KR101778203B1

KR101778203B1 - 이고들빼기 식물체의 추출물을 포함하는 허혈-재관류 손상을 예방 또는 치료하기 위한 조성물 및 그의 용도

Info

Publication number: KR101778203B1
Application number: KR1020160125103A
Authority: KR
Inventors: 노주원; 권학철; 유지혜; 권재영; 박진수; 장혁재; 김성수; 박천수; 이화미; 이희주
Original assignee: 한국과학기술연구원; 울산대학교 산학협력단
Priority date: 2016-09-28
Filing date: 2016-09-28
Publication date: 2017-09-26
Also published as: US20180085414A1; US20190381122A1; US11285186B2

Abstract

이고들빼기 (Crepidiastrum denticulatum) 식물체의 추출물을 유효성분으로 포함하는 개체에서 허혈-재관류 손상을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물, 식품용 조성물 및 상기 약학적 조성물을 이용한 허혈-재관류 손상을 예방 또는 치료하기 위한 방법을 제공한다.

Description

이고들빼기 식물체의 추출물을 포함하는 허혈-재관류 손상을 예방 또는 치료하기 위한 조성물 및 그의 용도{Composition comprising Crepidiastrum denticulatum extract for preventing or treating ischemia reperfusion injury and use thereof}

이고들빼기 (Crepidiastrum denticulatum) 식물체의 추출물을 유효성분으로 포함하는 개체에서 허혈-재관류 손상을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물, 식품용 조성물 및 상기 약학적 조성물을 이용한 허혈-재관류 손상을 예방 또는 치료하기 위한 방법에 관한 것이다.

장기 이식 수술이나 심혈관계 질환 치료를 위한 수술 등의 외과적 처치 시에 특정 조직으로의 혈액 공급을 제한할 수 있는데, 이런 경우 간, 신장, 심장, 뇌 등 계속적인 혈류 공급이 중요한 장기에 혈액 순환이 차단됨에 따라 허혈로 인한 손상이 발생한다. 또한 산소가 제대로 공급되지 않는 허혈 상태에서 재관류에 의하여 갑자기 혈류량이 증가되면 여러 복합적인 원인으로 인하여 세포와 조직이 크게 손상될 수 있다. 특히 간 또는 신장 허혈-재관류성 손상(liver or renal Ischemia Reperfusion Injury:IRI)은 주로 간 또는 신장 이식이나 심장질환 수술 이후 빈번히 발생하는 주요한 합병증이다. 수술 도중에 혈류의 차단에 의하여 간 또는 신장으로 혈액 공급이 일시 중단된 후 뒤이어 시행되는 재관류(reperfusion)는 심각한 급성염증반응(acute inflammation response)과 급성조직손상을 유도할 수 있다.(J.V. Bonventre 등, Ischemic Kidney Int, 2004, 66, 480-485). 특히, 이러한 급성 염증반응이나 조식손상에 의한 세포사멸(cell apotosis)은 간부전이나 신부전을 일으키는 주요 원인 중 하나이므로 매우 심각한 위험요소로 인식되고 있다(R. Bonegio 등, Curr Opin Nephrol Hypertension. 2002, 11, 301-308). 허혈성 재관류 손상은 산소 결핍 상태에서 갑자기 혈류량이 증가해 세포 내 칼슘 농도가 갑자기 증가함으로써 발생하기도 한다. 세포내 칼슘의 증가는 미토콘드리아의 손상을 매개할 수 있는데, 이때 미토콘드리아 손상에 의하여 유리된 물질과 ATP가 반응해서 활성산소가 발생하고, 이를 인체가 염증으로 인식해 백혈구가 공격하면서 더 많은 활성산소가 발생해 결국 세포 손상으로 이어질 수 있다. 허혈성 재관류 손상은 혈액이 다시 유입되는 속도가 빠를수록 심하게 나타나는데, 심장 수술이나 장기 이식수술이 끝난 후 혈류가 재개될 때 허혈성 재관류 손상이 빈번히 발생한다. 이처럼 허혈성 재관류 손상이 예측되는 경우, 활성산소에 의한 손상을 주요 요인 중 하나로 간주하여 이에 대한 치료제로서 강력한 항산화제를 미리 투여해 이를 예방할 수 있다는 연구결과가 보고되어 있다. 그러나, 강력한 항산화제의 경우도 유효성의 한계 때문에 제한적으로 사용되어 왔고 일부 약물에 대한 임상 연구가 진행되고 있지만, 허혈성 재관류 손상을 직접적으로 예방 또는 치료하는 약물은 현재까지 개발된 바 없다. 전 세계적으로 장기 이식술과 같은 허혈성 재관류 조직손상을 야기할 수 있는 외과적 시술이 급증하고 있으나 간 또는 신장 이식시 문제가 되는 허혈-재관류 손상 후에 염증반응과 세포 사멸을 억제하면서 장기의 기능을 회복할 수 있는 새로운 기법 개발이 의학적으로나 사회적으로 절실히 요구되고 있는 실정이다.

한편, 이고들빼기(Crepidiastrum denticulatum)는 국화과의 한해살이 또는 두해살이풀로 산과 들의 건조한 곳에서 자라며, 높이 30∼70 ㎝이고, 줄기는 가늘고 자줏빛이다. 뿌리에 달린 잎은 주걱 모양이며 꽃이 필 때 스러지고 줄기에 달린 잎은 어긋나며 잎자루가 없다. 잎 길이는 6-11 ㎝, 나비는 3-7 ㎝이며 끝은 둔하다. 밑부분은 귀처럼 되어 줄기를 반쯤 감싸고, 가장자리에 이 모양의 톱니가 드문드문 있다. 꽃은 8-9월에 노란색으로 피고 두화는 지름 15 ㎜ 정도로서 산방꽃차례로 달리는데, 꽃이 필 때는 곧게 서고 진 다음 밑으로 처진다. 어린순을 나물로 먹고, 한국, 일본, 중국 및 인도차이나에 분포한다.

