KR101674874B1 - 항암제 내성 예측용 바이오마커로서의 ｉｃａｍ－３ 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항암제(anticancer agents) 내성 예측용 바이오마커(biomarker) 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 ICAM-3(intercellular adhesion molecule-3)를 이용하여 항암제 내성 여부를 예측할 수 있는 방법 및 이에 사용되는 바이오마커 및 진단용 키트(kit)에 관한 것이다. 본 발명의 방법, 바이오마커 및 키트는 항암제 치료를 받은 환자의 항암제에 대한 내성 발생 여부를 신속히 예측할 수 있으므로, 임상의에 의한 향후 치료의 효과적인 프로토콜을 계획 및 수행하는데 관한 정확한 기초 정보를 제공할 수 있다.

Description

항암제 내성 예측용 바이오마커로서의 ＩＣＡＭ－３ 및 이의 용도{ICAM-3 AS BIOMARKER FOR THE PREDICTION OF RESISTANCE AGAINST ANTICANCER AGENTS AND USE THEREOF}

본 발명은 항암제(anticancer agents) 내성 예측용 바이오마커(biomarker) 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 ICAM-3(intercellular adhesion molecule-3)를 이용하여 항암제 내성 여부를 예측할 수 있는 방법 및 이에 사용되는 바이오마커 및 진단용 키트(kit)에 관한 것이다.

암은 전 세계적으로 주요한 사망 원인 중의 하나이며, 주요한 치료 방법은 외과적 수술, 항암제 처방 및 방사선 치료의 3가지 방법이 있다. 그러나, 이들 주요한 치료 방법 중 방사선 및 항암제 치료에 대해 암은 내성을 지니게 되는 경우가 많으며, 이는 재발 및 전이를 유발하여 암환자를 죽음에 이르게 한다.

암의 내성 형성에 관하여 여러 가지 이론이 있으나, Meads 등은 Environment-mediated drug resistance 이론을 주창하였다(Meads et al ., Nat. Rev. Cancer 9 (2009) 665~74). 이 이론에 따르면 치료시 민감한 암세포는 세포사멸(apoptosis)을 통하여 사멸하는데 반하여, 암세포를 둘러싸고 있는 미세 환경 요인에 의한 새로운 내성 기전을 통하여 생존함으로써 후천적인 내성을 획득한다는 이론이다(도 1).

따라서, 암의 효과적인 치료를 위하여, 방사선 및 항암제에 의한 치료에 대한 내성에 관한 심도있는 연구가 암의 정복에 무엇보다도 중요한 화두가 되고 있는 현실이다.

KR 10-2013-7003284 A

본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 항암제 치료를 받은 환자가 항암제에 대한 내성 획득 여부를 신속하게 예측 및 판단할 수 있는 효과적인 방법을 제공하며, 상기 방법에 사용되는 항암제 내성 예측용 바이오마커 및 키트를 제공하고자 하는 것이다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 항암제가 처리된 암 환자로부터 분리된 암세포의 ICAM-3의 발현량을 측정하고, 항암제 처리 전의 암 환자로부터 분리된 암세포로부터 측정된 ICAM-3의 발현량과 비교하여, 항암제 처리 후의 암 환자로부터 분리된 암세포로부터 측정된 ICAM-3의 발현량이 증가하는 경우에, 항암제에 대한 내성이 발생할 가능성이 존재하는 것으로 판단하는, 항암제 내성 예측을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.

상기 항암제는 파클리탁셀(paclitaxel) 또는 빈크리스틴(vincristine)인 것이 바람직하다.

상기 암세포는 폐암세포 또는 자궁경부암세포인 것이 바람직하다.

상기 ICAM-3의 발현량 측정은 mRNA 또는 단백질의 양을 측정하는 것이 바람직하다.

상기 mRNA 양의 측정은 RT-PCR(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 노던 블라팅(northern blotting) 또는 핵산 마이크로어레이(nucleotide microarray)에 의한 측정인 것이 바람직하다.

상기 단백질 양의 측정은 항원-항체 반응에 의한 측정인 것이 바람직하다.

상기 항원-항체 반응에 의한 측정은 웨스턴 블라팅(western bltting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), RIA(radioimmunoassay), 면역조직화학(immunohistochemistry) 또는 단백질 마이크로어레이(protein microarray) 또는 앱타머(aptamer)에 의한 검출인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 ICAM-3를 포함하는 항암제 내성 예측용 바이오마커를 제공한다.

상기 ICAM-3는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 핵산인 것이 바람직하다.

상기 ICAM-3는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 ICAM-3의 발현량을 측정할 수 있는 수단을 포함하는 항암제 내성 예측용 키트를 제공한다.

