체 및 기준 항체는 C5에 결합하는 것에 있어서 서로 경쟁하는 것이다. 따라서, 일반적으로, 경쟁하는 검사 항-C5 항체는 상기 비아코어(등록상표) 차단 분석에서, 분석동안 및 기준 항-C5 항체의 존재하에서 상기 기록된 결합이 검사 항체와 기준 항체 함께의 최대 이론적 결합의 80% 내지 0.1%(예를 들면, 80% 내지 4%), 특히 최대 이론적 결합의 75% 내지 0.1%(예를 들면, 75% 내지 4%), 보다 특히 최대 이론적 결합(상기 정의한 바와 같음)의 70% 내지 0.1%(예를 들면, 70% 내지 4%)이도록, C5에 결합할 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 항-C5 항체는 C5에 결합하는 것에 있어서 항체 CFA0341 및 CFA0330으로부터 선택된 VH 및 VL 쌍을 포함하는 항체와 경쟁한다. 일부 실시양태에서, 항-C5 항체는 C5에 결합하는 것에 있어서 CFA0538, CFA0501, CFA0599, CFA0307, CFA0366, CFA0675, 및 CFA0672로부터 선택된 항체와 경쟁한다. 일부 실시양태에서, 항-C5 항체는 C5에 결합하는 것에 있어서 항체 CFA0329와 경쟁한다. 일부 실시양태에서, 항-C5 항체는 C5에 결합하는 것에 있어서 항체 CFA0666과 경쟁한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 항-C5 항체는 C5에 결합하는 것에 있어서 항체 CFA0305 또는 305LO5의 VH 및 VL 쌍을 포함하는 항체와 경쟁한다.
또 다른 실시양태에서, 항-C5 항체는 산성 pH에서보다 중성 pH에서 더 높은 친화도하에 C5에 결합한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 항-C5 항체는 C5에 결합하는 것에 있어서 CFA0538, CFA0501, CFA0599, CFA0307, CFA0366, CFA0675, 및 CFA0672로부터 선택된 VH 및 VL 쌍을 포함하는 항체와 경쟁한다. 일부 실시양태에서, 항-C5 항체는 C5에 결합하는 것에 있어서 항체 CFA0666과 경쟁한다. 또 다른 실시양태에서, 항-C5 항체는 pH 5.8에서보다 pH 7.4에서 더 높은 친화도하에 C5에 결합한다.
또 다른 실시양태에서, 항-C5 항체는 산성 pH에서보다 중성 pH에서 더 높은 친화도하에 C5에 결합한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 항-C5 항체는 C5에 결합하는 것에 있어서 항체 CFA0503 또는 305LO5의 VH 및 VL 쌍을 포함하는 항체와 경쟁한다. 또 다른 실시양태에서, 항-C5 항체는 pH 5.8에서보다 pH 7.4에서 더 높은 친화도하에 C5에 결합한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 항-C5 항체는 C5에 결합하는 것에 있어서 서열번호 22의 VH 및 서열번호 26의 VL, 또는 서열번호 21의 VH 및 서열번호 25의 VL로부터 선택된 VH 및 VL 쌍을 포함하는 항체와 경쟁한다. 일부 실시양태에서, 항-C5 항체는 C5에 결합하는 것에 있어서 다음으로부터 선택된 VH 및 VL 쌍을 포함하는 항체와 경쟁한다: (a) 서열번호 5의 VH 및 서열번호 15의 VL; (b) 서열번호 4의 VH 및 서열번호 14의 VL; (c) 서열번호 6의 VH 및 서열번호 16의 VL; (d) 서열번호 2의 VH 및 서열번호 12의 VL; (e) 서열번호 3의 VH 및 서열번호 13의 VL; (f) 서열번호 1의 VH 및 서열번호 11의 VL; (g) 서열번호 9의 VH 및 서열번호 19의 VL; (h) 서열번호 7의 VH 및 서열번호 17의 VL; 및 (i) 서열번호 8의 VH 및 서열번호 18의 VL. 일부 실시양태에서, 항-C5 항체는 C5에 결합하는 것에 있어서 서열번호 23의 VH 및 서열번호 27의 VL을 포함하는 항체와 경쟁한다. 일부 실시양태에서, 항-C5 항체는 C5에 결합하는 것에 있어서 서열번호 7의 VH 및 서열번호 17의 VL을 포함하는 항체와 경쟁한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 항-C5 항체는 C5에 결합하는 것에 있어서 다음으로부터 선택된 VH 및 VL 쌍을 포함하는 항체와 경쟁한다: (a) 서열번호 1의 VH 및 서열번호 11의 VL; (b) 서열번호 22의 VH 및 서열번호 26의 VL; (c) 서열번호 21의 VH 및 서열번호 25의 VL; (d) 서열번호 5의 VH 및 서열번호 15의 VL; (e) 서열번호 4의 VH 및 서열번호 14의 VL; (f) 서열번호 6의 VH 및 서열번호 16의 VL; (g) 서열번호 2의 VH 및 서열번호 12의 VL; (h) 서열번호 3의 VH 및 서열번호 13의 VL; (i) 서열번호 9의 VH 및 서열번호 19의 VL; (j) 서열번호 7의 VH 및 서열번호 17의 VL; (k) 서열번호 8의 VH 및 서열번호 18의 VL; (l) 서열번호 23의 VH 및 서열번호 27의 VL; 및 (m) 서열번호 10의 VH 및 서열번호 20의 VL.
특정 실시양태에서, 본 발명의 항-C5 항체는 C5에 결합하는 것에 있어서 다음으로부터 선택된 VH 및 VL 쌍을 포함하는 항체와 경쟁한다: (a) 서열번호 22의 VH 및 서열번호 26의 VL; (b) 서열번호 21의 VH 및 서열번호 25의 VL; (c) 서열번호 5의 VH 및 서열번호 15의 VL; (d) 서열번호 4의 VH 및 서열번호 14의 VL; (e) 서열번호 6의 VH 및 서열번호 16의 VL; (f) 서열번호 2의 VH 및 서열번호 12의 VL; (g) 서열번호 3의 VH 및 서열번호 13의 VL; (h) 서열번호 9의 VH 및 서열번호 19의 VL; (i) 서열번호 7의 VH 및 서열번호 17의 VL; (j) 서열번호 8의 VH 및 서열번호 18의 VL; 및 (k) 서열번호 23의 VH 및 서열번호 27의 VL.
특정 실시양태에서, 본 발명의 항-C5 항체는 C5에 결합하는 것에 있어서 서열번호 1의 VH 및 서열번호 11의 VL, 또는 서열번호 10의 VH 및 서열번호 20의 VL로부터 선택된 VH 및 VL 쌍을 포함하는 항체와 경쟁한다.
또 다른 실시양태에서, 항-C5 항체는 산성 pH에서보다 중성 pH에서 더 높은 친화도하에 C5에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항-C5 항체는 산성 pH에서보다 중성 pH에서 더 높은 친화도하에 C5에 결합하고, C5에 결합하는 것에 있어서 다음으로부터 선택된 VH 및 VL 쌍을 포함하는 항체와 경쟁한다: (a) 서열번호 1의 VH 및 서열번호 11의 VL; (b) 서열번호 5의 VH 및 서열번호 15의 VL; (c) 서열번호 4의 VH 및 서열번호 14의 VL; (d) 서열번호 6의 VH 및 서열번호 16의 VL; (e) 서열번호 2의 VH 및 서열번호 12의 VL; (f) 서열번호 3의 VH 및 서열번호 13의 VL; (g) 서열번호 9의 VH 및 서열번호 19의 VL; (h) 서열번호 7의 VH 및 서열번호 17의 VL; (i) 서열번호 8의 VH 및 서열번호 18의 VL; 및 (j) 서열번호 10의 VH 및 서열번호 20의 VL. 또 다른 실시양태에서, 항-C5 항체는 pH 5.8에서보다 pH 7.4에서 더 높은 친화도하에 C5에 결합한다.
일부 실시양태에서, 항-C5 항체는 산성 pH에서보다 중성 pH에서 더 높은 친화도하에 C5에 결합하고, C5에 결합하는 것에 있어서 다음으로부터 선택된 VH 및 VL 쌍을 포함하는 항체와 경쟁한다: (a) 서열번호 5의 VH 및 서열번호 15의 VL; (b) 서열번호 4의 VH 및 서열번호 14의 VL; (c) 서열번호 6의 VH 및 서열번호 16의 VL; (d) 서열번호 2의 VH 및 서열번호 12의 VL; (e) 서열번호 3의 VH 및 서열번호 13의 VL; (f) 서열번호 1의 VH 및 서열번호 11의 VL; (g) 서열번호 9의 VH 및 서열번호 19의 VL; (h) 서열번호 7의 VH 및 서열번호 17의 VL; 및 (i) 서열번호 8의 VH 및 서열번호 18의 VL. 또 다른 실시양태에서, 항-C5 항체는 pH 5.8에서보다 pH 7.4에서 더 높은 친화도하에 C5에 결합한다.
일부 실시양태에서, 항-C5 항체는 산성 pH에서보다 중성 pH에서 더 높은 친화도하에 C5에 결합하고, C5에 결합하는 것에 있어서 서열번호 1의 VH 및 서열번호 11의 VL, 또는 서열번호 10의 VH 및 서열번호 20의 VL로부터 선택된 VH 및 VL 쌍을 포함하는 항체와 경쟁한다. 또 다른 실시양태에서, 항-C5 항체는 pH 5.8에서보다 pH 7.4에서 더 높은 친화도하에 C5에 결합한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 항-C5 항체가 특정 에피토프에 결합하는지 여부는 다음과 같이 측정할 수 있다: C5의 상의 아미노산(알라닌 제외)이 알라닌으로 치환되는 C5 점 돌연변이체를 293 세포에서 발현시키고, C5 돌연변이체에 대한 항-C5 항체의 결합을 ELISA, 웨스턴 블롯 또는 비아코어(등록상표)에 의해 검사하되; 야생형 C5에 대한 그의 결합에 비해 C5 돌연변이체에 대한 항-C5 항체의 결합의 실질적인 감소 또는 배제는 항-C5 항체가 C5 상의 그 아미노산을 포함하는 에피토프에 결합함을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 알라닌으로 치환될 C5 상의 아미노산은 C5의 베타쇄(서열번호 40)의 Glu48, Asp51, His70, His72, Lys109, 및 His110으로 이루어진 군에서 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 알라닌으로 치환될 C5 상의 아미노산은 C5의 베타쇄(서열번호 40)의 Asp51 또는 Lys109이다.
또 다른 실시양태에서, pH-의존성 결합 특성을 갖는 항-C5 항체가 특정 에피토프에 결합하는지 여부는 다음과 같이 측정할 수 있다: C5 상의 히스티딘 잔기가 또 다른 아미노산(예를 들면, 티로신)으로 치환되는 C5 점 돌연변이체를 293 세포에서 발현시키고, C5 돌연변이체에 대한 항-C5 항체의 결합을 ELISA, 웨스턴 블롯 또는 비아코어(등록상표)에 의해 검사하되; 산성 pH에서의 C5 돌연변이체에 대한 그의 결합에 비해 산성 pH에서 야생형 C5에 대한 항-C5 항체의 결합의 실질적인 감소는 항-C5 항체가 C5 상의 상기 히스티딘 잔기를 포함하는 에피토프에 결합함을 나타낸다. 또 다른 실시양태에서, 중성 pH에서 야생형 C5에 대한 항-C5 항체의 결합은 중성 pH에서 C5 돌연변이체에 대한 그의 결합에 비해 실질적으로 감소되지 않는다. 특정 실시양태에서, 또 다른 아미노산으로 치환될 C5 상의 히스티딘 잔기는 C5의 베타쇄(서열번호 40)의 His70, His72 및 His110으로 이루어진 군에서 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 히스티딘 잔기 His70은 티로신으로 치환된다.
2. 활성 분석법
한 태양에서, 생물 활성을 갖는 그의 항-C5 항체를 확인하기 위한 분석법이 제공된다. 생물 활성은, 예를 들면, C5 활성화의 억제, C5가 절단되어 C5a 및 C5b를 생성하는 것의 방지, C5 전환효소가 C5 상의 절단 부위로 접근하는 것의 차단, C5의 활성화에 의해 야기된 용혈 활성 차단 등을 포함할 수 있다. 생체내 및/또는 시험관내에서 상기 생물 활성을 갖는 항체도 또한 제공된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 상기 생물 활성에 대해 검사된다.
특정 실시양태에서, 검사 항체가 C5의 C5a 및 C5b로의 절단을 억제하는지 여부는, 예를 들면, 문헌 [Isenman et al., J Immunol. 124(1):326-331 (1980)]에 기술된 방법에 의해 측정된다. 또 다른 실시양태에서, 상기 여부는 절단된 C5a 및/또는 C5b 단백질을 특이적으로 검출하는 방법, 예를 들면, ELISA 또는 웨스턴 블롯에 의해 측정된다. 검사 항체의 존재하에서(또는 검사 항체와 접촉한 후에) 감소된 양의 절단 생성물(즉, C5a 및/또는 C5b)이 검출되는 경우, 검사 항체는 C5의 절단을 억제할 수 있는 항체로 확인된다. 특정 실시양태에서, C5a의 농도 및/또는 생리적 활성은, 예를 들면, 주화성 분석법, RIA 또는 ELISA에 의해 측정될 수 있다(예를 들면, 문헌 [Ward and Zvaifler J. Clin. Invest. 50(3):606-616 (1971)] 참조).
특정 실시양태에서, 검사 항체가 C5 전환효소의 C5로의 접근을 차단하는지 여부는 C5 전환효소와 C5 사이의 단백질 상호작용의 검출을 위한 방법, 예를 들면, ELISA 또는 비아코어(등록상표)에 의해 측정된다. 상기 상호작용이 검사 항체의 존재하에서(또는 그와 접촉한 후에) 감소되는 경우, 상기 검사 항체는 C5 전환효소의 C5로의 접근을 차단할 수 있는 항체로 확인된다.
특정 실시양태에서, C5 활성은 대상의 체액중에서 그의 세포-용해 능력의 함수로서 측정될 수 있다. C5의 세포-용해 능력 또는 그의 감소는 당해 분야에 공지된 방법에 의해, 예를 들면, 문헌 [Kabat and Mayer (eds), Experimental Immunochemistry, 2nd Edition, 135-240, Springfield, IL, CC Thomas (1961), pages 135-139]에 기술된 용혈 분석법과 같은 통상적인 용혈 분석법, 또는 예를 들면, 문헌 [Hillmen et al., N. Engl. J. Med. 350(6): 552-559 (2004)]에 기술된 바와 같은 닭 적혈구 용혈 방법과 같은 상기 분석법의 통상적인 변형방법에 의해 측정될 수 있다. 특정 실시양태에서, C5 활성 또는 그의 억제는 CH50eq 분석법을 이용하여 정량화된다. CH50eq 분석법은 혈청중 전체 고전적 보체 활성을 측정하기 위한 방법이다. 상기 검사는 고전적 보체 경로의 활성제로서 항체-감작된 적혈구, 및 50% 용해를 제공하는데 필요한 양(CH50)을 측정하기 위한 검사 혈청의 다양한 희석물을 사용하는 용해 분석법이다. 용혈 백분율은, 예를 들면, 분광광도계를 사용하여 측정할 수 있다. CH50eq 분석법은 말단 보체 복합체(TCC) 자체가 직접적으로, 측정된 용혈의 원인이기 때문에, 상기 TCC 생성의 비간접적 측정을 제공한다. C5 활성화의 억제도 또한 실시예에 나타내고 예시된 방법들을 이용하여 검출되고/되거나 측정될 수 있다. 상기 또는 기타 적합한 유형의 분석법들을 이용하여, C5의 활성화를 억제할 수 있는 후보 항체가 스크리닝될 수 있다. 특정 실시양태에서, C5 활성화의 억제는 유사한 조건하에서의 음성 대조군의 효과와 비교시 분석법에서 C5 활성화에 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% 또는 40% 이상의 감소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 억제는 적어도 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상의 C5 활성화의 억제를 말한다.
D. 면역접합체
본 발명은 또한 하나 이상의 세포독성 약제, 예를 들어, 화학치료제 또는 화학치료 약물, 성장 억제제, 독소(예를 들면, 단백질 독소, 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원을 갖는 효소적으로 활성인 독소, 또는 그의 단편들), 또는 방사성 동위원소에 접합된 본 발명의 항-C5 항체를 포함하는 면역접합체를 제공한다.
한 실시양태에서, 면역접합체는, 메이탄시노이드(예를 들면, 미국 특허 제 5,208,020 호, 제 5,416,064 호 및 유럽 특허 제 0 425 235 B1 호 참조); 오리스타틴, 예를 들면, 모노메틸오리스타틴 약물 잔기 DE 및 DF(MMAE 및 MMAF)(미국 특허 제 5,635,483 호, 제 5,780,588 호 및 7,498,298 호 참조); 돌라스타틴; 칼리키아미신 또는 그의 유도체(미국 특허 제 5,712,374 호, 제 5,714,586 호, 제 5,739,116 호, 제 5,767,285 호, 제 5,770,701 호, 제 5,770,710 호, 제 5,773,001 호 및 제 5,877,296 호; 문헌 [Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993); and Lode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)] 참조); 안트라사이클린, 예를 들어, 다우노마이신 또는 독소루비신(문헌 [Kratz et al.,urrent Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002)]; 및 미국 특허 제 6,630,579 호 참조); 메토트렉세이트; 빈데신; 탁산, 예를 들어, 도세탁셀, 파클리탁셀, 라로탁셀 및 오르타탁셀; 트리코테신; 및 CC1065를 포함한(이로 한정되지는 않는다) 하나 이상의 약물에 항체가 접합된 항체-약물 접합체(ADC)이다.