한국 공개 특허 제1020160023310호는 이고들빼기 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 노화 예방 또는 지연용 화장료 조성물을 개시한다. 한국 공개 특허 제1020110139582는 이고들빼기 추출물을 포함하는 숙취해소 및 에탄올성 간 해독 작용을 가진 추출물 제조 방법을 개시한다.

그러나, 종래 기술에 의하더라도 이고들빼기 추출물이 허혈-재관류에 의한 조직 손상을 예방 또는 치료하는 효과에 대하여는 지금까지 알려진 바 없다.

일 양상은 고들빼기 (Crepidiastrum sp.) 속 식물체의 추출물을 유효성분으로 포함하는 개체에서 허혈-재관류 손상을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공한다.

다른 양상은 고들빼기 (Crepidiastrum sp.) 속 식물체의 추출물을 유효성분으로 포함하는 개체에서 허혈-재관류 손상을 예방 또는 치료하기 위한 식품용 조성물을 제공한다.

다른 양상은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체의 허혈-재관류 손상을 예방 또는 치료하기 위한 방법을 제공한다.

일 양상은 고들빼기 속 (Crepidiastrum sp.) 식물체의 추출물을 유효성분으로 포함하는 개체에서 허혈-재관류 손상을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공한다.

상기 고들빼기 속 식물체는 이고들빼기(Crepidiastrum denticulatum (Houtt.)), 고들빼기(Crepidiastrum sonchifolium (Bunge)), 갯고들빼기(Crepidiastrum lanceolatum (Houtt.)), 까치고들빼기Crepidiastrum chelidoniifolium(Makino)), 절영풀(Crepidiastrum platyphyllum (Franch. & Sav.)), 또는 지리고들빼기(Crepidiastrum koidzumianum)일 수 있다.

상기 식물체는 전체 또는 부분일 수 있다. 상기 부분은 지상부, 또는 지하부일 수 있다. 상기 지상부는 줄기, 잎, 꽃 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 지하부는 뿌리일 수 있다.

상기 추출물은 상기 식물체를 물, C1 내지 C6의 알코올 또는 이들의 혼합물을 추출 용매로 하여 추출된 것일 수 있다. 상기 알코올은 C1 내지 C3의 알코올, C1 내지 C4, C1 내지 C5 또는 C1 내지 C6의 알코올일 수 있다. 상기 알코올은 일차 알콜일 수 있다. 상기 C1 내지 C6의 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 또는 이들의 혼합물인 것일 수 있다.

상기 추출은 상기 식물체를 용매 중에 일정 시간 동안 담가 두는 것을 포함할 수 있다. 상기 추출은 교반 또는 가열하는 것을 포함할 수 있다. 상기 가열은 50℃, 60℃, 70℃, 80℃, 또는 환류 온도까지 가열하는 것을 포함할 수 있다. 상기 가열은 50℃ 내지 환류 온도, 60℃ 내지 환류 온도, 70℃ 내지 환류 온도, 80℃ 내지 환류 온도, 또는 환류 온도까지 가열하는 것일 수 있다. 상기 추출 시간은 선택된 온도에 따라 달라질 수 있는데 1 시간 내지 2개월, 예를 들면, 1 시간 내지 1개월, 1 시간 내지 15일, 1 시간 내지 10일, 1 시간 내지 5일, 1 시간 내지 3일, 1 시간 내지 2일, 1 시간 내지 1일, 5 시간 내지 1개월, 5 시간 내지 15일, 5 시간 내지 10일, 5 시간 내지 5일, 5 시간 내지 3일, 5 시간 내지 2일, 5 시간 내지 1일, 10 시간 내지 1개월, 10 시간 내지 15일, 10 시간 내지 10일, 10 시간 내지 5일, 10 시간 내지 3일, 또는 10 시간 내지 2일일 수 있다. 상기 추출은 상기 식물체를 용매 중에서 환류 추출하는 것일 수 있다. 상기 용매는 상기 식물체 중량에 대하여 1 배, 2 배, 5 배, 10 배 또는 15배 이상의 부피를 갖는 것일 수 있다. 상기 용매는 상기 식물체 중량에 대하여 1배 내지 15배, 2배 내지 15배, 5배 내지 15배, 10배 내지 15배 또는 약 15배의 부피를 갖는 것일 수 있다. 상기 식물체는 음지에 건조한 것일 수 있다.

상기 추출은 또한 얻어진 추출액으로부터 감압 농축과 같은 알려진 방법에 의하여 용매를 제거하는 것을 포함할 수 있다. 상기 추출은 또한 얻어진 추출물을 동결건조와 같은 건조에 의하여 건조 추출물을 제조하는 것을 포함할 수 있다.

구체적으로, 상기 추출은 이고들빼기와 같은 고들빼기 식물체의 전초 또는 지상부를 용매와 혼합하고 인큐베이션하여 용매 중에 추출하여 추출물을 얻는 단계; 용매 중 추출물을 여과하는 단계; 및 여과된 추출물을 감압 농축한 후 건조하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 추출 방법으로는 여과법, 열수 추출, 침지 추출, 환류냉각 추출, 가압추출, 아임계추출, 초임계추출 및 초음파추출 등 당업계의 통상적인 방법을 이용할 수 있다. 예를 들면, 열수 추출 방법일 수 있다. 열수 추출은 1회 내지 5회 추출하는 것일 수 있다. 상기 감압농축은 진공 감압농축기 또는 진공 회전증발기를 이용하는 것일 수 있다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조 또는 동결건조하는 것일 수 있다.

