KR101607643B1 - Method for screening agent against cancer metastasis using Bax/complex-I - Google Patents

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Abstract

The present invention relates to a method for screening an agent inhibiting cancer metastasis comprising a step of treating a candidate material predicted to inhibit the cancer metastasis of a cancer cell, and a step of measuring the content of a Bax/complex-I composite in the cancer cell; and to a pharmaceutical composition for inhibiting cancer metastasis comprising an agent for inhibiting the expression of p53 and Bcl-w, which relate to the formation of the composite, or an agent for promoting the expression of Bax. The method for screening an agent inhibiting cancer metastasis provided in the present invention is used in discovering a preparation preventing cancer metastasis in advance by controlling the infiltration of a cancer cell by promoting the formation of the Bax/complex-I in the cancer cell, thereby being used in the invention of an effective cancer medicine.

Description

Ｂａｘ/ｃｏｍｐｌｅｘ-Ⅰ 복합체를 이용한 암전이 억제제의 스크리닝 방법{Method for screening agent against cancer metastasis using Bax/complex-I}(Bax / complex-I complex screening agent for cancer metastasis using a Bax / complex-I complex)

본 발명은 Bax/complex-I 복합체를 이용한 암전이 억제제의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 암세포에 암의 전이를 억제할 것으로 예상되는 후보물질을 처리하고, 상기 암세포에서 Bax/complex-I 복합체의 함량을 측정하는 단계를 포함하는 암전이 억제제의 스크리닝 방법 및 상기 복합체의 형성에 관여하는 Bcl-w의 발현억제제 또는 Bax의 발현촉진제를 포함하는 암전이 억제용 약학 조성물에 관한 것이다.
The present invention relates to a method for screening for an inhibitor of cancer metastasis using a Bax / complex-I complex. More specifically, the present invention relates to a method for screening a candidate agent which is expected to inhibit cancer metastasis to cancer cells, -I complex of the present invention, and a pharmaceutical composition for suppressing cancer metastasis which comprises an expression inhibitor of Bcl-w or an expression promoter of Bax which is involved in formation of the complex.

우리나라 암(악성신생물) 사망자 수는 2002년 우리나라 총 사망자 246,515명(조사망률 인구 10만 명당 512명) 가운데 25.5%(남성 사망자의 29.6%, 여성 사망자의 20.5%)인 62,887명으로 암으로 인한 사망(사망률 인구 10만 명당 130.7명)이 사망원인 1위를 차지하고 있다. 암 사망순위는 폐암, 위암, 간암, 대장암 및 췌장암 순으로, 이들 5대 암에 의한 사망이 전체 암 사망의 약 70%를 차지하고 있다. 또한, 남성에 있어 주요 암 사망원인은 폐암, 위암, 간암 및 대장암 등으로 이들 4대 암에 의한 사망자 수(28,147명)가 전체 남성 암 사망자 수(40,177명)의 70%를 차지하고 있으며, 여성에 있어 주요 암 사망원인은 위암, 폐암, 간암, 대장암 및 췌장암 등으로 이들 5대 암에 의한 사망자 수(13,630명)가 전체 여성 암 사망자 수(22,710명)의 60%를 차지하고 있다.The number of cancer deaths in Korea was 62,887, or 25.5% (29.6% of male deaths and 20.5% of female deaths) among 246,515 deaths in Korea (512 deaths per 100,000 population in Korea) Death (130.7 deaths per 100 000 population) is the number one cause of death. Cancer death rankings are lung cancer, stomach cancer, liver cancer, colorectal cancer and pancreatic cancer, and deaths of these five cancer accounts for about 70% of all cancer deaths. The major causes of cancer death in males are lung cancer, stomach cancer, liver cancer, and colon cancer. These deaths from the four major cancers (28,147) account for 70% of all male cancer deaths (40,177) The major causes of cancer deaths are gastric cancer, lung cancer, liver cancer, colon cancer and pancreatic cancer. The death toll from these 5 major cancers (13,630) accounts for 60% of all female cancer deaths (22,710).

이러한 암은 치료후에도 전이 등의 과정을 통해 쉽게 재발할 수 있기 때문에, 이의 치료에 어려움을 겪고 있다. 전이는 악성 종양의 진행에 수반되는 현상으로, 악성 종양 세포가 증식하고 암이 진행함에 따라 전이에 필요한 새로운 유전 형질을 획득한 후 혈관과 림프선으로 침윤하고 혈액과 림프를 따라 순환하다가 다른 조직에 정착한 후 증식하게 된다. 이러한 전이의 작용기작을 규명하기 위하여 활발한 연구가 진행되고 있으며, 이와 관련된 연구결과에 따라, 전이를 예방하려는 연구가 추가로 진행되고 있다.These cancers are difficult to treat because they can easily recur through the process of metastasis after treatment. Metastasis is a phenomenon associated with the progression of malignant tumors. As malignant tumor cells proliferate and cancer progresses, they acquire new genetic traits necessary for metastasis, infiltrate into the blood vessels and lymph nodes, circulate along the blood and lymph, And then proliferate. In order to clarify the mechanisms of these metastases, active research is under way. According to the results of these studies, further studies are being conducted to prevent metastasis.

예를 들어, 한국공개특허 제2014-0049198호에는 hTERT mRNA를 표적하는 리보자임 및 ｐ53 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스를 이용하여 간으로 전이된 암을 치료하는 방법이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2014-0134818호에는 암세포의 전이 또는 침윤에 관여하는 Ei24, p53 및 p21의 발현을 증가시킴으로써 암세포의 항-전이 및 항-침윤 효능을 갖는 엉겅퀴 추출물이 개시되어 있다.For example, Korean Patent Laid-Open Publication No. 2014-0049198 discloses a method of treating cancer metastasized to liver by using recombinant adenovirus comprising a ribozyme and a p53 gene targeting hTERT mRNA, 2014-0134818 discloses a thistle extract having anti-metastasis and anti-infiltration effects of cancer cells by increasing the expression of Ei24, p53 and p21 that are involved in cancer cell metastasis or infiltration.

한편, 암치료 유전자로 알려진 p53은 인간에서 TP53 유전자에 의해 인코딩되는 종양 억제 단백질을 코딩하는 유전자로서, 세포 내 DNA를 손상시키는 신호에 반응하여 다양한 하위 유전자의 발현을 조절함으로써 세포 주기를 조절하고, 세포사멸을 유도함으로써 세포가 악성형질로 전환되지 않도록 보호한다고 알려져 있다. On the other hand, p53, which is known as a cancer treatment gene, is a gene encoding a tumor suppressor protein encoded by the TP53 gene in humans. It regulates cell cycle by regulating the expression of various sub genes in response to a signal that damages intracellular DNA, It is known to protect cells from being converted into malignant traits by inducing apoptosis.

현재까지는, 상기 암치료 유전자는 유전자 수준과 단백질 수준에서 서로 다른 기작을 통해 암을 치료하는 효과를 나타낸다고 알려져 있으나, 단백질 수준에서의 항암효과에 대하여는 그의 작용기작이 규명되지 않고 있다. 아울러, 최근의 연구결과에 의하면, 상기 암치료 유전자로 알려진 p53이 암의 전이를 억제할 수 있다고 보고되었으나, 이와 관련된 작용기작 역시 명확하게 규명되지 않고 있다. 이들 유전자의 암전이 억제기작을 규명할 수 있다면, 이를 이용한 다양한 암전이 억제제의 개발에 활용될 수 있을 것으로 기대되고 있으나, 아직까지는 별다른 연구성과가 보고되지 않고 있는 실정이다.
It is known that the cancer treatment gene has the effect of treating cancer through different mechanisms at gene level and protein level, but its action mechanism at the protein level has not been elucidated. In addition, according to recent research results, it has been reported that p53, which is known as the cancer therapeutic gene, can inhibit metastasis of cancer, but its action mechanism has not been clarified. Although it is expected that the inhibition mechanism of these genes may be used to develop various inhibitors of cancer metastasis using these genes, there have been no reports of research results.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 암치료 유전자로 알려진 p53의 암전이 억제기작을 규명하고, 이를 응용하여 다양한 암전이 억제제를 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 상기 p53이 핵 및 세포질에서 발현되어 암세포의 침윤을 억제하는 Bax/complex-I 복합체의 형성을 촉진함을 확인하였으며, 특히 Bax의 C-말단측 4개잔기와 complex-I의 ND5 서브유닛을 통하여 상기 복합체를 형성함을 규명하여, 위양성 암전이 억제제가 아닌, 암의 전이를 억제할 수 있다고 예상되는 후보물질을 암세포에 처리한 다음, 상기 복합체의 형성여부를 확인할 경우, 상기 후보물질이 암전이 억제제로서 사용될 수 있는지를 구별할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
Under these circumstances, the inventors of the present invention have sought to develop various inhibitors of cancer metastasis by identifying the inhibitory mechanism of p53, which is known as a cancer treatment gene, and by applying it, the inventors have found that the p53 is expressed in nuclear and cytoplasm, In particular, the present inventors confirmed that the complex formed through the C-terminal 4 residues of Bax and the ND5 subunit of the complex-I to form a complex of the false positive metastasis inhibitor , It was confirmed that the candidate substance could be used as an inhibitor of cancer metastasis when cancer cells were treated with a candidate substance expected to inhibit metastasis of the cancer but not cancer, , Thereby completing the present invention.

본 발명의 하나의 목적은 암전이 억제효과를 나타낼 것으로 예상되는 후보물질을 암세포에 처리하고, 상기 암세포에서 p53에 의해 형성되는 Bax/complex-I 복합체의 형성여부를 확인하는 단계를 포함하는 암전이 억제제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.One object of the present invention is to provide a method for treating a cancer cell, which comprises treating a cancer cell with a candidate substance expected to exhibit a suppression effect of cancer metastasis and confirming whether a Bax / complex-I complex formed by p53 is formed in the cancer cell And to provide a screening method of an inhibitor.

본 발명의 다른 목적은 상기 복합체의 형성에 관여하는 p53, Bcl-w의 발현억제제 또는 Bax의 발현촉진제를 포함하는 암전이 억제용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for inhibiting cancer metastasis comprising an expression inhibitor of p53, Bcl-w or an expression promoter of Bax involved in the formation of the complex.

본 발명자들은 암치료 유전자로 알려진 p53의 암전이 억제효과를 규명하고자, 다양한 연구를 수행하던 중, 암의 전이를 촉진하는 역할을 수행하는 것으로 알려진 Bcl-2 패밀리 단백질에 주목하게 되었다. 상기 Bcl-2 패밀리 단백질은 세포사멸을 조절하는 역할을 수행할 수 있는데, 예를 들어 Bcl-2, Bcl-XL 및 Bcl-w는 세포생존성을 증가시키고, Bax 및 Bak은 세포생존성을 감소시킨다고 알려져 있다. 암세포에 있어서, 세포침윤수준은 암세포의 생존성과 직접적으로 연관되는데, 암세포의 침윤수준이 증가할 수록 생존성 및 전이성 역시 증가하기 때문이다. 이에 따라, 본 발명자들은 암세포의 생존성을 증가시키는 Bcl-2 패밀리 단백질(Bcl-2, Bcl-XL 및 Bcl-w)이 암세포의 침윤성과 관련될 것으로 가정하고, p53의 암전이 억제활성과 상기 Bcl-2 패밀리 단백질이 연관될 것으로 가정하였다. 상기 가정을 확인하기 위한 연구를 수행한 결과, p53은 세포질에서 상기 Bcl-2 패밀리 단백질의 하나인 Bcl-w와 결합하여 암세포의 침윤수준을 감소시킴을 확인하였다. 이에, 상기 Bcl-w가 암세포의 침윤수준에 미치는 효과를 심층적으로 연구한 결과, 상기 Bcl-w가 p53과 결합하지 않을 경우에는, Bax와 결합하여 Bcl-w/Bax복합체를 형성할 수 있는데, 상기 Bax는 미토콘드리아의 외막에 위치하며, 미토콘드리아의 내막에 위치한 미토콘드리아 세포호흡에 관여하는 단백질인 complex-I과 결합하여 Bax/complex-I 복합체를 형성함으로써 complex-I을 불활성화시키는 역할을 수행한다. 상기와 같이, Bcl-w/Bax복합체가 형성되면, Bax와 결합되지 않은 complex-I이 활성화되어 세포내 ROS 수준을 증가시키고, 이에 의하여 암세포의 침윤수준이 증가함을 확인하였다. The present inventors focused on the Bcl-2 family protein, which is known to play a role in promoting cancer metastasis, while carrying out various studies to investigate the inhibitory effect of p53, which is known as a cancer treatment gene, in cancer metastasis. For example, Bcl-2, Bcl-X L and Bcl-w increase cell viability and Bax and Bak inhibit cell viability. Respectively. In cancer cells, the level of cellular invasion is directly related to the survival of cancer cells, as the level of invasion of cancer cells increases as well as survival and metastasis. Accordingly, the present inventors have assumed that Bcl-2 family proteins (Bcl-2, Bcl-X L and Bcl-w) which increase the survival of cancer cells are related to invasiveness of cancer cells, It was assumed that the Bcl-2 family protein would be involved. As a result of the study to confirm the above assumption, it was confirmed that p53 binds to Bcl-2 family protein, Bcl-2, in the cytoplasm and reduces the invasion level of cancer cells. Thus, the inventors of the present invention have conducted intensive studies on the effect of Bcl-w on the invasion level of cancer cells. When the Bcl-w does not bind to p53, Bcl-w / Bax complex can be formed in association with Bax, Bax is located in the outer membrane of mitochondria and binds to complex-I, a protein involved in respiration of mitochondrial cells located in the inner membrane of mitochondria, to form a Bax / complex-I complex, thereby deactivating complex-I. As described above, when the Bcl-w / Bax complex is formed, it is confirmed that complex-I not associated with Bax is activated to increase intracellular ROS levels, thereby increasing the invasion level of cancer cells.

이처럼, p53, Bcl-w 및 Bax는 서로의 연결관계에 따라 각각의 복합체를 형성하여, 최종적으로 complex-I을 활성화시키거나 또는 불활성화시켜서 암세포의 침윤수준을 증가시키거나 감소시킬 수 있다는 점은 지금까지 전혀알려져 있지 않고, 본 발명자에 의하여 최초로 규명되었다. 더욱이, Bax/complex-I 복합체의 형성함에 있어서, Bax의 C-말단측 4개잔기와 complex-I의 ND5 서브유닛을 통하여 상기 복합체를 형성함을 최초로 규명하여 위양성의 제제를 스크리닝할 위험성을 감소시킬 수 있는 방법을 규명하였다.As described above, p53, Bcl-w, and Bax form complexes depending on the mutual connection, and finally, complex-I is activated or inactivated to increase or decrease the infiltration level of cancer cells It has not been known at all so far and was first identified by the present inventors. Furthermore, in the formation of the Bax / complex-I complex, it was first identified to form the complex through the C-terminal 4 residues of Bax and the ND5 subunit of complex-I, thereby reducing the risk of screening for a false- And how it can be done.

또한, 상기 규명된 바를 응용하면, 암전이를 억제할 수 있는 제제를 발굴하거나, 암전이를 억제할 수 있는 치료제를 개발할 수 있다. 하나의 예로서, 암의 전이를 억제할 수 있을 것으로 기대되는 후보물질을 암세포에 처리하고, 상기 암세포에서 최종적으로 암세포의 침윤수준을 결정하는 Bax/complex-I 복합체의 형성여부를 확인하면, 상기 후보물질이 암세포의 전이를 억제할 수 있는 지의 여부를 확인할 수 있다. 다른 예로서, 외부에서 투여되는 p53, Bcl-w의 발현을 억제시킬 수 있는 제제 또는 Bax의 발현을 촉진시킬 수 있는 제제는 최종적으로 암세포의 침윤수준을 결정하는 Bax/complex-I 복합체의 형성을 촉진할 수 있으므로, 암세포의 전이를 억제하는 약학 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있을 것으로 분석되었다. 상기 p53이 암세포의 전이를 억제할 수 있다는 것은 이미 공지되었으나, Bcl-w의 발현을 억제시킬 수 있는 제제 또는 Bax의 발현을 촉진시킬 수 있는 제제가 암세포의 전이를 억제할 수 있다는 것은 본 발명자에 의하여 최초로 규명되었다.
Further, application of the above-described studies can develop a therapeutic agent capable of inhibiting cancer metastasis or inhibiting cancer metastasis. As one example, when a cancer cell is treated with a candidate substance expected to inhibit cancer metastasis and whether a Bax / complex-I complex that determines the invasion level of cancer cells is finally formed in the cancer cells is confirmed, It can be confirmed whether or not the candidate substance can inhibit cancer cell metastasis. As another example, preparations capable of inhibiting the expression of exogenously administered p53, Bcl-w or agents capable of promoting expression of Bax may ultimately result in the formation of a Bax / complex-I complex that determines the invasion level of cancer cells It can be used as an active ingredient of a pharmaceutical composition for inhibiting metastasis of cancer cells. It has already been known that p53 can inhibit the metastasis of cancer cells. However, it is known that agents capable of inhibiting the expression of Bcl-w or agents capable of promoting the expression of Bax can inhibit the metastasis of cancer cells. Was first identified.

상술한 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 암전이 억제제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
In one embodiment for achieving the above-mentioned object, the present invention provides a method for screening for a cancer metastasis inhibitor.

본 발명에서 제공하는 암전이 억제제의 스크리닝 방법은 (a) 암전이 억제활성을 나타낼 것으로 예상되는 후보물질을 암세포에 처리하는 단계; 및, (b) 상기 암세포에서 Bax/complex-I 복합체의 함량을 측정하는 단계를 포함한다.
The present invention provides a method for screening for a cancer metastasis inhibitor comprising the steps of: (a) treating cancer cells with a candidate substance expected to exhibit a cancer metastasis inhibitory activity; And (b) measuring the content of the Bax / complex-I complex in the cancer cell.

상기 방법에 있어서, 사용되는 암세포는 세포내에서 p53/Bcl-w 복합체, Bcl-w/Bax 복합체 또는 Bax/complex-I 복합체를 형성하여 침윤 또는 전이될 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서 세포내에서 p53/Bcl-w 복합체, Bcl-w/Bax 복합체 또는 Bax/complex-I 복합체를 형성하여, 침윤 또는 전이될 수 있는 폐암, 유방암, 대장암, 위암, 뇌암, 췌장암, 갑상선암, 피부암, 골수암, 림프종, 자궁암, 자궁경부암 등의 암으로부터 유래된 세포가 될 수 있고, 다른 예로서 세포내에서 Bcl-w/Bax 복합체를 형성할 수 있는 폐암, 유방암, 대장암, 위암, 뇌암, 췌장암, 갑상선암, 피부암, 골수암, 림프종, 자궁암, 자궁경부암 등의 암으로부터 유래된 세포가 될 수 있으며, 또 다른 예로서 세포내에서 Bcl-w/Bax 복합체를 형성할 수 있는 폐암세포인 H460 세포 또는 H1299 세포가 될 수 있다.
In the above method, the cancer cells to be used are not particularly limited as long as they can form infiltration or metastasis by forming p53 / Bcl-w complex, Bcl-w / Bax complex or Bax / complex- Such as lung cancer, breast cancer, colorectal cancer, stomach cancer, brain cancer, pancreatic cancer, thyroid cancer, and pancreatic cancer, which form p53 / Bcl-w complex, Bcl-w / Bax complex or Bax / complex- Breast cancer, colon cancer, stomach cancer, brain cancer, colon cancer, colon cancer, colon cancer, colon cancer, ovarian cancer, ovarian cancer, ovarian cancer, skin cancer, bone marrow cancer, lymphoma, uterine cancer, cervical cancer, Cancer cells such as pancreatic cancer, thyroid cancer, skin cancer, bone marrow cancer, lymphoma, uterine cancer, cervical cancer, etc. Another example is H460 cell which is a lung cancer cell capable of forming a Bcl-w / H1299 cells.

상기 방법에 있어서, Bax/complex-I 복합체의 함량을 측정하는 방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서 면역침전법, GST 융합단백질 침전법, 웨스턴블럿 분석법 등의 다양한 면역학적 방법을 사용할 수 있다.
In this method, the method of measuring the content of the Bax / complex-I complex is not particularly limited, but various immunological methods such as immunoprecipitation, GST fusion protein precipitation and Western blot analysis can be used .

본 발명의 용어 "p53"이란, SDS-PAGE 상에서 53kDa의 크기를 나타내는 암억제 단백질로서 사람에서는 TP53 유전자에 의하여 코딩된다고 알려져 있다. 상기 p53은 다세포 생물에서 세포주기를 정지시키고, 암의 발생을 억제하며 게놈 유전자의 안정성을 향상시킨다고 알려져 있고, 단백질의 경우 대량의 프롤린잔기를 포함한다. 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 구체적인 염기서열 및 단백질 정보는 NCBI에 공지되어 있다(GenBank: NM_000546, NP_000537 등).The term "p53" of the present invention is a cancer-inhibiting protein exhibiting a size of 53 kDa on SDS-PAGE and is known to be encoded by the TP53 gene in humans. The p53 is known to stop the cell cycle in multicellular organisms, inhibit the development of cancer and improve the stability of genomic genes, and proteins contain a large amount of proline residues. The specific base sequence and protein information of the gene encoding the protein is known from NCBI (GenBank: NM_000546, NP_000537, etc.).

본 발명에 있어서, 상기 p53은 세포질에서 Bcl-w와 결합하여 Bax/complex-I 복합체의 형성을 유도함으로써, 목적하는 후보물질이 암전이 억제활성을 나타내는지의 여부를 확인하기 위한 수단으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서는, 상기 p53으로서 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 사용하였다.
In the present invention, the p53 may be used as a means for confirming whether a desired candidate substance exhibits an anti-metastatic activity by inducing the formation of a Bax / complex-I complex by binding to Bcl-w in the cytoplasm . For example, in the present invention, a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 was used as the p53.

본 발명의 용어 "Bcl-w"란, 주로 "BCL2L2(Bcl-2-like protein 2)"라고 호칭되는 Bcl-2 패밀리 단백질 중의 하나를 의미한다. 상기 Bcl-w는 세포가 사멸될 수 있는 수준의 열악한 조건에서 세포자멸 가능성을 억제시키는 효과를 나타낸다. 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 구체적인 염기서열 및 단백질 정보는 NCBI에 공지되어 있다(GenBank: NM_001199839, NP_001186768 등).The term "Bcl-w" of the present invention means one of Bcl-2 family proteins mainly called "Bcl-2-like protein 2". The Bcl-w exhibits an effect of suppressing the possibility of apoptosis in a poor condition where the cell can be killed. Specific base sequences and protein information of the gene encoding the protein are known from NCBI (GenBank: NM_001199839, NP_001186768, etc.).

본 발명에 있어서, 상기 Bcl-w는 세포질에서 p53 또는 Bax와 결합하여 Bax/complex-I 복합체의 형성을 유도하거나 억제함으로써, 목적하는 후보물질이 암전이 억제활성을 나타내는지의 여부를 확인하기 위한 수단으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서는, 상기 Bcl-w로서 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 사용하였다.
In the present invention, the Bcl-w binds to p53 or Bax in the cytoplasm to induce or inhibit the formation of Bax / complex-I complex to thereby determine whether a desired candidate substance exhibits an anti- Lt; / RTI > For example, in the present invention, a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 was used as the Bcl-w.

본 발명의 용어 "Bax(Bcl-2-associated X protein)"란, "bcl-2-like protein 4"라고도 호칭되는 Bcl-2 패밀리 단백질 중의 하나를 의미한다. 상기 Bax는 세포의 세포자멸(apoptosis)를 촉진시키는 역할을 수행하는데, 주로 미토콘드리아의 외막에 결합된 상태로 존재하며, 그의 C-말단의 4개 잔기는 미토콘드리아 내막과 외막사이의 막간공간에 돌출된 상태로 존재한다. 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 구체적인 염기서열 및 단백질 정보는 NCBI에 공지되어 있다(GenBank: NM_001291428, NP_001278357 등).The term "Bax (Bcl-2-associated X protein)" of the present invention means one of the Bcl-2 family proteins called "bcl-2-like protein 4". The Bax plays a role in promoting apoptosis of cells, mainly in the state of being bound to the outer membrane of mitochondria, and the four residues at its C-terminus protrude into the intermolecular space between the mitochondrial inner membrane and the outer membrane Lt; / RTI > The specific base sequence and protein information of the gene encoding the protein are known from NCBI (GenBank: NM_001291428, NP_001278357, etc.).

본 발명에 있어서, 상기 Bax는 세포질에서 Bcl-w 또는 complex-I과 결합하여 Bax/complex-I 복합체를 형성하지 않거나 또는 형성함으로써, 목적하는 후보물질이 암전이 억제활성을 나타내는지의 여부를 확인하기 위한 수단으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서는, 상기 Bax로서 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 사용하였다.
In the present invention, the Bax binds to Bcl-w or complex-I in the cytoplasm and does not form or form a Bax / complex-I complex, thereby confirming whether the desired candidate substance exhibits an anti- As shown in FIG. For example, in the present invention, a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 was used as the Bax.