또 다른 실시양태에서, 면역접합체는, 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄(슈도모나스 에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터의), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사크린, 유동(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 미국자리공(Phytolaca americana) 단백질(PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 여주(momordica charantia) 억제제, 커신, 크로틴, 비누풀(sapaonaria officinalis) 억제제, 젤로닌, 미토젤린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테신을 포함한(이로 한정되지는 않는다), 효소적으로 활성인 독소 또는 그의 단편에 접합된 본원에 기술된 바와 같은 항체를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 면역접합체는 방사성 원자에 접합된 본원에 기술된 바와 같은 항체를 포함하여 방사성접합체를 생성한다. 다양한 방사성 동위원소가 방사성접합체의 생성에 이용가능하다. 예로는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소가 포함된다. 방사성접합체가 검출에 사용되는 경우, 상기 방사성접합체는 섬광조영술 연구용의 방사성 원소, 예를 들면, tc99m 또는 I123, 또는 핵자기 공명(NMR) 영상법(자기 공명 영상법, mri로도 알려져 있음)를 위한 스핀 표지, 예를 들어, 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 플루오르-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.
항체와 세포독성 약제의 접합체는 다양한 이작용성 단백질 커플링제, 예를 들어, N-숙신이미딜-3-(2-피리딜다이티오) 프로피오네이트(SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(SMCC), 이미노티올란(IT), 이미도에스터의 이작용성 유도체(예를 들어, 다이메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스터(예를 들어, 다이숙신이미딜 수베레이트) 알데하이드(예를 들어, 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물(예를 들어, 비스(p-아지도벤조일)헥산다이아민), 비스-다이아조늄 유도체(예를 들어, 비스-(p-다이아조늄벤조일)-에틸렌다이아민), 다이이소시아네이트(예를 들어, 톨루엔 2,6-다이이소시아네이트) 및 비스-활성 플루오르 화합물(예를 들어, 1,5-다이플루오로-2,4-다이니트로벤젠)을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들면, 리신 면역독소는 문헌 [Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)]에 기술된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸다이에틸렌 트리아민펜타아세트산(MX-DTPA)은 항체에 방사성뉴클레오티드를 접합시키기 위한 대표적인 킬레이트화제이다(국제 특허 공개 제94/11026 호 참조). 링커는 세포에서 세포독성 약물의 방출을 촉진하는 "절단성 링커"일 수 있다. 예를 들면, 산-불안정 링커, 펩티다제-민감성 링커, 광불안정 링커, 다이메틸 링커 또는 다이설파이드-함유 링커(문헌 [Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992)]; 미국 특허 제 5,208,020 호)를 사용할 수 있다.
면역접합체 또는 ADC는 본원에서 특별히, 상업적으로 시판하는(예를 들면, 미국 일리노이주 록포드의 피어스 바이오테크놀로지 인코포레이티드(Pierce Biotechnology, Inc.)에서) BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 설포-EMCS, 설포-GMBS, 설포-KMUS, 설포-MBS, 설포-SIAB, 설포-SMCC, 및 설포-SMPB, 및 SVSB(숙신이미딜-(4-비닐설폰)벤조에이트)를 포함한(이로 한정되지는 않는다) 가교결합 시약을 사용하여 제조된 상기 접합체들을 포괄하지만, 이로 한정되지는 않는다.
E. 진단 및 검출을 위한 방법 및 조성물
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 임의의 항-C5 항체는 생물 샘플에서 C5의 존재를 검출하기에 유용하다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "검출"은 정량적 또는 정성적 검출을 포함한다. 특정 실시양태에서, 생물 샘플은 세포 또는 조직, 예를 들어, 혈청, 전혈, 혈장, 생검 샘플, 조직 샘플, 세포 현탁액, 타액, 객담, 구강액, 뇌척수액, 양수, 복수, 모유, 초유, 유선 분비물, 림프, 소변, 땀, 누액, 위액, 윤활액, 복막액, 수정체액 및 점액을 포함한다.
한 실시양태에서, 진단 또는 검출 방법에 사용하기 위한 항-C5 항체가 제공된다. 또 다른 태양에서, 생물 샘플중 C5의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 생물 샘플을 C5에 대한 항-C5 항체의 결합을 허용하는 조건하에서 본원에 기술된 바와 같은 항-C5 항체와 접촉시키고, 항-C5 항체와 C5 사이에 복합체가 형성되는지 여부를 검출하는 것을 포함한다. 상기 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다. 한 실시양태에서, 예를 들면, C5가 환자 선별을 위한 바이오마커인 경우, 항-C5 항체를 사용하여 항-C5 항체를 사용한 치료에 해당되는 대상을 선별한다.
또 다른 실시양태에서, C5의 과도하거나 통제되지 않는 활성화를 수반하는 보체-매개 질환 또는 질병을 갖는 개체를 본 발명의 항-C5 항체를 포함하는 치료에 적합한 것으로 선별하는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 (a) 개체로부터 수득된 C5에서 유전자 변이를 검출하고, (b) 상기 유전자 변이가 개체로부터 수득된 C5에서 검출되는 경우 상기 개체를 본 발명의 항-C5 항체를 포함하는 치료에 적합한 것으로 선별하는 것을 포함한다. 또 다른 태양에서, C5의 과도하거나 통제되지 않는 활성화를 수반하는 보체-매개 질환 또는 질병을 갖는 개체를 위한 치료를 선별하는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 (a) 개체로부터 수득된 C5에서 유전자 변이를 검출하고, (b) 상기 유전자 변이가 개체로부터 수득된 C5에서 검출되는 경우 상기 개체를 위해 본 발명의 항-C5 항체를 포함하는 치료를 선별하는 것을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, C5의 과도하거나 통제되지 않는 활성화를 수반하는 보체-매개된 질환 또는 질병을 갖는 개체를 치료하는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 (a) 개체로부터 수득된 C5에서 유전자 변이를 검출하고, (b) 개체로부터 수득된 C5에서 유전자 변이가 검출되는 경우 상기 개체를 본 발명의 항-C5 항체를 포함하는 치료에 적합한 것으로 선별하고, (c) 본 발명의 항-C5 항체를 상기 개체에게 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, C5의 과도하거나 통제되지 않는 활성화를 수반하는 보체-매개된 질환 또는 질병을 갖는 개체를 치료하는데 사용하기 위한 본 발명의 항-C5 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 상기 개체로부터 수득된 C5에서 유전자 변이가 검출되는 경우 상기 개체는 본 발명의 항-C5 항체로 치료된다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항-C5 항체를 포함하는 치료에 적합한 것으로서 C5의 과도하거나 통제되지 않는 활성화를 수반하는 보체-매개된 질환 또는 질병을 갖는 개체를 선별하기 위한 C5에서의 유전자 변이의 시험관내 용도가 제공된다. 특정 실시양태에서, 개체로부터 수득된 C5에서 유전자 변이가 검출되는 경우 상기 개체는 상기 치료에 적합한 것으로서 선별된다. 또 다른 실시양태에서, C5의 과도하거나 통제되지 않는 활성화를 수반하는 보체-매개된 질환 또는 질병을 갖는 개체를 위한 치료를 선별하기 위한 C5에서의 유전자 변이의 시험관내 용도가 제공된다. 특정 실시양태에서, 개체로부터 수득된 C5에서 유전자 변이가 검출되는 경우 본 발명의 항-C5 항체를 포함하는 치료가 상기 개체를 위해 선별된다.
C5에서의 유전자 변이를 갖는 일부 환자가 기존 항-C5 항체를 포함하는 치료에 불량한 반응을 나타내는 것으로 보고되었다(문헌 [Nishimura et al., N. Engl. J. Med. 370:632-639 (2014)]). 상기 환자는, 하기 실시예에서 입증되는 바와 같이, 상기 항체가 C5 변이체뿐 아니라 야생형 C5의 활성화에 대해 억제 활성을 가지기 때문에, 본 발명의 항-C5 항체를 포함하는 치료로 치료되도록 권장된다.
C5에서의 유전자 변이의 검출은 선행 기술에서 알려진 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 방법은 서열분석, PCR, RT-PCR, 및 하이브리드화-기반 방법, 예를 들면, 서던 블롯 또는 노던 블롯을 포함할 수 있으나, 이로 한정되지는 않는다. C5 변이체는 하나 이상의 유전자 변이를 포함할 수 있다. 상기 유전자 변이는 V145I, R449G, V802I, R885H, R928Q, D966Y, S1310N, 및 E1437D로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 여기에서, R885H는, 예를 들면, 위치 885에서의 아르기닌이 히스티딘으로 치환된 유전자 변이를 의미한다. 특정 실시양태에서, C5 변이체는 야생형 C5와 유사한 생물 활성을 갖는다.
본 발명의 항체를 사용하여 진단될 수 있는 대표적인 질환으로는 다음이 포함된다: 류마티스성 관절염(RA); 전신성 홍반성 루프스(SLE); 루프스 신염; 허혈 재관류 손상(IRI); 천식; 발작성 야간 헤모글로빈뇨(PNH); 용혈 요독 증후군(HUS)(예를 들면, 비정형 용혈 요독 증후군(aHUS)); 고밀도 침착병(DDD); 시신경척수염(NMO); 다초점성 운동신경병증(MMN): 다발성 경화증(MS): 전신 경화증; 황반변성(예를 들면, 연령-관련 황반변성(AMD)); 용혈, 간효소 증가 및 저혈소판(HELLP) 증후군; 혈전성 혈소판감소성 자반증(TTP); 자연 유산; 수포성 표피박리증; 재발성 유산; 자간전증; 외상성 뇌손상; 중증 근무력증; 한랭응집소병; 쇼그렌(Sjogren) 증후군; 피부근염; 수포성 유천포창; 광독성 반응; 시가(Shiga) 독소 에스케리치아 콜라이-관련 용혈성 요독 증후군; 전형적 또는 감염성 용혈성 요독 증후군(tHUS); C3 사구체신염; 항중성구 세포질 항체(ANCA)-연관 혈관염; 체액 및 혈관 이식 거부반응; 급성 항체 매개 거부반응(AMR); 이식편 기능장애; 심근경색; 동종이계 이식; 패혈증; 관상동맥 질환; 유전성 혈관부종; 피부근염; 그레이브(Grave)씨병; 죽상동맥경화증; 알츠하이머(Alzheimer)병(AD); 헌팅톤(Huntington)병; 크레이츠펠트-야콥(Creutzfeld-Jacob)병; 파킨슨(Parkinson)병; 암; 상처; 패혈성 쇼크; 척수 손상; 포도막염; 당뇨성 안질환; 미숙아 망막증; 사구체신염; 막성 신염; 면역글로불린 A 신장병증; 성인 호흡 곤란 증후군(ARDS); 만성 폐쇄성 폐질환(COPD); 낭성 섬유증; 용혈성 빈혈; 발작성 한랭 혈색소뇨증; 아나필락시스 쇼크; 알러지; 골다공증; 골관절염; 하시모토(Hashimoto) 갑상선염; 제 1형 당뇨병; 건선; 천포창; 자가면역 용혈성 빈혈(AIHA); 특발성 혈소판감소성 자반병(ITP); 굿파스튜어(Goodpasture) 증후군; 데고스(Degos)병; 항인지질 증후군(APS); 파국적 APS(CAPS); 심혈관 질환; 심근염; 뇌혈관 질환; 말초혈관 질환; 신장혈관 질환; 장간막/장 혈관 질환; 혈관염; 헤노흐-쉔라인(Henoch-Schonlein) 자반병성 신염; 다카야스(Takayasu)병; 확장성 심근병증; 당뇨성 혈관병증; 카와사키(Kawasaki)병(동맥염); 정맥 공기 색전(VGE), 스텐트 설치후 재협착; 회전 죽상반절제술; 막성 신장병증; 길랑-바레(Guillain-Barre) 증후군(GBS); 피셔(Fisher) 증후군; 항원-유도성 관절염; 윤활막 염증; 바이러스 감염; 세균 감염; 진균 감염; 및 심근경색, 심폐 우회술 및 혈액투석에서 비롯된 손상.
특정 실시양태에서, 표지된 항-C5 항체가 제공된다. 표지로는 직접 검출되는 표지 또는 잔기(예를 들어, 형광, 발색, 전자-고밀도, 화학발광 및 방사성 표지) 뿐 아니라, 예를 들어, 효소 반응 또는 분자 상호작용을 통해 간접적으로 검출되는 잔기, 예를 들어, 효소 또는 리간드가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 대표적인 표지로는 방사성동위원소 32P, 14C, 125I. 3H 및 131I, 형광단, 예를 들어, 희토류 킬레이트화물 또는 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 움벨리페론, 루세리퍼라제, 예를 들면, 반딧불이 루시퍼라제 및 세균성 루시퍼라제(미국 특허 제 4,737,456 호), 루시페린, 2,3-다이하이드로프탈라진디온, 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP), 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제, 예를 들면, 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제 및 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제, HRP, 락토퍼옥시다제 또는 마이크로퍼옥시다제와 같은 염료 전구체를 산화시키기 위해 과산화수소를 사용하는 효소와 커플링된 헤테로사이클릭 옥시다제, 예를 들면, 우리카제 및 잔틴 옥시다제, 비오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파지 표지, 안정한 유리 라디칼 등이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다.
F. 약학 제형
본원에 기술된 바와 같은 항-C5 항체의 약학 제형은 목적하는 정도의 순도를 갖는 상기 항체를 하나 이상의 선택적인 약학적으로 허용되는 담체(문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)])와 혼합함으로써, 동결건조 제형 또는 수용액의 형태로 제조된다. 약학적으로 허용되는 담체는 일반적으로, 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 무독성이며, 다음을 포함하나 이로 한정되지는 않는다: 완충제, 예를 들어, 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 아스콜브산 및 메티오닌을 포함한 산화방지제; 방부제(예를 들어, 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신; 모노사카라이드, 다이사카라이드, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함한 기타 탄수화물; 킬레이트화제, 예를 들어, EDTA; 당, 예를 들면, 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨; 염-생성 상대-이온, 예를 들어, 나트륨; 금속 착체(예를 들면, Zn-단백질 착체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG). 본원에서 대표적인 약학적으로 허용되는 담체로는 또한 간질성(intersitial) 약물 분산제, 예를 들어, 가용성 중성-활성 히알루로니다제 당단백질(sHASEGP), 예를 들면, 인간 가용성 PH-20 히알루로니다제 당단백질, 예를 들어, rHuPH20(하일레넥스(HYLENEX, 등록상표), 박스터 인터내셔날 인코포레이티드(Baxter International, Inc.))이 포함된다. rHuPH20을 포함하여, 특정한 대표적 sHASEGP 및 사용 방법은 미국 특허 공개 제 2005/0260186 호 및 제 2006/0104968 호에 기술되어 있다. 한 태양에서, sHASEGP는 콘드로이티나제와 같은 하나 이상의 추가의 글리코스아미노글리카나제와 혼합된다.
대표적인 동결건조 항체 제형이 미국 특허 제 6,267,958 호에 기술되어 있다. 수성 항체 제형으로는 미국 특허 제 6,171,586 호 및 국제 특허 공개 제 2006/044908 호에 기술된 것들이 포함되며, 상기 후자의 제형은 히스티딘-아세테이트 완충제를 포함한다.
본 발명의 제형은 또한 치료되는 특정한 적응증에 필요한 대로 하나보다 많은 활성 성분, 바람직하게는 서로 불리하게 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는 성분들을 함유할 수 있다. 상기 활성 성분들은 적절하게는 의도한 목적에 효과적인 양으로 함께 존재한다.
활성 성분들은, 예를 들면, 코아세르베이션(coacervation) 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조된 미세캡슐에, 예를 들면, 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-미세캡슐 및 폴리(메틸메타크릴레이트) 미세캡슐 각각에, 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들면, 리포좀, 알부민 미세구, 미세유화액, 나노-입자 및 나노캡슐)에, 또는 마크로유화액에 봉입될 수 있다. 상기 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
서방성 제제가 제조될 수 있다. 서방성 제제의 적절한 예로는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되며, 상기 매트릭스는 성형 제품, 예를 들면, 필름 또는 미세캡슐의 형태이다.
생체내 투여에 사용될 제형은 일반적으로 멸균성이다. 멸균은, 예를 들면, 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성될 수 있다.
G. 치료 방법 및 조성물
본원에 제공된 임의의 항-C5 항체는 치료 방법에 사용될 수 있다.
한 태양에서, 약제로 사용하기 위한 항-C5 항체가 제공된다. 또 다른 태양에서, C5의 과도하거나 통제되지 않는 활성화를 수반하는 보체-매개 질환 또는 질병을 치료하는데 사용하기 위한 항-C5 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 치료 방법에 사용하기 위한 항-C5 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 본 발명은, 개체에게 효과량의 항-C5 항체를 투여하는 것을 포함하는, C5의 과도하거나 통제되지 않는 활성화를 수반하는 보체-매개 질환 또는 질병을 갖는 개체를 치료하는 방법에 사용하기 위한, 항-C5 항체를 제공한다. 한 상기 실시양태에서, 상기 방법은 개체에게 효과량의 하나 이상의 추가의 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 임의의 상기 실시양태에 따른 "개체"는 바람직하게는 인간이다.
항원이 가용성 단백질인 경우, 항체 자체가 혈장에서 더 긴 반감기를 가지고 항원에 대한 운반체로서 작용하기 때문에, 그 항원에 대한 항체의 결합은 혈장에서 항원의 연장된 반감기(즉, 혈장으로부터 항원의 감소된 제거)를 야기할 수 있다. 이것은 세포내 엔도솜 경로를 통한 FcRn에 의한 항원-항체 복합체의 재순환에 기인한다(문헌 [Roopenian, Nat. Rev. Immunol. 7(9):715-725 (2007)]). 그러나, 세포내로의 진입후에 산성 엔도솜 구획내로 항체를 방출하는 동안 중성 세포외 환경에서 그 항원에 결합하는, pH-의존성 결합 특성을 갖는 항체는, pH-비의존적 방식으로 결합하는 그의 대응물에 비해 항원 중화 및 제거와 관련하여 우수한 성질을 가질 것으로 예상된다(문헌 [Igawa et al., Nat. Biotech.. 28(11):1203-1207 (2010); Devanaboyina et al., mAbs 5(6):851-859 (2013)]; 국제 특허 공개 제 2009/125825 호).