상기 허혈은 자연적 또는 인공적으로 발생된 것일 수 있다. 인공적으로 발생된 허혈은 혈관에서 혈류를 인공적으로 감소시키는 것을 포함한다. 상기 혈류를 인공적으로 감소시키는 것은 혈관을 막거나 차단하는 것을 포함한다. 상기 혈관을 막는 것은 혈관에 압력을 가하여 혈관의 단면적을 감소시키는 것을 포함한다. 상기 혈관의 단면적을 감소시키는 것은 혈관을 결착하는 것(clamping) 또는 절단하는 것을 포함한다. 또한 상기 혈류를 인공적으로 감소시키는 것은 수술 중에 수행되는 것일 수 있다. 상기 수술은 조직 이식(transplantion) 수술, 조직 절제술, 저혈류 수복 수술(aneurysm repair surgery), 또는 동맥내막절제술(endarterectomy)을 포함할 수 있다. 상기 조직 이식은 심장, 간, 신장, 폐, 췌장, 위, 소장, 또는 대장 이식을 포함하는 것일 수 있다. 상기 조직 절제술은 간, 신장, 폐, 위, 소장, 또는 대장 절제술을 포함한다.

자연적으로 발생된 허혈은 허혈을 야기시키는 질환(ischemic disorder)에 의하여 야기된 것일 수 있다. 허혈을 야기시키는 질환은 염증질환, 심근경색(myocardial infarction), 동맥경화(atherosclerosis), 말초혈관질환(peripheral vascular disorder), 폐색전증(pulmonary embolus), 정맥혈전증(venous thrombosis), 일시적 허혈 공격(transient ischemic attack), 협심증(unstable angina), 뇌혈관허혈(cerebral vascular ischemia), 뇌졸증(stroke), 허혈성 신경질환(ischemic neurological disorder), 허혈성 신장질환(ischemic kidney disease), 혈관염(vasculitis), 또는 외상(traumatic injury)을 포함하는 것일 수 있다. 상기 염증질환은 류마티스 관절염 또는 전신성 홍반 루푸스(system lupus erythematosus)를 포함하는 것일 수 있다.

상기 재관류는 자연적 또는 인공적으로 재관류시키는 것일 수 있다. 인공적으로 재관류시키는 것은 혈관에서 혈류를 인공적으로 증가시키는 것을 포함한다. 혈류를 인공적으로 증가시키는 것은 막히거나 폐쇄된 혈관을 개방하거나 절단된 혈관을 연결하는 것을 포함한다. 혈류를 인공적으로 증가시키는 것은 체외로부터 혈액을 공급하는 것은 포함한다. 상기 허혈 및 재관류 중 어느 하나 이상은 인공적으로 발생된 것일 수 있다.

상기 허혈 및 재관류는 급성일 수 있다. 용어 "급성"이란 허혈 또는 재관류되는 속도가 빨라서 조직 손상이 빠른 속도로 진행하는 것을 나타낸다. 급성 허혈 및/또는 재관류는 혈관 폐쇄와 개방을 포함하는 것 일수 있다. 상기 혈관은 동맥 예를 들면 대동맥 또는 신장동맥 또는 간 혈관 예를 들면, 간 문맥(portal vein)일 수 있다. 급성 허혈 및/또는 재관류는 혈관의 완전한 폐색과 개방을 포함하는 것일 수 있다.

상기 허혈-재관류 손상은 수술 과정에서 일시적으로 혈류를 막은 후 발생하는 것이거나 외과적 처치에 있어 혈관을 일시적 폐쇄하고 다시 개방하는 과정을 반복하여 발생된 허혈-재관류 손상일 수 있다.

상기 허혈 또는 재관류는 3분, 5분, 10분, 15분, 20분, 30분, 또는 60분 이상 지속된 것일 수 있다. 상기 허혈은 3분 내지 60분, 5분 내지 60분, 10분 내지 60분, 15분 내지 60분, 20분 내지 60분, 30분 내지 60분, 3분 내지 50분, 3분 내지 30분, 3분 내지 15분, 5분 내지 60분, 5분 내지 30분, 10분 내지 60분, 또는 10분 내지 30분, 15분 내지 60분, 또는 15분 내지 30분 동안 지속된 것일 수 있다.

상기 허혈-재관류 손상은 간, 신장, 심장, 폐, 소장, 대장 또는 췌장 손상인 것일 수 있다.

구체적으로, 상기 허혈-재관류 손상은 아래 허혈질환 중 어느 하나로 인한 손상으로 인한 질환일 수 있다: 신장암 절제술에서와 같이 임의의 동맥 부분을 일시적으로 폐쇄하는 외과수술 절차; 신장, 심장, 간, 폐, 소장, 췌장 등 이식이 필요한 장기에 대한 체외 배양, 보존 및 재이식 절차; 수술과정 또는 지혈 과정 중 혈관의 클램핑에 의하여 발생하는 혈류 감소나 중단 및 추후 조직에 대한 산소 및/또는 영양분의 유입 회복; 또는 세포사멸이나 자식작용에 의해 죽음을 야기할 수도 있는 저산소증, 허혈 혹은 외상으로 심각한 해부학적 및 기능적 병변이 일어나는 시점에 이르는 기타의 조직손상.

상기 조성물은 허혈-재관류 손상 발생 전, 발생과 동시 또는 발생 후에 투여하기 위한 것일 수 있다. 상기 투여는 수술 전, 중 또는 후에 투여하기 위한 것일 수 있다. 상기 조성물은 수술 전 혈관을 폐쇄하기 전, 폐쇄와 동시 또는 후에 투여하기 위한 것일 수 있다. 상기 혈관은 대동맥을 포함한 동맥인 것일 수 있다. 상기 수술은 혈관 폐쇄와 재관류를 교대로 수행하는 것을 포함하고, 상기 투여는 상기 혈관 폐쇄 전, 혈관 폐쇄와 재관류 사이, 또는 재관류 중에 투여하기 위한 것일 수 있다. 상기 조성물은 장기이식에 의한 허혈-재관류 손상으로서 간, 신장, 심장, 폐, 소장 또는 췌장 중 어느 하나 이상을 이식하는 과정에서 또는 이식한 후 발생된 급성 허혈-재관류 손상일 수 있다.

상기 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 중량% 내지 80 중량%, 예를 들면, 0.01 중량% 내지 60 중량%, 0.01 중량% 내지 40 중량%, 0.01 중량% 내지 30 중량%, 0.01 중량% 내지 20 중량%, 0.01 중량% 내지 10 중량%, 0.01 중량% 내지 5 중량%, 0.05 중량% 내지 60 중량%, 0.05 중량% 내지 40 중량%, 0.05 중량% 내지 30 중량%, 0.05 중량% 내지 20 중량%, 0.05 중량% 내지 10 중량%, 0.05 중량% 내지 5 중량%, 0.1 중량% 내지 60 중량%, 0.1 중량% 내지 40 중량%, 0.1 중량% 내지 30 중량%, 0.1 중량% 내지 20 중량%, 0.1 중량% 내지 10 중량%, 또는 0.1 중량% 내지 5 중량%의 상기 추출물을 포함할 수 있다.

상기 조성물은 약제학적으로, 또는 식품학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 포함할 수 있다. 상기 담체는 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 부형제는 미결정 셀룰로오스, 유당, 저치환도 히드록시셀룰로오스, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 붕해제는 전분글리콜산 나트륨, 무수인산일수소 칼슘, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 결합제는 폴리비닐피롤리돈, 저치환도 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 활택제는 스테아린산 마그네슘, 이산화규소, 탈크, 또는 그 조합일 수 있다.

상기 조성물은 경구 또는 비경구 투여 제형으로 제형화될 수 있다. 비경구 투여 제형은 주사제일 수 있다.

상기 조성물은 약학, 또는 식품 조성물일 수 있다.

다른 양상은 고들빼기 속 (Crepidiastrum sp.) 식물체의 추출물을 유효성분으로 포함하는 개체에서 허혈-재관류 손상을 예방 또는 치료하기 위한 식품용 조성물을 제공한다. 상기 식품은 기능성 식품일 수 있다.

식품용 조성물은 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카리드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카리드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카리드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 상기 조성물 100 중량부당 0.01~0.04 중량부, 구체적으로는 약 0.02 ~ 0.03 중량부 범위에서 선택할 수 있다.

상기 외에 상기 식품용 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 기능성 식품은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

다른 양상은 상기한 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 단계를 포함하는 개체의 허혈-재관류 손상을 예방 또는 치료하기 위한 방법을 제공한다.

상기 투여는 당업계에 알려진 방법에 의하여 투여될 수 있다. 투여는 예를 들면, 정맥내, 근육내, 경구, 또는 피하 투여와 같은 경로로, 임의의 수단에 의하여 개체로 직접적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 전신적으로 또는 국부적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 허혈-재관류가 존재하거나 발생이 예상되는 부위에 국소적으로 투여하는 것일 수 있다.

상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 사람, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 또는 고양이일 수 있다.

상기 투여는 개체의 허혈-재관류 손상을 예방 또는 치료하기에 충분한 "치료학적 유효량"을 투여하는 것일 수 있다. 상기 투여는 상기 추출물을 개체당 일당 0.1 mg 내지 1,000 mg, 예를 들면, 0.1 mg 내지 500 mg, 0.1 mg 내지 100 mg, 0.1 mg 내지 50 mg, 0.1 mg 내지 25 mg, 1 mg 내지 1,000 mg, 1 mg 내지 500 mg, 1 mg 내지 100 mg, 1 mg 내지 50 mg, 1 mg 내지 25 mg, 5mg 내지 1,000 mg, 5 mg 내지 500 mg, 5 mg 내지 100 mg, 5 mg 내지 50 mg, 5 mg 내지 25 mg, 10mg 내지 1,000 mg, 10 mg 내지 500 mg, 10 mg 내지 100 mg, 10 mg 내지 50 mg, 또는 10 mg 내지 25 mg을 투여하는 것일 수 있다.

상기 투여는 허혈-재관류 손상 발생 전, 발생과 동시 또는 발생 후에 수행되는 것일 수 있다.

일 양상에 따른 개체에서 허혈-재관류 손상을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물에 의하면 개체에서 허혈-재관류 손상을 예방 또는 치료하데 사용될 수 있다.

다른 양상에 따른 개체에서 허혈-재관류 손상을 예방 또는 치료하기 위한 식품용 조성물에 의하면, 개체에서 허혈-재관류 손상을 예방 또는 치료하는데 식품으로 사용될 수 있다.

다른 양상에 따른 개체의 허혈-재관류 손상을 예방 또는 치료하기 위한 방법에 의하면, 개체의 허혈-재관류 손상을 효율적으로 예방 또는 치료할 수 있다.