상기 수단은 프라이머(primer), 프로브(probe), 항체(antibody), 항체 단편(antibody fragment), 마이크로어레이(microarray) 및 앱타머로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.

본 발명의 방법, 바이오마커 및 키트는 항암제 치료를 받은 환자의 항암제에 대한 내성 발생 여부를 신속히 예측할 수 있으므로, 임상의에 의한 향후 치료의 효과적인 프로토콜을 계획 및 수행하는데 관한 정확한 기초 정보를 제공할 수 있다.

도 1은 항암 치료에 대한 내성 발생을 모식적으로 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 실시예에서 사용된 항암제인 파클리탁셀과 빈크리스틴의 화학구조를 나타낸 것이다.
도 3은 세포사멸을 억제하는 ICAM-3의 항암제 내성 부여 효과를 설명하는 도면이다.
도 4는 ICAM-3의 항암제 내성 부여 효과가 Akt 및 ERK의 활성화에 의한 것임을 보여주는 도면이다.
도 5는 CREB2의 활성화가 ICAM-3의 항암제 내성 부여 효과에 영향을 미침을 보여주는 도면이다.
도 6은 H460 암세포와 방사선 내성주에서의 ICAM-3-Akt/ERK-CREB2의 활성화에 의한 항암제 내성 기작을 설명하는 도면이다.
도 7은 마우스의 종양 이식체 모델에서의 ICAM-3 항암제 내성 부여 효과를 보여주는 도면이다.
도 8은 ICAM-8의 암세포 내에서의 다양한 기능을 모식적으로 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

ICAM-3는 본 발명의 발명자가 참여한 종래의 연구에서 방사선 내성을 부여하는 유전자로 분석되어졌으며, 또한, 이 유전자는 본 발명의 발명자에 의하여 암세포의 침윤성 및 전이성을 증가시키는 기능 역시 가진 것으로 규명되었다. 따라서, 본 발명의 발명자는 이와 같은 기능이 밝혀진 ICAM-3 유전자는 방사선치료 전이 유발에 대한 중요한 단서를 제공할 수 있는 후보 유전자로 추정하였으며, 본 발명에서는 방사선에 대한 내성 이외에 항암제에 대해서도 내성을 지니고 있는지에 대한 연구를 진행하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 항암제가 처리된 암 환자로부터 분리된 암세포의 ICAM-3 의 발현량을 측정하고, 항암제 처리 전의 암 환자로부터 분리된 암세포로부터 측정된 ICAM-3의 발현량과 비교하여, 항암제 처리 후의 암 환자로부터 분리된 암세포로부터 측정된 ICAM-3의 발현량이 증가하는 경우에, 항암제에 대한 내성이 발생할 가능성이 존재하는 것으로 판단하는, 항암제 내성 예측을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.

바람직한 구체예로서, 본 발명의 항암제 내성 예측을 위한 정보 제공 방법은 다음의 단계들을 포함할 수 있다:

암 환자로부터 분리된 암세포 조직으로부터 시료를 준비하고, 상기 시료로부터 ICAM-3 발현량을 측정하는 제 1단계;

항암제를 투여한 암 환자로부터 분리된 암세포 조직으로부터 시료를 준비하고, 상기 시료로부터 ICAM-3 발현량을 측정하는 제 2단계;

상기 제 1단계의 결과와 상기 제 2단계의 결과를 비교하는 단계;

상기 비교를 통하여 상기 제 1단계의 ICAM-3 발현량보다 상기 제 2단계의 ICAM-3 발현량이 증가된 경우, 항암제 내성 가능성이 높은 것으로 판단하기 위한 정보를 제공하는 단계.

상기 항암제는 도 2에 표시된 파클리탁셀(paclitaxel) 또는 빈크리스틴(vincristine)인 것이 바람직하다.

상기 암세포는 폐암세포 또는 자궁경부암세포인 것이 바람직하다.

상기 ICAM-3의 발현량 측정은 mRNA 또는 단백질의 양을 측정하는 것이 바람직하다.

상기 mRNA 양의 측정은 RT-PCR(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 노던 블라팅(northern blotting) 또는 핵산 마이크로어레이(nucleotide microarray)에 의한 측정인 것이 바람직하다.

상기 단백질 양의 측정은 항원-항체 반응에 의한 측정인 것이 바람직하다.

상기 항원-항체 반응에 의한 측정은 웨스턴 블라팅, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), RIA(radioimmunoassay), 면역조직화학(immunohistochemistry) 또는 단백질 마이크로어레이(protein microarray) 또는 앱타머(aptamer)에 의한 검출인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 ICAM-3를 포함하는 항암제 내성 예측용 바이오마커를 제공한다.

