KR101760464B1 - 교모세포종의 진단 또는 예후 예측용 바이오 마커 및 그 용도 - Google Patents

교모세포종의 진단 또는 예후 예측용 바이오 마커 및 그 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR101760464B1
KR101760464B1 KR1020100100050A KR20100100050A KR101760464B1 KR 101760464 B1 KR101760464 B1 KR 101760464B1 KR 1020100100050 A KR1020100100050 A KR 1020100100050A KR 20100100050 A KR20100100050 A KR 20100100050A KR 101760464 B1 KR101760464 B1 KR 101760464B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
glioblastoma
prognosis
diagnosis
protein
biomarker
Prior art date
Application number
KR1020100100050A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20120038339A (ko
Inventor
남도현
김종현
박관
신형진
홍승철
이정일
공두식
설호준
서연림
Original Assignee
사회복지법인 삼성생명공익재단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 사회복지법인 삼성생명공익재단 filed Critical 사회복지법인 삼성생명공익재단
Priority to KR1020100100050A priority Critical patent/KR101760464B1/ko
Priority to PCT/KR2011/007592 priority patent/WO2012050365A2/ko
Publication of KR20120038339A publication Critical patent/KR20120038339A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101760464B1 publication Critical patent/KR101760464B1/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 교모세포종의 진단 또는 예후 예측을 위한 바이오 마커 및 그 용도에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 survivin, cyclinE, DCC, TGF-β, CDC25B, Histone H1, p-EGFR, p-VEGFR2/3 및 p16 로 구성된 군에서 선택되는 단백질을 교모세포종의 진단 또는 예후 예측을 위한 바이오 마커로 활용하여, 교모세포종의 진단 또는 예후 예측에 필요한 정보를 제공하기 위해 상기 단백질의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 단백질의 분석방법에 관한 것이다.
본 발명의 분석을 통해 발굴된 단백질들은 교모세포종 환자의 예후 예측에 적용가능 함으로 이를 이용한 교모세포종 예후 진단용 키트를 제공할 수 있고, 발굴된 단백질들을 대상으로 한 새로운 개념의 표적 치료법 및 항암제 개발에 응용될 수 있어 유용하다. 또한, 이에 따라 관련 산업 분야에 큰 파급효과를 가져올 수 있어 유용하다.