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 혈장으로부터 C5의 제거를 증진시키는데 사용하기 위한 항-C5 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 혈장으로부터 C5의 제거를 증진시키기에 효과적인 양의 항-C5 항체를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 혈장으로부터 C5의 제거를 증진시키는 방법에서 사용하기 위한 항-C5 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 항-C5 항체는 pH-의존성 결합 특성을 갖지 않는 종래의 항-C5 항체에 비해, 혈장으로부터 C5의 제거를 증진시킨다. 임의의 상기 실시양태에 따른 "개체"는 바람직하게는 인간이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 혈장내 C5의 축적을 억제하는데 사용하기 위한 항-C5 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 혈장내 C5의 축적을 억제하기에 효과적인 양의 항-C5 항체를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 혈장내 C5의 축적을 억제하는 방법에 사용하기 위한 항-C5 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 혈장내 C5의 축적은 항원-항체 복합체 생성의 결과이다. 또 다른 실시양태에서, 항-C5 항체는 pH-의존성 결합 특성을 갖지 않는 종래의 항-C5 항체에 비해, 혈장내 C5의 축적을 억제한다. 임의의 상기 실시양태에 따른 "개체"는 바람직하게는 인간이다.
본 발명의 항-C5 항체는 C5의 활성화를 억제할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 C5의 활성화를 억제하는데 사용하기 위한 항-C5 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 C5의 활성화를 억제하기에 효과적인 양의 항-C5 항체를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 C5의 활성화를 억제하는 방법에 사용하기 위한 항-C5 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, C5에 의해 매개된 세포독성은 C5의 활성화를 저해시킴으로써 억제된다. 임의의 상기 실시양태에 따른 "개체"는 바람직하게는 인간이다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 약제의 생산 또는 제조에 있어서 항-C5 항체의 용도를 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 약제는 C5의 과도하거나 통제되지 않는 활성화를 수반하는 보체-매개 질환 또는 질병의 치료를 위한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 약제는 C5의 과도하거나 통제되지 않는 활성화를 수반하는 보체-매개 질환 또는 질병을 갖는 개체에게 효과량의 약제를 투여하는 것을 포함하는, C5의 과도하거나 통제되지 않는 활성화를 수반하는 보체-매개 질환 또는 질병을 치료하는 방법에 사용하기 위한 것이다. 한 상기 실시양태에서, 상기 방법은 효과량의 하나 이상의 추가의 치료제를 개체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 임의의 상기 실시양태에 따른 "개체"는 바람직하게는 인간이다.
또 다른 실시양태에서, 약제는 혈장으로부터 C5의 제거를 증진시키기 위한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 약제는 혈장으로부터 C5의 제거를 증진시키기에 효과적인 양의 약제를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 혈장으로부터 C5의 제거를 증진시키는 방법에 사용하기 위한 것이다. 한 실시양태에서, 항-C5 항체는 pH-의존성 결합 특성을 갖지 않는 종래의 항-C5 항체에 비해, 혈장으로부터 C5의 제거를 증진시킨다. 임의의 상기 실시양태에 따른 "개체"는 인간일 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 약제는 혈장내 C5의 축적을 억제하는데 사용하기 위한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 약제는 혈장내 C5의 축적을 억제하기에 효과적인 양의 약제를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 혈장내 C5의 축적을 억제하는 방법에 사용하기 위한 것이다. 한 실시양태에서, 혈장내 C5의 축적은 항원-항체 복합체 생성의 결과이다. 또 다른 실시양태에서, 항-C5 항체는 pH-의존성 결합 특성을 갖지 않는 종래의 항-C5 항체에 비해, 혈장내 C5의 축적을 억제한다. 임의의 상기 실시양태에 따른 "개체"는 인간일 수 있다.
본 발명의 항-C5 항체는 C5의 활성화를 억제할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 약제는 C5의 활성화를 억제하기 위한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 약제는 C5의 활성화를 억제하기에 효과적인 양의 약제를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 C5의 활성화를 억제하는 방법에 사용하기 위한 것이다. 한 실시양태에서, C5에 의해 매개된 세포독성은 C5의 활성화를 저해시킴으로써 억제된다. 임의의 상기 실시양태에 따른 "개체"는 인간일 수 있다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 C5의 과도하거나 통제되지 않는 활성화를 수반하는 보체-매개 질환 또는 질병을 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 C5의 과도하거나 통제되지 않는 활성화를 수반하는 보체-매개 질환 또는 질병을 갖는 개체에게 효과량의 항-C5 항체를 투여하는 것을 포함한다. 한 상기 실시양태에서, 상기 방법은 효과량의 하나 이상의 추가의 치료제를 개체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 임의의 상기 실시양태에 따른 "개체"는 인간일 수 있다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 개체에서 혈장으로부터 C5의 제거를 증진시키기 위한 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 혈장으로부터 C5의 제거를 증진시키기에 효과적인 양의 항-C5 항체를 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-C5 항체는 pH-의존성 결합 특성을 갖지 않는 종래의 항-C5 항체에 비해, 혈장으로부터 C5의 제거를 증진시킨다. 한 실시양태에서, "개체"는 인간이다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 개체에서 혈장내 C5의 축적을 억제하기 위한 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 혈장내 C5의 축적을 억제하기에 효과적인 양의 항-C5 항체를 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 혈장내 C5의 축적은 항원-항체 복합체 생성의 결과이다. 또 다른 실시양태에서, 항-C5 항체는 pH-의존성 결합 특성을 갖지 않는 종래의 항-C5 항체에 비해, 혈장내 C5의 축적을 억제한다. 한 실시양태에서, "개체"는 인간이다.
본 발명의 항-C5 항체는 C5의 활성화를 억제할 수 있다. 또 다른 태양에서, 본 발명은 개체에서 C5의 활성화를 억제하기 위한 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 C5의 활성화를 억제하기에 효과적인 양의 항-C5 항체를 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, C5에 의해 매개된 세포독성은 C5의 활성화를 저해시킴으로써 억제된다. 한 실시양태에서, "개체"는 인간이다.
또 다른 태양에서, 본 발명은, 예를 들면, 임의의 상기 치료 방법에 사용하기 위한, 본원에 제공된 임의의 항-C5 항체를 포함하는 약학 제형을 제공한다. 한 실시양태에서, 약학 제형은 본원에 제공된 임의의 항-C5 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 약학 제형은 본원에 제공된 임의의 항-C5 항체 및 하나 이상의 추가의 치료제를 포함한다.
또 다른 태양에서, 약학 제형은 C5의 과도하거나 통제되지 않는 활성화를 수반하는 보체-매개 질환 또는 질병의 치료를 위한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 약학 제형은 혈장으로부터 C5의 제거를 증진시키기 위한 것이다. 한 실시양태에서, 항-C5 항체는 pH-의존성 결합 특성을 갖지 않는 종래의 항-C5 항체에 비해, 혈장으로부터 C5의 제거를 증진시킨다. 또 다른 실시양태에서, 약학 제형은 혈장내 C5의 축적을 억제하는데 사용하기 위한 것이다. 한 실시양태에서, 혈장내 C5의 축적은 항원-항체 복합체 생성의 결과이다. 또 다른 실시양태에서, 항-C5 항체는 pH-의존성 결합 특성을 갖지 않는 종래의 항-C5 항체에 비해, 혈장내 C5의 축적을 억제한다. 본 발명의 항-C5 항체는 C5의 활성화를 억제할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 약학 제형은 C5의 활성화를 억제하기 위한 것이다. 한 실시양태에서, C5에 의해 매개된 세포독성은 C5의 활성화를 저해시킴으로써 억제된다. 한 실시양태에서, 약학 제형은 C5의 과도하거나 통제되지 않는 활성화를 수반하는 보체-매개 질환 또는 질병을 갖는 개체에게 투여된다. 임의의 상기 실시양태에 따른 "개체"는 바람직하게는 인간이다.
한 태양에서, 개체는 야생형 C5를 갖는다. 또 다른 태양에서, 개체는 C5 변이체를 갖는다. 특정 실시양태에서, C5 변이체는 야생형 C5와 유사한 생물 활성을 갖는다. 상기 C5 변이체는 V145I, R449G, V802I, R885H, R928Q, D966Y, S1310N, 및 E1437D로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상의 변이를 포함할 수 있다. 여기에서, 예를 들면, R885H는 위치 885에서의 아르기닌이 히스티딘으로 치환된 유전자 변이를 의미한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은, 예를 들면, 임의의 상기 치료 방법들에서 사용하기 위해, 본원에 제공된 임의의 항-C5 항체를 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하는 것을 포함하는, 약제 또는 약학 제형을 제조하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 약제 또는 약학 제형을 제조하는 방법은 하나 이상의 추가의 치료제를 상기 약제 또는 약학 제형에 첨가하는 것을 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, C5의 과도하거나 통제되지 않는 활성화를 수반하는 보체-매개 질환 또는 질병은 다음으로 이루어진 군에서 선택된다: 류마티스성 관절염(RA); 전신성 홍반성 루프스(SLE); 루프스 신염; 허혈 재관류 손상(IRI); 천식; 발작성 야간 헤모글로빈뇨(PNH); 용혈 요독 증후군(HUS)(예를 들면, 비정형 용혈 요독 증후군(aHUS)); 고밀도 침착병(DDD); 시신경척수염(NMO); 다초점성 운동신경병증(MMN): 다발성 경화증(MS): 전신 경화증; 황반변성(예를 들면, 연령-관련 황반변성(AMD)); 용혈, 간효소 증가 및 저혈소판(HELLP) 증후군; 혈전성 혈소판감소성 자반증(TTP); 자연 유산; 수포성 표피박리증; 재발성 유산; 자간전증; 외상성 뇌손상; 중증 근무력증; 한랭응집소병; 쇼그렌 증후군; 피부근염; 수포성 유천포창; 광독성 반응; 시가 독소 에스케리치아 콜라이-관련 용혈성 요독 증후군; 전형적 또는 감염성 용혈성 요독 증후군(tHUS); C3 사구체신염; 항중성구 세포질 항체(ANCA)-연관 혈관염; 체액 및 혈관 이식 거부반응; 급성 항체 매개 거부반응(AMR); 이식편 기능장애; 심근경색; 동종이계 이식; 패혈증; 관상동맥 질환; 유전성 혈관부종; 피부근염; 그레이브씨병; 죽상동맥경화증; 알츠하이머병(AD); 헌팅톤병; 크레이츠펠트-야콥병; 파킨슨병; 암; 상처; 패혈성 쇼크; 척수 손상; 포도막염; 당뇨성 안질환; 미숙아 망막증; 사구체신염; 막성 신염; 면역글로불린 A 신장병증; 성인 호흡 곤란 증후군(ARDS); 만성 폐쇄성 폐질환(COPD); 낭성 섬유증; 용혈성 빈혈; 발작성 한랭 혈색소뇨증; 아나필락시스 쇼크; 알러지; 골다공증; 골관절염; 하시모토 갑상선염; 제 1형 당뇨병; 건선; 천포창; 자가면역 용혈성 빈혈(AIHA); 특발성 혈소판감소성 자반병(ITP); 굿파스튜어 증후군; 데고스병; 항인지질 증후군(APS); 파국적 APS(CAPS); 심혈관 질환; 심근염; 뇌혈관 질환; 말초혈관 질환; 신장혈관 질환; 장간막/장 혈관 질환; 혈관염; 헤노흐-쉔라인 자반병성 신염; 다카야스병; 확장성 심근병증; 당뇨성 혈관병증; 카와사키병(동맥염); 정맥 공기 색전(VGE), 스텐트 설치후 재협착; 회전 죽상반절제술; 막성 신장병증; 길랑-바레 증후군(GBS); 피셔 증후군; 항원-유도성 관절염; 윤활막 염증; 바이러스 감염; 세균 감염; 진균 감염; 및 심근경색, 심폐 우회술 및 혈액투석에서 비롯된 손상.
특정 실시양태에서, 보체-매개 질환 또는 질병은 안질환이다. 또 다른 실시양태에서, 안질환은 황반변성이다. 또 다른 실시양태에서, 황반변성은 AMD이다. 또 다른 실시양태에서, AMD는 건조형 AMD이다.
특정 실시양태에서, 보체-매개 질환 또는 질병은 PNH이다.
특정 실시양태에서, 보체-매개 질환 또는 질병은 심근경색이다.
특정 실시양태에서, 보체-매개 질환 또는 질병은 RA이다.
특정 실시양태에서, 보체-매개 질환 또는 질병은 골다공증 또는 골관절염이다.
특정 실시양태에서, 보체-매개 질환 또는 질병은 염증이다.
특정 실시양태에서, 보체-매개 질환 또는 질병은 암이다.
본 발명의 항체는 치료에 단독으로 또는 다른 약제와 함께 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 항체는 하나 이상의 추가의 치료제와 공-투여될 수 있다.
상기 언급된 상기 병용 치료는 병용 투여(2개 이상의 치료제가 동일하거나 별개의 제형에 포함되는 경우), 및 별개 투여를 포함하며, 이 경우 본 발명의 항체의 투여는 추가 치료제 또는 치료제들의 투여 전에, 투여와 동시에 및/또는 투여 후에 일어날 수 있다. 한 실시양태에서, 항-C5 항체의 투여 및 추가 치료제의 투여는 서로 약 1 개월 이내에, 또는 약 1주, 2주 또는 3주 이내에, 또는 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일 또는 6일 이내에 일어난다.
본 발명의 항체(및 임의의 추가의 치료제)는, 비경구, 폐내 및 비강내, 및 국소 치료를 위해 필요한 경우, 병변내 투여를 포함하여, 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있다. 비경구 주입으로는 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여가 포함된다. 투약은, 부분적으로 투여가 단기간인지 또는 장기간인지 여부에 따라, 임의의 적합한 경로에 의해, 예를 들면, 정맥내 또는 피하 주사와 같은 주사에 의할 수 있다. 다양한 시점에 걸친 단일 또는 다중 투여, 볼루스(bolus) 투여 및 펄스 주입을 포함하지만 이로 한정되지는 않는 다양한 투약 일정이 본원에서 고려된다.
본 발명의 항체는 올바른 의료 행위에 일치하는 방식으로 제형화되고 복용되고 투여된다. 이와 관련하여 고려할 요인들로는 치료되는 특정 질환, 치료되는 특정 포유동물, 개개 환자의 임상적 상태, 질환의 원인, 약제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 일정, 및 의사에게 공지된 기타 요인들이 포함된다. 항체는 문제의 질환을 예방하거나 치료하기 위해 현재 사용되는 하나 이상의 약제와 함께 제형화될 필요는 없지만 선택적으로 함께 제형화된다. 상기 다른 약제들의 효과량은 제형에 존재하는 항체의 양, 질환 또는 치료의 유형, 및 상기 논의된 다른 요인들에 따라 달라진다. 상기 다른 약제들은 일반적으로 본원에 기술된 바와 동일한 투여량으로 및 동일한 투여 경로하에, 또는 본원에 기술된 투여량의 약 1 내지 99%의 양으로, 또는 실험적/임상적으로 적절한 것으로 결정된 임의의 투여량으로 및 임의의 경로에 의해 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명 항체의 적절한 투여량(단독으로 또는 하나 이상의 다른 추가 치료제와 함께 사용될 때)은 치료될 질환의 유형, 항체의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 항체가 예방 목적으로 투여되는지 아니면 치료 목적으로 투여되는지 여부, 이전의 치료, 항체에 대한 환자의 임상 병력 및 반응, 및 주치의의 재량에 따라 달라질 것이다. 항체는 환자에게 한번에 또는 일련의 치료과정 동안 적절히 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라서, 약 1 ㎍/kg 내지 15 mg/kg(예를 들면, 0.1 내지 10 mg/kg)의 항체가, 예를 들면, 한번 이상의 별개의 투여에 의하든지 또는 연속 주입에 의하든지, 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 한 전형적인 일일 투여량은, 상기 언급한 요인들에 따라서, 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 이상의 범위일 수 있다. 수일 이상동안 반복 투여하기 위해, 상태에 따라서, 치료는 일반적으로 질환 증상의 목적하는 억제가 일어날 때까지 지속된다. 항체의 한 예시적인 투여량은 약 0.05 내지 약 10 mg/kg의 범위이다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg(또는 이들의 임의의 조합) 중 하나 이상의 용량을 환자에게 투여할 수 있다. 상기 용량은 간헐적으로, 예를 들면, 매주 또는 3주마다(예를 들면, 환자가 약 2 내지 약 20개, 또는 예를 들면, 약 6개 용량의 항체를 투여받도록) 투여될 수 있다. 초기의 더 높은 부하 용량에 이어, 하나 이상의 더 낮은 용량이 투여될 수 있다. 상기 치료의 진행은 통상적인 기술 및 분석법들에 의해 용이하게 모니터링된다.
임의의 상기 제형 또는 치료 방법은 항-C5 항체 대신에 또는 그에 더하여 본 발명의 면역접합체를 사용하여 수행될 수 있는 것으로 이해된다.
H. 제품
본 발명의 또 다른 태양에서, 전술한 질환의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제품이 제공된다. 상기 제품은 용기, 및 용기 상에 또는 용기에 부착된 표지 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기로는, 예를 들면, 병, 바이알, 주사기, IV 용액 주머니 등이 포함된다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 제조될 수 있다. 용기는 조성물을 단독으로, 또는 질병을 치료, 예방 및/또는 진단하는데 효과적인 다른 조성물과 함께 포함하며, 멸균 진입구를 가질 수 있다(예를 들면, 용기는 피하 주사 바늘에 의해 관통될 수 있는 스토퍼를 갖는 정맥내 용액 주머니 또는 바이알일 수 있다). 조성물중 하나 이상의 활성 약제는 본 발명의 항체이다. 표지 또는 패키지 삽입물은 조성물이 선택되는 질병을 치료하기 위해 사용되는 것을 지시한다. 또한, 제품은 (a) 본 발명의 항체를 포함하는 조성물이 그 안에 함유된 제 1 용기; 및 (b) 추가의 세포독성 약제 또는 그렇지 않으면 치료제를 포함하는 조성물이 그 안에 함유된 제 2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 실시양태에서의 제품은 또한 조성물이 특정 질병을 치료하기 위해 사용될 수 있음을 나타내는 패키지 삽입물을 포함할 수 있다. 다르게는 또는 추가로, 제품은 약학적으로 허용되는 완충제, 예를 들어, 주사용 정균수(BWFI), 포스페이트-완충 식염수, 링거(Ringer)액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제 2(또는 제 3)의 용기를 또한 포함할 수 있다. 상기 제품은 다른 완충제, 희석제, 충전제, 바늘 및 주사기를 포함하여, 상업적 및 사용자의 관점에서 바람직한 다른 물질을 또한 포함할 수 있다.