도 1은 마우스 모델 준비와 약물의 투여 및 조직 적출 일정을 나타낸 것이다.
도 2는 간 IRI 마우스 모델에 이고들빼기 추출물 함유 조성물을 투여한 경우 혈청 중 ALT, AST 및 LDH 수준을 나타낸다.
도 3은 간 IRI 마우스 모델에 이고들빼기 추출물 함유 조성물을 투여한 경우 간 조직을 헤마톡실린-에오신(H&E) 염색한 결과를 나타낸다.
도 4는 간 IRI 마우스 모델에 이고들빼기 추출물 함유 조성물을 투여한 경우 간 조직 내 MDA, MPO, 및 글루타티온 수준을 측정한 결과를 나타낸다.
도 5 내지 8은 이고들빼기 추출물의 허혈-재관류 간손상(IRI)에 대한 효과에 작용하는 주요 인자들의 웨스턴블롯 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 IRI 마우스 모델에 이고들빼기 추출물 함유 조성물을 투여한 경우 혈액 중 BUN 및 혈청 중 크레아티닌 수준을 나타낸다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 간 IRI 모델 마우스에서 이고들빼기 추출물 함유 조성물의 효능 확인

1. 이고들빼기 추출물의 제조

이고들빼기 (C.denticulatum) 추출물 제조를 위하여 강원도 평창에서 재배한 이고들빼기 지상부를 구매하여 사용하였다. 구매한 이고들빼기를 음지에서 건조 후 세절된 이고들빼기 지상부 600g에 70% 에탄올 3리터를 가하고 3시간 동안 환류추출한 후 추출액을 감압 건조하여 이고들빼기 에탄올 추출물 80g을 수득하였다.

2. 간 IRI 유발 마우스 모델 준비

10주령 수컷 C57BL/6마우스(체중: 22~25g)는 대한바이오링크(DaeHanBioLink Co., Ltd, Eumseong, 한국)에서 구입하였다. 모든 실험들은 NIH에서 발행된 실험동물의 주의 및 이용(공개번호 85-23, 개정1985)의 가이드라인을 준수하였으며, KIST(강릉, 한국)의 윤리위원회로부터 승인을 받았다. 마우스는 표준 실험실 조건인 온도 22℃ ±2℃, 및 상대적 습도 55%에서 사육하였고, 동물들에게 기본적인 마우스 사료와 수돗물을 자의섭식으로 제공하였다.

허혈은 40분 동안 미세혈관 겸자를 가지고 간문맥을 폐쇄하여 시행하였다. 재관류는 간문맥 폐쇄 클램프를 제거함으로써 시행되었다. 폐색(occlusion)과 재관류(reperfusion)는 간의 색에서 변화로 확인되었으며 약간 연한 색조(paler shade)나 약간 붉은색(blush)으로 변화됨을 관찰하였다. 허혈-재관류가 진행되는 동안 동물들은 따뜻한 식염수로 수분이 잘 공급되게 하였다. 따뜻한 패드를 사용하여 일정한 체온 37℃를 유지하도록 하였다. 가짜수술군(sham operation)도 간문맥 클램프를 제외하고 유사한 형태로 수행되었다. 혈액과 간 조직은 재관류 후 6시간 뒤에 채취되었다. 간은 적출하여 질소 용액에 동결시키고 추가 분석 때까지 -80℃에서 저장하였다. 혈액 시료는 아래쪽 대정맥에서 채취하였다.

3. 간 IRI 유발 마우스 모델에서의 이고들빼기 추출물 투여군, 가짜수술군 및 대조군과의 ALT, AST 및 LDH 수준 변화 비교

이고들빼기 추출물은 증류수에 75mg/kg이 되도록 용해 또는 현탁시켰다. 30마리의 마우스들을 10마리씩 세 개의 그룹으로 무작위로 분리하였다. 가짜수술군(sham group)과 IRI 그룹 대조군(IRI)에 대해서는 이고들빼기가 용해되지 않은 용매만 1일 1회 0.1ml/20g 체중 (BW)의 용량을 경구 투여하였다. 실험군 즉 이고들빼기 처리군(CD+IRI)은 상기 이고들빼기 추출물 용액을 IRI 4일 전부터 위내로(intragastrically) 1일 1회 투여 75mg /kg, 체중(BW)의 용량으로 경구 투여하였다.

혈액 시료는 하대정맥에서 채취하였으며 4℃에서 30분 동안 6000×g로 원심분리하여 혈장 또는 혈청을 분리하였다. 도 1은 마우스 모델 준비와 약물의 투여 및 조직 적출 일정을 나타낸 것이다. 도 1 내지 6에서, sham 및 IRI는 각각 "가짜 수술" 및 허혈-재관류 손상(ischemia-reperfusion injury)을 나타내고, CD는 이고들빼기 에탄올을 추출물을 나타낸다.

또한, 허혈-재관류 간 손상에 대한 이고들빼기 추출물의 효과를 확인하기 위하여 간기능 지표인 혈청 알라닌 트란스아미나제(alanine transaminase:ALT), 아스파르테이트 트란스아미나제(aspartate transaminase:AST), 및 락테이트 데히드로게나제(lactate dehydrogenase:LDH) 수준을 측정하였다. 각 항목의 수치는 코바스 C702분석기(로슈, 독일)로 측정하였고 데이터는 평균±표준편차(SEM)로 표시된다(*P<0.05 이고들빼기 추출물(CD+IRI) vs. 용매처리된 그룹(IRI), 가짜수술군(sham)). 그 결과, 도 2에서 나타내었다. 도 2는 간 IRI 마우스 모델에 이고들빼기 추출물 함유 조성물을 투여한 경우 혈청 중 ALT, AST 및 LDH 수준을 나타낸다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 가짜수술군(Sham)군에 비해 대조군(IRI)에서 혈청 ALT, AST 및 LDH 수치가 현저하게 증가하는 반면, 약물 처리군(CD+IRI)의 혈청 ALT, AST 및 LDH 수치는 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다. 이는 이고들빼기 추출물이 허혈-재관류 간 손상을 예방 또는 치료하는 효능이 있다는 것을 나타낸다.

