KR20220088910A - 치료 및 진단 표적으로서의 hla-h, hla-j, hla-l, hla-v 및 hla-y - Google Patents

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Abstract

본 발명은 대상체에서 종양의 치료 또는 예방을 위한 약제(medicament) 또는 대상체에서 종양 검출을 위한 진단제(diagnostic agent)의 제조방법에 관한 것으로 (A) 상기 대상체로부터 얻은 샘플에서 HLA-H, HLA-J, HLA-L, HLA-V 또는 HLA-Y와 적어도 85% 동일한 적어도 하나의 핵산 분자 및/또는 적어도 하나의 단백질 또는 펩티드의 발현을 결정하는 단계를 포함하되, 핵산 분자는 상기 단백질 또는 폴리펩티드를 인코딩하거나 적어도 150개의 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 단편으로 이뤄지고, 및 (B) 대상체에서 적어도 하나의 핵산 분자 및/또는 적어도 하나의 단백질 또는 펩티드의 발현을 억제할 수 있는 약제를 제조하는 단계 및/또는 대상체에서 적어도 하나의 핵산 분자 및/또는 적어도 하나의 단백질 또는 펩티드의 발현 부위를 생체 내에서 검출할 수 있는 진단제를 제조하는 단계를 포함한다.

Description

치료 및 진단 표적으로서의 HLA-H, HLA-J, HLA-L, HLA-V 및 HLA-Y
본 발명은 대상체에서 종양의 치료 또는 예방을 위한 약제(medicament) 또는 대상체에서 종양 검출을 위한 진단제(diagnostic agent)의 제조방법에 관한 것으로 (A) 상기 대상체로부터 얻은 샘플에서 적어도 하나의 핵산 분자 및/또는 적어도 하나의 단백질 또는 펩티드의 발현을 결정하되, 적어도 하나의 핵산 분자는 (a) 서열번호 1 내지 5 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드를 인코딩(encoding)하는 핵산 분자, (b) 서열번호 6 내지 10 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 분자, (c) (a)의 아미노산 서열과 적어도 85% 동일하고, 바람직하게는 적어도 90% 동일하며, 가장 바람직하게는 적어도 95% 동일한 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자, (d) (b)의 뉴클레오티드 서열과 적어도 95% 동일하고, 바람직하게는 적어도 96% 동일하며, 가장 바람직하게는 적어도 98% 동일한 뉴클레오티드 서열로 이루어진 핵산 분자, (e) (d)의 핵산 분자에 대해 축퇴(degenerate)된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 핵산 분자, (f) (a) 내지 (e) 중 어느 하나의 핵산 분자의 단편으로 이루어지며, 상기 단편은 적어도 150개의 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 300개의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 적어도 450개의 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 적어도 600개의 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자, 및 (g) (a) 내지 (f) 중 어느 하나의 핵산 분자에 해당하되, T는 U로 대체된 핵산 분자로부터 선택되며, 및 여기서 적어도 하나의 단백질 또는 펩티드는 (a) 내지 (g) 중 어느 하나의 핵산 분자에 의해 인코딩되는 단백질 또는 펩티드로부터 선택되는 단계; 및 (B) 적어도 하나의 핵산 분자 및/또는 적어도 하나의 단백질 또는 펩티드가 (A)에서 발현되는 경우, 대상체에서 적어도 하나의 핵산 분자 및/또는 적어도 하나의 단백질 또는 펩티드의 발현을 억제할 수 있는 약제를 제조하는 단계, 및/또는 (B') 적어도 하나의 핵산 분자 및/또는 적어도 하나의 단백질 또는 펩티드가 (A)에서 발현되는 경우, 대상체에서 적어도 하나의 핵산 분자 및/또는 적어도 하나의 단백질 또는 펩티드의 발현 부위를 생체내에서 검출할 수 있는 진단제를 제조하는 단계를 포함한다.
본 명세서에는, 특허 출원서 및 제조사 매뉴얼을 포함하는 다수의 문서가 인용된다. 이들 문서의 개시는, 본 발명의 특허성과 관련이 있는 것으로 간주되지는 않지만, 그 전체가 참조로 여기에 포함된다. 보다 구체적으로, 모든 참조 문서는 각각의 개별 문서가 참조로서 구체적이고 개별적으로 포함된 것으로 표시된 것과 동일한 정도의 참조로 포함된다.
맞춤형 종양 요법은 특정 종양 요법에 더 잘 반응할 환자를 예측하는 기술에 중점을 둔 치료 전략이다. 이 접근법은 종양 마커(tumor marker)가 치료에 대한 환자의 예후 및 종양 반응과 관련이 있다는 아이디어에 기초한다. 종양 마커는 치료 반응을 예측하는 DNA, RNA, 단백질 및 대사체 프로파일일 수 있다.
종양이 있는 환자를 위한 적합한 치료법을 선택하는 것은 지속적으로 발전하는 분자 진단 및 빠르게 부상하는 생물 의학 문헌을 기반으로 하는 복잡한 결정이다. 임상 시험에서 실행 가능한 게놈 변경(actionable genomic alteration) 및 표적 요법(targeted therapy) 간의 연관성을 추적하는 것은 종양 전문의와 연구원 모두가 다루는 데 어려울 수 있다. 화학 요법은 많은 종양 유형에 대한 암 치료의 중추로 남아 있지만, 반응률이 제한적이고 현저한 부작용이 있다. 암 발병, 진행 및 내성과 관련된 구동 분자 메커니즘(driver molecular mechanisms)이 치료 표적으로 점점 더 추구되고 있다. 성공적인 맞춤형 종양 치료의 예로 유방의 HER2, 만성 골수성 백혈병(chronic myeloid leukemia)의 bcr-abl 또는 비-소-세포폐암(NSCLC)의 ALK를 표적으로 하는 것은 종양학에 혁명을 일으켰다.
종양학의 정밀 의학은 진단 바이오마커(건강한 환자에서 암의 발생을 감지하기 위해, 종양을 조기에 식별하기 위해), 예후 바이오마커(질병의 자연 경과를 예측하기 위해), 예측 바이오마커(특정 치료법이 있는 경우 임상 결과를 예측하기 위해), 약리유전학(pharmacogenomic) 바이오마커(약물 대사의 변화를 식별하고 특정 치료와 관련된 반응 및 독성을 예측하기 위해)를 식별하기 위한 노력에 이르기까지 연속선(continuum)에 걸쳐 있다.
그러나, 효과적인 맞춤형 종양 요법 및 종양 진단에 도달하기 위한 치료 및 진단 표적으로서 종양의 평가에/치료에 사용될 수 있는 새로운 수단 및 방법을 식별하는 것이 여전히 시급하다. 이러한 필요성은 본 발명에 의해 다루어진다.
따라서, 본 발명은 제1 양태에서 대상체에서 종양의 치료 또는 예방을 위한 약제(medicament) 또는 대상체에서 종양 검출을 위한 진단제(diagnostic agent)의 제조방법에 관한 것으로 (A) 상기 대상체로부터 얻은 샘플에서 적어도 하나의 핵산 분자 및/또는 적어도 하나의 단백질 또는 펩티드의 발현을 결정하되, 적어도 하나의 핵산 분자는 (a) 서열번호 1 내지 5 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드를 인코딩(encoding)하는 핵산 분자, (b) 서열번호 6 내지 10 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 분자, (c) (a)의 아미노산 서열과 적어도 85% 동일하고, 바람직하게는 적어도 90% 동일하며, 가장 바람직하게는 적어도 95% 동일한 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자, (d) (b)의 뉴클레오티드 서열과 적어도 95% 동일하고, 바람직하게는 적어도 96% 동일하며, 가장 바람직하게는 적어도 98% 동일한 뉴클레오티드 서열로 이루어진 핵산 분자, (e) (d)의 핵산 분자에 대해 축퇴(degenerate)된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 핵산 분자, (f) (a) 내지 (e) 중 어느 하나의 핵산 분자의 단편으로 이루어지며, 상기 단편은 적어도 150개의 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 300개의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 적어도 450개의 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 적어도 600개의 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자, 및 (g) (a) 내지 (f) 중 어느 하나의 핵산 분자에 해당하되, T는 U로 대체된 핵산 분자로부터 선택되며, 및 여기서 적어도 하나의 단백질 또는 펩티드는 (a) 내지 (g) 중 어느 하나의 핵산 분자에 의해 인코딩되는 단백질 또는 펩티드로부터 선택되는 단계; 및 (B) 적어도 하나의 핵산 분자 및/또는 적어도 하나의 단백질 또는 펩티드가 (A)에서 발현되는 경우, 대상체에서 적어도 하나의 핵산 분자 및/또는 적어도 하나의 단백질 또는 펩티드의 발현을 억제할 수 있는 약제를 제조하는 단계, 및/또는 (B') 적어도 하나의 핵산 분자 및/또는 적어도 하나의 단백질 또는 펩티드가 (A)에서 발현되는 경우, 대상체에서 적어도 하나의 핵산 분자 및/또는 적어도 하나의 단백질 또는 펩티드의 발현 부위를 생체 내에서 검출할 수 있는 진단제를 제조하는 단계를 포함한다.
본 발명에서 사용된 용어 "약제(medicament)"는 종양의 치료 또는 예방과 관련하여 약학적으로 활성인 화합물 또는 화합물의 조합을 지칭한다. 본 발명에서 사용된 용어 "진단제(diagnostic agent)"는 대상체에서 종양의 검출을 위해 사용될 수 있는 화합물 또는 화합물의 조합을 지칭한다. 예를 들어 이하에서 더 상세히 설명되는 바와 같이, 진단제는 생체내(in vivo)에서 종양 병변(tumor lesion)을 검출할 수 있도록 하는 검출가능한 표지로 라벨링될 수 있다. 종양 병변은 대상체의 종양 조직 영역이다. 약제뿐만 아니라 진단제도 대상체에 투여될 수 있다.
적어도 하나의 핵산 분자 및/또는 적어도 하나의 단백질 또는 펩티드가 본 발명의 제1 양태의 방법의 단계 (A)에서 발현되는 경우, 약제의 성질은 본 발명에 따른 대상체에서 적어도 하나의 핵산 분자 및/또는 적어도 하나의 단백질 또는 펩티드의 발현을 억제할 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다. 유사하게, 적어도 하나의 핵산 분자 및/또는 적어도 하나의 단백질 또는 펩티드가 본 발명의 제1 양태의 방법의 단계 (A)에서 발현되는 경우, 진단제의 성질은 본 발명에 따른 대상체에서 적어도 하나의 핵산 분자 및/또는 적어도 하나의 단백질 또는 펩티드의 발현 부위를 생체내에서 검출할 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다. 발현 부위와 관련하여 종양은 일반적으로 원발성 종양 부위(primary tumor site)라고 불리우는 특정 신체 부위에서 기원하는 것으로 이해된다. 종양 성장의 결과로 종양은 신체의 별개의 부위, 이른바 이차 종양 부위(secondary tumor site)에서 전이를 형성할 수 있다. 진단제는 바람직하게는 적어도 원발성 종양 부위 그리고 더욱 바람직하게는 원발성 및 존재하는 경우, (적어도 부분적으로)이차 종양 부위 모두를 검출할 수 있다.
약제는 바람직하게는 적어도 하나의 핵산 분자 또는 적어도 하나의 단백질 또는 펩티드를 특이적으로 억제하고 진단제는 바람직하게는 본 발명에 따른 적어도 하나의 핵산 분자 또는 적어도 하나의 단백질 또는 펩티드를 특이적으로 검출한다. 이것은 약제가 다른 핵산 분자 또는 단백질 또는 펩티드를 억제하지 않거나 본질적으로 억제하지 않는다는 것을 의미한다. 이것은 또한 진단제가 다른 핵산 분자 또는 단백질 또는 펩티드를 검출하지 않거나 본질적으로 검출하지 않는다는 것을 의미한다. 특히, 각각의 선택된 표적 HLA 핵산 분자 또는 단백질 또는 펩티드 이외의 다른 HLA 핵산 분자 또는 단백질 또는 펩티드가 억제되거나 검출되지 않는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 용어 "대상체(subject)"는 포유 동물, 바람직하게는 가축 또는 말, 소, 돼지, 양, 염소, 개 또는 고양이와 같은 애완 동물, 가장 바람직하게는 인간을 지칭한다. 대상체는 암이 의심되는 대상체 또는 암이 있는 것으로 알려진 대상체일 수 있다. 후자의 경우 대상체는 이미 효과적이지 않은 암 치료를 받았을 수 있다. 치료로 인해 발현이 바뀌었는지 판단하기 위해 치료 전과 후에 상기 방법을 사용하는 것 또한 가능하다.
종양은 생리적 기능을 갖지 않는 비정상적인 양성 또는 악성 조직의 새로운 성장이며, 일반적으로 제어되지 않는 빠른 세포 증식에서 발생한다. 종양은 바람직하게는 암이다. 암은 생리적 기능을 갖지 않는 비정상적인 악성 조직의 새로운 성장이며, 일반적으로 제어되지 않는 빠른 세포 증식에서 발생한다. 상기 암은 바람직하게는 유방암, 난소암, 자궁내막암, 질암, 외음부암, 방광암, 침샘암, 자궁내막암, 췌장암, 갑상선암, 신장암, 폐암, 상부 위장관 관련 암, 결장암, 결장직장암, 전립선암, 두경부 편평세포암(squamous-cell carcinoma of the head and neck), 자궁경부암, 교모세포종(glioblastomas), 악성복수(malignant ascites), 림프종 및 백혈병으로 이루어진 군에서 선택된다. 바람직한 암은 본 발명에서 하기에 정의될 것이다.
종양 또는 암은 바람직하게는 고형 종양 또는 암이다. 고형 종양 또는 암은 일반적으로 비-고형 종양(예: 백혈병)과 달리 낭종이나 액체 영역을 포함하지 않는 비정상적인 조직 덩어리이다.
서열번호 6 내지 10의 핵산 서열은 인간 HLA-H, HLA-J, HLA-L, HLA-V 및 HLA-Y를 각각 인코딩하는 유전자이다. 본 발명에 따른 핵산 분자는 게놈 DNA 또는 mRNA인 것이 바람직하다. mRNA의 경우, 핵산 분자는 추가로 폴리-A 꼬리를 포함할 수 있다.
서열번호 1 내지 5의 아미노산 서열은 각각 가용성 인간 HLA 단백질 HLA-H, HLA-J, HLA-L, HLA-V 및 HLA-Y이다. HLA 단백질은 막관통 도메인(transmembrane domain)을 포함하지 않기 때문에 가용성이다.
HLA-L과 관련하여 서열번호 3은 HLA-L의 가용성 형태이고 서열번호 8은 HLA-L의 가용성 형태를 인코딩하며, HLA-L은 서열번호 11(아미노산 서열) 및 12(뉴클레오티드 서열)의 막-결합 형태로도 발견될 수 있다는 점에 주목한다. 이 막-결합 형태는 막으로부터 단백질 분해 절단에 의해 막으로부터 방출될 수 있다. 막으로부터 분리에 의해 용해되는 이러한 HLA 형태는 셰딩된 동형체(shedded isoform)로도 알려져 있다; Rizzo et al. (2013), Mol Cell Biochem.; 381(1-2):243-55 참조. 따라서, 본 발명의 제1 양태에서 정의된 서열번호 8로부터 유래된 핵산 분자, 및 본 발명의 제1 양태에서 정의된 서열번호 3에서 유래된 단백질 또는 펩티드는 또한 서열번호 12 및 11 각각의 막-결합 형태로부터 유래될 수 있다. HLA-L 또는 이의 유래된 서열의 발현을 결정하는 것과 관련하여 가용성 형태로 결정을 한정하여 막-결합이 결정되지 않도록 하는 것 또한 바람직하다. 이는, 예를 들어, 분석 전에 샘플로부터 세포와 세포막을 제거하여 수행할 수 있다.
본 발명에 따른 용어 “핵산 서열” 또는 "핵산 분자"는 cDNA 또는 이중 또는 단일 가닥 게놈 DNA와 같은 DNA 및 RNA를 포함한다. 이와 관련하여, "DNA"(디옥시리보핵산)는 디옥시리보오스 당 골격에 함께 연결된 뉴클레오티드 염기라 불리는 화학적 빌딩 블록인 아데닌(A), 구아닌(G), 시토신(C) 및 티민(T)의 모든 사슬 또는 서열을 의미한다. DNA는 한 가닥의 뉴클레오티드 염기들을 가지거나 이중 나선 구조를 형성할 수 있는 두 개의 상보적인 가닥을 가질 수 있다. "RNA"(리보핵산)는 리보오스 당 골격에 함께 연결된 뉴클레오티드 염기라 불리는 화학적 빌딩 블록인 아데닌(A), 구아닌(G), 시토신(C) 및 우라실(U)의 모든 사슬 또는 서열을 의미한다. RNA는 일반적으로 mRNA와 같은 한 가닥의 뉴클레오티드 염기들을 갖는다. 단일-가닥 및 이중-가닥 하이브리드 분자, 즉 DNA-DNA, DNA-RNA 및 RNA-RNA도 포함된다. 특정 핵산 분자, 예를 들어, shRNA, miRNA, 또는 하기 본 명세서에 기재된 안티센스 핵산 분자는 또한 당업계에 공지된 많은 수단으로 변형될 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예는 메틸화, "캡(cap)", 하나 이상의 천연 뉴클레오티드의 유사체(analog)로의 치환, 및 뉴클레오티드간 변형, 예를 들어 비전하성 결합을 갖는 변형(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 및 전하성 결합을 갖는 변형 (예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)을 포함한다. 다음에서 폴리뉴클레오티드라고도 지칭되는 핵산분자는 추가의 공유 결합된 모이어티를 하나 이상 포함할 수 있고, 예를 들어 단백질 (예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩티드, 폴리-L-리신 등), 인터칼레이터(intercalator) (예: 아크리딘 (acridine), 소랄렌(psoralen) 등), 킬레이터(chelator) (예: 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등) 및 알킬레이터(alkylator)를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 메틸 또는 에틸 포스포트리에스테르 또는 알킬 포스포아미데이트 결합의 형성에 의해 유도체화 될 수 있다. DNA 또는 RNA의 합성 또는 반합성(semi-synthetic) 유도체 및 혼합 중합체와 같은 당업계에 공지된 핵산 모방 분자(mimicking molecule)가 추가로 포함된다. 본 발명에 따른 이러한 핵산 모방 분자 또는 핵산 유도체는 포스포로티오에이트 핵산(phosphorothioate nucleic acid), 포스포아미데이트 핵산(phosphoramidate nucleic acid), 2'-O-메톡시에틸 리보핵산(2'-O-methoxyethyl ribonucleic acid), 모르폴리노 핵산(morpholino nucleic acid), 헥시톨 핵산(hexitol nucleic acid, HNA), 펩티드 핵산(PNA) 및 잠금 핵산(locked nucleic acid, LNA)을 포함한다(Braasch and Corey, Chem Biol 2001, 8: 1 참조). LNA는 2'-산소와 4'-탄소 사이의 메틸렌 결합에 의해 리보스 고리가 속박된 RNA 유도체이다. 변형된 염기, 예를 들어 티오-우라실, 티오-구아닌 및 플루오로-우라실을 포함하는 핵산도 포함된다. 핵산 분자는 일반적으로 단백질 및/또는 폴리펩티드를 만들기 위해 세포 기구(cellular machinery)에 의해 사용되는 정보를 포함한 유전 정보를 전달한다. 본 발명의 핵산 분자는 추가적으로 프로모터, 인핸서, 반응 요소(response element), 신호 서열(signal sequence), 폴리아데닐화 서열(polyadenylation sequence), 인트론, 5'- 및 3'- 비-암호화 영역 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "단백질"은, 용어 "폴리펩티드"와 상호 교환적으로 사용되며, 50개 이상의 아미노산을 포함하는 단일 사슬 단백질 또는 이들의 단편을 포함하는 아미노산의 선형 분자 사슬을 나타낸다. 본 발명에서 사용된 용어 "펩티드"는 최대 49 개의 아미노산으로 이루어진 분자 그룹을 나타낸다. 본 발명에서 사용된 용어 "펩티드"는 아미노산의 증가된 선호도로 적어도 15개의 아미노산, 적어도 20개의 아미노산, 적어도 25개의 아미노산 및 적어도 40개의 아미노산으로 이루어진 분자의 그룹을 나타낸다. 펩티드 및 폴리펩티드 그룹은 용어 "(폴리)펩티드"를 사용하여 함께 지칭된다. (폴리)펩티드들은 적어도 2개의 동일하거나 상이한 분자로 구성된 올리고머를 추가로 형성할 수 있다. 이러한 다량체(multimer)에 상응하는 고차 구조는 동종 또는 이종이량체, 동종 또는 이종삼량체 등으로 그에 상응하여 불린다. 예를 들어, HLA 단백질은 시스테인을 포함하고 따라서 잠재적인 이량체화 부위를 포함한다. 용어 "(폴리)펩티드" 및 "단백질"은 또한 자연적으로 변형된 (폴리)펩티드 및 단백질을 지칭하며, 이는 예를 들어 글리코실화, 아세틸화, 인산화 및 당업계에 잘 알려진 유사한 변형에 의한 것이다.
본 발명에 따르면, 용어 "서열 동일성(sequence identity) 백분율(%)"은 주형 핵산 또는 아미노산 서열의 전체 길이를 구성하는 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 수 대비 둘 이상의 정렬된 핵산 또는 아미노산 서열의 동일한 뉴클레오티드/아미노산의 일치(“히트”) 수를 나타낸다. 즉, (부분)서열이 비교 창에 걸쳐 또는 당업계에 공지된 서열 비교 알고리즘을 사용하여 측정된 지정된 영역에 걸쳐 최대 상응하도록 비교되고 정렬될 때, 또는 수동으로 정렬되고 육안으로 검사할 때, 정렬(alignment)을 사용하면 둘 이상의 서열 또는 부분서열(subsequence)에 대해 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 백분율(예: 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일성)이 결정될 수 있다. 이러한 정의는 또한 정렬되는 모든 서열의 보체(complement)에도 적용된다.
