KR20230029059A - 트라스투주맙 저항성 예측용 신규 바이오마커 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 HER2를 선택적으로 공격하는 표적 항암제인 트라스투주맙에 대한 저항성 여부를 예측하기 위한 신규 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 암세포의 트라스투주맙 저항성 예측용 조성물 및 키트, 및 암세포의 트라스투주맙 저항성을 예측하기 위한 정보의 제공 방법에 관한 것이다. 본 발명에서는 암세포의 트라스투주맙 저항성을 예측할 수 있는 신규 바이오마커를 제시함으로써 트라스투주맙 저항성을 예측용 조성물 및 키트를 제공하여 조기에 트라스투주맙 저항성을 가지는 개체를 신속하고 정확하게 판별하고 적절한 치료법을 제공할 수 있다.
Description
본 발명은 HER2를 선택적으로 공격하는 표적 항암제인 트라스투주맙에 대한 저항성 여부를 예측하기 위한 신규 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 암세포의 트라스투주맙 저항성 예측용 조성물 및 키트, 및 암세포의 트라스투주맙 저항성을 예측하기 위한 정보의 제공 방법에 관한 것이다.
인간 표피성장인자 수용체(human epidermal growth factor receptor, HER)는 세포 표면에 발현되는 막 단백질로서 세포 밖에 존재하는 표피성장인자(EGF)가 결합하여 세포 분열을 유도하며, HER1, HER2, HER3 및 HER4로 구성된다. 이러한 HER 단백질은 많은 종류의 암세포의 표면에서 비정상적으로 높게 발현되며, 이로 인해 암세포의 분열 및 증식이 빠르게 일어난다. 따라서 HER 신호를 억제하거나 차단하여 HER 과발현 또는 양성 암을 치료할 수 있다.
현재까지 보고된 바에 따르면, 전체 유방암의 약 15 ~ 20%는 암세포 표면에서 HER2 단백질이 과발현되며, HER2 단백질을 과발현하지 않는 경우에 비해 더 나쁜 예후를 가지는 것으로 알려져 있다. HER2 단백질 과발현을 억제하는 약물로는 대표적으로 HER2 단클론항체인 트라스투주맙(Trastuzumab, 상품명 Herceptin)이 있다. 트라스투주맙은 HER2 과발현이 있는 유방암 환자의 생존을 연장시키는데 효과적이며, HER2 유전자 증폭 증가 또는 HER2 단백질 과발현을 가지는 초기 단계 유방암 환자의 재발 및 사망을 감소시키는 것으로 보고되었다. 하지만 일부 HER2 양성 암환자에서는 트라스투주맙을 처방하여 유방암이 완치됐음에도 불구하여 일정기간 경과 후 암이 재발하거나 전이되는 경우가 나타나는데, 이는 암세포가 트라스투주맙에 대한 저항성을 획득한 것으로 여겨진다. 그러므로 효과적이고 정확한 항암 치료를 위해서는 치료 초기에 암세포의 약물 저항성 여부를 판별하는 것이 중요하다.
최근에는 암환자로부터 트라스투주맙 저항성 여부를 판별할 수 있는 바이오마커에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다. 그러나 아직까지 상용화된 기술 및 이를 이용한 진단키트가 없으며, 현재 개발된 진단키트 시제품의 경우 높은 신뢰성을 가지지 못한다는 문제점이 있어 상용화가 지연되고 있다. 따라서 암세포의 트라스투주맙 저항성을 정확하고 신뢰할만한 수준으로 예측할 수 있는 바이오마커 및 이를 이용한 진단키트 등의 개발이 시급한 실정이다.
본 발명은 트라스투주맙 저항성 여부를 예측 가능한 신규 바이오마커를 검출할 수 있는 암세포의 트라스투주맙 저항성 예측용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 암세포의 트라스투주맙 저항성 예측용 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 트라스투주맙 저항성 여부를 예측 가능한 신규 바이오마커의 발현 수준을 측정하여 암세포의 트라스투주맙 저항성을 예측하기 위한 정보의 제공 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 트라스투주맙 저항성을 가지는 HER2 양성 유방암 세포주 또는 이를 도입한 유방암 마우스 모델에서 약물 저항성이 없는 유방암 세포에 비해 HMGCR 유전자 발현이 현저히 낮다는 것을 확인함으로써 HMGCR 유전자 또는 단백질을 암세포의 트라스투주맙 저항성을 예측 또는 판별하는 바이오마커로 제시하며, 이러한 바이오마커를 활용한 암세포의 트라스투주맙 저항성 예측용 조성물 및 키트, 및 이를 이용한 암세포의 트라스투주맙 저항성을 예측하기 위한 정보의 제공 방법을 제공하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 양상은 HMGCR 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 암세포의 트라스투주맙 저항성 예측용 조성물을 제공한다.
상기 트라스투주맙은 세포 표면에 존재하는 HER2의 세포외부분을 항원결정부(epitope)로 인식하는 단일클론항체로서 세포의 성장 및 증식에 관여하는 HER2 유전자 또는 그의 유전자산물 과발현으로 나타나는 종양을 치료하는 표적치료제이다. 트라스투주맙은 HER2와 선택적으로 결합하여 HER2가 작동하는 것을 무력화시킴으로써 세포의 성장신호를 차단하여 암세포의 증식을 억제하며, 주로 HER2 양성인 유방암 환자와 전이성 위암에 트라스투주맙을 단독으로 사용하거나 다른 항암제와 병용하여 투여하게 된다. 하지만 일부 환자에서는 트라스투주맙 치료의 효과가 약화되어 암이 재발하거나 전이되는 경우가 나타나며, 이런 경우에는 트라스투주맙에 대해 저항성이 있는 것으로 예후가 나쁜 편이다.
본 발명에서 사용된 "트라스투주맙 저항성 예측"은 암환자가 트라스투주맙 치료를 하더라도 암세포의 성장 및 증식이 억제되지 않아 트라스투주맙에 의한 치료 효과가 나타나지 않는 경우를 트라스투주맙에 대해 저항성 또는 내성(resistance)이 있다고 하며, 암환자에게 치료약물을 처방하기 전에 환자의 트라스투주맙 저항성 여부를 판단하는 것을 의미한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 암세포는 HER2 양성인 것일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 암세포는 HER2 양성 고형암 또는 전이암인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 암세포는 난소암, 복막암, 난관암, 유방암, 비소세포 폐암, 편평세포암, 전립선암, 위암 및 결장직장암으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 암 유래 세포인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 HMGCR 유전자 또는 단백질의 발현 수준은 암세포 또는 이를 포함하는 조직에서 측정되는 것일 수 있다.
본 발명에서 사용된 "바이오마커(biomarker)"는 일반적으로 생물학적 시료에서 검출 가능한 물질로서 생체 변화를 알아낼 수 있는 폴리펩티드, 단백질, 핵산, 유전자, 지질, 당지질, 당단백질, 당 등과 같은 유기 생체 분자들을 모두 포함한다. 본 발명에서는 바이오마커로서 HMGCR 유전자 또는 단백질을 이용할 수 있다.
상기 HMGCR(3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-CoA Reductase 또는 HMG-CoA 환원효소)은 콜레스테롤 생합성 과정 중 HMG-CoA가 NADPH를 사용하여 메발론산으로 전환되는 반응을 촉진하는 효소로서 HMGCR 유전자에 암호화되어 유전자의 전사 조절에 따라 세포내 콜레스테롤 항상성을 유지할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 트라스투주맙 저항성을 가지는 유방암 세포는 저항성이 없는 유방암 세포에 비해 콜레스테롤 생합성 경로에 관여하는 유전자들 중 HMGCR 유전자의 발현량이 현저히 감소하는 것을 확인하였다. 따라서, HMGCR 유전자 또는 이로부터 발현된 HMGCR 단백질은 암세포의 트라스투주맙 저항성을 예측하기 위한 바이오마커이며, 암세포의 트라스투주맙 저항성을 예측하기 위해서는 HMGCR 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 암세포에서 관찰하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 제제는 HMGCR 유전자 또는 단백질에 각각 특이적으로 결합하여 유전자 또는 단백질의 존재 여부 및 발현 수준을 측정할 수 있는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 제제는 HMGCR의 유전자 또는 단백질에 각각 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브, 항체, 앱타머, 올리고펩티드 및 PNA로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 제제는 HMGCR 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브인 것일 수 있다.
본 발명에서 사용된 "특이적으로 결합하는"이란 결합에 의해 표적 물질의 존재 여부를 검출할 수 있을 정도로 다른 물질에 비해 표적 물질에 대한 결합력이 뛰어남을 의미한다.
본 발명에서 사용된 "프라이머(primer)"는 적합한 온도 및 완충액 내에서 적합한 조건 (즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드(single strand oligonucleotide)를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있지만, 전형적으로 15 ~ 30 뉴클레오티드로 구성된다.
본 발명에서 사용된 "프로브(probe)"는 자연의 또는 변형된 모노머(monomer) 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함하고, 표적 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것이다.
본 발명의 일 실시예에서는 트라스투주맙 저항성을 가지는 유방암 세포 내 HMGCR 유전자 발현량을 측정하기 위해 HMGCR 유전자에 상보적으로 결합하는 정방향 프라이머(forward primer)와 역방향 프라이머(reverse primer)로 구성된 프라이머 세트를 사용하였다.
또한, 보다 구체적으로, 상기 제제는 HMGCR 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 앱타머(aptamer), 올리고펩티드 및 PNA(peptide nucleic acid)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에서 사용된 "항체"는 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명에서는 HMGCR 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 단클론 항체, 다클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 또한, 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄(light chain) 및 2개의 전체 길이의 중쇄(heavy chain)를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv 등일 수 있다.
상기 항체는 당업계에 공지된 기술을 통해 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들면, 단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method) Kohler 및 Milstein (1976) European Jounral of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리 (Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 다클론 항체는 표적 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 동물로부터 제조 가능하다.
상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전지영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리 및 정제할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 양상은 상기 조성물을 포함하는 암세포의 트라스투주맙 저항성 예측용 키트를 제공한다.
본 발명에서 사용된 "암세포의 트라스투주맙 저항성 예측용 키트"는 검사 대상자 또는 암환자로부터 채취한 생물학적 시료를 통해 트라스투주맙 저항성 여부를 예측할 수 있는 물질을 의미하며, 이를 통해 검사 대상자의 트라스투주맙 저항성 여부를 신속하고 간편하게 진단할 수 있다. 본 발명에서는 HMGCR 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함한다.
상기 키트는 통상적인 유전자 및 단백질 정량 분석에 기반한 진단 키트를 제한 없이 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 키트는 PCR 키트, RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, 단백질 키트 및 단백질 어레이 키트로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다.
예를 들면, 상기 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로 PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소, DNA 중합 효소 보조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있으며, 상기 키트가 면역 분석에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로 이차항체 및 표지의 기질을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있으며, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 진단용 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한, 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양상은 a) 암환자로부터 생물학적 시료를 채취하는 단계; b) 상기 생물학적 시료에서 HMGCR 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 c) 상기 측정된 HMGCR 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 암세포의 트라스투주맙 저항성을 예측하기 위한 정보의 제공 방법을 제공한다.
상기 a) 내지 c) 단계에 대해 다음에서 자세히 살펴보며, 전술한 내용과 공통된 내용은 과도한 복잡성을 회피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
상기 a) 단계는 트라스투주맙 저항성 여부에 대한 검사가 필요한 암환자로부터 생물학적 시료를 채취하는 과정이다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 a) 단계의 암환자는 HER2 양성 암환자인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 a) 단계의 생물학적 시료는 암세포 또는 이를 포함하는 조직인 것일 수 있다.
상기 b) 단계는 생물학적 시료에서 바이오마커 HMGCR의 존재 여부와 함께 발현 수준을 측정하는 과정으로, HMGCR 발현을 유전자 수준으로 측정하기 위해 증폭 반응을 이용할 수 있으며, 단백질 수준으로 측정하기 위해 항원-항체 반응을 이용할 수 있다. 본 발명에서는 전술한 암세포의 트라스투주맙 저항성 예측용 조성물 또는 키트를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 b) 단계의 바이오마커 HMGCR는 핵산 또는 단백질 발현 수준으로 측정되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 HMGCR 유전자의 발현 수준은 중합효소 연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, 핵산분해효소 보호 분석(nuclease protection assay), in situ 교잡법, DNA 마이크로어레이 및 노던 블롯으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 방법으로 측정되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 HMGCR 단백질의 발현 수준은 ELISA, 웨스턴 블롯, 방사선면역분석, 면역확산, 면역침전, 면역조직화학, 면역형광 및 단백질 마이크로어레이로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 방법으로 측정되는 것일 수 있다.
상기 c) 단계는 생물학적 시료에서 측정된 HMGCR의 유전자 또는 단백질 발현량을 트라스투주맙에 저항성을 나타내지 않는 대조군과 비교하여 트라스투주맙 저항성 여부를 판단하는 과정이다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 대조군은 정상인 또는 트라스투주맙 저항성이 없는 암환자인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 c) 단계는 측정된 HMGCR 유전자 또는 단백질의 발현 수준이 대조군에 비해 낮은 경우, 암세포가 트라스투주맙 저항성을 가지는 것으로 판별하는 것일 수 있다.
본 발명에서는 암세포의 트라스투주맙 저항성을 예측할 수 있는 신규 바이오마커를 제시함으로써 트라스투주맙 저항성을 예측용 조성물 및 키트를 제공하여 조기에 트라스투주맙 저항성을 가지는 개체를 신속하고 정확하게 판별하고 적절한 치료법을 제공할 수 있다.
도 1은 트라스투주맙 저항성 in vitro 모델을 나타낸 것으로, A는 BT474 세포의 계대배양 중 트라스투주맙 50 ug/ml 처리 여부에 따른 트라스투주맙 감수성 세포 (BT474_S) 및 저항성 세포 (BT474_R)를 수득하는 과정이며, B는 트라스투주맙 50 ug/ml을 처리한 BT474 세포에서 각 계대별 (passage 2, 4, 9, 11 및 13) 총 HER2 및 β-actin의 발현을 측정하여 트라스투주맙을 처리하지 않은 BT474 세포 (W/T)와 비교한 결과이며, C는 13계대의 BT474 세포에서 트라스투주맙 처리 여부에 따른 세포 형태학적 변화를 비교한 결과이다.
도 2는 트라스투주맙 저항성 in vivo 모델을 나타낸 것으로, A는 유방 지방 패드에 BT474 세포를 주입한 Balb/C 누드 마우스에 대해 트라스투주맙 20 mg/kg 복강 주사 여부에 따른 트라스투주맙 감수성 마우스 모델 (TRZ_S) 및 저항성 마우스 모델 (TRZ_R)을 제작하는 과정이며, B는 트라스투주맙 20 mg/kg 복강 주사 후 트라스투주맙 감수성 마우스 모델 (TRZ_S) 및 저항성 마우스 모델 (TRZ_R)의 종양 크기 변화를 비교한 결과이다.
도 3은 트라스투주맙 감수성/저항성 세포에서 콜레스테롤 생합성 경로 관련 유전자들의 발현 차이를 보여주는 GSEA 및 히트맵이다.
도 4는 트라스투주맙 감수성/저항성 세포에서 콜레스테롤 생합성 경로 관련 유전자 중 HMGCR, GGPS1 및 HMGCS1 유전자 발현량을 비교한 결과이다.
도 5는 트라스투주맙 감수성/저항성 세포의 HER2 내재화를 나타낸 것으로, A는 트라스투주맙 결합 분석 결과이며, B는 트라스투주맙이 HER2 내재화에 의해 세포내로 도입되는 과정을 보여주는 모식도이다.
도 2는 트라스투주맙 저항성 in vivo 모델을 나타낸 것으로, A는 유방 지방 패드에 BT474 세포를 주입한 Balb/C 누드 마우스에 대해 트라스투주맙 20 mg/kg 복강 주사 여부에 따른 트라스투주맙 감수성 마우스 모델 (TRZ_S) 및 저항성 마우스 모델 (TRZ_R)을 제작하는 과정이며, B는 트라스투주맙 20 mg/kg 복강 주사 후 트라스투주맙 감수성 마우스 모델 (TRZ_S) 및 저항성 마우스 모델 (TRZ_R)의 종양 크기 변화를 비교한 결과이다.
도 3은 트라스투주맙 감수성/저항성 세포에서 콜레스테롤 생합성 경로 관련 유전자들의 발현 차이를 보여주는 GSEA 및 히트맵이다.
도 4는 트라스투주맙 감수성/저항성 세포에서 콜레스테롤 생합성 경로 관련 유전자 중 HMGCR, GGPS1 및 HMGCS1 유전자 발현량을 비교한 결과이다.
도 5는 트라스투주맙 감수성/저항성 세포의 HER2 내재화를 나타낸 것으로, A는 트라스투주맙 결합 분석 결과이며, B는 트라스투주맙이 HER2 내재화에 의해 세포내로 도입되는 과정을 보여주는 모식도이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이러한 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시적으로 제시된 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이러한 예시적인 설명에 의하여 제한되는 것은 아니다.
1. 트라스투주맙 저항성 모델 제작
1-1.
In vitro
모델
트라스투주맙 저항성 in vitro 모델을 제작하기 위하여, 인간 유방암 세포주 BT474 세포를 사용하였다. BT474 세포는 HER2 발현 세포로서 트라스투주맙에 저항성이 없는 감수성 세포이다.
BT474 세포는 37℃의 5% CO2 배양기에서 배양배지로서 10% FBS(fetal bovine serum) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)을 함유한 RPMI 배지에서 배양하였다. BT474 세포는 배양배지에 트라스투주맙 50 ug/ml을 처리하거나 처리하지 않은 조건으로 4 ~ 5일 간격으로 계대배양하여 트라스투주맙 감수성/저항성 세포를 제작하였다 (도 1의 A). 계대배양 시 세포의 형태를 광학현미경으로 관찰하고 세포의 HER2 단백질 발현량을 측정하였다.
BT474 세포의 HER2 단백질 발현을 측정하기 위하여 웨스턴 블롯(Western blot)을 수행하였다. 먼저, 세포용해 완충액(lysis buffer)을 사용하여 각 그룹의 세포로부터 전체 단백질을 분리하였다. 동일한 양의 단백질 (30 μg)을 8 ~ 10% 아크릴아미드 겔(acrylamide gel)로 분리한 후 SDS-PAGE를 수행하였다. 겔의 단백질 밴드를 나일론 막으로 옮겨 실온에서 1시간 동안 5% 스킴 밀크(skim milk)를 처리하였다. 막은 1차 항체인 total HER2 항체 (Santa cruz, sc-33684) 또는 β-actin 항체 (Abfrontier, LF-PA0207)와 밤새 4℃에서 반응한 후 1xTBST (0.1 % tween-20 함유 tris-buffered saline (pH 7.4))로 15분간 3회 세척하였다. 막을 2차 항체 HRP-표지 항-마우스(anti-mouse) (Santa cruz, sc-2005)로 실온에서 2시간 반응시킨 후 1xTBST로 3회 세척하였다. 이후 ECL 시약을 이용하여 단백질 밴드를 검출하였다.
그 결과, 도 1의 B에 나타낸 바와 같이, BT474 세포에 트라스투주맙을 처리하여 계대배양한 경우에는 계대 초기에 트라스투주맙에 의한 세포 성장이 억제되어 트라스투주맙을 처리하지 않은 BT474 세포 (W/T)에 비해 총 HER2 단백질 발현량이 감소하였으나, 9계대(passage 9) 이후에는 트라스투주맙을 처리하더라도 세포 성장이 지속되어 총 HER2 단백질 발현량이 회복되었다.
또한, 도 1의 C에 나타낸 바와 같이, 13계대(passage 13)에서 트라스투주맙을 처리한 BT474 세포 (BT474_R)는 트라스투주맙을 처리하지 않은 BT474 세포 (BT474_S)와 비교하여 둥근 형태를 가지는 것으로 형태학적 변화가 관찰되었다.
따라서 트라스투주맙 존재하에서 13계대까지 배양한 BT474 세포는 트라스투주맙에 대해 저항성을 가지는 것으로 판단되어, 트라스투주맙 저항성 in vitro 모델로 사용하였다.
1-2.
In vivo
모델
트라스투주맙 저항성 in vivo 모델을 제작하기 위하여, 마우스에 BT474 세포를 정위이식(orthotopic transplantation)하였다.
5주령 암컷 Balb/C 누드 마우스(nude mouse)는 ㈜오리엔트바이오로부터 공급받아 사용하였다. 마우스의 유방 지방 패드(fat pad)의 양쪽에 Matrigel에 현탁된 BT474 세포 1X107를 주입하였다. 종양 크기가 평균적으로 100 mm3 에 도달하였을 때 트라스투주맙 20 mg/kg 또는 PBS를 복강 주사하였다 (도 2의 A). PBS 복강 주사한 대조군의 경우에는 트라스투주맙 감수성 (TRZ_S)인 반면, 트라스투주맙 주입으로 인해 종양 크기가 현저히 줄어들다가 일정 시간 이후 약물에 대해 저항성을 보이면서 종양이 커지는 경우에는 트라스투주맙 저항성 (TRZ_R)인 것으로 구분하였다 (도 2의 B). 트라스투주맙 감수성/저항성 마우스 모델에서 각각 종양 조직을 채취하여 배양배지에서 트라스투주맙 감수성/저항성 세포를 분리 배양하였다.