4. 허혈- 재관류 간 손상 마우스 모델에서 이고들빼기 추출물의 투여에 의한 간조직 변화 측정

허혈-재관류 간 손상에 대한 이고들빼기 추출물 효능을 검증하기 위하여, 면역조직화학염색법(Immunohistochemistry)을 수행하였다. 상기 2절에서 수득한 간 조직을 10% 포르말린(formalin)으로 고정하고 동결한 후, 70 내지 80% 에탄올 수용액으로 탈수하고, 파라핀(paraffin)으로 침투한 후, 5 ㎛ 두께로 섹션화하였다. 이 후, 헤마톡실린-에오신(H&E) 염색을 하여 현미경으로 관찰하고 촬영하였다.

도 3은 간 IRI 마우스 모델에 이고들빼기 추출물 함유 조성물을 투여한 경우 간 조직을 헤마톡실린-에오신(H&E) 염색한 결과를 나타낸다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 위수술군(Sham)의 경우 간소엽(hepatic lobule)과 간세포의 형태가 정상적으로 확인된 반면, 대조군(IRI)에서는 간조직의 염좌(distortion)와 광범위한 괴사(necrosis) 현상이 관찰되었다. 이고들빼기 추출물 투여군(IRI+CD)의 경우는 약간의 괴사와 중심정맥 주변으로 구조적 장애가 관찰되었으나 대조군(IRI)에 비하여 간 손상이 현저하게 완화됨을 확인하였다.

급성 간 괴사의 경우, 간 조직의 손상 정도는 하기한 바와 같이 0~4의 수준으로 점수화하여 등급으로 분리하였다. 하나의 전체적인 깊은 관상단편은 현미경으로 관찰하였고, 신장조직의 비율에 기초하여 세뇨관 괴사의 한도에 따라 점소로 등급화하였다. 높은 점수가 더 심각한 손상을 보여주는 것이다. (4점=최대값; 0=정상 신장; 1=최소 세포괴사, <30% 관련도; 2=약한 세포괴사, ~60%관련도; 3=중증 세포괴사, >60%관련도; 및 4=심각한 세포괴사).

5. 허혈- 재관류 간 손상 마우스 모델에서 이고들빼기 추출물에 의한 간 항산화 활성 변화 확인

이고들빼기 추출물의 허혈-재관류 간 손상 예방 및 치료 효과에 있어서 이고들빼기 추출물의 항산화 작용의 영향성을 알아보기 위하여 간 조직내의 말론디알데히드(malondialdehyde:MDA) 농도, 미엘로퍼옥시다제(myeloperoxidase:MPO) 활성 및 글루타티온(Glutathione)의 함량을 측정하였다. 상기 측정에서, 지질 분해산물인 MDA의 농도는 지질의 과산화 정도를 나타내는 지표로써 티온바르비투린산 반응성 물질(thionbarbituric acid reactive substance:TBARS) 방법을 사용하여 측정하였다. 간 조직은 4℃에서 차가운 용해 버퍼(lysis buffer)(50mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% sodium deoxycholic acid(DOC), 0.1% SDS, 1mM PMSF, protease inhibitor, 및 phosphatase inhibitor)를 첨가 후 조직 균질액을 만든 후 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 분리하였다. 상기 상등액 200 ㎕와 TBA 시약 600 ㎕를 혼합하여 95℃로 1시간 동안 가열하였다. 얼음 위에서 10분간 식힌 후 혼합액을 0.22 ㎛ 필터를 사용하여 혼합액만 취하였다. 수득한 상등액에 대하여 분광 광도기를 이용하여 532 nm에서 흡광도를 측정하였다.

또한 글루타티온 함량 측정을 위하여 간 조직 g수의 5배에 해당하는 5% 5-술포살리실산(5-sulfosalicylic acid)을 간 조직에 가하고 조직 균질액을 만든 후, 4℃에서 5분간 원심분리한 후 상등액을 취하였다. 0.248mg/ml NADPH 700㎕와 6 mM DTNB 100㎕ 및 정제수 180㎕를 혼합하여 미리 30℃로 온도를 조정해 놓고 상기 상등액 20㎕와 266 unit/ml GSSG 레덕타제 10 ㎕를 가하여 반응을 시작하였다. ELISA reader를 이용하여 10초 간격으로 3분간 흡광도 변화를 관찰하여 기울기를 구하고 100 mM 글루타티온 표준용액과 기울기를 비교하여 함량을 계산하였다.

또한 MPO 활성은 간 조직 100mg에 용해 버퍼 200㎕를 넣고 균질화한 후 4℃에서 13,000 rpm으로 15분간 원심분리하여 상층액을 수득한 다음 마우스 MPO assay ELISA kit(Hbt HK210, USA)를 사용하여 측정하였다. 구체적으로 상층액 100㎕를 96 -웰 플레이트에 넣은 다음 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후 플레이트를 비우고 상기 키트를 세척 완충용액으로 세척한 후 스트렙타비딘-페옥시다제 접합체(streptavidin-peroxidase conjugate) 100㎕를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후 플레이트를 비우고 세척 완충용액으로 세척한 다음 100㎕ TMB 기질 용액을 첨가하고 플레이트를 알루미늄 호일로 감싸고 실온에서 30분간 반응시켰다. 이후 상기 키트의 정지 용액 100㎕를 첨가하여 반응을 중시하고 ELISA reader를 이용하여 UV 450nm에서 흡광도를 측정하였다.

도 4는 간 IRI 마우스 모델에 이고들빼기 추출물 함유 조성물을 투여한 경우 간 조직 내 MDA, MPO, 및 글루타티온 수준을 측정한 결과를 나타낸다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 간 허혈-재관류 대조군(IRI)에서는 허혈-재관류 조직 손상에 의하여 MDA 농도와 MPO 활성이 증가하였고 글루타티온 함량이 위수술군(Sham)에 비하여 현저히 감소되었다. 그러나 이고들빼기 추출물 투여군(CD+IRI)에서는 MDA 농도와 MPO 활성 및 글루타티온 함량이 위수술군(Shame) 수준으로 변화되어 이고들빼기 추출물의 항산화 작용이 허혈-재관류 간손상의 예방 또는 치료 효능과 연관성이 큰 것으로 확인되었다.