본 발명의 상기 바이오마커는 항암제 내성의 예측을 목적으로 하는 분자 표지를 의미한다. 상기 바이오마커로 사용되는 ICAM-3는 서열번호 1로 표시되는 염기 서열을 갖는 핵산 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질일 수 있다. 또한, 상기 서열번호 1의 염기 서열 또는 서열번호 2의 아미노산 서열과 70%, 바람직하게는 80%, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 갖는 임의의 염기 서열 또는 아미노산 서열일 수도 있다.

또한, 본 발명은 ICAM-3의 발현량을 측정할 수 있는 수단을 포함하는 항암제 내성 예측용 키트를 제공한다.

상기 "ICAM-3"는 앞서 설명된 본 발명의 바이오마커에 대한 내용과 동일한 의미이다.

상기 "ICAM-3의 발현량"이라 함은 ICAM-3의 mRNA 발현량 또는 단백질 발현량을 의미한다.

상기 수단은 공지된 분자생물학적 수단 또는 면역화학적 수단일 수 있다.

바람직한 구체예로서, 상기 수단은 프라이머, 프로브, 항체, 항체 단편, 마이크로어레이 및 앱타머로 이루어지는 군으로부터 선택되는 측정 수단일 수 있다. 여기에서, 프라이머, 프로브 또는 핵산 마이크로어레이는 mRNA의 발현량을 측정하는 수단에 해당하고, 항체, 항체 단편, 단백질 마이크로어레이 또는 앱타머는 단백질의 발현량을 측정하는 수단에 해당한다.

상기 "프라이머"는 적합한 온도 및 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있을 수 있다. 또한, 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서, 본 발명에서의 프라이머는 주형인 ICAM-3 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다.

상기 "프로브"는 천연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타켓 뉴클레오타이드인 ICAM-3의 염기 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것을 말한다. 본 발명에 따른 프로브는 단일쇄일 수 있으며, 바람직하게는 올리고디옥시리보뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 프로브는 자연 dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 프로브는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 프로브는 골격 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대, 펩타이드 핵산(PNA)(M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드, 예컨대, C-5 치환된 피리미딘(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 등 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 등 포함), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.

상기 "항체"는 상기 ICAM-3 단백질에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 다클론 항체, 단일클론 항체 및 재조합 항체 등을 포함할 수 있다.

상기 항체는 상업적으로 구입하여 사용할 수 있으며, 상기 기술한 바와 같이 ICAM-3 단백질의 아미노산 서열이 공지되어 있으므로, 상기 아미노산 서열을 이용하여 항체를 직접 제조하여 사용할 수도 있다.

항체 제조 방법은 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에 공지된 다양한 항체 생산 기술을 이용할 수 있으며, 예컨대, 다클론 항체의 경우에는 ICAM-3 항원을 동물에 주사하고, 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있으며, 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조가능하다. 단일클론 항체의 경우에는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마(hybridoma) 방법(Kohler et al., European Jounral of Immunology, 6, 511-519, 1976)을 이용하여 제조할 수 있거나 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352, 624-628, 1991, Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조할 수 있다.

상기 "항체 단편"은 항체 분자의 기능적인 단편을 의미하며, 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 항체 단편으로서, 예를 들어, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.

상기 "마이크로어레이"는, 예를 들어 ICAM-3 유전자를 검출하기 위한 핵산 마이크로어레이 또는 ICAM-3 단백질을 검출하기 위한 단백질 마이크로어레이일 수 있다.

본 발명의 마이크로어레이는 ICAM-3 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기질(substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기질은 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함할 수 있다. 상기 혼성화 어레이 요소는 상기 기질 상에 배열되고 고정화되며, 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기질에 결합될 수 있다.

상기 "앱타머"는 ICAM-3 단백질에 친화성을 갖는 핵산 올리고머를 의미한다. 상기 앱타머는 무작위적으로 합성된 약 60염기로 이루어지는 DNA 올리고머를 합성하고, 이들 중에서 ICAM-3 단백질과 결합하는 DNA 올리고머를 친화성 컬럼으로 분리하고, 이를 증폭 및 상기 분리 과정을 반복하여 ICAM-3에 친화성을 갖는 앱타머를 제조할 수 있다.

본 발명의 항암제 내성 예측용 키트는 ICAM-3 유전자 검출용 또는 ICAM-3 단백질 검출용일 수 있다.

본 발명의 항암제 내성 예측용 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 유전자 증폭용인 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있으며, 본 발명의 항암제 내성 예측용 키트가 면역 분석에 적용되는 ICAM-3 단백질 검출용인 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, 이차항체 및 표지의 기질을 포함할 수 있다. 나아가, 본 발명에 따른 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

이하에서는, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

[ 실시예 ]

본 실시예에 사용된 구체적인 방법들은 앞선 비특허문헌 및 본 발명의 발명자에 의하여 공개된 Biochemical and Biophysical Research Communications 441 (2013) 507-513에 상세하게 기술되어 있으며, 상기 문헌들의 내용은 전체로서 본 명세서에 통합된다.

