JP2005287418A - Peptide having both cell killing and apoptosis defense property - Google Patents
Peptide having both cell killing and apoptosis defense property Download PDFInfo
- Publication number
- JP2005287418A JP2005287418A JP2004108220A JP2004108220A JP2005287418A JP 2005287418 A JP2005287418 A JP 2005287418A JP 2004108220 A JP2004108220 A JP 2004108220A JP 2004108220 A JP2004108220 A JP 2004108220A JP 2005287418 A JP2005287418 A JP 2005287418A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- peptide
- amino acid
- acid sequence
- xaa
- hccs
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 277
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 title claims abstract description 48
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 title abstract description 10
- 230000007123 defense Effects 0.000 title abstract description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 75
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 68
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 44
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 claims abstract description 32
- 230000009471 action Effects 0.000 claims abstract description 23
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 22
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims abstract description 19
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims abstract description 9
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 31
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 87
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 76
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 68
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 57
- 230000030833 cell death Effects 0.000 claims description 51
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 42
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 42
- 238000010361 transduction Methods 0.000 claims description 42
- 230000026683 transduction Effects 0.000 claims description 42
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 33
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 32
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 28
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 23
- 230000004224 protection Effects 0.000 claims description 17
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 17
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 14
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 claims description 13
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 claims description 13
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 13
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 13
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 12
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 claims description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 8
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 claims description 8
- 239000003139 biocide Substances 0.000 claims description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 6
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 claims description 6
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 claims description 4
- 108700000788 Human immunodeficiency virus 1 tat peptide (47-57) Proteins 0.000 claims description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 2
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 claims 1
- 102100031560 Excitatory amino acid transporter 3 Human genes 0.000 abstract description 59
- 101000866302 Homo sapiens Excitatory amino acid transporter 3 Proteins 0.000 abstract description 59
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 53
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 abstract description 15
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 15
- 102100035009 Holocytochrome c-type synthase Human genes 0.000 abstract description 9
- 108030003910 Holocytochrome-c synthases Proteins 0.000 abstract description 8
- 102100037024 E3 ubiquitin-protein ligase XIAP Human genes 0.000 abstract description 7
- 108700031544 X-Linked Inhibitor of Apoptosis Proteins 0.000 abstract description 7
- 102000011727 Caspases Human genes 0.000 abstract description 6
- 108010076667 Caspases Proteins 0.000 abstract description 6
- 230000035806 respiratory chain Effects 0.000 abstract description 6
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract description 5
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 abstract description 4
- 108010000728 Excitatory Amino Acid Transporter 3 Proteins 0.000 abstract description 3
- 102000034575 Glutamate transporters Human genes 0.000 abstract description 2
- 108091006151 Glutamate transporters Proteins 0.000 abstract description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 48
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 23
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 19
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 18
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 13
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 13
- 101710149951 Protein Tat Proteins 0.000 description 12
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 10
- 102000003952 Caspase 3 Human genes 0.000 description 9
- 108090000397 Caspase 3 Proteins 0.000 description 9
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 9
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 9
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 9
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 8
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 8
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 7
- 210000002161 motor neuron Anatomy 0.000 description 7
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 6
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 6
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 5
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 5
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 5
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 4
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- 230000001120 cytoprotective effect Effects 0.000 description 4
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 4
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 4
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 4
- 230000010627 oxidative phosphorylation Effects 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N Benzyl alcohol Chemical compound OCC1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012270 DNA recombination Methods 0.000 description 3
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 3
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 3
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 3
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- -1 t-butyloxycarbonyl Chemical group 0.000 description 3
- 238000001086 yeast two-hybrid system Methods 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 230000002407 ATP formation Effects 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- 102000000634 Cytochrome c oxidase subunit IV Human genes 0.000 description 2
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 2
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 2
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007981 Ornithine carbamoyltransferase Human genes 0.000 description 2
- 101710198224 Ornithine carbamoyltransferase, mitochondrial Proteins 0.000 description 2
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 101100388555 Rattus norvegicus Slc1a1 gene Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000002990 hypoglossal effect Effects 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 239000012948 isocyanate Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 2
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 2
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 2
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N methylparaben Chemical compound COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 2
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 2
- 230000016273 neuron death Effects 0.000 description 2
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N pentobarbital Chemical compound CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- 229940035936 ubiquinone Drugs 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- KPYXMALABCDPGN-HYOZMBHHSA-N (4s)-5-[[(2s)-6-amino-1-[[(2s,3s)-1-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(2r)-1-[[2-[[2-[[(1s)-3-amino-1-carboxy-3-oxopropyl]amino]-2-oxoethyl]amino]-2-oxoethyl]amino]-1-oxo-3-sulfanylpropan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]a Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN)CC1=CC=C(O)C=C1 KPYXMALABCDPGN-HYOZMBHHSA-N 0.000 description 1
- PVPBBTJXIKFICP-UHFFFAOYSA-N (7-aminophenothiazin-3-ylidene)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].C1=CC(=[NH2+])C=C2SC3=CC(N)=CC=C3N=C21 PVPBBTJXIKFICP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- UIFFUZWRFRDZJC-UHFFFAOYSA-N Antimycin A1 Natural products CC1OC(=O)C(CCCCCC)C(OC(=O)CC(C)C)C(C)OC(=O)C1NC(=O)C1=CC=CC(NC=O)=C1O UIFFUZWRFRDZJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NQWZLRAORXLWDN-UHFFFAOYSA-N Antimycin-A Natural products CCCCCCC(=O)OC1C(C)OC(=O)C(NC(=O)c2ccc(NC=O)cc2O)C(C)OC(=O)C1CCCC NQWZLRAORXLWDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000269350 Anura Species 0.000 description 1
- 229940088872 Apoptosis inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- 238000000035 BCA protein assay Methods 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 101100348617 Candida albicans (strain SC5314 / ATCC MYA-2876) NIK1 gene Proteins 0.000 description 1
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 108050008072 Cytochrome c oxidase subunit IV Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 108091006010 FLAG-tagged proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000700662 Fowlpox virus Species 0.000 description 1
- 206010017533 Fungal infection Diseases 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 108091006013 HA-tagged proteins Proteins 0.000 description 1
- 101000726355 Homo sapiens Cytochrome c Proteins 0.000 description 1
- 101000875603 Homo sapiens Cytochrome c oxidase subunit 8C, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 101000946589 Homo sapiens Holocytochrome c-type synthase Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 1
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 1
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- JACAKCWAOHKQBV-UWVGGRQHSA-N Met-Gly-Lys Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN JACAKCWAOHKQBV-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- 108020005196 Mitochondrial DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 1
- 101800000597 N-terminal peptide Proteins 0.000 description 1
- 102400000108 N-terminal peptide Human genes 0.000 description 1
- 208000028389 Nerve injury Diseases 0.000 description 1
- 108091093105 Nuclear DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 1
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 239000012722 SDS sample buffer Substances 0.000 description 1
- 101100007329 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) COS1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100221606 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) COS7 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- ABBQHOQBGMUPJH-UHFFFAOYSA-M Sodium salicylate Chemical compound [Na+].OC1=CC=CC=C1C([O-])=O ABBQHOQBGMUPJH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 241000701093 Suid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 1
- 108010076830 Thionins Proteins 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 201000003352 adrenal gland pheochromocytoma Diseases 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- VIROVYVQCGLCII-UHFFFAOYSA-N amobarbital Chemical compound CC(C)CCC1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O VIROVYVQCGLCII-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- UIFFUZWRFRDZJC-SBOOETFBSA-N antimycin A Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](CCCCCC)[C@@H](OC(=O)CC(C)C)[C@H](C)OC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=CC=CC(NC=O)=C1O UIFFUZWRFRDZJC-SBOOETFBSA-N 0.000 description 1
- PVEVXUMVNWSNIG-UHFFFAOYSA-N antimycin A3 Natural products CC1OC(=O)C(CCCC)C(OC(=O)CC(C)C)C(C)OC(=O)C1NC(=O)C1=CC=CC(NC=O)=C1O PVEVXUMVNWSNIG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000158 apoptosis inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 235000019445 benzyl alcohol Nutrition 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000030570 cellular localization Effects 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 150000001945 cysteines Chemical group 0.000 description 1
- 108010019760 cytochrome C synthetase Proteins 0.000 description 1
- 230000000445 cytocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000010013 cytotoxic mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 229940009976 deoxycholate Drugs 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000012407 engineering method Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 125000005519 fluorenylmethyloxycarbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 1
- 230000004217 heart function Effects 0.000 description 1
- 102000046496 human COX8C Human genes 0.000 description 1
- 102000047064 human SLC1A1 Human genes 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000005555 hypertensive agent Substances 0.000 description 1
- 210000001169 hypoglossal nerve Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 108091006086 inhibitor proteins Proteins 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 229910052816 inorganic phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010841 mRNA extraction Methods 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 235000010270 methyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004292 methyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 229960002216 methylparaben Drugs 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 210000001700 mitochondrial membrane Anatomy 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 208000031225 myocardial ischemia Diseases 0.000 description 1
- 239000004081 narcotic agent Substances 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 230000008764 nerve damage Effects 0.000 description 1
- 231100000065 noncytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002020 noncytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 229960001412 pentobarbital Drugs 0.000 description 1
- 229950000964 pepstatin Drugs 0.000 description 1
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 1
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 229940080469 phosphocellulose Drugs 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000002633 protecting effect Effects 0.000 description 1
- 230000016314 protein import into mitochondrial matrix Effects 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000006479 redox reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- JUVIOZPCNVVQFO-UHFFFAOYSA-N rotenone Natural products O1C2=C3CC(C(C)=C)OC3=CC=C2C(=O)C2C1COC1=C2C=C(OC)C(OC)=C1 JUVIOZPCNVVQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940080817 rotenone Drugs 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229960004025 sodium salicylate Drugs 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- BWMISRWJRUSYEX-SZKNIZGXSA-N terbinafine hydrochloride Chemical compound Cl.C1=CC=C2C(CN(C\C=C\C#CC(C)(C)C)C)=CC=CC2=C1 BWMISRWJRUSYEX-SZKNIZGXSA-N 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 201000004647 tinea pedis Diseases 0.000 description 1
- 230000001256 tonic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003021 water soluble solvent Substances 0.000 description 1
Abstract
Description
本発明は、細胞殺傷性と細胞死防御性とを併せもつ新規なペプチド、該ペプチドをコードするＤＮＡ、該ペプチドに対する抗体、該ペプチドを有効成分とする細胞殺傷作用や細胞死防御作用を必要とする疾病の予防・治療薬等に関する。 The present invention requires a novel peptide having both cell killing and cell death protection, DNA encoding the peptide, an antibody against the peptide, cell killing and cell death protection using the peptide as an active ingredient It relates to preventive / therapeutic drugs for diseases.