6. 허혈- 재관류 간 손상 마우스 모델에서 이고들빼기 추출물에 의한 단백질 발현율 분석

허혈-재관류 간 손상에 있어서 이고들빼기 추출물에 의한 보호 효과에 대한 작용기전을 살펴보기 위하여 웨스턴 블롯팅에 의한 산화, 염증 또는 세포사멸과 관련된 단백질 발현을 조사하였다.

간 조직은 아이스 버퍼 1M Tris-HCl 버퍼, pH 7.5, 프로테아제 저해제, 25mM 소디움 플로리드(Sodium fluoride), 10mM 소디움 오르소바나데이트 (Sodium orthovanadate), 0.5 mol/L EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) 및 계면활성제 (1% Triton X-100; GenDEPOT, Barker, TX, USA)에서 으깨진 후 14,000rpm에서 20분 동안 원심분리되었다. 단백질 농도는 브래포드 단백질 어세이 (Bradford protein assay, Bio-Rad, Hercules, USA)를 사용하여 측정하였다. 단백질 추출물의 20㎍은 10%, 15% 소디움 도데실설페이트 폴리아크릴아미드겔 (SDS-PAGE; Bio-Rad, USA)에서 분리하여 니트로세룰로오스 멤브레인 (nitrocellulose membrane, Bio-Rad, Herculesm, USA)으로 옮겨졌다. 멤브레인들은 Tris-버퍼된 염수 및 Tween 20(TBST) 버퍼(10mM Tris-base, 100mM NaCl, 0.1% Tween-20, pH 8.0)에서 5% 스킴 밀크로 120분간 차단한 후, TBS/T로 세 번 세척하였다.

이 후 HSP70, Bcl-2-연관된 X 단백질(Bcl-2-associated X protein:Bax), 카스파제3, 고이동성 그룹 박스-1(high mobility group box-1:HMGB1), 인산화된 IκBα(Phosphorylated-IκBα:p-IκBα), 핵인자-카파 B p65(Nuclear factor-kappa B p65:NF-κBp65), toll-유사 수용체2(Toll like receptor 2:TLR2), toll-유사 수용체4(Toll like receptor 4:TLR4) 및 유도성 니트릭 옥시드 신타제 (Inducible nitric oxide synthase:iNOS)에 해당하는 1차 항체를 4℃에서 밤새 반응시켰다. 상기 막에 붙은 일차 항체에 HRP(Horseradish peroxidase)가 접합된 이차 항체 (HRP-conjugated secondary antibody)를 붙이고, 이를 EZ-Capture ST 이미징 시스템(Atto, Japan)을 사용하여 확인하였으며 (도 5), 블롯 이미지는 정량분석을 위하여 수거하였다. 그 결과를 도 5 내지 8에 나타내었다.

도 5는 이고들빼기 추출물의 허혈-재관류 간손상(IRI)에 대한 효과에 작용하는 생체 인자들의 웨스턴블롯 결과를 나타낸 것이다.

도 6은 이고들빼기 추출물의 허혈-재관류 간손상(IRI)에 대한 효과에 작용하는 주요 인자들의 웨스턴블롯 결과를 그래프로 나타낸 것이다. (A) Heat shock protein 70(HSP70), (B) inducible nitric oxide synthase(iNOS), (C) toll-like receptor 4(TLR4), (D) toll-like receptor 2(TLR2).

도 7은 이고들빼기 추출물의 허혈-재관류 간손상(IRI)에 대한 효과에 작용하는 주요 인자들의 웨스턴블롯 결과를 그래프로 나타낸 것이다. (A) Nuclear factor-kappa B p65(NF-κBp65), (B) phosphorylated-IκBα(p-IκBα) (C) high mobility group box-1(HMGB1).

도 8은 이고들빼기 추출물의 허혈-재관류 간손상(IRI)에 대한 효과에 작용하는 주요 인자들의 웨스턴블롯 결과를 그래프로 나타낸 것이다. (A) Caspase3 (B) Bax(Bcl-2-associated X protein).

도 5 내지 8에 나타낸 바와 같이, 간 허혈-재관류 대조군(IRI)에서는 iNOS, TLR4, TLR2, NF-κBp65, HSP70 등의 염증과 관련된 단백질의 발현이 증가되었고, 이고들빼기 추출물은 수술 및 허혈-재관류로 인한 이들 염증반응 인자들의 발현을 억제하는 것으로 확인되었다. 반면, 이고들빼기의 허혈-재관류 간손상 보호 효과는 HMGB1(high mobility group box-1) 및 p-IκBα(Phosphorylated-IκBα)의 염증인자나(도 5, 및 도 7) caspase3 및 Bax와 같은 세포사멸 인자와 연관성이 없는 것으로 나타났다 (도 5, 및 도 8).

실시예 2: 신장 IRI 모델 마우스에서 이고들빼기 추출물 함유 조성물의 효능 확인

1. 신장 IRI 유발 마우스 모델 준비

신장 IRI 유발을 위한 마우스 구입 및 사육은 상기 실시예 1의 2절에서와 동일한 조건으로 수행하였다. 허혈은 30분 동안 미세혈관 겸자를 가지고 양쪽 신장 혈관 뿌리(renal pedicle)에 클램핑을 가하여 시행하였다. 재관류는 혈관 클램프가 제거된 후 시작되었다. 폐색(occlusion)과 재관류(reperfusion)는 신장의 색에서 변화로 확인되었으며 어두운 자색조 (dark purple)나 약간 붉은색(blush)으로 변화됨을 관찰하였다. 허혈-재관류가 진행되는 동안 동물들은 따뜻한 식염수로 수분이 잘 공급되게 하였다. 따뜻한 패드를 사용하여 일정한 체온인 37℃를 유지하도록 하였다. 가짜수술군(sham operation)도 신장 클램프를 제외하고 유사한 형태로 수행되었다. 혈액과 신장조직은 재관류 후 48시간 뒤에 수거되었다. 양쪽 신장은 분리하여 질소 용액에 동결시키고 추가 분석 때까지 -80℃에서 저장하였다. 혈액 시료는 아래쪽 대정맥에서 채취하였다.