임의의 상기 제품은 항-C5 항체 대신에 또는 그에 더하여 본 발명의 면역접합체를 포함할 수 있는 것으로 이해된다.
실시예
하기는 본 발명의 방법 및 조성물의 실시예들이다. 상기에 제공된 일반적인 설명들을 고려하여, 다양한 다른 실시양태들이 실행될 수 있는 것으로 이해된다.
실시예 1
C5의 제조
1.1. 재조합 인간 및 사이노몰구스 원숭이 C5의 발현 및 정제
재조합 인간 C5(NCBI 진뱅크(NCBI GenBank) 수탁 번호 NP_001726.2, 서열번호 39)를 프리스타일(FreeStyle)293-F 세포주(써모 피셔(Thermo Fisher), 미국 캘리포니아주 칼즈배드)를 사용하여 발현시켰다. 인간 C5를 발현하는 조정 배지를 동 부피의 밀리큐 워터(milliQ water)로 희석시킨 다음, Q-세파로스 FF 또는 Q-세파로스 HP 음이온 교환 컬럼(지이 헬쓰케어(GE healthcare), 스웨덴 웁살라)에 적용한 후, NaCl 구배로 용출시켰다. 인간 C5를 함유하는 분획들을 취합한 다음, 염 농도 및 pH를 각각 80 mM NaCl 및 pH 6.4로 조정하였다. 생성된 샘플을 SP-세파로스 HP 양이온 교환 컬럼(지이 헬쓰케어, 스웨덴 웁살라) 상에 적용하고, NaCl 구배로 용출시켰다. 인간 C5를 함유하는 분획들을 취합하고 CHT 세라믹 하이드록시아파타이트 컬럼(바이오-래드 래버러토리즈(Bio-Rad Laboratories), 미국 캘리포니아주 허큘리스)에 적용하였다. 이어서, 인간 C5 용출액을 슈퍼덱스(Superdex) 200 겔 여과 컬럼(지이 헬쓰케어, 스웨덴 웁살라)에 적용하였다. 인간 C5를 함유하는 분획들을 취합하고 -150 ℃에서 저장하였다.
재조합 사이노몰구스 원숭이 C5(NCBI 진뱅크 수탁 번호 XP_005580972, 서열번호 44)의 발현 및 정제를 인간 대응물과 동일한 방식으로 수행하였다.
1.2. 혈장으로부터 사이노몰구스 원숭이 C5(cynoC5)의 정제
사이노몰구스 원숭이로부터의 혈장 샘플을 SSL7-아가로스(인비보겐(Invivogen), 미국 캘리포니아주 샌디에고)에 적용한 후, 100 mM 아세트산나트륨(pH 3.5)으로 희석하였다. cynoC5를 함유하는 분획들을 즉시 중화시키고 펩티드 M 아가로스(인비보겐, 미국 캘리포니아주 샌디에고)와 동시에 단백질 A HP 컬럼(지이 헬쓰케어, 스웨덴 웁살라)에 적용하였다. 이어서, 관류 분획을 슈퍼덱스 200 겔 여과 컬럼(지이 헬쓰케어, 스웨덴 웁살라)에 적용하였다. cynoC5를 함유하는 분획들을 취합하고 -80 ℃에서 저장하였다.
실시예 2
항 C5 항체의 생성
2.1. 항체 스크리닝
항-C5 항체를 다음과 같이 제조하고, 선별하고, 분석하였다:
12 내지 16 주령의 NZW 토끼를 인간 C5 및/또는 원숭이 C5(50 내지 100 ㎍/용량/토끼)로 피내 면역화시켰다. 상기 용량을 2개월의 기간에 걸쳐 4 또는 5회 반복하였다. 최종 면역화 1 주일 후에, 비장 및 혈액을 면역화된 토끼로부터 수거하였다. 항원-특이적 B-세포를 표지된 항원으로 염색시키고, FCM 세포 분류기(FACS 아리아 III, BD)로 분류하고, 25,000개 세포/웰의 EL4 세포(유럽 미생물 균주 보존기관(European Collection of Cell Cultures)) 및 20배 희석된 활성화 토끼 T-세포 조정 배지와 함께 1개 세포/웰 밀도로 96-웰 플레이트에 도말하고, 7 내지 12 일동안 배양하였다. EL4 세포를 미토마이신 C(시그마(Sigma), Cat No. M4287)로 2 시간동안 처리하고 미리 3회 세척하였다. 활성화된 토끼 T-세포 조정 배지는 피토헤마글루티닌-M(로슈(Roche), Cat No. 1 1082132-001), 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(시그마, Cat No. P1585) 및 2% FBS를 함유하는 RPMI-1640 배지에서 토끼 흉선세포를 배양함으로써 제조하였다. 배양후에, B-세포 배양 상등액을 추가의 분석을 위해 수거하고 펠릿을 저온보존하였다.
ELISA 분석을 이용하여 B-세포 배양 상등액 중 항체의 특이성을 검사하였다. 스트렙타비딘(진스크립트(GeneScript), Cat No. Z02043)을 실온에서 384-웰 맥시소프(MAXISorp)(눈크(Nunc), Cat No. 164688) 상에 PBS 중의 50 nM로 코팅하였다. 이어서, 플레이트를 5배 희석된 블로킹 원(Blocking One)(나칼라이 테스크(Nacalai Tesque), Cat No. 03953-95)으로 차단하였다. 인간 또는 원숭이 C5를 NHS-PEG4-비오틴(피어스(PIERCE), Cat No. 21329)으로 표지화하고 차단된 ELISA 플레이트에 첨가하고 1 시간동안 배양하고 세척하였다. B-세포 배양 상등액을 ELISA 플레이트에 첨가하고 1 시간동안 배양하고 세척하였다. 염소 항-토끼 IgG-양고추냉이 퍼옥시다제(베틸(BETHYL), Cat No. A120-111P)로 결합을 검출한 후 ABTS(KPL, Cat No. 50-66-06)를 첨가하였다.
ELISA 분석을 이용하여 C5에 대한 항체의 pH-의존성 결합을 평가하였다. PBS(-)로 1 ㎍/ml로 희석된 염소 항-토끼 IgG-Fc(베틸, Cat No. A120-111A)를 384-웰 맥시소프(눈크, Cat No. 164688)에 첨가하고, 실온에서 1 시간동안 배양하고, 5배 희석된 블로킹 원(나칼라이 테스크, Cat No. 03953-95)으로 차단시켰다. 배양후에, 플레이트를 세척하고 B-세포 배양 상등액을 첨가하였다. 플레이트를 1 시간동안 배양하고, 세척하고, 500 pM의 비오틴화 인간 또는 원숭이 C5를 첨가하고 1 시간동안 배양하였다. 배양후에, 플레이트를 세척하고 실온에서 pH 7.4 MES 완충액(20 mM MES, 150 mM NaCl 및 1.2 mM CaCl2) 또는 pH 5.8 MES 완충액(20 mM MES, 150 mM NaCl 및 1 mM EDTA)과 함께 1 시간동안 배양하였다. 배양후에, 비오틴화 C5의 결합은 스트렙타비딘-양고추냉이 퍼옥시다제 접합체(써모 사이언티픽, Cat No. 21132)로 검출한 후 ABTS(KPL, Cat No. 50-66-06)를 첨가하였다.
옥텟 RED384 시스템(폴 라이프 사이언시즈(Pall Life Sciences))을 이용하여 C5에 대한 항체의 친화도 및 pH-의존성 결합을 평가하였다. B-세포 배양 상등액 중에 분비된 항체를 단백질 A 바이오센서 팁(폴 라이프 사이언시즈) 상에 부하시키고 pH 7.4 MES 완충액 중의 50 nM 인간 또는 원숭이 C5 중에 침지시켜 결합 동역학을 분석하였다. 해리 동역학은 pH 7.4 MES 완충액 및 pH 5.8 MES 완충액 둘 다에서 분석하였다.
총 41,439개 B-세포주를 인간 또는 원숭이 C5에 대한 친화도 및 pH-의존성 결합에 대해 스크리닝하고, 677개 세포주를 선별하고 CFA0001-0677로 지정하였다. 선별된 세포주의 RNA를 ZR-96 퀵(Quick)-RNA 키트(자이모 리서치(ZYMO RESEARCH), Cat No. R1053)를 사용하여 저온보존된 세포 펠릿들로부터 정제하였다. 선별된 세포주들에서 항체 중쇄 가변 영역을 암호화하는 DNA를 역전사 PCR로 증폭시키고, F760G4(서열번호 33) 또는 F939G4(서열번호 34) 중쇄 불변 영역을 암호화하는 DNA와 재조합시켰다. 항체 경쇄 가변 영역을 암호화하는 DNA를 역전사 PCR로 증폭시키고 k0MTC 경쇄 불변 영역(서열번호 36)을 암호화하는 DNA와 재조합시켰다. 별개로, 기존 인간화 항-C5 항체인 에쿨리주맙(EcuH-G2G4, 서열번호 29 및 EcuL-k0, 서열번호 30)의 중쇄 및 경쇄 유전자들을 합성하였다. VH(EcuH, 서열번호 31)를 암호화하는 DNA를 변형된 인간 IgG4 CH(F760G4, 서열번호 33)를 암호화하는 DNA에 프레임내 융합시키고, VL(EcuL, 서열번호 32)을 암호화하는 DNA를 k0 경쇄 불변 영역(서열번호 37)을 암호화하는 DNA에 프레임내 융합시켰다. 융합된 암호화 서열들 각각은 또한 발현 벡터내에 클로닝하였다. 항체들을 프리스타일(FreeStyle)™ 293-F 세포(인비트로겐(Invitrogen))에서 발현시키고 배양 상등액으로부터 정제하여 기능 활성을 평가하였다. 항체의 활성을 중화시키는 것은 실시예 5.1에 기술된 바와 같은 리포좀 용해 분석법을 이용하여 보체 활성의 억제를 검사함으로써 평가하였다.
2.2 샌드위치 ELISA에 의한 에피토프 비닝
높은 친화도, pH 의존성 또는 중화 활성을 갖는 항-C5 항체를 추가의 분석을 위해 선별하였다. 선별된 항체를 샌드위치 ELISA 분석을 이용하여 C5 단백질의 동일하거나 중복되는 에피토프에 결합하는 상이한 에피토프 빈들로 분류하였다. 비표지된 포획 항체를 PBS(-)로 1 ㎍/ml로 희석하고 384-웰 맥시소프 플레이트(눈크, Cat No. 164688)에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1 시간동안 배양하고 5배 희석된 블로킹 원(나칼라이 테스크, Cat No. 03953-95)으로 차단하였다. 플레이트를 1 시간동안 배양하고 세척하고, 2 nM의 인간 C5를 첨가하고 1 시간동안 배양하였다. 배양후에, 플레이트를 세척하고, 표지된 검출 항체(1 ㎍/ml, NHS-PEG4-비오틴으로 비오틴화됨)를 첨가하였다. 1 시간 배양한 후에, 비오틴화 항체의 결합을 스트렙타비딘-양고추냉이 퍼옥시다제 접합체(써모 사이언티픽, Cat No. 21132)로 검출한 후 ABTS(KPL, Cat No. 50-66-06)를 첨가하였다.
모든 항-C5 항체들은 포획 항체 및 검출 항체 둘 다로 사용되었으며, 완전히 쌍을 이루었다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 상호 경쟁성 항체들은 7개 에피토프 빈으로 분류되었다: CFA0668, CFA0334 및 CFA0319는 에피토프 A로 분류되었고, CFA0647, CFA0589, CFA0341, CFA0639, CFA0635, CFA0330 및 CFA0318은 에피토프 B로 분류되었고, CFA0538, CFA0501, CFA0599, CFA0307, CFA0366, CFA0305, CFA0675, CFA0666 및 CFA0672는 에피토프 C로 분류되었고, 에쿨리주맙 및 CFA0322는 에피토프 D로 분류되었고, CFA0329는 에피토프 E로 분류되었고, CFA0359 및 CFA0217은 에피토프 F로 분류되었으며, CFA0579, CFA0328 및 CFA0272는 에피토프 G로 분류되었다. 도 1은 항-C5 키메라 항체들 중 일부의 에피토프 비닝을 보여준다. 에피토프 C로 분류된 VH 및 VL 항-C5 항체들의 서열이 표 2에 열거되어 있다.
에피토프 C로 분류된 항-C5 항체
서열번호
항체 VH VL HVR-H1 HVR-H2 HVR-H3 HVR-L1 HVR-L2 HVR-L3
CFA0305 1 11 45 55 65 75 85 95
CFA0307 2 12 46 56 66 76 86 96
CFA0366 3 13 47 57 67 77 87 97
CFA0501 4 14 48 58 68 78 88 98
CFA0538 5 15 49 59 69 79 89 99
CFA0599 6 16 50 60 70 80 90 100
CFA0666 7 17 51 61 71 81 91 101
CFA0672 8 18 52 62 72 82 92 102
CFA0675 9 19 53 63 73 83 93 103
2.3. 인간화 및 최적화
항체의 잠재적인 면역원성을 감소시키기 위해 항-C5 항체들중 일부의 가변 영역의 인간화를 수행하였다. 항-C5 토끼 항체의 상보성-결정 영역(CDR)을 통상적인 CDR 그라프팅 접근방법(문헌 [Nature 321:522-525 (1986)])을 이용하여 동종 인간 항체 프레임워크(FR) 상에 그라프팅시켰다. 인간화 VH 및 VL을 암호화하는 유전자를 합성하고 변형된 인간 IgG4 CH(SG402, 서열번호 35) 및 인간 CL(SK1, 서열번호 38) 각각과 결합시키고, 결합된 서열 각각을 발현 벡터 내에 클로닝시켰다.
리드(lead) 항체중 일부의 결합 성질을 개선시킨 돌연변이 및 돌연변이 조합을 확인하기 위해 많은 돌연변이 및 돌연변이 조합들을 검사하였다. 이어서, 중성 pH에서 C5에 대한 결합 친화도를 증대시키거나 산성 pH에서 C5에 대한 결합 친화도를 감소시키기 위해 다수의 돌연변이를 인간화 가변 영역에 도입시켰다. 이렇게, 최적화된 변이체들 중 하나인 305LO5(VH, 서열번호 10; VL, 서열번호 20; HVR-H1, 서열번호 54; HVR-H2, 서열번호 64; HVR-H3, 서열번호 74; HVR-L1, 서열번호 84; HVR-L2, 서열번호 94; 및 HVR-L3, 서열번호 104)를 CFA0305로부터 생성하였다.
항체들을 중쇄 및 경쇄 발현 벡터의 혼합물로 동시-형질감염된 HEK293 세포에서 발현시키고 단백질 A에 의해 정제하였다.
실시예 3
항-C5 항체의 결합 특성화
3.1. 재조합 항체의 발현 및 정제
프라스타일293-F 세포주(써모 피셔, 미국 캘리포니아주 칼즈배드)를 사용하여 재조합 항체를 일시적으로 발현시켰다. 항체를 발현하는 조정 배지로부터의 정제는 단백질 A를 사용하는 통상적인 방법을 이용하여 수행하였다. 필요한 경우 겔 여과도 또한 수행하였다.
3.2. pH 의존성 평가
재조합 인간 C5에 대한 항-C5 항체의 동역학 파라미터들을 비아코어(등록상표) T200 기기(지이 헬쓰케어)를 사용하여 37 ℃에서 pH 7.4 및 pH 5.8에서 평가하였다. 아민 커플링 키트(지이 헬쓰케어)를 지이 헬쓰케어에 의해 권장된 세팅에 따라 사용하여 ProA/G(피어스)를 CM4 센서칩 상에 고정화시켰다. 항체 및 분석물들을 각각의 러닝 완충액, ACES pH 7.4 및 pH 5.8(20 mM ACES, 150 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 0.05% 트윈 20, 0.005% NaN3)로 희석하였다. 각각의 항체를 ProA/G에 의해 센서 표면 상에 포획하였다. 항체 포획 수준은 전형적으로 60 내지 90 공명 단위(RU)이었다. 이어서, 재조합 인간 C5를 10 및 20 nM 또는 20 및 40 nM의 농도로 주입한 후 해리시켰다. 표면을, 25 mM NaOH를 사용하여 재생시켰다. 비아코어(등록상표) T200 평가 소프트웨어, 버전 2.0(지이 헬쓰케어)을 사용하여 센서그램을 1:1 결합 모델로 적합화시켜 두 pH 조건 모두에서 동역학 파라미터를 측정하였다. 모든 항체들의 센서그램은 도 2a 및 2b에 나타내었다. 항체들의 결합 상수(ka), 해리 상수(kd), 및 결합 친화도(KD)는 표 3에 열거되어 있다. CFA0330(VH, 서열번호 21 및 VL, 서열번호 25) 및 CFA0341(VH, 서열번호 22 및 VL, 서열번호 26)을 제외한 모든 항체들이 pH 7.4에서 보다 pH 5.8에서 비교적 더 빠른 해리 상수를 나타내었다.