Description

교모세포종의 진단 또는 예후 예측용 바이오 마커 및 그 용도 {Biomarker for Diagnosis or Confirming of Progress Stage of Glioblastoma and the Use Thereof}
본 발명은 교모세포종의 진단 또는 예후 예측을 위한 바이오 마커 및 그 용도에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 survivin, cyclinE, DCC, TGF-β, CDC25B, Histone H1, p-EGFR, p-VEGFR2/3 및 p16 로 구성된 군에서 선택되는 단백질을 교모세포종의 진단 또는 예후 예측을 위한 바이오 마커로 활용하여, 교모세포종의 진단 또는 예후 예측에 필요한 정보를 제공하기 위해 상기 단백질의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 단백질의 분석방법에 관한 것이다.
신경교종 (glioma)은 원발성 뇌종양 (primary brain tumor)의 60%를 차지하는 종양으로 현재까지도 방사선 치료 외엔 특별한 치료법이 없는 악성 종양이다. 특히 가장 악성으로 분류되는 교모세포종 (glioblastoma)은 다른 암과 비교하여 방사선 및 항암제 치료에 대한 저항성이 매우 높아 일단 진단되면 기대 생존기간이 1년에 불과하다. 또한 뇌혈관 장벽이 있어 약물의 전달이 쉽지 않고, 상대적으로 뇌신경 생물학에 대한 이해의 부족 때문에 치료제 개발에서 소외된 분야이기도 하다.
최근 시스템 생물학 (systems biology) 및 생물정보학 기법 (bioinformatics tools)의 비약적 발전에 따라 교모세포종의 발생과 병증의 진행과 관련된 것으로 여겨지는 의미 있는 유전적 결함 및 유전자 발현 패턴들이 보고되고 있으나, 임상성과를 대표할 수 있는 분자 마커 (molecular marker)들의 발굴 성과는 전무한 실정이며, 유전자 발현 분석이 전사체 (trascriptom) 수준에 머물러 있어 실제 암 조직에서의 단백질 발현 정도를 대변하지 못하는 한계가 있다.
이에 본 발명자들은 교모세포종 예후를 예측할 수 있는 바이오마커를 제공하기 위하여 조직 마이크로어레이 (TMA, tissue microarray) 기법을 도입하여 교모세포종과 관련된 중요 단백질들의 발현 패턴을 분석하였고, 새로운 개념의 영상 분석 기법 및 최적화된 histochemical score (H-score)를 통해 분석함으로써 이들 중요 단백질(survivin, cyclinE, DCC, TGF-β CDC25B, Histone H1, p-EGFR, p-VEGFR2/3, p16)들을 교모세포종의 진단 또는 교모세포종의 진행정도를 확인하는 데 적용할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 survivin, cyclinE, DCC, TGF-β, CDC25B, Histone H1, p-EGFR, p-VEGFR2/3 및 p16 로 구성된 군에서 선택되는 교모세포종의 진단 또는 예후 예측용 바이오 마커를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은, survivin, cyclinE, DCC, TGF-β, CDC25B, Histone H1, p-EGFR, p-VEGFR2/3 및 p16 로 구성된 군에서 선택되는 단백질을 코딩하는 유전자의 발현량을 측정할 수 있는 물질을 포함하는, 교모세포종의 진단 또는 예후 예측용 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은, 교모세포종의 진단 또는 예후 예측에 필요한 정보 제공을 위해, survivin, cyclinE, DCC, TGF-β, CDC25B, Histone H1, p-EGFR, p-VEGFR2/3 및 p16 로 구성된 군에서 선택되는 단백질의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 단백질의 분석방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 survivin, cyclinE, DCC, TGF-β, CDC25B, Histone H1, p-EGFR, p-VEGFR2/3 및 p16 로 구성된 군에서 선택되는 교모세포종의 진단 또는 예후 예측용 바이오 마커를 제공한다.
본 발명은 또한, survivin, cyclinE, DCC, TGF-β, CDC25B, Histone H1, p-EGFR, p-VEGFR2/3 및 p16 로 구성된 군에서 선택되는 단백질을 코딩하는 유전자의 발현량을 측정할 수 있는 물질을 포함하는, 교모세포종의 진단 또는 예후 예측용 키트를 제공한다.
본 발명은 또한, 교모세포종의 진단 또는 예후 예측에 필요한 정보 제공을 위해, survivin, cyclinE, DCC, TGF-β, CDC25B, Histone H1, p-EGFR, p-VEGFR2/3 및 p16 로 구성된 군에서 선택되는 단백질의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 단백질의 분석방법을 제공한다.
본 발명의 분석을 통해 발굴된 단백질들은 교모세포종 환자의 예후 예측에 적용가능 함으로 이를 이용한 교모세포종 예후 진단용 키트를 제공할 수 있고, 발굴된 단백질들을 대상으로 한 새로운 개념의 표적 치료법 및 항암제 개발에 응용될 수 있어 유용하다. 또한, 이에 따라 관련 산업 분야에 큰 파급효과를 가져올 수 있어 유용하다.
도 1은 조직 마이크로어레이(TMA) image를 manual scoring 방법과 최적화된 H-scoring 방법을 통해 분석하여 분석 방법에 따른 차이가 나타나지 않음을 나타낸 것이다(A: survivin, B: APC).
도 2는 교모세포종 환자 56례의 임상 예후를 108 가지의 단백질 발현 수준을 이용해 분류한 결과이다(A: 정규화 전후의 단백질 발현 수준을 boxplot으로 나타낸 결과, B: Hierarchical clustering 결과를 heatmap과 dendogram으로 나타낸 결과, C: Univariate survival analysis을 통해 분석한 생존률 (overall survival)을 Kaplan-Meier method를 이용해 나타낸 결과).
도 3은 발굴된 예후 예측용 마커 단백질의 발현을 또 다른 교모세포종 환자의 조직을 이용한 TMA (82례) 및 public DNA microarray data (55례) 와의 비교분석을 통해 검증한 결과를 나타낸 것이다(A: 10 종의 바이오마커들을 대상으로 한 hierarchical clustering 결과, B: 분리된 2 환자군의 Kaplan-Meier survival curves, C: 9종의 대상 유전자와 환자간의 euclidean distance를 나타낸 결과, D: 각 그룹별 Kaplan-Meier survival curves를 overall survival과 비교한 결과).