본 발명과 관련된 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 분석 및 정렬은 바람직하게는 NCBI BLAST 알고리즘을 사용하여 수행된다(Stephen F. Altschul, Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, 및 David J. Lipman (1997), Nucleic Acids Res. 25:3389-3402). BLAST는 뉴클레오티드 서열(nucleotide BLAST) 및 아미노산 서열(protein BLAST)에 사용될 수 있다. 통상의 기술자는 핵산 서열을 정렬하는데 적합한 추가의 프로그램을 알고 있다.
본 발명에 정의된 바와 같이, 적어도 85% 동일성, 바람직하게는 적어도 90% 동일성, 가장 바람직하게는 적어도 95% 동일성의 서열 동일성이 본 발명에 의해 구상된다. 그러나, 또한, 점차 증가하는 선호도로써, 적어도 97.5%, 적어도 98.5%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8% 및 100% 동일성의 서열 동일성이 본 발명에 의해 구상된다.
본 발명에 사용된 용어 "축퇴(degenerate)"는 유전자 코드의 변성을 지칭한다. 코돈의 변성은 유전자 코드의 중복이며, 아미노산을 지정하는 3-염기 쌍 코돈 조합의 다양성으로 나타난다. 유전자 코드의 변성은 동의어 돌연변이의 존재를 설명하는 것이다.
상기 샘플은 대상체의 체액이거나 대상체의 기관에서 추출한 조직 샘플일 수 있다. 체액의 비-제한적인 예는 전혈, 혈장, 혈청, 소변, 복막액, 및 흉막액, 뇌척수액, 눈물액 또는 용액 중 이들로부터의 세포이다. 조직의 비-제한적인 예는 결장, 간, 유방, 난소 및 고환이다. 조직 샘플은 흡인 또는 종지점(punctuation), 절제 또는 생검 또는 절개된 세포 물질을 얻을 수 있는 기타 수술적 방법으로 채취할 수 있다. 상기 샘플은 가공된 샘플, 예를 들어, 냉동, 고정, 포매(embedding) 샘플 등일 수 있다. 바람직한 샘플의 유형은 포르말린 고정 파라핀 포매(formaline fixed paraffin embedded, FFPE) 샘플이다. FFPE 샘플의 준비는 표준 의료 관행이며 이러한 샘플은 장기간 보존될 수 있다.
발현을 평가하는 방법, 바람직하게는 본 발명의 방법과 관련하여 핵산 분자 또는 단백질 또는 펩티드의 발현 수준을 평가하는 방법은 당업계에 확립되어 있다.
예를 들어, 핵산 분자의 발현은 실시간 정량 PCR(RT-qPCR), 전기 영동 기술 또는 DNA 마이크로 어레이(Roth(2002), Curr. Issues Mol. Biol., 4: 93-100)에 의하여 평가될 수 있고, 여기서 RT-qPCR이 바람직하다. 이러한 방법에서 발현 수준은 샘플에서 하나 이상의 참조 유전자의 (평균)발현 수준에 대해 정규화 될 것이다. 본원에서 사용된, 상기 용어 "참조 유전자(reference gene)"는 검사되는 시스템에서, 즉, 종양에서 RNA 전사체/mRNA 수준에서 상대적으로 변하지 않는 수준의 발현을 갖는 유전자를 의미한다. 이러한 유전자는 하우스키핑 유전자(housekeeping gene)라고 지칭될 수 있다. 참조 유전자의 비-제한적인 예는 CALM2, B2M, RPL37A, GUSB, HPRT1 및 GAPDH, 바람직하게는 CALM2 및/또는 B2M이다. 다른 적합한 참조 유전자는 당업자에게 알려져 있다.
RT-qPCR은 하나 이상의 지정된 파장의 광선으로 각 샘플을 비추고 여기된 형광단에서 방출되는 형광을 감지할 수 있는 능력을 가진 열 순환기에서 수행된다. 상기 열 순환기는 또한 샘플을 빠르게 가열하고 냉각할 수 있으므로 핵산 및 DNA 중합효소의 물리 화학적 특성을 활용할 수 있다. 실시간 qPCR에서 PCR 산물을 검출하는 두 가지 일반적인 방법은 다음과 같다: (1) 임의의 이중 가닥 DNA 사이에 삽입(intercalate)되는 비-특이적 형광 염료, (2) 프로브가 이의 상보적인 서열과 혼성화 한 다음에만 검출될 수 있는 형광 리포터로 표지된 올리고뉴클레오티드로 이루어진 서열-특이적 DNA 프로브 (예: TaqMan 프로브). 상기 프로브는 일반적으로 형광 표지된 프로브이다. 바람직하게는, 상기 형광 표지된 프로브는 형광 리포터 염료 및 소광(quencher) 염료 모두로 표지된 올리고뉴클레오티드(=이중-표지 프로브)로 구성된다. 적합한 형광 리포터 및 소광 염료/모이어티는 당업자에게 공지되어 있으며, 상기 리포터 염료/모이어티는 6-FAMTM, JOETM, Cy5®, Cy3®(이에 제한되지 않음)를 포함하고, 상기 소광 염료/모이어티는 dabcyl, TAMRATM, BHQTM-1, -2 또는 -3(이에 제한되지 않음)을 포함한다. 바람직하게는 본 발명에 따라 사용하기 위한 프라이머는 15 내지 30개 뉴클레오티드의 길이를 가지며, 특히 디옥시리보뉴클레오티드이다. 한 구체예에서, 상기 프라이머는 (1) HLA 유전자의 표적 mRNA-서열에 특이적이거나 이들로부터 유래되며, (2) 120bp 미만 (바람직하게는 100bp 미만)의 앰플리콘(amplicon) 크기를 제공하고, (3) mRNA-특이적 (엑손/인트론 고려; 바람직하게는 게놈 DNA의 증폭 없음)이며, (4) 이량체화하는 경향이 없고, 및/또는 (5) 58℃내지 62℃범위의 녹는점(melting temperature, Tm) (바람직하게는, Tm은 약 60℃을 갖도록 설계된다. 언급된 바와 같이, 상기 프로브는 (2)에 따른 RT-qPCR에 필요하지만, (1)에 따른 RT-qPCR의 경우, 프로브는 SYBR 그린과 같은 인터칼레이팅 염료(intercalating dye)로 대체될 수 있다.
RT-qPCR은 아래의 실시예에서 설명된다. HLA-H, J, L 및 G의 발현을 검출하기 위한 특정 프라이머는 표 1에 기술되어 있다. 이러한 프라이머 쌍 중 하나 이상은 바람직하게는 본 발명에서 정의된 HLA-H, J, L 및/또는 G 또는 이로부터 유래된 핵산 분자의 발현을 검출하는데 사용된다. 이들 프라이머 쌍 각각은 표 1에 나타낸 바와 같이 각각의 프로브와 함께 사용하는 것이 보다 바람직하다.
또한 qPCR의 대안으로서, 전기 영동 기술 또는 DNA 마이크로 어레이를 사용하여 본 발명의 제1 양태의 핵산분자의 수준을 얻을 수 있다. mRNA 식별 및 정량화에 대한 기존의 접근 방식은 크기에 대한 정보를 제공하는 겔 전기 영동과 서열-특이적 프로빙의 조합을 통해 이루어진다. 노던 블롯(Northern blot)은 이 부류에서 가장 일반적으로 적용되는 기술이다. 리보뉴클레아제 보호 분석(ribonuclease protection assay; RPA)은 노던 블롯에 대하여 더 민감하고 적은 노동력을 요구하는 대안으로 개발되었다. 용액에서 표지된 리보뉴클레오티드 프로브를 사용하여 혼성화가 수행된 후, 단일-가닥 RNA를 선택적으로 분해하는 리보뉴클레아제 혼합물(예: RNase A 및 RNase T1)로 비-혼성화된 샘플과 프로브를 분해한다. 이어지는 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동은 정량화 수단을 제공하며 프로브에 의하여 혼성화된 영역의 크기도 제공한다. 노던 블롯과 RPA 모두에서, 정량의 정확성과 정밀도는 검출 방법과 사용된 참조 또는 기준의 기능이다. 가장 일반적으로, 프로브는 32P 또는 33P로 방사성 표지되며, 이 경우 최종 겔이 X-선 필름 또는 인광체 스크린(phosphor screen)에 노출되고, 각 밴드의 강도는 농도계 또는 인광체 이미징 기기(imager)로 각각 정량화된다. 두 경우. 모두 노출 시간을 필요한 감도에 맞게 조정할 수 있지만 인광체 기반 기술은 일반적으로 더 민감하고 더 큰 동적 범위를 갖는다. 방사능 사용에 대한 대안으로, 프로브는 항원 또는 햅텐 (hapten)으로 표지될 수 있고, 그 후 이는 호스래디쉬 퍼옥시다제-(horseradish peroxidase-) 또는 알칼리성 포스파타제-(alkaline phosphatase-)가 접합된 항체에 의해 결합되고, 기질을 첨가한 후에 필름 또는 형광 이미징 기기(fluorescence imager) 상에서 화학발광에 의해 정량화된다. 이들의 모든 이미징 사용에서, 프로브 없는 겔의 인접 영역에서의 배경값을 공제해야 한다. 겔 형식의 가장 큰 장점은 모든 참조 기준(reference standard)이 샘플과 동시에 이미지화 될 수 있다는 것이다. 마찬가지로, 하우스키핑 유전자의 검출은 모든 샘플에 대해 동일한 조건에서 수행된다.
또한, 차세대 시퀀싱(next generation sequencing, NGS)이 사용될 수 있다(Behjati and Tarpey, Arch Dis Child Educ Pract Ed. 2013 Dec; 98(6): 236). NGS는 게놈 연구에 혁명을 일으킨 RNA 또는 DNA 시퀀싱 기술이다. NGS를 사용하면 전체 인간 게놈을 하루 안에 시퀀싱할 수 있다. 대조적으로, 인간 게놈을 해독하는 데 사용되었던 이전의 생어(Sanger) 시퀀싱 기술은 최종 초안을 제공하는데 10년 이상이 필요했다. 본 발명의 관점에서, NGS는 개방 구조(게놈 와이드 엑솜 시퀀싱)로 정량화하거나 본 출원에 개시된 각각의 HLA 유전자 및 동형을 보유하는 집중된 패널(focussed panel)에 의해 사용될 수 있다.
DNA 마이크로 어레이의 구축(construction)을 위해, 두 가지 기술이 등장했다. 일반적으로, 어레이 설계를 위한 각 경우의 출발점은 조사될 유전자 또는 추정 유전자(putative gene)에 해당하는 일련의 서열이다. 첫 번째 접근법에서, 올리고뉴클레오티드 프로브는 유리 기판에서 시작하여 화학적으로 합성된다. cDNA 프로브에 대한 올리고뉴클레오티드 혼성화의 가변적 효율 때문에, 여러 올리고뉴클레오티드 프로브가 각 관심 유전자에 상보적으로 합성된다. 더욱이, 어레이 상의 각각 완전히 상보적인 올리고뉴클레오티드에 대해, 단일 뉴클레오티드 위치에 불일치를 갖는 올리고뉴클레오티드가 구축되고 정규화에 사용된다. 올리고뉴클레오티드 어레이는 일반적으로 약 104-106 프로브/cm2의 밀도로 생성된다. DNA 마이크로 어레이 구축을 위한 두 번째 주요 기술은 cDNA 프로브를 유리 슬라이드 또는 기타 적합한 기판에 직접 로봇으로 인쇄하는 것이다. 관심있는 각 유전자에 대한 DNA 클론을 얻고, 정제하고, 범용 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 공통 벡터에서 증폭한다. 상기 프로브는 50-200 μm 정도 크기의 스팟에 로봇으로 침적(deposit)된다. 이 공간에서, 예를 들어, 약 103 프로브/cm2의 밀도를 얻을 수 있다.
단백질 또는 펩티드의 발현은 예를 들어 "단백질 또는 펩티드에 대한 결합 분자" 및 바람직하게는 "단백질 또는 펩티드에 대한 특이적 결합 분자"를 사용하여 결정될 수 있다. 단백질 또는 펩티드에 대한 결합 분자는 알려진 조건 하에서 단백질 또는 펩티드에 주로 결합되는 분자를 가리킨다. 단백질 또는 펩티드의 발현은 또한 웨스턴 블롯 분석, 질량 분광 분석, FACS 분석, ELISA 및 면역조직화학(immunohistochemistry)을 사용하여 얻을 수 있다. 이러한 기술은 단백질 또는 펩티드를 정성적으로, 반-정량적으로 및/또는 정량적으로 검출하는데 사용할 수 있는 방법의 비-제한적인 예이다.
웨스턴 블롯 분석은 널리 사용되며, 주어진 샘플, 예를 들어, 조직 균질물 또는 신체 추출물에서 특정 단백질 또는 펩티드를 검출하는데 사용되는 잘 알려진 분석 기술이다. 이는 겔 전기영동을 사용하여 (폴리)펩티드의 길이(변성 조건) 또는 단백질의 3D 구조(천연/비 변성 조건)에 따라 천연 또는 변성된 단백질 또는 펩타드를 분리한다. 그런 다음 단백질 또는 펩티드는 막(일반적으로 니트로셀룰로오스 또는 PVDF)으로 이동되고, 여기서 표적 단백질에 특이적인 항체를 사용하여 탐침 (검출)된다.
또한 질량 분석법(mass spectrometry; MS)은 널리 사용되고 잘 알려진 분석 기술로, 하전된 입자의 질량 대 전하 비율을 측정한다. 질량 분석법은 입자의 질량을 결정하고, 샘플 또는 분자의 원소 조성을 결정하고, 단백질, 펩티드 및 기타 화합물과 같은 분자의 화학 구조를 밝히는데 사용된다. 상기 MS의 원리는 하전된 분자 또는 분자 단편을 생성하기 위해 화학적 화합물을 이온화하고 이들의 질량 대 전하 비율을 측정하는 것으로 이루어진다.
형광 활성화 세포 분류(FACS) 분석은 널리 사용되고 잘 알려진 분석 기술로, 여기서 생물학적 세포는 각 세포의 형광 특성의 특정 광 산란에 따라 분류된다. 세포는 4% 포름알데히드에 고정되고, 0.2% Triton-X-100으로 투과되고, 형광단-표지된 항체(예: 단일- 또는 다-클론 항-HLA 항체)와 함께 인큐베이션 될 수 있다.
효소면역정량법(Enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA)은 또한 널리 사용되고 잘 알려진 민감한 분석 기술로, 여기서 효소는 특정 단백질 또는 펩티드의 검출을 위한 마커로서 항체 또는 항원에 연결된다.
면역조직화학(IHC)은 면역염색의 가장 일반적인 적용이다. 항체가 생물학적 조직의 항원에 특이적으로 결합하는 원리를 이용하여 조직 절편의 세포에서 항원(단백질)을 선택적으로 식별하는 과정을 포함한다. 특정 장치와 결합하여 IHC는 단백질 발현의 정량적인 현장 평가(in situ assessment)에 사용될 수 있다(Cregger et al. (2006) Arch Pathol Lab Med, 130:1026-1030 검토). 정량적 IHC는 염색 강도가 절대적인 단백질 수준과 상관관계가 있다는 사실을 이용한다.
HLA-L, HLA-H 및 HLA-J가 당업계에서 유사유전자(pseudogenes)로 잘못된 주석이 달렸다는 점을 출원인에 의해 놀랍게도 이전에 발견되었다. 사실, 이들 유전자는 단백질을 코딩하고 HLA-L, HLA-H 및 HLA-J의 발현은 다양한 암에서 검출되었다(PCT/EP2019/060606, EP 19 18 4729.2, EP 19 18 4681.5 및 EP 19 18 4717.7). 또한, HLA-V 및 HLA-Y에서도 프로모터 영역 및 오픈 리딩 프레임(open reading frame)이 발견되었다. HLA-L, HLA-H, HLA-J, HLA-V 및 HLA-Y 모두 당업계에서 잘못된 주석이 달렸으므로, HLA-L, HLA-H, HLA-J, HLA-V 및 HLA-Y는 일괄하여 새로운 HLA-그룹으로 기술될 수 있으며, 이를 여기서 클래스 lw라고 한다. 또한, 방광암(bladder cancer) 환자에서 HLA-L, HLA-H 및 HLA-J의 높은 발현 수준은 이들 환자의 생존과 부정적인 관련이 있는 것으로 밝혀졌다. 이러한 HLA 유전자의 발현 수준이 높을수록 환자가 2년 이내에 암으로 사망할 가능성이 더 높다(EP 19 18 4681.5 및 EP 19 18 4717.7). 이 증거자료는 가용성 HLA 형태 L, H 및 J의 발현이 종양 환자의 면역계를 피하는 메커니즘으로 종양에 의해 사용된다는 것을 보여준다. HLA-V 및 HLA-Y에 대해서도 동일하게 가정할 수 있다. 이러한 이론에 얽매이지 않고 본 발명자들은 이러한 가용성 HLA가 종양 환자의 면역계에 의해 종양 세포가 인식되는 것을 방지하는 종양 세포 주위의 구름으로부터 형성된다고 믿는다. 따라서 핵산 또는 단백질 수준에서 HLA-L, HLA-H, HLA-J, HLA-V 및/또는 HLA-Y를 억제할 수 있는 약제가 종양의 치료 및 예방에 적합한 수단이다. 유사하게, 핵산 또는 단백질 수준에서 생체 내 HLA-L, HLA-H, HLA-J, HLA-V 및/또는 HLA-Y의 부위를 검출할 수 있는 진단제는 대상체에서 종양을 진단할 수 있다. 그러나, 종양 세포는 이질적(heterogenous)이지 않기 때문에 모든 종양은 면역 계를 벗어나기 위해 가용성 HLA-L, HLA-H, HLA-J, HLA-V 및 HLA-Y 중 하나 이상의 발현을 사용할 수 있다. 이러한 이유로 본 발명의 제1 양태의 방법은 핵산 및/또는 단백질 수준에서 HLA-L, HLA-H, HLA-J, HLA-V 및 HLA-Y의 발현을 결정한 다음(단계 A) HLA-L, HLA-H, HLA-J, HLA-V 및/또는 HLA-Y가 발현되는 경우 약제(단계 B) 및/또는 진단제(B')를 제조한다. 이 약제 또는 진단제는 특히 본 발명의 제1 양태의 방법에서 사용되는 것으로서 샘플을 얻은 대상체에 대한 개인 맞춤형 약제 또는 진단제로 사용될 수 있다. 이 접근 방식은 첨부된 실시예에서 더 자세히 설명된다. 실시예 1 및 2는 HLA 발현의 영상화 및 검출을 보여준다. 실시예 3 및 4에서는 항-HLA 진단제 및 치료제의 생성을 나타낸다. 실시예 5는 암 마우스 모델에서 HLA 발현의 진단에 관한 것이다. 마지막으로, 실시예 6 내지 9는 암 환자에서 HLA 발현의 진단 및 항-HLA 요법을 예시한다.
본 발명의 제1 양태의 바람직한 구체예에 따르면 상기 방법은 (i) 서열번호 6 내지 10의 뉴클레오티드 서열 중 적어도 2개의 핵산 분자 또는 본 발명의 제1 양태에서 정의된 핵산 분자, (ii) 서열번호 1 내지 5 중 어느 하나의 아미노산 서열 중 적어도 2개의 단백질 또는 본 발명의 제1 양태에서 정의된 단백질 또는 펩티드, 및/또는 (iii) 서열 번호 6 내지 10의 뉴클레오티드 서열 중 적어도 하나의 핵산 분자 또는 제1항에 정의된 핵산 분자 및 서열 번호 1 내지 5 중 어느 하나의 아미노산 서열 중 적어도 하나의 단백질 또는 펩티드 또는 본 발명의 제1 양태에서 정의된 단백질 또는 펩티드의 발현이, 단계 (A)에서 결정되는 것을 포함한다.
종양은 HLA-L, HLA-H, HLA-J, HLA-Y 및 HLA-V 중 하나를 발현할 뿐만 아니라 종양 환자의 면역계를 벗어나기 위해 이들 중 2개 또는 3개 모두를 발현할 수 있다. 이러한 이유로 핵산 수준, 단백질 수준 또는 이들 임의의 혼합물에서 HLA-L, HLA-H, HLA-J, HLA-Y 및 HLA-V 중 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개 및 5개 모두의 발현을 증가하는 선호도에 따라 결정하는 것이 유리하다.
HLA-L, HLA-H, HLA-J, HLA-Y 및 HLA-V 중 하나 이상을 측정하고 본 발명에서 설명된 HLA 유전자, 단백질 또는 펩티드 중 하나 이상을 선택적으로 추가로 측정하는 것 또한 치료할 환자에 최적화된 항-HLA 치료 요법을 컴파일(compiling)할 수 있기 때문이다. 진단 측정과 관련하여 이들 HLA 중 하나 이상은, 예를 들어, 선택된 종양 병변에서 HLA 발현 프로파일(expression profile)을 결정할 수 있게 한다.
본 발명의 제1 양태의 또 다른 바람직한 구체예에 따르면 상기 방법은 HLA 클래스 Ib 유전자 HLA-E, HLA-F, 및 HLA-G 중 적어도 하나 및/또는 상기 MHC 클래스 Ib 유전자로부터 생성된 적어도 하나의 단백질 또는 펩티드의 발현을 단계 (A)에서 결정하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 제1 양태의 더 바람직한 구체예에 따르면, 상기 방법은 HLA 클래스 I 유전자 HLA-A, HLA-B, 및 HLA-C 중 적어도 하나 및/또는 상기 MHC 클래스 I 유전자로부터 생성된 적어도 하나의 단백질 또는 펩티드의 발현을 단계 (A)에서 결정하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 제1 양태의 또 다른 바람직한 구체예에 따르면, 상기 방법은 HLA 클래스 II 유전자 HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DRA, 및 HLA-DRB1 중 적어도 하나 및/또는 상기 MHC 클래스 II 유전자로부터 생성된 적어도 하나의 단백질 또는 펩티드의 발현을 단계 (A)에서 결정하는 단계를 추가로 포함한다.