1. 세포사멸을 억제하는 ICAM -3의 항암제 내성 부여 효과

ICAM-3가 항암제에 대한 암세포의 내성을 증가시키는지 관찰하기 위하여, 비소세포성 암세포주인 NCI-H1299에 ICAM-3를 과발현시켜 NCI-H1299/ICAM-3 세포주를 구축하였으며(도 3의 A), 이 세포주를 대상으로 프로피디움 아이오다이드 흡수(propidium iodide(PI) uptake) 방법을 통하여 항암제 처리 후, 세포 사멸을 측정하였다(도 3의 B). 항암제로는 세포의 마이크로튜블(microtubule)을 표적으로 하는 항암제인 탁솔의 유도체인 파클리탁셀과 빈크리스틴 2가지가 이용되었다(도 1의 A 및 B). 본 항암제들은 폐암의 치료에 사용되는 항암제들 중의 하나이며, 암세포와 같이 활발하게 증식하는 세포 내의 마이크로튜블의 합성 및 분해 과정을 차단함으로써 세포의 사멸을 유도하는 항암제이다. 항암제 처리 후 96시간 경과 후, NCI-H1299/ICAM-3 세포주에서는 30% 이상의 세포 사멸 억제 효과를 보였으며, PI 흡수(uptake)가 여러 가지 세포사멸 기전 중 세포사멸을 측정할 수 있는 방법이란 데에 착안하여, 웨스턴 블라팅으로 항암제 처리 후 세포 내 세포사멸 관련 분자들의 변화를 측정하였다(도 3의 C). 도 3의 C에 나타난 바와 같이, 항암제 처리에 의한 캐스파제(caspase)-3, 8, 9의 활성화가 NCI-H1299/ICAM-3 세포주의 경우 대조군 보다 적게 나타났음을 확인할 수 있다. 또한, 본 실험의 결과 ICAM-3가 세포사멸의 2가지 경로인 외인성 경로(extrinsic pathway)와 내인성 경로(intrinsic pathway)의 시작 캐스파제인 캐스파제-8과 9의 활성화를 동시에 억제시키고 있으며, 두 가지 경로의 공동적인 실행(executioner) 캐스파제인 캐스파제-3의 활성화 역시 억제하고 있는 것으로 확인하였다. 또한, 세포사멸의 지시자(indicator) 중의 하나로 나타나고 있는 PARP의 활성화(cleavage) 역시 ICAM-3 과발현에 의하여 억제되어지고 있으며, 항-세포사멸의 기능을 지니고 있는 Bcl-2, Bcl-X_L, Mcl-1 역시 항암제 처리에 의한 발현 감소가 ICAM-3에 의하여 억제되고 있는 것을 관찰하였다. 도 3의 D에서는 세포사멸을 혈구계(hematocytometer)를 이용하여 육안으로 세포의 사멸 양상을 관찰한 결과를 나타내고 있다. 표에 나타난 바와 같이, ICAM-3의 과발현 세포주에서 30% 이상의 세포사멸 감소를 관찰할 수 있었다. 파클리탁셀과 빈크리스리스틴의 처리에 의한 세포사멸 억제가 ICAM-3에 의한 세포사멸 억제의 주요한 기전인지를 확인하기 위하여, pan-캐스파제 저해제(inhibitor)인 zVAD-fmk의 처리후 세포 사멸을 PI 흡수 방법을 통하여 수행하였다. zVAD-fmk의 처리로 캐스파제의 활성화를 억제한 후 세포 사멸 측정 결과, 대조군 및 ICAM-3 과발현 세포주 모두에서 세포사멸 억제 효과가 나타났다. 따라서, 본 실험 결과 파클리탁셀과 빈크리스틴에 의한 세포사멸은 세포사멸이 주로 작동하는 신호 전달 경로를 통하여 발생하며, 세포사멸의 발생 억제는 상기 항암제에 의한 세포사멸 억제를 유도한다고 생각되며, 또한, ICAM-3에 의한 항암제 내성 발생 역시 세포사멸의 발생 억제에 유래한다고 추론되어질 수 있다.

2. ICAM -3의 항암제 내성 부여에 대한 Akt 및 ERK 의 활성화 영향

다음으로 ICAM-3에 의한 항암제 내성 발생에 작용하는 세포 내 신호 전달 기전을 연구하였다. 본 NCI-H1299/ICAM-3 세포주에서 웨스턴 블라팅으로 대표적인 암세포 생존 기전 및 증식 기전인 Akt와 ERK 분자의 활성 및 발현 양상을 관찰하였다(도 4의 A). 그 결과, NCI-H1299/ICAM-3 세포주에서는 지속적인 Akt 및 ERK 분자의 인산화반응(phosphorylation)이 증가되어 있음을 관찰할 수 있었다. 이 실험 결과는 또한 간접적으로나마 Akt 및 ERK가 ICAM-3의 발현 증가에 따라 활성이 촉진되어지므로, ICAM-3의 세포 내 신호 전달 경로에서 ICAM-3의 하위 신호 전달 경로에 위치하고 있음을 알수 있다. 이러한 신호 전달 분자인 Akt와 ERK의 활성 증가가 파클리탁셀과 빈크리스틴의 암세포 사멸 작용에 어떠한 영향을 미치는지 규명하기 위하여 Akt의 상위 신호 전달 분자인 PI3 키나제의 저해제인 LY294002와 ERK의 저해제인 PD98059를 이용하여 전처리 후 파클리탁셀과 빈크리스틴을 처리하고, 세포사멸을 PI 흡수 방법으로 측정하였다(도 4의 B). 본 실험 결과, 저해제들인 LY294002과 PD98052의 처리시, 대조군 및 NCI-H1299/ICAM-3 세포주에서의 세포의 사멸이 현저하게 증가하여 50% 이상의 증가율을 보인 경우도 관찰되었다. 따라서, ICAM-3에 의한 항암제 내성 증가에는 Akt와 ERK 분자의 활성화가 작동함을 알 수 있었다. 또한, LY294002과 PD98052의 처리시 항암제에 의한 세포사멸 증가 양상을 관찰하기 위하여 웨스턴 블라팅을 수행하였다(도 4의 C). 본 실험 결과, 각 저해제의 처리시 캐스파제-3, 8, 9의 활성화가 증가되었으며, Bcl-2, Bcl-X_L, Mcl-1의 발현은 현저히 감소함을 확인하였다. 따라서, 상기 저해제를 이용한 Akt와 ERK의 신호 전달 경로 억제는 파클리탁셀 및 빈크리스틴에 의한 암세포의 세포사멸 유도 작용을 증가시킴을 관찰할 수 있었다. 또한, 대조군과 비교하여 ICAM-3 과발현 세포주에 대한 Akt와 ERK 신호 전달 경로의 억제 정도는 비교적 적었음을 웨스턴 블랏 상에서 확인할 수 있었다. 또한, 저해제들과 항암제 간의 조합에서 세포계수 분석(cell counting assay)을 수행하였으며, 본 실험의 결과에서도 Akt와 ERK 신호 전달 경로의 억제는 50% 이상의 세포사멸 증가를 촉진함을 알 수 있었다. 본 실험 결과, ICAM-3의 발현 증가는 Akt 및 ERKl 활성 증가를 유도하며, 이는 항암제 내성에 중요한 작용을 함을 알 수 있었다.

3. ICAM -3의 항암제 내성 부여에 대한 CREB2 활성화의 영향

본 발명자는 이러한 ICAM-3에 의한 항암제 내성 부여 작용에 전사 인자 중의 하나인 CREB2가 작동함을 규명하였다(도 5). ICAM-3와 전사인자 단백질인 CREB 패밀리 간의 관계는 본 발명자가 ICAM-3에 의한 CREB1의 활성화 증가가 암세포의 전이성(migration) 및 침윤성을 증가시키는 것을 규명하여 입증하였으며, 본 발명에서도 항암제 내성과 CREB1의 관련성을 조사하였으나 관련이 없는 것으로 나타났다. 대신, CREB 단백질 패밀리에 속하는 CREB2의 활성 역시 ICAM-3에 의하여 증가함을 관찰하였고(도 5의 A), 이 활성 증가가 Akt 및 ERK의 활성 증가와 관련이 있음을 Akt와 ERK의 저해제 처리시 ICAM-3의 활성이 감소됨을 관찰함으로써 입증하였다(도 5의 B). CREB2 siRNA를 이용한 CREB2 발현 억제 실험을 수행하여 CREB2의 발현이 siRNA 처리시 감소됨을 관찰하였고(도 5의 C), 이 siRNA를 이용하여 siRNA 처리 후 파클리탁셀 및 빈크리스틴 처리시 30% 이상의 세포사멸 효과가 증가됨을 관찰하였다(도 5의 D). 그리고, 같은 조건하에서 웨스턴 블라팅을 수행하여 CREB2 siRNA 처리시, 캐스파제-8, 9의 활성 증가가 발생함을 관찰하고, CREB2의 발현 감소와 항암제의 동시 처리는 세포사멸의 증가를 유발함을 규명하였다(도 5의 E). 따라서, 본 실험의 결과, CREB2가 ICAM-3 - Akt/ERK의 신호 전달 경로의 하부에 위치하여 ICAM-3 - Akt/ERK - CREB2의 신호 전달을 구성하며, 이 신호 전달의 활성화가 항암제 내성 부여에 작동한다는 것을 규명하였다.

4. H460 암세포와 방사선 내성주에서 ICAM -3 - Akt / ERK - CREB2 의 활성화에 의한 항암제 내성 효과

ICAM-3 - Akt/ERK - CREB2 신호 전달의 활성화에 의한 항암제 내성 부여가 다른 세포주에도 적용되는지 알아보기 위하여, 같은 비소세포성 폐암 세포주인 NCI-H460 세포주에 ICAM-3를 주입하여 NCI-H460/ICAM-3 세포주를 구축하고, 거기에서도 Akt와 ERK의 인산화반응(phosphorylation)이 증가됨을 관찰하였고(도 6의 A), CREB2 역시 활성화됨을 확인하였다(도 6의 B). 이 세포주 역시 파클리탁셀과 빈크리스틴 첨가시에 세포사멸이 대조군에 비하여 감소함을 확인하였고(도 6의 C), 이 세포사멸 억제는 세포사멸의 활성 억제에 기인함을 관찰하였다(도 6의 D). 비소세포성 세포주 이외에, 자궁 경부암세포인 SiHa 세포주의 방사선 내성주에서도 ICAM-3 - Akt/ERK - CREB2 신호 전달의 활성화에 의한 항암제 내성 생성을 확인하였다. ICAM-3가 과발현되어 있는 항암제 내성주인 SiHa/R에서 역시 모세포인 SiHa에 비교하여 Akt와 ERK의 인산화반응이 증가되었고(도 6의 E), CREB2의 활성 증가가 나타났으며(도 6의 F), 파클리탁셀과 빈크리스틴 처리시 세포사멸이 SiHa/R에서 적었다(도 6의 G). 또한, 웨스턴 블라팅 결과에서 세포사멸 활성화가 SiHa/R에서 적게 발생함을 관찰하였다(도 6의 H). 따라서, NCI-H1299 이외에 다른 비소세포성 폐암주 및 ICAM-3가 과발현되어 있는 방사선 내성주에서도 ICAM-3 - Akt/ERK - CREB2 신호 전달의 활성화에 의한 항암제 내성이 나타난다는 것을 입증하였다.

5. 마우스의 종양이식체 모델에서의 ICAM -3 항암제 내성 부여의 효과

본 실험에서 이용된 NCI-H460/ICAM-3 세포주를 마우스에 피하 주사 후 구축되어진 제노그라프(xenograft)에 대한 파클리탁셀과 빈크리스틴 주사시에 세포사멸이 대조군에 비하여 적게 발생함을 TUNEL 분석을 이용한 조직 분석을 통하여 입증하였다(도 7).

6. 결 론

본 발명의 발명자에 의한 실험 결과, ICAM-3는 방사선 내성뿐만 아니라 항암제 내성까지 유발하는 방사선/항암제 교차 내성 유발 인자임을 규명하였다. 또한, ICAM-3에 의한 항암제 내성은 ICAM-3 - Akt/ERK - CREB2 신호 전달의 활성화에 의한 세포사멸 억제에 의해 발생함을 관찰하였으며, ICAM-3 - Akt/ERK - CREB2 신호 전달의 활성화 및 그로 인한 세포사멸 억제에 의한 항암제 내성 유도가 여러 가지 비소세포성 폐암 세포주 및 방사선 내성주에서도 발생하는다는 것을 입증하였다. 또한, 이와 같은 결과는, 마우스를 이용한 동물 시험에서도, ICAM-3 과발현 세포주의 세포사멸 발생 억제가 생성됨을 규명하였다. 따라서, ICAM-3와 관련된 신호 전달 체계에 대한 저해제 및 치료용 항체의 개발은 새로운 항암제의 개발로 이어질 수 있을 것으로 예상된다. 종합적으로, ICAM-3는 FAK 활성화를 통한 방사선 내성 부여, ERK를 통한 암세포 증식 촉진, ICAM-3 - Akt - CREB-1-MMP 활성화를 통한 암세포의 전이 및 침윤 촉진 이외에, ICAM-3 - Akt/ERK - CREB2 활성화을 통한 항암제 내성 부여 기능이 있음을 본 발명을 통하여 입증하였다(도 8).