도 4는 분리된 2 환자군에서의 발굴된 예후 예측용 마커 단백질의 발현을 나타낸 것이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 교모세포종의 예후를 예측할 수 있는 교모세포종과 관련된 중요 단백질들을 발굴하기 위하여, 교모세포종 환자를 대상으로 조직 마이크로어레이(TMA, tissue microarray) 기법으로 교모세포종 연관 단백질들의 발현을 분석하고, 새로운 개념의 영상 분석 기법 및 최적화된 histochemical score(H-score)를 이용하여 분석을 실시하였다. 그 결과, 교모세포종 환자군을 교모세포종 예후가 좋은 환자군과 좋지 않은 환자군으로 나눌 수 있었고, 두 환자군에서 survivin, cyclinE, DCC, TGF-β, CDC25B, Histone H1, p-EGFR, p-VEGFR2/3 및 p16 단백질의 발현 차이가 나타남을 확인하였다.
즉, 예후가 좋지 않은 환자군에서는 예후가 좋은 환자군과 비교하여 survivin, cyclinE, DCC, TGF-β 단백질이 과발현되었고, CDC25B, Histone H1, p-EGFR, p-VEGFR2/3 및 p16 단백질이 저발현되었음을 확인하였다.
본 발명은 일 관점에서 survivin, cyclinE, DCC, TGF-β, CDC25B, Histone H1, p-EGFR, p-VEGFR2/3 및 p16 로 구성된 군에서 선택되는 교모세포종의 진단 또는 예후 예측용 바이오 마커에 관한 것이다.
본 발명은 다른 관점에서, survivin, cyclinE, DCC, TGF-β, CDC25B, Histone H1, p-EGFR, p-VEGFR2/3 및 p16 로 구성된 군에서 선택되는 단백질을 코딩하는 유전자의 발현량을 측정할 수 있는 물질을 포함하는, 교모세포종의 진단 또는 예후 예측용 키트에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 물질은 상기 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적인 상보적 서열을 갖는 프라이머인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 교모세포종의 진단 또는 예후 예측에 필요한 정보 제공을 위해, survivin, cyclinE, DCC, TGF-β, CDC25B, Histone H1, p-EGFR, p-VEGFR2/3 및 p16 로 구성된 군에서 선택되는 단백질의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 단백질의 분석방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 survivin, cyclinE, DCC 및 TGF-β 단백질이 과발현된 것을 측정함으로써 교모세포종의 진단 또는 예후를 예측할 수 있고, DC25B, Histone H1, p-EGFR, p-VEGFR2/3 및 p16 단백질이 저발현된 것을 측정함으로써 교모세포종의 진단 또는 예후를 예측할 수 있다. 또한, survivin, cyclinE 단백질의 발현 정도가 교모세포종 환자군을 나누는 중요한 요소로 기능함을 확인하였다.
교모세포종은 일단 진단되면 기대 생존기간이 1년에 불과하기 때문에 교모세포종의 예후를 예측하는 것은 매우 중요한데, 이에 따라 향후에 적용가능한 치료방법 등이 달라지는 점에서 본 발명에서 교모세포종 진단 또는 예후 예측용 인자로 발굴한 단백질의 발현량을 측정하여, 예후가 좋은 환자군과 좋지 않은 환자군으로 구별할 수 있음은 교모세포종 환자의 치료에 중요한 기준이 되고, 따라서 상기 단백질들의 과발현 또는 저발현 정도를 측정함으로써 교모세포종의 진단 또는 예후 예측에 필요한 정보를 얻을 수 있다. 또한, 상기 단백질들의 발현량을 측정함으로써 교모세포종의 진단 또는 예후를 예측할 수 있으므로, 이를 이용하여 교모세포종의 치료법을 개발하는 데 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명에서는 조직 마이크로어레이(TMA, tissue microarray) 기법 및 최적화된 histochemical score(H-score)를 이용한 분석 결과를 교모세포종에서의 생존 시간과 같은 임상 변수들과 통합적으로 분석하여 immunoprofiling 하였고, 이를 토대로 교모세포종의 예후를 예측할 수 있는 분자 마커를 분석하였다. 총 56례의 교모세포종 환자를 대상으로 108가지의 교모세포종 연관 단백질들의 발현을 분석한 결과, 단백질 발현의 차이를 보이는 환자군 (cluster)이 두 그룹 (n=19, 37)으로 나누어지는 것을 확인하였고, 두 그룹간 생존 기간의 차이가 통계적으로 유의미하게 나타나는 것을 확인하였다(p<0.05). 도 2는 R program의 affy package안의 'normalize.quantiles' 기능을 이용해 분석하여 정규화 전후의 단백질 발현 수준을 boxplot으로 나타내었고, 또한 R program package (Comprehensive R archives network (CRAN). [cited]; Available from: http://cran.r-project.org/.)를 이용한 Hierarchical clustering 결과를 heatmap과 dendogram으로 나타낸 결과 및 Kaplan-Meier method를 이용하여 Univariate survival analysis을 통해 분석한 생존률 (overall survival)을 분석한 결과를 나타내었다.
도 3에서는 발굴된 예후 예측용 마커 단백질의 발현을 또 다른 교모세포종 환자의 조직을 이용한 10 종의 바이오마커들을 대상으로 한 hierarchical clustering 결과, 환자군은 2개의 집단으로 나누어지고, 분리된 2 환자군을 대상으로 Kaplan-Meier survival curves를 통해 유의미함을 검증하였고 log-rank 분석법을 통해 분석된 생존률 (Overall survival)에서도 통계적으로 유의미한 차이를 확인하였다. 또한, 9종의 대상 유전자와 환자간의 euclidean distance를 검증하고 각 그룹별 Kaplan-Meier survival curves를 overall survival과 비교한 결과 통계적으로 유의미함을 검증하였다.
본 발명에서는 또한, 두 그룹 중 예후가 좋지 않은 환자군에서 survivin, cyclinE, DCC, TGF-β, CDC25B, Histone H1, p-EGFR, p-VEGFR2/3, p16 단백질들의 유의미한 발현 차이를 검증하였다 (q < 0.05). 또한, 본 연구를 통해 발굴된 상기 단백질들이 교모세포종 환자의 예후를 예측할 수 있는 마커로 사용될 수 있는지 검증하기 위해 독립적으로 제작된 82례의 교모세포종 샘플과 public DNA array data를 대상으로 검증한 결과, 단백질 및 RNA 발현 수준 모두 상기의 2 환자군을 구별할 수 있음을 확인하였고, 따라서 상기 단백질은 그 발현량을 측정함으로써 교모세포종의 진단 또는 예후를 예측하는 데 이용될 수 있음을 의미한다.