ミトコンドリアは高等生物の細胞内に存在する細胞小器官であり、その内部にある酸化的リン酸化系を使って細胞の活動に必要なエネルギーの大部分を供給している。このミトコンドリア内には、核ＤＮＡとは独立したミトコンドリアＤＮＡが存在し、酸化的リン酸化系の酵素を構成する１３種のポリペプチドをコードしている。電子伝達系の酸化還元反応によって遊離されるエネルギーを用いて、ＡＤＰと無機リン酸からＡＴＰを合成する反応として知られる酸化的リン酸化の阻害剤には、電子伝達阻害剤（呼吸阻害剤）、エネルギー転移阻害剤（Ｈ+−ＡＴＰアーゼの阻害剤）、膜の透過性を高める脱共役剤の３種があり、呼吸阻害剤としては、ＫＣＮ，ＮＯ，ＮａＮ3，ＣＯなどのチトクロームオキシダーゼ阻害剤、アンチマイシンＡなどのチトクロームｂ−ｃ1間阻害剤、ＳＨ試薬などのコハク酸−ユビキノン間阻害剤、ロテノン，アミタールなどのＮＡＤ−ユビキノン間阻害剤が知られている。 Mitochondria are organelles that exist in cells of higher organisms, and use the oxidative phosphorylation system inside them to supply most of the energy necessary for cellular activities. In this mitochondria, there exists mitochondrial DNA independent of nuclear DNA, and encodes 13 kinds of polypeptides constituting enzymes of the oxidative phosphorylation system. Inhibitors of oxidative phosphorylation known as a reaction of synthesizing ATP from ADP and inorganic phosphate using the energy released by the redox reaction of the electron transport system include electron transport inhibitors (respiration inhibitors), There are three types of energy transfer inhibitors (inhibitors of H + -ATPase) and uncouplers that increase membrane permeability. Cytochrome oxidase inhibitors such as KCN, NO, NaN 3 , and CO are used as respiratory inhibitors. Inhibitors between cytochrome b-c 1 such as antimycin A, succinic acid-ubiquinone inhibitors such as SH reagent, and NAD-ubiquinone inhibitors such as rotenone and amital are known.
ホロチトクロームC合成酵素（holocytochrome c synthetase；ＨＣＣＳ）は、ミトコンドリアでのＡＴＰ産生を担う呼吸鎖に必須の酵素であり、ミトコンドリア膜間に存在してホロチトクロームＣを合成する。上記のように、現在までに種々の酸化的リン酸化の阻害剤は知られているが、ＨＣＣＳに作用してその活性を抑制する分子は全く知られておらず、ＨＣＣＳをターゲットとしたＡＴＰ合成阻害およびそれに引き続く殺細胞効果を目的としたペプチドや阻害剤は全く知られていない。また、ＨＣＣＳはミトコンドリアに移行せず細胞質中に存在すると細胞毒性を持つが、このメカニズムについても全く不明であった。 Holocytochrome c synthetase (HCCS) is an enzyme essential for the respiratory chain responsible for ATP production in mitochondria, and exists between mitochondrial membranes to synthesize horocytochrome C. As described above, various inhibitors of oxidative phosphorylation are known to date, but no molecule that acts on HCCS to suppress its activity is known at all, and ATP synthesis targeting HCCS is not known. There are no known peptides or inhibitors intended for inhibition and subsequent cell killing effect. In addition, HCCS has cytotoxicity when it exists in the cytoplasm without migrating to mitochondria, but this mechanism is completely unknown.
その他、ミトコンドリアに所定のタンパク質を移行するためのシグナルペプチドとして、例えば、ヒトチトクロームＣ酸化酵素のサブユニットVIIIの移行シグナルペプチド（例えば、非特許文献１参照）、ヒトオルニチントランスカルバミラーゼの移行シグナルペプチド（例えば、非特許文献２参照）等が知られており、これら移行シグナルペプチドをコードする塩基配列の３'側に所定のタンパク質をコードする塩基配列を結合し、この結合体を発現ベクターに組み込んで融合タンパク質発現用組換えベクターを構築して、細胞内に遺伝子導入することにより、ターゲットであるミトコンドリアに、かかる融合タンパク質を移行させることが可能となることも知られている（例えば、特許文献１参照）。
本発明の課題は、細胞内で局在する部位の違いによって細胞殺傷性あるいは細胞死防御性と異なる機能発現をもたらすペプチド、該ペプチドをコードするＤＮＡ、該ペプチドに対する抗体、該ペプチドを過剰発現するトランスジェニック非ヒト動物、該ペプチドを有効成分とする細胞殺傷作用や細胞死防御作用を必要とする疾病の予防・治療薬等を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a peptide that exhibits functional expression different from cell killing or cell death protection depending on the location localized in the cell, DNA encoding the peptide, an antibody against the peptide, and overexpression of the peptide An object of the present invention is to provide a transgenic non-human animal, a preventive / therapeutic agent for a disease that requires a cell killing action or a cell death protection action using the peptide as an active ingredient.
本発明者らは、ヒトを含む脊髄動物の神経細胞型グルタミン酸トランスポーター（ＥＡＡＣ１／ＥＡＡＴ３：Excitatory Amino Acid Carrier 1、別称Excitatory Amino Acid Transporter 3）のＮ末端と結合するタンパク質を探索する目的で、ＥＡＡＣ１のＮ末端をベイトとしてマウスブレインライブラリー酵母ツーハイブリッドを行ったところ、ミトコンドリア膜間腔に存在する呼吸鎖関連蛋白ＨＣＣＳがＥＡＡＣ１のＮ末端の１７アミノ酸からなるペプチドフラグメントと特異的に結合することを見い出した。かかるＥＡＡＣ１のＮ末端ペプチドフラグメントをミトコンドリア中に導入すると、ＨＣＣＳと特異的に結合してＨＣＣＳ活性を阻害するため、呼吸鎖が切断されて細胞殺傷性がもたらされることを見い出した。すなわち、ＥＡＡＣ１のＮ末端ペプチドのＮ末に癌細胞特異的な取込みチャネルを認識するペプチドを付加することによって、ＥＡＡＣ１のＮ末端ペプチドを複数の癌細胞に特異的に取込ませるデリバリーシステムを考案し、該システムを用いて癌細胞の生残率を有意に抑えられることを確認した。 The present inventors searched for a protein that binds to the N-terminus of a neuronal glutamate transporter (EAAC1 / EAAT3: Excitatory Amino Acid Transporter 3, also known as Excitatory Amino Acid Transporter 3) in vertebrate animals including humans. When the mouse brain library yeast two-hybrid was performed using the N-terminus of the EAAC1, the respiratory chain-related protein HCCS present in the mitochondrial intermembrane space was specifically bound to a peptide fragment consisting of 17 amino acids at the N-terminus of EAAC1. I found it. It has been found that introduction of such an N-terminal peptide fragment of EAAC1 into mitochondria specifically binds to HCCS and inhibits HCCS activity, so that the respiratory chain is cleaved, resulting in cell killing. That is, a delivery system for specifically incorporating EAAC1 N-terminal peptide into a plurality of cancer cells was devised by adding a peptide that recognizes a cancer cell-specific uptake channel to the N-terminus of the EAAC1 N-terminal peptide. It was confirmed that the survival rate of cancer cells could be significantly suppressed using the system.
また、細胞障害が生じたときには、ＨＣＣＳがミトコンドリアへ移行しなくなり、その際に見られる細胞毒性のメカニズムを明らかにした。すなわち、細胞質中に存在しカスパーゼを介したアポトーシスを抑制しているＸＩＡＰ（カスパーゼの阻害因子であるアポトーシス阻害タンパクファミリー）の機能をＨＣＣＳはＸＩＡＰに結合により阻害する。上記ＥＡＡＣ１のＮ末端ペプチドフラグメントを細胞質内に局在させると、細胞質中のＨＣＣＳと結合してフリーのＨＣＣＳが減少し、その結果ＨＣＣＳにより消費されたＸＩＡＰが消費され難くなるため、カスパーゼを介する細胞死（アポトーシス）防御性がもたらされることを見い出した。すなわち、ＸＩＡＰ活性の保護作用を有するＥＡＡＣ１のＮ末端ペプチドを細胞質に局在化させると、活性化型カスパーゼ３を示すバンドが薄くなることから、カスパーゼ３の活性が低下していることが示され、その結果ＥＡＡＣ１Ｎ末ペプチドは細胞質内に局在して細胞死防御分子として機能することを明らかにした。 In addition, when cell damage occurred, HCCS did not migrate to mitochondria, and the cytotoxic mechanism observed at that time was clarified. That is, HCCS inhibits the function of XIAP (apoptosis inhibitor protein family that is an inhibitor of caspase) present in the cytoplasm and suppressing caspase-mediated apoptosis by binding to XIAP. When the N-terminal peptide fragment of EAAC1 is localized in the cytoplasm, it binds to the HCCS in the cytoplasm and free HCCS is reduced, and as a result, XIAP consumed by HCCS is hardly consumed. It has been found that death (apoptosis) protection is brought about. That is, when the N-terminal peptide of EAAC1 having a protective action for XIAP activity is localized in the cytoplasm, the band indicating activated caspase 3 becomes thin, indicating that the activity of caspase 3 is reduced. As a result, it was clarified that the EAAC1N terminal peptide is localized in the cytoplasm and functions as a cell death defense molecule.
以上のように、ＥＡＡＣ１のＮ末端ペプチドは、ミトコンドリア中に局在させると細胞殺傷性を、また細胞質中に局在させるとＸＩＡＰ活性の保護作用を有するため細胞死防御分子として機能することを見い出した。また、ＥＡＡＣ１のＮ末端ペプチドのＮ末から９番目のＣｙｓのみをＡｌａに置換しただけで殺傷活性が大幅に低下することから、９番目付近のコンフォーメーションが殺傷活性に関わる創薬上重要な部位であることがわかった。本発明はこれらの知見に基づいて完成するに至ったものである。 As described above, it has been found that the N-terminal peptide of EAAC1 functions as a cell death defense molecule because it has a cell-killing effect when localized in the mitochondria and has a protective action against XIAP activity when localized in the cytoplasm. It was. In addition, since only the 9th Cys from the N-terminus of the N-terminal peptide of EAAC1 is replaced with Ala, the killing activity is greatly reduced, so that the conformation near the 9th is an important site for drug discovery related to the killing activity. I found out that The present invention has been completed based on these findings.