본 발명의 용어 "complex-I"이란, "NADH:ubiquinone oxidoreductase"라고도 호칭되는 미토콘드리아의 세포호흡 연쇄에 관여하는 단백질 복합체를 의미한다. 인간의 complex-I은 두개의 도메인을 형성하는 45개의 서브유닛으로 구성되는데, 세포막 결합 도메인은 미토콘드리아 내막에 위치하고, 세포질 도메인은 미토콘드리아 간질에 돌출되어 있다고 알려져 있다. The term "complex-I" of the present invention means a protein complex involved in the cell respiration chain of mitochondria, also called "NADH: ubiquinone oxidoreductase ". Human complex-I consists of 45 subunits forming two domains, the cell membrane-binding domain is located in the mitochondrial inner membrane, and the cytoplasmic domain is known to protrude into the mitochondrial epilepsy.

본 발명에 있어서, 상기 complex-I은 이를 구성하는 세포막 결합 도메인의 ND5(NADH dehydrogenase 5) 서브유닛을 통하여 세포질에서 Bax와 결합하거나 또는 결합하지 않음으로써, 불활성화되거나 활성화되어, 암세포의 침윤수준을 감소시키거나 또는 증가시킬 수 있어, 암전이 억제활성을 나타내는 지의 여부를 확인하기 위한 직접적인 수단으로서, 사용될 수 있다. 이때, 상기 ND5 서브유닛을 코딩하는 유전자의 염기서열 및 단백질 정보는 NCBI에 공지되어 있다(GenBank: AIY61497.1 등). 예를 들어, 본 발명에서는, 상기 complex-I의 ND5로서 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 사용하였다.
In the present invention, the complex-I is inactivated or activated by binding or not binding to Bax in the cytoplasm through the ND5 (NADH dehydrogenase 5) subunit of the cell membrane binding domain constituting the complex-I, Or can be used as a direct means to ascertain whether the metastasis shows inhibitory activity. At this time, the nucleotide sequence and protein information of the gene encoding the ND5 subunit are known in NCBI (GenBank: AIY61497.1, etc.). For example, in the present invention, a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 was used as ND5 of the complex-I.

상기 방법에 의하여 측정된 복합체의 함량을 상기 후보물질을 처리하지 않은 암세포(대조군)에서 측정된 복합체의 함량과 비교하여, 상기 후보물질이 복합체 형성을 촉진하는지의 여부를 확인하게 되는데, 대체로 대조군에서 측정된 함량보다 높은 수준을 나타낼 경우에는 상기 후보물질이 Bax/complex-I 복합체의 형성을 촉진하여 암전이를 억제하는 활성을 갖는다고 판단할 수 있다. 다만, 상기 후보물질이 비특이적으로 복합체의 형성을 촉진할 수 있는데(위양성), 이경우에는 상기 후보물질이 암전이를 억제하는 활성을 나타내는지의 여부를 명확하게 판단할 수 없다는 단점이 있다.The content of the complex measured by the above method is compared with the content of the complex measured in the cancer cells not treated with the candidate substance (control group) to confirm whether or not the candidate substance promotes complex formation. In general, It can be judged that the candidate substance has an activity of inhibiting the metastasis by promoting the formation of Bax / complex-I complex. However, it is disadvantageous that the candidate substance can nonspecifically promote the formation of the complex (false positives), in which case it is not possible to clearly determine whether the candidate substance exhibits the activity of suppressing cancer metastasis.

따라서, 상기 단점을 극복하기 위하여는, 상기 복합체를 형성하는 Bax 또는 complex-I의 변이체를 발현시켜서 정상상태에서도 상기 복합체를 형성하지 못하는 변이된 암세포에 상기 후보물질을 처리하고, 이로부터 상기 복합체의 함량을 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 즉, 정상적으로 상기 복합체를 형성하는 세포에서 복합체의 함량을 증가시키는 것으로 확인된 후보물질이 상기 변이된 암세포에서도 복합체를 형성하게 한다면, 상기 후보물질은 비특이적으로 상기 복합체의 형성을 촉진시킨다고 판단할 수 있다. 이때, 사용될 수 있는 Bax 또는 complex-I의 변이체는 상기 복합체의 형성을 억제하는 한 특별히 제한되지 않으나, 일 예로서, 상기 복합체 형성에 중요한 역할을 수행하는 C-말단의 4개 잔기가 결실 또는 치환된 변이체 Bax, ND5 서브유닛이 결실 또는 치환된 변이체 complex-I 등이 될 수 있다.
Therefore, in order to overcome the above disadvantages, it is desirable to treat the candidate substance in mutated cancer cells that do not form the complex even in a normal state by expressing mutants of Bax or complex-I forming the complex, And the step of measuring the content may be further included. That is, if the candidate substance normally found to increase the content of the complex in the cells forming the complex forms a complex in the mutated cancer cells, it can be judged that the candidate substance nonspecifically promotes the formation of the complex . The variant of Bax or complex-I that can be used herein is not particularly limited as long as it inhibits the formation of the complex. For example, four residues at the C-terminus, which plays an important role in the complex formation, The mutant Bax, the mutant complex-I in which the ND5 subunit is deleted or substituted, and the like.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 본 발명자들은 세포질에 축적되는 변이체 p53을 발현시킬 경우, 암세포의 침윤수준이 감소함을 확인함에 따라, p53의 암세포 침윤억제 활성이 세포질에서 수행됨을 확인하고(도 1a), 세포질에서 p53의 암세포 침윤억제 활성을 연구하였다. 그 결과, p53에 의한 침윤억제 활성은 세포내 ROS를 감소시킴에 의하여 유발되고(도 1b), 세포내 ROS 수준, PI3K의 활성 및 인산화된 Akt와 MMP-2의 수준을 감소시킴에 의하여 유발되며(도 1c), p53과 Bcl-w의 결합 및 Bcl-w와 Bax의 결합이 관여함(도 1d 내지 1f)을 확인하였다. According to one embodiment of the present invention, the present inventors confirmed that when the mutant p53 accumulated in the cytoplasm is expressed, the invasion level of the cancer cell is decreased, and thus the inhibitory activity of the p53 against the cancer cell infiltration is carried out in the cytoplasm 1a), and the inhibitory activity of p53 against cancer cell infiltration in cytoplasm was studied. As a result, the inhibition of p53 infiltration is induced by decreasing intracellular ROS (Fig. 1b) and is induced by decreasing intracellular ROS level, PI3K activity, and phosphorylated Akt and MMP-2 levels (Fig. 1C), binding of p53 to Bcl-w and binding of Bcl-w to Bax (Fig. 1d to Fig. 1f).

또한, ROS 생성에 관여하고, Bax에 의하여 영향을 받는 미토콘드리아 호흡연쇄에 작용하는 4개의 다중체 단백질 복합체를 대상으로, 상기 세포침윤과 연관된 것을 연구한 결과, Bax와 연관된 미토콘드리아 호흡연쇄 연관 단백질은 complex-I이고, 상기 complex-I은 ROS의 생성에 직접적으로 연관되며(도 2a), Bax의 발현억제에 따라 complex-I의 활성이 가장 큰 수준으로 증가하고(도 2b 및 2c), ΔΨm과 ATP 수준이 모두 증가함(도 2d)을 확인하였다.In addition, four multimeric protein complexes involved in ROS production and affecting the mitochondrial respiratory chain affected by Bax were studied for their involvement in cell infiltration. As a result, Bax-associated mitochondrial respiration chain- -I, and the complex-I is directly related to the production of ROS (Fig. 2a), increased to the largest active-level of complex I according to the inhibition of the Bax expression (Fig. 2b and 2c), and ΔΨ m ATP levels were all increased (Fig. 2d).

아울러, Bax 및 complex-I의 결합부위를 분석한 결과, Bax의 C-말단의 4개 잔기(도 3a) 및 complex-I의 ND5 서브유닛(도 3b 및 3c)을 통하여, 상호결합함(도 3d 및 3e)을 확인하였다.Analysis of the binding sites of Bax and complex-I showed mutual binding (Fig. 3a) through the four C-terminal residues of Bax (Fig. 3a) and ND5 subunits of complex-I (Fig. 3b and 3c) 3d and 3e).

다음으로, 암세포의 침윤에 미치는 Bcl-w와 complex-I의 효과를 분석한 결과, Bcl-w는 암세포의 침윤과정을 complex-I을 통하여 조절하고(도 4a), Bcl-w의 과발현에 따라 complex-I의 활성이 증가하며(도 4b), ΔΨm과 ATP 수준이 모두 증가하고(도 4c), 암세포내에서 Bax/complex-I(ND5) 복합체의 수준이 증가하며(도 4d), Bcl-w가 p53과 결합하면, Bax/complex-I(ND5) 복합체의 형성을 야기함(도 4e 및 4f)을 확인하였다. Next, the effects of Bcl-w and complex-I on the invasion of cancer cells were analyzed. As a result, Bcl-w regulated the invasion process of cancer cells through complex-I (FIG. 4A) complex (Figure 4b) increases both ΔΨ m and ATP levels (Figure 4c) and increases the level of the Bax / complex-I (ND5) complex in cancer cells (Figure 4d) When -w binds to p53, it leads to the formation of the Bax / complex-I (ND5) complex (Fig. 4E and 4F).

또 다음으로, 상기 암세포의 침윤억제에 관여하는 Bcl-w 및 Bax의 효과를 다른 단백질로 대체할 수 있는지 연구한 결과, Bcl-XL의 과발현은 complex-I의 활성, ΔΨm의 수준 및 ATP 수준을 모두 증가시키고(도 6a), p53이 발현된 조건에서는 Bcl-XL이 Bax와 복합체를 형성할 수 있으며(도 6b), 전체적으로 ROS 수준 및 침윤수준이 증가하고(도 6c), Bak의 발현억제는 complex-I의 활성, ΔΨm의 수준 및 ATP 수준을 모두 증가시키고(도 6d), Bak는 C-말단 4개 잔기를 통하여 complex-I(ND5)과 결합체를 형성할 수 있으며(도 6e), Bak의 발현억제는 암세포의 침윤수준을 증가시키고(도 6f), p53의 발현여부에 따라 Bcl-w/Bak 복합체 또는 Bak/complex-I 복합체 형성이 야기됨(도 6g)을 확인하였다.The overexpression of Bcl-X L overexpresses the activity of complex-I, the level of ΔΨ m , and the level of ATP (Fig. 6A), Bcl-X L can form a complex with Bax (Fig. 6B) under the conditions in which p53 is expressed (Fig. 6C), and the ROS level and invasion level as a whole Expression inhibition increases both the activity of complex-I, the level of ΔΨ m and the level of ATP (Fig. 6d), Bak can form a complex with complex-I (ND5) through the C-terminal four residues 6e), inhibition of Bak expression increased the level of invasion of cancer cells (Fig. 6f) and caused the formation of Bcl-w / Bak complex or Bak / complex-I complex depending on the expression of p53 (Fig. 6g) .

또 다음으로, 핵에서 발현된 p53이 암세포의 침윤에 미치는 효과를 분석한 결과, 핵에서 p53의 과발현은 세포내 Bax의 발현수준을 증가시키고(도 7a), 암세포의 침윤수준을 감소시켰으며(도 7b), Bcl-w의 발현이 억제될 경우에도 ROS 수준 및 침윤수준을 감소시키고(도 7c), Bax/complex-I 복합체 형성을 촉진하며(도 7d), complex-I의 활성, ΔΨm의 수준 및 ATP 수준을 모두 감소시킴(도 7e)을 확인하였다.Next, analysis of the effect of nuclear-expressed p53 on cancer cell infiltration revealed that overexpression of p53 in the nucleus increased the expression level of intracellular Bax (Fig. 7a) and decreased the invasion level of cancer cells FIG. 7b), even if the expression of Bcl-w be suppressed reduce ROS levels and saturation levels and (Fig. 7c), Bax / complex-I promotes the complex formation is possible (Fig. 7d), activity of the complex-I, ΔΨ m And ATP levels (Fig. 7E).

끝으로, 이식종양 동물모델을 제작하고, 이를 이용한 p53의 암세포 침윤억제효과를 검증한 결과, 상술한 암세포의 침윤억제에 관여하는 성분이 과발현된다 하여도 종양의 크기는 변하지 않고(도 8a), Bcl-w가 과발현될 경우, 종양세포의 혈관침투성이 증가하며(도 8b), p53과 Bcl-w이 동시에 과발현되면 종양세포의 혈관침투성이 감소함(도 8c)을 확인하였다.
Finally, when a transplant tumor animal model was prepared and the inhibitory effect of p53 against cancer cell infiltration was examined, even if the components involved in the inhibition of infiltration of cancer cells were overexpressed, the tumor size did not change (FIG. 8A) When the Bcl-w is overexpressed, the vascular permeability of the tumor cells increases (FIG. 8B), and when the p53 and Bcl-w are simultaneously overexpressed, the vascular permeability of the tumor cells decreases (FIG. 8C).

따라서, 상기 결과를 종합하면, 암세포의 세포질에 축적된 p53은 미토콘드리아의 외막에서 Bcl-w와 결합하여 복합체를 형성하고, 핵에서 발현된 p53은 Bax의 발현을 촉진시키며, 상기 발현된 Bax는 미토콘드리아의 내막에 결합된 complex-I과 결합하여, complex-I을 불활성화 시킴으로써 암세포의 침윤수준을 감소시킴(도 9a)을 알 수 있었다.
Thus, the above results indicate that p53 accumulated in the cytoplasm of cancer cells binds to Bcl-w in the outer membrane of mitochondria to form a complex, p53 expressed in the nucleus promotes expression of Bax, and the expressed Bax expresses mitochondria I inactivated the complex-I by binding to the complex-I bound to the inner membrane of the endothelial cells (FIG. 9A).

상술한 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 Bax/complex-I 복합체의 형성에 관여하는 Bax 유전자, 상기 Bax 유전자의 발현을 촉진시킬 수 있는 제제 또는 Bcl-w의 발현을 억제시킬 수 있는 제제를 각각 개별적으로 또는 조합하여 포함하는 암전이 억제용 약학 조성물을 제공한다.
As another embodiment for achieving the above object, the present invention provides a method for inhibiting the expression of the Bax gene involved in the formation of the Bax / complex-I complex, the agent capable of promoting the expression of the Bax gene or the expression of Bcl-w Or a pharmaceutically acceptable salt thereof, each separately or in combination.

상술한 바와 같이, Bax/complex-I 복합체를 구성함에 있어서, 상기 Bax는 미토콘드리아의 내막에 결합된 comple-I과 Bax의 C-말단의 4개 잔기를 통하여 결합함으로써, 상기 complex-I을 불활성화시키지만, 세포질내에 Bcl-w가 존재할 경우에는, 결합친화도의 차이로 인하여, 상기 Bax가 complex-I 대신에 Bcl-w과 결합함으로써, 결과적으로는 complex-I을 활성화시킬 수 있고, 이로 인하여 암세포의 침윤수준이 증가하게 된다. 따라서, 상기 암세포에 Bax를 코딩하는 유전자를 도입하거나, 상기 Bax 유전자의 발현을 촉진시킬 수 있는 제제를 도입하거나 또는 상기 Bcl-w의 발현을 억제할 수 있는 제제를 도입한다면, Bax/complex-I 복합체의 형성을 촉진하여, 결과적으로는 암세포의 침윤수준을 감소시킴으로써, 암전이를 억제할 수 있으므로, 상기 Bax 유전자, 상기 Bax의 발현을 촉진시킬 수 있는 제제 또는 Bcl-w의 발현을 억제시킬 수 있는 제제는 본 발명에서 제공하는 암전이 억제용 약학조성물의 유효성분으로 사용될 수 있다.
As described above, in constructing the Bax / complex-I complex, the Bax binds through the four C-terminal residues of comple-I bound to the inner membrane of mitochondria, thereby inactivating the complex-I However, when Bcl-w is present in the cytoplasm, due to the difference in binding affinity, Bax binds to Bcl-w instead of complex-I, resulting in activation of complex-I, The level of infiltration of the skin is increased. Therefore, if a gene encoding Bax is introduced into the cancer cell, or a preparation capable of promoting expression of the Bax gene is introduced or a preparation capable of inhibiting the expression of Bax-w is introduced, Bax / complex-I It is possible to suppress the expression of Bax gene, the agent capable of promoting the expression of Bax, or the expression of Bcl-w, because it can inhibit cancer metastasis by reducing the invasion level of cancer cells as a result The present agent can be used as an active ingredient of the pharmaceutical composition for suppressing cancer metastasis provided by the present invention.

먼저, 상기 약학조성물의 유효성분으로 사용될 수 있는, Bax 유전자는 서열번호 3의 아미노산 서열을 코딩할 수 있는 폴리뉴클레오티드가 될 수 있는데, 그 예로서 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드가 될 수 있다.
First, the Bax gene which can be used as an active ingredient of the pharmaceutical composition may be a polynucleotide capable of encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, for example, a polynucleotide of SEQ ID NO: 5.

다음으로, 상기 약학조성물의 유효성분으로 사용될 수 있는, Bcl-w의 발현을 억제할 수 있는 제제는 Bcl-w/Bax 복합체의 형성을 억제시켜서, Bax/complex-I 복합체의 함량을 향상시킬 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 그 예로서, Bcl-w 유전자의 발현을 억제시킬 수 있는 siRNA, shRNA 등이 될 수 있다.
Next, a preparation capable of inhibiting the expression of Bcl-w, which can be used as an active ingredient of the above pharmaceutical composition, inhibits the formation of the Bcl-w / Bax complex, thereby improving the content of the Bax / complex-I complex For example, siRNA, shRNA, etc., which can inhibit the expression of the Bcl-w gene.

본 발명의 암전이 억제용 약학 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명에서, 상기 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물과 이의 분획물들에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
The pharmaceutical composition for suppressing cancer metastasis of the present invention may further comprise an appropriate carrier, excipient or diluent conventionally used in the production of a pharmaceutical composition. Specifically, the pharmaceutical composition may be formulated in the form of oral, granule, tablet, capsule, suspension, emulsion, syrup, aerosol or the like oral preparation, external preparation, suppository and sterilized injection solution according to a conventional method Can be used. In the present invention, the carrier, excipient and diluent which may be contained in the pharmaceutical composition include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate , Calcium silicate, cellulose, methylcellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil. In the case of formulation, a diluent or excipient such as a filler, an extender, a binder, a wetting agent, a disintegrant, or a surfactant is usually used. Solid formulations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules and the like, which may contain at least one excipient such as starch, calcium carbonate, Sucrose, lactose, gelatin and the like. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc are also used. Liquid preparations for oral use may include various excipients such as wetting agents, sweetening agents, fragrances, preservatives, etc. in addition to water and liquid paraffin, which are simple diluents commonly used in suspension, liquid solutions, emulsions and syrups have. Formulations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories. Examples of the suspending agent include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like. Examples of the suppository base include witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin, glycerogelatin and the like.

본 발명의 약학적 조성물에 포함된 각 유효성분의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 최종 조성물 총중량을 기준으로 0.0001 내지 50 중량%, 다른 예로서 0.01 내지 20 중량%의 함량으로 포함될 수 있다.
The content of each active ingredient contained in the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited, but may be in the range of 0.0001 to 50% by weight, and as another example, 0.01 to 20% by weight based on the total weight of the final composition.

상기 본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
The pharmaceutical composition of the present invention can be administered in a pharmaceutically effective amount. The term "pharmaceutically effective amount " of the present invention means a therapeutic or prophylactic treatment of a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment or prevention. And the effective dose level refers to the amount of the effective amount of the composition of the present invention, and the effective dose level is determined depending on the severity of the disease, the activity of the drug, the age, weight, health, sex, sensitivity of the patient to the drug, The duration of the treatment, the factors including the drugs used in combination or concurrently with the composition of the present invention used, and other factors well known in the medical field. The pharmaceutical composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with another therapeutic agent, and may be administered sequentially or simultaneously with a conventional therapeutic agent. And can be administered singly or multiply. It is important to take into account all of the above factors and administer an amount that will achieve the maximum effect in the least amount without side effects.

본 발명의 약학조성물의 투여량은 예를 들어, 본 발명의 약학적 조성물을 사람을 포함하는 포유동물에 하루 동안 1 내지 20 ㎎/㎏, 다른 예로서 1 내지 10 ㎎/㎏으로 투여할 수 있고, 본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다.
The dosage of the pharmaceutical composition of the present invention can be administered, for example, by administering the pharmaceutical composition of the present invention to a mammal, including a human, for 1 to 20 mg / kg, for example 1 to 10 mg / kg per day , The frequency of administration of the composition of the present invention is not particularly limited, but it may be administered once a day or divided into several doses.

상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 약제학적으로 유효한 양으로 암의 전이가 발생할 가능성이 있거나 또는 발생된 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 전이를 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
In yet another embodiment for accomplishing the above object, the present invention provides a method for preventing the metastasis of cancer comprising the step of administering the pharmaceutical composition to a subject in a pharmaceutically effective amount, Or < / RTI >

상술한 바와 같이, 본 발명에서 제공하는 약학 조성물은 암세포의 침윤수준을 감소시킬 수 있는 Bax/complex-I 복합체의 형성을 촉진시킬 수 있으므로, 상기 약학 조성물은 암의 전이를 예방 또는 치료하는데 사용될 수 있다.
As described above, since the pharmaceutical composition provided in the present invention can promote the formation of a Bax / complex-I complex capable of reducing the level of invasion of cancer cells, the pharmaceutical composition can be used for preventing or treating cancer metastasis have.

본 발명에서 용어 "개체"란 암의 전이가 발생될 가능성이 있거나 또는 발생된 쥐, 가축, 인간 등을 포함하는 포유동물을 제한 없이 포함한다.The term "individual" as used herein includes, without limitation, mammals, including, but not limited to, rats, cattle,

본 발명의 암의 전이를 예방 또는 치료하는 방법에 있어서, 상기 약학적 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여도 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 목적하는 바에 따라 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있다. 다만, 경구 투여시에는 위산에 의하여 상기 약학 조성물에 포함된 유효성분이 변성될 수 있기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
In the method of preventing or treating cancer metastasis of the present invention, the administration route of the pharmaceutical composition may be administered through any conventional route as long as it can reach the target tissue. The pharmaceutical composition of the present invention may be administered intraperitoneally, intravenously, intramuscularly, subcutaneously, intradermally, orally, intranasally, intracorporally, rectally, as desired, though not particularly limited thereto . However, since the active ingredient contained in the pharmaceutical composition can be denatured by gastric acid when orally administered, the oral composition should be formulated so as to coat the active agent or protect it from decomposition at the top. In addition, the composition may be administered by any device capable of transferring the active agent to the target cell.

본 발명에서 제공하는 암 전이 억제제의 스크리닝 방법을 이용하면, 암세포에서 Bax/complex-I 복합체의 형성을 촉진시켜서 암세포의 침윤을 억제함으로써, 암의 전이를 사전에 방지할 수 있는 제제를 발굴할 수 있으므로, 보다 효과적인 암치료제의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.
By using the screening method of the cancer metastasis inhibitor provided in the present invention, it is possible to find a preparation that can prevent the cancer metastasis by inhibiting invasion of cancer cells by promoting the formation of Bax / complex-I complex in cancer cells Therefore, it can be widely used for development of more effective cancer treatment agent.