교모세포종 관련 단백질들의 발현량을 분석한 결과, 교모세포종 예후가 좋지 않은 환자군에서는 교모세포종 예후가 좋은 환자군에 비하여 survivin, cyclinE, DCC 및 TGF-β 단백질은 과발현되고, CDC25B, Histone H1, p-EGFR, p-VEGFR2/3 및 p16 단백질은 저발현되는 것을 확인하였다(표 1).
Code Protein Localization Adjusted p-Value Up/down regulated
at poor prognosis
X50 cyclin E Nuclear 0.00744 Up
X16 DCC Nuclear 0.0155 Up
X41 survivin Nuclear 0.0295 Up
X44 TGF β Cytoplasm 0.0104 Up
X08 CDC25B Nuclear 0.00744 Down
X24 Histone H1 (B419) Nuclear 0.0113 Down
X78 p-EGFR Cytoplasm 0.0295 Down
X75 p-VEGFR2/3 Cytoplasm 0.0122 Down
X31 p16 Cytoplasm 0.00744 Down
X31 p16 Nuclear 0.00744 Down
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
조직 마이크로어레이를 위한 샘플의 수집 (교모세포종 환자 및 조직의 수집)
2004년 1월부터 2006년 12월까지 삼성 의료 연구소로부터 62 GBM 샘플을 얻었다. 환자들의 나이는 13세에서 78세로 분포되어 있었고, 그들의 생존 기간은 22일에서 913일로 중앙값(median value)은 376.5일이었다. 또한, 본 발명에서 발굴한 교모세포종 예후 예측 인자 단백질들의 검증을 위해 독립적으로 제작된 82 GBM 샘플(2004년 1월부터 2007년 12월 사이에 GBM으로 진단받은 환자들로부터 획득)을 삼성 의료 연구소로부터 얻었다.
뇌 조직의 처리
세포 접종 및 치료 후 적정 시기에 뇌 적출을 시행하였다. 뇌 적출 전후에 종양의 생물학적 상태를 파악하고 조직 검사를 위하여, brain harvest 후 brain matrix에 적출한 뇌를 놓고, 뇌를 2 mm 간격으로 절편을 만들고, 세포주가 주입된 곳을 중심으로 하나의 조직 절편을 OCT compound를 이용해서 frozen block을 만들었다. 그리고 나머지 조직 절편들은 buffered 10% formalin 용액에 넣어 4℃에서 24시간 고정한 후에, paraffin block을 만들었다. Frozen section은 8 um 두께로 동결절편기를 이용해서 절편을 만든 후, -20℃에서 보관하고, Paraffin section은 4 um두께로 절편을 만든 후, 상온에서 보관하였다. 면역조직화학적 방법으로 발현을 확인하기 위해서는, 먼저de-paraffin과 re-hydration과정을 거쳐서 조직을 준비하였다. 준비된 조직을 Gill's Hematoxylin과 Eosin으로 15-20초간 발색한 후 수세함으로 background 염색하였다. 그 후, 탈수과정을 한 후에 permount로 mounting하였다. 이 때, control sample은 2차 항체에만 반응시키고, 염색은 되지 않아야 한다. 이를 사용하여 염색된 종양의 크기와 수를 측정하는 방법으로 각 세포군의 Tumorigenecity를 판정하였다.
조직면역학적 검사
파라핀 절편 (4-6 um)을 coating된 slide glass에 붙이고, 하룻밤 동안 건조시켰다. 조직은 xylene으로 de-paraffin 과정을 거친 후, 점차적으로 alcohol 퍼센트에 따라 [100, 95, 80% ethanol, DW] sample을 처리하고, PBS (pH 7.5)에 re-hydrate과정 거쳤다. sample은 물에 넣어 전자레인지에서 5분간 antigen retrival을 수행하거나 pepsin을 처리해서 37℃에서 15분간 방치한 후, PBS로 수세하였다. 3% H2O2로 조직내에 있는 peroxidase와 반응시켰다. 5% normal horse serum/1% normal goat serum으로 조직을 blocking하고, 일차 항체 cytosine deaminase antibody와 상온에서는 3시간, 4℃에서는 overnight시켰다. 이를 수세한 후, 5% normal horse serum/1% normal goat serum으로 조직을 blocking하고, HRP가 붙은 이차 항체를 상온에서 1시간 동안 처리하였다. DAB으로 5-10분 정도 발색반응을 한 후, DAB의 발색 정도는 현미경 상에서 확인하고 적당한 발색 정도를 결정하였다. Gill's Hematoxylin으로 15-20초간 발색한 후 수세함으로 background 염색하고, 탈수과정을 한 후에 permount로 mounting을 하였다.
조직 마이크로 어레이( TMA ) 이미지의 H- scoring 방법에 의한 분석
각 환자의 조직을 사용해 준비한 파라핀 블록으로부터 절편을 만들고 H&E 염색 기법을 통해 병리학적으로 암조직인 부위를 선별하였다. 선별된 부위를 Beecher Instruments (Sun Prairie, WI )사의 MTA-1 기기를 이용해 tissue microarray를 동사의 standard protocol에 따라 제작하였다. 이렇게 준비된 TMA 슬라이드를 대상으로 교모세포종과 관련된 것으로 알려진 중요 단백질 78종의 발현 패턴을 면역염색화학적 기법을 통해 분석하였다 (각 단백질의 발현 및 세포내 위치 정보는 기존 연구 논문들을 통해 설정하였음). 염색을 마친 TAM 슬라이드는 Aperio사의 Scan Scope CS System을 이용해 이미지 파일로 변환하고 변환된 이미지는 Bioimagene사의 TissueMine (Bioimagene Co., USA) 프로그램을 이용하여 정확한 세포내 위치에서 보이는 염색 강도에 따라 [grade 0 (negative), 1 (weak), 2 (moderate), and 3 (strong)]와 같이 나누어 자동으로 분석하였다. 상기의 이미지 분석 후, H-score(0-300)는 0 negative % + 1 weak % + 2 moderate % + 3 strong %의 기준을 설정하여 검증하였다 (McCarty KS et al., Arch Pathol Lab Med. 1985;109(8):716-21; Abd El-Rehim DM et al., Int J Cancer. 2005;116(3):340-50). 이를 통하여, 조직 마이크로어레이 이미지를 manual scoring 방법과 최적화된 H-scoring 방법을 이용하여 분석한 결과, 분석 방법에 따른 차이가 나타나지 않음을 확인하였다(도1).