Figure 112017012024887-pct00001
3.3 교차 반응성 검사
인간 C5(hC5) 및 사이노몰구스 원숭이 C5(cynoC5)에 대한 항-C5 항체의 교차-반응성을 관찰하기 위해, 비아코어(등록상표) 동역학 분석을 수행하였다. 분석 세팅은 실시예 3.2에서 기술된 바와 동일하였다. 재조합 cynoC5는 2, 10 및 50 nM의 농도로 주입하였다. 동역학 파라미터는 실시예 3.2에서 기술된 바와 동일한 데이터 적합화에 의해 측정하였다. pH 7.4에서의 결합 동역학 및 친화도가 표 4에 열거되어 있다. 표 4에 나타낸 hC5에 대한 동역학 파라미터들은 실시예 3.2의 결과이다. CFA0672를 제외하고 모든 항-C5 항체들이 hC5 및 cynoC5에 대해 필적하는 KD를 나타내었다. cynoC5에 대한 CFA0672의 KD는 hC5에 대한 것보다 8배 더 약했다.
Figure 112017012024887-pct00002
실시예 4
항-C5 항체의 에피토프 맵핑
4.1. C5 베타쇄-유래 펩티드에 대한 항-C5 MAb의 결합
항-C5 단일클론 항체(MAb)를 웨스턴 블롯 분석에서 C5 베타쇄-유래 펩티드에 대한 결합에 대해 y검사하였다. GST-태그(pGEX-4T-1, 지이 헬쓰케어 라이프 사이언시즈, 28-9545-49)에 융합된 C5 펩티드: 19 내지 180, 161 내지 340, 321 내지 500, 및 481 내지 660을 에스케리치아 콜라이(DH5 알파, 토요보(TOYOBO), DNA-903)에서 발현시켰다. 37 ℃에서 1 mM 이소프로필 베타-D-1-티오갈락토피라노시드(IPTG)와 함께 5 시간동안 배양한 후 에스케리치아 콜라이 샘플을 수거하고, 20000 x g에서 1 분동안 원심분리하여 펠릿을 수득하였다. 상기 펠릿을 샘플 완충용액(2ME+)(와코(Wako), 191-13272)으로 현탁시키고 웨스턴 블롯 분석에 사용하였다. 각 펩티드의 발현은 항-GST 항체(압캠(Abcam), ab9085)를 사용하여 확인하였다(도 3). 화살표는 GST-융합된 C5 펩티드(46 내지 49kDa)를 나타낸다. 항-C5 MAb: CFA0305, CFA0307, CFA0366, CFA0501, CFA0538, CFA0599, CFA0666, CFA0672, 및 CFA0675는 C5의 19 내지 180에 결합되었다(도 3).
4.2. 인간 C5의 MG1-MG2 도메인(1 내지 225)의 발현 및 정제
프라스타일293-F 세포주(써모 피셔, 미국 캘리포니아주 칼즈배드)를 사용하여 인간 C5 베타쇄의 재조합 MG1-MG2 도메인(서열번호 43)을 일시적으로 발현시켰다. MG1-MG2 도메인을 발현하는 조정 배지를 1/2 부피의 밀리큐 워터로 희석한 후, Q-세파로스 FF 음이온 교환 컬럼(지이 헬쓰케어, 스웨덴 웁살라)에 적용하였다. 음이온 교환 컬럼으로부터의 관류 분획을 pH 5.0으로 조정하고, SP-세파로스 HP 양이온 교환 컬럼(지이 헬쓰케어, 스웨덴 웁살라)에 적용하고 NaCl 구배로 용출시켰다. MG1-MG2 도메인을 함유하는 분획을 용출물로부터 수거하고. 이어서 1 x PBS로 평형화시킨 슈퍼덱스 75 겔 여과 컬럼(GE 헬쓰 케어, 스웨덴 웁살라)에 적용하였다. 이어서, MG1-MG2 도메인을 함유하는 분획들을 취합하고 -80 ℃에서 저장하였다.
4.3. MG1-MG2 도메인에 대한 결합 능력
MG1-MG2 도메인에 대한 항-C5 항체의 결합 능력은, 측정을 pH 7.4 조건하에서만 수행한 것을 제외하고 실시예 3.2에서 기술된 바와 동일한 분석 세팅을 이용하여 측정하였다. MG1-MG2 도메인은 20 nM 및 40 nM의 농도로 주입하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 에쿨리주맙-F760G4를 제외한 모든 항체들이 결합 반응의 증가를 나타내어, 상기 항체들이 MG1-MG2 결합제임을 시사하였다. 공지되어 있는 알파쇄 결합제인 에쿨리주맙-F760G4는 MG1-MG2 도메인에 대한 결합을 나타내지 않았다.
4.4. C5 MG1-MG2 도메인-유래 펩티드에 대한 항-C5 MAb의 결합
항-C5 MAb를 웨스턴 블롯 분석에서 MG1-MG2 도메인-유래 펩티드에 대한 결합에 대해 검사하였다. GST-태그에 융합된 C5 펩티드: 33 내지 124, 45 내지 124, 52 내지 124, 33 내지 111, 33 내지 108, 및 45 내지 111(서열번호 40)을 에스케리치아 콜라이에서 발현시켰다. 37 ℃에서 1 mM IPTG와 함께 5 시간동안 배양한 후 에스케리치아 콜라이 샘플을 수거하고, 20000 x g에서 1 분동안 원심분리하여 펠릿을 수득하였다. 상기 펠릿을 샘플 완충용액(2ME+)으로 현탁시키고 웨스턴 블롯 분석에 사용하였다. C5-유래 펩티드의 발현은 항-GST 항체를 사용하여 확인하였다(도 5a). CFA0305는 33 내지 124의 펩티드에만 결합하였다(도 5b). CFA0305는 재조합 인간 C5(rhC5)의 베타쇄(약 70 kDa)에 결합하였으며, 이것을 대조군으로 사용하였다. 도 5c는 C5-유래 펩티드에 대한 항-C5 MAb의 반응을 요약한 것이다.
4.5. C5 돌연변이체에 대한 항-C5 MAb의 결합
C5 베타쇄 중의 3개의 아미노산 잔기: E48, D51 및 K109는 결정 구조 분석에 의해 C5와 항-C5-MAb 사이의 결합에 수반되는 것으로 예측되었기 때문에, 항-C5 MAb를 웨스턴 블롯 분석에서 인간 C5 점 돌연변이체에 대한 결합에 대해 검사하였다. E48, D51 및 K109 중 어느 하나가 알라닌으로 치환된 C5 점 돌연변이체를 리포펙션(lipofection)에 의해 FS293 세포에서 발현시켰다. 리포펙션 5 일후에 배양 배지를 수거한 다음, 웨스턴 블롯에 사용하였다. SDS-PAGE를 환원 조건하에서 수행하였다. 결과는 도 6에 나타내었다. 에쿨리주맙은 야생형(WT) C5 및 3개 C5 점 돌연변이체의 알파쇄에 결합한 반면, CFA0305는 WT C5의 베타쇄에 강하게, E48A C5 돌연변이체에는 약하게 결합하였으며, D51A 및 K109A C5 돌연변이체의 베타쇄에는 결합하지 않음으로써, 상기 3개 아미노산 잔기들이 항체/항원 상호작용에 수반됨을 시사하였다. 표 5는 항-C5 MAb(CFA0305, CFA0307, CFA0366, CFA0501, CFA0538, CFA0599, CFA0666, CFA0672, 및 CFA0675)의 웨스턴 블롯 분석의 요약을 나타낸 것이다. 항-C5 MAb는 동일한 에피토프 C로 분류되지만, 결합 패턴은 항체들 사이에서 약간 상이하여, 항-C5 MAb에 대한 C5의 결합 영역이 서로 근접하지만 동일하지는 않음을 시사한다.
Figure 112017012024887-pct00003
4.6. C5 돌연변이체를 사용한 항-C5 항체의 비아코어(등록상표) 결합 분석
잔기 E48, G51, 및 K109가 항체/항원 상호작용에 실제로 수반되는지를 검사하기 위해, 비아코어(등록상표) 결합 분석을 수행하였다. 실시예 4.5에서 기술된 바와 같이, 3개의 C5 돌연변이체를 제조하였다: E48A, G51A, 및 K109A. FS293 세포에서 과발현된 돌연변이 C5를 함유하는 배양 상등액 샘플을 40 ㎍/ml의 돌연변이 C5에서 제조하였다. 비아코어(등록상표) 결합 분석을 위해, 샘플을 비아코어(등록상표) 러닝 완충액(ACES pH 7.4, 10 mg/ml BSA, 1 mg/ml 카복시메틸 덱스트란)을 사용하여 4 ㎍/ml의 돌연변이 C5의 최종 샘플 농도로 10배 희석하였다.
3개의 C5 돌연변이체와 항-C5 항체의 상호작용을, 37 ℃에서 비아코어(등록상표) T200 기기(지이 헬쓰케어)를 사용하여, 실시예 3.2에서 기술된 분석 조건을 이용하여 평가하였다. 10 mg/ml BSA, 1 mg/ml 카복시메틸 덱스트란을 함유하는 ACES pH 7.4 완충액을 러닝 완충액으로 사용하였다. 단일클론 마우스 항-인간 IgG, Fc 단편 특이 항체(지이 헬쓰케어)에 의해 에쿨리주맙-F760G4 및 305LO5를 상이한 유동 세포 상에 포획시켰다. 유동 세포 1을 기준 표면으로 사용하였다. 야생형 및 돌연변이 C5 단백질을 4 ㎍/ml 농도로 센서 표면 위에 주입시켜 포획된 항체와 상호작용시켰다. 각 분석 주기 끝에, 센서 표면을 3M MgCl2로 재생시켰다. 결과는 비아 이벨류에이션(Bia Evaluation) 소프트웨어, 버전 2.0(지이 헬쓰케어)을 사용하여 분석하였다. 기준 유동 세포(유동 세포 1) 및 러닝 완충액의 블랭크 주입물의 곡선을 포획 항체를 갖는 유동 세포의 곡선으로부터 감하였다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 3개의 C5 돌연변이체는 모두 야생형 C5와 비교하여 유사한 결합 프로필하에 에쿨리주맙에 결합할 수 있다. 305LO5의 경우, 3개의 돌연변이체 모두 야생형 C5에 비해 305LO5에 대한 더 낮은 결합 반응을 나타내었다. D51A 및 K109A 돌연변이체는 305LO5에 의한 C5의 결합을 기준선 수준까지 감소시켰다.
4.7. 항-C5 항체와 C5 사이의 pH 의존성 상호작용에 기여하는 C5 상의 His 잔기의 확인
결정 구조 분석 결과 인간 C5 상의 3개의 히스티딘 잔기가 항체/항원 계면에 위치하는 것으로 확인되었다. 약 6.0의 전형적인 pKa를 갖는 히스티딘 잔기는 pH 의존성 단백질-단백질 상호작용에 기여하는 것으로 알려져 있다(문헌 [Igawa et al., Biochim Biophys Acta 1844(11):1943-1950 (2014)]). 항체/항원 계면 상의 His 잔기들 중 어느 것이 항-C5 항체와 C5 사이의 pH 의존성 상호작용에 기여하는지를 조사하기 위해, 비아코어(등록상표) 결합 분석을 수행하였다. 단일 His 돌연변이를 갖는 3개의 인간 C5 돌연변이체(H70Y, H72Y, 및 H110Y), 및 이중-His 돌연변이(H70Y + H110Y)를 갖는 돌연변이체를 다음과 같이 제조하였다: H70, H72, 및 H110 중 어느 하나가 티로신으로 치환된 단일 His 돌연변이체, 및 H70 및 H110 둘 다가 티로신으로 치환된 이중 His 돌연변이체를 리포펙션에 의해 FS293 세포에서 발현시켰다. pH-의존성 항-C5 항체인 305LO5에 대한 C5 His 돌연변이체의 항원 결합 성질을, 실시예 4.6에서 기술된 바와 같은 변형된 비아코어(등록상표) 분석에 의해 측정하였다. 간략하게, pH 5.8에서의 또 다른 해리 단계를 pH 7.4에서의 해리 단계 직후에 비아코어(등록상표) 분석에 통합시켜 pH 7.4에서 생성된 복합체들로부터의 항체와 항원 사이의 pH-의존성 해리를 평가하였다. 스크러버(Scrubber) 2.0(바이오로직 소프트웨어(BioLogic Software)) 곡선 적합화 소프트웨어를 사용하여 데이터를 처리하고 적합화시킴으로써 pH 5.8에서의 해리 속도를 측정하였다.
도 8에 나타낸 바와 같이, H70 또는 H110에서의 C5 단일 His 돌연변이 및 이중 His 돌연변이(H70 + H110)는 중성 pH에서 305LO5에 대한 C5의 결합에 영향을 미치지 않았다. 한편, H72에서의 단일 His 돌연변이는 305LO5에 대한 C5의 결합에 대한 상당한 감손을 나타내었다. C5 His 돌연변이체 및 C5-wt 단백질에 대한 pH 5.8에서의 해리 속도는 표 6에 나타내었다. 표 6에 나타낸 바와 같이, C5-wt가 검사한 C5 항원들 중에서 pH 5.8에서 305LO5로부터 가장 빠른 해리를 나타내었다. H70에서의 단일 His 돌연변이는 C5-wt에 비해 pH 5.8에서 거의 2배 더 느린 해리 속도를 나타내었고, H110에서의 단일 His 돌연변이는 pH 5.8에서 약간 더 느린 해리 속도를 나타내었다. H70 및 H110 둘 다에서의 이중 His 돌연변이는 pH 5.8에서 C5-wt보다 거의 3배 더 느린 해리 속도하에 pH-의존성 결합에 더 큰 영향을 야기하였다.
305LO5에 결합하는 C5 His 돌연변이체에 대한 pH 5.8 해리 속도 값
항원 kd(1/s)
C5-wt 1.1E-2
C5-H70Y 5.3E-3
C5-H110Y 9.3E-3
C5-H70Y,H110Y 3.9E-3
실시예 5
C5 활성화에 대한 항-C5 항체의 억제 활성
5.1. 항-C5 MAb에 의한 보체-활성화된 리포좀 용해의 억제
항-C5 MAb를 리포좀 용해 분석에 의해 보체 활성의 억제에 대해 검사하였다. 30 ㎕의 정상 인간 혈청(6.7%)(바이오프레딕(Biopredic), SER018)을 96-웰 플레이트에서 20 ㎕의 희석된 MAb와 혼합하고 25 ℃에서 30 분동안 진탕기 상에서 배양하였다. 다이니트로페닐(오토키트(Autokit) CH50, 와코(Wako), 995-40801)에 대해 항체로 감작된 리포좀을 각 웰로 옮기고 플레이트를 25 ℃에서 진탕기 상에서 2 분동안 두었다. 50 ㎕의 기질 용액(오토키트 CH50)을 각 웰에 첨가하고 25 ℃에서 2 분동안 진탕시켜 혼합하였다. 최종 혼합물을 37 ℃에서 40 분 동안 배양한 후에, 혼합물을 340 nm에서의 OD를 측정하였다. 리포좀 용해 퍼센트는 100 x [(ODMAb - OD혈청 및 리포좀 배경)]/[(ODMAb 비함유 - OD혈청 및 리포좀 배경)]으로 정의되었다. 도 9a는 항-C5 MAb: CFA0305, 0307, 0366, 0501, 0538, 0599, 0666, 0672, 및 0675가 리포좀 용해를 억제하였음을 보여준다. 2개의 비-pH-의존성 항체: CFA0330 및 0341도 또한 용해를 억제하였다(도 9b).
5.2. 항-C5 MAb에 의한 C5a 생성의 억제
항-C5 MAb가 C5의 C5a 및 C5b로의 절단을 억제하는지를 확인하기 위해 항-C5 MAb를 리포좀 용해시 C5a 생성에 대해 검사하였다. 리포좀 용해로부터의 상등액 중 C5a 수준은 C5a ELISA 키트(R&D 시스템즈, DY2037)를 사용하여 정량화하였다. 모든 MAb가 상등액중에서 C5a 생성을 용량-의존적으로 억제하였다(도 10a 및 10b).
5.3. 항-C5 MAb에 의한 보체-활성화된 용혈의 억제
항-C5 MAb를 용혈 분석에서 고전적 보체 활성의 억제에 대해 검사하였다. 닭의 적혈구 세포(cRBC)(이노베이티브 리서치(Innovative research), IC05-0810)를 0.5 mM MgCl2 및 0.15 mM CaCl2를 함유하는 젤라틴/베로날-완충 식염수(GVB++)(보스톤 바이오프로덕츠(Boston BioProducts), IBB-300X)로 세척한 후, 4 ℃에서 1 ㎍/ml에서 항-닭 RBC 항체(로크랜드(Rockland) 103-4139)로 15 분동안 감작시켰다. 이어서, 세포를 GVB++로 세척하고 동일 완충액에 5x107 세포/ml로 현탁시켰다. 별도의 환저 96-웰 마이크로검사 플레이트에서, 50 ㎕의 정상 인간 혈청(20%)(바이오프레딕, SER019)을 50 ㎕의 희석된 Mab와 혼합하고 37 ℃에서 진탕기상에서 30 분동안 배양하였다. 이어서, 60 ㎕의 감작된 cRBC 현탁액을 혈청을 함유하는 웰에 첨가하고, 항체 혼합물을 37 ℃에서 30 분동안 배양하였다. 배양후에, 플레이트를 4 ℃에서 1000 x g로 2 분동안 원심분리하였다. 상등액(100 ㎕)을 630 nm에서의 기준 파장하에 415 nm에서의 OD 측정을 위해 편평한 바닥의 96-웰 마이크로검사 플레이트 상의 웰로 옮겼다. 용혈 퍼센트는 100 x [(ODMAb - OD혈청 및 cRBCs)]/[(OD MAb 비함유 - OD혈청 및 cRBCs 배경)]으로 정의되었다. 도 11은 항-C5 Mab: CFA0305 및 305LO5가 cRBC의 용혈을 억제하였음을 보여준다.