すなわち本発明は、以下の（Ａ）〜（Ｃ）の何れかのアミノ酸配列からなるペプチド。
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列；
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるペプチドがホロチトクロームC合成酵素（ＨＣＣＳ）結合活性を有するアミノ酸配列；
（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるペプチドがホロチトクロームC合成酵素（ＨＣＣＳ）結合活性を有するアミノ酸配列；（請求項１）や、（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるペプチドがホロチトクロームC合成酵素（ＨＣＣＳ）結合活性を有するアミノ酸配列；、又は、（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるペプチドがホロチトクロームC合成酵素（ＨＣＣＳ）結合活性を有するアミノ酸配列；が、Ｎ末から９番目にＣｙｓを有するアミノ酸配列であることを特徴とする請求項１記載のペプチド（請求項２）や、Ｎ末から９番目にＣｙｓを有するアミノ酸配列が、一般式：Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ1−Ｘａａ2−Ｘａａ3−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｘａａ4−Ｘａａ5−Ｘａａ6−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｘａａ7−Ａｓｎ（式中、Ｘａａ1はＡｌａ又はＴｈｒを、Ｘａａ2はＡｒｇ又はＳｅｒを、Ｘａａ3はＬｙｓ又はＳｅｒを、Ｘａａ4はＧｌｕ又はＡｓｐを、Ｘａａ5はＴｒｐ，Ｓｅｒ又はＣｙｓを、Ｘａａ6はＬｙｓ又はＡｒｇを、Ｘａａ7はＬｙｓ又はＡｒｇをそれぞれ表す。）で表されることを特徴とする請求項２記載のペプチド（請求項３）や、以下の（Ａ）〜（Ｆ）の何れかの塩基配列からなるＤＮＡ。
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードする塩基配列；
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつホロチトクロームC合成酵素（ＨＣＣＳ）結合活性を有するペプチドをコードする塩基配列；
（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつホロチトクロームC合成酵素（ＨＣＣＳ）結合活性を有するペプチドをコードする塩基配列；
（Ｄ）配列番号１に示される塩基配列；
（Ｅ）配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつホロチトクロームC合成酵素（ＨＣＣＳ）結合活性を有するペプチドをコードする塩基配列；
（Ｆ）配列番号１に示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつホロチトクロームC合成酵素（ＨＣＣＳ）結合活性を有するペプチドをコードする塩基配列；（請求項４）や、（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつホロチトクロームC合成酵素（ＨＣＣＳ）結合活性を有するペプチドをコードする塩基配列；、又は、（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつホロチトクロームC合成酵素（ＨＣＣＳ）結合活性を有するペプチドをコードする塩基配列；が、Ｎ末から９番目にＣｙｓを有するアミノ酸配列からなるペプチドをコードする塩基配列であることを特徴とする請求項４記載のＤＮＡ（請求項５）や、Ｎ末から９番目にＣｙｓを有するアミノ酸配列からなるペプチドをコードする塩基配列が、一般式：Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ1−Ｘａａ2−Ｘａａ3−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｘａａ4−Ｘａａ5−Ｘａａ6−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｘａａ7−Ａｓｎ（式中、Ｘａａ1はＡｌａ又はＴｈｒを、Ｘａａ2はＡｒｇ又はＳｅｒを、Ｘａａ3はＬｙｓ又はＳｅｒを、Ｘａａ4はＧｌｕ又はＡｓｐを、Ｘａａ5はＴｒｐ，Ｓｅｒ又はＣｙｓを、Ｘａａ6はＬｙｓ又はＡｒｇを、Ｘａａ7はＬｙｓ又はＡｒｇをそれぞれ表す。）で表されるペプチドをコードする塩基配列であることを特徴とする請求項５記載のＤＮＡ（請求項６）や、請求項１〜３のいずれか記載のペプチドのＮ末端側に、前記ペプチドをミトコンドリアに移行させることができるタンパク質導入ドメインが連結されているタンパク質導入ドメイン結合ペプチド（請求項７）や、ペプチドをミトコンドリアに移行させることができるタンパク質導入ドメインが、Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇからなるタンパク質導入ドメインであることを特徴とする請求項７記載のタンパク質導入ドメイン結合ペプチド（請求項８）や、請求項１〜３のいずれか記載のペプチドのＮ末端側に前記ペプチドをミトコンドリアに移行させることができるタンパク質導入ドメインが連結されているタンパク質導入ドメイン結合ペプチドをコードするＤＮＡ（請求項９）や、ペプチドをミトコンドリアに移行させることができるタンパク質導入ドメインが、Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇからなるタンパク質導入ドメインであることを特徴とする請求項９記載のタンパク質導入ドメイン結合ペプチドをコードするＤＮＡ（請求項１０）や、請求項１〜３のいずれか記載のペプチド、又は請求項７若しくは８記載のタンパク質導入ドメイン結合ペプチドと、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとが結合している融合ペプチド（請求項１１）や、請求項４〜６のいずれか記載のＤＮＡを含み、かつ請求項１〜３のいずれか記載のペプチドを発現することができる組換えベクター（請求項１２）や、請求項９又は１０記載のＤＮＡを含み、かつ請求項７又は８記載のタンパク質導入ドメイン結合ペプチドを発現することができる組換えベクター（請求項１３）や、請求項１２記載の組換えベクターが導入され、かつ請求項１〜３のいずれか記載のペプチドを発現することができる形質転換体（請求項１４）、請求項１３記載の組換えベクターが導入され、かつ請求項７又は８記載のタンパク質導入ドメイン結合ペプチドを発現することができる形質転換体（請求項１５）や、 請求項１〜３のいずれか記載のペプチド、又は請求項７若しくは８記載のタンパク質導入ドメイン結合ペプチドを特異的に認識することができる抗体（請求項１６）や、モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１６記載の抗体（請求項１７）や、請求項４〜６のいずれか記載のＤＮＡ又は請求項９若しくは１０記載のＤＮＡが導入され、請求項１〜３のいずれか記載のペプチド又は請求項７若しくは８記載のタンパク質導入ドメイン結合ペプチドを過剰に発現するトランスジェニック非ヒト動物（請求項１８）や、トランスジェニックマウスであることを特徴とする請求項１６記載のトランスジェニック非ヒト動物（請求項１９）に関する。
That is, the present invention is a peptide comprising any one of the following amino acid sequences (A) to (C).
(A) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2;
(B) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added, and a peptide comprising the amino acid sequence is a horocytochrome C synthase (HCCS) An amino acid sequence having binding activity;
(C) an amino acid sequence having at least 60% homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and the peptide comprising the amino acid sequence has a horocytochrome C synthase (HCCS) binding activity; (B) The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added, and a peptide comprising the amino acid sequence is a holo An amino acid sequence having cytochrome C synthase (HCCS) binding activity; or (C) an amino acid sequence having at least 60% homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and consisting of the amino acid sequence An amino acid sequence in which the peptide has holocytochrome C synthase (HCCS) binding activity; The peptide according to claim 1 (Claim 2), which is an amino acid sequence having Cys in the eye, or an amino acid sequence having Cys at the 9th position from the N-terminus is represented by the general formula: Met-Gly-Lys-Pro -Xaa 1 -Xaa 2 -Xaa 3 -Gly-Cys-Xaa 4 -Xaa 5 -Xaa 6 -Arg-Phe-Leu-Xaa 7 -Asn (where Xaa 1 is Ala or Thr, Xaa 2 is Arg or Ser, Xaa 3 represents Lys or Ser, Xaa 4 represents Glu or Asp, Xaa 5 represents Trp, Ser or Cys, Xaa 6 represents Lys or Arg, and Xaa 7 represents Lys or Arg. A DNA comprising the peptide according to claim 2 (claim 3) or any one of the following base sequences (A) to (F):
(A) a base sequence encoding a peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2;
(B) The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added, and encodes a peptide having horocytochrome C synthase (HCCS) binding activity Base sequence;
(C) a base sequence encoding a peptide consisting of an amino acid sequence having at least 60% homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having a horocytochrome C synthase (HCCS) binding activity;
(D) the base sequence represented by SEQ ID NO: 1;
(E) In the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, encodes a peptide having a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted or added, and having a horocytochrome C synthase (HCCS) binding activity Base sequence;
(F) a nucleotide sequence that hybridizes with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 under a stringent condition and encodes a peptide having a horocytochrome C synthase (HCCS) binding activity; (Claim 4); B) A base encoding a peptide having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having a horocytochrome C synthase (HCCS) binding activity Or (C) a base sequence encoding a peptide having an amino acid sequence having at least 60% homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having a horocytochrome C synthase (HCCS) binding activity Is a nucleotide sequence encoding a peptide consisting of an amino acid sequence having Cys at position 9 from the N-terminus The DNA according to claim 4 (claim 5) or a base sequence encoding a peptide comprising an amino acid sequence having Cys at the 9th position from the N-terminus is represented by the general formula: Met-Gly-Lys- Pro-Xaa 1 -Xaa 2 -Xaa 3 -Gly-Cys-Xaa 4 -Xaa 5 -Xaa 6 -Arg-Phe-Leu-Xaa 7 -Asn (where Xaa 1 is Ala or Thr, Xaa 2 is Arg Or Ser, Xaa 3 represents Lys or Ser, Xaa 4 represents Glu or Asp, Xaa 5 represents Trp, Ser or Cys, Xaa 6 represents Lys or Arg, and Xaa 7 represents Lys or Arg. The DNA according to claim 5 (claim 6) or the peptide according to any one of claims 1 to 3, which is a base sequence encoding the peptide represented by A protein transduction domain-binding peptide in which a protein transduction domain capable of translocating the peptide to the mitochondria is linked to the N-terminal side (Claim 7), or a protein transduction domain capable of translocating the peptide to the mitochondria is Tyr. A protein transduction domain-binding peptide according to claim 7 (Claim 8), which is a protein transduction domain consisting of -Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg, A DNA encoding a protein transduction domain-binding peptide in which a protein transduction domain capable of transferring the peptide to mitochondria is linked to the N-terminal side of the peptide according to any one of items 1 to 3 (claim 9), and a peptide Migrating to mitochondria The protein transduction domain according to claim 9, wherein the protein transduction domain that can be obtained is a protein transduction domain consisting of Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg A DNA encoding a binding peptide (Claim 10), a peptide according to any one of Claims 1 to 3, or a protein transduction domain binding peptide according to Claim 7 or 8, and a marker protein and / or a peptide tag bind to each other A recombinant peptide comprising the DNA of any one of claims 4 to 6 and capable of expressing the peptide of any one of claims 1 to 3 (claim) 12) or the protein-introduced protein according to claim 7 or 8, which comprises the DNA according to claim 9 or 10. A recombinant vector capable of expressing an in-binding peptide (Claim 13) or a trait capable of expressing the peptide according to any one of Claims 1 to 3 into which the recombinant vector according to Claim 12 has been introduced. A transformant (Claim 14), a transformant into which the recombinant vector according to Claim 13 is introduced and capable of expressing the protein transduction domain binding peptide according to Claim 7 or 8 (Claim 15); An antibody capable of specifically recognizing the peptide according to any one of Items 1 to 3, or the protein transduction domain-binding peptide according to Claim 7 or 8 (Claim 16), or a monoclonal antibody, The antibody according to claim 16 (claim 17), the DNA according to any of claims 4 to 6, or the DNA according to claim 9 or 10 is introduced, and A transgenic non-human animal (Claim 18) or a transgenic mouse that overexpresses the peptide according to any one of Items 1 to 3 or the protein transduction domain-binding peptide according to Claim 7 or 8. The transgenic non-human animal according to claim 16 (claim 19).