Claims (8)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 교모세포종의 진단 또는 예후 예측에 필요한 정보 제공을 위해, cyclinE, DCC 및 TGF-β 단백질의 과발현 여부; 및
    CDC25B, Histone H1, p-EGFR, 및 p-VEGFR2/3 단백질의 저발현 여부를 측정하는 것을 포함하는 단백질의 분석방법.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. cyclinE, DCC 및 TGF-β 단백질을 코딩하는 유전자의 발현량을 측정할 수 있는 물질; 및
    CDC25B, Histone H1, p-EGFR, 및 p-VEGFR2/3 단백질을 코딩하는 유전자의 발현량을 측정할 수 있는 물질을 포함하는, 교모세포종의 진단 또는 예후 예측용 키트.
  8. 제7항에 있어서, 상기 물질은 상기 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적인 상보적 서열을 갖는 프라이머인 것을 특징으로 하는 교모세포종의 진단 또는 예후 예측용 키트.






KR1020100100050A 2010-10-13 2010-10-13 교모세포종의 진단 또는 예후 예측용 바이오 마커 및 그 용도 KR101760464B1 (ko)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020100100050A KR101760464B1 (ko) 2010-10-13 2010-10-13 교모세포종의 진단 또는 예후 예측용 바이오 마커 및 그 용도
PCT/KR2011/007592 WO2012050365A2 (ko) 2010-10-13 2011-10-12 교모세포종의 진단 또는 예후 예측용 바이오 마커 및 그 용도