5.4. 항-C5 MAb에 의한 대체 보체 경로의 억제
대체 경로에 대한 용혈 분석을 고전적 경로 용혈 분석과 유사한 방식으로 수행하였다. 뉴질랜드 화이트 토끼(인비보스(InVivos))로부터 채취된 혈액을 동일 부피의 알세버(Alserver) 용액(시그마, A3551)과 혼합하고, 혼합물을 토끼 RBC(rRBC)로 사용하였다. rRBC를 2 mM MgCl2 및 10 mM EGTA로 보충된 GVB로 세척하고 동일한 완충액에 7x108 세포/ml로 현탁시켰다. 환저 96-웰 마이크로검사 플레이트에서, 40 ㎕의 정상 인간 혈청(25%)(바이오프레딕, SER019)을 40 ㎕의 희석된 Mab와 혼합하고 37 ℃에서 진탕기상에서 30 분동안 배양하였다. 이어서, 20 ㎕의 rRBC 현탁액을 혈청을 함유하는 웰에 첨가하고, 항체 혼합물을 37 ℃에서 60 분동안 배양하였다. 배양후에, 플레이트를 4 ℃에서 1000 x g로 2 분동안 원심분리하였다. 상등액(70 ㎕)을 630 nm에서의 기준 파장하에 415 nm에서의 OD 측정을 위해 편평한 바닥의 96-웰 마이크로검사 플레이트 상의 웰로 옮겼다. 도 12는 항-C5 Mab: CFA0305 및 CFA0672가 rRBC의 용혈을 억제하여 상기 항체들이 대체 보체 경로를 억제하는 것을 시사함을 보여준다.
실시예 6
마우스에서 인간 C5를 사용한 항-C5 단일클론 항체의 약동학 연구
6.1. C57BL/6 마우스를 이용한 생체내 검사
인간 C5 단독 또는 인간 C5와 항-인간 C5 항체를 C57BL/6 마우스(인비보스 또는 생물 자원 센터(Biological Resource Centre), 싱가폴)에 투여한 후에 인간 C5(칼바이오켐(Calbiochem)) 및 항-인간 C5 항체의 생체내 동역학을 평가하였다. 인간 C5 용액(0.01 mg/ml) 또는 인간 C5 및 항-인간 C5 항체[각각, 0.01 mg/ml 및 2 mg/ml(CFA0305-F760G4, CFA0307-F760G4, CFA0366-F760G4, CFA0501-F760G4, CFA0538-F760G4, CFA0599-F760G4, CFA0666-F760G4, CFA0672-F760G4, 및 CFA0675-F760G4) 또는 0.2 mg/ml(CFA0330-F760G4, 및 CFA0341-F760G4)]를 함유하는 혼합물의 용액을 10 ml/kg의 용량으로 미정맥 내에 1회 투여하였다. 이 경우에, 항-인간 C5 항체는 인간 C5에 비해 과량으로 존재하며, 따라서 거의 모든 인간 C5가 항체에 결합될 것으로 추정된다. 투여 5분후, 7시간후, 1일후, 2일후, 3일후 및 7일후에 혈액을 수거하였다. 수거된 혈액을 즉시 14,000 rpm 및 4 ℃에서 10분동안 원심분리시켜 혈장을 분리하였다. 분리된 혈장은 분석전에 -80 ℃에서 냉장고에 저장하였다. 사용된 항-인간 C5 항체는 다음과 같다: 전술한 CFA0305-F760G4, CFA0307-F760G4, CFA0330-F760G4, CFA0341-F760G4, CFA0366-F760G4, CFA0501-F760G4, CFA0538-F760G4, CFA0599-F760G4, CFA0666-F760G4, CFA0672-F760G4, 및 CFA0675-F760G4.
6.2. 전기화학발광(ECL) 분석에 의한 전체 인간 C5 혈장 농도의 측정
마우스 혈장내 총 인간 C5의 농도는 ECL로 측정하였다.
혈장 샘플내 CFA0330-F760G4, CFA0341-F760G4, 또는 인간 C5 단독의 존재하에서, 다음의 방법을 이용하였다. 항-인간 C5 항체(산타 크루즈(Santa Cruz))를 멀티-어레이(MULTI-ARRAY) 96-웰 빈 플레이트(메조 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery)) 상에 분배시키고 4 ℃에서 밤새 정치시켜 항-인간 C5-고정화된 플레이트를 제조하였다. 1 ㎍/ml의 주입 항체(CFA0330-F760G4 또는 CFA0341-F760G4)로 100배 이상 희석된 보정 곡선 샘플 및 마우스 혈장 샘플을 준비하고 37 ℃에서 30 분동안 배양하였다. 이어서, 상기 샘플들을 항-인간 C5-고정화된 플레이트 상에 분배시키고 실온에서 1 시간동안 정치시켰다. 이어서, 설포-태그(SULFO-TAG) 표지된 항-인간 IgG 항체(메조 스케일 디스커버리)를 첨가하여 실온에서 1 시간동안 반응시키고, 세척을 수행하였다. 그 직후에, 리드 버퍼 T(Read Buffer T)(x4)(메조 스케일 디스커버리)를 분배하고 섹터 이미저(Sector Imager) 2400(메조 스케일 디스커버리)을 사용하여 측정을 수행하였다.
혈장 샘플내 CFA0305-F760G4, CFA0307-F760G4, CFA0366-F760G4, CFA0501-F760G4, CFA0538-F760G4, CFA0599-F760G4, CFA0666-F760G4, CFA0672-F760G4, 또는 CFA0675-F760G4의 존재하에서, 다음의 방법을 이용하였다. 항-인간 C5 항체(CFA0329-F939G4; VH, 서열번호 23 및 VL, 서열번호 27)를 멀티-어레이 96-웰 빈 플레이트(메조 스케일 디스커버리) 상에 분배시키고 4 ℃에서 밤새 정치시켜 항-인간 C5-고정화된 플레이트를 제조하였다. 산성 용액(pH 5.5)으로 100배 이상 희석된 보정 곡선 샘플 및 마우스 혈장 샘플을 준비하고 37 ℃에서 30 분동안 배양하였다. 이어서, 상기 샘플들을 항-인간 C5-고정화된 플레이트 상에 분배시키고 실온에서 1 시간동안 정치시켰다. 이어서, 설포-태그 표지된 항-인간 C5 항체(CFA0300-F939G4; VH, 서열번호 24 및 VL, 서열번호 28)를 첨가하여 실온에서 1 시간동안 반응시키고, 세척을 수행하였다. 그 직후에, 리드 버퍼 T(x4)(메조 스케일 디스커버리)를 분배하고 섹터 이미저 2400(메조 스케일 디스커버리)을 사용하여 측정을 수행하였다.
인간 C5 농도는 분석용 소프트웨어 소프트맥스 프로(SOFTmax PRO)(몰레큘라 디바이시즈(Molecular Devices))를 사용하여 보정 곡선의 반응을 기준으로 계산하였다. 상기 방법에 의해 측정시 정맥내 투여후 혈장 인간 C5 농도의 시간 경과를 도 13에 나타내었다. 데이터는 5분째에 혈장 인간 C5 농도와 비교한 나머지 백분율로서 플로팅하였다.
6.3. ECL 분석에 의한 항-인간 C5 항체 혈장 농도 측정
마우스 혈장내 항-인간 C5의 농도는 ECL로 측정하였다. 항-인간 IgG(감마쇄 특이적) F(ab')2 항체 단편(시그마) 또는 항-인간 IgG 카파쇄 항체(안티바디 솔루션즈(Antibody Solutions))를 멀티-어레이 96-웰 빈 플레이트(메조 스케일 디스커버리) 상에 분배시키고 4 ℃에서 밤새 정치시켜 항-인간 IgG-고정화된 플레이트를 제조하였다. 100배 이상 희석된 보정 곡선 샘플 및 마우스 혈장 샘플을 준비하였다. 이어서, 상기 샘플들을 항-인간 IgG-고정화된 플레이트 상에 분배시키고 실온에서 1 시간동안 정치시켰다. 이어서, 비오틴화 항-인간 IgG 항체(서던바이오테크(Southernbiotech)) 또는 설포-태그 표지된 항-인간 IgG Fc 항체(서던바이오테크)를 첨가하여 실온에서 1 시간동안 반응시키고, 세척을 수행하였다. 이어서, 비오틴화 항-인간 IgG 항체가 사용된 경우에만, 설포-태그 표지된 스트렙타비딘(메조 스케일 디스커버리)을 첨가하여 실온에서 1 시간동안 반응시키고 세척을 수행하였다. 그 직후에, 리드 버퍼 T(x4)(메조 스케일 디스커버리)를 분배하고 섹터 이미저 2400(메조 스케일 디스커버리)을 사용하여 측정을 수행하였다. 항-인간 C5 항체 농도는 분석용 소프트웨어 소프트맥스 프로(몰레큘라 디바이시즈)를 사용하여 보정 곡선의 반응을 기준으로 계산하였다. 상기 방법에 의해 측정시 정맥내 투여후 혈장내 항-인간 C5 항체 농도의 시간 경과를 도 14에 나타내었다. 데이터는 5분째에 혈장내 항-인간 C5 항체 농도와 비교한 나머지 백분율로서 플로팅하였다.
6.4. 생체내 인간 C5의 제거에 대한 pH 의존성 항-인간 C5 항체 결합의 효과
pH 의존성 항-인간 C5 항체(CFA0305-F760G4, CFA0307-F760G4, CFA0366-F760G4, CFA0501-F760G4, CFA0538-F760G4, CFA0599-F760G4, CFA0666-F760G4, CFA0672-F760G4, 및 CFA0675-F760G4) 및 비-pH 의존성 항-인간 C5 항체(CFA0330-F760G4, 및 CFA0341-F760G4)를 생체내에서 검사하고, 생성된 혈장내 항-인간 C5 항체 농도 및 혈장내 인간 C5 농도를 비교하였다. 도 14에 나타낸 바와 같이, 항체 노출은 필적하였다. 한편, pH 의존성 항-인간 C5 항체와 동시에 투여된 인간 C5의 제거는 비-pH 의존성 항-인간 C5 항체에 비해 촉진되었다(도 13).
실시예 7
항-C5 단일클론 항체(305 변이체)의 최적화
그 성질을 더 개선시키기 위해 항-C5 항체 305LO5의 최적화된 가변 영역에 다수의 돌연변이를 도입시키고, 최적화된 가변 영역 305LO15, 305LO16, 305LO18, 305LO19, 305LO20, 305LO22, 및 305LO23을 생성시켰다. 305 변이체의 VH 및 VL의 아미노산 서열들은 각각 표 7 및 8에 열거되어 있다. 인간화 VH를 암호화하는 유전자들을 변형된 인간 IgG1 CH 변이체 SG115(서열번호 114), 및 변형된 인간 IgG4 CH 변이체 SG422(서열번호 115) 또는 SG429(서열번호 116)와 결합시켰다. 인간화 VL을 암호화하는 유전자를 인간 CL(SK1, 서열번호 38)과 결합시켰다. 별개로, 인간화 항-C5 항체, BNJ441을 암호화하는 중쇄 및 경쇄 유전자(BNJ441H, 서열번호 149; BNJ441L, 서열번호 150)를 합성하고 각각 발현 벡터내에 클로닝하였다.
항체들을 중쇄 및 경쇄 발현 벡터의 조합으로 동시-형질감염된 HEK293 세포에서 발현시키고 단백질 A로 정제하였다.
Figure 112017012024887-pct00004
Figure 112017012024887-pct00005
실시예 8
항-C5 항체(305 변이체)의 결합 특성화
다음의 3가지 상이한 조건에서 37 ℃에서 비아코어(등록상표) T200 기기(지이 헬쓰케어)를 사용하여 재조합 인간 C5에 대한 항-C5 항체의 동역학 파라미터를 평가하였다: (1) 결합 및 해리 둘 다 pH 7.4에서인 조건, (2) 결합 및 해리 둘 다 pH 5.8에서인 조건, 및 (3) 결합은 pH 7.4에서이지만 해리는 pH 5.8에서인 조건. 지이 헬쓰케어에 의해 권장된 세팅에 따라서 아민 커플링 키트(지이 헬쓰케어)를 사용하여 ProA/G(피어스)를 CM1 센서칩 상에 고정화시켰다. 조건 (1) 및 (3)에서 항체 및 분석물은 ACES pH 7.4 완충액(20 mM ACES, 150 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 0.05% 트윈 20, 0.005% NaN3)에 희석시켰으며, 조건 (2)에서는 항체 및 분석물들을 ACES pH 5.8 완충액(20 mM ACES, 150 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 0.05% 트윈 20, 0.005% NaN3)에 희석시켰다. 각각의 항체를 ProA/G에 의해 센서 표면위에 포획하였다. 항체 포획 수준은 전형적으로 60 내지 90 공명 단위(RU)이었다. 이어서, 재조합 인간 C5를 3배 연속 희석에 의해 제조된 3 내지 27 nM 또는 13.3 내지 120 nM에서 주입한 후 해리시켰다. 25 mM NaOH를 사용하여 표면을 재생하였다. 조건 (1) 및 (2)에서의 동역학 파라미터는 센서그램을 1:1 결합 모델로 적합화시킴으로써 측정하였고, 조건 (3)에서의 해리 속도는 비아코어(등록상표) T200 평가 소프트웨어, 버전 2.0(지이 헬쓰케어)을 사용하여 센서그램을 MCK에 대한 1:1 해리 모델로 적합화시켜 측정하였다. 모든 항체의 pH 의존성은 조건 (2) 및 (1)의 해리 속도의 비로서 나타내었다.
결합 속도(ka), 해리 속도(kd), 결합 친화도(KD), 및 pH 의존성은 표 9에 열거되어 있다. 모든 항체들은 pH 7.4에서보다 pH 5.8에서 더 빠른 해리를 나타내었으며, 그의 pH 의존성은 약 20배였다.
Figure 112017012024887-pct00006
pH 7.4 및 pH 5.8에서 재조합 인간 C5에 대한 항-C5 항체들(BNJ441, 에쿨리주맙, 및 305 변이체)의 결합 친화도를 37 ℃에서 비아코어(등록상표) T200 기기(지이 헬쓰케어)를 사용하여 측정하여 항원 결합시 pH의 영향을 평가하였다. 아민 커플링 키트(지이 헬쓰케어)를 제조사에 의해 권장된 세팅에 따라 사용하여 염소 항-인간 IgG(Fc) 다중클론 항체(KPL #01-10-20)를 CM4 센서칩 상에 고정화시켰다. 항체 및 분석물은 20 mM ACES, 150 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 0.05% 트윈 20 및 0.005% NaN3을 함유하는 ACES pH 7.4 완충액 또는 ACES pH 5.8 완충액에 희석시켰다. 항체를 항-Fc 방법을 이용하여 센서 표면위에 포획하였으며, 포획 수준은 전형적으로 50 내지 80 공명 단위(RU)이었다. pH 7.4 분석 조건의 경우 27 nM로부터, 또는 pH 5.8 분석 조건의 경우 135 nM로부터 출발하는 3배 연속 희석에 의해 재조합 C5를 제조하였다. 20 mM HCl, 0.01% 트윈 20을 사용하여 표면을 재생하였다. 데이터는 비아이벨류에이션 2.0 소프트웨어(지이 헬쓰케어)를 사용하여 1:1 결합 모델로 처리하고 적합화시켰다.
pH 7.4 및 pH 5.8에서 재조합 인간 C5에 대한 BNJ441, 에쿨리주맙 및 305 변이체의 결합 친화도(KD)는 표 10에 나타내었다. 305 변이체는 93의 (pH 5.8에서의 KD)/(pH 7.4에서의 KD) 비를 나타낸 BNJ441보다 8배 더 높은, 거의 800의 (pH 5.8에서의 KD)/(pH 7.4에서의 KD) 비를 나타내었다.
항체 KD(M) pH 5.8/pH 7.4에서의
KD의 비
pH 7.4 pH 5.8
305LO5 변이체 1.66E-10 1.32E-07 795
에쿨리주맙 1.42E-10 2.64E-09 19
BNJ441 1.38E-09 1.28E-07 93
실시예 9
C5 활성화에 대한 항-C5 항체(305 변이체)의 억제 활성
9.1 항-C5 MAb에 의한 보체-활성화된 리포좀 용해의 억제
항-C5 MAb를 리포좀 용해 분석에 의해 보체 활성의 억제에 대해 검사하였다. 30 ㎕의 정상 인간 혈청(6.7%)(바이오프레딕, SER018)을 96-웰 플레이트에서 20 ㎕의 희석된 MAb와 혼합하고 실온에서 30 분동안 진탕기 상에서 배양하였다. 다이니트로페닐(오토키트 CH50, 와코, 995-40801)에 대해 항체로 감작된 리포좀을 각 웰로 옮기고 플레이트를 37 ℃에서 진탕기 상에서 2 분동안 두었다. 50 ㎕의 기질 용액(오토키트 CH50)을 각 웰에 첨가하고 37 ℃에서 2 분동안 진탕시켜 혼합하였다. 최종 혼합물을 37 ℃에서 40 분 동안 배양한 후에, 340 nm에서의 OD를 측정하였다. 리포좀 용해 퍼센트는 100 x [(ODMAb - OD혈청 및 리포좀 배경)]/[(ODMAb 비함유 - OD혈청 및 리포좀 배경)]으로 정의되었다. 도 15는 항-C5 MAb: 305LO15-SG422, 305LO16-SG422, 305LO18-SG422, 305LO19-SG422, 305LO20-SG422, 및 305LO20-SG115가 리포좀 용해를 억제하였음을 보여준다. Fc 변이체를 갖는 2개의 항체: 305LO15-SG115 및 305LO23-SG429도 또한 리포좀 용해를 억제하였다(도 16).