また本発明は、請求項１〜３のいずれか記載のペプチド又は請求項１２記載の組換えベクターと被検物質とを被験非ヒト動物に投与し、細胞死防御活性の程度を測定・評価することを特徴とする細胞死防御活性の促進物質又は抑制物質のスクリーニング方法（請求項２０）や、請求項７又は８記載のタンパク質導入ドメイン結合ペプチド又は請求項１３記載の組換えベクターと被検物質とを被検物質を被験非ヒト動物に投与し、細胞殺傷活性の程度を測定・評価することを特徴とする細胞殺傷活性の促進物質又は抑制物質のスクリーニング方法（請求項２１）や、請求項１〜３のいずれか記載のペプチド、又は請求項７若しくは８記載のタンパク質導入ドメイン結合ペプチドからなるホロチトクロームC合成酵素（ＨＣＣＳ）不活化剤（請求項２２）や、請求項１〜３のいずれか記載のペプチド又は請求項１２記載の組換えベクターからなる細胞死防御剤（請求項２３）や、請求項２３記載の細胞死防御剤を有効成分として含有することを特徴とする細胞死防御作用を必要とする疾病の予防・治療薬（請求項２４）や、細胞死防御作用を必要とする疾病が、筋萎縮性側索硬化症であることを特徴とする請求項２４記載の疾病の予防・治療薬（請求項２５）や、請求項７若しくは８記載のタンパク質導入ドメイン結合ペプチド、又は請求項１３記載の組換えベクターからなる細胞殺傷剤（請求項２６）や、請求項２６記載の細胞殺傷剤を有効成分として含有することを特徴とする細胞殺傷作用を必要とする疾病の予防・治療薬（請求項２７）や、細胞殺傷作用を必要とする疾病が、悪性腫瘍・癌であることを特徴とする請求項２７記載の疾病の予防・治療薬（請求項２８）や、請求項２４記載の疾病の予防・治療薬を投与することを特徴とする細胞死防御作用を必要とする疾病の予防・治療方法（請求項２９）や、細胞死防御作用を必要とする疾病が、筋萎縮性側索硬化症であることを特徴とする請求項２９記載の細胞死防御作用を必要とする疾病の予防・治療方法（請求項３０）や、請求項２７記載の疾病の予防・治療薬を投与することを特徴とする細胞殺傷作用を必要とする疾病の予防・治療方法（請求項３１）や、細胞殺傷作用を必要とする疾病が、悪性腫瘍・癌であることを特徴とする請求項３１記載の細胞殺傷作用を必要とする疾病の予防・治療方法（請求項３２）に関する。 Further, the present invention administers the peptide according to any one of claims 1 to 3 or the recombinant vector according to claim 12 and a test substance to a test non-human animal, and measures and evaluates the degree of cell death protection activity. A screening method for a substance that promotes or suppresses cell death protection activity (claim 20), the protein transduction domain-binding peptide according to claim 7 or 8, or the recombinant vector according to claim 13 and a test substance A screening method for a cell killing activity promoting substance or inhibitor (Claim 21), wherein the test substance is administered to a test non-human animal, and the degree of cell killing activity is measured and evaluated. A holotitochrome C synthase (HCCS) inactivating agent comprising the peptide according to any one of 1 to 3 or the protein transduction domain-binding peptide according to claim 7 or 8 (claim) 22), a cell death protective agent comprising the peptide according to any one of claims 1 to 3 or the recombinant vector according to claim 12 (claim 23), or the cell death protective agent according to claim 23 as an active ingredient. A preventive / therapeutic agent for a disease that requires a cell death protective action (claim 24) or a disease that requires a cell death protective action, characterized by containing amyotrophic lateral sclerosis A preventive / therapeutic agent for disease according to claim 24 (claim 25), a protein transduction domain-binding peptide according to claim 7 or 8, or a cell killing agent comprising the recombinant vector according to claim 13 (claim) 26), a prophylactic / therapeutic agent for a disease requiring cell killing action comprising the cell killing agent of claim 26 as an active ingredient (claim 27), or cell killing action Disease is malignant A preventive / therapeutic agent for a disease according to claim 27 (claim 28), or a preventive / therapeutic agent for a disease according to claim 24, which is a tumor or cancer. 30. A cell death according to claim 29, wherein the disease prevention / treatment method (claim 29) or the disease requiring a cell death protection effect is amyotrophic lateral sclerosis. A method for preventing / treating a disease requiring a protective action (Claim 30), or a method for preventing / treating a disease requiring a cell killing action, comprising administering a preventive / therapeutic drug for a disease according to Claim 27. The method (claim 31) or the disease requiring a cell killing action is a malignant tumor / cancer, The method for preventing or treating a disease requiring a cell killing action according to claim 31 (claim) 32).
本発明のペプチド（本件ペプチド）はＨＣＣＳに結合しその活性阻害作用を有する初めてのペプチドであり、本件ペプチドの殺細胞効果や細胞死防御効果の作用点は従来の薬剤やペプチドにはないことから、本件ペプチドの細胞内局在を制御することにより、殺細胞効果と細胞生存効果の両者を選択することができる。例えば、本件ペプチドにミトコンドリア移行シグナルペプチドを付加することにより選択的に本件ペプチドをミトコンドリアへ移行させ、本件ペプチドをミトコンドリア内に局在させることでチロクロームＣの合成を阻害し呼吸鎖を切断し、癌細胞などで効率的な細胞死を誘導することができる。一方、ミトコンドリアへ移行させることなく細胞質で本件ペプチドを発現させることで、細胞質中に存在するＨＣＣＳによるＸＩＡＰの活性抑制を阻害し、カスパーゼ依存性のアポトーシスを抑制することができる。また、本件ペプチドのＨＣＣＳ活性阻害の作用には、９番目のアミノ酸のシステインが必須であることから、このアミノ酸を中心とした領域の３次元構造に基づいて、本件ペプチドと同等の作用を有する低分子のＨＣＣＳ阻害薬の開発を行うことが可能となる。 The peptide of the present invention (the peptide of the present invention) is the first peptide that binds to HCCS and has an activity-inhibiting action, and the action point of the cell killing effect and cell death protective effect of the peptide is not found in conventional drugs or peptides. By controlling the intracellular localization of the present peptide, it is possible to select both the cell killing effect and the cell survival effect. For example, by adding a mitochondrial translocation signal peptide to the peptide, the peptide is selectively transferred to the mitochondria, and by localizing the peptide in the mitochondria, the synthesis of thyrochrome C is inhibited and the respiratory chain is cleaved. Efficient cell death can be induced in cells and the like. On the other hand, by expressing the peptide in the cytoplasm without being transferred to mitochondria, inhibition of XIAP activity by HCCS present in the cytoplasm can be inhibited, and caspase-dependent apoptosis can be suppressed. In addition, the cysteine of the ninth amino acid is essential for the action of inhibiting the HCCS activity of the peptide of the present invention. Therefore, based on the three-dimensional structure of the region centered on this amino acid, It is possible to develop molecular HCCS inhibitors.
本発明のペプチドとしては、（Ａ）ＥＡＡＣ１のＮ末端の１７アミノ酸からなる配列番号２に示されるアミノ酸配列；（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＨＣＣＳ結合活性を有するアミノ酸配列；又は（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＨＣＣＳ結合活性を有するアミノ酸配列；の何れかのアミノ酸配列からなるペプチド（以下「本件ペプチド[１]」ということがある）、あるいは、本件ペプチド[１]のＮ末端側に、本件ペプチド[１]をミトコンドリアに移行させることができるタンパク質導入ドメインが連結されているタンパク質導入ドメイン結合ペプチド（以下「本件ペプチド[２]」ということがあり、本件ペプチド[１]と本件ペプチド[２]を総称して「本件ペプチド」ということがある）であれば特に制限されず、ここで「ＨＣＣＳ結合活性を有するペプチド」とは、ＨＣＣＳに結合することによりＨＣＣＳのもつ酵素活性に何らかの形で関与するペプチドを意味し、その具体的な作用機構は特に限定されないが、本件ペプチドの具体的な作用の一例としては、ＨＣＣＳに特異的に結合し、ＨＣＣＳのもつ酵素活性を阻害する作用を挙げることができるが、これに限定されるものではない。 The peptide of the present invention includes (A) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 consisting of 17 amino acids at the N-terminal of EAAC1; (B) one or several amino acids deleted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 An amino acid sequence consisting of a substituted or added amino acid sequence and having HCCS binding activity; or (C) an amino acid sequence having at least 60% homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and HCCS binding A peptide comprising any one of the amino acid sequences (hereinafter sometimes referred to as “the peptide [1]”) or the peptide [1] on the N-terminal side of the peptide [1] Protein transduction domain binding peptide in which protein transduction domains that can be transferred to Hereinafter, it may be referred to as “the peptide [2]”, and the peptide [1] and the peptide [2] may be collectively referred to as “the peptide”. The term “peptide having activity” means a peptide that participates in some form in the enzyme activity of HCCS by binding to HCCS, and its specific action mechanism is not particularly limited. An example is an action that specifically binds to HCCS and inhibits the enzyme activity of HCCS, but is not limited thereto.
また、本発明のＤＮＡとしては、（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列；（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＨＣＣＳ結合活性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列；（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＨＣＣＳ結合活性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列；（Ｄ）ＥＡＡＣ１のＮ末端の１７アミノ酸をコードする配列番号１に示される塩基配列；（Ｅ）配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつＨＣＣＳ結合活性を有するペプチドをコードする塩基配列；又は（Ｆ）配列番号１に示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＣＣＳ結合活性を有するペプチドをコードする塩基配列；の何れかの塩基配列からなるＤＮＡ（以下「本件ＤＮＡ[１]」ということがある）、あるいは、本件ペプチドＩのＮ末端側に、本件ペプチド[１]をミトコンドリアに移行させることができるタンパク質導入ドメインが連結されているタンパク質導入ドメイン結合ペプチドをコードするＤＮＡ（以下「本件ＤＮＡ[２]」ということがあり、本件ＤＮＡ[１]と本件ＤＮＡ[２]を総称して「本件ＤＮＡ」ということがある）であれば特に制限されない。 The DNA of the present invention includes (A) a base sequence encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2; (B) one or several amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 deleted or substituted Or a nucleotide sequence consisting of an added amino acid sequence and encoding an amino acid sequence having HCCS binding activity; (C) consisting of an amino acid sequence having at least 60% homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and A base sequence encoding an amino acid sequence having HCCS binding activity; (D) a base sequence represented by SEQ ID NO: 1 encoding the N-terminal 17 amino acids of EAAC1; (E) 1 or 2 in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 A peptide consisting of a base sequence in which several bases are deleted, substituted or added and having HCCS binding activity Or (F) a base sequence that hybridizes with the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 under a stringent condition and encodes a peptide having HCCS binding activity. Protein introduction in which DNA (hereinafter sometimes referred to as “the present DNA [1]”) or a protein transduction domain capable of transferring the present peptide [1] to mitochondria is linked to the N-terminal side of the present peptide I Particularly limited as long as it is a DNA encoding a domain-binding peptide (hereinafter sometimes referred to as “the present DNA [2]”, and the present DNA [1] and the present DNA [2] may be collectively referred to as “the present DNA”). Not.
上記「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」とは、例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を意味する。また、上記「１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を意味する。 The “amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added” is, for example, 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3 amino acids. It means an amino acid sequence that is deleted, substituted or added. The “base sequence in which one or several bases have been deleted, substituted or added” is, for example, 1 to 20, preferably 1 to 15, more preferably 1 to 10, more preferably 1 It means a base sequence in which ˜5 arbitrary number of bases are deleted, substituted or added.
例えば、これら１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるＤＮＡ（変異ＤＮＡ）は、化学合成、ＤＮＡ工学的手法、突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法により作製することもできる。具体的には、配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、ＤＮＡ工学的な手法等を用いて、これらＤＮＡに変異を導入することにより、変異ＤＮＡを取得することができる。ＤＮＡ工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は、特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989.以後 "モレキュラークローニング第２版" と略す）、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38,John Wiley & Sons (1987-1997)等に記載の方法に準じて行うことができる。この変異ＤＮＡを適切な発現系を用いて発現させることにより、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドを得ることができる。 For example, DNA (mutant DNA) comprising a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted or added can be obtained by any method known to those skilled in the art such as chemical synthesis, DNA engineering techniques, mutagenesis, etc. Can also be produced. Specifically, the DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is mutated using a method of contacting with a drug that is a mutagen, a method of irradiating with ultraviolet rays, a DNA engineering method, etc. Mutant DNA can be obtained by introducing. Site-directed mutagenesis, which is one of DNA engineering techniques, is useful because it can introduce a specific mutation at a specific position. Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY., 1989. (hereinafter abbreviated as "Molecular Cloning 2nd Edition"), Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-38, John Wiley & Sons (1987-1997), etc. Can be done. By expressing this mutant DNA using an appropriate expression system, a peptide having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, or added can be obtained.
上記「配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列」とは、配列番号２に示されるアミノ酸配列との相同性が６０％以上であれば特に制限されるものではなく、例えば、６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上であることを意味する。 The “amino acid sequence having at least 60% or more homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2” is particularly limited as long as the homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is 60% or more. Instead, for example, it means 60% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, still more preferably 90% or more, particularly preferably 95% or more, and most preferably 98% or more.