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020100100050A KR101760464B1 (ko) 2010-10-13 2010-10-13 교모세포종의 진단 또는 예후 예측용 바이오 마커 및 그 용도

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20120038339A KR20120038339A (ko) 2012-04-23
KR101760464B1 true KR101760464B1 (ko) 2017-07-24

Family

ID=45938804

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020100100050A KR101760464B1 (ko) 2010-10-13 2010-10-13 교모세포종의 진단 또는 예후 예측용 바이오 마커 및 그 용도

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR101760464B1 (ko)
WO (1) WO2012050365A2 (ko)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101692044B1 (ko) * 2014-12-05 2017-01-04 사회복지법인 삼성생명공익재단 교모세포종에서 표피 성장인자 수용체 억제제의 치료 효과를 예측하는 방법
US20180133327A1 (en) * 2015-03-16 2018-05-17 Amal Therapeutics Sa Cell Penetrating Peptides and Complexes Comprising the Same
WO2017068182A1 (en) * 2015-10-22 2017-04-27 Basilea Pharmaceutica Ag Use of eb1 as a biomarker of drug response
CN109963585A (zh) 2016-09-21 2019-07-02 阿尔勒治疗公司 包括细胞穿透肽、多表位和tlr肽激动剂的用于治疗癌症的融合物
KR102320436B1 (ko) * 2020-01-13 2021-11-03 주식회사 메타큐라 교모종줄기세포 엑소좀 유래 펩타이드를 포함하는 교모세포종의 진단용 바이오마커 조성물
CN111454254B (zh) 2020-04-26 2023-06-02 云白药征武科技(上海)有限公司 一种具有含氟取代基的苯并咪唑衍生物的制备及其应用
CN114075604B (zh) * 2022-01-18 2022-04-08 天津医科大学总医院 胶质母细胞瘤预后预测评分模型及其在指导临床精准诊疗中的应用
KR20230144764A (ko) * 2022-04-08 2023-10-17 연세대학교 산학협력단 유전자로 정의된 암기원세포, 및 이의 분류방법
KR20230144759A (ko) * 2022-04-08 2023-10-17 연세대학교 산학협력단 유전자로 정의된 암기원세포, 및 이의 분류방법