도 1a는 Bcl-w가 발현되거나 또는 발현되지 않는 폐암세포(H1299)에서, 야생형 또는 변이체 p53(p53K305N 또는 p53K305N / R175H)의 발현에 따른 폐암세포의 침윤수준을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진 및 그래프이다.
도 1b는 Bcl-w가 발현되거나 또는 발현되지 않는 폐암세포(H1299)에서, 야생형 또는 변이체 p53(p53K305N 또는 p53K305N / R175H)의 발현에 따른 세포내 ROS 수준을 DCF 및 MitoSOX Red 프로브를 이용하여 분석한 결과를 나타내는 그래프로서, 상단은 DCF를 사용하여 유세포 분석을 수행한 결과를 나타내는 그래프이고, 하단의 좌측은 DCF를 사용하여 분석한 ROS의 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이며, 하단의 우측은 MitoSOX Red 프로브를 사용하여 분석한 ROS의 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 1c는 Bcl-w가 발현되거나 또는 발현되지 않는 폐암세포(H1299)에서, 야생형 또는 변이체 p53(p53K305N 또는 p53K305N / R175H)의 발현에 따른 세포내 PI3K의 활성 및 인산화된 Akt과 MMP-2의 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프 및 사진이다.
도 1d는 야생형 또는 변이체 p53와 GST, GST-Bcl-w 또는 GST-Bax 단백질을 반응시킨 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진으로서, 상단은 야생형 또는 변이체 p53와 GST 또는 GST-Bcl-w를 반응시킨 결과를 나타내고, 중단은 p53의 발현수준을 비교한 결과를 나타내며, 하단은 야생형 또는 변이체 p53와 GST 또는 GST-Bax를 반응시킨 결과를 나타낸다.
도 1e는 Bcl-w가 발현되지 않는 폐암세포(H1299)에서, 야생형 또는 변이체 p53(p53K305N 또는 p53K305N / R175H)의 발현에 따른 p53, Bcl-w 및 Bax 간의 결합활성을 분석한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다.
도 1f는 야생형 또는 변이체 p53와 Bcl-w 및 Bax를 동시에 반응시킨 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다.
도 2a는 Bax의 발현을 억제하거나 또는 억제하지 않는 조건에서, 암세포의 침윤과 관련된 미토콘드리아 호흡연쇄 연관 단백질을 검출한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2b는 Bax의 발현이 억제된 조건에서 complex-I, II, III 및 IV의 활성변화를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2c는 H1299 세포에서 Bax와 결합할 수 있는 미토콘드리아 호흡연쇄 연관 단백질을 검출한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다.
도 2d는 Bax의 발현억제에 따른 ΔΨm과 ATP 수준의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 3a는 야생형 또는 변이체 Bax가 도입된 LoVo 세포에서 상기 Bax의 종류에 따른 complex-I과의 결합활성(상단), ROS 수준(하단 좌측) 및 침윤수준(하단 우측)을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진 및 그래프이다.
도 3b는 암세포에서 면역침전분석을 통하여 Bax와 결합할 수 있는 complex-I을 구성하는 서브유닛을 선별한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다.
도 3c는 야생형 또는 변이체 Bax가 도입된 H1299 세포에서 Bax의 C-말단의 4개 잔기가 complex-I의 ND5 서브유닛과 결합할 수 있는지를 확인한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다.
도 3d는 ND5 또는 ND5G13289A이 발현되는 H1299 세포의 파쇄물을 대상으로 Bax가 외인성 ND5(Myc-WT) 또는 ND5G13289A(Myc-G13289A)와 결합체를 형성하는지의 여부를 확인한 결과를 나타내는 면역침전분석 사진 및 웨스턴블럿 분석사진이다.
도 3e은 야생형 또는 변이체 ND5의 발현에 따른 암세포에서 ROS 수준과 침윤수준의 변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4a는 Bcl-w가 발현되지 않거나 또는 발현되는 폐암세포(H1299)에서 다양한 암세포의 침윤과 관련된 미토콘드리아 호흡연쇄 연관 단백질의 활성억제에 따른, ROS 수준과 침윤수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4b는 야생형 또는 변이체 Bcl-w가 과발현된 조건에서 complex-I, II, III 및 IV의 활성변화를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4c는 야생형 또는 변이체 Bcl-w가 과발현된 조건에서 ΔΨm과 ATP 수준의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 4d는 야생형 또는 변이체 Bcl-w가 과발현된 조건에서 Bax와 complex-I(ND5)의 결합여부를 확인한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다.
도 4e는 Bcl-w와 결합할 수 있거나 또는 결합할 수 없는 변이체 p53(p53K305N 또는 p53K305N / R175H)의 발현에 따른 complex-I 활성(좌측), ΔΨm 수준(중간) 및 ATP 수준(우측)을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4f는 Bcl-w와 결합할 수 있거나 또는 결합할 수 없는 변이체 p53(p53K305N 또는 p53K305N / R175H)의 발현에 따른 Bax와 complex-I(ND5)의 결합여부를 확인한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다.
도 5a는 세포질에 p53이 축적되는 IMR-32 신경아세포종 세포에서 야생형 p53의 발현억제에 따른, 세포내 ROS 수준(좌측) 및 침윤수준(우측)의 변화를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5b는 세포질에 p53이 축적되는 IMR-32 신경아세포종 세포에서 야생형 p53의 발현억제에 따른, 세포질의 Bcl-w/Bax 복합체, Bax/complex-I(ND5) 복합체 수준의 변화를 분석한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다.
도 5c는 세포질에 p53이 축적되는 IMR-32 신경아세포종 세포에서 야생형 p53의 발현억제에 따른, complex-I 활성(좌측), ΔΨm 수준(중간) 및 ATP 수준(우측)을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5d는 세포질에 p53이 축적되는 IMR-32 신경아세포종 세포에서 야생형 p53와 Bcl-w(좌측) 또는 p53와 Bax(우측)의 동시 발현억제에 따른 침윤수준의 변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6a는 Bcl-XL의 발현에 따른, complex-I 활성(좌측), ΔΨm 수준(중간) 및 ATP 수준(우측)을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6b는 Bcl-XL의 발현에 따른, 야생형 또는 변이된 p53과 Bcl-XL를 포함하는 복합체의 수준을 분석한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다.
도 6c는 야생형 또는 변이체 p53과 Bcl-XL의 발현에 따른, 세포내 ROS 수준(좌측) 및 침윤수준(우측)의 변화를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6d는 Bak의 발현억제에 따른, complex-I 활성(좌측), ΔΨm 수준(중간) 및 ATP 수준(우측)을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6e는 Bak의 C-말단 4개 잔기의 존재여부에 따른, Bak와 complex-I(ND5) 결합체의 함량변화를 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다.
도 6f는 변이체 p53(p53K305N)의 발현과 Bak의 발현억제에 따른, 암세포의 침윤수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6g는 변이체 p53(p53K305N 또는 p53K305N / R175H)의 발현에 따른, Bcl-w/Bak 복합체 또는 Bak/complex-I 복합체의 수준을 분석한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다.
도 7a는 야생형 또는 변이체 p53(p53R175H 또는 p53K305N)의 발현에 따른, 세포침윤에 관여하는 단백질의 발현수준 변화를 분석한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다.
도 7b는 야생형 또는 변이체 p53(p53R175H)의 발현에 따른, 암세포의 침윤수준의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 7c는 야생형 p53이 과발현되는 조건에서, Bax 또는 Blc-w의 발현억제에 따른, 세포내 ROS 수준 및 침윤수준의 변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7d는 야생형 또는 변이체 p53(p53R175H)의 발현에 따른, Bax/complex-I 복합체 수준의 변화를 분석한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다.
도 7e는 야생형 또는 변이체 p53(p53R175H)의 발현에 따른, complex-I 활성(좌측), ΔΨm 수준(중간) 및 ATP 수준(우측)을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8a는 야생형 또는 변이체 p53 또는 Bcl-w가 도입된 이식종양 동물모델에서 시간의 경과에 따른 종양의 부피변화를 나타내는 그래프이다.
도 8b는 야생형 또는 변이체 Bcl-w(G94A)의 과발현에 따른, 종양세포의 혈관침투성을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8c는 야생형 Bcl-w와, 야생형 또는 변이체 p53(R175H, K305N 또는 K305N/R175H)의 과발현에 따른, 종양세포의 혈관침투성을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9a는 암세포의 침윤에 미치는 세포질 p53의 작용기작을 나타내는 개략도이다.
도 9b는 미토콘드리아 막에 위치한 Bax와 complex-I의 위치를 나타내는 개략도이다.FIG. 1A is a graph showing the results of comparison of invasion levels of lung cancer cells with wild-type or mutant p53 (p53 K305N or p53 K305N / R175H ) expression in Bcl-w expressing or non-expressing lung cancer cells (H1299) Analysis photographs and graphs.
Figure 1B shows the levels of intracellular ROS following the expression of wild-type or mutant p53 (p53 K305N or p53 K305N / R175H ) in lung cancer cells (H1299) in which Bcl-w was expressed or not expressed using DCF and MitoSOX Red probes The upper graph is a graph showing the results of performing flow cytometry using DCF and the lower graph on the left is a graph showing the results of comparing the levels of ROS analyzed using DCF. Is a graph showing the results of comparing the levels of ROS analyzed using the MitoSOX Red probe.
1c shows the activity of intracellular PI3K and the activity of phosphorylated Akt and MMP-2 ( Fig . 1B ) on the expression of wild-type or mutant p53 (p53 K305N or p53 K305N / R175H ) in lung cancer cells (H1299) expressing Bcl- Of the present invention.
FIG. 1D is a Western blot image showing the result of reacting wild-type or mutant p53 with GST, GST-Bcl-w or GST-Bax protein, and the upper part shows the result of reacting wild type or mutant p53 with GST or GST-Bcl- , And the interruption shows the result of comparing the expression level of p53 and the lower end shows the result of reacting wild-type or mutant p53 with GST or GST-Bax.
FIG. 1E shows the results of analysis of binding activity between p53, Bcl-w and Bax according to the expression of wild-type or mutant p53 (p53 K305N or p53 K305N / R175H ) in lung cancer cells (H1299) Western blot analysis.
FIG. 1F is a Western blot analysis image showing the results of simultaneous reaction of wild-type or mutant p53 with Bcl-w and Bax.
FIG. 2A is a graph showing the results of detection of mitochondrial respiratory chain-associated proteins associated with the invasion of cancer cells under conditions that inhibit or inhibit the expression of Bax. FIG.
FIG. 2B is a graph showing the results of measuring changes in the activity of complex-I, II, III, and IV under the condition in which expression of Bax was inhibited.
FIG. 2c is a Western blot analysis image showing the result of detection of mitochondrial respiratory chain-linked protein capable of binding to Bax in H1299 cells.
FIG. 2d is a graph showing changes in ΔΨ m and ATP levels with inhibition of Bax expression.
3A shows the results of comparing the binding activity (upper), ROS level (lower left) and invasion level (lower right) of complex-I with the wild-type or mutant Bax-introduced LoVo cells, It is a blot analysis photograph and graph.
FIG. 3B is a Western blot analysis image showing a result of selecting subunits constituting a complex-I capable of binding to Bax through immunoprecipitation analysis in cancer cells.
FIG. 3c is a Western blot analysis image showing the result of confirming whether four C-terminal residues of Bax can bind to the ND5 subunit of complex-I in H1299 cells into which wild type or mutant Bax was introduced.
FIG. 3D is a photograph showing immunoprecipitation analysis showing the result of confirming whether Bax forms a complex with ND5 (Myc-WT) or ND5 G13289A (Myc-G13289A) in the H1299 cell lysate expressing ND5 or ND5 G13289A And Western blot analysis.
FIG. 3E is a graph showing the results of comparing the changes of ROS level and invasion level in cancer cells according to the expression of wild type or mutant ND5. FIG.
FIG. 4A is a graph showing the results of comparing the levels of ROS and invasion according to inhibition of the activity of mitochondrial respiration chain-associated proteins associated with invasion of various cancer cells in lung cancer cells (H1299) in which Bcl-w is not expressed or expressed.
FIG. 4B is a graph showing the results of measuring the activity changes of complex-I, II, III and IV under the condition that wild-type or mutant Bcl-w is overexpressed.
FIG. 4C is a graph showing the changes in ΔΨ m and ATP levels under the conditions in which wild-type or mutant Bcl-w is overexpressed.
FIG. 4D is a Western blot analysis image showing the result of confirming the binding of Bax to complex-I (ND5) under the condition that wild type or mutant Bcl-w is overexpressed.
Figure 4e shows the complex-I activity (left), the ΔΨ m level (intermediate) and the ATP level (right side), according to the expression of mutant p53 that can bind or not bind Bcl-w (p53 K305N or p53 K305N / R175H ) ). FIG.
Figure 4f is a Western blot analysis showing the binding of complex-I (ND5) with Bax according to the expression of mutant p53 (p53 K305N or p53 K305N / R175H ) that can bind or not bind to Bcl-w It is a photograph.
FIG. 5A is a graph showing the results of analysis of changes in intracellular ROS levels (left) and invasion levels (right) upon inhibition of wild-type p53 expression in IMR-32 neuroblastoma cells in which cytoplasmic p53 accumulates. FIG.
FIG. 5B shows the results of analysis of changes in cytoplasmic Bcl-w / Bax complex and Bax / complex-I (ND5) complex levels in the IMR-32 neuroblastoma cells, This is a western blot analysis photograph.
FIG. 5c shows the results of analysis of complex-I activity (left), ΔΨ m level (intermediate) and ATP level (right) according to the inhibition of wild-type p53 expression in IMR-32 neuroblastoma cells in which cytoplasmic p53 accumulates Graph.
FIG. 5D is a graph showing the results of comparing changes in invasion level with inhibition of co-expression of wild-type p53 and Bcl-w (left) or p53 and Bax (right) in IMR-32 neuroblastoma cells in which cytoplasmic p53 accumulates .
FIG. 6A is a graph showing the results of analysis of complex-I activity (left), ΔΨ m level (middle), and ATP level (right) according to the expression of Bcl-X L. FIG.
Figure 6b is a photograph of Western blot analysis of the analysis of the level of a complex comprising a wild-type or mutated p53 and Bcl-X L in accordance with the expression of Bcl-X L.
FIG. 6C is a graph showing the results of analysis of changes in intracellular ROS levels (left) and invasion levels (right) according to expression of wild-type or mutant p53 and Bcl-X L. FIG.
FIG. 6D is a graph showing the results of analysis of complex-I activity (left), ΔΨ m level (middle) and ATP level (right) according to inhibition of Bak expression.
FIG. 6E is a Western blot analysis image showing the result of comparing the contents of Bak and complex-I (ND5) complexes according to the presence of four C-terminal residues of Bak.
FIG. 6F is a graph showing the results of comparing the invasion level of cancer cells with the expression of mutant p53 (p53 K305N ) and the inhibition of Bak expression.
FIG. 6g is a western blot analysis image showing the results of analysis of the levels of Bcl-w / Bak complex or Bak / complex-I complex according to expression of mutant p53 (p53 K305N or p53 K305N / R175H ).
FIG. 7A is a Western blot analysis image showing a result of analyzing the expression level of a protein involved in cell infiltration according to the expression of wild type or mutant p53 (p53 R175H or p53 K305N ).
FIG. 7B is a graph showing the change in the level of invasion of cancer cells with expression of wild-type or mutant p53 (p53 R175H ).
FIG. 7C is a graph showing the results of comparing changes in intracellular ROS levels and invasion levels with inhibition of Bax or Blc-w expression under the condition that wild-type p53 is overexpressed.
FIG. 7d is a western blot analysis showing the results of analysis of changes in the Bax / complex-I complex level due to the expression of wild-type or mutant p53 (p53 R175H ).
FIG. 7E is a graph showing the results of analysis of complex-I activity (left), ΔΨ m level (middle) and ATP level (right) according to expression of wild type or mutant p53 (p53 R175H ).
8A is a graph showing tumor volume change over time in an animal model of transplantation tumor in which wild-type or mutant p53 or Bcl-w was introduced.
FIG. 8B is a graph showing the results of comparing vascular permeability of tumor cells with overexpression of wild-type or mutant Bcl-w (G94A). FIG.
8C is a graph showing the results of comparison of vascular permeability of tumor cells with overexpression of wild-type Bcl-w and wild-type or mutant p53 (R175H, K305N or K305N / R175H).
FIG. 9A is a schematic diagram showing the action mechanism of cytoplasmic p53 on invasion of cancer cells. FIG.
FIG. 9B is a schematic diagram showing the position of complex-I with Bax located in the mitochondrial membrane. FIG.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, these examples are for illustrative purposes only, and the scope of the present invention is not limited to these examples.

실시예Example 1: 암세포의 침윤에 미치는  1: Effect on invasion of cancer cells BclBcl -w와 with -w p53p53 의 효과Effect of

실시예Example 1-1: 암세포 침윤억제 유발부위의 확인 1-1: Identification of cancer cell infiltration-inducing site

pcDNA3 벡터 또는 Bcl-w를 코딩하는 pcDNA3 벡터를 p53이 발현되지 않는 폐암세포(H1299 세포)에 1차로 도입하고 배양한 다음, 상기 배양된 세포에 다시 p53, p53K305N 또는 p53K305N / R175H를 코딩하는 pcDNA3 벡터를 2차로 도입하고 배양하였다. 상기 2차로 도입된 세포에서 도입된 각 유전자의 발현수준을 웨스턴블럿 분석을 통해 확인하고, 각 세포의 침윤수준은 Matrigel 코팅필터를 이용하여 평가하였다(도 1a). 이때, 내부대조군으로 β-액틴을 사용하였다.a pcDNA3 vector encoding a pcDNA3 vector or Bcl-w is firstly introduced into lung cancer cells (H1299 cells) in which p53 is not expressed and cultured. Then, the cultured cells are again transfected with p53, p53 K305N or p53 K305N / R175H pcDNA3 vector was introduced secondarily and cultured. Expression levels of the respective genes introduced from the secondarily introduced cells were confirmed by Western blot analysis and the level of infiltration of each cell was evaluated using a Matrigel coating filter (Fig. 1A). At this time, β-actin was used as an internal control.

도 1a는 Bcl-w가 발현되거나 또는 발현되지 않는 폐암세포(H1299)에서, 야생형 또는 변이체 p53(p53K305N 또는 p53K305N / R175H)의 발현에 따른 폐암세포의 침윤수준을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진 및 그래프이다. 도 1a에서 보듯이, Bcl-w의 발현여부에 관계없이, 야생형 p53 및 변이체 p53(p53K305N)이 발현된 암세포는 대조군에 비하여 침윤수준이 감소하였으나, 변이체 p53(p53K305N / R175H)이 발현된 암세포는 대조군과 유사한 침윤수준을 나타냄을 확인하였다. 아울러, Bcl-w가 발현된 세포에서는 전체적인 침윤수준이 증가함을 확인하였다.FIG. 1A is a graph showing the results of comparison of invasion levels of lung cancer cells with wild-type or mutant p53 (p53 K305N or p53 K305N / R175H ) expression in Bcl-w expressing or non-expressing lung cancer cells (H1299) Analysis photographs and graphs. As shown in FIG. 1A, regardless of the expression of Bcl-w, the cancer cells expressing wild-type p53 and mutant p53 (p53 K305N ) showed a decrease in invasion level as compared with the control, but mutant p53 (p53 K305N / R175H ) The cancer cells showed similar levels of invasion as the control group. In addition, it was confirmed that the total invasion level was increased in cells expressing Bcl-w.

따라서, Bcl-w는 암세포의 침윤수준을 증가시킬 수 있고, p53은 암세포의 침윤수준을 감소시킬 수 있는데, 이러한 p53의 효과는 175번 아미노산 잔기가 관여함을 알 수 있었다. 특히, 변이체 p53(p53K305N)은 DNA 결합활성이 소멸되고, 세포질에 축적되는 것으로 알려져 있는데, 상기 변이체 p53(p53K305N)가 발현될 경우, 암세포의 침윤수준이 감소한다는 결과로부터, 상기 암세포의 침윤을 억제하는 작용기작은 세포질에서 작용하는 것임을 알 수 있었다.
Thus, Bcl-w can increase the invasion level of cancer cells and p53 can decrease the invasion level of cancer cells. The effect of p53 was found to be involved with amino acid residue 175. In particular, mutant p53 (p53 K305N ) is known to be abolished and accumulated in the cytoplasm. When the mutant p53 (p53 K305N ) is expressed, the infiltration level of the cancer cells decreases, In the cytoplasm of the cytoplasm.

실시예Example 1-2:  1-2: ROSROS 의 수준에 미치는 On the level of BclBcl -w와 with -w p53p53 의 효과Effect of

상기 실시예 1-1의 결과로부터, 세포침윤을 억제하는 과정이 세포질에서 수행됨을 확인하였으므로, 암세포의 침윤에 작용한다고 알려진 세포내 ROS의 수준을 비교하고자 하였다. 즉, 상기 2차 도입된 세포를 대상으로, DCF 및 MitoSOX Red 프로브를 이용하여 세포성 ROS 및 미토콘드리아 ROS의 수준을 분석하였다(도 1b).From the results of Example 1-1, it was confirmed that the cell infiltration-inhibiting process was carried out in the cytoplasm, so that the level of intracellular ROS, which is known to act on the infiltration of cancer cells, was compared. That is, the levels of cellular ROS and mitochondrial ROS were analyzed using the DCF and MitoSOX Red probes for the secondarily introduced cells (FIG. 1B).

도 1b는 Bcl-w가 발현되거나 또는 발현되지 않는 폐암세포(H1299)에서, 야생형 또는 변이체 p53(p53K305N 또는 p53K305N / R175H)의 발현에 따른 세포내 ROS 수준을 DCF 및 MitoSOX Red 프로브를 이용하여 분석한 결과를 나타내는 그래프로서, 상단은 DCF를 사용하여 유세포 분석을 수행한 결과를 나타내는 그래프이고, 하단의 좌측은 DCF를 사용하여 분석한 ROS의 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이며, 하단의 우측은 MitoSOX Red 프로브를 사용하여 분석한 ROS의 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 1b에서 보듯이, Bcl-w의 발현여부에 관계없이, 야생형 p53 및 변이체 p53(p53K305N)이 발현된 암세포는 대조군에 비하여 ROS의 수준이 감소하였으나, 변이체 p53(p53K305N / R175H)이 발현된 암세포는 대조군과 유사한 ROS 수준을 나타냄을 확인하였다. 아울러, Bcl-w가 발현된 세포에서는 전체적인 ROS 수준이 증가함을 확인하였다.Figure 1B shows the levels of intracellular ROS following the expression of wild-type or mutant p53 (p53 K305N or p53 K305N / R175H ) in lung cancer cells (H1299) in which Bcl-w was expressed or not expressed using DCF and MitoSOX Red probes The upper graph is a graph showing the results of performing flow cytometry using DCF and the lower graph on the left is a graph showing the results of comparing the levels of ROS analyzed using DCF. Is a graph showing the results of comparing the levels of ROS analyzed using the MitoSOX Red probe. As shown in FIG. 1B, regardless of the expression of Bcl-w, cancer cells expressing wild-type p53 and mutant p53 (p53 K305N ) showed a decrease in the level of ROS compared to the control, but mutant p53 (p53 K305N / R175H ) Cancer cells showed similar ROS levels to those of the control group. In addition, it was confirmed that the total ROS level was increased in cells expressing Bcl-w.

상기 결과는 도 1a의 결과와 일치하므로, p53에 의한 침윤억제 활성은 세포내 ROS를 감소시킴에 의하여 유발됨을 알 수 있었다.
The results are in agreement with the results shown in FIG. 1A, indicating that the inhibition of p53 infiltration is caused by decreasing intracellular ROS.

실시예Example 1-3:  1-3: PI3KPI3K 의 활성 및 인산화된 Of activated and phosphorylated AktAkt 과 and MMPMMP -2의 수준에 미치는 On the level of -2 BclBcl -w와 p53의 효과Effects of -w and p53

상기 실시예 1-2의 결과로부터, p53에 의한 침윤억제 활성이 세포내 ROS를 감소시킴에 의하여 유발됨을 알 수 있었으므로, 상기 ROS의 수준에 영향을 줄 수 있는 조절인자인 PI3K의 활성 및 인산화된 Akt과 MMP-2의 수준을 비교하고자 하였다. 즉, 상기 2차 도입된 세포를 대상으로, 항-PI31K 항체를 이용한 면역침전분석을 수행한 다음, PI3K의 활성은 경쟁적 ELISA를 이용하여 분석하고, PI3K에 영향을 미치는 인산화된 Akt와 MMP-2의 수준은 웨스턴블럿 분석을 통하여 비교하였다(도 1c).From the results of Example 1-2, it was found that the inhibitory activity of p53 infiltration was induced by decreasing the intracellular ROS. Thus, the activity and phosphorylation of PI3K, which is a regulatory factor affecting the level of ROS, And the level of MMP-2. Namely, the secondarily introduced cells were subjected to immunoprecipitation analysis using an anti-PI31K antibody, and the activity of PI3K was analyzed using a competitive ELISA, and phosphorylated Akt and MMP-2 Were compared by Western blot analysis (Figure 1c).

도 1c는 Bcl-w가 발현되거나 또는 발현되지 않는 폐암세포(H1299)에서, 야생형 또는 변이체 p53(p53K305N 또는 p53K305N / R175H)의 발현에 따른 세포내 PI3K의 활성 및 인산화된 Akt과 MMP-2의 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프 및 사진이다. 도 1c에서 보듯이, Bcl-w의 발현여부에 관계없이, 야생형 p53 및 변이체 p53(p53K305N)이 발현된 암세포는 대조군에 비하여 PI3K의 활성 및 인산화된 Akt와 MMP-2의 수준이 감소하였으나, 변이체 p53(p53K305N / R175H)이 발현된 암세포는 대조군과 유사한 PI3K의 활성 및 인산화된 Akt와 MMP-2의 수준을 나타냄을 확인하였다. 아울러, Bcl-w가 발현된 세포에서는 전체적인 PI3K의 활성 및 인산화된 Akt와 MMP-2의 수준이 증가함을 확인하였다.1c shows the activity of intracellular PI3K and the activity of phosphorylated Akt and MMP-2 ( Fig . 1B ) on the expression of wild-type or mutant p53 (p53 K305N or p53 K305N / R175H ) in lung cancer cells (H1299) expressing Bcl- Of the present invention. As shown in FIG. 1C, regardless of the expression of Bcl-w, PI3K activity and phosphorylated Akt and MMP-2 levels were decreased in cancer cells expressing wild-type p53 and mutant p53 (p53 K305N ) The mutant p53 (p53 K305N / R175H ) expressing cancer cells showed similar PI3K activity and phosphorylated Akt and MMP-2 levels as the control group. In addition, it was confirmed that PI3K activity and phosphorylated Akt and MMP-2 levels were increased in Bcl-w expressing cells.