인간 백혈구 항원 (HLA) 시스템 또는 복합체는 인간의 주조직 적합성 복합체(MHC) 단백질을 인코딩하는 유전자 복합체이다. 이러한 세포-표면 단백질은 인간의 면역계 조절을 담당한다. HLA 유전자 복합체는 염색체 6p21 내의 3Mbp 스트레치 상에 있다. HLA 유전자는, 다양한 대립 유전자를 가지고 있음을 의미하는, 고도의 다형성(polymorphic)을 가지므로 적응 면역계를 미세 조정(fine-tune)할 수 있다. 특정 유전자에 의해 인코딩된 단백질은 장기 이식의 인자로서 역사적 발견의 결과로서, 항원으로도 알려져 있다.
HLA 시스템은 I부터 III까지의 세 가지 클래스로 나뉜다. 두 가지 주요 클래스는 MHC 클래스 I 및 II이다.
인간은 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C로 알려진 세 가지 주요 또는 고전적인 MHC 클래스 I 유전자를 가지고 있다. 주요 MHC 클래스 I 유전자는 당해 분야에서 클래스 I 또는 클래스 Ia로 지칭된다. 이 유전자로부터 생성된 단백질은 거의 모든 세포의 표면에 존재한다. 세포 표면에서, 이러한 단백질은 세포 내로부터 내보내진 단백질 단편(펩티드)에 결합된다. MHC 클래스 I 단백질은 이러한 펩티드를 면역계에 표시한다. 종양 MHC 클래스 Ia 발현의 손실을 포함하여, T-세포 인식을 피하기 위한 면역 회피 전략은 일반적으로 악성 세포에서 발견된다(Garrido, Curr Opin Immunol. 2016 Apr; 39: 44-51). 따라서, 종양 세포는 면역계를 회피하기 위해 MHC 클래스 Iw의 발현을 상향 조절하는 반면, MHC 클래스 Ia의 발현은 종양 세포에 의해 감소된다. 따라서, 본 발명에 기재된 치료는 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C의 발현을 증가시키는 화합물을 포함할 수 있다. 가장 단순한 형태에서 이러한 화합물은 HLA-A, HLA-B 및/또는 HLA-C 또는 HLA-A, HLA-B 및/또는 HLA-C를 발현하는 벡터 또는 플라스미드일 수 있다. MHC 클래스 Ia는 하향조절되고 MHC 클래스 Iw는 면역계를 회피하기 위해 종양 세포에 의해 상향조절되기 때문에, 각각 적어도 하나의 구성원(member)의 검출은 또한 본 발명의 방법의 선택성을 증가시킬 수 있다. 이것은 또한 MHC 클래스 Ia가 정상 세포에 의해 발현되는 반면 MHC 클래스 Iw는 본 발명자들이 아는 한 그렇지 않기 때문이다. 따라서 정상 조직과 악성 조직의 경계를 보다 선택적으로 결정할 수 있다.
또한 인간은 HLA-E, HLA-F 및 HLA-G로 알려진, 3개의 마이너(minor) 또는 비-고전적(non-classical) MHC 클래스 I 유전자를 가지고 있다. 마이너 MHC 클래스 I 유전자는 당업계에서 클래스 Ib로 지칭된다. HLA 클래스 Ib 유전자인, HLA-E, HLA-F 및 HLA-G는, 고전적인 HLA 클래스 Ia 유전자보다 한참 뒤에 발견되었다. 다양한 연구 결과가 성인기에서 HLA 클래스 Ib 분자의 기능적 역할을 뒷받침하지만, 특히 HLA-G 및 HLA-F는 생식 및 임신과 관련하여 가장 집중적으로, 또한 주로 연구되었다(Persson et al. (2017), Immunogenetics, DOI 10.1007/s00251-017-0988-4). 태반의 태아-모체 경계면에서 HLA 클래스 Ib 단백질의 발현은 반-동종 태아(semi-allogenic fetus)의 모체 수용에 중요한 것으로 보인다. HLA 클래스 Ia의 기능과 달리, HLA 클래스 Ib는 면역-조절 및 관용 기능을 보유한다. HLA-F는, 예를 들어, HLA-F1, -F2 또는 -F3일 수 있다. 유사하게, HLA-G는 HLA-G1, -G2, -G3, -G4, -G5, -G6 및 -G7 중 하나일 수 있다. 보다 구체적으로, HLA-G의 1차 전사체(8 Exons; NCBI Gene Bank NM_002127.5, version of September 16, 2019)는 막 결합(HLA-G1, -G2, -G3, -G4) 및 가용성(HLA-G5, -G6, -G7) 단백질 동형체(protein isoform)를 인코딩하는 7개의 대체 mRNA로 스플라이싱될 수 있다(Carosella et al., 2008, Trends Immunol.; 29(3):125-32). HLA-G1은 전장 HLA-G 분자이고, HLA-G2에는 엑손 4가 없고, HLA-G3에는 엑손 4와 5가 없으며, HLA-G4에는 엑손 5가 없다. HLA-G1 내지 -G4는 엑손 6과 7에 의해 인코딩되는 막횡단 및 세포질 꼬리(cytoplasmic tail)의 존재로 인한 막-결합 분자이다. HLA-G5는 HLA-G1과 유사하지만 인트론 5를 유지하고, HLA-G6에는 엑손 4가 없지만 인트론 5는 유지하고, HLA-G7에는 엑손 4가 없지만 인트론 3은 유지한다. HLA-G5 및 -G6은 막횡단 및 세포질 꼬리의 번역을 방지하기 위한 조기 정지 코돈을 포함하는 인트론 5의 존재로 인해 가용성 형태이다. HLA-G7은 조기 정지 코돈을 포함하는 인트론 3의 존재로 인해 용해된다. 또한 HLA-F가 교대로 접합된다. 세 개의 동형체 F1, F2 및 F3은 모두 막-결합 동형체이다. HLA-E의 동형체는 보고되지 않았으며 HLA-E는 막-결합되어 있다. HLA-E, HLA.-F1, F2, F3 및 HLA-G1, G2, G3, G4, G5, G6 및 G7의 아미노산 서열은 각각 서열번호 13 내지 23에, 이들 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 각각 서열번호 24 내지 34에 제시되어 있다. MHC 클래스 Ib 단백질 및 펩티드는 또한 HLA-L과 관련하여 상기 본원에서 논의된 바와 같이 그의 개방형 구조(open conformer) 형태를 포함한다. 예를 들어, HLA-F의 개방형 구조는 선행 기술에 알려져 있다; Garcia-Beltran (2016); Nat Immunol. 2016 Sep; 17(9):1067-1074. 예를 들어, 고전적인 HLA 형태 및 다른 HLA 중쇄(heavy HLA chain)의 복합체와는 별도로, β마이크로글로불린(β및 펩티드 결합 홈에 결합된 펩티드의 부재를 특징으로 하는 HLA-F의 안정적인 개방형 구조(OC)가 있다(Sim et al. (2017) Immunity 2017, 46, 972-974). HLA-F와 같은, 일부 HLA 유전자는 다른 HLA 클래스 I 분자의 중쇄와 복합체를 형성한다(Goodridge et al(2010) J. Immunol. 2010, 184, 6199-6208). 또한, 이들 개방형 구조 및 복합체는 본 발명에 따라 사용될 수 있는 HLA 클래스 Ib 유전자에 포함된다. MHC 클래스 Iw의 경우와 마찬가지로 종양은 면역계를 회피하기 위해 MHC 클래스 Ib의 발현을 상향 조절한다(Wurfel et. al. (2019), Int. J. Mol. Sci. 2019, 20, 1830; doi: 10.3390/ijms20081830). 따라서 본 발명에 기재된 치료는 HLA-E, F 및/또는 G의 억제제를 포함할 수 있다. 클래스 Iw 억제제(예: 항체, siRNA, 소형(small), 항체 모방체, 분자 등) 유형의 바람직한 예는 본 발명의 하기에 기재되어 있고 이러한 바람직한 유형은 Ib 억제제에 준용하여 적용된다.
인간에는 6개의 주요 MHC 클래스 II 유전자가 있다: HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DRA 및 HLA-DRB1. MHC 클래스 II 유전자는 특정 면역계 세포의 표면에 거의 독점적으로 존재하는 단백질을 만들기 위한 명령을 제공한다. MHC 클래스 I 단백질과 마찬가지로, 이 단백질은 면역계에 펩티드를 제시한다. MHC 클래스 II 유전자는 특정 면역계 세포의 표면에 거의 독점적으로 존재하는 단백질을 만들기 위한 명령을 제공한다. MHC 클래스 I 단백질과 마찬가지로, 이 단백질은 면역계에 펩티드를 제시한다. 종양 세포에 의한 MHC-II 발현의 생물학적 결과는 Axelrod et al. (2019), Clin Cancer Res, DOI: 10.1158/1078-0432에서 검토된다. 축적된 증거는 종양-특이적 MHC-II가, 면역 요법으로 치료된 환자를 포함하여, 암 환자의 좋은 결과 및 뮤린 모델(murine model)의 종양 거부와 관련이 있음을 보여준다. 예를 들어, 종양 세포에 대한 MHC-II 분자의 발현은 면역 관문 차단(immune checkpoint blockade)에 대한 반응을 예측할 수 있다.
종양 항원은 T-세포 수용체에 의해 인식되기 위해 HLA-제한 방식으로 제시되어야 하기 때문에, 인간 백혈구 항원(HLA) 분자는 면역 인식 및 면역계에 의한 신생 세포(neoplastic cell)의 후속 사멸에 필수적이다. 손상된 HLA-Ia 발현은 세포독성 면역 기전의 활성화를 방지하는 반면, 손상된 HLA-II 발현은 항원 제시 세포의 항원-제시 능력에 영향을 미친다. 종양 세포에 의한 비정상적인 HLA-Ib 발현은 거의 모든 면역 세포의 활동을 억제함으로써 면역 회피를 촉진한다(Rodriguez(2017), Immunogenetics(2017), Oncology Letters, https://doi.org/10.3892/ol.2017.6784, pages: 4415-4427 및 EP 2 561 890 B1 및 W
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rfel et al.(2019), Int. J. Mol. Sci. 2019, 20, 1830, doi:10.3390/ijms20081830).
보다 구체적으로, HLA-I(a)는 종양 세포의 면역 인식 및 종양과 면역 세포 사이의 신호 전달에 중요하기 때문에, 종양 세포 표면의 변경된 HLA-I(a) 발현은 발암을 촉진하는 초기의 빈번한 사건이다. 여러 연구에서 이형접합성 손실(loss of heterozygosity, LOH)로 인한 다중 HLA 대립유전자의 적어도 50% 손실과 함께, 다양한 인간 종양에서 고전적 HLA-I(a) 분자 발현의 전체 또는 부분적 손실이 보고되었다. 다양한 면역 이펙터(effector)에 의한 인식을 회피하기 위해 종양 세포가 사용하는 또 다른 HLA 매개 전략은 면역-적격 세포에 대한 억제제 리간드로 기능하여 종양 면역 회피를 허용하는 소수 또는 비-고전적 HLA-Ib 분자의 비정상적인 발현이다.
상기 이유들 때문에, 본 발명의 제1 양태의 방법에서 하나 이상의 HLA 클래스 Ia, HLA 클래스 Ib 및/또는 HLA 클래스 II 유전자 또는 단백질 또는 펩티드의 발현을 추가로 평가하는 것이 유리하다. 이 발현 분석의 결과는 종양이 대상체의 면역계를 회피하는 방법에 대한 추가 정보를 제공하므로 종양 환자에게 종양과 싸우기(combat) 위한 맞춤형 약제 또는 생체 내 종양 부위를 검출하기 위한 맞춤형 진단제를 제공하기 위해 고려할 수 있는 추가 정보를 제공한다.
예를 들어, HLA 클래스 Ib의 발현이 검출되는 경우 새로운 HLA 클래스 lw와 관련하여 상기에서 기재된 바와 같이, 핵산 또는 단백질 수준에서 검출된 HLA 클래스 Ib를 억제할 수 있는 화합물을 약제에 혼입시키는 것이 또한 바람직하다. 유사하게, HLA 클래스 Ib의 발현이 검출되는 경우 새로운 HLA 클래스 lw와 관련하여 본 발명의 상기에서 기재된 바와 같이, 핵산 또는 단백질 수준에서 HLA 클래스 Ib의 부위 및/또는 양을 생채 내에서 검출할 수 있는 화합물을 진단제에 포함하는 것이 또한 바람직하다. 이 점에 있어서 Iw 클래스와 관련하여 본 발명의 상기 또는 하기에서 기재된 바람직한 특징 및 구체예는 클래스 lb에 준용하여 적용된다.
본 발명의 제1 양태의 또다른 바람직한 구체예에 따르면, 상기 방법은 임신 초기 및 암배아 퇴행 동안 발현되는 적어도 하나의 성장 인자 및/또는 적어도 하나의 종양 마커 및/또는 적어도 하나의 단백질의 발현이 단계 (A)에서 결정하는 단계를 추가로 포함한다.
성장 인자는 세포 성장, 증식, 치유 및/또는 세포 분화를 자극할 수 있는 자연 발생 물질이다. 종양 형성 및 종양 진행에서 성장 인자의 역할은, 예를 들어, Witsch et al. (2011), Physiology (Bethesda). 2010 Apr; 25(2): 85-101에서 검토되었다. 종양은 종양 세포가 통제할 수 없는 방식으로 성장할 수 있는 효과와 함께 성장 인자를 비정상적으로 발현한다. 성장 인자의 발현이 검출되는 경우 핵산 또는 단백질 수준에서 검출된 성장 인자를 억제할 수 있는 화합물을 약제에 혼합하는 것이 바람직하며, 이는 새로운 HLA 클래스 Iw와 관련하여 상기 기재된 바와 같다. 유사하게, 성장 인자의 발현이 검출되는 경우 핵산 또는 단백질 수준에서 성장 인자의 부위 및/또는 양을 생체 내에서 검출할 수 있는 화합물을 진단제에 통합하는 것이 또한 바람직하며, 이는 새로운 HLA 클래스 Iw와 관련하여 상기 본 발명에서 기재된 바와 같다. 이 점에 있어서 Iw 클래스와 관련하여 본 발명의 상기 또는 하기에서 기재된 바람직한 특징 및 구체예는 성장 인자에 준용하여 적용된다.
종양 마커(tumor marker)는 혈액, 소변 또는 신체 조직에서 발견되는 하나 이상의 암 유형의 존재에 의해 상승될 수 있는 바이오마커(biomarker)이다. 각각 특정 질병 과정을 나타내는 다양한 종양 마커가 있으며, 이들은 암의 존재를 감지하는 데 도움이 되도록 종양학에서 사용된다. 본 발명에서 종양 마커는 핵산 분자, 단백질, 접합된 단백질, 또는 펩티드일 수 있다. 따라서, 종양 마커의 검출은 종양 진단에 도움이 될 수 있다. 따라서, 종양 마커의 발현이 검출되는 경우, 핵산 또는 단백질 수준에서 종양 마커의 부위 및/또는 양을 생체 내에서 검출할 수 있는 화합물을 진단제에 혼합하는 것이 또한 바람직하며, 새로운 HLA 클래스 Iw와 관련하여 상기 본 발명에서 기재된 바와 같다. 이 점에 있어서 Iw 클래스와 관련하여 본 발명의 상기 또는 하기에서 기재된 바람직한 특징 및 구체예는 종양 마커에 준용하여 적용된다.
임신 초기 및 암배아 퇴행(carcinoembryonic regression)에서 발현되는 단백질(예: 암배아 항원(carcinoembryonic antigen, CEA) 유전자 패밀리)은 일반적으로 출생 후 높게 발현되지 않는다. 이 단백질의 정상적인 기능은 조직 구조를 구성하고 다양한 신호 전달을 조절하는 것이다. 그들의 비정상적인 발현은 인간 악성 종양의 발병으로 이어진다. 특히, CEA 및 CEACAM6은 많은 유형의 인간 암에서 상향-조절된다. 그들의 비정상적인 발현은 인간의 악성 종양에서 발견된다. 이러한 단백질의 발현이 검출되는 경우, 핵산 또는 단백질 수준에서 검출된 단백질을 억제할 수 있는 화합물을 약제에 혼합하는 것이 또한 바람직하며, 이는 새로운 HLA 클래스 Iw와 관련하여 상기 본 발명에서 기재된 바와 같다. 유사하게, 이러한 단백질의 발현이 검출되는 경우, 핵산 또는 단백질 수준에서 단백질의 부위 및/또는 양을 생체 내에서 검출할 수 있는 화합물을 진단제에 혼합하는 것이 또한 바람직하며, 이는 새로운 HLA 클래스 Iw와 관련하여 상기 본 발명에서 기재된 바와 같다. 이 점에 있어서 Iw 클래스와 관련하여 본 발명의 상기 또는 하기에서 기재된 바람직한 특징 및 구체예는 이러한 단백질에 준용하여 적용된다.
본 발명의 제1 양태의 보다 바람직한 구체예에 따르면, 적어도 하나의 성장 인자는 표피 성장 인자(epidermal growth factor, EGF), 섬유아세포 성장 인자(fibroblast growth factor, FGF), 염기성 섬유아세포 성장 인자(basic fibroblast growth factor, bFGF), 성장 분화 인자-9(growth differentiation factor-9, GDF9), 간세포 성장 인자(hepatocyte growth factor, HGF), 간암-유래 성장 인자(hepatoma-derived growth factor, HDGF), 각질세포 성장 인자(keratinocyte growth factor, KGF), 신경 성장 인자(nerve growth factor, NGF), 태반 성장 인자(placental growth factor, PGF), 혈소판-유래 성장 인자(platelet-derived growth factor, PDGF), 기질 세포-유래 인자 1(stromal cell-derived factor 1, SDF1), 형질전환 성장 인자(transforming growth factor), 및 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
상기 성장 인자 목록은 이러한 성장 인자의 발현이 종양 증식을 유도하는 것으로 알려져 있기 때문에 선호된다.
본 발명의 제1 양태의 또 다른 더 바람직한 구체예에 따르면, 적어도 하나의 종양 마커는 소마토스타틴 수용체(somatostatin receptors), TSH(thyrotropin) 수용체, 티로신 수용체(tyrosin receptors), 및 전립선-특이적 막 항원(prostate-specific membrane antigen, PSMA)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
위의 종양 마커 목록은 이러한 마커가 현재 특정 종양의 진단에 사용되기 때문에 선호된다.
본 발명의 제1 양태의 또 다른 바람직한 구체예에 따르면, (i) 약제는 저분자, 압타머, siRNA, shRNA, miRNA, 리보자임, 안티센스 핵산 분자, CRISPR-Cas9-기반 작제물, CRISPR Cpf1-기반 작제물, 메가뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제, 또는 적어도 하나의 핵산 분자의 발현을 억제할 수 있는 TALE(transcription activator-like(TAL) effector) 뉴클레아제이거나 이를 포함하며, 및/또는 (ii) 약제는 저분자, 항체, 단백질 약물, 또는 적어도 하나의 단백질 또는 펩티드를 억제할 수 있는 압타머이거나 이를 포함하되, 단백질 약물은 바람직하게는 항체 모방체이고, 여기서 항체 모방체는 바람직하게는 아피바디(affibodies), 애드넥틴(adnectins), 안티칼린(anticalins), 달핀(DARPin), 아비머(avimers), 나노피틴(nanofitins), 아필린(affilins), 쿠니츠 도메인 펩티드(Kunitz domain peptides) 및 피노머(Fynomers®이며, 및/또는 (iii) 진단제는 저분자, 압타머, siRNA, shRNA, miRNA, 리보자임, 안티센스 핵산 분자, CRISPR-Cas9-기반 작제물, CRISPR-Cpf1-기반 작제물, 메가뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제, 및 적어도 하나의 발현된 핵산 분자에 결합할 수 있는 TALE(transcription activator-like(TAL) effector) 뉴클레아제이거나 이를 포함하며, 및/또는 (iv) 진단제는 저분자, 항체, 단백질 약물, 또는 적어도 하나의 발현된 단백질 또는 펩티드에 결합할 수 있는 압타머이거나 이를 포함하되, 단백질 약물은 바람직하게는 항체 모방체이고, 여기서 항체 모방체는 바람직하게는 아피바디(affibodies), 애드넥틴(adnectins), 안티칼린(anticalins), 달핀(DARPin), 아비머(avimers), 나노피틴(nanofitins), 아필린(affilins), 쿠니츠 도메인 펩티드(Kunitz domain peptides) 및 피노머(Fynomers®로부터 선택된다.
본원에서 사용되는 "저분자"는 바람직하게는 유기 분자이다. 유기 분자는 탄소 기반, 탄소-탄소 결합에 의해 서로 연결된 탄소 원자를 갖는 화학적 화합물의 부류와 관련되거나 이에 속한다. 용어 유기의 원래 정의는 화학 화합물의 공급원과 관련되며, 무기 화합물은 광물 공급원에서 얻은 것인 반면에, 유기 화합물은 식물 또는 동물 또는 미생물 공급원에서 얻은 탄소-함유 화합물이다. 유기 화합물은 천연 또는 합성일 수 있다. 유기 분자는 바람직하게는 방향족 분자이고 더욱 바람직하게는 헤테로 방향족 분자이다. 유기 화학에서, 상기 용어 방향족이란 동일한 원자 세트를 가진 다른 기하학적 또는 연결 배열보다 더 높은 안정성을 나타내는 공명 결합 고리를 갖는 사이클릭(고리-모양의), 평면(평평한) 분자를 설명하는데 사용된다. 방향족 분자는 매우 안정적이며, 쉽게 분해되어 다른 물질과 반응하지 않는다. 헤테로 방향족 분자에서, 방향족 고리의 원자 중 적어도 하나는 탄소 이외의 원자, 예를 들어 N, S, 또는 O이다. 전술한 모든 유기 분자에 대해 분자량은 바람직하게는 200 Da 내지 1500 Da 범위이고, 더욱 바람직하게는 300 Da 내지 1000 Da범위이다.