上記「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸をプローブとして使用し、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られる塩基配列を意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍程度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラークローニング第２版等に記載されている方法に準じて行うことができる。 The above-mentioned “base sequence that hybridizes under stringent conditions” means that a nucleic acid such as DNA or RNA is used as a probe, and a colony hybridization method, a plaque hybridization method, a Southern blot hybridization method, or the like is used. Specifically, using a filter in which DNA derived from colonies or plaques or a fragment of the DNA is immobilized, the DNA is high at 65 ° C. in the presence of 0.7 to 1.0 M NaCl. After hybridization, the filter is washed under conditions of 65 ° C. using an SSC solution of about 0.1 to 2 times (the composition of a 1-fold concentration SSC solution is 150 mM sodium chloride, 15 mM sodium citrate). The DNA which can be identified can be mentioned. Hybridization can be performed according to the method described in Molecular Cloning 2nd edition.
例えば、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げることができ、例えば６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡを好適に例示することができる。 For example, DNA that can hybridize under stringent conditions can include DNA having a certain degree of homology with the base sequence of the DNA used as a probe, for example, 60% or more, preferably 70%. Preferred examples thereof include DNA having homology of 80% or more, more preferably 90% or more, particularly preferably 95% or more, and most preferably 98% or more.
本件ＤＮＡの取得方法や調製方法は特に限定されるものでなく、本明細書中に開示した配列番号１等又は配列番号２等に示される塩基配列情報又はアミノ酸配列情報に基づいて適当なブローブやプライマーを調製し、それらを用いて当該ＤＮＡが存在することが予測されるｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより目的のＤＮＡを単離したり、常法に従って化学合成により調製することができる。 The method for obtaining and preparing the present DNA is not particularly limited, and suitable probes or amino acid sequence information shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 disclosed in the present specification may be used. The target DNA can be isolated by preparing primers and using them to screen a cDNA library in which the DNA is expected to exist, or can be prepared by chemical synthesis according to a conventional method.
具体的には、本件ＤＮＡ[１]が単離された動物より、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、次いで、このライブラリーから、ＥＡＡＣ１遺伝子の塩基配列情報に基づいて適当なプローブを作製し、かかるプローブを用いて所望クローンを選抜することにより、本件ＤＮＡ[１]を取得することができる。上記ｃＤＮＡの起源としては、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ウサギ、イヌ等の動物由来の各種の細胞または組織を例示することができ、また、これらの細胞又は組織からの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニングなどはいずれも常法に従って実施することができる。本件ＤＮＡ[１]をｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法は、例えば、モレキュラークローニング第２版に記載の方法等、当業者により常用される方法を挙げることができる。ヒト、ウシ、ウサギ、イヌ、マウス、ラット由来の本件ＤＮＡ[Ｉ]の塩基配列を、それぞれ配列番号１、３、５、７、９、１１として例示する（図１参照）。また、ヒトＥＡＡＣ１遺伝子の塩基配列を配列番号１３として例示する。 Specifically, a cDNA library is prepared from the animal from which the DNA [1] is isolated according to a conventional method, and then an appropriate probe is prepared from the library based on the nucleotide sequence information of the EAAC1 gene. The present DNA [1] can be obtained by selecting a desired clone using such a probe. Examples of the origin of the cDNA include various cells or tissues derived from animals such as humans, mice, rats, cows, rabbits, dogs, etc. In addition, isolation of total RNA from these cells or tissues, mRNA Isolation and purification, cDNA acquisition and cloning thereof can all be performed according to conventional methods. Examples of the method for screening the present DNA [1] from a cDNA library include methods commonly used by those skilled in the art, such as the method described in Molecular Cloning 2nd edition. The nucleotide sequences of the DNA [I] derived from human, bovine, rabbit, dog, mouse, and rat are exemplified as SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, and 11 (see FIG. 1). The base sequence of the human EAAC1 gene is exemplified as SEQ ID NO: 13.
また、上記（Ｂ）〜（Ｆ）のいずれかに示される塩基配列からなる変異ＤＮＡ又は相同ＤＮＡとしては、配列番号１、３、５、７又は９に示される塩基配列又はその一部を有するＤＮＡ断片を利用し、他の生物体等より、該ＤＮＡのホモログを適当な条件下でスクリーニングすることにより単離することができる。その他、前述の変異ＤＮＡの作製方法により調製することもできる。 The mutant DNA or homologous DNA consisting of the base sequence shown in any of (B) to (F) above has the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 or 9 or a part thereof. DNA fragments can be used to isolate homologs of the DNA from other organisms by screening under appropriate conditions. In addition, it can also be prepared by the aforementioned method for producing mutant DNA.
本件ペプチドの取得・調製方法は特に限定されず、天然由来のペプチドでも、化学合成したペプチドでも、ＤＮＡ組換え技術により作製した組み換えペプチドの何れでもよい。天然由来のペプチドを取得する場合には、かかるペプチドを発現している細胞又は組織からペプチドの単離・精製方法を適宜組み合わせることにより、本件ペプチド]１[を取得することができる。化学合成によりペプチドを調製する場合には、例えば、Fmoc法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)、tBoc法(t−ブチルオキシカルボニル法)等の化学合成法に従って本件ペプチドを合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して本件ペプチドを合成することもできる。ＤＮＡ組換え技術によりペプチドを調製する場合には、該ペプチドをコードする塩基配列からなるＤＮＡを好適な発現系に導入することにより本件ペプチドを調製することができる。 The method for obtaining and preparing the present peptide is not particularly limited, and may be a naturally occurring peptide, a chemically synthesized peptide, or a recombinant peptide produced by a DNA recombination technique. When a naturally-occurring peptide is obtained, the present peptide] 1 [can be obtained by appropriately combining peptide isolation / purification methods from cells or tissues expressing such peptide. When a peptide is prepared by chemical synthesis, the peptide can be synthesized according to a chemical synthesis method such as Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) or tBoc method (t-butyloxycarbonyl method). Moreover, this peptide can also be synthesize | combined using various commercially available peptide synthesizers. When a peptide is prepared by a DNA recombination technique, the present peptide can be prepared by introducing DNA consisting of a base sequence encoding the peptide into a suitable expression system.
例えば、ＤＮＡ組換え技術によって本件ペプチドを調製する場合、かかるペプチドを細胞培養物から回収し精製するには、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法、好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが用いられる。特に、アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、本件ペプチドに対するモノクローナル抗体等の抗体を結合させたカラムや、上記本件ペプチドに通常のペプチドタグを付加した場合は、このペプチドタグに親和性のある物質を結合したカラムを用いることにより、これらのペプチドの精製物を得ることができる。 For example, when preparing the peptides by DNA recombination techniques, such peptides can be recovered from cell culture and purified by ammonium sulfate or ethanol precipitation, acid extraction, anion or cation exchange chromatography, phosphocellulose chromatography, hydrophobic Known methods including interaction chromatography, affinity chromatography, hydroxyapatite chromatography and lectin chromatography, preferably high performance liquid chromatography are used. In particular, as a column used for affinity chromatography, for example, a column to which an antibody such as a monoclonal antibody against the peptide of the present invention is bound, or when a normal peptide tag is added to the peptide of the present invention, the peptide tag has an affinity. By using a column to which substances are bound, purified products of these peptides can be obtained.
さらに、配列番号２に示されるアミノ酸配列（ＭＧＫＰＡＲＫＧＣＥＷＫＲＦＬＫＮ）を有するヒト由来の本件ペプチド[１]において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の一例を示す配列番号１に示される塩基配列の情報に基づいて当業者であれば適宜調製又は取得することができる。例えば、配列番号１に示される塩基配列又はその一部を有するＤＮＡをプローブとしてヒト以外の生物より、該ＤＮＡのホモログを適当な条件下でスクリーニングすることにより単離することができる。このホモログＤＮＡの全長ＤＮＡをクローニング後、発現ベクターに組み込み適当な宿主で発現させることにより、該ホモログＤＮＡによりコードされるペプチド、例えば、ウシ（ＭＧＫＰＡＲＫＧＣＤＷＫＲＦＬＲＮ；配列番号４）、ウサギ（ＭＧＫＰＡＲＫＧＣＤＳＫＲＦＬＫＮ；配列番号６）、イヌ（ＭＧＫＰＡＲＫＧＣＤＣＲＲＦＬＲＮ；配列番号８）、マウス（ＭＧＫＰＴＳＳＧＣＤＷＲＲＦＬＲＮ；配列番号１０）、ラット（ＭＧＫＰＴＳＳＧＣＤＷＲＲＦＬＲＮ；配列番号１２）を製造することもできる（図１参照）。また、ヒトＥＡＡＣ１のアミノ酸配列を配列番号１４として例示する。 Furthermore, in the present peptide [1] derived from human having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (MGKPARKGCEWKRFLKN), a peptide consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added, or A peptide comprising an amino acid sequence having 60% or more homology with the amino acid sequence shown is based on the information of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 showing an example of the base sequence encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. Those skilled in the art can appropriately prepare or obtain them. For example, the DNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a part thereof can be used as a probe to isolate a DNA homolog by screening under appropriate conditions from a non-human organism. After cloning the full-length DNA of this homolog DNA, it is incorporated into an expression vector and expressed in a suitable host, whereby a peptide encoded by the homolog DNA, for example, bovine (MGKPARKGCDWKRFLRN; SEQ ID NO: 4), rabbit (MGKPARKGCDSKRFLKN; SEQ ID NO: 6 ), Dogs (MGKPARKGCDCRRFRLRN; SEQ ID NO: 8), mice (MGKPTSSGCDWRRFRLRN; SEQ ID NO: 10), and rats (MGKPTSSGCDWRRFLRRN; SEQ ID NO: 12) can also be produced (see FIG. 1). The amino acid sequence of human EAAC1 is exemplified as SEQ ID NO: 14.
本件ペプチド[１]を特異的にミトコンドリア内へ移行させるために、本件ペプチド[１]のＮ末端側に、本件ペプチド[１]をミトコンドリアに移行させることができるタンパク質導入ドメインが連結されているタンパク質導入ドメイン結合ペプチド、すなわち本件ペプチド[２]を調製することができる。タンパク質導入ドメインとしては、ＨＩＶウイルスのＴａｔタンパク質のもつ１１アミノ酸残基からなるタンパク質導入ドメイン（protein transduction domain；ＰＴＤ）のＴａｔ配列（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ；配列番号１５）の他、多くのミトコンドリア分子が有しているミトコンドリア移行シグナルペプチド、例えばヒトチトクロームｃ酸化酵素のサブユニットVIIIの移行シグナルペプチド（ＭＳＶＬＴＰＬＬＬＲＧＬＴＧＳＡＲＲＬＰＶＰＲＡＫ；配列番号１６）、ヒトオルニチントランスカルバミラーゼの移行シグナルペプチド（ＭＬＦＮＬＲＩＬＬＮＮＡＡＦＲＮＧＨＮＦＭＶＲＮＦＲＣＧＱＰＬＱ；配列番号１７）等を好適に例示することができる。なお反対に、Ｔａｔ配列の代わりに小胞体（ＥＲ）移行シグナルペプチドなどを用いてミトコンドリアに移行させなくすることも可能である。 In order to specifically transfer this peptide [1] into mitochondria, a protein transduction domain capable of transferring this peptide [1] to mitochondria is linked to the N-terminal side of this peptide [1]. A transduction domain-binding peptide, ie the present peptide [2] can be prepared. As a protein transduction domain, many mitochondrial molecules have a Tat sequence (YGRKKRRQRRRR; SEQ ID NO: 15) of a protein transduction domain (PTD) consisting of 11 amino acid residues of the Tat protein of HIV virus. Mitochondrial transition signal peptides such as human cytochrome c oxidase subunit VIII transition signal peptide (MSVLTPLLLLRGLTGSARRRVPPRAK; SEQ ID NO: 16), human ornithine transcarbamylase transition signal peptide (MLFNLRILLNLNAAFRNGHNFVRCGQPLQ; SEQ ID NO: 17) be able to. On the other hand, it is also possible to prevent transfer to the mitochondria using an endoplasmic reticulum (ER) transfer signal peptide or the like instead of the Tat sequence.
また、本件ペプチド[１]を特異的にミトコンドリア内へ移行させるために、細胞内に本件ペプチド[２]を導入する方法として、巨大分子と非共有結合体を形成し、タンパク質等の巨大分子の構造を変化させ、タンパク質等の巨大分子を細胞内にデリバリーすることができるChariot（Active Motif社製）等の細胞毒性のない試薬を用いることができるが、本件ペプチド[２]をコードする本件ＤＮＡ[２]を含む組換えベクターを構築し、細胞内に遺伝子導入することにより、細胞内で本件ペプチド[２]を発現させ、ミトコンドリア内へ本件ペプチド[１]を移行させることもできる。 In order to transfer the peptide [1] specifically into mitochondria, a method for introducing the peptide [2] into cells is to form a non-covalent conjugate with a macromolecule, Non-cytotoxic reagents such as Chariot (manufactured by Active Motif) that can change the structure and deliver macromolecules such as proteins into cells can be used, but the DNA encoding the peptide [2] By constructing a recombinant vector containing [2] and introducing a gene into the cell, the peptide [2] can be expressed in the cell and the peptide [1] can be transferred into the mitochondria.
また、配列番号１０に示されるマウスの本件ペプチド[１]のＮ末から９番目のアミノ酸であるシステイン（Ｃｙｓ）をアラニンに置換したＣ９Ａペプチド（ＭＧＫＰＴＳＳＧＡＤＷＲＲＦＬＲＮ；配列番号１８）をＴａｔ配列に結合したＴａｔ結合Ｃ９Ａペプチドでは殺細胞効果は認められなかったことから、本件ペプチドのＨＣＣＳ活性阻害の作用には、９番目のアミノ酸のシステインが必須であることがわかった。したがって、本件ペプチド[１]や本件ＤＮＡ[１]においては、Ｎ末から９番目にシステインを有するアミノ酸配列からなるペプチドや該ペプチドをコードするＤＮＡを好適に例示することができ、中でも、ヒト（配列番号２）、ウシ（配列番号４）、ウサギ（配列番号６）、イヌ（配列番号８）、マウス（配列番号１０）、ラット（配列番号１２）のアミノ酸配列比較から、Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ1−Ｘａａ2−Ｘａａ3−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｘａａ4−Ｘａａ5−Ｘａａ6−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｘａａ7−Ａｓｎ（式中、Ｘａａ1はＡｌａ又はＴｈｒを、Ｘａａ2はＡｒｇ又はＳｅｒを、Ｘａａ3はＬｙｓ又はＳｅｒを、Ｘａａ4はＧｌｕ又はＡｓｐを、Ｘａａ5はＴｒｐ，Ｓｅｒ又はＣｙｓを、Ｘａａ6はＬｙｓ又はＡｒｇを、Ｘａａ7はＬｙｓ又はＡｒｇをそれぞれ表す。；配列番号１９）で表されるペプチドや該ペプチドをコードするＤＮＡを好適に例示することができる。同様に、上記本件ペプチド[１]や本件ＤＮＡ[１]に相当する本件ペプチド[２]や本件ＤＮＡ[２]を好適なものとして例示することができる。例えば、上記Ｎ末から９番目のシステインを中心とした領域の３次元構造に基づいて、あるいは動物間で保存されている領域情報に基づいて、本件ペプチドと同等の作用を有する低分子のＨＣＣＳ阻害薬の開発を行うことが容易となる。 In addition, the Tat sequence in which the C9A peptide (MGKPTSSGADWRRFRNRN; SEQ ID NO: 18) in which the cysteine (Cys), which is the ninth amino acid from the N terminus of the present peptide [1] of the mouse shown in SEQ ID NO: 10 is substituted with alanine, is bound to the Tat sequence. Since the cytocidal effect was not observed with the conjugated C9A peptide, it was found that the cysteine of the ninth amino acid is essential for the action of the present peptide to inhibit the HCCS activity. Therefore, in the present peptide [1] and the present DNA [1], a peptide consisting of an amino acid sequence having a cysteine at the 9th position from the N-terminus and a DNA encoding the peptide can be preferably exemplified. From the amino acid sequence comparison of SEQ ID NO: 2), bovine (SEQ ID NO: 4), rabbit (SEQ ID NO: 6), dog (SEQ ID NO: 8), mouse (SEQ ID NO: 10), rat (SEQ ID NO: 12), Met-Gly-Lys -Pro-Xaa 1 -Xaa 2 -Xaa 3 -Gly-Cys-Xaa 4 -Xaa 5 -Xaa 6 -Arg-Phe-Leu-Xaa 7 -Asn (where Xaa 1 represents Ala or Thr, Xaa 2 represents Arg or Ser, Xaa 3 is Lys or Ser, Xaa 4 is Glu or Asp, Xaa 5 is Trp, Ser or Cys, Xaa 6 is Lys or A rg, Xaa 7 represents Lys or Arg, respectively; a peptide represented by SEQ ID NO: 19) and a DNA encoding the peptide can be preferably exemplified. Similarly, the present peptide [2] and the present DNA [2] corresponding to the present peptide [1] and the present DNA [1] can be preferably exemplified. For example, based on the three-dimensional structure of the region centering on the 9th cysteine from the N-terminal, or based on region information conserved between animals, small molecule HCCS inhibition having the same action as the present peptide It becomes easy to develop drugs.
本発明の融合ペプチドとしては、上記本件ペプチドとマーカータンパク質及び／又はペプチドタグとが結合しているものであればどのようなものでもよい。マーカータンパク質としては、従来知られているマーカータンパク質であれば特に制限されるものではなく、例えば、アルカリフォスファターゼ、ＨＲＰ等の酵素、抗体のＦｃ領域、ＧＦＰ等の蛍光物質などを具体的に挙げることができ、また本発明におけるペプチドタグとしては、ＨＡ、ＦＬＡＧ、Ｍｙｃ等のエピトープタグや、ＧＳＴ、マルトース結合タンパク質、ビオチン化ペプチド、オリゴヒスチジン等の親和性タグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例示することができる。かかる融合ペプチドは、常法により作製することができ、Ｎｉ−ＮＴＡとＨｉｓタグの親和性を利用した本件ペプチドの精製や、本件ペプチドの検出や、本件ペプチドに対する抗体の定量や、その他当該分野の研究用試薬としても有用である。 The fusion peptide of the present invention may be any peptide as long as the peptide of the present invention is bound to a marker protein and / or a peptide tag. The marker protein is not particularly limited as long as it is a conventionally known marker protein. Specific examples include an enzyme such as alkaline phosphatase and HRP, an Fc region of an antibody, and a fluorescent substance such as GFP. As peptide tags in the present invention, conventionally known peptide tags such as epitope tags such as HA, FLAG, and Myc, and affinity tags such as GST, maltose binding protein, biotinylated peptide, oligohistidine, etc. Specific examples can be given. Such a fusion peptide can be prepared by a conventional method. Purification of the peptide using the affinity between Ni-NTA and His tag, detection of the peptide, quantification of an antibody against the peptide, and other related fields. It is also useful as a research reagent.
本発明の組換えベクターとしては、前記本件ＤＮＡを含み、かつ上記本件ペプチドを発現することができる組換えベクターであれば特に制限されず、本発明の組換えベクターは、本件ＤＮＡを、例えば動物細胞発現用の発現ベクターに適切にインテグレイトすることにより構築することができる。かかる発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製可能であるものや、あるいは宿主細胞の染色体中へ組込み可能であるものが好ましく、また、本件ＤＮＡを発現できる位置にプロモーター、エンハンサー、ターミネーター等の制御配列を含有しているものを好適に使用することができる。また、発現系としては、上記本件ペプチドを宿主細胞内で発現させることができる発現系であればどのようなものでもよく、染色体、エピソーム及びウイルスに由来する発現系、例えば、細菌プラスミド由来、酵母プラスミド由来、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス由来のベクター、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来及びこれらの組合せに由来するベクター、例えば、コスミドやファージミドのようなプラスミドとバクテリオファージの遺伝的要素に由来するものを挙げることができる。 The recombinant vector of the present invention is not particularly limited as long as it contains the DNA of the present invention and can express the peptide of the present invention. It can be constructed by appropriately integrating into an expression vector for cell expression. Such an expression vector is preferably one that can replicate autonomously in the host cell or one that can be integrated into the chromosome of the host cell, and a control sequence such as a promoter, enhancer, or terminator at a position where the present DNA can be expressed. What contains can be used suitably. The expression system may be any expression system that can express the peptide of the present invention in a host cell, such as an expression system derived from a chromosome, episome, or virus, such as a bacterial plasmid, yeast Plasmid-derived, papovavirus such as SV40, vaccinia virus, adenovirus, fowlpox virus, pseudorabies virus, retrovirus-derived vector, bacteriophage-derived, transposon-derived and combinations thereof, such as cosmids and phagemids And those derived from the genetic elements of such plasmids and bacteriophages.
また、異なる細胞種が混在する組織や腫瘍組織では、特定の細胞種あるいは癌細胞など細胞種の選択性・特異性を引き出すため、アデノウイルスなどのウイルスベクターを有利に用いることができる。この場合、Ｃｒｅ−ＬｏｘＰなどの系を用いることで容易に細胞種特異的に本件ペプチドを発現させることも可能となる。これにより、特定の細胞種特異的に本ペプチドの殺細胞作用と細胞生存作用を発揮することができる。 In addition, in a tissue or tumor tissue in which different cell types are mixed, a virus vector such as an adenovirus can be advantageously used in order to extract selectivity and specificity of a cell type such as a specific cell type or cancer cell. In this case, by using a system such as Cre-LoxP, the present peptide can be easily expressed in a cell type-specific manner. Thereby, the cell killing action and cell survival action of this peptide can be exhibited specifically for a specific cell type.
本発明の形質転換体としては、上記本発明の組換えベクターが導入され、かつ上記本件ペプチドを発現する形質転換体であれば特に制限されず、形質転換酵母、形質転換植物（細胞、組織、個体）、形質転換細菌、形質転換動物（細胞、組織、個体）を挙げることができるが、形質転換動物細胞が好ましい。動物細胞宿主としては、ナマルバ細胞、ＣＯＳ１細胞、ＣＯＳ７細胞、ＣＨＯ細胞等を挙げることができる。動物細胞への組み換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポーレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を用いることができる。 The transformant of the present invention is not particularly limited as long as it is a transformant into which the above-described recombinant vector of the present invention has been introduced and expresses the peptide of the present invention. Transformed yeast, transformed plants (cells, tissues, Individuals), transformed bacteria, and transformed animals (cells, tissues, individuals), but transformed animal cells are preferred. Examples of animal cell hosts include Namalva cells, COS1 cells, COS7 cells, CHO cells and the like. As a method for introducing a recombinant vector into animal cells, for example, an electroporation method, a calcium phosphate method, a lipofection method, or the like can be used.