항-C5 MAb를 재조합 인간 C5(서열번호 39)의 억제에 대해 검사하였다. 10 ㎕의 C5-결핍 인간 혈청(시그마, C1163)을 96-웰 플레이트에서 20 ㎕의 희석된 MAb 및 20 ㎕의 재조합 C5(0.1 ㎍/ml)와 혼합하고, 37 ℃에서 진탕기 상에서 1 시간동안 배양하였다. 리포좀(오토키트 CH50)을 각 웰로 옮기고 37 ℃에서 진탕기 상에서 2 분동안 두었다. 50 ㎕의 기질 용액(오토키트 CH50)을 각 웰에 첨가하고 37 ℃에서 2 분동안 진탕시켜 혼합하였다. 최종 혼합물을 37 ℃에서 180 분 동안 배양한 후에, 340 nm에서의 OD를 측정하였다. 리포좀 용해 퍼센트는 상기와 같이 정의되었다. 도 17은 항-C5 Mab: 305LO22-SG115, 305LO22-SG422, 305LO23-SG115, 및 305LO23-SG422가 리포좀 용해를 억제하였음을 보여준다.
9.2. 항-C5 MAb에 의한 C5a 생성의 억제
항-C5 MAb가 C5의 C5a 및 C5b로의 절단을 억제하는지를 확인하기 위해 항-C5 MAb를 리포좀 용해시 C5a 생성에 대해 검사하였다. 리포좀 용해 분석으로부터의 상등액 중 C5a 수준은 C5a ELISA 키트(R&D 시스템즈, DY2037)를 사용하여 정량화하였다. 모든 MAb가 상등액중에서 C5a 생성을 용량-의존적으로 억제하였다(도 18 및 19).
9.3. 사이노몰구스 원숭이 혈장에서 보체 활성의 측정
항-C5 MAb를 사이노몰구스 원숭이 혈장에서의 보체 활성의 억제에 대해 검사하였다. 항-C5 Mab를 원숭이에게 내부 투여하고(20 mg/kg), 제 56일까지 혈장 샘플을 주기적으로 수거하였다. 닭의 적혈구 세포(cRBC)(이노베이티브 리서치, IC05-0810)를 0.5 mM MgCl2 및 0.15 mM CaCl2를 함유하는 젤라틴/베로날-완충 식염수(GVB++)(보스톤 바이오프로덕츠, IBB-300X)로 세척한 후, 4 ℃에서 항-닭 RBC 항체(로크랜드 103-4139)로 1 ㎍/ml에서 15 분동안 감작시켰다. 이어서, 세포를 GVB++로 세척하고 동일 완충액에 1x108 세포/ml로 현탁시켰다. 별도의 환저 96-웰 마이크로검사 플레이트에서, 원숭이 혈장을 감작된 cRBC와 함께 37 ℃에서 20 분동안 배양하였다. 배양후에, 플레이트를 4 ℃에서 1000 x g로 2 분동안 원심분리하였다. 상등액을 630 nm에서의 기준 파장하에 415 nm에서의 OD 측정을 위해 편평한 바닥의 96-웰 마이크로검사 플레이트 상의 웰로 옮겼다. 용혈 퍼센트는 100 x [(OD투여후 - OD혈장 및 cRBC 배경)]/[(OD 투여전 - OD혈장 및 cRBC 배경)]으로 정의되었다. 도 20은 항-C5 MAb: 305LO15-SG422, 305LO15-SG115, 305LO16-SG422, 305LO18-SG422, 305LO19-SG422, 305LO20-SG422, 305LO20-SG115, 및 305LO23-SG115가 혈장에서의 보체 활성을 억제하였음을 보여준다
9.4. 항-C5 MAb에 의한 C5 변이체의 생물 활성의 억제
항-C5 MAb를 재조합 인간 C5 변이체: V145I, R449G, V802I, R885H, R928Q, D966Y, S1310N, 및 E1437D의 억제에 대해 검사하였다. C5에 R885H 돌연변이를 갖는 PNH 환자는 에쿨리주맙에 불량한 반응을 나타내는 것으로 보고되었다(예를 들면, 문헌 [Nishimura et al., New Engl. J. Med. 370:632-639 (2014)] 참조). 인간 C5 변이체 각각을 FS293 세포에서 발현시키고, 상등액을 하기의 연구에 사용하였다. 10 ㎕의 C5-결핍 인간 혈청(시그마, C1163)을 96-웰 플레이트에서 20 ㎕의 희석된 MAb, 및 재조합 C5 변이체(2 내지 3 ㎍/ml)를 함유하는 세포 배양 배지 20 ㎕와 혼합하고, 37 ℃에서 진탕기 상에서 0.5 시간동안 배양하였다. 리포좀(오토키트 CH50)을 각 웰로 옮기고 37 ℃에서 진탕기 상에서 2 분동안 두었다. 50 ㎕의 기질 용액(오토키트 CH50)을 각 웰에 첨가하고 37 ℃에서 2 분동안 진탕시켜 혼합하였다. 최종 혼합물을 37 ℃에서 90 분 동안 배양한 후에, 340 nm에서의 OD를 측정하였다. 리포좀 용해 퍼센트는 상기와 같이 정의되었다. 도 21은 항-C5 MAb(에쿨리주맙)이 R885H C5 변이체를 억제하지 않았지만 검사된 다른 변이체를 억제하였음을 보여준다. 도 22는 항-C5 MAb(305 변이체)가 검사된 C5의 모든 변이체를 억제하였음을 보여준다.
9.5. 항-C5 MAb에 의한 보체-활성화된 리포좀 용해의 억제
항-C5 MAb를 리포좀 용해 분석에 의해 보체 활성의 억제에 대해 검사하였다. 30 ㎕의 정상 인간 혈청(6.7%)(바이오프레딕, SER018)을 96-웰 플레이트에서 20 ㎕의 희석된 MAb와 혼합하고 실온에서 30 분동안 진탕기 상에서 배양하였다. 다이니트로페닐(오토키트 CH50, 와코, 995-40801)에 대해 항체로 감작된 리포좀을 각 웰로 옮기고 플레이트를 25 ℃에서 진탕기 상에서 2 분동안 두었다. 50 ㎕의 기질 용액(오토키트 CH50)을 각 웰에 첨가하고 25 ℃에서 2 분동안 진탕시켜 혼합하였다. 최종 혼합물을 37 ℃에서 45 분 동안 배양한 후에, 혼합물을 340 nm에서의 OD를 측정하였다. 리포좀 용해의 퍼센트 억제는 100 x [(ODMAb - OD혈청 및 리포좀 배경)]/[(ODMAb 비함유 - OD혈청 및 리포좀 배경)]으로 정의되었다. 도 23은 항-C5 MAb, BNJ441 및 305 변이체가 리포좀 용해를 억제하였고, 305 변이체가 BNJ441보다 더 강한 억제 활성을 가짐을 보여준다.
실시예 10
사이노몰구스 원숭이에서 항-C5 단일클론 항체(305 변이체)의 약동학 연구
10.1. 사이노몰구스 원숭이를 이용한 생체내 검사
사이노몰구스 원숭이(신 니폰 바이오메디칼 래버러토리즈 리미티드(Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd.), 일본)에서 항-인간 C5 항체를 투여한 후에 항-인간 C5 항체의 생체내 동역학을 평가하였다. 항-인간 C5 항체(2.5 mg/ml)의 용액을 30분 주입하여 앞발의 요측피정맥 내에 약 8 ml/kg의 용량으로 1회 투여하였다. 투여전, 및 투여 5분후, 7시간후, 1일후, 2일후, 3일후, 7일후, 14일후, 21일후, 28일후, 35일후, 42일후, 49일후 및 56일후에 혈액을 수거하였다. 수거된 혈액을 즉시 1,700 x g 및 4 ℃에서 10분동안 원심분리시켜 혈장을 분리하였다. 분리된 혈장은 분석전에 -70 ℃ 이하에서 냉장고에 저장하였다. 항-인간 C5 항체는 실시예 7에서 기술된 바와 같이 제조하였다.
10.2. ELISA 분석에 의한 총 사이노몰구스 원숭이 C5 혈장 농도의 측정
사이노몰구스 원숭이 혈장내 총 사이노몰구스 원숭이 C5의 농도는 ELISA로 측정하였다. 항-인간 C5 항체(실시예 2에 기술된 방법을 이용하여 제작된 사내 항체)를 눈크-이뮤노플레이트 맥시소프(Nunc-ImmunoPlate MaxiSorp(날지 눈크 인터내셔날(Nalge Nunc International)) 상에 분배하고 4 ℃에서 밤새 정치시켜 항-사이노몰구스 원숭이 C5-고정화된 플레이트를 제조하였다. 0.4 ㎍/ml의 주입 항체로 20000배 희석된 보정 곡선 샘플 및 사이노몰구스 원숭이 혈장 샘플을 준비하고 37 ℃에서 60 분동안 배양하였다. 이어서, 상기 샘플들을 항-사이노몰구스 원숭이 C5-고정화된 플레이트 상에 분배시키고 실온에서 1 시간동안 정치시켰다. 이어서, HRP-표지된 항-인간 IgG 항체(서던바이오테크)를 첨가하여 실온에서 30 분동안 반응시키고, 세척을 수행하였다. 이어서, ABTS ELISA HRP 기질(KPL)을 첨가하였다. 405 nm의 파장에서 플레이트 판독기에 의해 신호를 측정하였다. 사이노몰구스 원숭이 C5 농도는 분석용 소프트웨어 소프트맥스 프로(몰레큘라 디바이시즈)를 사용하여 보정 곡선의 반응을 기준으로 계산하였다. 상기 방법에 의해 측정시 정맥내 투여후 혈장내 사이노몰구스 원숭이 C5 농도의 시간 경과를 도 24에 나타내었다. 데이터는 투여전에 혈장내 사이노몰구스 원숭이 C5 농도와 비교한 나머지 백분율로서 플로팅하였다. pH 의존성 항-인간 C5 항체들(305LO15-SG422, 305LO15-SG115, 305LO16-SG422, 305LO18-SG422, 305LO19-SG422, 305LO20-SG422, 305LO20-SG115, 305LO22-SG422, 305LO23-SG422, 및 305LO23-SG115)은 비-pH 의존성 항-인간 C5 항체에 비해 혈장 C5의 더 낮은 축적을 나타내었다.
10.3. ELISA 분석에 의한 항-인간 C5 항체 혈장 농도의 측정
사이노몰구스 원숭이 혈장내 총 항-인간 C5의 농도는 ELISA로 측정하였다. 항-인간 IgG 카파쇄 항체(안티바디 솔루션즈)를 눈크-이뮤노플레이트 맥시소프(날지 눈크 인터내셔날) 상에 분배시키고 4 ℃에서 밤새 정치시켜 항-인간 IgG-고정화된 플레이트를 제조하였다. 100배 이상 희석된 보정 곡선 샘플 및 사이노몰구스 원숭이 혈장 샘플을 준비하였다. 이어서, 상기 샘플들을 항-인간 IgG-고정화된 플레이트 상에 분배시키고 실온에서 1 시간동안 정치시켰다. 이어서, HRP-표지된 항-인간 IgG 항체(서던바이오테크)를 첨가하여 실온에서 30 분동안 반응시키고, 세척을 수행하였다. 이어서, ABTS ELISA HRP 기질(KPL)을 첨가하였다. 405 nm의 파장에서 플레이트 판독기에 의해 신호를 측정하였다. 항-인간 C5 항체 농도는 분석용 소프트웨어 소프트맥스 프로(몰레큘라 디바이시즈)를 사용하여 보정 곡선의 반응을 기준으로 계산하였다. 상기 방법에 의해 측정시 정맥내 투여후 혈장내 항-인간 C5 항체 농도의 시간 경과를 도 25에 나타내었다. pH 의존성 항-인간 C5 항체들(305LO15-SG422, 305LO15-SG115, 305LO16-SG422, 305LO18-SG422, 305LO19-SG422, 305LO20-SG422, 305LO20-SG115, 305LO22-SG422, 305LO23-SG422, 및 305LO23-SG115)은 비-pH 의존성 항-인간 C5 항체에 비해 더 긴 반감기를 나타내었다.
실시예 11
305 변이체 Fab 및 인간 C5-MG1 도메인 복합체의 X-선 결정 구조 분석
11.1. 인간 C5의 MG1 도메인(20-124)의 발현 및 정제
트롬빈 절단성 링커를 통해 GST-태그에 융합된 MG1 도메인(서열번호 39의 아미노산 20 내지 124)(GST-MG1)을 pGEX-4T-1 벡터(지이 헬쓰케어)를 사용하여 에스케리치아 콜라이 균주 BL21 DE3 pLysS(프로메가(Promega))에서 발현시켰다. 단백질 발현은 25 ℃에서 0.1 mM 이소프로필 베타-D-1-티오갈락토피라노시드(IPTG)로 5 시간동안 유도하였다. 세균 세포 펠릿을 라이소나제(메르크(Merck)) 및 완전 프로테아제 억제제 칵테일(로슈)로 보충된 버그부스터(Bugbuster)(메르크)로 용해시킨 후, GSTrap 컬럼(지이 헬쓰케어)을 제조사의 지시에 따라서 사용하여 가용성 분획으로부터 GST-MG1을 정제하였다. GST 태그를 트롬빈(시그마)으로 절단하고, 생성된 MG1 도메인을 슈퍼덱스 75 겔 여과 컬럼(지이 헬쓰케어)으로 더 정제하였다. MG1 도메인을 함유하는 분획들을 취합하고 -80 ℃에서 저장하였다.
11.2. 305 변이체의 Fab 단편의 제조
305로부터 최적화된 변이체들 중 하나의 Fab 단편을 파파인(로슈 다이아그노스틱스(Roche Diagnostics, Cat No.1047825)에 의한 제한 절단을 이용하는 통상적인 방법에 의해 제조한 후, Fc 단편을 제거하기 위한 단백질 A 컬럼(MabSlect SuRe, 지이 헬쓰케어), 양이온 교환 컬럼(하이트랩(HiTrap) SP HP, 지이 헬쓰케어), 및 겔 여과 컬럼(슈퍼덱스200 16/60, 지이 헬쓰케어) 상에 담지시켰다. Fab 단편을 함유하는 분획들을 취합하고 -80 ℃에서 저장하였다.
11.3. 305 변이체 Fab 및 인간 C5-MG1 도메인 복합체의 제조
정제된 재조합 인간 C5-MG1 도메인을 정제된 305 변이체 Fab 단편과 1:1 몰비로 혼합하였다. 25 mM HEPES pH 7.5, 100 mM NaCl로 평형화된 컬럼을 이용하여 겔 여과 크로마토그래피(슈퍼덱스x200 10/300 증가, 지이 헬쓰케어)에 의해 복합체를 정제하였다.
11.4. 결정화
정제된 복합체를 약 10 mg/ml로 농축하고, 4 ℃에서 시딩(seeding) 방법과 함께 싯팅 드롭 증기 확산(sitting drop vapor diffusion) 방법에 의해 결정화를 수행하였다. 수용기 용액은 0.2 M 마그네슘 포르메이트 탈수물, 15.0% w/v 폴리에틸렌 글리콜 3350으로 이루어졌다. 이에 의해 수일내에 판상(plate-like) 결정을 수득하는데 성공하였다. 상기 결정을 0.2 M 마그네슘 포르메이트 탈수물, 25.0% w/v 폴리에틸렌 글리콜 3350, 및 20% 글리세롤의 용액에 침지시켰다.
11.5. 데이터 수집 및 구조 측정
X-선 회절 데이터를 SPring-8에서 BL32XU로 측정하였다. 측정시, 냉동 상태를 유지하도록 결정을 지속적으로 -178 ℃에서 질소 스트림 중에 두었으며, 결정을 한번에 1.0도 회전시키면서, 빔 라인에 결합된 MX-225HS CCD 검출기(레이요닉스(RAYONIX))를 사용하여 총 180개의 X-선 회절 영상을 수집하였다. Xia2 프로그램(문헌 [J. Appl. Cryst. 43:186-190 (2010)]), XDS 패키지(문헌 [Acta. Cryst. D66:125-132 (2010)]), 및 Scala(문헌 [Acta. Cryst. D62:72-82 (2006)])를 사용하여 세포 파라미터들의 측정, 회절 스폿의 지수화, 및 회절 영상으로부터 수득된 회절 데이터의 처리를 수행하고, 최종적으로 2.11 Å(s) 해상도 이하의 회절 강도 데이터를 수득하였다. 결정학 데이터 통계 결과는 표 11에 나타내었다.
X-선 데이터 수집 및 개선 결과 통계
데이터 수집
공간군 P1
단위 격자
a,b,c(Å) 39.79, 55.10, 127.76
α,β,γ(°) 89.18, 86.24, 78.20
해상도(Å) 49.49-2.11
전반사 112,102
고유 반사 56,154
완성도(최고 해상도 셀)(%) 92.1(95.8)
R merg e a(최고 해상도 셀)(%) 7.2(31.7)
개선
해상도(Å) 25.00-2.11
반사 53,398
Rfactorb(R free c)(%) 20.42(26.44)
이상값으로부터의 rms 편차
결합 길이(Å) 0.0088
결합각(°) 1.3441
a; R merge = ΣhklΣj│Ij(hkl) - 〈I(hkl)〉│/ΣhklΣj│Ij(hkl)(여기서, Ij(hkl) 및 〈I(hkl)〉은 각각 측정치 j의 강도 및 지수 hkl 하의 반사에 대한 평균 강도이다).
b; Rfactor = Σhkl│F calc(hkl)│ - │F obs(hkl)│/Σhkl│F obs(hkl)(여기서, F obs 및 F calc는 각각 관찰된 구조 인자 크기 및 계산된 구조 인자 크기이다).
c; R free는 무작위로 무효화된 반사의 5% 하에 계산된다.
구조는 프로그램 페이서(Phaser)(문헌 [J. Appl. Cryst. 40:658-674 (2007)])를 사용하여 분자 치환에 의해 측정하였다. Fab 도메인의 탐색 모델은 발표된 인간 IgG4 Fab 결정 구조(PDB 코드: 1BBJ)로부터 유도하였으며, MG1 도메인의 탐색 모델은 발표된 인간 C5 결정 구조(PDB 코드: 3CU7, 문헌 [Nat.Immunol. 9:753-760 (2008)])로부터 유도하였다. 쿠트(Coot) 프로그램(문헌 [Acta Cryst. D66:486-501 (2010)])을 사용하여 모델을 구축하고 프로그램 레프막5(Refmac5)(문헌 [Acta Cryst. D67:355-367 (2011)])를 사용하여 개선하였다. 25-2.11 Å(s)로부터의 회절 강도 데이터에 대한 결정학 신뢰도 인자(R)는 20.42%였으며, 이때 프리 R(Free R) 값은 26.44%이다. 구조 개선 통계 결과는 표 11에 나타내었다.