또한, 본 발명에 따른 "저분자"는 무기 화합물일 수 있다. 무기 화합물은 광물 공급원으로부터 유래되며 탄소 원자가 없는 모든 화합물(이산화탄소, 일산화탄소 및 탄산염 제외)을 포함한다. 바람직하게는, 저분자는 약 2000 Da 미만, 또는 약 1000 Da 미만, 예컨대 약 500 Da 미만, 그리고 더욱 바람직하게는 약 Da amu 미만의 분자량을 갖는다. 저분자의 크기는 당업계에 잘 알려진 방법, 예를 들어 질량 분석법에 의해 결정될 수 있다. 저분자는, 예를 들어, 표적 분자의 결정 구조를 기반으로 설계될 수 있으며, 여기서 생물학적 활성을 담당할 것으로 추정되는 부위는 생체 내 고처리량 스크리닝(HTS) 분석과 같은 생체 내 분석을 통해 확인 및 검증될 수 있다.
본 발명에 따라 사용되는 용어 "항체"는, 예를 들어, 다클론 또는 단클론 항체를 포함한다. 또한, 표적에 대한 결합 특이성을 여전히 유지하는 이의 유도체 또는 단편, 예를 들어 HLA-J는 용어 "항체"에 포함된다. 항체 단편 또는 유도체는, 특히, Fab 또는 Fab' 단편, Fd, F(ab')2, Fv 또는 scFv 단편, 단일 도메인 VH 또는 V-유사 도메인, 예컨대 VhH 또는 V-NAR-도메인뿐만 아니라 미니바디, 디아바디, 트리바디 또는 트리플바디, 테트라바디 또는 화학적으로 접합된 Fab'-다량체를 포함한다(예를 들어, Harlow and Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 198; Harlow and Lane "Using Antibodies: A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999; Altshuler EP, Serebryanaya DV, Katrukha AG. 2010, Biochemistry (Mosc)., vol. 75(13), 1584; Holliger P, Hudson PJ. 2005, Nat Biotechnol., vol. 23(9), 1126 참조). 특히 다량체 형식은 2개의 상이한 유형의 항원에 동시에 결합할 수 있는 이중 특이적 항체를 포함한다. 제1 항원은 본 발명에 따른 단백질에서 발견될 수 있다. 제2 항원은, 예를 들어, 암 세포 또는 특정 유형의 암 세포에서 특이적으로 발현되는 종양 마커일 수 있다. 이중 특이적 항체 형식의 비-제한적 예는 바이클로닉(이중 특이적, 전장 인간 IgG 항체), DART(Dual-affinity Re-targeting Antibody) 및 BiTE(다른 항체의 두 개의 단일-사슬 가변 단편 (scFv)으로 구성됨)분자이다(Kontermann and Brinkmann (2015), Drug Discovery Today, 20(7):838-847). 이러한 이중 특이적 항체의 사용은 이중 특이적 항체의 항종양 작용을 종양 세포에 집중시키는 것을 가능하게 한다.
상기 용어 "항체"는 또한 키메라(인간 불변 도메인, 비인간 가변 도메인), 단일 사슬 및 인간화 항체 (비인간 CDR을 제외한 인간 항체)와 같은 구체예를 포함한다.
항체 생산을 위한 다양한 기술은 당업계, 예를 들어, Harlow and Lane (1988) 및 (1999) 및 Altshuler et al., 2010, loc. cit.에 잘 알려져 있다. 따라서, 다클론 항체는 첨가제 및 보조제와 혼합된 항원으로 면역화한 후 동물의 혈액에서 얻을 수 있으며, 단클론 항체는 연속 세포주 배양에 의해 생산된 항체를 제공하는 임의의 기술에 의해 생산될 수 있다. 이러한 기술에 대한 예가 Harlow E 및 Lane D, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; Harlow E 및 Lane D, 항체 사용: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999 등에 설명되고; K hler 및 Milstein, 1975에 의해 처음 기술된 하이브리도마(hybridoma) 기술, 트리오마(trioma) 기술, 인간 B-세포 하이브리도마 기술(예: Kozbor D, 1983, Immunology Today, vol.4, 7; Li J, et al. 2006, PNAS, vol. 103(10), 3557 참조) 및 인간 단클론 항체를 생산하기 위한 EBV-하이브리도마 기술(Cole et al., 1985, Alan R. Liss, Inc, 77-96)을 포함한다. 또한, 재조합 항체는 단클론 항체로부터 얻거나 파지, 리보솜, mRNA 또는 세포 제시(cell display)와 같은 다양한 제시 방법을 사용하여 신규하게 제조될 수 있다. 재조합(인간화) 항체의 발현에 적합한 시스템은, 예를 들어, 박테리아, 효모, 곤충, 포유류 세포주 또는 유전자 이식 동물 또는 식물로부터 선택될 수 있다(예: US patent 6,080,560; Holliger P, Hudson PJ. 2005, Nat Biotechnol., vol. 23(9), 11265 참조). 또한, 단일 사슬 항체의 생산에 대해 기술된 기술(특히, US Patent 4,946,778 참조)은, 예를 들어, HLA-J의 에피토프에 특이적인 단일 사슬 항체를 생산하도록 적응될 수 있다. BIAcore 시스템에 사용된 표면 플라즈몬 공명은 파지 항체의 효율을 높이기 위해 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "항체 모방체(antibody mimetic)"는 항체와 같이 항원, 예를 들어 HLA-J 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 화합물을 의미하나, 항체와 구조적 관련은 없다. 항체 모방체는 일반적으로 몰질량이 약 3-20 kDa인 인공 펩티드 또는 단백질이다. 예를 들어, 항체 모방체는 애피바디(affibody), 애드넥틴(adnectin), 안티칼린(anticalin), 달핀(DARPin), 아비머(avimer), 나노피틴(nanofitin), 애필린(affilin), 쿠니츠 도메인 펩티드(Kunitz domain peptides), 피노머(Fynomers®삼중특이적 결합 분자(trispecific binding molecule) 및 프로바디(probody)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 이들 폴리펩티드는 당업계에 잘 알려져 있으며, 이하에서 더욱 상세하게 설명된다.
본 발명에서 사용된 용어 "애피바디(affibody)"는 포도상구균(staphylococcal) 단백질 A의 Z-도메인으로부터 유래된 항체 모방체 패밀리를 지칭한다. 구조적으로, 애피바디 분자는 삼중-나선(three-helix) 다발 도메인을 기반으로 하며, 이는 또한 융합 단백질에 통합될 수 있다. 애피바디는 그 자체로 약 6 kDa의 분자량을 가지며 고온과 산성 또는 알칼리성 조건에서 안정적이다. 표적 특이성은 모 단백질 도메인의 결합 활성에 관여하는 두 개의 알파-나선에 위치한 13개 아미노산의 무작위화에 의해 획득된다(Feldwisch J, Tolmachev V.;(2012) Methods Mol Biol. 899: 103-26).
본원에서 사용된 용어 "애드넥틴(adnectin)"("모노바디(monobody)"라고도 함)은 인간 피브로넥틴 III (10Fn3)의 10번째 세포 외 도메인을 기반으로 하는 분자에 관한 것으로, 이는 2 내지 3개의 노출된 루프를 갖는 94개 잔기의 Ig-유사 β샌드위치 폴드를 채택하지만, 중앙의 이황화 다리가 없다(Gebauer and Skerra (2009) Curr Opinion in Chemical Biology 13:245-255). 원하는 표적, 예를 들어 HLA-J에 대한 특이성을 갖는 애드넥틴은 단백질의 특정 루프에 변형을 도입함으로써 유전적으로 조작될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "안티칼린(anticalin)"은 리포칼린 유래의 조작된 단백질을 지칭한다(Beste G, Schmidt FS, Stibora T, Skerra A. (1999) Proc Natl Acad Sci U S A. 96(5):1898-903; Gebauer 및 Skerra (2009) Curr Opinion in Chemical Biology 13:245-255). 안티칼린은 리포칼린 중에서 고도로 보존된 코어 단위를 형성하고 개방 말단에서 4개의 구조적으로 가변적인 루프를 통해 리간드에 대한 결합 부위를 자연적으로 형성하는 8가닥의 β배럴을 갖는다. 안티칼린은, IgG 수퍼패밀리와 동종 (homologous)은 아니지만, 지금까지 항체의 결합 부위에 대해 전형적인 것으로 간주되는 특징을 보여준다: (i) 서열 변이의 결과로 높은 구조적 가소성(plasticity) 및 (ii) 상이한 모양을 갖는 표적에 대해 유도된 맞춤을 허용하는 상승된 형태적 유연성(conformational flexibility).
본원에서 사용된 용어 "달핀(DARPin)"은 일반적으로 3 개의 반복된 β에서 발생하는 단단한 인터페이스를 제공하는 설계된 안키린(ankyrin) 반복 도메인(166개 잔기)을 의미한다. 달핀은 일반적으로 인공적인 공통 서열(consensus sequence)에 해당하는 3개의 반복을 가지며, 여기서 반복 당 6개의 위치가 무작위로 지정된다. 결과적으로 달핀은 구조적 유연성이 부족하다(Gebauer 및 Skerra, 2009).
본원에서 사용되는 용어 "아비머(avimer)"는 각각 30 내지 35개 아미노산의 2개 이상의 펩티드 서열로 구성되는 항체 모방체 부류를 지칭하며, 이는 다양한 막 수용체의 A-도메인으로부터 유래되고 링커 펩티드로 연결된다. 표적 분자의 결합은 A-도메인을 통해서 발생하고 원하는 결합 특이성을 갖는 도메인, 예를 들어 HLA-J에 대한 도메인은, 예를 들어, 파지(phage) 디스플레이 기술에 의해 선택될 수 있다. 아비머에 포함된 다른 A-도메인의 결합 특이성은 동일할 수 있지만 반드시 동일 할 필요는 없다(Weidle UH, et al.,(2013), Cancer Genomics Proteomics; 10(4):155-68).
"나노피틴(nanofitin)"(아피틴으로도 알려짐)은 술포로부스 아시도칼다리우스(Sulfolobus acidocaldarius)의 DNA 결합 단백질 Sac7d로부터 유래된 항체 모방 단백질이다. 나노피틴은 일반적으로 약 7 kDa의 분자량을 가지며, 결합 표면 상의 아미노산의 무작위화(randomising)에 의하여 표적 분자, 예를 들어 HLA-J에 특이적으로 결합하도록 설계된다(Mouratou B, Behar G, Paillard-Laurance L, Colinet S, Pecorari F.,(2012) Methods Mol Biol.; 805:315-31).
본 발명에서 사용된 용어 "애필린(affilin)"은 감마-B 결정형 또는 유비퀴틴을 스캐폴드로 사용하고 이러한 단백질의 표면에 있는 아미노산을 무작위 돌연변이 유발에 의해 변형함으로써 개발된 항체 모방체를 의미한다. 원하는 표적 특이성, 예를 들어 HLA-J에 대한 표적 특이성을 갖는 애필린의 선택은, 예를 들어, 파지 디스플레이 또는 리보좀 디스플레이 기술에 의해 수행된다. 스캐폴드에 따라 애필린의 분자량은 약 10 또는 20 kDa이다. 본 발명에서 사용된 용어 애필린은 또한 이합체 또는 다합체화된 형태의 애필린도 의미한다(Weidle UH, et al., (2013), Cancer Genomics Proteomics; 10(4):155-68).
"쿠니츠 도메인 펩티드(Kunitz domain peptide)"는 소 췌장 트립신 억제제(BPTI), 아밀로이드 전구체 단백질(APP) 또는 조직 인자 경로 억제제(TFPI)와 같은 쿠니츠-유형 프로테아제 억제제의 쿠니츠 도메인으로부터 유래된다. 쿠니츠 도메인은 대략 6kDA의 분자량을 가지며 원하는 표적, 예를 들어 HLA-J에 대한 특이성을 갖는 도메인은 파지 디스플레이와 같은 디스플레이 기술에 의해 선택될 수 있다(Weidle et al., (2013), Cancer Genomics Proteomics; 10 (4):155-68).
본 발명에서 사용된 용어 "피노머(Fynomer®는 인간 Fyn SH3 도메인으로부터 유래된 비-면역글로불린-유래 결합 폴리펩티드를 지칭한다. Fyn SH3-유래 폴리펩티드는 당업계에 잘 알려져 있고, 예를 들어, Grabulovski et al. (2007) JBC, 282, p. 3196-3204, WO 2008/022759, Bertschinger et al (2007) Protein Eng Des Sel 20(2):57-68, Gebauer and Skerra (2009) Curr Opinion in Chemical Biology 13:245-255, or Schlatter et al. (2012), MAbs 4:4, 1-12에 설명되어 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "삼중 특이적 결합 분자(trispecific binding molecule)"는 3개의 결합 도메인을 가지며, 따라서 3개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있고, 바람직하게는 특이적으로 결합할 수 있는 폴리펩티드 분자를 지칭한다. 이들 3개의 에피토프 중 적어도 하나는 본 발명의 제4 양태의 단백질의 에피토프이다. 2개의 다른 에피토프는 본 발명의 제4 양태의 단백질의 에피토프일 수 있거나 1개 또는 2개의 상이한 항원의 에피토프일 수 있다. 삼중 특이적 결합 분자는 바람직하게는 TriTac이다. TriTac은 연장된 혈청 반감기를 갖고 단클론 항체 크기의 약 1/3을 갖도록 설계된 3 개의 결합 도메인으로 구성된 고형 종양에 대한 T-세포 인게이저(T-cell engager)이다.
압타머는 특정 표적 분자에 결합하는 핵산분자 또는 펩티드 분자이다. 압타머는 일반적으로 대규모 무작위 서열 풀에서 선택하여 만들어 지지만, 리보스위치(riboswitche)에 천연 압타머도 존재한다. 압타머는 거대분자 약물(macromolecular drug)로 기초 연구 및 임상 목적 모두에 사용할 수 있다. 압타머는 표적 분자의 존재 하에 리보자임과 결합하여 자가-절단될 수 있다. 이러한 화합물 분자는 추가 연구, 산업 및 임상적 적용을 갖는다(Osborne et. al.(1997), Current Opinion in Chemical Biology, 1:5-9; Stull & Szoka(1995), Pharmaceutical Research, 12, 4:465-483).
핵산 압타머는 일반적으로 (보통 짧은)올리고 뉴클레오티드의 가닥으로 이루어진 핵산 종(species) 이다. 통상적으로, 이들은 시험관 내 선택의 반복 라운드 또는 이와 동등하게, SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)를 통해 조작되어 저분자, 단백질, 핵산, 심지어 세포, 조직 및 유기체와 같은 다양한 분자 표적에 결합한다.
펩티드 압타머는 일반적으로 세포 내부의 다른 단백질 상호작용을 방해하도록 설계된 펩티드 또는 단백질이다. 그들은 단백질 스캐폴드의 양쪽 끝에 부착된 가변 펩티드 루프로 이루어진다. 이러한 이중 구조적 제약은 펩티드 압타머의 결합 친화도를 항체에 필적하는 수준(나노몰 범위)으로 크게 증가시킨다. 가변 펩티드 루프는 통상적으로 10 내지 20 개의 아미노산을 포함하고, 스캐폴드는 우수한 용해도 특성을 갖는 임의의 단백질일 수 있다. 현재, 박테리아 단백질 티오레독신-A(Thioredoxin-A)는 가장 일반적으로 사용되는 스캐폴드 단백질이며, 가변 펩티드 루프는 야생형 단백질에서 Cys-Gly-Pro-Cys-loop(서열 번호 35)인 레독스-활성화 부위 내에 삽입되며, 두 개의 시스테인 측면 사슬은 이황화 다리를 형성할 수 있다. 펩티드 압타머는 다른 시스템을 사용하여 선택될 수 있지만, 현재 가장 널리 사용되는 것은 효모 2-하이브리드 시스템(yeast two-hybrid system)이다.
압타머는 일반적으로 사용되는 생체분자, 특히 항체에 필적하는 분자 인식 특성을 제공하기 때문에 생명공학 및 치료적 응용을 위한 유용성을 제공한다. 차별적 인식능 외에도, 압타머는 시험관에서 완벽하게 조작될 수 있고, 화학적 합성에 의해 쉽게 생산되며, 바람직한 저장 특성을 가지고, 치료적 응용에서 면역원성을 거의 또는 전혀 나타내지 않기 때문에 항체 이상의 이점을 제공한다. 변형되지 않은 압타머는, 압타머의 본질적으로 낮은 분자량의 결과로, 주로 뉴클레아제에 의해 분해되거나 신장에 의해 체내 제거되기 때문에, 혈류에서 빠르게 제거되며, 반감기가 몇 분에서 몇 시간이다. 변형되지 않은 압타머 응용은 현재 혈액 응고와 같은 일시적인 상태를 치료하거나, 국소 전달이 가능한 눈과 같은 장기를 치료하는 데 중점을 두고 있다. 이 빠른 제거는 생체 내 진단 이미징과 같은 응용분야에서 이점이 될 수 있다. 2'-불소-치환된 피리미딘, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 결합, 알부민 또는 기타 반감기 연장 단백질과의 융합 등과 같은 여러 변형이 과학자들에게 가능하며, 그렇게 함으로써 압타머의 반감기가 몇 일 또는 몇 주로 증가될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "프로바디(probody)"는 프로테아제-활성화 가능한 항체 전구약물(prodrug) 예를 들어 프로테아제-활성화 항체 전구약물을 지칭한다. 프로바디는, 예를 들어, 본래의(authentic) IgG 중쇄와 변형된 경쇄로 이루어진다. 마스킹 펩티드는 종양 특이적 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 펩티드 링커를 통해 경쇄에 융합된다. 상기 마스킹 펩티드는 프로바디가 건강한 조직에 결합하는 것을 방지하여, 독성 부작용을 최소화한다. 또한 저분자, 항체 또는 항체 모방체 및 압타머의 결합 및/또는 억제 활성을 특정 조직 또는 세포 유형, 특히 병에 걸린 조직 또는 프로바디에 의한 세포 유형으로 제한하는 것이 가능하다. 이러한 프로바디에서 저분자, 항체 또는 항체 모방체 또는 압타머는 또한 본 발명의 단백질에 대한 결합을 제한하거나 방지하는 마스킹 펩티드에 결합되고, 마스킹 펩티드는 프로테아제에 의해 절단될 수 있다. 프로테아제는 기질로 알려진 특정 아미노산 서열을 절단하여 단백질을 더 작은 조각으로 분해하는 효소이다. 정상적인 건강한 조직에서, 프로테아제 활성은 엄격하게 제어된다. 암세포에서 프로테아제 활성이 상향 조절된다. 프로테아제 활성이 조절되고 최소인 건강한 조직이나 세포에서 프로바디의 표적-결합 영역은 차폐된 상태로 남아 있으므로 결합할 수 없다. 한편, 프로테아제 활성이 상향 조절되는 병든 조직 또는 세포에서, 프로바디의 표적-결합 영역은 차폐되지 않고 따라서 결합 및/또는 억제할 수 있다.
본 발명에 따르면, 용어 "작은 간섭 RNA(siRNA)"는, 짧은 간섭 RNA 또는 침묵 RNA로도 알려져 있으며, 18 내지 30개, 바람직하게는 19 내지 25개, 가장 바람직하게는 21 내지 23개, 또는 훨씬 더 바람직하게는 21개의 뉴클레오티드-길이의 이중-가닥 RNA 분자의 부류로 생물학에서 다양한 역할을 하는 것을 지칭한다. 특히, siRNA 특정 유전자의 발현을 siRNA가 간섭하는 RNA 간섭 (RNAi) 경로에 관여한다. RNAi 경로에서의 역할 외에도, siRNA는 또한 RNAi-관련 경로에서, 예를 들어, 항바이러스 메커니즘 또는 게놈의 염색질 구조를 형성에서도 작용한다.
자연에서 자연적으로 발견되는 siRNA는 잘 정의된 구조를 갖는다: 양쪽 끝에 2-nt 3' 돌출부(overhang)를 갖는 짧은 이중 가닥 RNA(dsRNA). 각 가닥은 5' 포스페이트 그룹과 3' 하이드록실(-OH) 그룹을 갖는다. 이 구조는 긴 dsRNA 또는 작은 헤어핀 RNA를 siRNA로 변환하는 효소인 다이서(dicer)에 의해 처리된 결과이다. siRNA는 또한 관심 유전자의 특이적 녹다운을 유발하기 위해 세포에 외인성으로(인위적으로) 도입될 수 있다. 따라서, 본질적으로 서열이 알려진 임의의 유전자는 서열 상보성에 기초하여 적절하게 맞춤화된 siRNA로 표적화될 수 있다. 이중-가닥 RNA 분자 또는 이의 대사 처리 생성물(metabolic processing product)은, 표적-특이적 핵산 변형, 특히 RNA 간섭 및/또는 DNA 메틸화를 매개할 수 있다. 외인성으로 도입된 siRNA는 3' 및 5' 말단에 돌출부가 없을 수 있지만, 하나 이상의 RNA 가닥이 5'- 및/또는 3'-돌출부를 갖는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 이중-가닥의 한쪽 말단은 1 내지 5개 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 1 내지 3개의 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 2개의 뉴클레오티드 3'-돌출부를 갖는다. 다른 말단은 평활말단(blunt-end)이거나 최대 6개의 뉴클레오티드 3'-돌출부를 가질 것이다. 일반적으로, siRNA로서 작용하기에 적합한 임의의 RNA 분자가 본 발명에서 구상된다. 지금까지 가장 효율적인 침묵(silencing)은 2-nt 3'-돌출부를 갖는 방식으로 짝을 이루는 21-nt 센스 및 21-nt 안티센스 가닥으로 구성된 siRNA 이중가닥(duplexes)으로 얻어졌다. 상기 2-nt 3' 돌출부의 서열은 첫 번째 염기 쌍에 인접한 짝을 이루지 않은 뉴클레오티드로 제한되는 표적 인식의 특이성에 약간의 기여를 한다(Elbashir et al. 2001). 3' 돌출부의 2'-데옥시뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드만큼 효율적이지만 합성 비용이 더 저렴하고 아마도 더 많은 뉴클레아제 내성이 있다. siRNA의 전달은 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여, 예를 들어 siRNA를 식염수와 조합하고 상기 조합물을 정맥 내 또는 비강 내로 투여하거나 글루코스(예를 들어 5 % 글루코스) 또는 양이온성 지질에서 siRNA를 제형화함으로써 달성될 수 있으며, 폴리머는 정맥 내(IV) 또는 복강 내(IP)의 전신 경로를 통한 생체 내 siRNA 전달에 사용될 수 있다(Fougerolles et al. (2008), Current Opinion in Pharmacology, 8:280-285; Lu et al. (2008), Methods in Molecular Biology, vol. 437: Drug Delivery Systems - Chapter 3: Delivering Small Interfering RNA for Novel Therapeutics).