2. 신장 IRI 유발 마우스 모델에서의 이고들빼기 추출물 투여군, 가짜수술군 및 대조군과의 효능 비교

이고들빼기 추출물은 3차 증류수에 75mg/kg이 되도록 용해시켰다. 30마리의 마우스들을 10마리씩 세 개의 그룹으로 무작위로 분리하였다. 가짜수술군(shame)과 IRI 그룹 대조군(IRI)에 대해서는 이고들빼기가 용해되지 않은 용매만 1일 1회 0.1ml/20g, 체중(BW)을 경구 투여하였다. 실험군 즉, 이고들빼기 처리군(CD+IRI)은 상기 이고들빼기 추출물 용액을 IRI 4일전부터 시술 후 2일까지 위내로(intragastrically) 1일 1회 투여 75mg /kg, 체중(BW)의 용량으로 경구 투여하였다.

혈액 시료는 하대정맥에서 채취하였으며 혈액요소질소(Blood urea nitrogen, BUN)와 혈청 크레아티닌(serum creatinine) 수치는 코바스 C702 분석기(로슈, 독일)로 측정하였다. 각 실험결과는 평균±표준편차(SEM)로 표시하였다. (*P<0.05 이고들빼기 추출물 (CD+IRI) vs 용매처리 그룹 (IRI), 가짜수술군 (sham)).

그 결과, 도 9에 나타내었다. 도 9는 IRI 마우스 모델에 이고들빼기 추출물 함유 조성물을 투여한 경우 혈액 중 BUN 및 혈청 중 크레아티닌 수준을 나타낸다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 용매처리된 마우스(IRI그룹)에서 IRI는 신장 기능장애를 야기하였다. IRI 2일 후에는 BUN 및 혈청 크레아티닌 수치가 현저히 올라갔다. 반면, 약물투여군(CD+IRI)에서는 BUN과 크레아티닌 수치가 유의적으로 감소함을 확인하였다. 이는 이고들빼기 추출물 함유 조성물이 허혈-재관류 신장 손상을 예방 또는 개선시키는 효능이 있다는 것을 나타낸다.

Claims

이고들빼기 (Crepidiastrum denticulatum) 식물체의 추출물을 유효성분으로 포함하는 개체에서 허혈-재관류 손상을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 추출물은 물, C1 내지 C6의 알코올 또는 이들의 혼합물을 추출 용매로 하여 추출된 것인 조성물.
청구항 2에 있어서, 상기 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 또는 이들의 혼합물인 것인 조성물.
청구항 1에 있어서, 허혈은 인공적으로 발생된 것인 조성물.
청구항 4에 있어서, 인공적으로 발생된 허혈은 혈관에서 혈류를 인공적으로 감소시키는 것을 포함하는 것인 조성물.
청구항 5에 있어서, 상기 혈류를 인공적으로 감소시키는 것은 혈관을 막거나 차단하는 것을 포함하는 것인 조성물.
청구항 5에 있어서, 상기 혈류를 인공적으로 감소시키는 것은 수술 중에 수행되는 것인 조성물.
청구항 7에 있어서, 상기 수술은 조직 이식(transplantion) 수술, 조직 절제술, 저혈류 수복 수술(aneurysm repair surgery), 또는 동맥내막절제술(endarterectomy)을 포함하는 것인 조성물.
청구항 8에 있어서, 상기 조직 이식은 심장, 간, 신장, 폐, 췌장, 위, 소장, 또는 대장 이식을 포함하는 것인 조성물.
청구항 8에 있어서, 상기 조직 절제술은 간, 신장, 폐, 위, 소장, 또는 대장 절제술을 포함하는 것인 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 허혈은 허혈을 야기시키는 질환(ischemic disorder)에 의하여 야기된 것인 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 재관류는 인공적으로 재관류시키는 것인 조성물.
청구항 12에 있어서, 인공적으로 재관류시키는 것은 혈관에서 혈류를 인공적으로 증가시키는 것을 포함하는 것인 조성물.
청구항 13에 있어서, 혈류를 인공적으로 증가시키는 것은 막히거나 폐쇄된 혈관을 개방하거나 절단된 혈관을 연결하는 것을 포함하는 것인 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 허혈 및 재관류 중 어느 하나 이상은 인공적으로 발생된 것인 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 허혈은 10분 내지 60분 동안 지속된 것인 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 허혈-재관류 손상은 간, 신장, 심장, 폐, 소장, 대장 또는 췌장 손상인 것인 조성물.
청구항 1에 있어서, 허혈-재관류 손상 발생 전, 발생과 동시 또는 발생 후에 투여하기 위한 것인 조성물.
청구항 7에 있어서, 수술 전, 수술과 동시 또는 후에 투여하기 위한 것인 조성물.
이고들빼기 (Crepidiastrum denticulatum) 식물체의 추출물을 유효성분으로 포함하는 개체에서 허혈-재관류 손상을 예방 또는 개선하기 위한 식품용 조성물.
청구항 1 내지 19 중 어느 한 항의 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체의 허혈-재관류 손상을 예방 또는 치료하기 위한 방법으로서, 상기 개체는 사람이 아닌 포유동물인 것인 방법.