<110> AAA <120> ICAM-3 AS BIOMARKER FOR THE PREDICTION OF TOLERANCE AGAINST ANTICANCER AGENTS AND USE THEREOF <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 999 <212> DNA <213> Homo sapiens ICAM-3 nucleotide sequence <400> 1 atggccacca tggtaccatc cgtgttgtgg cccagggcct gctggactct gctggtctgc 60 tgtctgctga ccccaggtgt ccaggggcag gagttccttt tgcgggtgga gccccagaac 120 cctgtgctct ctgctggagg gtccctgttt gtgaactgca gtactgattg tcccagcttt 180 gagaaaatcg ccttggagac gtccctatca aaggagctgg tggccagtgg catgggctgg 240 gcagccttca atctcagcaa cgtgactggc aacagtcgga tcctctgctc agtgtactgc 300 aatggctccc agataacagg ctcctctaac atcaccgtgt acgggctccc ggagcgtgtg 360 gagctggcac ccctgcctcc ttggcagccg gtgggccaga acttcaccct gcgctgccaa 420 gtggagggtg ggtcgccccg gaccagcctc acggtggtgc tgcttcgctg ggaggaggag 480 ctgagccggc agcccgcagt ggaggagcca gcggaggtca ctgccactgt gctggccagc 540 agagacgacc acggagcccc tttctcatgc cgcacagaac tggacatgca gccccagggg 600 ctgggactgt tcgtgaacac ctcagccccc cgccagctcc gaacctttgt cctgcccgtg 660 acccccccgc gcctcgtggc cccccggttc ttggaggtgg aaacgtcgtg gccggtggac 720 tgcaccctag acgggctttt tccagcctca gaggcccagg tctacctggc gctgggggac 780 cagatgctga atgcgacagt catgaaccac ggggacacgc taacggccac agccacagcc 840 acggcgcgcg cggatcagga gggtgcccgg gagatcgtct gcaacgtgac cctagggggc 900 gagagacggg aggcccggga gaacttgacg gtctttagct tcctaggacc cattgtgaac 960 ctcagcgagc ccaccgccca tgaggggtcc acagtgacc 999 <210> 2 <211> 547 <212> PRT <213> Homo sapiens ICAM-3 amino acid sequence <400> 2 Met Ala Thr Met Val Pro Ser Val Leu Trp Pro Arg Ala Cys Trp Thr 1 5 10 15 Leu Leu Val Cys Cys Leu Leu Thr Pro Gly Val Gln Gly Gln Glu Phe 20 25 30 Leu Leu Arg Val Glu Pro Gln Asn Pro Val Leu Ser Ala Gly Gly Ser 35 40 45 Leu Phe Val Asn Cys Ser Thr Asp Cys Pro Ser Ser Glu Lys Ile Ala 50 55 60 Leu Glu Thr Ser Leu Ser Lys Glu Leu Val Ala Ser Gly Met Gly Trp 65 70 75 80 Ala Ala Phe Asn Leu Ser Asn Val Thr Gly Asn Ser Arg Ile Leu Cys 85 90 95 Ser Val Tyr Cys Asn Gly Ser Gln Ile Thr Gly Ser Ser Asn Ile Thr 100 105 110 Val Tyr Gly Leu Pro Glu Arg Val Glu Leu Ala Pro Leu Pro Pro Trp 115 120 125 Gln Pro Val Gly Gln Asn Phe Thr Leu Arg Cys Gln Val Glu Gly Gly 130 135 140 Ser Pro Arg Thr Ser Leu Thr Val Val Leu Leu Arg Trp Glu Glu Glu 145 150 155 160 Leu Ser Arg Gln Pro Ala Val Glu Glu Pro Ala Glu Val Thr Ala Thr 165 170 175 Val Leu Ala Ser Arg Asp Asp His Gly Ala Pro Phe Ser Cys Arg Thr 180 185 190 Glu Leu Asp Met Gln Pro Gln Gly Leu Gly Leu Phe Val Asn Thr Ser 195 200 205 Ala Pro Arg Gln Leu Arg Thr Phe Val Leu Pro Val Thr Pro Pro Arg 210 215 220 Leu Val Ala Pro Arg Phe Leu Glu Val Glu Thr Ser Trp Pro Val Asp 225 230 235 240 Cys Thr Leu Asp Gly Leu Phe Pro Ala Ser Glu Ala Gln Val Tyr Leu 245 250 255 Ala Leu Gly Asp Gln Met Leu Asn Ala Thr Val Met Asn His Gly Asp 260 265 270 Thr Leu Thr Ala Thr Ala Thr Ala Thr Ala Arg Ala Asp Gln Glu Gly 275 280 285 Ala Arg Glu Ile Val Cys Asn Val Thr Leu Gly Gly Glu Arg Arg Glu 290 295 300 Ala Arg Glu Asn Leu Thr Val Phe Ser Phe Leu Gly Pro Ile Val Asn 305 310 315 320 Leu Ser Glu Pro Thr Ala His Glu Gly Ser Thr Val Thr Val Ser Cys 325 330 335 Met Ala Gly Ala Arg Val Gln Val Thr Leu Asp Gly Val Pro Ala Ala 340 345 350 Ala Pro Gly Gln Pro Ala Gln Leu Gln Leu Asn Ala Thr Glu Ser Asp 355 360 365 Asp Gly Arg Ser Phe Phe Cys Ser Ala Thr Leu Glu Val Asp Gly Glu 370 375 380 Phe Leu His Arg Asn Ser Ser Val Gln Leu Arg Val Leu Tyr Gly Pro 385 390 395 400 Lys Ile Asp Arg Ala Thr Cys Pro Gln His Leu Lys Trp Lys Asp Lys 405 410 415 Thr Arg His Val Leu Gln Cys Gln Ala Arg Gly Asn Pro Tyr Pro Glu 420 425 430 Leu Arg Cys Leu Lys Glu Gly Ser Ser Arg Glu Val Pro Val Gly Ile 435 440 445 Pro Phe Phe Val Asn Val Thr His Asn Gly Thr Tyr Gln Cys Gln Ala 450 455 460 Ser Ser Ser Arg Gly Lys Tyr Thr Leu Val Val Val Met Asp Ile Glu 465 470 475 480 Ala Gly Ser Ser His Phe Val Pro Val Phe Val Ala Val Leu Leu Thr 485 490 495 Leu Gly Val Val Thr Ile Val Leu Ala Leu Met Tyr Val Phe Arg Glu 500 505 510 His Gln Arg Ser Gly Ser Tyr His Val Arg Glu Glu Ser Thr Tyr Leu 515 520 525 Pro Leu Thr Ser Met Gln Pro Thr Glu Ala Met Gly Glu Glu Pro Ser 530 535 540 Arg Ala Glu 545