짧은 헤어핀 RNA(shRNA)는 RNA 간섭을 통해 유전자 발현을 침묵시키는데 사용될 수 있는 단단한 헤어핀 회전(hairpin turn)를 만드는 RNA의 서열이다. shRNA는 벡터를 세포에 도입하여 U6 프로모터를 이용하여 shRNA가 항상 발현되도록 한다. 이 벡터는 일반적으로 딸 세포로 전달되어 유전자 침묵이 유전되도록 한다. shRNA 헤어핀 구조는 세포 기계(cellular machinery)에 의해 siRNA로 절단된 다음 RNA-유도 침묵 복합체(RISC)에 결합된다. 이 복합체는 결합된 siRNA와 매칭되는 mRNA에 결합하고 절단한다. 본 발명에서 사용되는 si/shRNA는 적절하게 보호된 리보뉴클레오시드 포스포라미다이트 및 통상적인 DNA/RNA 합성기를 사용하여 화학적으로 합성하는 것이 바람직하다. RNA 합성 시약 공급 업체는 Proligo(Hamburg, Germany), Dharmacon Research (Lafayette, CO, USA), Pierce Chemical(part of Perbio Science, Rockford, IL, USA), Glen Research(Sterling, VA, USA), ChemGenes(Ashland, MA, USA), 및 Cruachem(Glasgow, UK)이다. 가장 편리하게, siRNA 또는 shRNA는 다양한 품질과 비용의 RNA-합성 제품을 판매하는 상업적 RNA 올리고 합성 공급 업체로부터 얻는다. 일반적으로, 본 발명에서 적용할 수 있는 RNA는 통상적으로 합성되어 RNAi에 적합한 품질로 쉽게 제공된다.
RNAi에 영향을 미치는 추가의 분자는, 예를 들어, 마이크로 RNA(miRNA)를 포함한다. 상기 RNA 종은 단일 가닥 RNA 분자이다. 내인성으로 존재하는 miRNA 분자는 상보적 mRNA 전사체에 결합하고 RNA 간섭과 유사한 과정을 통해 상기 mRNA 전사체의 분해를 촉발함으로써 유전자 발현을 조절한다. 따라서, 외인성 miRNA는 각 세포에 도입된 후 억제제(예를 들어, HLA-J의 억제제)로 사용될 수 있다.
리보자임(리보 핵산 효소, RNA 효소 또는 촉매 RNA라고도 함)은 화학 반응을 촉매하는 RNA 분자 이다. 많은 천연 리보자임은 자신의 절단 또는 다른 RNA의 절단을 촉매하지만, 또한 리보솜의 아미노 전이 효소 활성 (aminotransferase activity)을 촉매하는 것으로도 밝혀졌다. 잘 특성화된 작은 자가-절단 RNA의 비 제한적인 예는, 해머헤드(hammerhead), 헤어핀(hairpin), 델타 간염 바이러스 (hepatitis delta virus) 및 시험관 내-선택된 납-의존성 리보자임인 반면, 그룹 I 인트론은 더 큰 리보자임의 예시이다. 촉매적 자가-절단의 원리는 최근 몇 년 동안 잘 확립되었다. 해머헤드 리보자임은 리보자임 활성을 갖는 RNA 분자 중에서 가장 잘 특성화된다. 해머헤드 구조가 이종 RNA 서열에 통합될 수 있고 이에 의해 리보자임 활성이 이러한 분자로 전달될 수 있음이 입증되었으므로, 표적 서열이 잠재적으로 일치하는 절단 부위를 포함하는 경우, 거의 모든 표적 서열에 대한 촉매 안티센스 서열이 생성될 수 있는 것으로 보인다. 해머헤드 리보자임을 구성하는 기본 원리는 다음과 같다: GUC(또는 CUC) 삼중자(triplet)를 포함하는 RNA의 관심 영역을 선택한다. 일반적으로 각각 6 내지 8개의 뉴클레오티드를 갖는 두개의 올리고뉴클레오티드 가닥을 취하고, 그 사이에 촉매 해머헤드 서열이 삽입된다. 가장 좋은 결과는 일반적으로 짧은 리보자임과 표적 서열에서 얻을 수 있다.
본 발명에 따른 유용한 최근 개발은 작은 화합물을 인식하는 압타머와 해머헤드 리보자임의 조합이다. 표적 분자와 결합할 때 압타머에서 유도된 형태적 변화는 리보자임의 촉매 기능을 조절할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "안티센스 핵산분자(antisense nucleic acid molecule)"는 표적 핵산에 상보적인 핵산을 지칭한다. 본 발명에 따른 안티센스 분자는 표적 핵산과 상호 작용할 수 있고, 보다 구체적으로 표적 핵산과 혼성화 할 수 있다. 하이브리드의 형성으로 인해, 표적 유전자(들)의 전사 및/또는 표적 mRNA의 번역이 감소되거나 차단된다. 안티센스 기술과 관련된 표준 방법이 설명되어 있다(예를 들어, Melani et al., Cancer Res.(1991) 51: 2897-2901 참조).
CRISPR/Cas9 및 CRISPR-Cpf1 기술은 거의 모든 세포/모델 유기체에 적용할 수 있으며 녹아웃 돌연변이, 염색체 결실, DNA 서열 편집 및 유전자 발현 조절에 사용될 수 있다. 유전자 발현의 조절은 특정 유전자, 여기서는, 예를 들면, HLA-J 유전자의 전사를 억제하기 위해 전사 억제자와 접합된 촉매적으로 사멸된 Cas9 효소(dCas9)를 사용하여 처리할 수 있다. 유사하게, 촉매적으로 불활성인, "사멸된" Cpf1 뉴클레아제(Prevotella 및 Francisella-1의 CRISPR)는 합성 전사 억제자 또는 활성자에 융합되어 내인성 프로모터, 예를 들어, HLA-J 발현을 조절하는 프로모터를 하향조절 할 수 있다. 또는, 징크 핑거 뉴클레아제(zinc finger nuclease, ZFN) 또는 전사 활성화 인자-유사 이펙터 뉴클레아제(transcription activator-like effector nuclease, TALEN)의 DNA 결합 도메인은 표적(예를 들어 HLA-J) 유전자 또는 이의 프로모터 영역 또는 5'-UTR을 특이적으로 인식하도록 설계되어 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있다.
관심 유전자 또는 그의 발현에 관여하는 조절 분자를 표적으로 하는 억제 핵산 분자로서 제공된 억제제가 또한 본원에서 고려된다. 표적 유전자 또는 조절 분자의 발현을 감소 또는 없애는 이러한 분자는, 비 제한적으로, 메가뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제, 및 전사 활성화 인자-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN)를 포함한다. 이러한 방법은 Silva et al., Curr Gene Ther. 2011; 11(1):11-27; Miller et al., Nature biotechnology. 2011; 29(2):143-148, and Klug, Annual review of biochemistry. 2010; 79:213-231에 기술된다.
본 발명의 제1 양태의 보다 바람직한 구체예에 따르면, 약제이거나 약제에 포함되는 저분자, 항체, 단백질 약물, 또는 압타머는 세포독성제에 융합되며, 여기서 세포독성제는 바람직하게는 치료 방사성 동위원소, 보다 바람직하게는 177Lu, 90Y, 67Cu 및 225Ac, 및/또는 진단제이거나 진단제에 포함되는 저분자, 항체, 단백질 약물 또는 압타머는 영상제(imaging agent)에 융합되며, 여기서 영상제는 바람직하게는 치료 방사성 동위원소, 보다 바람직하게는 67Ga, 44Sc, 111In, 99mTc, 57Co, 131I이다.
이 바람직한 구체예에 따르면 저분자, 항체, 단백질 약물, 또는 압타머는 접합체의 형태로 생성된다. 접합체를 디자인하기 위한 절단가능 및 절단불가능 링커는 당업계에 공지되어 있다.
이 경우 저분자, 항체, 단백질 약물 또는 압타머 자체는 억제 효과가 없을 수 있지만 억제 효과는 접합 파트너(conjugation partner)에 의해서만 부여된다. 유사하게, 저분자, 항체, 단백질 약물 또는 압타머 자체는 생체 내에서 종양 부위를 검출할 수 없지만 상기 검출은 접합 파트너에 의해서만 가능하다.
이러한 경우 저분자, 항체, 단백질 약물, 또는 압타머는 본 발명에 따른 단백질 또는 펩티드에 대한 약제 또는 진단제의 부위-특이적 결합을 부여한다.
약제의 경우 세포독성제는 본 발명에 따른 단백질을 생산 및/또는 이에 결합하는 세포를 죽일 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 단백질에 결합하는 분자의 표적화 능력을 세포독성제의 세포-사멸 능력과 결합함으로써, 접합체는 건강한 조직과 병든 조직 및 세포를 구별할 수 있게 하는 억제제가 된다. 유사하게, 진단제의 경우 진단제는 본 발명에 따른 단백질을 생산 및/또는 이에 결합하는 세포를 검출(예를 들어, 가시화(make visible))할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 단백질에 결합하는 분자의 표적화 능력을 진단제의 세포-사멸 능력과 결합함으로써, 접합체는 생체 내 종양 부위의 검출을 가능하게 하는 진단제가 된다.
치료용 방사성 동위원소는 암세포를 죽이는 양만큼 종양 세포에 직접 방사선을 전달한다. 이러한 동위원소의 예는 177Lu, 90Y, 67Cu 및 225Ac이다. 반면에, 치료용 방사성 동위원소는 방사선 진단을 통해 방사선을 감지할 수 있는 양만 종양 세포에 직접 방사선을 전달한다. 이러한 동위원소의 예는 67Ga, 44Sc, 111In, 99mTc, 57Co, 131I이다.
본 발명은 제2 양태에서 대상체에서 종양의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 본 발명의 제1 양태의 방법에 의해 제조된 약제에 관한 것이다.
치료될 대상체는 바람직하게는 본 발명의 제1 양태의 방법에서 사용되는 샘플을 얻은 동일한 대상체이다. 결과적으로 대상체는 대상체의 종양에 맞춰진 종양 치료 또는 예방을 받는다.
본 발명은 제3 양태에서 대상체의 종양 부위의 생체 내 검출에 사용하기 위한 본 발명의 제1 양태의 방법에 의해 제조된 진단제에 관한 것이다.
진단될 대상체는 바람직하게는 본 발명의 제1 양태의 방법에서 사용되는 샘플을 얻은 동일한 대상체이다. 결과적으로 대상체는 대상체의 종양에 맞는 종양 진단을 받는다.
본 발명의 제3 양태의 바람직한 실시예에 따르면, 검출은 대상체의 전신을 스캐닝하는 것을 포함하고, 스캐닝은 바람직하게는 전신 양전자 방사 단층촬영(PET) 스캐너를 사용한다.
전신 양전자 방사 단층 촬영(PET) 스캐너와 같은 전신 스캐너는 사진, 바람직하게는 전체 인체의 3D 사진을 생성한다.
PET 스캐너는 스캐너의 높은 효율성으로 인해 특히 유리하다. 표준 방사선량(standard radiation dose)을 사용하여 아주 짧은 순간만에 이미지를 생성할 수 있으며, 이는 기존 장치보다 훨씬 빠르다. 또한, 방사선 노출을 줄이는데 도움을 주기 위해, 스캐너 시간을 몇 초만 더 투자하면 선량(dose)을 줄일 수 있다. 스캐너는 다양한 조직과 기관이 다양한 자극에 어떻게 반응하는지 평가할 수 있다. 염증의 확산, 다양한 장애의 영향 및 암 종양의 이동성 또한 이 스캐닝 기술을 사용하여 더 쉽게 평가될 수 있다. PET 스캐너는 바람직하게 Explorer Total Body ScanTM이다.
본 발명의 제3 양태의 바람직한 구체예에 따르면, 검출은 대상체의 종양 부위로 방사성 동위원소의 방사선량 흡수를 측정하는 것을 포함한다.
이 구체예에 따르면, 진단용 방사성 동위원소, 보다 바람직하게는 67Ga, 44Sc, 111In, 99mTc, 57Co, 131I가 검출에 사용된다. 방사성 동위원소는 바람직하게는 상기 본 발명에 기재된 바와 같은 접합체의 일부이다.
대상체의 종양 부위로 방사성 동위원소의 방사선량 흡수를 측정하기 위한 수단 및 방법은, 예를 들어, Eberle Huguette et al. (2014) World J Nucl Med.; 13(1): 50-55 또는 Journal of Radiation Research and Applied Sciences로부터 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, Siemens e.cam SPECT 시스템은 이미징에 사용될 수 있으며 이미지를 기반으로 하는 흡수의 정량화는 소프트웨어, 예를 들어 이미지 J 소프트웨어에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 제3 양태의 보다 바람직한 구체예에 따르면, 측정된 방사선량 흡수에 기초하여 약제의 치료적 유효량(therapeutically effective amount)이 결정되어야 하며, 여기서 약제는 바람직하게는 본 발명의 제1 양태의 방법에 의해 제조된다.
종양에서 방사성핵종(radionuclide) 흡수의 정량화는 치료에 대한 환자의 반응, 중요한 장기에 대한 선량(dose)을 평가하고 종양을 진단하는데 중요하며 권장된다(Francis et al. (2015) Journal of Radiation Research and Applied Sciences, 8(2):182-189). 예를 들어, 진단용 방사성 동위원소의 흡수가 낮다는 것은 치료용 방사성 동위원소가 더 많이 필요하다는 것을 나타내며 그 반대의 경우도 마찬가지다.
본 명세서, 특히 청구항에서 특징화된 구체예와 관련하여, 종속항에서 언급된 각각의 구체예는 상기 종속항이 인용하는 각 청구항(독립항 또는 종속항)의 각 구체예와 결합되도록 의도된다. 예를 들어, 3개의 대안 A, B 및 C를 나열하는 독립항 1; 3개의 대안 D, E, 및 F를 나열하는 종속항 2; 및 청구항 1 및 2에 종속하고 3개의 대안 G, H, I를 나열하는 청구항 3의 경우, 달리 특별히 언급하지 않는 한, 명세서는 A, D, G; A, D, H; A, D, I; A, E, G; A, E, H; A, E, I; A, F, G; A, F, H; A, F, I; B, D, G; B, D, H; B, D, I; B, E, G; B, E, H; B, E, I; B, F, G; B, F, H; B, F, I; C, D, G; C, D, H; C, D, I; C, E, G; C, E, H; C, E, I; C, F, G; C, F, H; C, F, I의 조합에 해당하는 구체예를 모호하지 않게 개시하는 것으로 이해되어야 한다.
유사하게, 그리고 또한 독립항 및/또는 종속항이 대안을 언급하지 않는 경우, 종속항이 복수의 이전 청구항을 다시 언급하는 경우, 여기에 포함되는 발명 주제의 임의의 조합은 명시적으로 개시된 것으로 간주되는 것으로 이해된다. 예를 들어, 독립항 1, 청구항 1을 인용하는 종속항 2, 및 청구항 2 및 1을 모두 인용하는 종속항 3의 경우, 청구항 3, 2 및 1의 주제의 조합과 같이 청구항 3 및 1의 주제의 조합이 명확하고 모호하지 않게 개시된다. 제1 항 내지 제3 항 중 어느 한 항을 인용하는 추가의 종속항 4가 존재하는 경우, 청구항 4 및 1, 청구항 4, 2 및 1, 청구항 4, 3, 및 1의 주제의 조합뿐 아니라, 청구항 4, 3, 2, 및 1의 조합이 명확하고 모호하지 않게 개시된다.
도면들을 보여준다.
도 1: 알파 2 및 3 도메인, 막관통 도메인 및 세포질 영역과 상응하는 연결 펩티드 영역에서 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F 동형, HLA-G, HLA-H 및 HLA-J의 단백질 서열 요약. 공통 서열(consensus sequence)은 정렬된 서열 위에 회색으로 강조 표시된다. HLA 펩티드 서열의 차이도 회색으로 강조 표시된다. 예측된 알파 3은 다른 HLA 유전자와 다르며 회색으로 강조 표시된다. 고유한 HLA-J 항체 생성을 위한 펩티드 서열은 "JULY Antibody"라는, 갈색 화살표로 표시된다.
도 2: 태반 조직뿐만 아니라 환자의 난소암, 유방암 및 방광암 조직에서 웨스턴 블롯 분석에 의한 HLA-J 단백질 발현의 증거.
실시예는 본 발명을 예시한다.
실시예는 본 발명을 예시한다.
실시예 1: 방사성핵종(radionuclide)-표지된 항-HLA 항체를 이용한 암세포 영상화
이 실시예는 진단학으로도 표시되는 방사성핵종이 표지된 항체의 도움으로 개인화된 항-종양 치료의 생성을 설명한다. 또한 양전자 방출 단층 촬영(PET) 및 컴퓨터 단층 촬영(CT)을 통해 환자의 종양 및 전이를 감지하고 치료하는 생체 내 방법을 설명한다.
첫 번째 단계에서, 종양 및 전이의 개별적이고 독특한 HLA 발현 패턴(성인 및/또는 배아 및/또는 이전의 "유사유전자(pseudogene)")은 진단용 방사성핵종에 표지된 항-HLA 항체로 시각화된다. HLA 발현 패턴을 결정한 후 암 세포 분포 및 종양 크기를 평가한 후, 치료 방사성핵종에 표지된 치료용, 맞춤형 항-HLA 항체 혼합물이 적용된다. 첫 번째 단계에서 적용된, 진단용 방사성핵종에 표지된 항-HLA 항체로 치료 반응과 성공 여부를 모니터링할 수 있다.
방사선 노출을 최소화하고 적용된 방사성-표지된 항-HLA 항체, 흡수 동역학(uptake kinetic)의 치료 효과를 최대화하기 위해서 치료 전에 HLA 상태를 결정하는 것이 유리하다.
PET/CT 영상은 HLA 발현 패턴을 결정하기 위해 전신 스캐너 "Explorer Total Body ScannerTM"(United Imaging, Shanghai)로 수행된다. 이 시스템은 다른 PET/CT-Scanner에 비해 40배 더 높은 감도와 30초의 총 측정 시간을 가지고 있다. 크기가 2.8mm 이상인 HLA를 발현하는 병변을 6배 높은 영상 해상도로 검출한다. 전신 스캐너는 또한 환자의 방사선 부담을 낮추고 부작용을 최소화한다.
오로지 종양 세포에서만 발현되는 HLA 클래스 Ib 및 Iw 유전자를 검출하기 위해 적용되는 항체는 예를 들어, 항-HLA-G 항체("LILLY1" 및 "LILLY2"로 명명) 및 항-HLA-J 항체("JULY"로 명명)이다. 이러한 항체는 다른 HLA 유전자(BioGenes, Berlin, Germany)에 대한 교차 반응성을 최소화하기 위해 각 HLA 클래스 Ib 및 Iw 유전자를 위한 고유한 펩티드 서열이 생성된다. HLA-J 항체는 HLA-J의 고유한 알파 3 및 막관통 도메인의 c-말단 끝에 생성되었다(도 1). 펩티드 서열은 알파 3 도메인, 연결 펩티드 및 막관통 도메인의 n-말단 끝에 걸쳐 있는 22개의 아미노산을 포함한다.
실시예 2 - HLA-J 단백질 발현의 검출
HLA-J 단백질의 존재를 입증하기 위해 환자의 난소암, 유방암 및 방광암 조직 및 태반에서 웨스턴 블롯 분석을 수행했다(n=1). 20 μg의 단백질 조직 용해물을 변성 조건에서 10% SDS-PAGE 겔에서 분리하고 젖은 니트로셀룰로오스 막으로 옮겼다. 특정 항-HLA-J 항체 "JULY"로 인큐베이션(incubation) 한 후, 보라색 침전물은 HPR과 결합된 항-토끼 항체로 인큐베이션 한 후 TMB 기질을 적용한 후 관찰되었다. 웨스턴 블롯 분석은 관찰된 크기가 약 55 kDa인 HLA-J 단백질의 존재를 밝혀냈다(도 2). HLA-J의 계산된 단백질 크기는 약 26.7 kDa이다. 난소암 조직 샘플과 관련하여, 약 100 kDa에서 추가 밴드가 감지될 수 있다. 이러한 발견은 HLA-J가 이황화 결합을 생성할 수 있는 시스테인 잔기로 인해 주로 이량체 및 사량체 형태로 존재함을 나타낼 수 있다.
실시예 3 - 이미징(Imaging)를 위한 68 Gallium을 사용한 항-HLA-J JULY-mAb 및 항-HLA-G LILLY-mAb의 표지(labelling)
암 세포 분포를 완전히 평가하기 위해, HLA-J 항체 JULY와 항-HLA-G LILLY를 진단 방사성핵종인 Gallium-68로 표지되었다.