本件ペプチドを特異的に認識することができる抗体としては、本件ペプチド[１]に特異的に結合する抗体が好ましく、かかる抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等の免疫特異的な抗体を具体的に挙げることができ、これらは本件ペプチド[１]を抗原として用いて常法により作製することができるが、その中でもモノクローナル抗体がその特異性の点でより好ましい。かかるモノクローナル抗体等の本件ペプチドに特異的に結合する抗体は、例えば、本件ペプチド[１]の変異又は欠失に起因する疾病の診断や本件ペプチド[１]の分子機構を明らかにする上で有用である。 As an antibody capable of specifically recognizing the present peptide, an antibody that specifically binds to the present peptide [1] is preferable, and as such an antibody, a monoclonal antibody, a polyclonal antibody, a chimeric antibody, a single chain antibody, a human Specific examples include immunospecific antibodies such as conjugated antibodies, and these can be prepared by conventional methods using the present peptide [1] as an antigen. Among them, monoclonal antibodies are characterized by their specificity. And more preferable. Such an antibody that specifically binds to the peptide, such as a monoclonal antibody, is useful for, for example, diagnosing diseases caused by mutation or deletion of the peptide [1] and clarifying the molecular mechanism of the peptide [1]. It is.
本件ペプチドに対する抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒト以外）に該ペプチド又はエピトープを含む断片を投与することにより産生され、例えばモノクローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物により産生される抗体をもたらす、ハイブリドーマ法（Nature 256, 495-497, 1975）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Immunology Today 4, 72, 1983）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp.77-96, Alan R.Liss, Inc., 1985）など任意の方法を用いることができる。以下に本件ペプチド[１]として、ヒト由来のペプチドを例に挙げてマウス由来の本件ペプチド[１]に対して特異的に結合するモノクローナル抗体の作製方法を説明する。 An antibody against the peptide is produced by administering a fragment containing the peptide or epitope to an animal (preferably a non-human) using a conventional protocol. For example, for the preparation of a monoclonal antibody, a continuous cell line culture is used. Hybridoma method (Nature 256, 495-497, 1975), trioma method, human B cell hybridoma method (Immunology Today 4, 72, 1983) and EBV-hybridoma method (MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp. 77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985) can be used. Hereinafter, as the present peptide [1], a method for producing a monoclonal antibody that specifically binds to the present peptide [1] derived from a mouse will be described taking a human-derived peptide as an example.
上記本発明のモノクローナル抗体は、該モノクローナル抗体産生ハイブリドーマをインビボ又はインビトロで常法により培養することにより生産することができる。例えば、インビボ系においては、齧歯動物、好ましくはマウス又はラットの腹腔内で培養することにより、またインビトロ系においては、動物細胞培養用培地で培養することにより得ることができる。インビトロ系でハイブリドーマを培養するための培地としては、ストレプトマイシンやペニシリン等の抗生物質を含むＲＰＭＩ１６４０又はＭＥＭ等の細胞培養培地を例示することができる。 The monoclonal antibody of the present invention can be produced by culturing the monoclonal antibody-producing hybridoma in vivo or in vitro by a conventional method. For example, in an in vivo system, it can be obtained by culturing in the abdominal cavity of a rodent, preferably a mouse or a rat. In an in vitro system, it can be obtained by culturing in an animal cell culture medium. As a medium for culturing a hybridoma in an in vitro system, a cell culture medium such as RPMI 1640 or MEM containing an antibiotic such as streptomycin or penicillin can be exemplified.
上記本発明のルモノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、例えば、ヒト、ラット、イヌ等から得られた本件ペプチド[１]を用いてＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫し、免疫されたマウスの脾臓細胞とマウスＮＳ−１細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１８）とを、常法により細胞融合させ、免疫蛍光染色パターンによりスクリーニングすることにより、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作出することができる。また、かかるモノクローナル抗体の分離・精製方法としては、ペプチドやタンパク質の精製に一般的に用いられる方法であればどのような方法でもよく、アフィニティークロマトグラフィー等の液体クロマトグラフィーを具体的に例示することができる。 The le monoclonal antibody-producing hybridoma of the present invention immunizes BALB / c mice using the peptide [1] obtained from, for example, humans, rats, dogs, etc., and spleen cells of the immunized mice and mouse NS- By hybridizing one cell (ATCC TIB-18) with a conventional method and screening with an immunofluorescent staining pattern, a hybridoma producing the monoclonal antibody of the present invention can be produced. In addition, as a method for separating and purifying the monoclonal antibody, any method generally used for the purification of peptides and proteins may be used, and liquid chromatography such as affinity chromatography is specifically exemplified. Can do.
また、本発明の上記本件ペプチド[１]に対する一本鎖抗体をつくるためには、一本鎖抗体の調製法（米国特許第4,946,778号）を適用することができる。また、ヒト化抗体を発現させるために、トランスジェニックマウス又は他の哺乳動物等を利用したり、上記抗体を用いて、本件ペプチド[１]を発現するクローンを単離・同定したり、アフィニティークロマトグラフィーで本件ペプチドを精製することもできる。本件ペプチドに対する抗体は、本件ペプチドの分子機構を明らかにする上で有用である。 In order to produce a single-chain antibody against the peptide [1] of the present invention, a method for preparing a single-chain antibody (US Pat. No. 4,946,778) can be applied. In order to express humanized antibodies, transgenic mice or other mammals are used, clones expressing the peptide [1] are isolated and identified using the above antibodies, affinity chromatography The peptide can also be purified by chromatography. The antibody against the present peptide is useful for clarifying the molecular mechanism of the present peptide.
また上記本件ペプチドに対するモノクローナル抗体等の抗体に、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）又はテトラメチルローダミンイソシアネート等の蛍光物質や、125Ｉ、32Ｐ、14Ｃ、35Ｓ又は3Ｈ等のラジオアイソトープや、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ又はフィコエリトリン等の酵素で標識したものや、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光発光タンパク質などを融合させた融合タンパク質を用いることによって、本件ペプチドの機能解析を有利に行うことができる。また、本発明の抗体を用いた免疫学的測定方法としては、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、血球凝集反応法、オクタロニー法等の方法を挙げることができる。 In addition, antibodies such as monoclonal antibodies against the peptide of the present invention include, for example, fluorescent substances such as FITC (fluorescein isocyanate) or tetramethylrhodamine isocyanate, radioisotopes such as 125 I, 32 P, 14 C, 35 S or 3 H, The functional analysis of the peptide is advantageous by using a fusion protein fused with an enzyme such as alkaline phosphatase, peroxidase, β-galactosidase or phycoerythrin, or a fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP). It can be carried out. Examples of the immunological measurement method using the antibody of the present invention include RIA method, ELISA method, fluorescent antibody method, plaque method, spot method, hemagglutination method, and octalony method.
本発明のトランスジェニック非ヒト動物としては、本件ＤＮＡが導入され、本件ペプチドを過剰発現する非ヒト動物であれば特に制限されるものではなく、ここで、本件ペプチドを過剰発現するとは、野生型の非ヒト動物の本件ペプチド発現量に比べて有意に多量の本件ペプチドを発現することをいう。また、上記非ヒト動物としては、ラット，マウス，ウシ，ブタ，ニワトリ，カエル，ヒト，イヌ，ウサギ等を挙げることができるが、中でもマウスやラットが好ましい。また、本発明のトランスジェニック非ヒト動物の好ましい態様として、ホモ体であるトランスジェニック非ヒト動物を挙げることができる。かかる変異染色体をホモに有するホモ体は、染色体をヘテロに有するマウス等の非ヒト動物同士を交配することにより得ることができ、本件ペプチド発現量がヘテロ体よりも多いことから、実験モデル動物として特に好ましい。本件ＤＮＡが導入され、本件ペプチドを過剰発現するトランスジェニック非ヒト動物は、細胞死防除効果、特に神経細胞死防除効果を有する。本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、細胞死、特に神経細胞死等に関する実験モデル動物として有用である。 The transgenic non-human animal of the present invention is not particularly limited as long as it is a non-human animal into which the present DNA has been introduced and overexpresses the present peptide. This means that the present peptide is expressed in a significantly larger amount than that of the non-human animal. Examples of the non-human animals include rats, mice, cows, pigs, chickens, frogs, humans, dogs, rabbits, etc. Among them, mice and rats are preferable. Moreover, as a preferable embodiment of the transgenic non-human animal of the present invention, a transgenic non-human animal that is a homozygote can be mentioned. A homozygote having such a mutated chromosome can be obtained by crossing non-human animals such as mice having a heterozygous chromosome, and since the present peptide expression level is higher than that of the heterozygote, Particularly preferred. The transgenic non-human animal into which the present DNA is introduced and overexpresses the present peptide has a cell death control effect, particularly a nerve cell death control effect. The transgenic non-human animal of the present invention is useful as an experimental model animal for cell death, particularly nerve cell death.
本発明のトランスジェニック非ヒト動物の作製方法としては、公知のトランスジェニック動物の作製方法（例えば、Proc. Natl. Acad.Sci. USA 77:7380-7384,1980）を挙げることができる。例えば、本件ペプチドトランスジェニックマウスを創製する方法としては、常法により調製した本件ＤＮＡを発現ベクターに導入し、この遺伝子発現ベクターをリニアライズした導入遺伝子を含む直鎖ＤＮＡフラグメントをマウス受精卵雄性前核にマイクロインジェクションし、この受精卵あるいは２細胞期胚を仮親マウスの卵管に移植し、仔マウスを発生させ、その産仔の組織から抽出したＤＮＡを用いてＰＣＲ法等により、本件ＤＮＡが組み込まれていることを確認する方法等を挙げることができる。 Examples of the method for producing a transgenic non-human animal of the present invention include known methods for producing a transgenic animal (for example, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 7380-7384, 1980). For example, as a method for creating the present peptide transgenic mouse, the present DNA prepared by a conventional method is introduced into an expression vector, and a linear DNA fragment containing a transgene obtained by linearizing the gene expression vector is introduced into a male fertilized ovary. Microinjected into the nucleus, this fertilized egg or 2-cell stage embryo is transplanted into the oviduct of a foster mother mouse, a pup mouse is generated, and the DNA is extracted from the pup tissue by PCR or the like. The method of confirming that it is incorporated can be mentioned.
本発明のスクリーニング方法としては、本件ペプチド[１]又は本件ペプチド[１]を発現することができる本発明の組換えベクターと被検物質とを、ラットやマウス等の被験非ヒト動物に投与し、細胞死防御活性の程度を測定・評価する細胞死防御活性の促進物質又は抑制物質のスクリーニング方法や、本件ペプチド[２]又は本件ペプチド[２]を発現することができる本発明の組換えベクターと被検物質とを、ラットやマウス等の被験非ヒト動物に投与し、細胞殺傷活性の程度を測定・評価する細胞殺傷活性の促進物質又は抑制物質のスクリーニング方法であれば特に制限されるものではなく、具体的には、ラットやマウス等の被験非ヒト動物に本件ペプチドや組換えベクターを経静脈的に投与する前後、あるいは投与と同時に被検物質を経口若しくは非経口的に投与し、細胞死防御活性や細胞殺傷活性の程度を測定し、被検物質を投与しない対照の測定値と比較・評価することにより、細胞死防御活性や細胞殺傷活性の促進物質や抑制物質をスクリーニングすることができる。 As the screening method of the present invention, the present peptide [1] or the recombinant vector of the present invention capable of expressing the present peptide [1] and the test substance are administered to a test non-human animal such as a rat or mouse. , A method for screening or evaluating a cell death protective activity promoting or inhibiting substance for measuring / evaluating the degree of cell death protective activity, and the recombinant vector of the present invention capable of expressing the present peptide [2] or the present peptide [2] And a test substance are administered to a test non-human animal such as a rat or mouse, and the screening method for a cell killing activity promoter or inhibitor is particularly limited. Specifically, the test substance is orally administered before, after, or simultaneously with intravenous administration of the peptide or recombinant vector to non-human animals such as rats and mice. It is administered parenterally, the degree of cell death protection activity and cell killing activity is measured, and compared with the measurement value of the control to which the test substance is not administered, the cell death protection activity and cell killing activity are measured. Promoters and inhibitors can be screened.