Claims (13)

1. 파클리탁셀 또는 빈크리스틴으로 특정된 항암제가 처리된 비소세포성 폐암 또는 자궁경부암 환자로부터 분리된 암세포의 ICAM-3(intercellular adhesion molecule-3)의 발현량을 측정하고, 항암제 처리 전의 암 환자로부터 분리된 암세포로부터 측정된 ICAM-3의 발현량과 비교하여, 항암제 처리 후의 암 환자로부터 분리된 암세포로부터 측정된 ICAM-3의 발현량이 증가하는 경우에, 항암제에 대한 내성이 발생할 가능성이 존재하는 것으로 판단하는, 비소세포성 폐암 또는 자궁경부암의 파클리탁셀 또는 빈크리스틴으로 특정된 항암제 내성 예측을 위한 정보 제공 방법.
2. 제 1항에 있어서, 상기 방법은 다음의 단계들을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
   비소세포성 폐암 또는 자궁경부암 환자로부터 분리된 암세포 조직으로부터 시료를 준비하고, 상기 시료로부터 ICAM-3 발현량을 측정하는 제 1단계;
   파클리탁셀 또는 빈크리스틴으로 특정된 항암제를 투여한 비소세포성 폐암 또는 자궁경부암 환자로부터 분리된 암세포 조직으로부터 시료를 준비하고, 상기 시료로부터 ICAM-3 발현량을 측정하는 제 2단계;
   상기 제 1단계의 결과와 상기 제 2단계의 결과를 비교하는 단계;
   상기 비교를 통하여 상기 제 1단계의 ICAM-3 발현량보다 상기 제 2단계의 ICAM-3 발현량이 증가된 경우, 항암제 내성 가능성이 높은 것으로 판단하기 위한 정보를 제공하는 단계.
3. 삭제
4. 삭제
5. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 ICAM-3의 발현량 측정은 mRNA 또는 단백질의 양을 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 5항에 있어서, 상기 mRNA 양의 측정은 RT-PCR(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 노던 블라팅 또는 핵산 마이크로어레이에 의한 측정인 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제 5항에 있어서, 상기 단백질 양의 측정은 항원-항체 반응에 의한 측정인 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제 7항에 있어서, 상기 항원-항체 반응에 의한 측정은 웨스턴 블라팅, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), RIA(radioimmunoassay), 면역조직화학(immunohistochemistry) 또는 단백질 마이크로어레이 또는 앱타머에 의한 검출인 것을 특징으로 하는 방법.
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12. ICAM-3(intercellular adhesion molecule-3)의 발현량을 측정할 수 있는 수단을 포함하는 비소세포성 폐암 또는 자궁경부암의 파클리탁셀 또는 빈크리스틴으로 특정된 항암제 내성 예측용 키트.
13. 제 12항에 있어서, 상기 수단은 프라이머, 프로브, 항체, 항체 단편, 마이크로어레이 및 앱타머로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 키트.

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