양쪽성 원소인, Gallium-68은 현재의 지식 상태에 따라 288일의 긴 반감기를 가진 모핵종 germanium-68의 Ge-68/Ga-68 생성기 시스템(generator system)으로부터 파생되었다(Zhernosekov et al., J Nucl Med 2007 Oct; 48(10):1741-8). 방사성 화학적으로 순수한 gallium-68을 얻기 위해, Ge-68/Ga-68 생성기로 후-처리된 양이온 교환을 수행하여 10분 이내로 순수한 gallium-68을 수집할 수 있다(Mueller et al., Recent Results Cancer Res 2013; 194:77-87). gallium-68 자체의 반감기가 약 68분이므로 빠른 표시를 수행해야 한다. gallium-68은 카세트-기반 합성 시스템 클릭 화학(EZAG, Berlin, Germany)을 기반으로 하는 킬레이터 DOTA(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-N,N',N",N"'-tetraacetic acid)를 사용하여 JULY 및 LILLY로 표시되었다. 이 시스템은 방사성 의약품 생성을 위해 자동화된, 빠르고 GMP 준수 생산 방법을 제공한다. 화학적 및 방사성-화학적 순도뿐만 아니라 품질, 무균, 내독소 테스트는 European Pharmacopeia, V.8.0의 모노그래프에 따라 테스트되었다(European Pharmacopoeia (Ph. Eur.) Vol 8 (2013-2016) European Directorate of Quality of Medicines). 생체 분포, 결합 친화도 및 선량 측정은 환자의 신선한-냉동 조직 슬라이스뿐만 아니라 세포주(cell lines)에서도 생체 내 확인되었다.
JULY 및 LILLY 치료로 표시된 Lutetium-177에 대한 요건들은 Lutetium-177 PSMA 치료와 유사하다(Baum et al., Nuklearmediziner 2015; 38(02): 145-152). 배드 베르카 프로토콜(bad berka protocol)에 따라 신장 보호를 수행했다(Schuchardt et al., Recent Results Cancer Res. 2013; 194:519-36).
실시예 4 - 치료를 위한 177 Lutetium을 사용한 항-HLA-J JULY-mAb 및 항-HLA-G LILLY의 표지
Lutetium-177은 연조직에서 평균 침투 범위가 650 μm이고 반감기가 6.72일인 저에너지 베타 방출 방사성핵종이다. 이 베타 방출 방사성핵종의 작은 범위이지만, 알파 방출 방사성핵종의 50배 더 큰 범위는 lutetium-177을 최적의 치료 방사성핵종으로 만든다. 낮은 에너지 감마선의 방출은 PET/CT를 통한 이미징 및 분포 분석을 가능하게 한다. 이는 특허 DE102011051868A1에 따라 ytterbium-176을 통한 간접 생산 경로에 의해 생성된다. 항체 JULY 및 LILLY의 표시는 Repetto-Llamazares et al, PLoS One. 2014; 9(7)에 기재된 대로 수행되었다.
화학적 및 방사성-화학적 순도뿐만 아니라 품질, 무균, 내독소 테스트는 European Pharmacopeia, V.8.0의 모노그래프에 따라 테스트되었다(European Pharmacopoeia (Ph. Eur.) Vol 8 (2013-2016) European Directorate of Quality of Medicines). 생체 분포, 결합 친화도 및 선량 측정은 환자의 신선한-냉동 조직 슬라이스뿐만 아니라 세포주에서도 확인되었다.
실시예 5 - BBN 유도 방광암 발암 동물 모델에서 꼬리 정맥으로 정맥내 주사 및 방광 내 점적(instillation)을 통한 전신 적용 후 생체 내 68 Gallium 방사성표지된 항-HLA-J JULY-mAb 및 항-HLA-G Lilly-mab의 생체 분포
실험 동물 설정
George et al(Transl Oncol. 2013 Jun; 6(3): 244-255)에 따르면 C57BL/6/c 마우스(Charles River Laboratories International, Inc, Wilmington, MA)에서 방광 특이적 발암물질 N-부틸-N-(4-히드록시부틸) 니트로사민(BBN)으로 방광암이 유발되었다. 간단히 말해서, 동물을 두 그룹으로 나누었다(n = 27-30/그룹). 그룹 1은 수돗물만 받은 대조군으로 사용되었고, 그룹 2는 BBN으로 처리되었다. BBN(TCI America, Portland, OR) 발암물질은 식수에 0.05%로 생후 8주 내지 20주 사이의 마우스에게 임의로 공급되었다. 물 소비량을 기록하여 BBN 섭취량을 결정하고 그룹 간에 비교했다. 체중은 8주와 32주 사이 여러 시점에서 측정되었다. 동물은 종양 진행 및 생존을 위해 모니터링되었고 방광 및 장기 무게를 얻기 위해 32주 후에 죽였다.
68 Gallium 방사성표지된 항-HLA-J JULY-mAb 및 항-HLA-G Lilly-Mab의 생체 분포:
방광암이 성공적으로 발병한 동물과 종양이 없는 마우스에서 생체 분포를 평가했다. 동물에 6.66 MBq의 Gallium-68 표지된 항-HLA-J JULY-mAb 또는 Gallium-68 표지된 항-HLA-G Lilly-mab를 방광 내 주사했다. 주사 후 45분 및 90분 후, 마우스를 희생시키고 γ카운터에서 Gallium-68 표지된 항-HLA-J JULY-mAb 또는 Gallium-68 표지된 항-HLA-G Lilly-mAb 축적을 측정하기 위해 장기를 준비했다. 흡수는 조직 그램당 주사된 활성의 백분율로 표현했다. 방광을 분리하고 반으로 분할하여 한 부분은 조직학 및 면역조직화학을 위해 처리하고 다른 부분은 RNA 분리를 위해 급속 냉동했다.
꼬리 정맥안으로 정맥 주사를 통해 전신 Gallium-68 표지된 항-HLA-J JULY-mAb 또는 Gallium-68 표지된 항-HLA-G Lilly-mAb을 적용하여 전신 생체 분포(systemic biodistribution)를 결정하기 위해 두 번째 설정을 수행했다. 주사 후 45분 및 90분 후, 마우스를 희생시키고 γ카운터에서 Gallium-68 표지된 항-HLA-J JULY-mAb 또는 Gallium-68 표지된 항-HLA-G Lilly-mAb 축적을 측정하기 위해 장기를 준비했다. 흡수는 조직 그램당 주사된 활성의 백분율로 표현했다. 방광을 분리하고 반으로 분할하여 한 부분은 조직학 및 면역조직화학을 위해 처리하고 다른 부분은 RNA 분리를 위해 급속 냉동했다.
PET-CT 스캐너로 생체 분포를 모니터링했다.
177 Lutetium 방사성표지된 항-HLA-J JULY-mAb 및 항-HLA-G Lilly-mAb의 방사선면역치료:
방사선면역치료는 종양이 있는 마우스로 수행되었으며 각각 10마리의 동물들로 구성된 9개 그룹으로 나눴다. 이 그룹은 BBN 유도 후 1시간, 7일 또는 14일에 PBS의 100 μL 중 Lutetium-177 항-HLA-J JULY-mAb 또는 Lutetium-177 항-HLA-G LILLY-mAb의 0.925 MBq을 방광 내로 또는 BBN 유도 후 1시간 또는 7일째에 PBS의 100 μL 중 Lutetium-177 항-HLA-J JULY-mAb 또는 68-Gallium 항-HLA-G LILLY-mAb의 0.37 MBq를, 또는 BBN 유도 후 1시간 또는 7일에 0.9% NaCl의 40 μL 중 40 μg의 미토마이신 C를, 또는 BBN 유도 후 1시간에 표지되지 않은 Lutetium-177 항-HLA-J JULY-mAb 또는 Lutetium-177 항-HLA-G LILLY-mAb의 2μg이 투여되었다. 대조군은 BBN 유도 후 1시간에 PBS를 방광 내로 투여되었다. 치료 동안, 마우스를 마취시켰다(90분).
꼬리 정맥안으로 정맥 주사를 통해 Lutetium-177 항-HLA-J JULY-mAb 또는 68-Gallium 항-HLA-G LILLY-mAb을 전신 적용하여 두 번째 설정을 수행했다. 종양이 있는 마우스를 각각 10마리씩 9개 그룹으로 나누었다. 이 그룹은 BBN 유도 후 1시간, 7일 또는 14일에 PBS의 100 μL 중 Lutetium-177 항-HLA-J JULY-mAb 또는 Lutetium-177 항-HLA-G LILLY-mAb의 0.925 MBq를 정맥 내로 또는 BBN 유도 후 1시간 또는 7일째에 PBS 의 100 μL 중 Lutetium-177 항-HLA-J JULY-mAb 또는 68-Gallium 항-HLA-G LILLY-mAb의 0.37 MBq를, 또는 BBN 유도 후 1시간 또는 7일에 0.9% NaCl의 40 μL 중 40 μg 미토마이신 C를, 또는 BBN 유도 후 1시간에 표지되지 않은 Lutetium-177 항-HLA-J JULY-mAb 또는 Lutetium-177 항-HLA-G LILLY-mAb의 2μg이 투여되었다. 대조군은 종양 세포 접종 후 1시간에 PBS를 방광내로 투여받았다. 치료 동안, 마우스를 마취시켰다(90분).
방사선 면역 요법은 PET-CT 스캐너로 모니터링되었다.
조직병리학적 평가 및 조직 마이크로어레이 준비
방광 조직병리학을 평가하기 위해, 방광을 먼저 절제하고 세로로 반으로 자른 다음 10% 완충 포르말린에 고정했다. 그런 다음 포르말린으로 고정된 방광을 파라핀 포매(paraffin embedded), 절단 및 표준 프로토콜에 따라 헤마톡실린(hematoxylin) 및 에오신(eosin)으로 염색했다. 염색된 슬라이드는 전문 병리학자(S.S.S.)에 의해 조직병리학적으로 등급이 매겨졌고, 방광은 정상 또는 암, 침습성(invasive) 또는 근육 침습성(muscleinvasive) 방광으로 분류되었다. 그런 다음 조직 마이크로어레이의 구성을 위한 종양 영역을 표시하기 위해 이를 검토했다. 조직 마이크로어레이는 수동 조직 배열기(Beecher Instruments, Silver Spring, MD)를 사용한 원래의 파라핀 블록에서 펀칭된 0.6-mm 원통형 코어를 사용하여 만들어졌다. 대표 재현성(representative reproducibility)을 향상시키기 위해 개별 블록에서 3중 코어가 만들어졌다. 따라서, 180마리의 암컷 마우스를 나타내는 총 540개의 코어를 사용하여 5개의 마스터 블록을 생성했다. 이 블록에서 5-마이크로미터 섹션을 잘라 하전 슬라이드(Fisher Scientific, Houston, TX)에 놓고 적절하게 염색했다. 간단히 말해서, 이 슬라이드는 탈파라핀화되고, 재수화되었으며, 항원 검색을 위해 마이크로웨이브 또는 프로테이나제 K에 의해 사전처리되었다. 그 후 면역조직화학적 염색은 상응하는 항체를 사용하여 수행되었다. 염색 절차는 보편적인 비오틴화된 Ig 이차 항체, DAB 기질 및 헤마톡실린 대조염색을 사용한 간접 비오틴-아비딘 시스템을 기반으로했다. 1차 항체를 생략하거나 관련 없는 항체(마우스 단클론 Ig)와 함께 배양한 후 음성 대조군 슬라이드를 얻었다.
Ki-67 염색에 의한 종양 세포 증식
상기에서 생성된 조직 마이크로어레이를 사용하여, TechMate 500 Plus(Dako North America Inc)에서 25분 동안 인큐베이션하고 DAB로 시각화한 단클론 MIB-1 항체(clone MIB-1, mouse IgG1, 1:100 from Dako North America Inc, Carpinteria, CA)를 사용하여 면역조직화학에 의해 평가된 Ki-67 항원을 염색했다. 전체 조직 섹션에 대해 x20 배율 대물렌즈(Caliper, Hopkinton, MA)가 있는 CRI 다중 스펙트럼 카메라를 사용한 Vectra 스캐너를 사용하여 이미지를 캡처했다. 이미지 분석은 InForm 1.2 소프트웨어를 사용하여 수행되었다. InForm은 각 조직 섹션의 대표 필드에서 Ki-67 양성 세포를 계산하도록 교육되었다. 이미지에서, 요로피세포(urothelia) 이외의 조직 영역은 Image-Pro Plus 소프트웨어(Media Cybernetics Inc, Bethesda, MD)를 사용하여 가려졌다. 양성으로 염색된 세포의 백분율은 조직의 전체 섹션에 대한 이미지를 사용하여 계산되었다.
세포자연사(Apoptosis) 분석
세포 사멸은 이전에 설명한 바와 같이 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제-매개 dUTP 닉 엔드 라벨링(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labelling, TUNEL) 분석을 사용하여 DNA 가닥 파손의 효소적 라벨링에 의해 원 위치(in situ)에서 검출되었다. 음성 대조군의 경우, 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제가 탈이온수로 대체되었고, 1.0 g/ml DNase I(DN 25; Sigma-Aldrich, St Louis, MO)으로 사전처리된 섹션이 양성 대조군에 사용되었다. 상기에서 설명한 대로 Vectra 스캐너를 사용하여 이미지를 캡처하고, InForm 1.2 및 Image-Pro Plus 소프트웨어를 사용하여 TUNEL 양성 세포의 백분율이 결정되었다.
HLA 면역조직화학
HLA-J와 HLA-G의 면역조직화학염색을 위해, HLA-J와 HLA-G에 대한 토끼 다클론항체(BioGenes, Berlin, Germany)를 사용하였다. HLA-J 및 HLA-G 발현 평가는 올레드 스코어링(Allred scoring)의 수정된 버전을 사용하여 조직 치료에 대해 블라인드(blind) 한 병리학자(S.S.S.)에 의해 수행되었다. 백분율 등급에 강도를 곱하여 0에서 9까지의 종합점수를 얻었다. HLA-J 및 -G 발현 점수는 음성(0), 낮음(<6), 높음(≥6)으로 그룹화되었다.
HLA mRNA 발현 분석
수컷 마우스에서 얻은 방광 표본을 분말화하고 QIAshredder 컬럼(Qiagen, Hilden, Germany)으로 균질화하여 제조업체의 권장 사항에 따라 RNeasy Mini Kit(Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 총 RNA를 추출했다. RNA는 TaqMan 프라이머 및 프로브를 사용하여 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응(qPCR) 분석에 의해 정량화되었다. 모든 추출물은 안정한 참조(reference)/하우스키퍼(housekeeper) 유전자로 알려진 구성적으로 발현되는 Calmodulin 2 유전자(CALM2) 유전자를 실시간 PCR(RT-qPCR)로 정량하여 고품질 RNA 함량이 충분한지 테스트했다. RT-qPCR 방법에 의한 유전자 발현의 상세한 분석을 위해, 관심 영역에 인접하는 프라이머와 그 사이에 혼성화하는 형광 표지된 프로브를 사용했다. RNA-특이적 프라이머/프로브 서열은 엑손/엑손 경계를 가로질러 프라이머/프로브 서열을 위치시킴으로써 RNA-특이적 측정을 가능하게 하는 데 사용되었다. 동일한 유전자의 여러 동형체(isoform)이 존재하는 경우, 모든 관련 또는 선택된 스플라이스 변이체를 적절하게 증폭하기 위해 프라이머는 선택되었다. 모든 프라이머 쌍은 기존의 PCR 반응에 의한 특이성에 대해 확인되었다. HLA-H, J, L 및 G에 대해 특정 프라이머가 생성되었다(표 1).
유전자 정방향_프라이머(For_Primer) 프로브 역방향 프라이머(Rev-Primer)
HLA-G-Ex3 GGCCGGAGTATTGGGAAGA CAAGGCCCACGCACAGACTGACA GCAGGGTCTGCAGGTTCATT
HLA-G Ex4 CTGCGGCTCAGATCTCCAA CGCAAGTGTGAGGCGGCCAAT CAGGTAGGCTCTCCTTTGTTCAG
HLA-G Ex5 CACCACCCTGTCTTTGACTATGAG ACCCTGAGGTGCTGGGCCCTG AGTATGATCTCCGCAGGGTAGAAG
HLA-G Ex6 CATCCCCATCATGGGTATCG TGCTGGCCTGGTTGTCCTTGCA CCGCAGCTCCAGTGACTACA
HLA-G Ex8 GACCCTCTTCCTCATGCTGAAC CATTCCTTCCCCAATCACCTTTCCTGTT CATCCCAGCCCCTTTTCTG
HLA-G Ex3-5 TTCATCGCCATGGGCTACG CGACACGCAGTTCGTGCGGTTC ATCCTCGGACACGCCGAGT
HLA-G Ex2/3 CCGAACCCTCTTCCTGCTGC CGAGACCTGGGCGGGCTCCC GCGCTGAAATACCTCATGGA
HLA-H Ex 2/3 GAGAGAACCTGCGGATCGC AGCGAGGGCGGTTCTCACACCATG CCACGTCGCAGCCATACAT
HLA-H GAGAGAACCTGCGGATCGC ACCAGAGCGAGGGCGGTTCTCACAC CGGGCCGGGACATGGT
KRT5 CGCCACTTACCGCAAGCT TGGAGGGCGAGGAATGCAGACTCA ACAGAGATGTTGACTGGTCCAACTC
KRT20 GCGACTACAGTGCATATTACAGACAA TTGAAGAGCTGCGAAGTCAGATTAAGGATGCT CACACCGAGCATTTTGCAGTT
CALM2 GAGCGAGCTGAGTGGTTGTG TCGCGTCTCGGAAACCGGTAGC AGTCAGTTGGTCAGCCATGCT
HLA-L Ex2/3 CCTGCTCCGCTATTACAACCA CGAGGCCGGTATGAACAGTTCGCCTA CGTTCAGGGCGATGTAATCC
HLA-L Ex5/6 GCTGTGGTTGCTGCTGCG AGAAAAGCTCAGGCAGCAATTGTGCTCAG CATAGTCCTCTTTACAAGTATCATGAGATG
HLA-L Ex 7 TCCTCTTCTGCTCAGCTCTCCTA CTCTCCCTTCCCTGAGTTGTAGTAATCCTAGCACT GCTTTATAGATCCATGAGTTTGCATTA
HLA-J Ex4/5 CAAGGGGCTGCCCAAGC CATCCTGAGATGGGTCACACATTTCTGGAA CCTCCTAGTCTTGGAACCTTGAGAAGT
상기 프라이머 및 프로브는 서열번호 36 내지 83에 해당한다. 예를 들어, HLA-G 엑손 3의 정방향 프라이머, 프로브 및 역방향 프라이머는 각각 서열번호 36, 37, 38이다.
결과
방광 특이적 발암물질인 BBN으로 치료한 결과 종양이 70% 성장했다. Gallium-68 표지된 항-HLA-J JULY-mAb 또는 Gallium-68 표지된 항-HLA-G Lilly-mAb(100 μL에서 6.66 MBq)의 방광 내 점적 후 45분 및 90분 후, 68Gallium 활성의 정량화를 통해 다른 기관에서 방사성면역접합체의 흡수를 분석했다. 추정되는 바와 같이, Gallium-68이 표지된 항-HLA-J JULY-mAb 또는 Gallium-68이 표지된 항-HLA-G Lilly-mAb의 국소적 방광 내 적용은 무시할 수 있는 전신 활성으로 방광에서 치료 화합물의 우수한 보유를 보장했다. 이러한 데이터는 질병의 징후 없이 300일 이상 생존한 동물을 희생시킨 후 확인된 바와 같이, 낮은 전신 독성을 시사한다.
방광 내 Lutetium-177 항-HLA-J JULY-mAb 및 Lutetium-177 항-HLA-G LILLY-mAb 치료 후 치료 반응 및 효능을 모니터링하기 위해 종양의 PET-CT 이미지를 치료 전후 다른 시점에서 기록했다. BBN 유도 14일 후 Lutetium-177 항-HLA-J JULY-mAb 및 Lutetium-177 항-HLA-G LILLY-mAb 치료를 적용한 후, 완전한 제거 및 종양 크기 감소가 모두 관찰될 수 있었다. 또한, Simple PCI 소프트웨어를 사용하여 치료 전후에 ROI를 통해 선택된 마우스의 종양에서 나오는 빛 방출을 정량화했다. BBN 유도 후 7일째에 Lutetium-177 항-HLA-J JULY-mAb 또는 Lutetium-177 항-HLA-G LILLY-mAb 치료(0.925MBq)로 처리된 마우스의 방광 내 종양의 광 방출은 방광 내 종양의 완전 또는 부분 소멸을 나타낸다.
종양 세포 점적 1시간 후 PBS 또는 표지되지 않은 항-HLA-J JULY-mAb 및 항-HLA-G LILLY-mAb 치료로 처리된 마우스는 각각 41일 및 89일의 중간 생존에 도달했다. BBN 유도 후 1시간 후에 0.37 또는 0.925 MBq로 Lutetium-177 항-HLA-J JULY-mAb 및 Lutetium-177 항-HLA-G LILLY-mAb 치료 요법을 받은 그룹은 모두 300일 이상(P < 0.001)의 유의하게 더 긴 중간 생존 기간을 보여주었고 어떤 종양도 발생하지 않았다. 동물의 90%에서 무병 생존(disease-free survival)이 관찰되었다.
실시예 6 - 68 Gallium 방사성표지된 항-HLA-J JULY-mAb 및 항-HLA-G Lilly-mAb의 생체 분포 및 선행(neoadjuvant) 백금 기반 화학 치료에 반응하지 않는 진행성, 근육-침습성(muscle-invasive) 방광암 환자의 방광에 점적 후 Lutetium-177로 방사성표지된 항체를 사용한 치료
선행 백금 기반 화학 치료에 반응하지 않는 진행성, 근육-침습성 방광암을 앓고 있는 환자에서 Gallium-68로 표지된 항-HLA-J JULY-mAb 및 Gallium-68로 표지된 항-HLA-G Lilly-mAb 항체를 사용하여 생체 분포를 수행했다. 점적은 EAU 비뇨기과 지침(Roupret et al., Eur Urol. 2018 Jan;73(1):111-122)에 따라 적용되었다. 전신 PET-CT 스캐너로 생체 분포를 모니터링했다. PET-CT를 사용한 분자 영상화 결과 68Gallium 표지가 붙은 항-HLA-J JULY-mAb 및 항-HLA-G Lilly-mAb가 주로 근육-침습성 방광암을 표적으로 하는 동시에 주변의 건강한 방광 조직에 대한 흡수율이 매우 낮은 것으로 나타났다. 이 데이터는 항-HLA-J JULY-mAb 및 항-HLA-G LILLY-mAb의 낮은 전신 독성을 나타내며, 결과적으로 효과적인 항-종양 치료가 된다.
방사선면역치료의 경우 환자는 표지된 lutetium-177로 표지된 항-HLA-J JULY-mAb 및 항-HLA-G LILLY-mAb로 투여받았다. 점적은 EAU 비뇨기과 지침(Roupret et al., Eur Urol. 2018 Jan; 73(1):111-122)에 따라 적용되었다. 정맥계를 통한 전신 적용과 비교하여 lutetium-177로 표지된 항-HLA-J JULY-mAb 및 항-HLA-G LILLY-mAb로 사용한 점적 치료의 장점은 전신적으로 더 낮은 방사성 독성 부담(radiotoxical burden)과 신장 기능의 보존이다. 모든 환자는 조직학적으로 입증된 근육-침습성 방광암이 있었다. 점적 치료 반응은 전신 PET-CT 스캐너로 모니터링되었다. 재구성은 저선량 CT를 기반으로 한 감쇠 및 산란 보정(scatter correction)을 포함하여 제조업체에서 구현한 반복적인 재구성 알고리즘을 사용하여 수행되었다. 정량 분석을 위해, 동적 목록 모드 데이터는 300초의 6개 이미지로 재구성되었다. 평균 표준화 흡수 값(standardized uptake value, SUV)은 방광과 모든 기관에서 고정된 크기의 관심 부피(volumes of interest, VOI)로 측정되었다.
HLA-J 및 HLA-G 양성 방광암이 발견되었다. 부작용은 관찰되지 않았다. Lutetium-177로 표지된 항-HLA-J JULY-mAb 및 항-HLA-G LILLY-mAb로 획득한 이미지는 Gallium-68로 표지된 항-HLA-J JULY-mAb 및 Gallium-68로 표지된 항-HLA-G Lilly-mAb 항체를 사용하여 얻은 이미지와 유사했다. PET-CT 이미지는 치료 반응을 평가하기 위해 다른 시점에서 촬영되었다. 환자들은 항-HLA-J 및 항-HLA-G 방사선면역치료에 종양 크기의 감소뿐만 아니라 병리학적 완전 반응(pathological complete response )에 대한 반응을 보였다는 것을 관찰할 수 있었다.
실시예 7 - 68 Gallium로 방사성표지된 항-HLA-J JULY-mAb 및 항-HLA-G Lilly-mAb의 생체 분포 및 선행 백금 기반 화학 치료에 반응하지 않는 진행성, 근육-침습성 방광암 환자에 Lutetium-177 로 방사성표지된 항체를 정맥 주사하여 치료
선행 백금 기반 화학 치료에 반응하지 않는 진행성, 근육-침습성 방광암을 앓고 있는 환자에서 Gallium-68로 표지된 항-HLA-J JULY-mAb 및 Gallium-68로 표지된 항-HLA-G Lilly-mAb 항체를 사용하여 생체 분포가 수행되었다. 정맥 주사는 EAU 비뇨기과 지침(Roupret et al., Eur Urol. 2018 Jan;73(1):111-122)에 따라 적용되었다. 전신 PET-CT 스캐너로 생체 분포를 모니터링했다. PET-CT를 사용한 분자 영상화 결과 68Gallium 표지가 된 항-HLA-J JULY-mAb 및 항-HLA-G Lilly-mAb가 근육 -침습성 방광암을 주요 표적으로 하는 동시에 다른 장기에 대한 흡수율이 매우 낮은 것으로 나타났다. 이 데이터는 항-HLA-J JULY-mAb 및 항-HLA-G LILLY-mAb의 낮은 전신 독성을 나타내며, 결과적으로 효과적인 항종양 치료가 된다.
방사선면역치료의 경우 환자는 lutetium-177로 표지된 항-HLA-J JULY-mAb 및 항-HLA-G LILLY-mAb를 투여받았다. 정맥 주사는 EAU 비뇨기과 지침(Roupret et al., Eur Urol. 2018 Jan;73(1):111-122)에 따라 적용되었다. 모든 환자는 조직학적으로 입증된 근육 침습성 방광암이 있었다. 방사선 면역치료반응은 전신 PET-CT 스캐너로 모니터링되었다. 재구성은 저선량 CT를 기반으로 한 감쇠 및 산란 보정을 포함하여 제조업체에서 구현한 반복적인 재구성 알고리즘을 사용하여 수행되었다. 정량 분석을 위해, 동적 목록 모드 데이터를 300초의 6개 이미지로 재구성했다. 평균 표준화 흡수 값(SUV)은 방광뿐만 아니라 모든 기관에서 고정된 크기의 관심 부피(VOI)로 측정되었다.
HLA-J 및 HLA-G 양성 방광암은 다른 장기에 대한 매우 낮은 흡수와 동시에 다른 전이성 측면도 검출되었다. 부작용은 관찰되지 않았다. Lutetium-177로 표지된 항-HLA-J JULY-mAb 및 항-HLA-G LILLY-mAb로 획득한 이미지는 Gallium-68로 표지된 항-HLA-J JULY-mAb 및 Gallium-68로 표지된 항-HLA-G Lilly-mAb 항체를 사용하여 이전에 얻은 이미지와 유사했다. PET-CT 이미지는 치료 반응을 평가하기 위해 다른 시점에서 촬영되었다. 환자들은 항-HLA-J 및 항-HLA-G 방사선면역치료에 종양 크기의 감소 및 병리학적 완전 반응에 대한 반응을 보였다는 것을 관찰할 수 있었다. 또한, 전이의 크기와 수도 감소했다. 일부 환자는 적용된 방사선면역치료에 대해 어떠한 전이나 종양도 전혀 없는 전체 완전한 병리학적 반응(total pathological complete response)을 보였다.
실시예 8 - 68 Gallium로 방사성표지된 항-HLA-J JULY-mAb 및 항-HLA-G Lilly-mAb의 생체 분포 및 BCG 점적에 불응성(refractory)인 비 근육 침습성 방광암 환자의 방광에 점적 후 Lutetium-177 로 방사성표지된 항체를 사용한 치료
선행 백금 기반 화학 치료에 반응하지 않은 진행성, 비-근육-침습성 방광암을 앓고 있는 환자에서 Gallium-68로 표지된 항-HLA-J JULY-mAb 및 Gallium-68로 표지된 항-HLA-G Lilly-mAb 항체로 생체 분포를 수행했다. 점적은 EAU 비뇨기과 지침(Roupret et al., Eur Urol. 2018 Jan;73(1):111-122)에 따라 적용되었다. 전신 PET-CT 스캐너로 생체 분포를 모니터링했다. PET-CT를 사용한 분자 영상화 결과 68Gallium로 표지된 항-HLA-J JULY-mAb 및 항-HLA-G Lilly-mAb가 주로 근육-침습성 방광암을 표적으로 하는 동시에 주변의 건강한 방광 조직에 대한 흡수율이 매우 낮은 것으로 나타났다. 이 데이터는 항-HLA-J JULY-mAb 및 항-HLA-G LILLY-mAb의 낮은 전신 독성을 나타내며, 결과적으로 효과적인 항-종양 치료가 된다.
방사선면역치료의 경우 환자는 Lutetium-177로 표지된 항-HLA-J JULY-mAb 및 항-HLA-G LILLY-mAb를 투여받았다. 점적은 EAU 비뇨기과 지침(Roupret et al., Eur Urol. 2018 Jan;73(1):111-122)에 따라 적용되었다. 정맥계를 통한 전신 적용과 비교하여 Lutetium-177로 표지된 항-HLA-J JULY-mAb 및 항-HLA-G LILLY-mAb를 사용한 점적 치료의 장점은 신장 기능의 보존뿐만 아니라 전신적으로 더 낮은 방사성 독성 부담이다. 모든 환자는 조직학적으로 입증된 비-근육-침습성 방광암이 있었다. 점적 치료 반응은 전신 PET-CT 스캐너로 모니터링되었다. 재구성은 저선량 CT를 기반으로 한 감쇠 및 산란 보정을 포함하여 제조업체에서 구현한 반복적인 재구성 알고리즘을 사용하여 수행되었다. 정량 분석을 위해 동적 목록 모드 데이터를 300초의 6개 이미지로 재구성했다. 평균 표준화 흡수 값(SUV)은 모든 기관뿐만 아니라 방광에서 고정된 크기의 관심 부피(VOI)로 측정되었다.
HLA-J 및 HLA-G 양성 방광암이 발견되었지만, 다른 장기에서는 발견되지 않았다. 부작용은 관찰되지 않았다. Lutetium-177로 표지된 항-HLA-J JULY-mAb 및 항-HLA-G LILLY-mAb로 획득한 이미지는 Gallium-68로 표지된 항-HLA-J JULY-mAb 및 Gallium-68로 표지된 항-HLA-G Lilly-mAb 항체를 사용하여 이전에 얻은 이미지와 유사했다. PET-CT 이미지는 치료 반응을 평가하기 위해 다른 시점에서 촬영되었다. 환자들은 항-HLA-J 및 항-HLA-G 방사선면역치료에 종양 크기의 감소와 병리학적 완전 반응에 대한 반응을 보였다는 것을 관찰할 수 있었다.
실시예 9 - 68 Gallium으로 표지된 항-HLA-J JULY-mAb 및 항-HLA-G Lilly-mAb의 생체 분포 및 BCG 점적에 불응성인 비근육 침습성 방광암 환자에게 Lutetium-177로 방사성표지된 항체를 정맥 주사하여 치료
BCG 치료에 반응하지 않은 진행성, 비-근육-침습성 방광암을 앓고 있는 환자에서 Gallium-68로 표지된 항-HLA-J JULY-mAb 및 Gallium-68로 표지된 항-HLA-G Lilly-mAb 항체로 생체 분포를 수행했다. 정맥 주사는 EAU 비뇨기과 지침(Roupret et al., Eur Urol. 2018 Jan;73(1):111-122)에 따라 적용되었다. 전신 PET-CT 스캐너로 생체 분포를 모니터링했다. PET-CT를 이용한 분자 영상화 결과 68Gallium으로 표지된 항-HLA-J JULY-mAb 및 항-HLA-G Lilly-mab이 주로 비-근육-침습성 방광암을 표적으로 하며 동시에 다른 장기에 대한 흡수가 매우 낮은 것으로 나타났다. 이 데이터는 항-HLA-J JULY-mAb 및 항-HLA-G LILLY-mAb의 낮은 전신 독성을 나타내며, 결과적으로 효과적인 항-종양 치료가 된다.
방사선면역치료의 경우 환자는 Lutetium-177로 표지된 항-HLA-J JULY-mAb 및 항-HLA-G LILLY-mAb을 투여받았다. 정맥 주사는 EAU 비뇨기과 지침(Roupret et al., Eur Urol. 2018 Jan;73(1):111-122)에 따라 적용되었다. 모든 환자는 조직학적으로 입증된 비-근육-침습성 방광암이 있었다. 전신 PET-CT 스캐너로 방사선면역치료반응을 모니터링했다. 재구성은 저선량 CT를 기반으로 한 감쇠 및 산란 보정을 포함하여 제조업체에서 구현한 반복적인 재구성 알고리즘을 사용하여 수행되었다. 정량 분석을 위해 동적 목록 모드 데이터를 300초의 6개 이미지로 재구성했다. 평균 표준화 흡수 값(SUV)은 모든 기관뿐만 아니라 방광에서 고정된 크기의 관심 부피(VOI)로 측정되었다.
HLA-J 및 HLA-G 양성 방광암뿐만 아니라 다른 장기에 대한 흡수가 매우 낮은 동시에 다른 전이성 측면도 검출되었다. 부작용은 관찰되지 않았다. Lutetium-177로 표지된 항-HLA-J JULY-mab 및 항-HLA-G LILLY-mab으로 획득한 이미지는 Gallium-68이 표지된 항-HLA-J JULY-mAb 및 Gallium-68이 표지된 항-HLA-G Lilly-mab 항체를 사용하여 이전에 얻은 이미지와 유사했다. PET-CT 이미지는 치료 반응을 평가하기 위해 다른 시점에서 촬영되었다. 환자들은 항-HLA-J 및 항-HLA-G 방사선면역 치료에 종양 크기의 감소 및 병리학적 완전 반응에 대한 반응을 보였다는 것을 관찰할 수 있었다. 또한, 전이의 크기와 수도 감소했다. 일부 환자는 적용된 방사선면역치료에 대해 어떠한 전이나 종양도 전혀 없는 전체 병리학적 완전한 반응을 보였다.
SEQUENCE LISTING <110> Intellexon GmbH <120> HLA-H, HLA-J and HLA-L as therapeutic and diagnostic targets <130> AC2757 PCT <150> EP 19 20 5451.8 <151> 2019-10-25 <160> 83 <170> BiSSAP 1.3 <210> 1 <211> 221 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> HLA-H soluble <400> 1 Met Val Leu Met Ala Pro Arg Thr Leu Leu Leu Leu Leu Ser Gly Ala 1 5 10 15 Leu Ala Leu Thr Leu Thr Gln Thr Trp Ala Arg Ser His Ser Met Arg 20 25 30 Tyr Phe Tyr Thr Thr Met Ser Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe 35 40 45 Ile Ser Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser 50 55 60 Asp Asp Ala Ser Pro Arg Glu Glu Pro Arg Ala Pro Trp Met Glu Arg 65 70 75 80 Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Arg Asn Thr Gln Ile Cys Lys Ala Gln 85 90 95 Ala Gln Thr Glu Arg Glu Asn Leu Arg Ile Ala Leu Arg Tyr Tyr Asn 100 105 110 Gln Ser Glu Gly Gly Ser His Thr Met Gln Val Met Tyr Gly Cys Asp 115 120 125 Val Gly Pro Asp Gly Arg Phe Leu Arg Gly Tyr Glu Gln His Ala Tyr 130 135 140 Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Asn Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr 145 150 155 160 Ala Ala Asp Met Ala Ala Gln Ile Thr Lys Arg Lys Trp Glu Ala Ala 165 170 175 Arg Arg Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr Leu Glu Gly Glu Phe Val Glu 180 185 190 Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu Thr Leu Gln Arg Ala 195 200 205 Asp Pro Pro Gln Asp Thr Tyr Asp Pro Pro Pro His Leu 210 215 220 <210> 2 <211> 219 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> HLA-J soluble <400> 2 Met Ala Pro Arg Thr Leu Leu Leu Leu Leu Ser Gly Thr Leu Ala Leu 1 5 10 15 Ala Glu Thr Trp Ala Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ser Trp Pro Gly Arg Gly Glu Pro Ser Phe Ile Ala Val Gly Tyr 35 40 45 Val Asp Asp Thr Gln Phe Val Arg Val Asp Ser Asp Ala Val Ser Leu 50 55 60 Arg Met Lys Thr Arg Ala Arg Trp Val Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr 65 70 75 80 Trp Asp Leu Gln Thr Leu Gly Ala Lys Ala Gln Ala Gln Thr Asp Arg 85 90 95 Val Asn Leu Arg Thr Leu Leu Arg Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Asp 100 105 110 Pro Pro Gln Asp Thr Arg Asp Pro Pro Pro Ser Leu Asn Met Arg His 115 120 125 Asn Glu Val Leu Gly Ser Gly Leu Leu Pro Cys Gly Asp His Ile Asp 130 135 140 Leu Ala Ala Gly Trp Gly Gly Pro Asp Pro Gly His Gly Ala Arg Gly 145 150 155 160 Asp Gln Ala His Arg Gly Trp Asn Leu Pro Glu Val Gly Gly Cys Gly 165 170 175 Ser Ala Phe Trp Arg Gly Thr Glu Ile His Met Pro Cys Ala Ala Gln 180 185 190 Gly Ala Ala Gln Ala Pro His Pro Glu Met Gly His Thr Phe Leu Glu 195 200 205 Thr Ser Arg Gly Ser Lys Thr Arg Arg Phe Leu 210 215 <210> 3 <211> 246 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> HLA-L soluble <400> 3 Met Gly Val Met Ala Pro Arg Thr Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Ala 1 5 10 15 Leu Ala Leu Thr Glu Thr Trp Ala Ala Thr Pro Val Arg Gly Trp Ser 20 25 30 Gly Gly Arg Arg Gly Trp Ser Arg Arg Gly Trp Ser Ile Gly Thr Arg 35 40 45 Arg His Gly Thr Pro Arg Ala Thr Arg Arg Phe Thr Glu Thr Cys Gly 50 55 60 Pro Cys Ser Ala Ile Thr Thr Arg Ala Arg Pro Val Thr Val Arg Leu 65 70 75 80 Arg Trp Gln Gly Leu His Arg Pro Glu Arg Gly Pro Ala Leu Leu Asp 85 90 95 Arg Arg Glu His Ser Gly Ser Asp Leu Pro Ala Gln Val 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cgagggcggt tctcacacca 540 tgcaggtgat gtatggctgc gacgtggggc ccgacgggcg cttcctccgc gggtatgaac 600 agcacgccta cgacggcaag gattacatcg ccctgaacga ggacctgcgc tcctggaccg 660 cggcggacat ggcagctcag atcaccaagc gcaagtggga ggcggcccgt cgggcggagc 720 agctgagagc ctacctggag ggcgagttcg tggagtggct ccgcagatac ctggagaacg 780 ggaaggagac gctgcagcgc gcggaccccc cccaagacac atatgaccca ccaccccatc 840 tctgaccatg aggccaccct gaggtgctgg gccctgggct tctaccctgc ggagatcaca 900 ctgacctggc agcgggatgg ggaggaccag acccaggaca cggagctcgt ggagaccagg 960 cctgcagggg atggaacctt ccagaagtgg gcggctgtgg tggtgccttc tggagaggag 1020 cagagataca cctgccatgt gcagcatgag ggtctgcccg agcccctcac cctgagatgg 1080 gagccatctt cccagcccaa cgtccccatc gtgggcatcg ttgctggcct ggttctactt 1140 gtagctgtgg tcactggagc tgtggtcgct gctgtaatgt ggaggaagaa gagctcagat 1200 agaaaaggag ggagctactc tcaggctgca acagcaacag tgcccagggc tctgatgtgt 1260 ctctcacggc ttgaaagtgt gagacagctg ccttgtgtgg gactgagagg caagagttgt 1320 tcctgccttc cctttgtgac ttgaagaacc ctgactttct ttctacaaag 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tgtccaccat gaccctgttc cccacactga 1320 cctacattcc ttccccgatc acctttcctg ttccagagaa gtggtgctgg gatgtctcca 1380 tctctgtctc aacttcatgg tgcactgagc tgtaacttct tacttcccta ttaaaattag 1440 aatctgagta taaatttact tttttcaaat tatttccatg acgggttgat gggttaatta 1500 aaggagaaga ttcctaaaat ttgagagaca aaataaatgg aagacatgag aa 1552 <210> 8 <211> 898 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> HLA-L soluble <400> 8 acgatcccgg cactacagtc ccggcgcaac cacccgcact cagattctcc ccaaacgcca 60 aggatggggg tcatggctcc ccgaaccctc ctcctgctgc tcttgggggc cctggccctg 120 accgagacct gggccgcgac tccgtgagtc cgaggatgga gcggcgggcg ccgtgggtgg 180 agcaggaggg gctggagtat tgggaccagg agacacggaa cgccaagggc cacgcgcaga 240 tttaccgagt gaacctgcgg accctgctcc gctattacaa ccagagcgag gccggtatga 300 acagttcgcc tacgatggca aggattacat cgccctgaac gaggacctgc actcctggac 360 cgccgcgaac acagcggctc agatctccca gcacaagtgg gaagcggaca aatactcaga 420 gcaggtcagg gcctacctga gggcaagtgc atggagtggc tccgcagaca cctggagaac 480 gggaaggaga cgctgcagca cgcggatccc ccaaaggcac atgtgaccca gcaccccatc 540 tctgaccatg aggccaccct gaggtgctgg gccctgggcc tctaccctgc ggagatcaca 600 ctgacctggc agcaggatgg ggaggaccag acccaggaca cggagcttgt ggagaccagg 660 cctgcagggg acggaacctt ccagaagtgg gtggctgtag tggtgccttc cggagaggag 720 cagagataca tgtgccatgt gcagcatgag gggctgccag agcccctcac cctgagatgg 780 gagccgtctt ctcagcccac catccccatc gtgggcatcg ttgctggcct gtttctcctt 840 ggagctgtgg tcactggagc tgtggttgct gctgcgatgt ggaggaagaa aagctcag 898 <210> 9 <211> 1285 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> HLA-V soluble <400> 9 gaaacattga gacagagcgc ttggcacaga agtagcgggg tcagggcgaa gtcccagggc 60 ctcaggcgtg gctctcagga tctcaggccc caaaggcggt gtatggattg gggaggccca 120 gcgctgggca ttccccatct ttgcagggtt tctcttctcc ctctcccaac ctgtgtcggg 180 tccttcttcc tgggtactca ccgggctgcc ccagttctca ctcccattga gtgtcgggtt 240 tctagagaag ccaatcaatg tagccgcggt cccggttcta aagttcccac gcacccaccg 300 ggactccgat tcttcccagt cgccgaggat ggtgtcatgg cgccccgaac cctgcttctg 360 ctgctctcgg gggccctggt cctgacccag acctgggcag gcttccactc cttgaggtat 420 ttccacacca ccatgtcccg gcccggccgc gcggatcccc gcttcctctc cgtgggcgac 480 gtggacgaca cgcagtgcgt gcggctcgac agcgacgcca cgagtcccag gatggagccg 540 cgggcgccgt ggatggagca ggaggggccg gaatattggg aagaggagac agggaccgcc 600 aaggccaaag cacagtttta ccgagtgaac ctgcggaccc tgagcggcta ctacaaccag 660 agtgaggcct aagtgcagct tcattccctc cctgttcgtg tggcctggac ttaatgactc 720 acttctaact gatagagtaa tgctgacata atagtttgtg attctgggtg tagaacataa 780 gactcactga agtttctact ttggttcttt ctttctctgg aatcatgagc cctgggggaa 840 gctggctgtt gtgtcataag gaggcctgtg gtccatgtga ctaggaagtg agtcctcctg 900 ggaccagaca ataagaagct aaagcctctt ccaaaagcca tgtgagagat tcttgtgtct 960 tgtgaatccc cggccccatt tgagccctca gatgattcag ccctggaaga caactagact 1020 gcaacgttgt gagaggccct gagccagaag cattcagaga aacttctcct ggattcctga 1080 ccatggataa ctgtgggaga tgataaatat ttgttgattt gagctgctaa gttgtaggtg 1140 acttgttatg cagcagtaga taactaatac agcttcacaa gagaggatga atcactgaac 1200 tttttcattt gctctaaatt cattataaga tattaaacat gtcatttgct tttaatattt 1260 aataaaaatt tccatggcta tataa 1285 <210> 10 <211> 1095 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> HLA-Y soluble <400> 10 atggcggtcg tggcgccccg aaccctcctc ctgctactct cgggggccct ggccctgacc 60 cagacctggg cgggctccca ctccatgagg tatttctcca catccgtgtc ccggcccggc 120 agtggagagc cccgcttcat cgcagtgggc tacgtggacg acacgcagtt cgtgcggttc 180 gacagcgacg ccgcgagcca gaggatggag ccgcgggcgc cgtggatgga gcaggaggag 240 ccggagtatt gggaccggca gacacagatc tccaagacca acgcacagat tgacctagag 300 agcctgcgga tcgcgctccg ctactacaac cagagcgagg ccggttctca caccatccag 360 aggatgtctg gctgcgacgt ggggtcggac gggcgcttcc tccgcgggta ccggcaggac 420 gcctacgacg gcaaggatta catcgccctg aacgaggacc tgcgctcttg gaccgcggcg 480 gacatggcgg ctcagatcac ccagcgcaag tgggaggcgg cccgtcaggc ggagcagttg 540 agagcctacc tggagggcga gtgcatggag tggctccgca gatacctgga gaacgggaag 600 gagacgctgc agcgcacgga ccccccccca agacacatat gacccaccac cccatctctg 660 accatgaggc caccctgagg tgctgggccc tgagcttcta ccctgcggag atcacactga 720 cctggcagcg ggatggggag gaccagaccc aggacacgga 