상기 결과는 도 1a 및 1b의 결과와 일치하므로, p53에 의한 침윤억제 활성은 세포내 ROS 수준, PI3K의 활성 및 인산화된 Akt와 MMP-2의 수준을 감소시킴에 의하여 유발됨을 알 수 있었다.
The results are in agreement with the results shown in FIGS. 1A and 1B. Therefore, it was found that the inhibition of p53 infiltration was induced by decreasing intracellular ROS levels, PI3K activity, and phosphorylated Akt and MMP-2 levels.

실시예Example 1-4: 암세포의 침윤억제 효과에 미치는  1-4: Effect on inhibition of infiltration of cancer cells p53p53 과 and BclBcl -w의 결합활성 분석Analysis of binding activity of -w

실시예Example 1-4-1: 재조합 단백질 분석 1-4-1: Analysis of recombinant proteins

상기 실시예 1-3에서 확인된 p53의 효과를 검증하기 위하여, 재조합 단백질을 사용한 결합활성 분석을 수행하였다.In order to verify the effect of p53 identified in Examples 1-3, binding activity analysis using recombinant proteins was performed.

구체적으로, 공지된 재조합 방법을 이용하여 상기 야생형 또는 변이체 p53을 각각 제작하고, GST, GST-Bcl-w 또는 GST-Bax 단백질과 반응시켰다. 반응이 종료된 후, 상기 반응물에 글루타티온이 결합된 세파로스 비드를 가하여 침전분석을 수행하고, 상기 침전분석에서 얻어진 침전물을 대상으로 항-p53 항체를 이용한 웨스턴블럿 분석을 수행하였다(도 1d).Specifically, the wild-type or mutant p53 was prepared using a known recombinant method and reacted with GST, GST-Bcl-w or GST-Bax protein. After completion of the reaction, the reaction mixture was subjected to precipitation analysis by adding Sepharose beads bound with glutathione to the reaction product, and western blot analysis using an anti-p53 antibody was performed on the precipitate obtained in the precipitation analysis (Fig. 1d).

도 1d는 야생형 또는 변이체 p53와 GST, GST-Bcl-w 또는 GST-Bax 단백질을 반응시킨 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진으로서, 상단은 야생형 또는 변이체 p53와 GST 또는 GST-Bcl-w를 반응시킨 결과를 나타내고, 중단은 p53의 발현수준을 비교한 결과를 나타내며, 하단은 야생형 또는 변이체 p53와 GST 또는 GST-Bax를 반응시킨 결과를 나타낸다. 도 1d에서 보듯이, 세포질의 p53은 Bcl-w와 특이적으로 결합하는데, 야생형 p53은 Bcl-w와 높은 특이성으로 결합하는 반면, 변이체 p53은 Bcl-w와 낮은 특이성으로 결합하며, 상기 p53의 175번 잔기가 변이된 경우에는 Bcl-w와 결합하지 않았고; 이에 반하여 Bax는 야생형 또는 변이체 p53과 유사한 수준으로 결합함을 확인하였다.
FIG. 1D is a Western blot image showing the result of reacting wild-type or mutant p53 with GST, GST-Bcl-w or GST-Bax protein, and the upper part shows the result of reacting wild type or mutant p53 with GST or GST-Bcl- , And the interruption shows the result of comparing the expression level of p53 and the lower end shows the result of reacting wild-type or mutant p53 with GST or GST-Bax. As shown in FIG. 1d, cytoplasmic p53 specifically binds to Bcl-w, wild-type p53 binds to Bcl-w with high specificity, while mutant p53 binds to Bcl-w with low specificity, Did not bind to Bcl-w when mutant 175 was mutated; In contrast, Bax was found to bind at similar levels to wild type or mutant p53.

상기 도 1d의 결과를 도 1a 내지 1c의 결과와 비교하면, 상기 p53에 의한 암세포침윤 억제활성을 나타내기 위하여는 p53과 Bcl-w의 결합이 필수적으로 요구되고, 상기 결합에는 175번 잔기가 중요한 역할을 수행함을 알 수 있었다
The result of FIG. 1D is compared with the results of FIGS. 1A to 1C. In order to exhibit the inhibitory activity against cancer cell infiltration by p53, the binding of p53 and Bcl-w is essential, I was able to find out

실시예Example 1-4-2: 세포  1-4-2: Cells 파쇄물Crush 분석 analysis

상기 실시예 1-3에서 확인된 p53의 효과를 검증하기 위하여, 상기 2차 도입된 암세포 중에서 Bcl-w가 발현되지 않는 암세포의 세포파쇄물을 사용한 결합활성 분석을 수행하였다. 즉, 상기 2차 도입된 암세포 중에서 Bcl-w가 발현되지 않는 암세포로부터 세포파쇄물을 수득하고, 상기 각각의 세포파쇄물을 대상으로, 항-Bcl-w 항체 또는 항-Bax 항체를 이용한 면역침전분석을 수행하였으며, 이로부터 얻어진 침전물을 대상으로 항-p53 항체 또는 항-Bcl-w 항체를 이용한 웨스턴블럿 분석을 수행하였다. 아울러, 상기 각각의 세포파쇄물을 대상으로, 항-p53 항체, 항-Bcl-w 항체 또는 항-Bax 항체를 이용한 웨스턴블럿 분석을 수행하였다(도 1e). In order to verify the effect of p53 identified in Example 1-3, binding activity analysis using cell lysates of cancer cells in which Bcl-w was not expressed in the secondarily introduced cancer cells was performed. Namely, cell lysates were obtained from cancer cells in which Bcl-w was not expressed in the secondarily introduced cancer cells, and the cell lysates were subjected to immunoprecipitation analysis using anti-Bcl-w antibody or anti-Bax antibody And the resulting precipitate was subjected to western blot analysis using anti-p53 antibody or anti-Bcl-w antibody. Each cell lysate was subjected to western blot analysis using anti-p53 antibody, anti-Bcl-w antibody or anti-Bax antibody (Fig. 1E).

도 1e는 Bcl-w가 발현되지 않는 폐암세포(H1299)에서, 야생형 또는 변이체 p53(p53K305N 또는 p53K305N / R175H)의 발현에 따른 p53, Bcl-w 및 Bax 간의 결합활성을 분석한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다. 도 1e에서 보듯이, Bcl-w와 p53의 결합은 야생형 p53 및 변이체 p53(p53K305N)이 발현된 암세포에서 확인되었고, Bax와 p53의 결합은 변이체 p53(p53K305N 또는 p53K305N / R175H)이 발현된 암세포에서 확인되었으며, Bcl-w와 Bax의 결합은 야생형 p53 및 변이체 p53(p53K305N / R175H)이 발현된 암세포에서 확인되었다.
FIG. 1E shows the results of analysis of binding activity between p53, Bcl-w and Bax according to the expression of wild-type or mutant p53 (p53 K305N or p53 K305N / R175H ) in lung cancer cells (H1299) Western blot analysis. As shown in FIG. 1E, the binding of Bcl-w to p53 was confirmed in cancer cells expressing wild-type p53 and mutant p53 (p53 K305N ), and the binding of Bax and p53 resulted in expression of mutant p53 (p53 K305N or p53 K305N / R175H ) , And the binding of Bcl-w and Bax was confirmed in cancer cells expressing wild-type p53 and mutant p53 (p53 K305N / R175H ).

실시예Example 1-4-3: 재조합 단백질 분석 1-4-3: Analysis of recombinant proteins

상기 실시예 1-4-2에서 확인된 결과를 명확히 하기 위하여, 재조합 단백질을 사용한 결합활성 분석을 수행하였다.In order to clarify the results confirmed in Example 1-4-2, binding activity analysis using recombinant proteins was performed.

구체적으로, 공지된 재조합 방법을 이용하여 상기 야생형 또는 변이체 p53을 각각 제작하고, 재조합 방법으로 발현된 Bcl-w 및 Bax를 동시에 반응시켰다. 반응이 종료된 후, 상기 반응물에 항-Bax 항체를 가하여 면역침전분석을 수행하고, 상기 침전분석에서 얻어진 침전물을 대상으로, 항-Bcl-w 항체를 이용한 웨스턴블럿 분석을 수행하였다. 또한, 상기 반응물을 대상으로, 항-p53 항체, 항-Bcl-w 항체 또는 항-Bax 항체를 이용한 웨스턴블럿 분석을 수행하였다(도 1f). Specifically, the wild-type or mutant p53 was prepared using a known recombinant method, and Bcl-w and Bax expressed by the recombinant method were simultaneously reacted. After completion of the reaction, an anti-Bax antibody was added to the reaction to perform immunoprecipitation analysis, and the precipitate obtained in the precipitation analysis was subjected to western blot analysis using an anti-Bcl-w antibody. In addition, Western blot analysis using anti-p53 antibody, anti-Bcl-w antibody or anti-Bax antibody was performed on the reactant (Fig. 1F).

도 1f는 야생형 또는 변이체 p53와 Bcl-w 및 Bax를 동시에 반응시킨 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다. 도 1f에서 보듯이, 야생형 p53 및 변이체 p53(p53K305N)는 Bcl-w 또는 Bax와 결합하는 반면, 변이체 p53(p53K305N / R175H)는 Bcl-w 또는 Bax와 결합하지 않아서, Bcl-w/Bax 결합체가 형성됨을 확인하였다.FIG. 1F is a Western blot analysis image showing the results of simultaneous reaction of wild-type or mutant p53 with Bcl-w and Bax. As shown in FIG. 1F, wild-type p53 and mutant p53 (p53 K305N ) bind to Bcl-w or Bax while mutant p53 (p53 K305N / R175H ) does not bind to Bcl-w or Bax, It was confirmed that a complex was formed.

Bcl-w는 Bax와 결합하여 세포침윤을 억제한다고 알려져 있기 때문에, Bcl-w에 대한 p53의 결합은 Bcl-w/Bax 복합체의 분해원인이 될 수 있다. 따라서, 암세포 침윤을 억제하지 못하는 변이체 p53(p53K305N / R175H)를 사용한 실험결과에서 Bcl-w/Bax 결합체가 형성되었다는 것은 상기 Bcl-w/Bax 결합체의 분해가 암세포의 침윤억제와 관련되고, 이는 p53에 의하여 유도됨을 알 수 있었다.
The binding of p53 to Bcl-w may be responsible for the degradation of the Bcl-w / Bax complex, since Bcl-w is known to bind to Bax and inhibit cellular infiltration. Therefore, the result of the experiment using the mutant p53 (p53 K305N / R175H ) that does not inhibit the cancer cell infiltration indicates that the Bcl-w / Bax complex is degraded by the inhibition of invasion of cancer cells, p53, respectively.

상기 실시예 1-1 내지 1-4의 결과를 종합하면, 세포질의 p53은 Bcl-w와 결합하여, Bcl-w/Bax 결합체의 형성을 억제함으로써, ROS 수준저하, PI3K의 활성감소, 인산화된 Akt와 MMP-2의 수준감소를 통해, 암세포의 침윤을 억제함을 알 수 있었다.
Taken together, the results of Examples 1-1 to 1-4 demonstrate that cytoplasmic p53 binds to Bcl-w and inhibits the formation of Bcl-w / Bax complexes, thereby reducing ROS levels, decreasing PI3K activity, By inhibiting the levels of Akt and MMP-2, we were able to inhibit the invasion of cancer cells.

실시예Example 2: 암세포의 침윤에 미치는  2: Effect on invasion of cancer cells BaxBax 와 Wow complexcomplex -I의 효과Effect of -I

Bax는 MPT(mitochondrial permeability transition)를 유도하여 자멸세포에서 ROS의 생산을 촉진하지만, 건강한 세포에서는 ROS의 생성을 억제하는데, 이의 작용기작은 알려져 있지 않다. 다만, 세포내 ROS는 미토콘드리아의 호흡연쇄에 의하여 발생되므로, 상기 미토콘드리아 호흡연쇄에 작용하는 4개의 다중체 단백질 복합체(complex-I, II, III 및 IV)에 상기 Bax가 작용하는지의 여부를 확인하고자 하였다.
Bax promotes the production of ROS in apoptotic cells by inducing mitochondrial permeability transition (MPT), but inhibits the production of ROS in healthy cells. However, since the intracellular ROS is generated by the respiration chain of mitochondria, it is necessary to confirm whether or not the Bax acts on the four multispecific protein complexes (complex-I, II, III and IV) acting on the mitochondrial respiratory chain Respectively.

실시예Example 2-1: 암세포의 침윤 억제활성에 대한  2-1: On the inhibitory activity of cancer cell infiltration BaxBax 와 연관된 Associated with complexcomplex 의 확인Confirmation of

대조군(cRNA) 또는 Bax siRNA를 H1299 세포에 도입하고 24시간동안 배양한 다음, complex-I의 억제제인 로테논(1 μM), complex-II의 억제제인 말로네이트(5 mM), complex-III의 억제제인 안티마이신 A(10 μM) 또는 complex-IV의 억제제인 KCN(500 μM)을 처리하거나 또는 처리하지 않고, 배양하였다. 배양이 종료된 후, ROS 수준과 침윤성을 평가하였다(도 2a).The control (cRNA) or Bax siRNA was introduced into H1299 cells and cultured for 24 hours. Then, the complex-I inhibitor, rotenone (1 μM), complex-II inhibitor malonate (5 mM) Antimycin A (10 μM), an inhibitor, or KCN (500 μM), an inhibitor of complex-IV, was cultured with or without treatment. After incubation was terminated, ROS levels and invasiveness were assessed (Fig. 2a).

도 2a는 Bax의 발현을 억제하거나 또는 억제하지 않는 조건에서, 암세포의 침윤과 관련된 미토콘드리아 호흡연쇄 연관 단백질을 검출한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 2a에서 보듯이, Bax의 발현이 억제되지 않은 상태에서는 모든 암세포가 대조군 보다 낮은 수준의 침윤수준을 나타내었고, Bax의 발현이 억제된 상태에서는 대부분의 암세포의 침윤수준이 증가하였으며, complex-I의 억제제인 로테논을 처리한 암세포는 Bax의 발현이 억제된 상태에서도 현저하게 낮은 ROS 수준 및 침윤수준을 나타냄을 확인하였다.FIG. 2A is a graph showing the results of detection of mitochondrial respiratory chain-associated proteins associated with the invasion of cancer cells under conditions that inhibit or inhibit the expression of Bax. FIG. As shown in FIG. 2A, when the expression of Bax was not inhibited, all the cancer cells showed a lower level of invasion than the control, and when the expression of Bax was inhibited, the invasion level of most cancer cells was increased. Inhibited the expression of Bax in the cancer cells treated with rotenone, but the ROS levels and infiltration levels were significantly lowered.

따라서, 암세포의 침윤 억제활성과 관련하여, Bax와 연관된 미토콘드리아 호흡연쇄 연관 단백질은 complex-I이고, 상기 complex-I은 ROS의 생성에 직접적으로 연관됨을 알 수 있었다.
Thus, with respect to the invasive inhibitory activity of cancer cells, the mitochondrial respiratory chain-associated protein associated with Bax is complex-I, and the complex-I is directly related to the production of ROS.

실시예Example 2-2:  2-2: complexcomplex 의 활성에 미치는 On the activity of BaxBax 의 효과Effect of

상기 실시예 2-1의 결과로부터, Bax와 complex-I이 연관됨을 확인하였으므로, 상기 complex-I의 활성에 Bax가 어떠한 영향을 미치는지를 확인하고자 하였다.From the results of Example 2-1, it was confirmed that Bax and complex-I are related to each other. Therefore, it was examined how Bax affects the activity of complex-I.

서로다른 서열의 Bax siRNA를 H1299 세포에 처리하여 배양하고, 상기 배양된 각 세포로부터 complex-I, II, III 및 IV의 활성변화를 측정하였다(도 2b).Bax siRNAs of different sequences were treated with H1299 cells, and the activity of complex-I, II, III and IV was measured from each of the cultured cells (FIG. 2B).

도 2b는 Bax의 발현이 억제된 조건에서 complex-I, II, III 및 IV의 활성변화를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 2b에서 보듯이, Bax의 발현억제에 따라 complex-I의 활성이 가장 큰 수준으로 증가함을 확인하였다.
FIG. 2B is a graph showing the results of measuring changes in the activity of complex-I, II, III, and IV under the condition in which expression of Bax was inhibited. As shown in FIG. 2B, it was confirmed that the activity of complex-I was increased to the highest level by inhibiting the expression of Bax.

실시예Example 2-3:  2-3: BaxBax 와 Wow complexcomplex -I의 결합활성 검증Verification of binding activity of -I

H1299 세포 파쇄물을 대상으로 각 complex에 대한 항체를 사용하여 면역침전분석을 수행하여 각각의 침전물을 수득하였다. 상기 수득한 침전물을 대상으로 항-Bax 항체 또는 항-Bcl-w 항체를 사용한 웨스턴블럿 분석을 수행하고, 상기 H1299 세포 파쇄물을 대상으로 동일한 항체를 사용한 웨스턴블럿 분석을 수행하였다(도 2c). 이때, 내부대조군으로 β-액틴을 사용하였다.H1299 cell lysates were subjected to immunoprecipitation analysis using antibodies against each complex to obtain individual precipitates. Western blot analysis using anti-Bax antibody or anti-Bcl-w antibody was performed on the obtained precipitate, and western blot analysis using the same antibody was performed on the H1299 cell lysate (FIG. 2C). At this time, β-actin was used as an internal control.

도 2c는 H1299 세포에서 Bax와 결합할 수 있는 미토콘드리아 호흡연쇄 연관 단백질을 검출한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다. 도 2c에서 보듯이, Bcl-w와 결합되는 미토콘드리아 호흡연쇄 연관 단백질은 검출되지 않았고, Bax와 결합되는 미토콘드리아 호흡연쇄 연관 단백질은 complex-I임을 확인하였다.
FIG. 2c is a Western blot analysis image showing the result of detection of mitochondrial respiratory chain-linked protein capable of binding to Bax in H1299 cells. As shown in FIG. 2C, the mitochondrial respiration chain-linked protein coupled with Bcl-w was not detected, and the mitochondrial respiration chain-linked protein coupled with Bax was found to be complex-I.

실시예Example 2-4: ΔΨ 2-4: ΔΨ mm 과 and 세포내Intracellular ATPATP 수준에 미치는  Level BaxBax 의 효과Effect of

서로다른 서열의 Bax siRNA를 H1299 세포에 처리하고, 상기 처리된 세포를 JC-1에 적용하고, 유세포분석을 수행함으로써, ΔΨm과 ATP 수준의 변화를 분석하였다(도 2d). 이때, ΔΨm 수준은 JC-1 밀도의 형태로 표시하였는데, 상기 ΔΨm 수준이 증가할 수록 JC-1 밀도가 감소되도록 표시하였다.The Bax siRNAs of different sequences were treated with H1299 cells, the treated cells were applied to JC-1, and flow cytometry was performed to analyze changes in ΔΨ m and ATP levels (FIG. 2d). At this time, the ΔΨ m level is expressed in the form of JC-1 density, and it is indicated that the JC-1 density decreases as the ΔΨ m level increases.

도 2d는 Bax의 발현억제에 따른 ΔΨm과 ATP 수준의 변화를 나타내는 그래프이다. 도 2d에서 보듯이, Bax의 발현이 억제되면, ΔΨm과 ATP 수준이 모두 증가함을 확인하였다
FIG. 2d is a graph showing changes in ΔΨ m and ATP levels with inhibition of Bax expression. As shown in FIG. 2d, when the expression of Bax was inhibited, it was confirmed that both ΔΨ m and ATP levels were increased

상기 실시예 2-1 내지 2-4의 결과를 종합하면, 암세포에서 Bax는 complex-I의 활성을 억제하고, ΔΨm 를 감소시키며, ATP 생산을 감소시키는 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
Taken together, the results of Examples 2-1 to 2-4 show that Bax inhibits the activity of complex-I, reduces ΔΨ m, and decreases ATP production in cancer cells.

실시예Example 3:  3: BaxBax 및  And complexcomplex -I의 결합부위 분석-I binding site analysis

실시예Example 3-1:  3-1: BaxBax 의 결합부위 분석Binding site analysis

일반적으로, Bax는 세포내에서 미토콘드리아의 막에 결합된 형태로 존재하는데, 그의 C-말단영역은 미토콘드리아 외막에 삽입되어 있고, C-말단의 4개 잔기(KKMG)는 미토콘드리아의 외막과 내막 사이에 존재하는 막간공간(intermembrane space)에 돌출된 형태로 존재한다고 알려져 있다.In general, Bax is present in the cell in a form bound to the mitochondrial membrane. Its C-terminal region is inserted into the mitochondrial outer membrane, and the four residues at the C-terminus (KKMG) are located between the outer membrane of the mitochondria and the inner membrane It is known to exist in a protruding form in an existing intermembrane space.

이에, Bax로부터 상기 C-말단의 4개 잔기를 결실시킬 경우, complex-I과의 결합활성이 변화되는지를 확인하고자 하였다.
Thus, it was tried to confirm whether the binding activity with complex-I was changed when 4 residues of C-terminal were deleted from Bax.

pTRE, pTRE-Bax 또는 pTRE-BaxΔC4 벡터가 도입된 LoVo 세포에 테트라사이클린(1 ㎍/㎖)을 16시간 동안 처리하여 유전자 발현을 유도하였다. 상기 외래유전자의 발현이 완료된 LoVo 세포를 파쇄하여 세포파쇄물을 수득하고, 상기 세포파쇄물에 항-complex-I 항체를 가하여 면역침전을 수행하였으며, 이로부터 침전물을 수득하였다. 상기 수득한 세포파쇄물과 침전물을 대상으로 항-Bax 항체를 이용한 웨스턴블럿 분석을 수행하였다. 또한, 상기 LoVo 세포를 대상으로 ROS 수준 및 침윤수준을 측정하였다(도 3a). LoVo cells into which pTRE, pTRE-Bax or pTRE-BaxΔC4 vectors were introduced were treated with tetracycline (1 μg / ml) for 16 hours to induce gene expression. LoVo cells in which the expression of the foreign gene was completed were disrupted to obtain cell lysates. Immunoprecipitation was performed by adding anti-complex-I antibody to the cell lysates, and a precipitate was obtained therefrom. Western blot analysis using the anti-Bax antibody was performed on the obtained cell lysate and precipitate. In addition, ROS levels and infiltration levels were measured in the LoVo cells (Fig. 3A).

도 3a는 야생형 또는 변이체 Bax가 도입된 LoVo 세포에서 상기 Bax의 종류에 따른 complex-I과의 결합활성(상단), ROS 수준(하단 좌측) 및 침윤수준(하단 우측)을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진 및 그래프이다. 도 3a에서 보듯이, Bax의 C-말단 4개 잔기가 결실되면 complex-I과 결합되지 않고, 이처럼 Bax가 complex-I과 결합되지 않으면, ROS 수준과 침윤수준이 증가함을 확인하였다. 반면, 야생형 Bax은 complex-I과 결합하고, 이에 따라 ROS 수준 및 침윤수준이 감소됨을 확인하였다.3A shows the results of comparing the binding activity (upper), ROS level (lower left) and invasion level (lower right) of complex-I with the wild-type or mutant Bax-introduced LoVo cells, It is a blot analysis photograph and graph. As shown in FIG. 3A, when four C-terminal residues of Bax are deleted, they are not bound to complex-I. Thus, it is confirmed that Rax level and invasion level are increased when Bax is not bound to complex-I. On the other hand, it was confirmed that wild-type Bax binds to complex-I, thereby reducing ROS level and invasion level.

따라서, Bax에 있어서, complex-I과의 결합은 C-말단의 4개 잔기를 통하여 수행됨을 알 수 있었다.
Thus, in Bax, the binding with complex-I was found to be carried out through four residues at the C-terminus.