11.6. 305 변이체 Fab 및 C5-MG1 도메인 복합체의 전체 구조
305로부터의 최적화된 변이체의 Fab 단편("305 Fab")은 인간 C5-MG1 도메인("MG1")에 1:1 비로 결합하였으며, 결정 구조의 비대칭 단위는 도 26a에 도시된 바와 같이, 2개의 복합체, 분자 1 및 2를 함유하였다. 분자 1 및 2는, 도 26b에 나타낸 바와 같이, 0.717 Å(s) RMSD에서 모든 잔기에서 C 알파 원자 위치와 잘 정렬될 수 있다. 하기에서 논의되는 도면들은 분자 1을 사용하여 제작되었다.
도 27a 및 27b에서, 305 Fab 접촉 영역의 에피토프를 MG1 아미노산 서열 및 결정 구조 각각에 맵핑하였다. 상기 에피토프는 결정 구조에서 305 Fab의 임의 부분으로부터 4.5 Å(s)의 거리 이내에 위치한 하나 이상의 원자들을 함유하는 MG1의 아미노산 잔기를 포함한다. 또한, 3.0 Å(s) 이내의 에피토프가 도 27a에서 강조되어 있다.
11.7. E48, D51, 및 K109의 상호작용
실시예 4.5 및 4.6에서 기술된 바와 같이, 305 항체 시리즈를 포함하는 항-C5 Mab들을 웨스턴 블롯 및 비아코어(등록상표) 결합 분석에 의해 3개의 인간 C5 점 돌연변이체, E48A, D51A, 및 K109A에 대한 결합에 대해 검사하였다. 305 변이체는 WT C5에 강하게 결합하였지만, 이들은 E48A C5 돌연변이체에는 약하게만 결합하였고, D51A 및 K109A 돌연변이체에는 결합하지 않았다. 305 Fab 및 MG1 복합체의 결정 구조는, 도 28a에 나타낸 바와 같이, 3개의 아미노산 E48, D51, 및 K109가 모두 305 Fab로부터 3.0 Å(s) 이내에 위치하여 Fab와 다수의 수소 결합을 형성함을 보여주었다. 보다 상세한 검사에서, MG1의 K109 잔기는 Fab의 중쇄의 계면에 형성된 홈에 매립되고, H-CDR3_G97, H-CDR3_Y100, 및 H-CDR3_T100b와의 3개의 수소 결합에 의해서, 및 H-CDR3_D95와의 염 가교에 의해 Fab와 밀접하게 상호작용한다(도 28d). D51은 MG1과 305 Fab의 사이에 위치하며, H-CDR1_Ser32 및 H-CDR2_Ser54와 2개의 수소 결합을 형성하여 공간을 채운다(도 28c). 이들은 C5의 K109 및 D51이 둘 다 305 항체 시리즈의 결합에 중요한 잔기임을 시사한다. 다른 한편으로, E48은 표면에 더 가깝게 위치하며 Fab와 단지 1개의 수소 결합을 형성하여, 항체 결합에 대한 그의 기여는 K109 및 E51보다 낮음을 시사한다(도 28b). 이러한 관계들은 인간 C5 돌연변이체의 웨스턴 블롯 및 비아코어(등록상표) 결합 분석의 결과와 일치한다(실시예 4.5 및 4.6). 부기: Fab 아미노산들에 대한 잔기 번호는 카밧 번호 체계에 근거한다(문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991]).
11.8. 인간 C5의 H70, H72, 및 H110과 305 항체 시리즈의 상호작용
결정 구조 분석에 의해, 도 27a 및 도 29a에 나타낸 바와 같이, 인간 C5 상의 3개 히스티딘 잔기, 즉, H70, H72, 및 H110이 305 변이체 Fab의 에피토프에 포함되는 것이 밝혀졌다. 인간 C5 돌연변이체 H70Y, H72Y, H110Y, 및 H70Y+H110Y(실시예 4.7)를 사용하여 인간 C5와 305 변이체 Fab 사이의 pH-의존성 단백질-단백질 상호작용에 대한 상기 히스티딘 잔기들의 기여를 조사하기 위해 비아코어(등록상표) 결합 분석을 수행하였다. 도 29c에 나타낸 바와 같이, C5의 상기 잔기는 305 Fab의 중쇄의 CDR2 루프 및 MG1의 루프((L73, S74, 및 E76)에 의해 형성된 포켓에 위치하며, 상기 공간을 치밀하게 채우고 있다. 또한, C5의 H72 잔기는 H-CDR2_Y58과 수소 결합을 형성한다. H72Y 돌연변이는, 티로신의 보다 부피가 큰 측쇄를 수용하기에 충분한 공간이 없기 때문에, 허용될 것으로 예상되지 않는다. 또한 H-CDR2_Y58과의 수소 결합도 유지될 수 없다. pH 의존성에 대한 H70 및 H110의 기여와 관련하여, H70Y 및 H110Y 돌연변이는 pH 5.8에서 C5로부터 305 변이체 Fab의 보다 느린 해리를 야기하였다. H70은 MG1의 T53과 분자내 수소 결합을 형성하는데, 이것은 C5의 H70이 MG1의 상호작용 계면의 상응하는 부분에서의 입체형태적 변화를 야기할 때 pH 5.8에서 파괴될 것으로 생각된다(도 29b). H110의 경우, 상기 C5 잔기의 양성자화는 305 Fab에 대한 전하 반발을 야기할 것으로 예상되며, 상기 반발은 인접 히스티딘 잔기, H-CDR3_H100c의 양성자화에 의해 증가될 수 있다(도 29d).
명확한 이해를 위해 예시 및 예로써 본 발명을 다소 상세히 기술하였지만, 상기 설명 및 예들은 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안된다. 본원에 인용된 모든 특허 및 과학 문헌들의 개시내용들은 명백히 전체로 참고로 인용된 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKIKAISHA <120> ANTI-C5 ANTIBODIES AND METHODS OF USE <130> C1-A1517P <140> PCT/JP2016/087481 <141> 2016-12-16 <150> JP-P-2015-247069 <151> 2015-12-18 <160> 150 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 1 Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser 1 5 10 15 Leu Ala Val Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Ser Ser Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Cys Ile Tyr Thr Gly Ser Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr Leu 65 70 75 80 Gln Met Thr Ser Leu Thr Val Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala 85 90 95 Ser Asp Gly Gly Tyr Val Thr Pro Thr His Ala Met Tyr Leu Trp Gly 100 105 110 Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized 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<223> An artificially synthesized sequence <400> 55 Cys Ile Tyr Thr Gly Ser Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys 1 5 10 15 Gly <210> 56 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 56 Cys Ile Tyr Thr Val Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys 1 5 10 15 Gly <210> 57 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 57 Cys Ile Tyr Ala Gly Ser Ser Gly Ile Ile Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala 1 5 10 15 Lys Gly <210> 58 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 58 Met Ile Tyr Gly Ser Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 1 5 10 15 <210> 59 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 59 Met Ile Tyr Gly Ser Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 1 5 10 15 <210> 60 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 60 Ile Ile Ser Phe Gly Gly Asp Ala Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 1 5 10 15 <210> 61 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 61 Thr Ile Asp Thr Gly Asp Asn Ser Phe Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly 1 5 10 15 <210> 62 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 62 Cys Ile Tyr Thr Gly Ser Asp Thr Thr Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Lys 1 5 10 15 Gly <210> 63 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 63 Thr Ile Asp Thr Gly Asp Asn Ser Phe Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly 1 5 10 15 <210> 64 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 64 Ala Ile Tyr Thr Gly Ser Gly Ala Thr Tyr Lys Ala Ser Trp Ala Lys 1 5 10 15 Gly <210> 65 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 65 Asp Gly Gly Tyr Val Thr Pro Thr His Ala Met Tyr Leu 1 5 10 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<223> An artificially synthesized sequence <400> 78 Gln Ala Ser Glu Ser Ile Ser Asn Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 79 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 79 Gln Ala Ser Glu Ser Ile Ser Asn Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 80 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 80 Gln Ala Ser Glu Ser Ile Tyr Ser Ala Leu Ala 1 5 10 <210> 81 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 81 Gln Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Ala Leu Ser 1 5 10 <210> 82 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 82 Gln Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Ser Leu Leu Ala 1 5 10 <210> 83 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 83 Gln Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Ala Leu Ser 1 5 10 <210> 84 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 84 Gln Ala Ser Gln Asn Ile Gly Ser Ser Leu Ala 1 5 10 <210> 85 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 85 Gly Ala Ser Lys Leu Ala Ser 1 5 <210> 86 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 86 Gly Ala Ser Asn Leu Glu Ser 1 5 <210> 87 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 87 Glu Ala Ser Lys Leu Ala Ser 1 5 <210> 88 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 88 Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser 1 5 <210> 89 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 89 Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser 1 5 <210> 90 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 90 Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser 1 5 <210> 91 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 91 Tyr Ala Ser Thr Leu Ala Ser 1 5 <210> 92 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 92 His Thr Ser Asp Leu Ala Ser 1 5 <210> 93 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 93 Tyr Ala Ser Thr Leu Ala Ser 1 5 <210> 94 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 94 Gly Ala Ser Lys Thr His Ser 1 5 <210> 95 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 95 Gln Cys Thr Phe Val Gly Ser Ser Tyr Gly Asn Ala 1 5 10 <210> 96 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 96 Leu Gln Gly Tyr Ser Tyr Ser Asn Val Asp Asp Ala 1 5 10 <210> 97 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 97 Gln Gly Thr Tyr Tyr Ser Ser Gly Trp Tyr Phe Ala 1 5 10 <210> 98 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 98 Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Ser Asn Val Asp Asn Thr 1 5 10 <210> 99 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 99 Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Ser Asn Val Asp Asn Thr 1 5 10 <210> 100 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 100 Gln Gln Tyr Tyr Ser Ser Thr Asn Val His Asn Ser 1 5 10 <210> 101 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 101 Gln Gln Tyr Tyr Asp Ile Asn Ser Val Asp Asn Thr 1 5 10 <210> 102 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 102 Gln Cys Thr Ala Tyr Gly Ser Ser Asp Val Gly Gly Thr 1 5 10 <210> 103 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 103 Gln Gln Tyr Tyr Asp Ile Asn Ser Val Asp Asn Thr 1 5 10 <210> 104 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 104 Gln Ser Thr Lys Val Gly Ser Ser Tyr Gly Asn His 1 5 10 <210> 105 <211> 1680 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 105 Met Gly Leu Trp Gly Ile Leu Cys Leu Leu Ile Phe Leu Asp Lys Thr 1 5 10 15 Trp Gly Gln Glu Gln Thr Tyr Val Ile Ser Ala Pro Lys Ile Leu Arg 20 25 30 Val Gly Ser Ser Glu Asn Val Val Ile Gln Val His Gly Tyr Thr Glu 35 40 45 Ala Phe Asp Ala Thr Leu Ser Leu Lys Ser Tyr Pro Asp Lys Lys Val 50 55 60 Thr Phe Ser Ser Gly Tyr Val Asn Leu Ser Pro Glu Asn Lys Phe Gln 65 70 75 80 Asn Ala Ala Leu Leu Thr Leu Gln Pro Asn Gln Val Pro Arg Glu Glu 85 90 95 Ser Pro Val Ser His Val Tyr Leu Glu Val Val Ser Lys His Phe Ser 100 105 110 Lys Ser Lys Lys Ile Pro Ile Thr Tyr Asn Asn Gly Ile Leu Phe Ile 115 120 125 His Thr Asp Lys Pro Val Tyr Thr Pro Asp Gln Ser Val Lys Ile Arg 130 135 140 Val Tyr Ser Leu Gly Asp Asp Leu Lys Pro Ala Lys Arg Glu Thr Val 145 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5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val His Ser Ser 20 25 30 Tyr Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Val Gly Ala Ile Phe Thr Gly Ser Gly Ala Glu Tyr Lys Ala Glu Trp 50 55 60 Ala Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Ser Asp Ala Gly Tyr Asp Tyr Pro Thr His Ala Met His Tyr 100 105 110 Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 109 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 109 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val His Ser Ser 20 25 30 Tyr Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Val Gly Ala Ile Phe Thr Gly Ser Gly Ala Glu Tyr Lys Ala Glu Trp 50 55 60 Ala Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Ser Asp Ala Gly Tyr Asp Tyr Pro Thr His Ala Met His Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 110 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 110 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val His Ser Ser 20 25 30 Tyr Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Val Ser Gly Ile Phe Thr Gly Ser Gly Ala Thr Tyr Lys Ala Glu Trp 50 55 60 Ala Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Ser Asp Ala Gly Tyr Asp Tyr Pro Thr His Ala Met His Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 111 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 111 Asp Ile Gln 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Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Arg Arg Gly Pro Lys Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ala His Tyr Thr Arg Lys Glu 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Pro 325 <210> 116 <211> 325 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 116 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Arg Arg Gly Pro Lys Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 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Thr Gly Ser Gly Ala Glu Tyr Lys Ala Glu Trp Ala Lys 1 5 10 15 Gly <210> 119 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 119 Ala Ile Phe Thr Gly Ser Gly Ala Glu Tyr Lys Ala Glu Trp Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 120 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 120 Gly Ile Phe Thr Gly Ser Gly Ala Thr Tyr Lys Ala Glu Trp Ala Lys 1 5 10 15 Gly <210> 121 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 121 Asp Ala Gly Tyr Asp Tyr Pro Thr His Ala Met His Tyr 1 5 10 <210> 122 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 122 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ser Leu Ala 1 5 10 <210> 123 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 123 Gly Ala Ser Glu Thr Glu Ser 1 5 <210> 124 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 124 Gly Ala Ser Thr Thr Gln Ser 1 5 <210> 125 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 125 Gln Asn Thr Lys Val Gly Ser Ser Tyr Gly Asn Thr 1 5 10 <210> 126 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is Met or Val <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa is Cys or Ala <400> 126 Ser Ser Tyr Tyr Xaa Xaa 1 5 <210> 127 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa is Cys, Ala or Gly <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa is Tyr or Phe <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa is Thr, Asp or Glu <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Xaa is Tyr, Lys or Gln <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> Xaa is Ser, Asp or Glu <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> Xaa is Ala or Val <400> 127 Xaa Ile Xaa Thr Gly Ser Gly Ala Xaa Tyr Xaa Ala Xaa Trp Xaa Lys 1 5 10 15 Gly <210> 128 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa is Gly or Ala <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is Val, Gln or Asp <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa is Thr or Tyr <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa is Tyr or His <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> Xaa is Leu or Tyr <400> 128 Asp Xaa Gly Tyr Xaa Xaa Pro Thr His Ala Met Xaa Xaa 1 5 10 <210> 129 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa is Gln or Arg <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is Asn, Gln or Gly <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa is Gly or Ser <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa is Asp, Lys or Ser <400> 129 Xaa Ala Ser Gln Xaa Ile Xaa Ser Xaa Leu Ala 1 5 10 <210> 130 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa is Lys, Glu or Thr <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is Leu or Thr <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa is Ala, His, Glu or Gln <400> 130 Gly Ala Ser Xaa Xaa Xaa Ser 1 5 <210> 131 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa is Ser, Cys, Asn or Thr <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa is Phe or Lys <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa is Ala, Thr or His <400> 131 Gln Xaa Thr Xaa Val Gly Ser Ser Tyr Gly Asn Xaa 1 5 10 <210> 132 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 132 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ser His 20 25 30 <210> 133 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 133 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val His 20 25 30 <210> 134 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 134 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val His 20 25 30 <210> 135 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 135 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly 1 5 10 <210> 136 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 136 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 1 5 10 <210> 137 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 137 Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr 1 5 10 15 Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Ser 20 25 30 <210> 138 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 138 Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr 1 5 10 15 Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Ser 20 25 30 <210> 139 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 139 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser 20 25 30 <210> 140 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 140 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 141 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 141 Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 142 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 142 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 143 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 143 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 144 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 144 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 145 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 145 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 146 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 146 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 147 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 147 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 148 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 148 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 149 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 149 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly His Ile Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly His Thr Glu Tyr Thr Glu Asn Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Phe Phe Gly Ser Ser Pro Asn Trp Tyr Phe Asp Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp 195 200 205 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys 210 215 220 Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala 420 425 430 Leu His Ser His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 445 <210> 150 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 150 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gly Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Ala 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Leu Asn Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210

Claims (15)

  1. (a) 서열번호 106의 VH 서열 및 서열번호 111의 VL 서열;
    (b) 서열번호 107의 VH 서열 및 서열번호 111의 VL 서열;
    (c) 서열번호 108의 VH 서열 및 서열번호 111의 VL 서열;
    (d) 서열번호 109의 VH 서열 및 서열번호 111의 VL 서열;
    (e) 서열번호 109의 VH 서열 및 서열번호 112의 VL 서열;
    (f) 서열번호 109의 VH 서열 및 서열번호 113의 VL 서열; 또는
    (g) 서열번호 110의 VH 서열 및 서열번호 113의 VL 서열
    을 포함하는, 항-C5 항체.
  2. 제 1 항에 있어서,
    서열번호 114의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역 및 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함하는 항-C5 항체.
  3. 제 1 항에 있어서,
    전장 IgG1 또는 IgG4 항체인 항-C5 항체.
  4. 제 2 항에 있어서,
    전장 IgG1 또는 IgG4 항체인 항-C5 항체.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 항-C5 항체를 암호화하는 단리된 핵산.
  6. 제 5 항에 따른 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  7. 항체가 생성되도록 제 6 항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 항체의 제조 방법.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
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  14. 삭제
  15. 삭제
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