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cggccgcggg gagccccgct tcatctctgt gggctacgtg gacgacaccc 180 agttcgtgcg cttcgacaac gacgccgcga gtccgaggat ggtgccgcgg gcgccgtgga 240 tggagcagga ggggtcagag tattgggacc gggagacacg gagcgccagg gacaccgcac 300 agattttccg agtgaatctg cggacgctgc gcggctacta caatcagagc gaggccgggt 360 ctcacaccct gcagtggatg catggctgcg agctggggcc cgacgggcgc ttcctccgcg 420 ggtatgaaca gttcgcctac gacggcaagg attatctcac cctgaatgag gacctgcgct 480 cctggaccgc ggtggacacg gcggctcaga tctccgagca aaagtcaaat gatgcctctg 540 aggcggagca ccagagagcc tacctggaag acacatgcgt ggagtggctc cacaaatacc 600 tggagaaggg gaaggagacg ctgcttcacc tggagccccc aaagacacac gtgactcacc 660 accccatctc tgaccatgag gccaccctga ggtgctgggc cctgggcttc taccctgcgg 720 agatcacact gacctggcag caggatgggg agggccatac ccaggacacg gagctcgtgg 780 agaccaggcc tgcaggggat ggaaccttcc agaagtgggc agctgtggtg gtgccttctg 840 gagaggagca gagatacacg tgccatgtgc agcatgaggg gctacccgag cccgtcaccc 900 tgagatggaa gccggcttcc cagcccacca tccccatcgt gggcatcatt gctggcctgg 960 ttctccttgg atctgtggtc 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ggagatgtcc tggactcaca cggaaactta gggctacgga 60 atgaagttct cactcccatt aggtgacagg tttttagaga agccaatcag cgtcgccgcg 120 gtcctggttc taaagtcctc gctcacccac ccggactcat tctccccaga cgccaaggat 180 ggtggtcatg gcgccccgaa ccctcttcct gctgctctcg ggggccctga ccctgaccga 240 gacctgggcg ggctcccact ccatgaggta tttcagcgcc gccgtgtccc ggcccggccg 300 cggggagccc cgcttcatcg ccatgggcta cgtggacgac acgcagttcg tgcggttcga 360 cagcgactcg gcgtgtccga ggatggagcc gcgggcgccg tgggtggagc aggaggggcc 420 ggagtattgg gaagaggaga cacggaacac caaggcccac gcacagactg acagaatgaa 480 cctgcagacc ctgcgcggct actacaacca gagcgaggcc agttctcaca ccctccagtg 540 gatgattggc tgcgacctgg ggtccgacgg acgcctcctc cgcgggtatg aacagtatgc 600 ctacgatggc aaggattacc tcgccctgaa cgaggacctg cgctcctgga ccgcagcgga 660 cactgcggct cagatctcca agcgcaagtg tgaggcggcc aatgtggctg aacaaaggag 720 agcctacctg gagggcacgt gcgtggagtg gctccacaga tacctggaga acgggaagga 780 gatgctgcag cgcgcggacc cccccaagac acacgtgacc caccaccctg tctttgacta 840 tgaggccacc ctgaggtgct gggccctggg cttctaccct 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agacacacgt 540 gacccaccac cctgtctttg actatgaggc caccctgagg tgctgggccc tgggcttcta 600 ccctgcggag atcatactga cctggcagcg ggatggggag gaccagaccc aggacgtgga 660 gctcgtggag accaggcctg caggggatgg aaccttccag aagtgggcag ctgtggtggt 720 gccttctgga gaggagcaga gatacacgtg ccatgtgcag catgaggggc tgccggagcc 780 cctcatgctg agatggagta aggagggaga tggaggcatc atgtctgtta gggaaagcag 840 gagcctctct gaagaccttt aa 862 <210> 34 <211> 529 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> HLA-G7 <400> 34 agtgtggtac tttgtcttga ggagatgtcc tggactcaca cggaaactta gggctacgga 60 atgaagttct cactcccatt aggtgacagg tttttagaga agccaatcag cgtcgccgcg 120 gtcctggttc taaagtcctc gctcacccac ccggactcat tctccccaga cgccaaggat 180 ggtggtcatg gcgccccgaa ccctcttcct gctgctctcg ggggccctga ccctgaccga 240 gacctgggcg ggctcccact ccatgaggta tttcagcgcc gccgtgtccc ggcccggccg 300 cggggagccc cgcttcatcg ccatgggcta cgtggacgac acgcagttcg tgcggttcga 360 cagcgactcg gcgtgtccga ggatggagcc gcgggcgccg tgggtggagc aggaggggcc 420 ggagtattgg gaagaggaga cacggaacac caaggcccac gcacagactg acagaatgaa 480 cctgcagacc ctgcgcggct actacaacca gagcgaggcc agtgagtaa 529 <210> 35 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> redox-active site <400> 35 Cys Gly Pro Cys 1 <210> 36 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-G Ex3 Forward Primer <400> 36 ggccggagta ttgggaaga 19 <210> 37 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-G Ex3 Probe <400> 37 caaggcccac gcacagactg aca 23 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-G Ex3 Reverse Primer <400> 38 gcagggtctg caggttcatt 20 <210> 39 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-G Ex4 Forward Primer <400> 39 ctgcggctca gatctccaa 19 <210> 40 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-G Ex4 Probe <400> 40 cgcaagtgtg aggcggccaa t 21 <210> 41 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-G Ex4 Reverse Primer <400> 41 caggtaggct ctcctttgtt cag 23 <210> 42 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-G Ex5 Forward Primer <400> 42 caccaccctg tctttgacta tgag 24 <210> 43 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-G Ex5 Probe <400> 43 accctgaggt gctgggccct g 21 <210> 44 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-G Ex5 Reverse Primer <400> 44 agtatgatct ccgcagggta gaag 24 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-G Ex6 Forward Primer <400> 45 catccccatc atgggtatcg 20 <210> 46 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-G Ex6 Probe <400> 46 tgctggcctg gttgtccttg ca 22 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-G Ex6 Reverse Primer <400> 47 ccgcagctcc agtgactaca 20 <210> 48 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-G Ex8 Forward Primer <400> 48 gaccctcttc ctcatgctga ac 22 <210> 49 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-G Ex8 Probe <400> 49 cattccttcc ccaatcacct ttcctgtt 28 <210> 50 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-G Ex8 Reverse Primer <400> 50 catcccagcc ccttttctg 19 <210> 51 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-G Ex3-5 Forward Primer <400> 51 ttcatcgcca tgggctacg 19 <210> 52 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-G Ex3-5 Probe <400> 52 cgacacgcag ttcgtgcggt tc 22 <210> 53 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-G Ex3-5 Reverse Primer <400> 53 atcctcggac acgccgagt 19 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-G Ex2/3 Forward Primer <400> 54 ccgaaccctc ttcctgctgc 20 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-G Ex2/3 Probe <400> 55 cgagacctgg gcgggctccc 20 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-G Ex2/3 Reverse Primer <400> 56 gcgctgaaat acctcatgga 20 <210> 57 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-H Ex2/3 Forward Primer <400> 57 gagagaacct gcggatcgc 19 <210> 58 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-H Ex2/3 Probe <400> 58 agcgagggcg gttctcacac catg 24 <210> 59 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-H Ex2/3 Reverse Primer <400> 59 ccacgtcgca gccatacat 19 <210> 60 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-H Forward Primer <400> 60 gagagaacct gcggatcgc 19 <210> 61 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-H Probe <400> 61 accagagcga gggcggttct cacac 25 <210> 62 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-H Reverse Primer <400> 62 cgggccggga catggt 16 <210> 63 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRT5 Forward Primer <400> 63 cgccacttac cgcaagct 18 <210> 64 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRT5 Probe <400> 64 tggagggcga ggaatgcaga ctca 24 <210> 65 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRT5 Reverse Primer <400> 65 acagagatgt tgactggtcc aactc 25 <210> 66 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRT20 Forward Primer <400> 66 gcgactacag tgcatattac agacaa 26 <210> 67 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRT20 Probe <400> 67 ttgaagagct gcgaagtcag attaaggatg ct 32 <210> 68 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRT20 Reverse Primer <400> 68 cacaccgagc attttgcagt t 21 <210> 69 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CALM2 Forward Primer <400> 69 gagcgagctg agtggttgtg 20 <210> 70 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CALM2 Probe <400> 70 tcgcgtctcg gaaaccggta gc 22 <210> 71 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CALM2 Reverse Primer <400> 71 agtcagttgg tcagccatgc t 21 <210> 72 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-L Ex2/3 Forward Primer <400> 72 cctgctccgc tattacaacc a 21 <210> 73 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-L Ex2/3 Probe <400> 73 cgaggccggt atgaacagtt cgccta 26 <210> 74 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-L Ex2/3 Reverse Primer <400> 74 cgttcagggc gatgtaatcc 20 <210> 75 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-L Ex5/6 Forward Primer <400> 75 gctgtggttg ctgctgcg 18 <210> 76 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-L Ex5/6 Probe <400> 76 agaaaagctc aggcagcaat tgtgctcag 29 <210> 77 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-L Ex5/6 Reverse Primer <400> 77 catagtcctc tttacaagta tcatgagatg 30 <210> 78 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-L Ex7 Forward Primer <400> 78 tcctcttctg ctcagctctc cta 23 <210> 79 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-L Ex7 Probe <400> 79 ctctcccttc cctgagttgt agtaatccta gcact 35 <210> 80 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-L Ex7 Reverse Primer <400> 80 gctttataga tccatgagtt tgcatta 27 <210> 81 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-J Ex4/5 Forward Primer <400> 81 caaggggctg cccaagc 17 <210> 82 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-J Ex4/5 Probe <400> 82 catcctgaga tgggtcacac atttctggaa 30 <210> 83 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-J Ex4/5 Reverse Primer <400> 83 cctcctagtc ttggaacctt gagaagt 27

Claims (15)

  1. (A) 대상체로부터 얻은 샘플에서 적어도 하나의 핵산 분자 및/또는 적어도 하나의 단백질 또는 펩티드의 발현을 결정하되,
    적어도 하나의 핵산 분자는
    (a) 서열번호 1 내지 5 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드를 인코딩(encoding)하는 핵산 분자,
    (b) 서열번호 6 내지 10 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 분자,
    (c) (a)의 아미노산 서열과 적어도 85% 동일하고, 바람직하게는 적어도 90% 동일하며, 가장 바람직하게는 적어도 95% 동일한 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자,
    (d) (b)의 뉴클레오티드 서열과 적어도 95% 동일하고, 바람직하게는 적어도 96% 동일하며, 가장 바람직하게는 적어도 98% 동일한 뉴클레오티드 서열로 이루어진 핵산 분자,
    (e) (d)의 핵산 분자에 대해 축퇴(degenerate)된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 핵산 분자,
    (f) (a) 내지 (e) 중 어느 하나의 핵산 분자의 단편으로 이루어지며, 상기 단편은 적어도 150개의 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 300개의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 적어도 450개의 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 적어도 600개의 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자, 및
    (g) (a) 내지 (f) 중 어느 하나의 핵산 분자에 해당하되, T는 U로 대체된 핵산 분자로부터 선택되며, 및
    여기서 적어도 하나의 단백질 또는 펩티드는 (a) 내지 (g) 중 어느 하나의 핵산 분자에 의해 인코딩되는 단백질 또는 펩티드로부터 선택되는 단계; 및
    (B) 적어도 하나의 핵산 분자 및/또는 적어도 하나의 단백질 또는 펩티드가 (A)에서 발현되는 경우, 대상체에서 적어도 하나의 핵산 분자 및/또는 적어도 하나의 단백질 또는 펩티드의 발현을 억제할 수 있는 약제(medicament)를 제조하는 단계, 및/또는
    (B') 적어도 하나의 핵산 분자 및/또는 적어도 하나의 단백질 또는 펩티드가 (A)에서 발현되는 경우, 대상체에서 적어도 하나의 핵산 분자 및/또는 적어도 하나의 단백질 또는 펩티드의 발현 부위를 생체내에서 검출할 수 있는 진단제(diagnostic agent)를 제조하는 단계를 포함하는, 대상체에서 종양의 치료 또는 예방을 위한 약제 또는 대상체에서 종양 검출을 위한 진단제의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    (i) 서열번호 6 내지 10의 뉴클레오티드 서열 중 적어도 2개의 핵산 분자 또는 제1항에 정의된 핵산 분자,
    (ii) 서열번호 1 내지 5 중 어느 하나의 아미노산 서열 중 적어도 2개의 단백질 또는 제1항에 정의된 단백질 또는 펩티드, 및/또는
    (iii) 서열번호 6 내지 10의 뉴클레오티드 서열의 적어도 하나의 핵산 분자 또는 제1항에 정의된 핵산 분자 및 서열 번호 1 내지 5 중 어느 하나의 아미노산 서열의 적어도 하나의 단백질 또는 펩티드 또는 제1항에 정의된 단백질 또는 펩티드의 발현이 단계 (A)에서 결정되는 제조방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    HLA 클래스 Ib 유전자 HLA-E, HLA-F, 및 HLA-G 중 적어도 하나 및/또는 상기 MHC 클래스 Ib 유전자로부터 생성된 적어도 하나의 단백질 또는 펩티드의 발현을 단계 (A)에서 추가로 결정하는 제조방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    HLA 클래스 I 유전자 HLA-A, HLA-B, 및 HLA-C 중 적어도 하나 및/또는 상기 MHC 클래스 I 유전자로부터 생성된 적어도 하나의 단백질 또는 펩티드의 발현을 단계 (A)에서 추가로 결정하는 제조방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    HLA 클래스 II 유전자 HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DRA, 및 HLA-DRB1 중 적어도 하나 및/또는 상기 MHC 클래스 II 유전자로부터 생성된 적어도 하나의 단백질 또는 펩티드의 발현을 단계 (A)에서 추가로 결정하는 제조방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    임신 초기 및 암배아 퇴행 동안 발현되는 적어도 하나의 성장 인자 및/또는 적어도 하나의 종양 마커 및/또는 적어도 하나의 단백질의 발현을 단계 (A)에서 추가로 결정하는 제조방법.
  7. 제6항에 있어서,
    적어도 하나의 성장 인자는 표피 성장 인자(epidermal growth factor, EGF), 섬유아세포 성장 인자(fibroblast growth factor, FGF), 염기성 섬유아세포 성장 인자(basic fibroblast growth factor, bFGF), 성장 분화 인자-9(growth differentiation factor-9, GDF9), 간세포 성장 인자(hepatocyte growth factor, HGF), 간암-유래 성장 인자(hepatoma-derived growth factor, HDGF), 각질세포 성장 인자(keratinocyte growth factor, KGF), 신경 성장 인자(nerve growth factor, NGF), 태반 성장 인자(placental growth factor, PGF), 혈소판-유래 성장 인자(platelet-derived growth factor, PDGF), 기질 세포-유래 인자 1(stromal cell-derived factor 1, SDF1), 형질전환 성장 인자(transforming growth factor), 및 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor)로 이루어진 군으로부터 선택되는 제조방법.
  8. 제6항에 있어서,
    적어도 하나의 종양 마커는 소마토스타틴 수용체(somatostatin receptors), TSH(thyrotropin) 수용체, 티로신 수용체(tyrosin receptors), 및 전립선-특이적 막 항원(prostate-specific membrane antigen, PSMA)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 제조방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 약제는 저분자, 압타머, siRNA, shRNA, miRNA, 리보자임, 안티센스 핵산 분자, CRISPR-Cas9-기반 작제물, CRISPR Cpf1-기반 작제물, 메가뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제, 또는 적어도 하나의 핵산 분자의 발현을 억제할 수 있는 TALE(transcription activator-like(TAL) effector) 뉴클레아제이거나 이를 포함하며, 및/또는
    (ii) 약제는 저분자, 항체, 단백질 약물, 또는 적어도 하나의 단백질 또는 펩티드를 억제할 수 있는 압타머이거나 이를 포함하되, 단백질 약물은 바람직하게는 항체 모방체이고, 여기서 항체 모방체는 바람직하게는 아피바디(affibodies), 애드넥틴(adnectins), 안티칼린(anticalins), 달핀(DARPin), 아비머(avimers), 나노피틴(nanofitins), 아필린(affilins), 쿠니츠 도메인 펩티드(Kunitz domain peptides) 및 피노머(Fynomers®이며, 및/또는
    (iii) 진단제는 저분자, 압타머, siRNA, shRNA, miRNA, 리보자임, 안티센스 핵산 분자, CRISPR-Cas9-기반 작제물, CRISPR-Cpf1-기반 작제물, 메가뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제, 및 적어도 하나의 발현된 핵산 분자에 결합할 수 있는 TALE(transcription activator-like(TAL) effector) 뉴클레아제이거나 이를 포함하며, 및/또는
    (iv) 진단제는 저분자, 항체, 단백질 약물, 또는 적어도 하나의 발현된 단백질 또는 펩티드에 결합할 수 있는 압타머이거나 이를 포함하되, 단백질 약물은 바람직하게는 항체 모방체이고, 여기서 항체 모방체는 바람직하게는 아피바디(affibodies), 애드넥틴(adnectins), 안티칼린(anticalins), 달핀(DARPin), 아비머(avimers), 나노피틴(nanofitins), 아필린(affilins), 쿠니츠 도메인 펩티드(Kunitz domain peptides) 및 피노머(Fynomers®로부터 선택되는 제조방법.
  10. 제9항에 있어서,
    약제이거나 약제에 포함되는 저분자, 항체, 단백질 약물 또는 압타머는 세포독성제에 융합되되, 세포독성제는 바람직하게는 치료 방사성 동위원소, 보다 바람직하게는 177Lu, 90Y, 67Cu 및 225Ac이고, 및/또는
    진단제이거나 진단제에 포함되는 저분자, 항체, 단백질 약물 또는 압타머는 영상제에 융합되되, 영상제는 바람직하게는 치료 방사성 동위원소, 보다 바람직하게는 67Ga, 44Sc, 111In, 99mTc, 57Co, 131I인 제조방법.
  11. 대상체에서 종양의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 제조방법에 의해 제조된 약제.
  12. 대상체에서 종양 부위의 생체내 검출에 사용하기 위한 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 진단제.
  13. 제12항에 있어서,
    검출은 대상체의 전신을 스캐닝하는 것을 포함하되, 스캐닝은 바람직하게는 전신 양전자 방출 단층촬영(PET) 스캐너를 사용하는 진단제.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서,
    검출은 대상체의 종양 부위로의 방사성 동위원소의 방사선량 흡수를 측정하는 것을 포함하는 진단제.
  15. 제14항에 있어서,
    측정된 방사선량 흡수에 기초하여 약제의 치료적 유효량이 결정되되, 약제는 바람직하게는 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조되는 진단제.
KR1020227017553A 2019-10-25 2020-10-19 치료 및 진단 표적으로서의 hla-h, hla-j, hla-l, hla-v 및 hla-y KR20220088910A (ko)

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