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Determination of p53 Mutation, EGFR Overexpression, and Loss of p16 Expression in Pediatric Glioblastomas(1997년)*
FBXW7/hCDC4 controls glioma cell proliferation in vitro and is a prognostic marker for survial in glioblastoma patients(2007년 2월)*
Prognostic significance fo the immuonhistochemical index survivin in glioma(2005년)*
Uematsu, M. et al., Prognostic significance of the immunohistochemical index of survivin in glioma: a comparative study with the MIB-1 index Journal of Neurooncology, May 2005, Vol. 72, No. 3*

Also Published As

Publication number Publication date
WO2012050365A2 (ko) 2012-04-19
WO2012050365A9 (ko) 2012-06-28
WO2012050365A3 (ko) 2012-11-01
KR20120038339A (ko) 2012-04-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101760464B1 (ko) 교모세포종의 진단 또는 예후 예측용 바이오 마커 및 그 용도
Mota et al. Molecular characterization of breast cancer cell lines by clinical immunohistochemical markers
AU2011289284B2 (en) Pancreatic cancer biomarkers and uses thereof
Langan et al. A pilot study assessing the potential role of non-CD133 colorectal cancer stem cells as biomarkers
Chen et al. Proteomic characterization of Her2/neu‐overexpressing breast cancer cells
CN104487591A (zh) 预测***癌预后之分子标记、方法及套组
Karamchandani et al. Profilin-1 expression is associated with high grade and stage and decreased disease-free survival in renal cell carcinoma
US8377648B2 (en) Autoimmune regulation of prostate cancer by annexin A3
CN104267191B (zh) 口腔鳞状细胞癌的生物标志物及其应用
Li et al. Screening and validating the core biomarkers in patients with pancreatic ductal adenocarcinoma
US20200232039A1 (en) Adm2 gene marker for diagnosis or prognosis prediction of thyroid cancer and uses thereof
Hogeboom-Gimeno et al. MYC amplification in angiosarcoma depends on etiological/clinical subgroups–Diagnostic and prognostic value
Sharma et al. Clinical biomarkers in soft tissue sarcoma A comprehensive review of current soft tissue sarcoma biomarkers
Hunt et al. Extensive intratumor proteogenomic heterogeneity revealed by multiregion sampling in high-grade serous Ovarian tumor specimens
KR20220014900A (ko) 폐암 진단용 다중 바이오마커 및 이의 용도
AL-Bedairy et al. Molecular Subtypes by Immunohistochemical for Iraqi Women with Breast Cancer
KR20230029059A (ko) 트라스투주맙 저항성 예측용 신규 바이오마커 및 이의 용도
Devrim et al. Coexistence of CD44 and Ki-67 as the prognostic markers in renal cell carcinoma
Guy et al. Expression of Ki-67 and Prognosis of Breast Invasive Carcinoma in Congolese Women
KR102416614B1 (ko) 방사선 저항성 지표 단백질 및 이의 검출방법
US20110104657A1 (en) Method of detecting malignancy of nasopharyngeal carcinoma and a nasopharyngeal carcinoma malignancy biomarker
CN103649334A (zh) Kiaa1456表达在结肠癌患者中预测生存
KR102461422B1 (ko) 양성 종양 또는 결절로부터 암을 구분하기 위한 바이오마커
KR102416607B1 (ko) 방사선 저항성 지표 단백질 및 이의 검출방법
KR102649794B1 (ko) 암 및/또는 뇌질환 바이오마커인 엑스트라-도메인 b 파이브로넥틴 및 이를 이용한 진단 방법

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant