KR101689318B1

KR101689318B1 - 에보디아민을 유효성분으로 포함하는 피부노화 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101689318B1
Application number: KR1020150002771A
Authority: KR
Inventors: 윤부현; 김완연; 김은기
Original assignee: 부산대학교 산학협력단
Priority date: 2015-01-08
Filing date: 2015-01-08
Publication date: 2016-12-23
Also published as: KR20160085581A

Abstract

본 발명은 에보디아민(Evodiamine)을 유효성분으로 포함하는 피부노화 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
세포에 UVB를 조사할 경우 헤지호그 시그널링이 촉진되어 피부 노화가 유발되는데, 본 발명에 따르면 에보디아민을 처리함으로써 헤지호그 시그널링을 억제하여 피부노화를 예방할 수 있다. 뿐만 아니라 에보디아민은 식물로부터 분리한 천연물로써 생체 내에서 세포독성을 거의 나타내지 않는다.

Description

에보디아민을 유효성분으로 포함하는 피부노화 예방 또는 치료용 조성물 {Compositions for prevention or treatment of skin-aging comprising Evodiamine}

본 발명은 에보디아민(Evodiamine)을 포함하는 피부노화(skin-aging) 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 에보디아민을 처리하여 헤지호그 시그널링(Hedgehog signaling)을 억제함으로써 UVB에 의해 유도된 피부 광노화를 예방 또는 치료하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

피부의 주된 역할은 자외선 방사와 같은 환경적인 요인들로부터 보호하는 것이다. 햇빛에 만성적으로 노출되면 주름, 건조함, 색소침착 및 피부 조기 노화와 같은 광노화가 나타난다(Gilchrest B A., J Invest Dermatol 2013, 133, E2-6). 자외선은 UVA(320-400nm), UVB(280-320nm) 및 UVC(200-280nm)로 구성되어 있는데, UVC는 오존층에 의하여 걸러지기 때문에, UVA와 UVB가 광노화 유도에 주된 요인으로 알려져 있다(Pandel R et al., ISRN Dermatol 2013, 930164). UVB는 UVA보다 돌연변이 발생률이 높고 많은 에너지를 포함하고 있어 더 유해한 결과를 초래한다(Yaar M et al., Br J Dermatol, 2007, 157:874-887). 또한, UVB는 피부의 표피를 통과한 후에 표피의 두께, 피부의 탄력성, 기질금속단백질분해효소(matrix metalloproteinases, MMPs)의 증가로 인한 콜라겐 감소 및 피부혈관팽창과 같은 다양한 부작용을 초래할 수 있다. 그 결과, 피부암 발병에 중요한 원인이 되는 것으로 간주되는 홍반, 세포 과다 생성, 주름 형성 및 광노화 등의 전암성 병변(precancerous lesion)이 나타난다.

헤지호그(Hedgehog, Hh) 리간드는, 소닉 Hh(Sonic Hh, SHH), 디저트 Hh(Desert Hh, DHH) 및 인디안 Hh(Indian Hh, IHH)로 구성되어 있다(Briscoe J et al., Nat Rev Mol Cell Biol 2013: 14: 416-429). 분비된 헤지호그 리간드는 세포 표면의 Hip1, Patched(Ptch)-1 및 Ptch-2에 결합한다. 일반적인 상황에서 smoothened(Smo)는 Ptch에 의해 억제되지만, 헤지호그 리간드가 Ptch에 결합하면, Smo가 활성화되어, GLI의 전사 활성을 일으킨다. GLI1은 전사 억제 도메인을 가지고 있지 않는 반면, 절단(cleaved)되어 활성을 가진 GLI2 및 GLI3는 전사 억제 기능을 갖는다. GLI2는 주로 헤지호그 시그널링에 반응하여 활성인자 기능을 담당하는 반면, GLI3는 억제 활성을 담당하는 것으로 알려져 있다. 헤지호그 시그널링이 없으면, GLI2는 단백질 키나제 A, 카제인 키나제 Ⅰ 및 글리코겐 합성효소(synthase) 키나제 3β에 의하여 인산화 되어, E3 연결효소 Slimb 및 β-TrCP(β-transducin repeat-containing protein)와 상호작용을 촉진한다. 유비퀴틴화된(ubiquitinated) GLI2는, 단백질분해효소복합체(proteasome)에 의하여 부분적으로 가공(processed)되어 절단되고, 핵으로 들어가서 타겟 유전자의 발현을 억제한다. 활성화된 Smo는 인산화를 억제함으로써 GLI2의 전사 활성을 용이하게 한다. 활성화된 형태의 GLI2는 핵 안의 GLI1, CCND1 및 BCL2와 같은 타겟 유전자를 발현시킨다(Harrison W et al., Oncogene 2014: 33: 2432-2440, Katoh Y et al., Curr Mol Med 2009: 9: 873-886).

헤지호그 시그널링 경로의 조절이상(deregulation)은 종양 형성을 유발하고, 뇌, 근육 및 피부암을 매개한다(Pasca di Magliano M et al., Nat Rev Cancer 2003: 3: 903-911). 많은 연구들은, 헤지호그 시그널링은 피부세포의 비이상적인 확산 및 유전적 불안정을 유도하여 피부암의 한 종류인 기저세포 상피암(basal cell carcinoma, BCC)을 일으킨다는 증거를 제시해 왔다(Pantazi E et al., Cell Death Dis 2014: 5: e:1028, Berman D M et al., Nature 2003: 425: 846-851). 과도한(aberrant) 헤지호그 시그널링은 GLI의 발현 및 활성화를 증가시키고 그 결과, 피부에서의 종양 형성을 유도한다. 헤지호그 시그널링과 피부세포의 종양 형성 사이의 관련성에 대하여는 다양하게 연구되어 왔지만, 광노화에서의 헤지호그 시그널링의 역할에 대하여는 거의 알려진 바가 없다.

오수유(Evodia rutaecarpa) 열매로부터 분리된 에보디아민은 퀴놀론계 알칼로이드로, 산화적 손상을 보호하는 능력이 있고, 세포 자살 유도, 세포 증식, 침입 및 전이의 억제를 포함하여 다양한 종류의 암에 대해 항암 활성을 나타내는 것으로 알려져왔다(Jiang J et al., Molecules 2009: 14: 1852-1859, Liao C H et al., Carcinogenesis 2005: 56: 968-975). 그럼에도 불구하고, 항-광노화 활성 및 피부에서 헤지호그 시그널링 억제기능과 관련된 에보디아민의 기능에 대하여는 거의 알려진 바가 없다.

사람 면역 시스템은 색소 및 단백질을 포함한 유해한 자외선 흡수와 관련된 보호분자를 가지고 있음에도 불구하고, 이러한 분자들은 장기적이고 만성적인 UVB 노출로 인한 축적된 손상은 치료할 수 없었다(Gilchrest B A, J Invest Dermatol 2013: 133: E2-6).

따라서 UVB에 의해 유도된 광노화, 특히 분자 메커니즘에 의한 광노화를 방지할 수 있는 시약 및 항-산화제를 개발하는 것이 요구되었다. 많은 연구자들이 Smo를 타겟으로 하는 선택적인 헤지호그 억제제들을 연구하여 왔고, 특히 사이클로파민(cyclopamine)의 발견 이후, 더 우수한 효능을 나타내는 파이토케미칼 분자를 발견하기 위하여 연구하였다(Lin T L et al., Onco Targets Ther 2012: 5: 47-58). 그 결과, 비스모데깁(Vismodegib)이 2012년 FDA승인을 받았으나, 기형발생과, 태아독성을 나타내어 임신 중에는 투여될 수 없음이 제시되었다(Von Hoff D D et al., N Engl J Med 2009: 361: 1164-1172). 비스모데깁에 더불어, 헤지호그를 억제하는 것으로 알려진 LED225 또한 임상실험 단계에 있었으나, 불행히도, 미각 손상(taste disturbance)과 같은 부작용이 나타남이 발표되었다(Kumari A et al., Neurophysiol 2014 Nov 12: jn.00822.2014).

이에 본 발명자는 이전에 개발된 헤지호그 시그널링 억제제를 대체할 수 있는 새로운 파이토케미컬에 주목하였고, 연구를 거듭한 끝에 에보디아민이 강력한 헤지호그 시그널링 억제제임을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 헤지호그 시그널링 억제활성을 가지며, 천연물로부터 유래하여 세포독성을 거의 나타내지 않는, 에보디아민을 유효성분으로 포함하는 피부노화 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 피부노화 방지용 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명의 다른 목적은 피부노화 억제제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 헤지호그 시그널링이 UVB에 의해 유도된 피부 광노화의 주된 원인이라는 것을 발견하였고, 에보디아민이 체내 및 체외에서 헤지호그 시그널링을 억제하는 신규화합물인 것을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명은 에보디아민(Evodiamine)을 유효성분으로 포함하는 피부노화 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, “에보디아민”은 다양한 식물에 포함되어 있는 퀴놀론계 알칼로이드로서, 공지된 방법으로 상기 식물체로부터 분리할 수 있다. 예를 들어, 에보디아민이 포함되어 있는 것으로 알려져 있는 오수유(Evodia rutaecarpa) 열매로부터 추출, 분리될 수 있다. 또한, 정제된 형태로서 상업적으로 판매되고 있는 에보디아민을 구입(Sigma, St. Louis, MO)하여 사용할 수 있다.

상기 에보디아민을 분리하는 방법으로서, 예를 들면 (ⅰ) 오수유 열매 분쇄물을 물로 열수추출하는 단계; (ⅱ) 상기 열수추출액에 클로로포름, 에틸아세테이트 및 부탄올을 순차적으로 분획하여 부탄올 분획물을 수득하는 단계; (ⅲ) 상기 수득된 부탄올 분획물을 농축하는 단계; 및 (ⅳ) 상기 농축된 농축액을 크로마토그래피로 정제하는 단계를 포함하여 수행할 수 있다.

또는, 잘게 자른 오수유에 물을 가하여 용해시킨 후 동량의 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올을 순차적으로 분획하여 추출을 3회 실시한다. 이렇게 얻어진 부탄올 분획물을 농축한 다음, 실리카 충진 컬럼을 통해 분리할 수 있다. 이때 사용된 용출용매는 제한적인 것은 아니나, 바람직하게는 클로로포름과 메탄올을 혼합하여 사용할 수 있는 것으로, 클로로포름:메탄올은 65~90:35~10의 농도 구배(gradient)로 사용할 수 있다.

상기 “피부노화”는 나이가 들어가면서 피부에 나타나게 되는 유형과 무형상의 변화를 의미한다. 피부 노화는 크게 두 가지 과정으로 일어난다. 특별한 환경적 요인 없이 세월의 흐름에 따라 누구에게나 일어나는 변화를 내인성 노화(intrinsic aging)라 하고, 햇볕과 같은 환경요인에 장기간 노출되어 얼굴, 목, 손등에 나타나는 변화를 광노화(photoaging)라고 한다. 내인성 노화의 주원인은 우리 몸의 대사과정에서 만들어진 반응성 활성산소라디칼에 의하여 우리 몸의 구성 성분에 생기는 손상이 누적되기 때문으로, 활성산소가 만들어진 후 몸속에 있는 여러 가지 보호 장치에 의하여 효과적으로 제거되지 못하게 되면 피부 손상이 초래된다. 피부 노화가 일어나면 피부의 상처 치유능력, 피부 면역기능, 비타민 D 합성능력 및 항산화 기능이 저하되고 피부 종양 발생이 증가하게 된다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 에보디아민은 아래 화학식을 갖는 약학 조성물 일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 에보디아민은 헤지호그 시그널링 이펙터(effector)인 GLI1 또는 GLI2의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물일 수 있다.

상기 “GLI”는 헤지호그 시그널링에서 전사 효과를 조절하는 단백질로, 세포의 운명 및 증식을 결정하고, 세포 배아 단계에서 다양한 종류의 세포와 대부분의 장기를 정형화(patterning)하는 데에도 관여하는 것으로 알려져 있다. GLI 전사 인자는 GLI를 담당하는 유전자와 결합하고, 전사복합체와 상호작용함으로써 전사를 촉진/억제 한다. GLI 전사 인자는 아연 집게(zinc finger) 도메인을 갖고 있어, 타겟 유전자에 대한 공통서열(consensus sequences)과 결합하여 전사를 촉진 또는 억제할 수 있다.

GLI1은 본래 신경교종(glioma tumour)으로부터 분리되었고, 근육, 뇌 및 기저세포암(BCC)과 같은 피부 종양 등 다양한 종류의 종양에서 많이 발견되었다. SHH와 GLI 유전자는 보통 모낭에서 발현되므로, 피부 종양에서 발현되는 GLI1은 모낭으로부터 유래할 수 있다.

사람의 케라티노사이트에서 GLI2의 활성화는 E2F1, CCND1, CDC2 및 CDC45L을 포함하는 세포 주기 진행과 관련된 다양한 유전자를 상향 조절한다. GLI2는 접촉 저지된(contact-inhibited) 케라티노사이트에서 G1-S기(phase)의 진행을 유도할 수 있다.

세포에 UVB가 조사될 경우 헤지호그 리간드가 과도하게 발현(over-expression)되고, 헤지호그 리간드는 Smo를 자극하여 GLI 단백질의 발현을 증가시킨다. 그러나, UVB 조사 전 에보디아민을 전처리할 경우, GLI 단백질의 수준은 UVB를 조사하기 전과 비슷하게 유지되었다.

상기 “헤지호그 리간드“는 헤지호그 시그널링에 관여하는 리간드를 의미하는 것으로 SHH(Sonic Hedgehog), DHH(Desert Hedgehog) 및 IHH(Indian Hedgehog)로 구성되어 있다(Briscoe J et al., Nat Rev Mol Cell Biol 2013: 14: 416-429).

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 에보디아민은 MMPs(Matrix Metalloproteinases)의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물일 수 있다.

상기 “MMPs”는 기질금속단백질분해효소(Matrix Metalloproteinases)를 의미하는 것으로, 세포의 기질을 분해하는 금속단백질분해효소의 총칭이다. 여러 종의 콜라게나아제, 젤라티나아제, 스토로멜라이신, 매트릴라이신 등이 들어 있다. MMP는 불활성한 효소로서 분비된 후 활성형으로 변환된다. 활성중심에는 아연이 존재하고, His-Glu-X-Gly-His-X-X-Gly-X-X-His라는 배열이 3개의 히스티딘 잔기와 결합하고 있다. 콜라겐 분해효소인 MMP1, 젤라틴 분해효소인 MMP2 및 MMP9가 있으며, 이들은 UVB에 의해 유도된 광노화에 관여할 수 있다(Kim M S et al., Photochem Photobiol 2013: 89: 911-918).

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 에보디아민은 TIMP1(Tissue inhibitor of metalloproteinase 1)의 발현을 촉진하는 것을 특징으로 하는 조성물일 수 있다.

상기 “TIMP1”은 Tissue inhibitor of metalloprotease를 의미하는 것으로, 동물세포의 기질금속단백질분해효소(MMPs)의 작용을 조절하는 내재성 억제제이다. 지금까지 TIMP1~4의 4종이 알려져 있는데, 모두 특징적인 12개의 시스테인을 포함하고 있다. 약 200개의 아미노산으로 구성되며 TIMP1에는 당사슬이 존재한다. TIMP1과 2는 많은 MMP의 활성부위에 결합하여 그들의 활성을 거의 비가역적으로 저해한다. 또한, TIMP1과 2는 각각 젤라티나아제B와 A전구체의 비활성부위에도 특이적으로 결합하고, 두 전구체의 활성화나 안정성을 조절한다. 또한 두 TIMP는 여러 가지 세포에 직접적으로 작용하여 증식촉진 활성을 나타낸다. 대부분의 배양세포는 두 가지의 TIMP를 분비하고 있다.

표피에 UVB를 조사하면, MMPs의 발현 촉진 및 TIMP의 발현 억제를 유발하고(Zaid M A et al., Photochem Photobiol 2007: 83: 882-888), MMPs 단백질이 증가하면, 피부에서 콜라겐 및 엘라스틴의 분해로 인한 피부 구조 손상 및 주름 형성을 초래한다(Kim S R et al., PLoS One 2013: 8: e73877). 또한, β-갈락톡시다제는 산성 조건에서 활성화 됨에도 불구하고, 노화-관련된 β-갈락톡시다제의 활성화는 부적당한 pH(pH6)에서도 검출되었다(Aliouat-Denis C M et al., Mol Cancer Res 2005: 3: 627-634). 이를 바탕으로 UVB 조사된 세포의 β-갈락톡시다제의 활성화를 관찰한 결과, UVB가 세포 노화를 촉진시키는 것을 확인할 수 있었으나, 에보디아민을 전처리할 경우 세포 노화 정도가 UVB 조사 전과 유사한 수준으로 유지되었다. 따라서, 세포에 UVB를 조사할 경우 MMPs의 발현을 촉진시키고 TIMP의 발현을 억제하여 세포 노화를 일으키는데, 이는 에보디아민의 전처리로 예방될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 피부노화는 자외선에 의한 광노화인 것을 특징으로 하는 조성물일 수 있다.

상기 “광노화”는 햇빛에 장기간 노출되어 얼굴, 목, 손등에 주름, 건조함, 색소침착 등이 나타나는 현상으로, 자외선 영역의 파장, 특히 UVB(290~320nm)가 주된 원인이다. 세월에 따라 나타나는 내인성 노화와 달리, 광노화는 내인성 노화에 비하여 변화의 정도가 심하고 나이보다 일찍부터 나타난다. 피부결이 거칠고 보다 더 건조하며 피부탄력은 현저하게 감소하여 처진 모습이나 깊은 피부주름, 자반과 피지선 과형성과 같은 병변도 흔히 관찰된다. 이러한 피부에서는 일광흑자(solar lentigo), 검버섯(seborrheic keratosis)과 같은 양성 종양 이외에 광선각화증 등과 같은 전암성 병변이나 편평세포암, 기저세포암과 같은 악성 변화소견이 나타나게 된다.

피부 세포에 UVB를 지속적으로 조사할 경우 주름이 발생하였고, 표피와 진피 모두 두께가 증가하였다. 뿐만 아니라 GLI1 및 GLI2의 발현 수준도 증가하였다. 하지만, UVB 조사 전 에보디아민을 국소적으로 전처리할 경우 상기 UVB 조사로 유발된 증상들 모두 UVB조사 전과 유사한 수준으로 회복시킬 수 있었다.

본 발명에 있어서, “약학적 조성물”은 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

상기 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 약제학적 조성물은 피부 외용제 조성물일 수 있다. 피부외용 약제학적 조성물은 자외선으로부터 피부보호 효과를 갖는 피부외용제로서 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제의 피부 외용제 형태의 약학조성물로 제조하여 사용할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.

또한 본 발명의 약학 조성물은 예방학적 또는 치료학적 유효량으로 투여될 수 있다. 투여량은 환자의 중증도, 연령, 성별, 체중, 약물에 대한 민감도, 현재 치료법의 종류, 투여 방법, 표적 세포 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 종래의 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 또한 단일 또는 다중 투여일 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 약학 조성물의 1일 투여량은 0.001-1000 mg/kg이다.

또한 상기 약학 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 국소 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 약학 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 에보디아민(Evodiamine)을 유효성분으로 포함하는 피부노화 방지용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지 크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 립스틱, 메이크업 베이스, 파운데이션, 프레스파우더, 루스파우더, 아이섀도로 이루어진 군에서 선택된 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물일 수 있다.

상기 “화장료 조성물”은 상기 에보디아민 뿐만 아니라, 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.

또한 에보디아민과 반응하여 피부노화 방지 효과를 손상시키지 않는 한도에서 종래부터 사용되어 오던 유기 자외선 차단제를 혼합하여 사용할 수도 있다.

상기 유기 자외선 차단제로는 글리세릴파바, 드로메트리졸트리실록산, 드로메트리졸, 디갈로일트리올리에이트, 디소듐페닐디벤즈이미다졸테트라설포네이트, 디에칠헥실부타미도트리아존, 디에칠아미노하이드록시벤조일헥실벤조에이트, 디이에이-메톡시신나메이트, 로우손과 디하이드록시아세톤의 혼합물, 메칠렌비스-벤조트리아졸릴테트라메칠부틸페놀, 4-메칠벤질리덴캠퍼, 멘틸안트라닐레이트, 벤조페논-3(옥시벤존),벤조페논-4, 벤조페논-8(디옥시페벤존), 부틸메톡시디벤조일메탄, 비스에칠헥실옥시페놀메톡시페닐트리아진, 시녹세이트, 에칠디하이드록시프로필파바, 옥토크릴렌, 에칠헥실디메칠파바, 에칠헥실메톡시신나메이트, 에칠헥실살리실레이트, 에칠헥실트리아존, 이소아밀-p-메톡시신나메이트, 폴리실리콘-15(디메치코디에칠벤잘말로네이트), 테레프탈릴리덴디캠퍼설포닉애씨드 및 그 염류, 티이에이-살리실레이트 및 아미노벤조익애씨드(파바)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 수렴화장수, 유연화장수, 영양화장수, 각종크림, 에센스, 팩, 파운데이션 등과 같은 화장품류와 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 미용액 등이 있을 수 있다.

또한, 본 발명은 a) 헤지호그 시그널링 리간드를 발현하는 세포를 준비하는 단계; b) 상기 세포에 후보물질을 처리하는 단계; 및 c) 상기 처리 후 헤지호그 시그널링 리간드의 작용이 억제되면, 상기 후보물질을 피부노화 억제제로서 판단하는 단계들을 포함하는 피부노화 억제제의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 a) 단계의 헤지호그 시그널링 리간드는 SHH(Sonic Hedgehog), DHH(Desert Hedgehog) 및 IHH(Indian Hedgehog)로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 피부노화 억제제의 스크리닝 방법일 수 있다.

세포에 UVB를 조사할 경우 헤지호그 시그널링이 촉진되어 피부 노화가 유발되는데, 본 발명에 따르면 에보디아민을 처리함으로써 헤지호그 시그널링을 억제하여 피부노화를 예방할 수 있다. 뿐만 아니라 에보디아민은 식물로부터 분리한 천연물로써 생체 내에서 세포독성을 거의 나타내지 않는다는 장점이 있다.

도 1 (a)는 정상 피부 및 편평상피암 피부에서의 SHH 발현을 온코마인 데이터베이스 (www.oncomine.org)를 사용하여 분석한 결과이다.
도 1 (b)는 UVB 조사에 따른 헤지호그 시그널링을 확인하기 위하여, UVB 조사 3시간 후, Smo 및 절단된 형태의 SHH 및 IHH의 단백질 수준을 웨스턴 블롯 분석을 통해 나타난 결과이다.
도 1 (c)는 정상적인 노화 과정에서 헤지호그 시그널링을 확인하기 위하여, 6개월령, 12개월령, 18개월령 및 24개월령의 SD 래트(n=5)의 피부 조직에서의 SHH 및 IHH mRNA수준을 qRT-PCR하여 분석한 결과이다.
도 1 (d 아래)는 헤지호그 시그널링을 조절하기 위한 후보물질을 선별하기 위하여, 천연물(에보디아민(Evo), 실리비닌, 람네틴. 시르실리올, NDGA, CAPE 및 커큐민)을 스크리닝한 결과이다.
도 1 (d 위)는 상기 스크리닝에 사용된 물질을 세포에 전처리 한 후 UVB를 조사하고, GLI1 및 GLI2의 mRNA 수준을 qRT-PCR법으로 분석한 결과이다.
도 1 (e)는 세포독성을 나타내지 않는 에보디아민의 용량을 결정하기 위해, 트리아조릴 블루 테트라졸리움 브로마이드 분석법(triazolyl blue tetrazolium bromide assay)으로 실험한 결과이다.
도 1 (f)는 UVB조사 및 에보디아민에 대한 헤지호그 시그널링을 확인하기 위하여, 웨스턴 블롯 분석한 결과이다. 튜블린 및 라민 B가 마커로 사용되었다.
도 2 (a)는 UVB에 의해 유도된 광노화에 대한 에보디아민의 효과를 확인하기 위하여, MMP1, MMP2, MMP9 및 TIMP1을 포함하는 광노화 마커의 단백질 수준을 웨스턴 블롯 분석한 결과이다.
도 2 (b)는 UVB에 의해 유도된 노화에서의 에보디아민의 억제 효과를 확인하기 위하여, 노화관련 β-갈락톡시다제 염색을 실시한 결과이다.
도 3 (a)는 마우스 모델에 UVB를 12주 동안 조사 한 후 등 피부의 에서의 주름 형성여부를 나타내는 결과이다.
도 3 (b 위)는 마우스의 등 피부의 파라핀 절편(section)을 만든 후, H&E 염색법으로 염색한 결과이다. 표피(E)와 진피(D)의 두께를 측정하였고(도 3 b 왼쪽 아래) 이러한 결과를 그래프로 나타내었다(도 3 b 오른쪽 아래).
도 3 (c)는 UVB 조사 후 GLI1 및 GLI2 단백질 발현을 측정하기 위하여 IHC 분석을 실시한 결과이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 조직샘플, 세포 배양 및 UVB 조사

6개월령, 12개월령, 18개월령 및 24개월령의 SD래트(Sprague Dawley)(n=5)의 피부 조직은 노화조직은행(Aging Tissue Bank, 부산대학교)에서 제공받아 사용하였다. HaCaT 세포(Cell line Service, Eppelheim, 독일)를 10% FBS 100U/mL 페니실린 및 100μg/mL의 스트렙토마이신을 포함한 DMEM 배지에서, 37℃, 95% air 5% CO₂조건에서 배양하였다.

동물세포배양배지(Dulbecco’s modified eagle medium, DMEM), 및 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS)은 깁코사(Gibco, Cambridge, MA)에서 구입하여 사용하였다.

UVB 처리 전, 80%정도로 세포로 채우고 FBS가 없는 배지에서 1시간 동안 유지시켰다. 그 다음, 세포를 인산완충식염수(Phosphate-buffered saline, PBS)로 세척하고, 디메틸설폭사이드(Dimethyl sulfoxide, DMSO)에 용해된 에보디아민을 첨가한 FBS가 없는 배지에서 배양한 후, 2시간 후에 UVB에 노출시켰다(50 J/m²). 290-320 nm, 조사 최대치 312nm의 UVB를 조사하는 BLE-8T312 전구(Spectronics Corp., Westbury, NY)를 사용하여 세포를 조사하였다. UVB 조사 세기는 포토테라피 라디오미터(phototherapy radiometer, International Light, Newburyport, MA)를 사용하여 측정하였다. UVB 처리 후, 배지는 새로운 것으로 교체하여 세포를 3시간 더 배양하였다.

< 실시예 2> 웨스턴 블롯 분석

웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)은 공지된 방법에 따라 수행하였다(Kim W et al., Radiat Res 2011: 176: 539-552).

전체 세포 용해물(Whole cell lysates, WCL)은 용해 버퍼(50mM Tris, pH7.4, 150mM NaCl, 1% Triton X-100, 25mM NaF, 1mM DTT, 20mM EGTA, 1mM Na₃VO₄, 0.3mM PMSF 및 5U/mL 아프로티닌)를 사용하여 준비하였다. 세포질/핵 추출물(CE/NE)을 얻기 위하여, 세포는 버퍼 A(10mM HEPES, pH 7.9, 50mM NaCl, 1mM DTT, 0.1mM EDTA, 1mM PMSF, 1μg/mL 아프로티닌, 5μg/mL 류펩틴 및 1μg/mL 펩스타틴 A)로 얼음 위에서 20분간 평형화(equilibrated) 하였다. 그리고는, 버퍼 B(0.1% NP-40을 포함한 버퍼 A)를 첨가하였고, 얼음 위에서 추가로 20분간 배양하였다. 원심분리한 후, 상청액(CE)을 수집하고 핵 펠렛은 버퍼 A로 2회 세척하고 버퍼 C(10mM HEPES, pH7.9, 400mM NaCl, 1mM DTT, 1mM EDTA 및 1mM EGTA)에서 재부유 상태(resuspended)가 되도록 하였다. 이를 12,000g로 4℃에서 15분간 원심분리 시켜 핵 추출물(NE)을 얻었다. WCL 또는 CE/NE에 포함된 단백질을 SDS-PAGE로 처리하고 니트로섬유소막으로 이동시켰다. 단백질을 포함하는 니트로섬유소 막을 5% 탈지우유가 첨가된 TBST(10mM Tris, 100mM NaCl 및 0.1% Tween 20)로 상온에서 1시간 동안 블로킹(blocking) 시킨 후, 1차 항체로 4℃에서 하루 동안 배양시켰다. 그 후 겨자무과산화효소(horseradish peroxidase, HRP)-컨쥬게이트된 2차 항체(Santa Cruz Biotechnology, Santa cruz, CA)와 같이 배양하고, 항체결합은 ECL 감지 시스템(ECL detection system, Roche Applied Science, Indianapolis, IN)을 사용하여 시각적으로 확인하였다.

<실시예 3> 실시간 정량 RT-PCR(qRT-PCR)

헤지호그 시그널링 관련 유전자의 표현 정도를 공지된 qRT-PCR법을 이용하여 측정하였다(Yang H J et al., J Biol Chem 2013: 288: 2965-2975).

반응물질과 프라이머(표 1)의 혼합물은 실시간 PCR 플레이트에 도포하고(Applied Biosystems, Foster City, CA), 모든 PCR 시약을 포함하고 있는 SYBR Green core reagent kit(Applied Biosystems) 및 Applied Biosystems-7900 HT 기기를 사용하여 qRT-PCR을 수행하였다. PCR은 95℃에서 15초, 60℃에서 1분 동안 처리하는 것을 40회 반복하는 단계로 구성하였다. GAPDH에 대한 각각의 유전자 발현은 2^-△CT법을 사용하여 측정하였다(Livak K J et al., Methods 2001: 25: 402-408). 데이터 표현을 간단하게 하기 위하여, 관련된 발현 값은 10²을 곱한 값으로 나타내었다.

<실시예 4> 세포 활성도 실험

세포활성도 실험(Cell viability assay)은 공지된 방법에 따라 수행하였다(Kim W et al., J Radiat Res 2010: 51: 285-296).

HaCaT 세포를 다른 농도의 에보디아민을 포함하거나, 포함하지 않은 24-웰 플레이트에서 2시간 동안 배양하였다. 배지를 제거한 후, 0.05%의 싸이아조릴 블루 테트라졸리움 브로마이드 용액(thiazolyl blue tetrazolium bromide solution, Sigma, St. Louis, MO)을 추가하고, 세포를 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 다음으로 사이아조릴 블루 테트라졸리움 브로마이드 용액은 DMSO로 교체하고 10분 동안 배양하였다. 배양 후 용액은 96-웰 플레이트에 2통으로 옮겼고, 흡광도를 570nm에서 측정하였다.

<실시예 5> 노화 관련 β-갈락토시다아제 염색

세포 노화는 공지된 방법에 따라 pH 6.0에서 β-갈락톡시다제의 활성을 관찰하여 측정하였다(Aliouat-Denis C M et al., Mol Cancer Res 2005: 3: 627-634). 에보디아민 처리 및 UVB조사 이후 세포를 PBS로 세척하고 상온에서 0.2% 글루타르알데히드 및 2% 포름알데이드로 고정시켰다. 그 후 다시 PBS로 세척하고, 37℃에서 1mg/mL X-gal(Duchefa, Haarlem, The Netherlands)를 포함하는 pH 6.0의 노화 관련 β-갈락토시다아제 염색 용액(40mM 구연산, 40mM H₂NaPO₄2H₂O, 5mM K₄Fe(CN)₆3H₂O), 5mM K₃Fe(CN)₆, 2mM MgCl₂ 및 150mM NaCl)에서 하룻밤 동안 배양시키고, 올림푸스 Ⅸ71현미경(Olympus Optical Co. Ltd., Tokyo, Japan)으로 관찰하였다.

<실시예 6> 동물 실험 프로토콜

실험동물은 공지된 방법에 따라 처리하였다(Kim E et al., Cancer Res 2014: 74: 5520-5531).

6주령의 흉선이 없는 수컷 BALB/c 마우스(Central Lab Animals Inc., Seoul., South Korea)를 생체 내(in vivo) 실험에 사용하였다. 프로토콜은 부산대학교 동물 사용 위원회의 승인을 받고, 실험동물사용을 위한 NIH에서 제공하는 가이드에 따라 수행하였다. 마우스는 개별로 또는 최대 5마리의 그룹으로 무균 케이지에서 사육되었다. 마우스는 상온(23±1℃)으로 조절되고, 12시간의 낮/밤 주기가 유지된 동물 케어 시설에서, 연구 전 1주 동안 격리되었다. 물과 표준 마우스 식사를 무제한(ad libitum)으로 급여하였다. 생체 내 광노화 실험을 위하여, 마우스의 등(등 피부)에 UVB를 일주일에 3번씩 12주 동안 조사하였다. 조사량은 1주 당 60mJ/cm²에서(홍반이 나타나는 최소 조사량 = 60mJ/cm²) 1주 당 120mJ/cm²까지 7주 동안 매주 점진적으로 증가시켰다.

<실시예 7> 헤모톡실린 및 이오신(H&E) 염색 및 면역화학분석(IHC)

마우스는 실험적인 처리(에보디아민 처리 및 UVB 조사) 후 희생시켰고, 4mm 두께로 잘라 포르말린으로 처리한 후, 재수화(rehydrate)되기 전에 파라핀에 고정시켜 절편을 제작하였다. H&E 염색을 위하여, 절편을 헤모톡실린 및 이오신에서 배양하였다. IHC처리를 위하여, 절편을 3%의 과산화수소/메탄올 용액에서 배양하였다. 0.25%의 펩신(Dako, Carpinteria, CA)에서 배양함으로써 항원회복(Antigen retrieval) 시켰다. 이후 절편을 블로킹 솔루션(DaKo)안에서 블로킹(blocking)시켰고, 1차 항체(Abchem, Cambridge, UK)와 함께 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. TBST로 세척 후, 절편을 폴리머-HRP-컨쥬게이트된 2차 항체(Dako)와 함께 배양하였다. 헤모톡실린 염색 및 청분(1% HCl 70% 에탄올)시킨 후, 3.3'-diaminobenzidine substrate Chromogen System(Dako)를 사용하여 항체 결합을 탐지하였고 염색된 부분은 Olympus Ⅸ71 현미경(Olympus Optical Co., Ltd., Tokyo, Japan)을 사용하여 검토하였다.

<실시예 8> 통계적 분석

모든 수치 데이터는 최소 3번의 독립된 실험을 반복한 후 평균±표준편차로 나타내었다. Tukey’s honestly significant difference test에 따라 one-way ANOVA를 사용하여 분석하였다. 프리즘 4 소프트웨어(Graphpad software, SanDiego, CA)는 모든 통계 분석을 수행하기 위하여 사용되었다. p-값<0.05인 것을 통계적 유의성이 있는 것으로 간주하였다.

<실험결과 1> UVB 노출로 인한 헤지호그 시그널링 변화 관찰

1.1 피부종양 발생과 헤지호그 시그널링의 관련성 확인

헤지호그 시그널링은 피부에서 종양의 발생 및 성장에 있어 중요한 역할을 한다(Epstein J H, J Am Acad Dermatol 1983: 9: 487-502). 이에 근거하여, 정상 피부 및 편평상피암 피부에서의 SHH(가장 대표적인 헤지호그 리간드)의 발현을 온코마인 데이터베이스 (www.oncomine.org)를 사용하여 분석하였다. 그 결과 정상 세포에서보다 편평상피암 피부에서 더 높은 SHH 발현이 나타나는 것을 확인하였다(도 1a 참조).

1.2 UVB노출과 헤지호그 시그널링 관련성 확인

UVB 노출로 인한 헤지호그 시그널링 경로(pathway)의 변화를 관찰하기 위하여, UVB 조사 후 HaCaT 세포에서의 헤지호그 리간드와 Smo의 발현을 측정하였다. 도 1b에서 나타난 바와 같이, Smo, SHH 및 IHH의 단백질 수준은 투여량에 비례하여 증가하였다. 뿐만 아니라, UVB 조사에 의해 GLI1 및 GLI2의 단백질 발현이 유도되었다(도 1d 참조).

Smo, SHH 및 IHH에 특이적인 항체는 산타 크루즈 바이오테크놀로지사(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)에서 구입하여 사용하였다.

1.3 헤지호그 시그널링과 일반적인 피부노화와의 연관성 확인

다음으로 헤지호그 시그널링이 일반적인 노화작용과 관련이 있는지 확인하기 위해 연령에 따른 SD 래트의 피부 조직에서 SHH 및 IHH의 mRNA 수준을 측정하였다. 두 개의 헤지호그 리간드 모두 mRNA 수준은 6개월령에서 18개월령의 래트까지 증가했고 24개월령의 래트에서는 눈에 띄게 감소하였다(도 1c 참조). 따라서 헤지호그 시그널링은 일반적인 노화와는 직접적으로 관련되지 않는다는 것을 확인 할 수 있다.

1.4 헤지호그 시그널링 억제 물질 스크리닝

다양한 천연물이 여러 암 세포 라인에서 이상반응 없이 시그널링 전달 경로를 조절하는 것으로 알려져 있기 때문에(Mann J, Nat Rev Cancer 2002: 2: 143-148, Kim W et al., Exp Mol Med 2011: 43: 323-333), 여러 천연물을 스크리닝의 후보물질로 선정하였다. 헤지호그 시그널링 경로에 관여하는 요소에 대한 발현 효과에 근거하여, 10개 이하의 후보물질이 선정되었고, 용해도와 분자량을 바탕으로 리핀스키-유사 기준(Lipinski-like criteria)에 따라 분석하였다(Kang J et al., J Biol Chem 2013: 288: 27343-27357, Kim W et al., Pharmacol Res 2013: 7: 90-101). 그 결과, 퀴놀론계 알칼로이드 중 하나인 에보디아민을 헤지호그 시그널링을 조절할 수 있는 물질로 선별하였다(도 1d 참조).

후보물질인 에보디아민(Evodiamine), 실리비닌(Silibinin), 람네틴(Rhamnetin), 시르실리올(Cirsiliol), 노르디히드로구아이아레트산(Nordihydroguaiaretic acid, NDGA), 카페익산 페네틸 에스테르(Caffeic acid phenethyl ester, CAPE) 및 커큐민(Curcumin)은 시그마사(Sigma, St. Louis, MO)에서 구입하여 사용하였다.

1.5 에보디아민의 세포활성 실험

세포 생존에 영향을 미치지 않고 사용될 수 있는 에보디아민의 농도를 결정하기 위하여, HaCaT 세포에 다른 농도의 에보디아민으로 처리하였다(도 1e 참조). 그 결과, 에보디아민의 농도가 5μM일 때 까지는 세포 생존에 영항을 미치지 않는다는 것을 확인하였다.

1.6 에보디아민의 헤지호그 시그널링 억제효과 확인

에보디아민이 헤지호그 시그널링 경로를 조절하는지 여부를 확인하기 위해, 헤지호그 시그널링의 마지막 반응자인 GLI 및 GLI2의 발현을 측정하였다. 그 결과 에보디아민은 UVB에 의해 유도된 GLI1 및 GLI2의 발현을 억제하는 것을 확인하였다(도 1f 참조). 따라서 에보디아민은 헤지호그 시그널링을 억제하는 효과가 있다고 할 수 있다.

즉, 일반적인 노화와 달리 UVB에 의해 유도된 광노화는 헤지호그 시그널링과 밀접한 관계가 있다. UVB에 노출될 경우 헤지호그 리간드 및 GLI 단백질의 수준이 증가하는데, 이러한 현상은 에보디아민 전처리로 억제할 수 있다.

<실험결과 2> UVB 조사에 따른 피부 노화 및 이에 대한 에보디아민의 효과

2.1 MMPs 및 TIMP1의 발현에 대한 에보디아민의 효과 확인

UVB에 의해 유도된 광노화는 MMP 발현의 증가 및 이에 따른 콜라겐의 분해 활성화에 영향을 받는 것으로 알려져 있다(Jiang J et al., Molecules 2009: 14: 1852-1859). MMP 발현에 대한 UVB의 효과를 확인하기 위하여, 광노화와 관련된 MMPs 수준의 변화를 측정하였다. 그 결과, MMP1, MMP2 및 MMP9의 세 개의 MMPs의 발현은 UVB 조사에 따라 증가하였고, MMPs의 세포 억제자인 TIMP1의 발현은 UVB 노출에 따라 감소하였다. 반면, 에보디아민을 처리할 경우 반대로 MMPs의 발현은 감소하고 TIMP1의 발현은 증가하는 것을 확인하였다(도 2a 참조).

MMP1, MMP2, MMP9 및 금속단백질분해효소 조직억제제(Tissue inhibitor of metalloproteinase 1, TIMP1)에 특이적인 항체는 산타 크루즈 바이오테크놀로지사(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)에서 구입하여 사용하였다.

2.2 세포 노화에 대한 에보디아민의 효과 확인

다음으로 노화 관련된 β-갈락토시다제 염색으로 세포 노화에 대하여 분석하였다. β-갈락톡시다제는 산성 조건에서 활성화 됨에도 불구하고, 노화-관련된 β-갈락톡시다제의 활성화는 부적당한 pH(pH6)에서도 검출되었다(Aliouat-Denis C M et al., Mol Cancer Res 2005: 3: 627-634). 그러므로 X-gal 염색으로 pH6에서 노화-관련된 β-갈락톡시다제의 활성화 여부를 관찰함으로써 세포 노화를 확인할 수 있다. 이에 근거하여 UVB 조사 후 β-갈락톡시다제의 활성화를 관찰하였다. 그 결과, UVB 조사는 세포 노화를 매우 촉진시켰으나, 에보디아민을 전처리할 경우 회복되는 것을 확인할 수 있었다(도 3b 참조).

즉, 에보디아민은 MMPs의 발현을 억제하고 TIMP의 발현은 증가시킴으로써 UVB에 의해 유도된 피부의 노화를 예방한다고 할 수 있다.

<실험결과 3> UVB에 의해 유도된 광노화에 대한 에보디아민의 효과(in vivo)

3.1 UVB 조사에 따른 주름형성에 대한 에보디아민의 효과

생체 내 환경(in vivo)에서 헤지호그 시그널링과 광노화의 관계를 확인하기 위하여, 광노화 마우스 모델을 설계하였다. 털이 없는 마우스에게 12주 동안(일주일에 3회) UVB를 조사하였고, 그 동안 조사량은 60mJ/cm²에서 120mJ/cm²까지 매주 10mJ/cm²씩 증가시켰다. 12주 동안 UVB를 조사한 결과, 등 피부에서 주름이 형성되었으나, 주름 형성은 UVB 조사 전 국소적으로 에보디아민을 처리하였을 경우 억제되었다(도 3a 참조).

3.2 UVB 조사에 따른 피부 두께 증가에 대한 에보디아민의 효과

도 3b에서 확인할 수 있듯이, 표피와 진피 모두 UVB 조사로 두께가 증가되었으나, 에보디아민을 국소적으로 처리할 경우 UVB를 조사하지 않았을 때와 비슷한 두께를 유지할 수 있었다.

3.3 UVB 조사에 따른 GLI 단백질 발현에 대한 에보디아민의 효과

UVB 조사에 따른 단백질 발현을 측정하기 위하여 IHC 분석을 실시하였다. 그 결과, 생체 환경에서 GLI1 및 GLI2의 수준은 광노화된 피부에서 증가하였으나, 에보디아민을 전처리할 경우 GLI 단백질의 발현 수준이 UVB를 조사하지 않았을 때와 비슷한 수준으로 유지되었다(도 3c참조).

즉, UVB에 노출되면 헤지호그 시그널링을 촉진시켜 광노화를 유발하는데, 에보디아민을 전처리할 경우 헤지호그 시그널링을 억제함으로써 광노화를 예방할 수 있다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

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하기 단계들을 포함하는 피부 광노화 억제제의 스크리닝 방법:
a) 헤지호그 시그널링 리간드를 발현하는 세포를 준비하는 단계;
b) 상기 세포에 후보물질을 처리하는 단계;
c) 상기 처리 후 헤지호그 시그널링 리간드의 작용이 억제되면, 상기 후보물질을 피부 광노화 억제제로서 판단하는 단계.
제8항에 있어서, 상기 a) 단계의 헤지호그 시그널링 리간드는 SHH(Sonic Hedgehog), DHH(Desert Hedgehog) 및 IHH(Indian Hedgehog)로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 피부 광노화 억제제의 스크리닝 방법.