실시예Example 3-2:  3-2: complexcomplex -I의 결합부위 분석-I binding site analysis

인간의 complex-I은 두개의 도메인을 형성하는 45개의 서브유닛으로 구성되는데, 세포막 결합 도메인은 미토콘드리아 내막에 위치하고, 세포질 도메인은 미토콘드리아 간질에 돌출되어 있다고 알려져 있다.Human complex-I consists of 45 subunits forming two domains, the cell membrane-binding domain is located in the mitochondrial inner membrane, and the cytoplasmic domain is known to protrude into the mitochondrial epilepsy.

상기 세포막 결합 도메인을 구성하는 서브유닛의 일부는 상기 막간공간에 돌출되어 있으므로, 상기 돌출된 부위를 통하여 Bax의 C-말단의 4개 잔기와 결합할 것으로 가정하였다.
Since a part of the subunits constituting the cell membrane-binding domain protrudes into the inter-membrane space, it is assumed that it binds to four C-terminal residues of Bax through the protruding site.

H1299 세포의 파쇄물을 대상으로 항-Bax 항체를 가하여 면역침전을 수행하였으며, 이로부터 침전물을 수득하였다. 상기 수득한 침전물을 대상으로 세포막 결합 도메인의 3개 서브유닛(ND1, ND2 또는 ND5)에 대한 각각의 항체 또는 세포질 도메인의 2개 서브유닛(NDUFS1 또는 NDUFV2)에 대한 각각의 항체를 사용한 웨스턴블럿 분석을 수행하였다(도 3b). The lysate of H1299 cells was subjected to immunoprecipitation by adding an anti-Bax antibody, from which a precipitate was obtained. The obtained precipitate was subjected to western blot analysis using the respective antibodies for two subunits (NDUFS1 or NDUFV2) of each antibody or cytoplasmic domain to three subunits (ND1, ND2 or ND5) of the cell membrane binding domain (Fig. 3B).

도 3b는 암세포에서 면역침전분석을 통하여 Bax와 결합할 수 있는 complex-I을 구성하는 서브유닛을 선별한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다. 도 3b에서 보듯이, Bax와 결합할 수 있는 complex-I을 구성하는 서브유닛은 ND5 임을 확인하였다.
FIG. 3B is a Western blot analysis image showing a result of selecting subunits constituting a complex-I capable of binding to Bax through immunoprecipitation analysis in cancer cells. As shown in FIG. 3B, it was confirmed that the sub-unit constituting the complex-I capable of binding to Bax was ND5.

상기 확인된 ND5 서브유닛이 Bax의 C-말단의 4개 잔기와 결합하는지의 여부를 확인하고자 하였다. 즉, pTRE, pTRE-Bax 또는 pTRE-BaxΔC4 벡터가 도입된 H1299 세포로부터 각각의 세포파쇄물을 수득하고, 상기 세포파쇄물을 대상으로 항-Bax 항체를 가하여 면역침전을 수행하였으며, 이로부터 침전물을 수득하였다. 상기 수득한 침전물을 대상으로 항-ND5 항체를 사용한 웨스턴블럿 분석을 수행하고, 비교군으로서 상기 세포파쇄물을 대상으로 항-Bax 항체 또는 항-ND5 항체를 사용한 웨스턴블럿 분석을 수행하였다(도 3c).To confirm whether the identified ND5 subunit binds to the four C-terminal residues of Bax. That is, each cell lysate was obtained from H1299 cells into which pTRE, pTRE-Bax or pTRE-BaxΔC4 vector was introduced, and the cell lysate was subjected to immunoprecipitation by adding an anti-Bax antibody to obtain a precipitate therefrom . The resulting precipitate was subjected to Western blot analysis using anti-ND5 antibody, and the cell lysate as a comparative group was subjected to Western blot analysis using anti-Bax antibody or anti-ND5 antibody (FIG. 3c) .

도 3c는 야생형 또는 변이체 Bax가 도입된 H1299 세포에서 Bax의 C-말단의 4개 잔기가 complex-I의 ND5 서브유닛과 결합할 수 있는지를 확인한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다. 도 3c에서 보듯이, C-말단의 4개 잔기가 결실된 변이체 Bax는 ND5 서브유닛과 결합하지 않았고, 정상적인 Bax만이 ND5 서브유닛과 결합함을 확인하였다.
FIG. 3c is a Western blot analysis image showing the result of confirming whether four C-terminal residues of Bax can bind to the ND5 subunit of complex-I in H1299 cells into which wild type or mutant Bax was introduced. As shown in FIG. 3C, mutant Bax lacking four residues at the C-terminus did not bind to the ND5 subunit, confirming that only normal Bax binds to the ND5 subunit.

따라서, complex-I에 있어서, Bax와의 결합은 ND5 서브유닛을 통하여 수행됨을 알 수 있었다.
Thus, in complex-I, it was found that the binding with Bax was carried out through the ND5 subunit.

실시예Example 3-3:  3-3: 변이체을Mutant 이용한  Used ND5ND5 서브유닛의 활성분석 Activity analysis of subunits

폐암세포에서는 상기 ND5 서브유닛의 다양한 변이체가 발현되는 것으로 알려져 있는데, 상기 변이체 중의 하나가 ND5의 13829번 아미노산 잔기인 글리신이 알라닌으로 치환된 변이체(ND5G13289A)이다. 상기 변이체 ND5를 이용하여 암세포의 침윤에 관여하는 ND5의 활성을 분석하였다.It is known that various mutants of the ND5 subunit are expressed in lung cancer cells. One of the mutants is a mutant (ND5 G13289A ) in which glycine, which is the amino acid residue 13829 of ND5, is substituted with alanine. The mutant ND5 was used to analyze the activity of ND5 involved in the invasion of cancer cells.

구체적으로, ND5 및 ND5G13289A을 코딩하는 pCMV/myc/mito 벡터를 H1299 세포에 도입하여 형질전환체를 수득하였다. 상기 형질전환체를 파쇄하여 파쇄물을 수득하고, 상기 파쇄물을 대상으로 면역침전분석 및 웨스턴블럿 분석을 수행하였다(도 3d).Specifically, pCMV / myc / mito vector encoding ND5 and ND5 G13289A was introduced into H1299 cells to obtain transformants. The transformant was disrupted to obtain a lysate, and the lysate was subjected to immunoprecipitation analysis and western blot analysis (FIG. 3D).

도 3d는 ND5 또는 ND5G13289A이 발현되는 H1299 세포의 파쇄물을 대상으로 Bax가 외인성 ND5(Myc-WT) 또는 ND5G13289A(Myc-G13289A)와 결합체를 형성하는지의 여부를 확인한 결과를 나타내는 면역침전분석 사진 및 웨스턴블럿 분석사진이다. 도 3d에서 보듯이, Bax는 외인성 ND5(Myc-WT)와는 결합체를 형성하지만, 외인성 ND5G13289A(Myc-G13289A)와는 결합체를 형성하지 않음을 확인하였다.
FIG. 3D is a photograph showing immunoprecipitation analysis showing the result of confirming whether Bax forms a complex with ND5 (Myc-WT) or ND5 G13289A (Myc-G13289A) in the H1299 cell lysate expressing ND5 or ND5 G13289A And Western blot analysis. As shown in FIG. 3D, it was confirmed that Bax forms a complex with extrinsic ND5 (Myc-WT) but does not form a complex with extrinsic ND5 G13289A (Myc-G13289A).

실시예Example 3-4:  3-4: 변이체Mutant ND5ND5 의 과발현이 암세포침윤에 미치는 효과Of Cancer Overexpression on Cancer Cell Infiltration

상기 실시예 3-3에서 수득한 형질전환체를 대상으로, ROS 수준과 침윤수준을 분석하였다(도 3e).The transformant obtained in Example 3-3 was analyzed for ROS level and infiltration level (FIG. 3E).

도 3e은 야생형 또는 변이체 ND5의 발현에 따른 암세포에서 ROS 수준과 침윤수준의 변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 3e에서 보듯이, 대조군에 비하여, 야생형 ND5가 도입된 암세포에서는 세포내 ROS 수준과 침윤수준이 증가하였고, 변이체 ND5가 도입된 암세포에서는 야생형 ND5가 도입된 암세포보다도 더욱 높은 수준으로 ROS 수준 및 침윤수준이 증가함을 확인하였다.FIG. 3E is a graph showing the results of comparing the changes of ROS level and invasion level in cancer cells according to the expression of wild type or mutant ND5. FIG. As shown in FIG. 3E, intracellular ROS levels and invasion levels were increased in wild-type ND5-introduced cancer cells, and in cancer cells into which mutant ND5 was introduced, levels of ROS and invasion were higher than those of wild-type ND5-introduced cancer cells And the level was increased.

상기 결과는, 변이체 ND5가 Bax와 결합하지 못하기 때문인 것으로 분석되었다.
This result was analyzed to be that mutant ND5 failed to bind Bax.

상기 실시예 3-1 내지 3-4의 결과를 종합하면, Bax의 C-말단의 4개 잔기와 complex-I의 ND5 서브유닛을 통하여, Bax와 complex-I이 결합하여, complex-I의 기능을 억제함으로써, ROS의 수준을 저하시키고, 암세포의 침윤을 억제함을 알 수 있었다.
Taken together, the results of Examples 3-1 to 3-4 show that Bax complex-I binds through four residues at the C-terminal of Bax and the ND5 subunit of complex-I, It was found that the level of ROS was lowered and the infiltration of cancer cells was suppressed.

실시예Example 4: 암세포의 침윤에 미치는  4: Inflammation of cancer cells BclBcl -w와 with -w complexcomplex -I의 효과Effect of -I

상기 실시예 1의 결과를 통하여 Bcl-w와 Bax가 복합체를 형성할 수 있고, 상기 실시예 3의 결과를 통하여 Bax와 complex-I이 복합체를 형성할 수 있음을 확인하였다. 이에 따라, 상기 Bax/complex-I 복합체의 형성에 있어서, Bcl-w는 상기 복합체의 형성을 억제하는 효과를 나타낼 수 있을 것으로 가정하고, 이를 확인하고자 하였다.
The result of Example 1 above shows that Bcl-w and Bax can form a complex, and that the complex-I can form a complex with Bax through the results of Example 3 above. Thus, it is assumed that Bcl-w can exhibit an effect of inhibiting the formation of the complex in the formation of the Bax / complex-I complex.

실시예Example 4-1:  4-1: BclBcl -w의 발현조건 하에서 Under the expression conditions of -w complexcomplex -I의 활성억제 효과 -I inhibitory effect

대조군과 Bcl-w가 도입된 H1299 세포를 대상으로 로테논(1 μM), 말로네이트(5 mM), 안티마이신 A(10 μM) 또는 KCN(500 μM)을 처리하거나 또는 처리하지 않고 배양하였으며, 상기 배양이 종료된 세포를 대상으로 세포내 ROS 수준과 침윤수준을 분석하였다(도 4a).H1299 cells transfected with the control and Bcl-w were cultured with or without treatment with rottenone (1 μM), malonate (5 mM), antimycin A (10 μM) or KCN (500 μM) The intracellular ROS level and infiltration level of the cultured cells were analyzed (Fig. 4A).

도 4a는 Bcl-w가 발현되지 않거나 또는 발현되는 폐암세포(H1299)에서 다양한 암세포의 침윤과 관련된 미토콘드리아 호흡연쇄 연관 단백질의 활성억제에 따른, ROS 수준과 침윤수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 4a에서 보듯이, Bcl-w가 발현되지 않을 경우에는 상기 미토콘드리아 호흡연쇄 연관 단백질의 활성을 억제하여도 ROS 수준 및 암세포의 침윤수준이 대조군보다 낮은 수준을 나타내었으나, Bcl-w가 발현될 경우에는 상기 미토콘드리아 호흡연쇄 연관 단백질의 활성을 억제할 경우 대부분 ROS 수준 및 암세포의 침윤수준이 증가함을 확인하였다. 다만, complex-I의 활성을 억제할 경우에는 이례적으로 ROS 수준 및 암세포의 침윤수준이 감소함을 확인하였다.FIG. 4A is a graph showing the results of comparing the levels of ROS and invasion according to inhibition of the activity of mitochondrial respiration chain-associated proteins associated with invasion of various cancer cells in lung cancer cells (H1299) in which Bcl-w is not expressed or expressed. As shown in FIG. 4A, when Bcl-w was not expressed, the levels of ROS and cancer cells were lower than those of the control group even when the mitochondrial respiration chain-associated protein was inhibited, but when Bcl-w was expressed Showed that the inhibition of the activity of the mitochondrial respiratory chain-associated protein increased the levels of ROS and invasiveness of cancer cells. However, when the complex-I activity was inhibited, it was confirmed that the level of ROS and the invasion level of cancer cells were reduced unusually.

따라서, Bcl-w 역시 Bax와 마찬가지로 암세포의 침윤과정을 complex-I을 통하여 조절할 수 있음을 알 수 있었다.
Therefore, Bcl-w can regulate the invasion process of cancer cells through complex-I as Bax.

실시예Example 4-2:  4-2: complexcomplex -I의 활성에 대한 For the activity of -I BclBcl -w 과발현의 효과-w Effect of Overexpression

상기 Bcl-w의 과발현이 complex-I의 활성에 직접적으로 어떠한 효과를 나타내는지 확인하고자, 대조군, Bcl-w 또는 Bcl-wG94A 유전자를 암세포에 도입하여 형질도입체를 각각 수득하고, 이를 배양하여 각각의 형질도입체를 수득한 다음, 상기 수득한 각각의 형질도입체를 파쇄하여, 각각의 세포파쇄물을 수득하였으며, 상기 수득한 각각의 세포파쇄물을 대상으로 complex I-IV의 활성을 비교하였다(도 4b).To confirm the effect of overexpression of Bcl-w directly on the activity of complex-I, a control group, Bcl-w or Bcl-w G94A gene was introduced into cancer cells to obtain transgenic plants and cultured Each of the transformed bodies was disrupted, and the resulting transformed bodies were disrupted to obtain respective cell lysates. The activity of complex I-IV was compared to each of the cell lysates obtained ( 4b).

도 4b는 야생형 또는 변이체 Bcl-w가 과발현된 조건에서 complex-I, II, III 및 IV의 활성변화를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 4b에서 보듯이, Bcl-w의 과발현에 따라 complex-I의 활성이 가장 큰 수준으로 증가함을 확인하였다.
FIG. 4B is a graph showing the results of measuring the activity changes of complex-I, II, III and IV under the condition that wild-type or mutant Bcl-w is overexpressed. As shown in FIG. 4B, it was confirmed that the activity of complex-I was increased to the highest level by overexpression of Bcl-w.

실시예Example 4-3: ΔΨ 4-3: ΔΨ mm 및  And ATPATP 수준에 대한  About level BclBcl -w 과발현의 효과-w Effect of Overexpression

상기 실시예 4-2에서 수득한 각각의 형질도입체를 JC-1에 적용하고, 유세포분석을 수행함으로써, ΔΨm과 ATP 수준의 변화를 분석하였다(도 4c). 이때, ΔΨm 수준은 JC-1 밀도의 형태로 표시하였는데, 상기 ΔΨm 수준이 증가할 수록 JC-1 밀도가 감소되도록 표시하였다.Each transfected solid obtained in Example 4-2 was applied to JC-1, and flow cytometry was performed to analyze changes in ΔΨ m and ATP levels (FIG. 4C). At this time, the ΔΨ m level is expressed in the form of JC-1 density, and it is indicated that the JC-1 density decreases as the ΔΨ m level increases.

도 4c는 야생형 또는 변이체 Bcl-w가 과발현된 조건에서 ΔΨm과 ATP 수준의 변화를 나타내는 그래프이다. 도 4c에서 보듯이, 야생형 Bcl-w가 과발현되면, ΔΨm과 ATP 수준이 모두 증가하였으나, 변이체 Bcl-w가 과발현되면, ΔΨm과 ATP 수준이 대조군과 유사한 수준을 나타냄을 확인하였다
FIG. 4C is a graph showing the changes in ΔΨ m and ATP levels under the conditions in which wild-type or mutant Bcl-w is overexpressed. As shown in FIG. 4C, when wild-type Bcl-w was overexpressed, both ΔΨ m and ATP levels were increased. However, when mutant Bcl-w was overexpressed, ΔΨ m and ATP levels were similar to those of the control group

실시예Example 4-4:  4-4: ND5ND5 와 Wow BaxBax 의 결합에 미치는 On the binding of BclBcl -w 과발현의 효과-w Effect of Overexpression

상기 실시예 4-2에서 수득한 각각의 세포파쇄물에 항-complex-I 항체 또는 항-Bax 항체를 가하고 면역침전을 수행하여 각각의 침전물을 수득하였으며, 상기 침전물 또는 세포파쇄물을 대상으로 항-Bcl-w 항체, 항-Bax 항체 또는 항-ND5 항체를 사용한 웨스턴블럿 분석을 수행하였다(도 4d).Each cell lysate obtained in Example 4-2 was subjected to immunoprecipitation by adding an anti-complex-I antibody or an anti-Bax antibody and each precipitate was obtained. The precipitate or cell lysate was subjected to anti-Bcl Western blot analysis using anti-W antibody, anti-Bax antibody or anti-ND5 antibody was performed (Fig. 4d).

도 4d는 야생형 또는 변이체 Bcl-w가 과발현된 조건에서 Bax와 complex-I(ND5)의 결합여부를 확인한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다. 도 4d에서 보듯이, 야생형 Bcl-w가 과발현되면, 암세포내에서 Bax/complex-I 복합체 또는 Bax/ND5 복합체의 수준이 극히 낮은 수준을 나타내었으나, 변이체 Bcl-w가 과발현되면, 암세포내에서 Bax/complex-I 복합체 또는 Bax/ND5 복합체의 수준이 현저하게 증가됨을 확인하였다. FIG. 4D is a Western blot analysis image showing the result of confirming the binding of Bax to complex-I (ND5) under the condition that wild type or mutant Bcl-w is overexpressed. As shown in FIG. 4D, when the wild type Bcl-w was overexpressed, the level of the Bax / complex-I complex or the Bax / ND5 complex was extremely low in the cancer cells. However, when the mutant Bcl-w was overexpressed, / complex-I < / RTI > complex or the Bax / ND5 complex was significantly increased.

이처럼, Bcl-w는 Bax와 결합하여 Bax/complex-I(ND5) 반응을 억제할 수 있으므로, Bcl-w는 Bax와 결합하여 complex-I을 활성화시키고, 상기 complex-I으로부터 Bax의 분리를 촉진시키는 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
Thus, since Bcl-w can inhibit the Bax / complex-I (ND5) response by binding to Bax, Bcl-w binds to Bax to activate complex-I and promote the separation of Bax from the complex- The results of this study are as follows.

실시예Example 4-5:  4-5: complexcomplex -I의 활성에 미치는 -I on the activity of p53p53 의 효과Effect of

상기 실시예 4-4의 결과로부터, Bcl-w가 간접적으로 complex-I의 활성을 조절함을 확인하였으므로, 상기 Bcl-w와 결합하여 이의 활성을 조절할 수 있는 p53 역시 간접적으로 complex-I의 활성을 조절할 수 있을 것으로 가정하고, 이를 확인하고자 하였다. 즉, 상기 실시예 1-1에서 수득한 Bcl-w와 결합할 수 있거나 또는 결합할 수 없는 변이체 p53이 2차로 도입된 각각의 세포를 대상으로, complex-I 활성, ΔΨm 수준 및 ATP 수준을 분석하였다(도 4e). From the results of Example 4-4, it was confirmed that Bcl-w indirectly regulates the activity of complex-I. Thus, p53, which can bind to Bcl-w and regulate its activity, And to confirm this. That is, the complex-I activity, ΔΨ m level, and ATP level of each cell into which the mutant p53 that can bind or not bind to Bcl-w obtained in Example 1-1 were secondarily introduced (Fig. 4E).

도 4e는 Bcl-w와 결합할 수 있거나 또는 결합할 수 없는 변이체 p53(p53K305N 또는 p53K305N / R175H)의 발현에 따른 complex-I 활성(좌측), ΔΨm 수준(중간) 및 ATP 수준(우측)을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 4e에서 보듯이, Bcl-w와 결합할 수 있는 변이체 p53(p53K305N)이 과발현된 세포에서는 complex-I의 활성이 저하되고, 이에 따라 ΔΨm과 ATP 수준이 모두 감소하였으나, Bcl-w와 결합할 수 없는 변이체 p53(p53K305N / R175H)이 과발현된 세포에서는 complex-I의 활성, ΔΨm 수준 및 ATP 수준이 모두 대조군과 유사한 수준을 나타냄을 확인하였다.Figure 4e shows the complex-I activity (left), the ΔΨ m level (intermediate) and the ATP level (right side), according to the expression of mutant p53 that can bind or not bind Bcl-w (p53 K305N or p53 K305N / R175H ) ). FIG. As shown in FIG. 4E, in the cells overexpressing the mutant p53 (p53 K305N ) capable of binding to Bcl-w, the activity of complex-I was decreased and both ΔΨ m and ATP levels were decreased. In the cells overexpressing mutant p53 (p53 K305N / R175H ), the complex-I activity, ΔΨ m level and ATP level were all similar to those of the control group.

이처럼, p53은 Bcl-w와 결합하여 Bax/complex-I(ND5) 복합체를 형성할 수 있고, 이에 따라 complex-I을 불활성화시켜서, 결과적으로는 암세포의 침윤을 억제하는 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
Thus, p53 can bind to Bcl-w to form a Bax / complex-I (ND5) complex, thereby inactivating complex-I, resulting in inhibiting the invasion of cancer cells there was.

실시예Example 4-6:  4-6: ND5ND5 와 Wow BaxBax 의 결합에 미치는 On the binding of p53p53 의 효과Effect of

상기 실시예 1-1에서 수득한 Bcl-w와 결합할 수 있거나 또는 결합할 수 없는 변이체 p53이 2차로 도입된 각각의 세포로부터 수득한 세포파쇄물에 항-complex-I 항체 또는 항-Bax 항체를 가하고 면역침전을 수행하여 각각의 침전물을 수득하였으며, 상기 침전물 또는 세포파쇄물을 대상으로 항-p53 항체, 항-Bax 항체 또는 항-ND5 항체를 사용한 웨스턴블럿 분석을 수행하였다(도 4f).The anti-complex-I antibody or the anti-Bax antibody was added to the cell lysate obtained from each cell into which the mutant p53 that can bind or not bind to the Bcl-w obtained in Example 1-1 was secondarily introduced And subjected to immunoprecipitation to obtain respective precipitates. Western blot analysis using anti-p53 antibody, anti-Bax antibody or anti-ND5 antibody was performed on the precipitate or cell lysate (Fig. 4F).

도 4f는 Bcl-w와 결합할 수 있거나 또는 결합할 수 없는 변이체 p53(p53K305N 또는 p53K305N / R175H)의 발현에 따른 Bax와 complex-I(ND5)의 결합여부를 확인한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다. 도 4f에서 보듯이, Bcl-w와 결합할 수 있는 변이체 p53(p53K305N)이 과발현된 세포에서는 Bax/complex-I(ND5) 결합체가 검출되었으나, Bcl-w와 결합할 수 없는 변이체 p53(p53K305N / R175H)이 과발현된 세포에서는 Bax/complex-I(ND5) 결합체가 검출되지 않음을 확인하였다.
Figure 4f is a Western blot analysis showing the binding of complex-I (ND5) with Bax according to the expression of mutant p53 (p53 K305N or p53 K305N / R175H ) that can bind or not bind to Bcl-w It is a photograph. As shown in FIG. 4F, Bax / complex-I (ND5) conjugate was detected in cells overexpressing mutant p53 (p53 K305N ) capable of binding to Bcl-w, but mutant p53 K305N / R175H ) overexpressing Bax / complex-I (ND5) was not detected.

상기 실시예 4-1 내지 4-6의 결과를 종합하면, 암세포내에서 p53은 Bcl-w와 함께 p53/Bcl-w 복합체를 형성하고, 이에 따라 미토콘드리아에서 Bax는 complex-I과 함께 Bax/complex-I 복합체를 형성하며, 결과적으로 세포침윤을 억제함을 알 수 있었다.
The results of Examples 4-1 to 4-6 show that p53 forms p53 / Bcl-w complex with Bcl-w in cancer cells, and thus Bax in mitochondria complexes with Bax / complex -I complex, resulting in inhibition of cell invasion.

실시예Example 5: 암세포 침윤활성에 대한 야생형  5: Wild type for cancer cell infiltration activity p53p53 의 효과Effect of

상기 실시예 1 내지 4에서는, 암세포의 침윤활성에 있어서, 핵에서 발현되는 p53이 세포질에서 작용하는 효과를 검증하기 위하여, 세포질에 축적되는 변이체 p53(p53K305N)을 이용하여 수행하였고, 상기 변이체 p53(p53K305N)이 세포질에서 암세포의 침윤을 억제하는 효과를 나타냄을 확인하였다. 이에, 상기 변이체 p53(p53K305N)이 아닌 야생형 p53도 세포질에서 동일한 효과를 나타낼 수 있는지의 여부를 확인하고자 하였다.
In Examples 1 to 4, the mutant p53 (p53 K305N ) accumulated in the cytoplasm was used to examine the effect of the p53 expressed in the nucleus on the cytosol in the invasion activity of the cancer cells, and the mutant p53 (p53 K305N ) inhibited the invasion of cancer cells in the cytoplasm. Thus, it was tried to confirm whether wild-type p53, which is not the mutant p53 (p53 K305N ), can exhibit the same effect in cytoplasm.

실시예Example 5-1:  5-1: 세포내Intracellular ROSROS 수준에 미치는 야생형  Wild type on the level p53p53 의 효과Effect of

세포질에 야생형 p53이 축적되는 IMR-32 신경아세포종 세포에 2종류의 p53 siRNA를 도입하여 형질도입체를 수득하고, 이를 배양한 다음, 세포내 ROS 수준 및 침윤수준을 비교하였다(도 5a). 이때, 대조군으로는 p53 siRNA가 포함되지 않은 빈 벡터(cRNA)가 도입된 형질도입체를 사용하였다.Two kinds of p53 siRNA were introduced into IMR-32 neuroblastoma cells in which wild type p53 was accumulated in the cytoplasm, and the intracellular ROS level and infiltration level were compared (Fig. 5A) after culturing. At this time, as a control group, a transgenic solid body into which an empty vector (cRNA) without p53 siRNA was introduced was used.

도 5a는 세포질에 p53이 축적되는 IMR-32 신경아세포종 세포에서 야생형 p53의 발현억제에 따른, 세포내 ROS 수준(좌측) 및 침윤수준(우측)의 변화를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 5a에서 보듯이, 세포질에 축적되는 야생형 p53의 발현이 억제되면, 세포내 ROS 수준 및 침윤수준이 증가함을 확인하였다.FIG. 5A is a graph showing the results of analysis of changes in intracellular ROS levels (left) and invasion levels (right) upon inhibition of wild-type p53 expression in IMR-32 neuroblastoma cells in which cytoplasmic p53 accumulates. FIG. As shown in FIG. 5A, when the expression of wild-type p53 accumulated in the cytoplasm was inhibited, it was confirmed that intracellular ROS level and invasion level were increased.

따라서, 변이체 p53(p53K305N)이 아닌 야생형 p53도 세포질에서 ROS 의존적인 세포침윤을 억제하는 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
Thus, wild type p53, which is not a mutant p53 (p53 K305N ), also has an effect of inhibiting ROS-dependent cell infiltration in the cytoplasm.

실시예Example 5-2:  5-2: 세포내Intracellular BaxBax // complexcomplex -I(-I ( ND5ND5 ) 복합체의 형성에 미치는 야생형 ) On the formation of complex p53p53 의 효과Effect of

상기 실시예 5-1에서 얻어진 각각의 형질도입체로부터 각각의 세포파쇄물을 수득한 다음, 상기 수득한 각각의 세포파쇄물에 항-Bax 항체 또는 항-complex-I 항체를 처리하여 면역침전을 수행하고, 이로부터 각각의 침전물을 수득하였으며, 상기 수득한 침전물을 대상으로 항-Bcl-w 항체, 항-Bax 항체, 항-p53 항체 또는 항-ND5 항체를 사용한 웨스턴블럿 분석을 수행하였다(도 5b).Each cell lysate obtained from each of the transformed bodies obtained in Example 5-1 was subjected to immunoprecipitation by treating the cell lysate obtained with the anti-Bax antibody or anti-complex-I antibody , From which each precipitate was obtained and the precipitate obtained was subjected to western blot analysis using anti-Bcl-w antibody, anti-Bax antibody, anti-p53 antibody or anti-ND5 antibody (Figure 5b) .

도 5b는 세포질에 p53이 축적되는 IMR-32 신경아세포종 세포에서 야생형 p53의 발현억제에 따른, 세포질의 Bcl-w/Bax 복합체, Bax/complex-I(ND5) 복합체 수준의 변화를 분석한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다. 도 5b에서 보듯이, 야생형 p53이 발현된 경우에는 세포질에서 Bax/complex-I(ND5) 복합체가 형성되는 반면, 야생형 p53이 발현되지 않는 경우에는 세포질에서 Bcl-w/Bax 복합체가 형성됨을 확인하였다.FIG. 5B shows the results of analysis of changes in cytoplasmic Bcl-w / Bax complex and Bax / complex-I (ND5) complex levels in the IMR-32 neuroblastoma cells, This is a western blot analysis photograph. As shown in FIG. 5B, when wild-type p53 was expressed, Bax / complex-I (ND5) complex was formed in cytoplasm, whereas when wild-type p53 was not expressed, Bcl-w / Bax complex was formed in cytoplasm .

따라서, 변이체 p53(p53K305N)이 아닌 야생형 p53도 세포질에서 Bcl-w와 결합하여 p53/Bcl-w 복합체를 형성하고, 이에 따라 Bax/complex-I(ND5) 복합체 형성을 통하여 세포침윤을 억제하는 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
Thus, wild-type p53, which is not a mutant p53 (p53 K305N ), also binds to Bcl-w in the cytoplasm to form a p53 / Bcl-w complex, thereby inhibiting cell infiltration through Bax / complex-I (ND5) complex formation Effect.

실시예Example 5-3:  5-3: complexcomplex -I 활성에 미치는 야생형 -I activity on wild type p53p53 의 효과Effect of

상기 실시예 5-1에서 얻어진 각각의 형질도입체를 대상으로, complex-I 활성, ΔΨm 수준 및 ATP 수준을 분석하였다(도 5c). Complex-I activity, ΔΨ m level, and ATP level were analyzed for each of the transformed bodies obtained in Example 5-1 (FIG. 5c).

도 5c는 세포질에 p53이 축적되는 IMR-32 신경아세포종 세포에서 야생형 p53의 발현억제에 따른, complex-I 활성(좌측), ΔΨm 수준(중간) 및 ATP 수준(우측)을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 5c에서 보듯이, 야생형 p53의 발현이 억제되면, complex-I의 활성이 증가되고, 이에 따라 ΔΨm과 ATP 수준이 모두 증가함을 확인하였다.FIG. 5c shows the results of analysis of complex-I activity (left), ΔΨ m level (intermediate) and ATP level (right) according to the inhibition of wild-type p53 expression in IMR-32 neuroblastoma cells in which cytoplasmic p53 accumulates Graph. As shown in FIG. 5C, when the expression of wild-type p53 was suppressed, the activity of complex-I was increased, and thus ΔΨ m and ATP levels were both increased.

따라서, 변이체 p53(p53K305N)이 아닌 야생형 p53도 Bcl-w로부터 Bax의 분리를 촉진시켜서, Bax과 complex-I(ND5)의 결합을 야기시키고, 이에 따라 complex-I 활성, ΔΨm 및 ATP 수준을 감소시킬 수 있음을 알 수 있었다.
Thus, wild-type p53 that is not mutant p53 (p53 K305N ) also promotes the separation of Bax from Bcl-w, resulting in the binding of Bax to complex-I (ND5) and thus complex-I activity, ΔΨ m and ATP levels Can be reduced.

실시예Example 5-4:  5-4: BclBcl -w 및 -w and BaxBax 의 기능에 미치는 야생형 Of wild type p53p53 의 효과Effect of

상기 실시예 5-1에서 얻어진 각각의 형질도입체에 Bcl-w siRNA 또는 Bax siRNA를 도입하여 각각의 2차 형질도입체를 제작하고, 이를 배양한 다음, 침윤수준을 비교하였다(도 5d).Bcl-w siRNA or Bax siRNA was introduced into each of the transgenic solid bodies obtained in Example 5-1 to prepare respective secondary transgenic solid bodies, which were cultured and then compared with the invasion levels (Fig. 5d).

도 5d는 세포질에 p53이 축적되는 IMR-32 신경아세포종 세포에서 야생형 p53와 Bcl-w(좌측) 또는 p53와 Bax(우측)의 동시 발현억제에 따른 침윤수준의 변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 5d에서 보듯이, p53의 발현이 억제된 경우에는 침윤수준이 증가함에 반하여, p53와 Bcl-w의 발현이 억제된 경우에는 세포침윤수준이 저하되고, p53와 Bax의 발현이 억제된 경우에는 세포침윤수준이 증가됨을 확인하였다.FIG. 5D is a graph showing the results of comparing changes in invasion level with inhibition of co-expression of wild-type p53 and Bcl-w (left) or p53 and Bax (right) in IMR-32 neuroblastoma cells in which cytoplasmic p53 accumulates . As shown in FIG. 5D, when the expression of p53 and Bcl-w is inhibited, the level of cellular infiltration is lowered and the expression of p53 and Bax is suppressed, while the level of invasion is increased when the expression of p53 is suppressed And the level of cellular infiltration was increased.

따라서, 변이체 p53(p53K305N)이 아닌 야생형 p53도 complex-I의 활성화에 관여하고, 이에 따라, 세포침윤이 조절됨을 알 수 있었다.
Thus, wild-type p53, which is not a mutant p53 (p53 K305N ), is involved in the activation of complex-I, and thus cell infiltration is regulated.

상기 실시예 5-1 내지 5-4의 결과를 종합하면, 암세포의 침윤활성의 조절에 대하여는, 야생형 p53도 변이체 p53(p53K305N)과 동일한 효과를 나타냄을 알 수 있었다.The results of Examples 5-1 to 5-4 above show that wild type p53 has the same effect as mutant p53 (p53 K305N ) in controlling the invasion activity of cancer cells.

실시예Example 6: 암세포 침윤활성에 대한  6: Cancer cell infiltration activity BclBcl -- XX LL 및  And BakLook 의 효과Effect of

상기 실시예 5의 결과로부터, 야생형 p53이 Bcl-w 및 Bax의 상류에서 암세포 침윤활성을 조절함을 확인하였으므로, 상기 Bcl-w 및 Bax의 효과를 다른 단백질로 대체할 수 있는지의 여부를 확인하고자 하였다.
From the results of Example 5, it was confirmed that wild-type p53 regulates cancer cell infiltration activity upstream of Bcl-w and Bax. Thus, it was confirmed whether or not the effect of Bcl-w and Bax could be replaced with other proteins Respectively.

실시예Example 6-1:  6-1: complexcomplex -I 활성에 미치는 -I activity BclBcl -- XX LL 의 효과Effect of

H1299 세포에 Bcl-XL을 코딩하는 벡터를 도입하여 형질도입체를 수득하고, 상기 형질도입체를 대상으로 complex-I 활성, ΔΨm 수준 및 ATP 수준을 분석하였다(도 6a).H1299 cells were transfected with a vector encoding Bcl-X L to obtain a plasmid, and the complex-I activity, ΔΨ m level, and ATP level of the transfected cells were analyzed (FIG. 6A).

도 6a는 Bcl-XL의 발현에 따른, complex-I 활성(좌측), ΔΨm 수준(중간) 및 ATP 수준(우측)을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 6a에서 보듯이, Bcl-XL이 발현되면, complex-I의 활성이 증가되고, 이에 따라 ΔΨm과 ATP 수준이 모두 증가함을 확인하였다.
FIG. 6A is a graph showing the results of analysis of complex-I activity (left), ΔΨ m level (middle), and ATP level (right) according to the expression of Bcl-X L. FIG. As shown in FIG. 6A, when Bcl-X L was expressed, the activity of complex-I was increased, and thus ΔΨ m and ATP levels were both increased.

실시예Example 6-2:  6-2: p53p53 에 대한 For BclBcl -- XX LL 의 효과Effect of

상기 실시예 6-1에서 수득한 형질도입체에 다시 야생형 또는 변이체 p53(p53K305N 또는 p53K305N / R175H)을 코딩하는 벡터를 2차로 도입하여 각각의 형질도입체를 수득하고, 이를 배양후 파쇄하여 각각의 세포파쇄물을 수득하였다. 상기 수득한 각각의 세포파쇄물에 항-Bcl-XL 항체를 가하고 면역침전분석을 수행하여, 침전물을 수득하였다. 상기 수득한 침전물을 대상으로 항-p53 항체 또는 항-Bax 항체를 사용한 웨스턴블럿 분석을 수행하였다(도 6b).A vector encoding wild type or mutant p53 (p53 K305N or p53 K305N / R175H ) was introduced secondarily to the transformed solid obtained in Example 6-1 to obtain respective transformed bodies , which were then cultured and disrupted Each cell lysate was obtained. Anti-Bcl-X L antibody was added to each cell lysate thus obtained, and immunoprecipitation analysis was carried out to obtain a precipitate. Western blot analysis using anti-p53 antibody or anti-Bax antibody was performed on the obtained precipitate (Fig. 6B).

도 6b는 Bcl-XL의 발현에 따른, 야생형 또는 변이된 p53과 Bcl-XL를 포함하는 복합체의 수준을 분석한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다. 도 6b에서 보듯이, 상기 Bcl-XL은 야생형 p53 및 변이체 p53(p53K305N / R175H)과 복합체를 형성하지 않고, 변이체 p53(p53K305N)과 복합체를 형성함을 확인하였다. 또한, 야생형 p53 및 변이체 p53(p53K305N / R175H)이 발현된 조건에서는 상기 Bcl-XL이 Bax와 복합체를 형성함을 확인하였다.
Figure 6b is a photograph of Western blot analysis of the analysis of the level of a complex comprising a wild-type or mutated p53 and Bcl-X L in accordance with the expression of Bcl-X L. As shown in FIG. 6B, it was confirmed that the Bcl-X L complexed with mutant p53 (p53 K305N ) without forming a complex with wild type p53 and mutant p53 (p53 K305N / R175H ). Further, it was confirmed that the Bcl-X L complexed with Bax under the condition that wild-type p53 and mutant p53 (p53 K305N / R175H ) were expressed.

실시예Example 6-3:  6-3: 세포내Intracellular ROSROS 수준에 미치는 야생형 또는  Wild-type or 변이체Mutant p53p53 과 and BclBcl -- XX LL 의 효과Effect of

상기 실시예 6-2에서 수득한 형질도입체를 대상으로 세포내 ROS 수준 및 침윤수준을 비교하였다(도 6c).The intracellular ROS level and infiltration level of the transgenic solid obtained in Example 6-2 were compared (Fig. 6C).

도 6c는 야생형 또는 변이체 p53과 Bcl-XL의 발현에 따른, 세포내 ROS 수준(좌측) 및 침윤수준(우측)의 변화를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 6c에서 보듯이, 야생형 또는 변이체 p53의 발현과는 상관없이, Bcl-XL이 발현된 세포에서는 전체적으로 ROS 수준 및 침윤수준이 증가함을 확인하였다.
FIG. 6C is a graph showing the results of analysis of changes in intracellular ROS levels (left) and invasion levels (right) according to expression of wild-type or mutant p53 and Bcl-X L. FIG. As shown in FIG. 6C, regardless of the expression of wild-type or mutant p53, it was confirmed that the levels of ROS and invasion were increased in cells expressing Bcl-X L as a whole.

실시예Example 6-4:  6-4: complexcomplex -I 활성에 미치는 -I activity BakLook 의 효과Effect of

LoVo 세포에 Bak siRNA를 코딩하는 벡터를 도입하여 형질도입체를 수득하고, 상기 형질도입체를 대상으로 complex-I 활성, ΔΨm 수준 및 ATP 수준을 분석하였다(도 6d).The vector encoding Bak siRNA was introduced into LoVo cells to obtain a plasmid, and the complex-I activity, ΔΨ m level, and ATP level of the transfected cells were analyzed (FIG. 6d).

도 6d는 Bak의 발현억제에 따른, complex-I 활성(좌측), ΔΨm 수준(중간) 및 ATP 수준(우측)을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 6d에서 보듯이, Bak의 발현이 억제되면, complex-I의 활성이 증가되고, 이에 따라 ΔΨm과 ATP 수준이 모두 증가함을 확인하였다.
FIG. 6D is a graph showing the results of analysis of complex-I activity (left), ΔΨ m level (middle) and ATP level (right) according to inhibition of Bak expression. As shown in FIG. 6d, when the expression of Bak was suppressed, the activity of complex-I was increased, and thus it was confirmed that both ΔΨ m and ATP levels were increased.

실시예Example 6-5:  6-5: complexcomplex -I과의 결합활성에 미치는 -I on the binding activity BakLook 의 C-말단 4개 Four C-termini 잔기의Residue 효과 effect

야생형 Bak 또는 Bak의 C-말단 4개 잔기가 결실된 변이체 Bak(BakΔC4)를 코딩하는 pTRE 발현벡터를 LoVo 세포에 도입하여 형질도입체를 수득하고, 상기 수득한 형질도입체에 테트라사이클린(1 ㎍/㎖)을 24시간 동안 처리하면서 배양하여, 도입된 유전자의 발현을 유도하였다. 배양이 종료된 후, 상기 배양된 형질도입체를 파쇄하여 각각의 세포파쇄물을 수득하고, 상기 세포파쇄물에 항-Bak 항체를 가하여 면역침전분석을 수행하였으며, 이로부터 침전물을 수득하였다. 상기 수득한 침전물 또는 세포파쇄물을 대상으로 항-Bak 항체 또는 항-ND5 항체를 사용하여 웨스턴블럿 분석을 수행하였다(도 6e).A pTRE expression vector encoding mutant Bak (Bak DELTA C4) in which the wild-type Bak or the C-terminal four residues of Bak was deleted was introduced into LoVo cells to obtain a transgenic solid, and the obtained transfected tetradecyclin / Ml) was cultured for 24 hours to induce the expression of the introduced gene. After completion of the cultivation, the cultured transformed bodies were disrupted to obtain individual cell lysates. Immunoprecipitation analysis was performed by adding an anti-Bak antibody to the cell lysates, from which a precipitate was obtained. Western blot analysis was performed using anti-Bak antibody or anti-ND5 antibody against the obtained precipitate or cell lysate (Fig. 6E).

도 6e는 Bak의 C-말단 4개 잔기의 존재여부에 따른, Bak와 complex-I(ND5) 결합체의 함량변화를 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다. 상기 도 6e에서 보듯이, 야생형 Bak는 complex-I(ND5)과 결합체를 형성할 수 있으나, Bak의 C-말단 4개 잔기가 결실된 변이체 Bak(BakΔC4)는 complex-I(ND5)과 결합체를 형성하지 못함을 확인하였다.FIG. 6E is a Western blot analysis image showing the result of comparing the contents of Bak and complex-I (ND5) complexes according to the presence of four C-terminal residues of Bak. As shown in FIG. 6E, the wild-type Bak can form a complex with complex-I (ND5), but the mutant Bak (BakΔC4) in which four C-terminal residues of Bak are deleted is complex-I (ND5) .

따라서, Bak는 Bak와 동일하게 C-말단 4개 잔기를 통하여 complex-I(ND5)과 결합체를 형성할 수 있음을 알 수 있었다.
Thus, Bak was able to form a complex with complex-I (ND5) through four C-terminal residues in the same manner as Bak.

실시예Example 6-6: 암세포 침윤활성에 대한  6-6: Cancer cell infiltration activity 변이체Mutant p53p53 및  And BakLook 의 효과Effect of

상기 실시예 6-4에서 수득한 형질전환체에 변이체 p53(p53K305N)을 코딩하는 벡터를 2차로 도입하여 각각의 2차 형질도입체를 수득하고, 상기 수득한 각각의 2차 형질도입체를 대상으로 침윤수준을 비교하였다(도 6f).The vector encoding mutant p53 (p53 K305N ) was secondly introduced into the transformant obtained in Example 6-4 to obtain each second-order transgenic solid, and each of the obtained second-order transgenic solid (Fig. 6F).

도 6f는 변이체 p53(p53K305N)의 발현과 Bak의 발현억제에 따른, 암세포의 침윤수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 6f에서 보듯이, Bak가 정상적으로 발현될 경우에는 변이체 p53의 발현에 의하여 침윤수준이 감소하였으나, Bak의 발현이 억제되면, 변이체 p53의 발현과는 상관없이 침윤수준이 증가함을 확인하였다. FIG. 6F is a graph showing the results of comparing the invasion level of cancer cells with the expression of mutant p53 (p53 K305N ) and the inhibition of Bak expression. As shown in FIG. 6 (f), when Bak was normally expressed, the level of invasion was decreased by the expression of mutant p53. However, when the expression of Bak was inhibited, the level of invasion was increased regardless of the expression of mutant p53.

따라서, 변이체 p53(p53K305N)은 Bak 의존적으로 암세포의 침윤을 억제함을 알 수 있었다.
Thus, mutant p53 (p53 K305N ) inhibited Bak infiltration of cancer cells.

실시예 6-7: Bak / complex -I 복합체의 형성에 미치는 변이체 p53 ( p53K305N )의 효과
Example 6-7: Variants affecting the formation of the Bak / complex- I complex Effect of p53 ( p53 K305N )

상기 실시예 6-4에서 수득한 형질전환체에 변이체 p53(p53K305N 또는 p53K305N/R175H)을 코딩하는 벡터를 2차로 도입하여 각각의 2차 형질도입체를 수득하고, 이로부터 각각의 세포파쇄물을 수득하였다. 상기 수득한 각각의 세포파쇄물에 항-Bcl-w 항체 또는 항-complex-I 항체를 가하여 면역침전분석을 수행하고, 이로부터 각각의 침전물을 수득하였다. 상기 수득한 침전물 또는 세포파쇄물을 대상으로 항-p53 항체 또는 항-Bak 항체를 사용한 웨스턴블럿 분석을 수행하였다(도 6g).The vector encoding the mutant p53 (p53 K305N or p53 K305N / R175H ) was secondly introduced into the transformant obtained in the above Example 6-4 to obtain respective secondary truncation bodies , from which each cell lysate ≪ / RTI > Immunoprecipitation analysis was performed by adding anti-Bcl-w antibody or anti-complex-I antibody to each cell lysate obtained, from which each precipitate was obtained. Western blot analysis using anti-p53 antibody or anti-Bak antibody was performed on the obtained precipitate or cell lysate (Fig. 6G).

도 6g는 변이체 p53(p53K305N 또는 p53K305N / R175H)의 발현에 따른, Bcl-w/Bak 복합체 또는 Bak/complex-I 복합체의 수준을 분석한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다. 도 6g에서 보듯이, 변이체 p53(p53K305N)가 발현된 경우에는 Bak/complex-I 복합체가 형성되는 반면, 변이체 p53(p53K305N / R175H)가 발현된 경우에는 Bcl-w/Bak 복합체가 형성됨을 확인하였다. FIG. 6g is a western blot analysis image showing the results of analysis of the levels of Bcl-w / Bak complex or Bak / complex-I complex according to expression of mutant p53 (p53 K305N or p53 K305N / R175H ). As shown in FIG. 6g, when the mutant p53 (p53 K305N ) is expressed, the Bak / complex-I complex is formed whereas when the mutant p53 (p53 K305N / R175H ) is expressed, the Bcl-w / Bak complex is formed Respectively.

따라서, Bak는 변이체 p53(p53K305N)과 결합하여 complex-I을 활성화시킴을 알 수 있었다.
Thus, Bak was found to activate complex-I by binding to mutant p53 (p53 K305N ).

상기 실시예 6-1 내지 6-7의 결과를 종합하면, 암세포의 침윤억제활성에 관여하는 Bcl-w 및 Bax의 기능은 각각 Bcl-XL 및 Bak로 대체할 수 있음을 알 수 있었다.
In summary, the results of Examples 6-1 to 6-7 show that the functions of Bcl-w and Bax, which are involved in the invasion inhibitory activity of cancer cells, can be replaced by Bcl-X L and Bak, respectively.

실시예Example 7: 핵에서 발현되는  7: expressed in the nucleus p53p53 의 암세포의 침윤에 미치는 효과On the invasion of cancer cells

p53은 전사조절인자로서 알려져 있으므로, 핵에서 암세포의 침윤에 대하여 어떠한 조절효과를 나타내는지를 확인하고자 하였다.
Since p53 is known as a transcriptional regulator, it has been attempted to determine what kind of regulatory effect it has on the invasion of cancer cells in the nucleus.

실시예Example 7-1: 핵에서 발현되는  7-1: Expressed in the nucleus p53p53 의 암세포의 침윤에 관여하는 단백질의 발현수준에 미치는 효과On the expression level of proteins involved in the invasion of cancer cells

H1299세포에 야생형 또는 변이체 p53(p53R175H 또는 p53K305N)을 코딩하는 벡터를 도입하여, 각각의 형질도입체를 수득하고, 상기 수득한 각각의 형질도입체의 핵에서 상기 야생형 또는 변이체 p53을 발현시켰다. 이어, 상기 각각의 형질도입체로부터 세포파쇄물을 수득하고, 항-p53 항체, 항-Bax 항체, 항-Bak 항체, 항-Bcl-w 항체 또는 항-Bcl-XL 항체를 이용한 웨스턴블럿 분석을 수행하였다(도 7a).H1299 cells were transfected with vectors encoding wild-type or mutant p53 (p53 R175H or p53 K305N ) to obtain respective transgenic solid bodies , and the wild-type or mutant p53 was expressed in each of the obtained transgenic solid bodies . Next, the transformants of each Figure to give a cell lysate from the solid, and wherein -p53 antibody, wherein the antibody -Bax, wherein -Bak antibody, wherein -Bcl-w antibody or anti-Western blot analysis using a -Bcl-X L antibody (Fig. 7A).