실시예 2. 트라스투주맙에 대한 감수성 세포와 저항성 세포 간의 유전자 발현 비교
2-1. RNA 시퀀싱(sequencing)
실시예 1의 in vitro 및 in vivo 모델을 통해 수득한 트라스투주맙 감수성 세포와 트라스투주맙 저항성 세포에 대해 RNA 시퀀싱을 수행하였다.
전체 전사체 시퀀싱 라이브러리는 TruSeq RNA sample preparation v2 kit (Illumina, RS-122-2001, RS-122-2002)를 이용하여 수행되었다. 라이브러리의 무결성(integrity)은 바이오애널라이저(bioanalyzer)와 큐빗(Qubit)으로 확인하였다. 라이브러리 시퀀싱은 TruSeq Rapid PE Cluster kit와 TruSeq Rapid SBS kit의 100-bp 페어드-엔드 모드로 Illumina HiSeq2500을 사용하여 수행되었다. 원본 이미지 데이터는 시퀀스 데이터로 염기-콜링(base-calling)에 의해 변환되고 FASTQ 형식으로 저장되었다. 4개의 독립 시료에 대한 페어드-엔드 리드는 Cutadapt를 사용하여 PCR 및 시퀀싱 어댑터 모두에 맞게 조정되었다. 조정된(Trimmed) 리드는 STAR59를 사용하여 hg19 인간 표준유전체(human reference genome)에 맞춰 얼라인하였다. 유전자 발현은 Expectation-Maximization(RSEM)에 의해 정량화 되었고 유전자 발현 수준에서 Cufflink와 Cuffdiff을 사용하여 유의적으로 차이가 있는 발현 여부를 결정하였다.
2-2. 히트맵(heatmap)
R 언어를 사용하여 유전자들의 발현 차이를 히트맵(heatmap)으로 제작하였다. 4개의 그룹 간에 발현된 유전자 차이를 기능적으로 분류하기 위해, GSEA(gene set enrichment analysis)를 GSEA 버전 2.2를 사용하여 Molecular Signatures Database 5.2 버전에 있는 모든 유전자 세트에 대해 실행하고 다중 가설 테스트를 수정하였다; FDR 임계값은 ≤0.25로 설정되었다. 4개의 유전자 세트에서 공통적인 유전자 세트를 평가하기 위해 Fisher's 정확 검정을 사용하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 콜레스테롤 생합성 경로에 관여하는 유전자들의 발현이 in vitro 및 in vivo 모델의 트라스투주맙 저항성 세포 (BT474_R 및 TRZ_R)에서 감소하였으며, 특히 HMGCR, GGPS1 및 HMGCS1 유전자의 발현이 현저히 감소하였다.
2-3. 실시간 중합연쇄증폭반응(Real-time PCR)
HMGCR, GGPS1 및 HMGCS1 유전자의 발현을 정량적으로 분석하기 위하여, 실시간 PCR을 수행하였다.
RNA 시퀀싱에서와 같은 방법으로 in vivo 모델의 세포에서 총 RNA를 분리한 후 하기 표 1과 같은 프라이머를 사용하여 95℃에서 10분간 반응 후 95℃에서 15초, 60℃에서 15초, 72℃에서 15초 반응하여 40회 반복하고, 72℃에서 5분간 반응시켜 각 유전자를 증폭하였다.
| 프라이머 명칭 | 프라이머 서열 (5'-3') | 서열번호 | |
| HMGCR | 정방향(F) | CACCAAGAAGACAGCCTGAA | 1 |
| 역방향(R) | CATCCTCCACAAGACATTGC | 2 | |
| GGPS1 | 정방향(F) | ACTCAAGAAACAGTCCAAAGA | 3 |
| 역방향(R) | TCTGTAGCTTGTCCTCTGGAA | 4 | |
| HMGCS1 | 정방향(F) | GCTCTGGAATCTGGAATG | 5 |
| 역방향(R) | CTCTTCAATGGCAGTGTT | 6 | |
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 트라스투주맙 저항성 세포 (TRZ_R)의 HMGCR, GGPS1 및 HMGCS1 유전자는 트라스투주맙 감수성 세포 (TRZ_S)에 비해 현저히 발현량이 감소한 것으로 나타났다. 특히 HMGCR은 콜레스테롤 합성 과정에 관여하는 속도 조절 효소(rate limiting enzyme)로 알려져 있고, 이를 표적으로 하는 임상적용 약물 (statin 계열)이 치료제로 이용되고 있어, 본 연구에서는 HMGCR 유전자를 트라스투주맙 저항성의 원인 유전자로 선별하였다.
실시예 3. 트라스투주맙에 대한 감수성 세포와 저항성 세포 간의 HER2 내재화(internalization) 비교
트라스투주맙에 대한 저항성 여부에 따른 세포의 HER2 내재화를 비교하기 위하여, 트라스투주맙 결합 분석(Trastuzumab binding assay)을 수행하였다.
In vivo 모델에서 분리된 트라스투주맙 감수성/저항성 세포에 트라스투주맙 50 ug/ml를 3시간 처리하였다. 이후 세포 배양액을 제거하고 PBS로 3회 세척한 후 새로운 배양배지로 교체하여 ErbB2/HER2 Alexa Fluor 647-conjugated antibody (R&D system, Cat. FAB9589R) 5 μg/mL를 첨가하고 2시간 반응시켰다. 이후 세포 배양액을 제거하고 0.25% 트립신(trypsin)을 처리하여 세포를 회수한 후 Flow cytometry (BD Biosciences, BD FACS Verse Flow Cytometer)를 이용하여 ErbB2/HER2 Alexa Fluor 647-conjugated antibody가 결합된 세포의 수를 측정하였다.
그 결과, 도 5의 A에 나타낸 바와 같이, 트라스투주맙 저항성 세포 (TRZ_R)의 세포막에서 HER2 발현이 높다는 것을 확인하였다.
종합하면, 트라스투주맙 저항성은 HER2 발현량이 많고 세포막을 구성하는 콜레스테롤의 생합성 경로에 관여하는 여러 유전자들의 발현이 현저하게 억제됨으로써 HER2 내재화가 원활하게 일어나지 않아 트라스투주맙에 대한 약효가 저하되는 것임을 알 수 있다 (도 5의 B).
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> SAMSUNG LIFE PUBLIC WELFARE FOUNDATION
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ctcttcaatg gcagtgtt 18
Claims (8)
- HMGCR 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 암세포의 트라스투주맙 저항성 예측용 조성물.
- 청구항 1에 있어서,
상기 암세포는 난소암, 복막암, 난관암, 유방암, 비소세포 폐암, 편평세포암, 전립선암, 위암 및 결장직장암으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 암 유래 세포인 것인 조성물.
- 청구항 1에 있어서,
상기 제제는 HMGCR 유전자 또는 단백질에 각각 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브, 항체, 앱타머, 올리고펩티드 및 PNA로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것인 조성물.
- 청구항 1 내지 3 중 어느 한 한의 조성물을 포함하는 암세포의 트라스투주맙 저항성 예측용 키트.
- a) 암환자로부터 생물학적 시료를 채취하는 단계;
b) 상기 생물학적 시료에서 HMGCR 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
c) 상기 측정된 HMGCR 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 대조군과 비교하는 단계
를 포함하는 암세포의 트라스투주맙 저항성을 예측하기 위한 정보의 제공 방법.
- 청구항 5에 있어서,
상기 b) 단계의 HMGCR 유전자의 발현 수준은 중합효소 연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, 핵산분해효소 보호 분석(nuclease protection assay), in situ 교잡법, DNA 마이크로어레이 및 노던 블롯으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 방법으로 핵산 발현 수준이 측정되는 것인 방법.
- 청구항 5에 있어서,
상기 b) 단계의 HMGCR 단백질의 발현 수준은 ELISA, 웨스턴 블롯, 방사선면역분석, 면역확산, 면역침전, 면역조직화학, 면역형광 및 단백질 마이크로어레이로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 방법으로 단백질 발현 수준이 측정되는 것인 방법.
- 청구항 5에 있어서,
상기 c) 단계는 측정된 HMGCR 유전자 또는 단백질의 발현 수준이 대조군에 비해 낮은 경우, 암세포가 트라스투주맙 저항성을 가지는 것으로 판별하는 것인 방법.
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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