도 7a는 야생형 또는 변이체 p53(p53R175H 또는 p53K305N)의 발현에 따른, 세포침윤에 관여하는 단백질의 발현수준 변화를 분석한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다. 도 7a에서 보듯이, 야생형 p53이 과발현된 경우에는 세포내 Bax의 발현수준이 특이적으로 증가하였으나, Bak, Bcl-w 또는 Bcl-XL의 수준은 증가되지 않음을 확인하였다.
FIG. 7A is a Western blot analysis image showing a result of analyzing the expression level of a protein involved in cell infiltration according to the expression of wild type or mutant p53 (p53 R175H or p53 K305N ). As shown in FIG. 7A, when the wild-type p53 was overexpressed, the expression level of Bax in the cell was specifically increased, but the level of Bak, Bcl-w or Bcl-X L was not increased.

실시예Example 7-2: 핵에서 발현되는  7-2: Expressed in the nucleus p53p53 의 암세포의 침윤에 미치는 효과On the invasion of cancer cells

상기 실시예 7-1에서 수득한 야생형 또는 변이체 p53(p53R175H)을 코딩하는 벡터를 도입하여 수득한 형질도입체를 대상으로 침윤수준을 비교하였다(도 7b).The infiltration levels of the obtained transgenic plants obtained by introducing the vector encoding wild-type or mutant p53 (p53 R175H ) obtained in Example 7-1 were compared (Fig. 7B).

도 7b는 야생형 또는 변이체 p53(p53R175H)의 발현에 따른, 암세포의 침윤수준의 변화를 나타내는 그래프이다. 도 7b에서 보듯이, 야생형 p53의 발현은 암세포의 침윤수준을 감소시켰으나, 변이체 p53은 암세포의 침윤수준을 오히려 증가시킴을 확인하였다. FIG. 7B is a graph showing the change in the level of invasion of cancer cells with expression of wild-type or mutant p53 (p53 R175H ). As shown in FIG. 7B, the expression of wild-type p53 decreased the invasion level of the cancer cells, but the mutant p53 increased the invasion level of the cancer cells rather.

상기 결과로부터, 암세포의 침윤에 Bax의 발현이 필요함을 알 수 있었다.
From the above results, it was found that the expression of Bax was necessary for invasion of cancer cells.

실시예Example 7-3: 핵에서 발현되는  7-3: Expressed in the nucleus p53p53 과, and, BclBcl -w 또는 -w or BaxBax 의 발현억제가 암세포의 침윤에 미치는 효과Effect of tumor suppressor on the invasion of cancer cells

상기 실시예 7-1에서 수득한 야생형 p53을 코딩하는 벡터를 도입하여 수득한 형질도입체에 다시 Bax siRNA 또는 Blc-w siRNA를 코딩하는 벡터를 도입하여 각각의 2차 형질도입체를 제작하고, 상기 각각의 2차 형질도입체를 대상으로 ROS 수준과 침윤수준을 측정하였다(도 7c).A vector encoding wild-type p53 obtained in Example 7-1 was introduced, and a vector encoding Bax siRNA or Blc-w siRNA was introduced into the obtained transgenic solid to prepare each secondary transgenic solid, ROS levels and infiltration levels were measured for each of the second-order transgenic plants (Fig. 7C).

도 7c는 야생형 p53이 과발현되는 조건에서, Bax 또는 Blc-w의 발현억제에 따른, 세포내 ROS 수준 및 침윤수준의 변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 7c에서 보듯이, 야생형 p53이 과발현되는 조건에서, Bax의 발현이 억제되면 ROS 수준과 침윤수준이 증가되는 반면, Bcl-w의 발현이 억제되면, ROS 수준과 침윤수준이 감소됨을 확인하였다.FIG. 7C is a graph showing the results of comparing changes in intracellular ROS levels and invasion levels with inhibition of Bax or Blc-w expression under the condition that wild-type p53 is overexpressed. As shown in FIG. 7C, when the expression of Bax is suppressed under the condition of overexpression of wild-type p53, the level of ROS and the level of invasion are increased, while that of Bcl-w is suppressed, the level of ROS and the level of invasion are decreased.

앞서 검토한 세포질 p53의 기능은 세포내 Bcl-w와 결합하여, Bax와 Complex-I의 복합체 형성을 촉진시키고, 이에 의하여 complex-I의 기능을 불활성화시키는 것으로 파악하였으므로, p53과 Bax의 연결고리 역할을 수행하는 Bcl-w의 발현이 억제되면, p53의 발현수준에 의하여 ROS 수준 및 침윤수준이 변화되지 않을 것으로 예상되었다. 그러나, 실제로는 Bcl-w의 발현이 억제된 암세포의 핵에서 p53이 과발현되면, ROS 수준 및 침윤수준이 감소하는 결과를 얻었으므로, 핵에서 발현되는 p53은 세포질내 작용기작과는 다른 방식으로 ROS 수준 및 침윤수준에 관여함을 알 수 있었다.
The function of the cytoplasmic p53 examined above was found to bind to intracellular Bcl-w to promote complex formation of Bax and Complex-I, thereby inactivating the function of complex-I. Thus, the linkage between p53 and Bax Inhibited the expression of Bcl-w, it was expected that the level of ROS and invasion level would not be changed by the expression level of p53. However, in fact, when p53 was overexpressed in the nucleus of cancer cells in which the expression of Bcl-w was inhibited, the level of ROS and the level of invasion were decreased. Therefore, p53 expressed in the nucleus was different from that in the cytoplasm, Level and infiltration level.

실시예Example 7-4: 핵에서 발현되는  7-4: Expressed in the nucleus p53p53 의 of BaxBax // complexcomplex -I 복합체 형성에 미치는 효과-I Effect on Complex Formation

상기 실시예 7-1에서 수득한 야생형 또는 변이체 p53(p53R175H)을 코딩하는 벡터를 도입하여 수득한 형질도입체를 파쇄하여 각각의 세포파쇄물을 수득하고, 상기 수득한 각각의 세포파쇄물에 항-complex-I 항체를 가하여 면역침전분석을 수행하였으며, 이로부터 침전물을 수득하였다. 상기 수득한 침전물 또는 세포파쇄물을 대상으로 항-p53 항체 또는 항-Bax 항체를 이용한 웨스턴블럿 분석을 수행하였다(도 7d).A vector encoding the wild type or mutant p53 (p53 R175H ) obtained in the above Example 7-1 was introduced, and the resulting transformed bodies were disrupted to obtain respective cell lysates. To each cell lysate thus obtained, anti- complex-I antibody was added to perform immunoprecipitation analysis, from which a precipitate was obtained. Western blot analysis using anti-p53 antibody or anti-Bax antibody was performed on the obtained precipitate or cell lysate (Fig. 7D).

도 7d는 야생형 또는 변이체 p53(p53R175H)의 발현에 따른, Bax/complex-I 복합체 수준의 변화를 분석한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다. 도 7d에서 보듯이, 야생형 p53이 과발현되면 Bax/complex-I 복합체가 형성되었으나, 변이체 p53이 과발현되면, Bax/complex-I 복합체가 형성되지 않음을 확인하였다.
FIG. 7d is a western blot analysis showing the results of analysis of changes in the Bax / complex-I complex level due to the expression of wild-type or mutant p53 (p53 R175H ). As shown in FIG. 7D, when the wild type p53 was overexpressed, the Bax / complex-I complex was formed. However, when the mutant p53 was overexpressed, it was confirmed that the Bax / complex-I complex was not formed.

실시예Example 7-5: 핵에서 발현되는  7-5: Expressed in the nucleus p53p53 의 of complexcomplex -I 활성에 미치는 효과-I Effect on activity

상기 실시예 7-4에서 수득한 형질도입체를 대상으로 complex-I 활성, ΔΨm 수준 및 ATP 수준을 분석하였다(도 7e).Complex-I activity, ΔΨ m level and ATP level were analyzed for the transformed solid obtained in Example 7-4 (FIG. 7e).

도 7e는 야생형 또는 변이체 p53(p53R175H)의 발현에 따른, complex-I 활성(좌측), ΔΨm 수준(중간) 및 ATP 수준(우측)을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 7e에서 보듯이, 야생형 p53이 과발현되면 complex-I의 활성이 감소되고, 이에 따라 ΔΨm과 ATP 수준이 모두 감소하였으나, 변이체 p53이 과발현되면, complex-I의 활성이 증가되고, 이에 따라 ΔΨm과 ATP 수준이 모두 증가함을 확인하였다.
FIG. 7E is a graph showing the results of analysis of complex-I activity (left), ΔΨ m level (middle) and ATP level (right) according to expression of wild type or mutant p53 (p53 R175H ). As shown in FIG. 7 (e), overexpression of wild-type p53 decreased the activity of complex-I, thereby decreasing both ΔΨ m and ATP levels. However, when mutant p53 was overexpressed, the activity of complex-I increased, m and ATP levels were increased.

상기 실시예 7-1 내지 7-5의 결과를 종합하면, 핵에서 발현된 p53은 Bax의 발현을 유도한 다음, Bax/complex-I 복합체 형성을 유발시키고, ROS의 생성을 억제함으로써 세포침윤을 억제함을 시사한다.
Taken together, the results of Examples 7-1 to 7-5 show that nucleated p53 induces Bax expression, induces Bax / complex-I complex formation, inhibits ROS production, .

실시예Example 8: 이식종양 동물모델을 통한 검증 8: Verification by transplantation tumor animal model

실시예Example 8-1: 이식종양 동물모델의 제작 8-1: Production of transplantation tumor animal model

야생형 또는 변이체 Bcl-w(G94A)를 코딩하는 pEGFP-C 벡터, 야생형 Bcl-w와 p53을 코딩하는 pEGFP-C 벡터, 야생형 Bcl-w와 변이체 p53(R175H)를 코딩하는 pEGFP-C 벡터, 야생형 Bcl-w와 변이체 p53(K305N)를 코딩하는 pEGFP-C 벡터 또는 야생형 Bcl-w와 변이체 p53(K305N/R175H)를 코딩하는 pEGFP-C 벡터가 각각 도입된 H460 세포를 마우스에 도입하여 각각의 이식종양 동물모델을 제작하였다.
PEGFP-C vector encoding wild type or mutant Bcl-w (G94A), pEGFP-C vector encoding wild type Bcl-w and p53, pEGFP-C vector encoding wild type Bcl-w and mutant p53 (R175H) H460 cells transfected with pEGFP-C vector encoding Bcl-w and mutant p53 (K305N) or pEGFP-C vector encoding wild-type Bcl-w and mutant p53 (K305N / R175H) A tumor animal model was constructed.

실시예Example 8-2: 이식종양 동물모델의  8-2: Transplantation of tumor animal models 종양부피Tumor volume 변화 분석 Change analysis

상기 실시예 8-1에서 제작된 각각의 이식종양 동물모델을 14일 동안 사육하면서, 이식된 종양의 부피변화를 측정하였다(도 8a).Each transplant tumor animal model prepared in Example 8-1 was cultivated for 14 days, and the volume change of the transplanted tumor was measured (Fig. 8A).

도 8a는 야생형 또는 변이체 p53 또는 Bcl-w가 도입된 이식종양 동물모델에서 시간의 경과에 따른 종양의 부피변화를 나타내는 그래프이다. 도 8a에서 보듯이, 도입된 유전자에 따른 종양부피의 변화는 나타나지 않음을 확인하였다.
8A is a graph showing tumor volume change over time in an animal model of transplantation tumor in which wild-type or mutant p53 or Bcl-w was introduced. As shown in FIG. 8A, it was confirmed that the tumor volume did not change according to the introduced gene.

실시예Example 8-3: 이식종양 동물모델에서  8-3: In a transplantation tumor animal model BclBcl -w와 관련된 종양세포의 of tumor cells associated with -w 혈관침투성Vascular permeability 분석 analysis

상기 실시예 8-2에서 사육된 각 이식종양 동물모델 중에서, 야생형 또는 변이체 Bcl-w(G94A)를 코딩하는 pEGFP-C 벡터가 도입된 이식종양 동물모델로부터 혈액을 채취하고, 상기 혈액에 포함된 세포의 핵을 DAPI로 염색한 다음, GFP-양성 및 DAPI-양성을 나타내는 세포를 혈관에 침투한 종양세포로 간주하였으며, 상기 혈액에 포함된 종양세포를 계수하여, 종양세포의 혈관침투성을 분석하였다(도 8b).Among the angled tumor animal models raised in Example 8-2, blood was collected from an animal model of grafted tumor in which a pEGFP-C vector coding for wild type or mutant Bcl-w (G94A) was introduced, The nuclei of the cells were stained with DAPI, and the cells showing GFP-positive and DAPI-positive were regarded as tumor cells infiltrating into the blood vessels. Tumor cells contained in the blood were counted to analyze the vascular permeability of the tumor cells (Fig. 8B).

도 8b는 야생형 또는 변이체 Bcl-w(G94A)의 과발현에 따른, 종양세포의 혈관침투성을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 8b에서 보듯이, 야생형 Bcl-w가 과발현된 이식종양 동물모델에서는 종양세포의 혈관침투성이 대조군에 비하여 높은 수준으로 증가하였으나, 변이체 Bcl-w가 과발현된 이식종양 동물모델에서는 종양세포의 혈관침투성이 대조군과 유사한 수준을 나타냄을 확인하였다.FIG. 8B is a graph showing the results of comparing vascular permeability of tumor cells with overexpression of wild-type or mutant Bcl-w (G94A). FIG. As shown in FIG. 8B, the vascular permeability of tumor cells was increased to a higher level than that of the control cells in the wild type Bcl-w overexpressed transplant tumor animal model, but in the transplanted tumor animal model in which mutant Bcl-w was overexpressed, Was similar to that of the control group.

앞서 확인된 바와 같이, Bcl-w는 Bax와 결합하여 Bcl-w/Bax 복합체를 형성함으로써, complex-I을 활성화시키고, 이에 따라 암세포의 침윤수준을 증가시킴을 확인하였으므로, 상기 증가된 종양세포의 혈관침투성은 이러한 암세포 침윤수준의 증가에 의하여 야기된 것임을 알 수 있었다.
As previously confirmed, Bcl-w was found to bind to Bax to form a Bcl-w / Bax complex, thereby activating complex-I, thereby increasing the level of invasion of cancer cells. Vascular permeability was found to be caused by an increase in the level of cancer cell infiltration.

실시예Example 8-4: 이식종양 동물모델에서  8-4: In a transplantation tumor animal model BclBcl -w 및 -w and p53p53 과 관련된 종양세포의 Of tumor cells associated with 혈관blood vessel 침투성 분석Permeability analysis

상기 실시예 8-2에서 사육된 각 이식종양 동물모델 중에서, 야생형 Bcl-w와, 야생형 또는 변이체 p53(R175H, K305N 또는 K305N/R175H)을 코딩하는 pEGFP-C 벡터가 도입된 이식종양 동물모델로부터 혈액을 채취하고, 상기 혈액에 포함된 세포의 핵을 DAPI로 염색한 다음, GFP-양성 및 DAPI-양성을 나타내는 세포를 혈관에 침투한 종양세포로 간주하였으며, 상기 혈액에 포함된 종양세포를 계수하여, 종양세포의 혈관침투성을 분석하였다(도 8c).Among the angiotomized tumor animal models raised in Example 8-2, from the transplantation tumor animal model into which wild-type Bcl-w and pEGFP-C vector encoding wild type or mutant p53 (R175H, K305N or K305N / R175H) Blood was collected, the nuclei of the cells contained in the blood were stained with DAPI, and the cells showing GFP-positive and DAPI-positive were regarded as tumor cells infiltrating into blood vessels. The tumor cells contained in the blood were counted , And the vascular permeability of the tumor cells was analyzed (Fig. 8C).

도 8c는 야생형 Bcl-w와, 야생형 또는 변이체 p53(R175H, K305N 또는 K305N/R175H)의 과발현에 따른, 종양세포의 혈관침투성을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 8c에서 보듯이, 야생형 Bcl-w가 과발현됨과 동시에 야생형 또는 변이체 p53(K305N)이 과발현된 이식종양 동물모델에서는 종양세포의 혈관침투성이 대조군보다 현저히 감소하였으나, 야생형 Bcl-w가 과발현됨과 동시에 변이체 p53(R175H 또는 K305N/R175H)이 과발현된 이식종양 동물모델에서는 종양세포의 혈관침투성이 대조군과 유사한 수준을 나타냄을 확인하였다.8C is a graph showing the results of comparison of vascular permeability of tumor cells with overexpression of wild-type Bcl-w and wild-type or mutant p53 (R175H, K305N or K305N / R175H). As shown in FIG. 8 (c), the vascular permeability of tumor cells was significantly lowered in wild-type or mutant p53 (K305N) overexpressed animal model, while wild-type Bcl-w was overexpressed and mutant The vascular permeability of tumor cells was similar to that of the control group in the transplanted tumor animal model in which p53 (R175H or K305N / R175H) was overexpressed.

앞서 확인된 바와 같이, p53은 Bcl-w와 결합하여 p53/Bcl-w 복합체를 형성하고, 이에 따라 Bax는 complex-I과 함께 Bax/complex-I 복합체를 형성하여 complex-I을 불활성화시키며, 이에 따라 암세포의 침윤수준을 감소시킴을 확인하였으므로, 상기 감소된 종양세포의 혈관침투성은 이러한 암세포 침윤수준의 감소에 의하여 야기된 것임을 알 수 있었다.
As previously noted, p53 binds to Bcl-w to form the p53 / Bcl-w complex, thus Bax forms a Bax / complex-I complex with complex-I to inactivate complex-I, As a result, it was confirmed that the reduced permeability of the tumor cells was caused by the decrease of the invasion level of the cancer cells.

상술한 실시예 1 내지 8의 결과를 종합하면, 도 9a 및 9b에 도시된 바와 같이, p53이 암세포의 침윤을 억제할 수 있음을 알 수 있었다.As can be seen from the results of Examples 1 to 8, it can be seen that p53 can inhibit the invasion of cancer cells, as shown in Figs. 9A and 9B.

도 9a는 암세포의 침윤에 미치는 세포질 p53의 작용기작을 나타내는 개략도이다. 도 9a에서 보듯이, 암세포의 세포질에 축적된 p53은 미토콘드리아의 외막에서 Bcl-w와 결합하여 복합체를 형성하고, 핵에서 발현된 p53은 Bax의 발현을 촉진시키며, 상기 발현된 Bax는 미토콘드리아의 내막에 결합된 complex-I과 결합하여, complex-I을 불활성화 시킴으로써 암세포의 침윤수준을 감소시킨다, 반면, 세포질내 p53이 존재하지 않은 경우에는 미토콘드리아의 외막에서 Bcl-w와 Bax가 결합하여 복합체를 형성하여 complex-I을 활성화시키고, 이에 따라 세포내 ROS 수준이 증가하여 암세포의 침윤수준을 증가시킨다. FIG. 9A is a schematic diagram showing the action mechanism of cytoplasmic p53 on invasion of cancer cells. FIG. As shown in FIG. 9A, p53 accumulated in the cytoplasm of cancer cells binds to Bcl-w in the outer membrane of mitochondria to form a complex, p53 expressed in the nucleus promotes expression of Bax, and the expressed Bax expresses the intima of mitochondria In contrast, in the absence of cytoplasmic p53, Bcl-w and Bax bind in the outer membrane of the mitochondria, resulting in complexes. And activate complex-I, thereby increasing intracellular ROS levels, thereby increasing the invasion level of cancer cells.

도 9b는 미토콘드리아 막에 위치한 Bax와 complex-I의 위치를 나타내는 개략도이다. 도 9b에서 보듯이, Bax는 미토콘드리아의 외막에 위치하고, C-말단의 4개 잔기를 미토콘드리아의 외막과 내막사이의 막간공간에 노출시키며, complex-I은 미토콘드리아의 내막에 위치하고, 이에 포함된 ND5 서브유닛은 상기 Bax의 C-말단 4개 잔기와 결합가능한 위치에 존재한다. 따라서, Bax의 C-말단의 4개 잔기와 complex-I의 ND5 서브유닛을 통하여, Bax/complex-I 복합체를 형성할 수 있다.
FIG. 9B is a schematic diagram showing the position of complex-I with Bax located in the mitochondrial membrane. FIG. As shown in FIG. 9B, Bax is located in the outer membrane of mitochondria and exposes four C-terminal residues to the inter-membrane space between the outer membrane and the inner membrane of mitochondria. Complex-I is located in the inner membrane of mitochondria, The unit is in a position capable of binding with the four C-terminal residues of Bax. Thus, the Bax / complex-I complex can be formed through the four C-terminal residues of Bax and the ND5 subunit of complex-I.

따라서, 상기 복합체의 형성을 억제할 수 있는 물질이 있다면, 이는 암세포의 침윤을 억제하는 암전이 치료제로 이용될 수 있음을 뒷받침하는 것이다.
Therefore, if there is a substance capable of inhibiting the formation of the complex, it is supported that cancer metastasis suppressing invasion of cancer cells can be used as a therapeutic agent.

<110> KOREA INSTITUTE OF RADIOLOGICAL & MEDICAL SCIENCES <120> Method for screening agent against cancer metastasis using Bax/complex-I <130> KPA141228-KR <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 393 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant p53 <400> 1 Met Glu Glu Pro Gln Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro Pro Leu Ser Gln 1 5 10 15 Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu 20 25 30 Ser Pro Leu Pro Ser Gln Ala Met Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp 35 40 45 Asp Ile Glu Gln Trp Phe Thr Glu Asp Pro Gly Pro Asp Glu Ala Pro 50 55 60 Arg Met Pro Glu Ala Ala Pro Pro Val Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro 65 70 75 80 Thr Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser Trp Pro Leu Ser Ser Ser 85 90 95 Val Pro Ser Gln Lys Thr Tyr Gln Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly 100 105 110 Phe Leu His Ser Gly Thr Ala Lys Ser Val Thr Cys Thr Tyr Ser Pro 115 120 125 Ala Leu Asn Lys Met Phe Cys Gln Leu Ala Lys Thr Cys Pro Val Gln 130 135 140 Leu Trp Val Asp Ser Thr Pro Pro Pro Gly Thr Arg Val Arg Ala Met 145 150 155 160 Ala Ile Tyr Lys Gln Ser Gln His Met Thr Glu Val Val Arg Arg Cys 165 170 175 Pro His His Glu Arg Cys Ser Asp Ser Asp Gly Leu Ala Pro Pro Gln 180 185 190 His Leu Ile Arg Val Glu Gly Asn Leu Arg Val Glu Tyr Leu Asp Asp 195 200 205 Arg Asn Thr Phe Arg His Ser Val Val Val Pro Tyr Glu Pro Pro Glu 210 215 220 Val Gly Ser Asp Cys Thr Thr Ile His Tyr Asn Tyr Met Cys Asn Ser 225 230 235 240 Ser Cys Met Gly Gly Met Asn Arg Arg Pro Ile Leu Thr Ile Ile Thr 245 250 255 Leu Glu Asp Ser Ser Gly Asn Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val 260 265 270 Arg Val Cys Ala Cys Pro Gly Arg Asp Arg Arg Thr Glu Glu Glu Asn 275 280 285 Leu Arg Lys Lys Gly Glu Pro His His Glu Leu Pro Pro Gly Ser Thr 290 295 300 Lys Arg Ala Leu Pro Asn Asn Thr Ser Ser Ser Pro Gln Pro Lys Lys 305 310 315 320 Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile Arg Gly Arg Glu 325 330 335 Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp 340 345 350 Ala Gln Ala Gly Lys Glu Pro Gly Gly Ser Arg Ala His Ser Ser His 355 360 365 Leu Lys Ser Lys Lys Gly Gln Ser Thr Ser Arg His Lys Lys Leu Met 370 375 380 Phe Lys Thr Glu Gly Pro Asp Ser Asp 385 390 <210> 2 <211> 193 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant Bcl-w <400> 2 Met Ala Thr Pro Ala Ser Ala Pro Asp Thr Arg Ala Leu Val Ala Asp 1 5 10 15 Phe Val Gly Tyr Lys Leu Arg Gln Lys Gly Tyr Val Cys Gly Ala Gly 20 25 30 Pro Gly Glu Gly Pro Ala Ala Asp Pro Leu His Gln Ala Met Arg Ala 35 40 45 Ala Gly Asp Glu Phe Glu Thr Arg Phe Arg Arg Thr Phe Ser Asp Leu 50 55 60 Ala Ala Gln Leu His Val Thr Pro Gly Ser Ala Gln Gln Arg Phe Thr 65 70 75 80 Gln Val Ser Asp Glu Leu Phe Gln Gly Gly Pro Asn Trp Gly Arg Leu 85 90 95 Val Ala Phe Phe Val Phe Gly Ala Ala Leu Cys Ala Glu Ser Val Asn 100 105 110 Lys Glu Met Glu Pro Leu Val Gly Gln Val Gln Glu Trp Met Val Ala 115 120 125 Tyr Leu Glu Thr Arg Leu Ala Asp Trp Ile His Ser Ser Gly Gly Trp 130 135 140 Ala Glu Phe Thr Ala Leu Tyr Gly Asp Gly Ala Leu Glu Glu Ala Arg 145 150 155 160 Arg Leu Arg Glu Gly Asn Trp Ala Ser Val Arg Thr Val Leu Thr Gly 165 170 175 Ala Val Ala Leu Gly Ala Leu Val Thr Val Gly Ala Phe Phe Ala Ser 180 185 190 Lys <210> 3 <211> 221 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant Bax <400> 3 Met Asp Gly Ser Gly Glu Gln Pro Arg Gly Gly Gly Pro Thr Ser Ser 1 5 10 15 Glu Gln Ile Met Lys Thr Gly Ala Leu Leu Leu Gln Gly Phe Ile Gln 20 25 30 Asp Arg Ala Gly Arg Met Gly Gly Glu Ala Pro Glu Leu Ala Leu Asp 35 40 45 Pro Val Pro Gln Asp Ala Ser Thr Lys Lys Leu Ser Glu Cys Leu Lys 50 55 60 Arg Ile Gly Asp Glu Leu Asp Ser Asn Met Glu Leu Gln Arg Met Ile 65 70 75 80 Ala Ala Val Asp Thr Asp Ser Pro Arg Glu Val Phe Phe Arg Val Ala 85 90 95 Ala Asp Met Phe Ser Asp Gly Asn Phe Asn Trp Gly Arg Val Val Ala 100 105 110 Leu Phe Tyr Phe Ala Ser Lys Leu Val Leu Lys Ala Leu Cys Thr Lys 115 120 125 Val Pro Glu Leu Ile Arg Thr Ile Met Gly Trp Thr Leu Asp Phe Leu 130 135 140 Arg Glu Arg Leu Leu Gly Trp Ile Gln Asp Gln Gly Gly Trp Gly Leu 145 150 155 160 Pro Leu Ala Glu Ser Leu Lys Arg Leu Met Ser Leu Ser Pro Gly Arg 165 170 175 Pro Pro Leu Leu Leu Trp Asp Ala His Val Ala Asp Arg Asp His Leu 180 185 190 Cys Gly Gly Ser Ala His Arg Leu Thr His His Leu Glu Glu Asp Gly 195 200 205 Leu Arg Pro Pro Ala Ala Leu Asp Cys Val Phe Pro Pro 210 215 220 <210> 4 <211> 577 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant ND5 <400> 4 Met Lys Asn Met Ile Cys Leu Ile Ser Phe Phe Phe Leu Phe Leu Phe 1 5 10 15 Ser Leu Met Asn Phe Met Phe Phe Ile Tyr Phe Ile Met Asn Asp Leu 20 25 30 Met Tyr Phe Leu Glu Trp Glu Ile Ile Cys Phe Asn Ser Met Asn Ile 35 40 45 Leu Tyr Ser Val Leu Leu Asp Trp Met Ser Phe Leu Phe Met Met Phe 50 55 60 Val Ser Leu Ile Ser Ser Val Val Ile Tyr Tyr Ser Lys Ser Tyr Met 65 70 75 80 Ser Ser Glu Lys Asn Leu Ile Arg Phe Ile Ile Leu Val Leu Leu Phe 85 90 95 Val Phe Ser Met Met Met Leu Ile Ile Ser Pro Asn Ile Ile Ser Ile 100 105 110 Leu Leu Gly Trp Asp Gly Leu Gly Leu Val Ser Tyr Cys Leu Val Ile 115 120 125 Tyr Tyr Gln Asn Ile Lys Ser Tyr Asn Ala Gly Met Leu Thr Ala Leu 130 135 140 Ser Asn Arg Val Gly Asp Val Phe Ile Leu Ile Val Ile Ser Trp Met 145 150 155 160 Met Asn Tyr Gly Ser Trp Asn Tyr Ile Phe Tyr Leu Asn Phe Met Lys 165 170 175 Asn Asp Phe Ser Met Met Met Val Met Phe Met Ile Ile Ile Ala Ser 180 185 190 Met Thr Lys Ser Ala Gln Ile Pro Phe Ser Ser Trp Leu Pro Ala Ala 195 200 205 Met Ala Ala Pro Thr Pro Val Ser Ala Leu Val His Ser Ser Thr Leu 210 215 220 Val Thr Ala Gly Val Tyr Leu Leu Ile Arg Phe Asn Glu Leu Leu Val 225 230 235 240 Met Ser Ile Phe Phe Lys Ile Leu Leu Ile Leu Ser Gly Leu Thr Met 245 250 255 Phe Met Ala Gly Val Ser Ala Asn Tyr Glu Phe Asp Leu Lys Lys Ile 260 265 270 Ile Ala Leu Ser Thr Leu Ser Gln Leu Gly Leu Met Met Ser Ile Leu 275 280 285 Ser Met Gly Phe Ser Asp Leu Ala Phe Phe His Leu Leu Thr His Ala 290 295 300 Met Phe Lys Ala Leu Leu Phe Met Cys Ala Gly Val Ile Ile His Met 305 310 315 320 Met Val Asp Ile Gln Asp Ile Arg Phe Met Gly Lys Met Ser Asn Phe 325 330 335 Ile Pro Leu Thr Cys Leu Cys Leu Asn Ile Ser Asn Leu Ser Leu Cys 340 345 350 Gly Ile Pro Phe Leu Ser Gly Phe Tyr Ser Lys Asp Leu Ile Leu Glu 355 360 365 Val Val Ser Met Ser Ser Leu Asn Phe Phe Ile Tyr Leu Leu Tyr Tyr 370 375 380 Val Ser Thr Gly Leu Thr Met Phe Tyr Thr Ile Arg Leu Leu Phe Tyr 385 390 395 400 Thr Met Ile Asn Asp Phe Asn Leu Met Ser Ile Tyr Asn Leu Tyr Asp 405 410 415 Glu Asp Phe Ile Met Leu Lys Ser Met Phe Val Leu Leu Phe Met Ser 420 425 430 Leu Ile Ser Gly Ser Leu Leu Met Trp Leu Ile Phe Tyr Lys Pro Tyr 435 440 445 Met Ile Tyr Leu Ser Leu Asn Met Lys Phe Met Val Ile Tyr Val Ile 450 455 460 Leu Leu Gly Met Phe Leu Gly Tyr Leu Ile Ser Asn Met Asn Ile Tyr 465 470 475 480 Ser Leu Asn Lys Tyr Leu Tyr Thr Tyr Lys Leu Ser Asn Phe Leu Ser 485 490 495 Thr Met Trp Phe Met Pro Asn Leu Ser Thr Tyr Gly Leu Asn Tyr Tyr 500 505 510 Phe Leu Asn Tyr Gly Phe Leu Leu Leu Lys Ile Leu Asp Phe Gly Trp 515 520 525 Met Glu Leu Tyr Ser Gly Gln Gly Met Phe Lys Ile Leu Lys Asn Tyr 530 535 540 Ser Leu Leu Tyr Gln Phe Phe Gln Leu Asn Asn Phe Lys Ile Tyr Leu 545 550 555 560 Phe Ser Phe Phe Met Trp Met Leu Phe Tyr Leu Ile Ile Phe Met Met 565 570 575 Tyr <210> 5 <211> 621 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant Bax <400> 5 tcacgtgacc cgggcgcgct gcggccgccc gcgcggaccc ggcgagaggc ggcggcggga 60 gcggcggtga tggacgggtc cggggagcag cccagaggcg ggggatgatt gccgccgtgg 120 acacagactc cccccgagag gtctttttcc gagtggcagc tgacatgttt tctgacggca 180 acttcaactg gggccgggtt gtcgcccttt tctactttgc cagcaaactg gtgctcaagg 240 ccctgtgcac caaggtgccg gaactgatca gaaccatcat gggctggaca ttggacttcc 300 tccgggagcg gctgttgggc tggatccaag accagggtgg ttgggacggc ctcctctcct 360 actttgggac gcccacgtgg cagaccgtga ccatctttgt ggcgggagtg ctcaccgcct 420 cactcaccat ctggaagaag atgggctgag gcccccagct gccttggact gtgtttttcc 480 tccataaatt atggcatttt tctgggaggg gtggggattg ggggacgtgg gcatttttct 540 tacttttgta attattgggg ggtgtgggga agagtggtct tgagggggta ataaacctcc 600 ttcgggacac aaaaaaaaaa a 621 <110> KOREA INSTITUTE OF RADIOLOGICAL & MEDICAL SCIENCES <120> Method for Screening Agent Against Cancer Metastasis using          Bax / complex-I <130> KPA141228-KR <160> 5 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 393 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant p53 <400> 1 Met Glu Glu Pro Gln Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro Pro Leu Ser Gln   1 5 10 15 Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu              20 25 30 Ser Pro Leu Pro Ser Gln Ala Met Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp          35 40 45 Asp Ile Glu Gln Trp Phe Thr Glu Asp Pro Gly Pro Asp Glu Ala Pro      50 55 60 Arg Met Pro Glu Ala Pro Pro Ala Pro Pro Ala Pro Pro Ala Pro Pro  65 70 75 80 Thr Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser Trp Pro Leu Ser Ser Ser                  85 90 95 Val Ser Ser Gln Lys Thr Tyr Gln Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly             100 105 110 Phe Leu His Ser Gly Thr Ala Lys Ser Val Thr Cys Thr Tyr Ser Pro         115 120 125 Ala Leu Asn Lys Met Phe Cys Gln Leu Ala Lys Thr Cys Pro Val Gln     130 135 140 Leu Trp Val Asp Ser Thr Pro Pro Gly Thr Arg Val Arg Ala Met 145 150 155 160 Ala Ile Tyr Lys Gln Ser Gln His Met Thr Glu Val Val Arg Arg Cys                 165 170 175 Pro His His Glu Arg Cys Ser Asp Ser Asp Gly Leu Ala Pro Pro Gln             180 185 190 His Leu Ile Arg Val Glu Gly Asn Leu Arg Val Glu Tyr Leu Asp Asp         195 200 205 Arg Asn Thr Phe Arg His Ser Val Val Val Pro Tyr Glu Pro Pro Glu     210 215 220 Val Gly Ser Asp Cys Thr Thr Ile His Tyr Asn Tyr Met Cys Asn Ser 225 230 235 240 Ser Cys Met Gly Gly Met Asn Arg Arg Pro Ile Leu Thr Ile Ile Thr                 245 250 255 Leu Glu Asp Ser Ser Gly Asn Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val             260 265 270 Arg Val Cys Ala Cys Pro Gly Arg Asp Arg Arg Thr Glu Glu Glu Asn         275 280 285 Leu Arg Lys Lys Gly Glu Pro His His Glu Leu Pro Pro Gly Ser Thr     290 295 300 Lys Arg Ala Leu Pro Asn Asn Thr Ser Ser Ser Pro Gln Pro Lys Lys 305 310 315 320 Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile Arg Gly Arg Glu                 325 330 335 Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp             340 345 350 Ala Gln Ala Gly Lys Glu Pro Gly Gly Ser Ser Ala His Ser Ser His         355 360 365 Leu Lys Ser Lys Lys Gly Gln Ser Thr Ser Arg His Lys Lys Leu Met     370 375 380 Phe Lys Thr Glu Gly Pro Asp Ser Asp 385 390 <210> 2 <211> 193 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant Bcl-w <400> 2 Met Ala Thr Pro Ala Ser Ala Pro Asp Thr Arg Ala Leu Val Ala Asp   1 5 10 15 Phe Val Gly Tyr Lys Leu Arg Gln Lys Gly Tyr Val Cys Gly Ala Gly              20 25 30 Pro Gly Glu Gly Pro Ala Ala Asp Pro Leu His Gln Ala Met Arg Ala          35 40 45 Ala Gly Asp Glu Phe Glu Thr Arg Phe Arg Arg Thr Phe Ser Asp Leu      50 55 60 Ala Ala Gln Leu His Val Thr Pro Gly Ser Ala Gln Gln Arg Phe Thr  65 70 75 80 Gln Val Ser Asp Glu Leu Phe Gln Gly Gly Pro Asn Trp Gly Arg Leu                  85 90 95 Val Ala Phe Phe Val Phe Gly Ala Ala Leu Cys Ala Glu Ser Val Asn             100 105 110 Lys Glu Met Glu Pro Leu Val Gly Gln Val Gln Glu Trp Met Val Ala         115 120 125 Tyr Leu Glu Thr Arg Leu Ala Asp Trp Ile His Ser Ser Gly Gly Trp     130 135 140 Ala Glu Phe Thr Ala Leu Tyr Gly Asp Gly Ala Leu Glu Glu Ala Arg 145 150 155 160 Arg Leu Arg Glu Gly Asn Trp Ala Ser Val Arg Thr Val Leu Thr Gly                 165 170 175 Ala Val Ala Leu Gly Ala Leu Val Thr Val Gly Ala Phe Phe Ala Ser             180 185 190 Lys     <210> 3 <211> 221 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant Bax <400> 3 Met Asp Gly Ser Gly Glu Gln Pro Arg Gly Gly Gly Pro Thr Ser Ser   1 5 10 15 Glu Gln Ile Met Lys Thr Gly Ala Leu Leu Leu Gln Gly Phe Ile Gln              20 25 30 Asp Arg Ala Gly Arg Met Gly Gly Glu Ala Pro Glu Leu Ala Leu Asp          35 40 45 Pro Val Pro Gln Asp Ala Ser Thr Lys Lys Leu Ser Glu Cys Leu Lys      50 55 60 Arg Ile Gly Asp Glu Leu Asp Ser Asn Met Glu Leu Gln Arg Met Ile  65 70 75 80 Ala Ala Val Asp Thr Asp Ser Pro Arg Glu Val Phe Phe Arg Val Ala                  85 90 95 Ala Asp Met Phe Ser Asp Gly Asn Phe Asn Trp Gly Arg Val Val Ala             100 105 110 Leu Phe Tyr Phe Ala Ser Lys Leu Val Leu Lys Ala Leu Cys Thr Lys         115 120 125 Val Pro Glu Leu Ile Arg Thr Ile Met Gly Trp Thr Leu Asp Phe Leu     130 135 140 Arg Glu Arg Leu Leu Gly Trp Ile Gln Asp Gln Gly Gly Trp Gly Leu 145 150 155 160 Pro Leu Ala Glu Ser Leu Lys Arg Leu Met Ser Leu Ser Pro Gly Arg                 165 170 175 Pro Pro Leu Leu Leu Trp Asp Ala His Val Ala Asp Arg Asp His Leu             180 185 190 Cys Gly Gly Ser Ala His Arg Leu Thr His Leu Glu Glu Asp Gly         195 200 205 Leu Arg Pro Pro Ala Ala Leu Asp Cys Val Phe Pro Pro     210 215 220 <210> 4 <211> 577 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant ND5 <400> 4 Met Lys Asn Met Ile Cys Leu Ile Ser Phe Phe Phe Leu Phe Leu Phe   1 5 10 15 Ser Leu Met Asn Phe Met Phe Phe Ile Tyr Phe Ile Met Asn Asp Leu              20 25 30 Met Tyr Phe Leu Glu Trp Glu Ile Ile Cys Phe Asn Ser Met Asn Ile          35 40 45 Leu Tyr Ser Val Leu Leu Asp Trp Met Ser Phe Leu Phe Met Met Phe      50 55 60 Val Ser Leu Ile Ser Ser Val Val Ile Tyr Tyr Ser Lys Ser Tyr Met  65 70 75 80 Ser Ser Glu Lys Asn Leu Ile Arg Phe Ile Ile Leu Val Leu Leu Phe                  85 90 95 Val Phe Ser Met Met Leu Ile Ile Ser Pro Asn Ile Ile Ser Ile             100 105 110 Leu Leu Gly Trp Asp Gly Leu Gly Leu Val Ser Tyr Cys Leu Val Ile         115 120 125 Tyr Tyr Gln Asn Ile Lys Ser Tyr Asn Ala Gly Met Leu Thr Ala Leu     130 135 140 Ser Asn Arg Val Gly Asp Val Phe Ile Leu Ile Val Ile Ser Trp Met 145 150 155 160 Met Asn Tyr Gly Ser Trp Asn Tyr Ile Phe Tyr Leu Asn Phe Met Lys                 165 170 175 Asn Asp Phe Ser Met Met Met Met Met Met Ile Ile Ile Ala Ser             180 185 190 Met Thr Lys Ser Ala Gln Ile Pro Phe Ser Ser Trp Leu Pro Ala Ala         195 200 205 Met Ala Ala Pro Thr Pro Val Ser Ala Leu Val His Ser Ser Thr Leu     210 215 220 Val Thr Ala Gly Val Tyr Leu Leu Ile Arg Phe Asn Gru Leu Leu Val 225 230 235 240 Met Ser Ile Phe Lys Ile Leu Leu Ile Leu Ser Gly Leu Thr Met                 245 250 255 Phe Met Ala Gly Val Ser Ala Asn Tyr Glu Phe Asp Leu Lys Lys Ile             260 265 270 Ile Ala Leu Ser Thr Leu Ser Gln Leu Gly Leu Met Met Ser Ile Leu         275 280 285 Ser Met Gly Phe Ser Asp Leu Ala Phe Phe His Leu Leu Thr His Ala     290 295 300 Met Phe Lys Ala Leu Leu Phe Met Cys Ala Gly Val Ile Ile His Met 305 310 315 320 Met Val Asp Ile Gln Asp Ile Arg Phe Met Gly Lys Met Ser Asn Phe                 325 330 335 Ile Pro Leu Thr Cys Leu Cys Leu Asn Ile Ser Asn Leu Ser Leu Cys             340 345 350 Gly Ile Pro Phe Leu Ser Gly Phe Tyr Ser Lys Asp Leu Ile Leu Glu         355 360 365 Val Val Ser Ser Ser Leu Asn Phe Phe Ile Tyr Leu Leu Tyr Tyr     370 375 380 Val Ser Thr Gly Leu Thr Met Phe Tyr Thr Ile Arg Leu Leu Phe Tyr 385 390 395 400 Thr Met Ile Asn Asp Phe Asn Leu Met Ser Ile Tyr Asn Leu Tyr Asp                 405 410 415 Glu Asp Phe Ile Met Leu Lys Ser Met Phe Val Leu Leu Phe Met Ser             420 425 430 Leu Ile Ser Gly Ser Leu Leu Met Trp Leu Ile Phe Tyr Lys Pro Tyr         435 440 445 Met Ile Tyr Leu Ser Leu Asn Met Lys Phe Met Val Ile Tyr Val Ile     450 455 460 Leu Leu Gly Met Phe Leu Gly Tyr Leu Ile Ser Asn Met Asn Ile Tyr 465 470 475 480 Ser Leu Asn Lys Tyr Leu Tyr Thr Tyr Lys Leu Ser Asn Phe Leu Ser                 485 490 495 Thr Met Trp Phe Met Pro Asn Leu Ser Thr Tyr Gly Leu Asn Tyr Tyr             500 505 510 Phe Leu Asn Tyr Gly Phe Leu Leu Leu Lys Ile Leu Asp Phe Gly Trp         515 520 525 Met Glu Leu Tyr Ser Gly Gln Gly Met Phe Lys Ile Leu Lys Asn Tyr     530 535 540 Ser Leu Leu Tyr Gln Phe Phe Gln Leu Asn Asn Phe Lys Ile Tyr Leu 545 550 555 560 Phe Ser Phe Phe Met Trp Met Leu Phe Tyr Leu Ile Ile Phe Met Met                 565 570 575 Tyr     <210> 5 <211> 621 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant Bax <400> 5 tcacgtgacc cgggcgcgct gcggccgccc gcgcggaccc ggcgagaggc ggcggcggga 60 gcggcggtga tggacgggtc cggggagcag cccagaggcg ggggatgatt gccgccgtgg 120 acacagactc cccccgagag gtctttttcc gagtggcagc tgacatgttt tctgacggca 180 acttcaactg gggccgggtt gtcgcccttt tctactttgc cagcaaactg gtgctcaagg 240 ccctgtgcac caaggtgccg gaactgatca gaaccatcat gggctggaca ttggacttcc 300 tccgggagcg gctgttgggc tggatccaag accagggtgg ttgggacggc ctcctctcct 360 actttgggac gcccacgtgg cagaccgtga ccatctttgt ggcgggagtg ctcaccgcct 420 cactcaccat ctggaagaag atgggctgag gcccccagct gccttggact gtgtttttcc 480 tccataaatt atggcatttt tctgggaggg gtggggattg ggggacgtgg gcatttttct 540 tacttttgg attattgggg ggtgtgggga agagtggtct tgagggggta ataaacctcc 600 ttcgggacac aaaaaaaaaa a 621

Claims (12)

(a) 암전이 억제활성을 나타낼 것으로 예상되는 후보물질을 암세포에 처리하는 단계; 및,
(b) 상기 암세포에서 Bax(Bcl-2-associated X protein)/complex-I(NADH:ubiquinone oxidoreductase) 복합체의 함량을 측정하는 단계를 포함하는, 암전이 억제제의 스크리닝 방법.
(a) treating cancer cells with a candidate substance expected to exhibit an inhibitory activity against cancer; And
(b) measuring the content of Bax (Bcl-2-associated X protein) / complex-I (NADH: ubiquinone oxidoreductase) complex in the cancer cell.
제1항에 있어서,
(a) 단계에서, 상기 암세포는 침윤 또는 전이될 수 있는 폐암, 유방암, 대장암, 위암, 뇌암, 췌장암, 갑상선암, 피부암, 골수암, 림프종, 자궁암 및 자궁경부암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
The method according to claim 1,
wherein said cancer cell is selected from the group consisting of lung cancer, breast cancer, colon cancer, stomach cancer, brain cancer, pancreatic cancer, thyroid cancer, skin cancer, bone cancer, lymphoma, uterine cancer and cervical cancer which may be invasive or metastatic.
제1항에 있어서,
(b) 단계에서, 상기 복합체의 함량은 면역침전법, GST 융합단백질 침전법 또는 웨스턴블럿 분석법을 통하여 측정하는 것인 방법
The method according to claim 1,
wherein in step (b), the content of the complex is measured by immunoprecipitation, GST fusion protein precipitation, or Western blot analysis
제1항에 있어서,
(b) 단계에서 측정된 복합체의 함량이, 후보물질이 처리되지 않은 암세포에서 측정된 복합체의 함량보다 높은 수준을 나타낼 경우, 상기 후보물질이 암전이 억제활성을 갖는다고 판정하는 것인 방법.
The method according to claim 1,
wherein the candidate substance is determined to have an anti-metastatic activity when the content of the complex measured in step (b) is higher than the content of the complex measured in the cancer cell not treated with the candidate substance.
제1항에 있어서,
상기 복합체를 형성하지 못하는 변이된 암세포에 후보물질을 처리하고, 복합체의 함량을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
The method according to claim 1,
Further comprising the step of treating the candidate substance to mutated cancer cells which do not form the complex and measuring the content of the complex.
삭제delete 제5항에 있어서,
상기 변이된 암세포는 C-말단의 4개 잔기가 결실 또는 치환된 변이체 Bax 또는 ND5 서브유닛이 결실 또는 치환된 변이체 complex-I을 발현시켜서 상기 복합체의 형성을 억제하는 것인 방법.
6. The method of claim 5,
Wherein the mutated cancer cells express mutant complex-I in which the mutant Bax or ND5 subunit with deletion or substitution of four residues at the C-terminal is deleted or substituted to inhibit the formation of the complex.
제7항에 있어서,
상기 복합체를 형성하지 못하는 변이된 암세포에 후보물질을 처리하여 측정된 복합체의 함량이 후보물질이 처리되지 않은 암세포에서 측정된 복합체의 함량보다 높은 수준을 나타낼 경우, 상기 후보물질이 위양성 암전이 억제활성을 갖는다고 판정하는 것인 방법.
8. The method of claim 7,
When the amount of the complex measured by treating the candidate substance with mutated cancer cells not capable of forming the complex exhibits a level higher than the content of the complex measured in the cancer cells not treated with the candidate substance, The method comprising the steps of:
삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete
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