上記被検物質として、本発明のトランスジェニック非ヒト動物を用いることもでき、また、上記被検物質としては、動植物・微生物からの抽出物などの天然物、化学合成により得られる化合物、各種生理活性ペプチドやタンパク質・ペプチド、従来公知の各種細胞死促進剤や細胞死抑制剤の他、各種アジュバントを例示することができる。本発明のスクリーニング方法により得られる細胞死防御活性の促進物質や細胞殺傷活性の抑制物質は、単独若しくは本件ペプチド[１]と併用することにより、筋萎縮性側索硬化症等の神経変性疾患やアポトーシスが関与する細胞死に起因する疾患の予防・治療薬として有用である可能性があり、また、細胞死防御活性の抑制物質や細胞殺傷活性の促進物質は、単独若しくは本件ペプチド[２]と併用することにより、癌・悪性腫瘍等の疾患の予防・治療薬として有用である可能性があり、さらにこれらの促進物質や阻害物質は、インビボにおけるＥＡＡＣ１とＨＣＣＳとの結合の作用機序を研究する上で有用である。 As the test substance, the transgenic non-human animal of the present invention can also be used. The test substance includes natural products such as extracts from animals, plants, and microorganisms, compounds obtained by chemical synthesis, various physiology. In addition to active peptides, proteins / peptides, conventionally known cell death promoters and cell death inhibitors, various adjuvants can be exemplified. The cell death-protecting activity-promoting substance and the cell-killing activity-suppressing substance obtained by the screening method of the present invention can be used alone or in combination with the present peptide [1], thereby causing neurodegenerative diseases such as amyotrophic lateral sclerosis, It may be useful as a prophylactic / therapeutic agent for diseases caused by cell death involving apoptosis, and a substance that suppresses cell death or promotes cell killing activity may be used alone or in combination with the peptide [2] Thus, it may be useful as a preventive / therapeutic agent for diseases such as cancer and malignant tumors, and further, these promoting substances and inhibitors study the mechanism of action of EAAC1 binding to HCCS in vivo. Useful above.
本発明のＨＣＣＳ不活化剤としては、本件ペプチド[１]又は本件ペプチド[２]からなるものであれば特に制限されず、本件ペプチド[１]や本件ペプチド[２]を発現することができる本発明の組換えベクターも、本件ペプチド[１]や本件ペプチド[２]を発現させる目的で使用する場合は、便宜上本発明のＨＣＣＳ不活化剤に含まれる。 The HCCS inactivating agent of the present invention is not particularly limited as long as it comprises the present peptide [1] or the present peptide [2], and can express the present peptide [1] or the present peptide [2]. The recombinant vector of the invention is also included in the HCCS inactivating agent of the present invention for convenience when used for the purpose of expressing the peptide [1] or the peptide [2].
本発明の細胞死防御剤としては、本件ペプチド[１]、又は本件ペプチド[１]を発現することができる本発明の組換えベクターからなり、本発明の細胞死防御作用を必要とする疾病の予防・治療薬としては、本発明の細胞死防御剤を有効成分として含有するものであればどのようなものでもよく、また本発明の細胞死防御作用を必要とする疾病の予防・治療方法としては、本発明の細胞死防御作用を必要とする疾病の予防・治療薬を投与する方法であれば制限されず、上記細胞死防御作用を必要とする疾病としては、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病等の神経変性疾患や腎不全、虚血性心疾患等のアポトーシスが関与する細胞死に起因する疾患を挙げることができる。 The cell death protective agent of the present invention comprises the peptide [1] of the present invention, or the recombinant vector of the present invention capable of expressing the peptide [1] of the present invention, and a disease requiring the cell death protective effect of the present invention. Any prophylactic / therapeutic agent may be used as long as it contains the cell death protective agent of the present invention as an active ingredient, and as a method for preventing / treating a disease requiring the cell death protective effect of the present invention. Is not limited as long as it is a method for administering the preventive / therapeutic agent for diseases requiring cell death protection according to the present invention, and the diseases requiring cell death protection include amyotrophic lateral sclerosis. In addition, neurodegenerative diseases such as multiple sclerosis, Alzheimer's disease, and Parkinson's disease, and diseases caused by cell death such as renal failure and ischemic heart disease can be mentioned.
また、本発明の細胞殺傷剤としては、本件ペプチド[２]、又は本件ペプチド[２]を発現することができる本発明の組換えベクターからなり、本発明の細胞殺傷作用を必要とする疾病の予防・治療薬としては、本発明の細胞殺傷剤を有効成分として含有するものであればどのようなものでもよく、また本発明の細胞殺傷作用を必要とする疾病の予防・治療方法としては、本発明の細胞殺傷作用を必要とする疾病の予防・治療薬を投与する方法であれば制限されず、上記細胞殺傷作用を必要とする疾病としては、悪性腫瘍・癌、水虫等の真菌感染症などの疾患を挙げることができる。 The cell killing agent of the present invention comprises the peptide [2] of the present invention, or the recombinant vector of the present invention that can express the peptide [2] of the present invention, and is used for the disease that requires the cell killing activity of the present invention. The preventive / therapeutic agent may be any as long as it contains the cell killing agent of the present invention as an active ingredient, and as a method for preventing / treating a disease requiring the cell killing effect of the present invention, The present invention is not limited as long as it is a method for administering a prophylactic / therapeutic agent for diseases requiring cell killing action, and the diseases requiring cell killing action include fungal infections such as malignant tumors / cancers and athlete's foot And other diseases.
本発明の予防・治療薬には、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を添加することができ、経口的又は非経口的に投与することができる。すなわち通常用いられる投与形態、例えば粉末、顆粒、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で経口的に投与することができ、あるいは、例えば溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射の型で非経口投与することができる他、スプレー剤の型で鼻孔内投与することもできるが、非経口投与的に投与することが好ましい。非経口的に投与する製剤の場合、蒸留水、生理的食塩水等の水溶性溶剤、サリチル酸ナトリウム等の溶解補助剤、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトール等の等張化剤、ヒト血清アルブミン等の安定化剤、メチルパラベン等の保存剤、ベンジルアルコール等の局麻剤を配合することができる。 The preventive / therapeutic agent of the present invention includes conventional pharmaceutically acceptable carriers, binders, stabilizers, excipients, diluents, pH buffers, disintegrants, solubilizers, solubilizers, etc. Various preparation ingredients such as a tonic can be added and can be administered orally or parenterally. That is, it can be administered orally in commonly used dosage forms, such as powders, granules, capsules, syrups, suspensions, etc., or, for example, in dosage forms such as solutions, emulsions, suspensions, etc. In addition to being able to be administered parenterally in the form of injection, it can also be administered intranasally in the form of a spray, but is preferably administered parenterally. For preparations for parenteral administration, water-soluble solvents such as distilled water and physiological saline, solubilizing agents such as sodium salicylate, isotonic agents such as sodium chloride, glycerin and D-mannitol, human serum albumin, etc. Stabilizers, preservatives such as methylparaben, and narcotics such as benzyl alcohol can be blended.
また、本発明の予防・治療薬の投与量は、疾病の種類、患者の体重や年齢、投与形態、症状等により適宜選定することができるが、例えば成人に投与する場合、有効成分である本件ペプチド又はそれらの薬学的に許容される塩を通常１回量として約０．０１〜１００ｎｍｏｌ／ｋｇ、好ましくは０．０５〜３０ｎｍｏｌ／ｋｇ、より好ましくは０．１〜１０ｎｍｏｌ／ｋｇであり、この量を１日１回〜３回投与するのが望ましい。本発明の心機能抑制／降圧剤を非経口的に投与するには、たとえば、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、骨髄腔内投与、経粘膜投与などを挙げることができるが、静脈内投与や皮下投与が好ましい。 The dose of the prophylactic / therapeutic agent of the present invention can be appropriately selected depending on the type of disease, the weight and age of the patient, the dosage form, symptoms, etc. For example, when administered to adults, The peptide or a pharmaceutically acceptable salt thereof is usually about 0.01 to 100 nmol / kg, preferably 0.05 to 30 nmol / kg, more preferably 0.1 to 10 nmol / kg as a single dose. It is desirable to administer the amount once to three times a day. Examples of parenteral administration of the cardiac function suppressing / hypertensive agent of the present invention include intravenous administration, subcutaneous administration, intramuscular administration, intramedullary administration, and transmucosal administration. Administration and subcutaneous administration are preferred.
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention more concretely, the technical scope of this invention is not limited to these illustrations.
［ペプチド合成］
以下のペプチドの合成は固相法を原理とするペプチド合成機を用いて行った。合成したペプチドは樹脂からの切り出しを行い、ＨＰＬＣを用いた逆相クロマトグラフィーを行い精製した。
Tat-EAAC；N-YGRKKRRQRRRMGKPTSSGCDWRRFLRN-C（配列番号２０）
Tat-EAAC-C9A ；N-YGRKKRRQRRRMGKPTSSGADWRRFLRN-C（配列番号２１）
EAAC1 peptide ；N-MGKPTSSGCDWRRFLRN-C（配列番号１０）
C9A peptide；N-MGKPTSSGADWRRFLRN-C（配列番号１８）
[Peptide synthesis]
The following peptides were synthesized using a peptide synthesizer based on the solid phase method. The synthesized peptide was excised from the resin and purified by reverse phase chromatography using HPLC.
Tat-EAAC; N-YGRKKRRQRRRMGKPTSSGCDWRRFLRN-C (SEQ ID NO: 20)
Tat-EAAC-C9A; N-YGRKKRRQRRRMGKPTSSGADWRRFLRN-C (SEQ ID NO: 21)
EAAC1 peptide; N-MGKPTSSGCDWRRFLRN-C (SEQ ID NO: 10)
C9A peptide; N-MGKPTSSGADWRRFLRN-C (SEQ ID NO: 18)
［プラスミド］
ラットＥＡＡＣ１（accession ナンバーD63772）の翻訳領域の後ろにＨＡタグを付加したインサートを哺乳類発現ベクターであるｐＭＥ１８Ｓ（genebank accession No. AB009864）にサブクローニングした。また、マウスＨＣＣＳ（accessionナンバーMMU36788）の翻訳領域の前にＦｌａｇタグを付加しｐＭＥ１８Ｓにサブクローニングした。
[Plasmid]
The insert in which the HA tag was added after the translation region of rat EAAC1 (accession number D63772) was subcloned into a mammalian expression vector pME18S (genebank accession No. AB009864). In addition, a Flag tag was added in front of the translation region of mouse HCCS (accession number MMU36788) and subcloned into pME18S.
［細胞培養］
ＰＣ１２細胞（ラット副腎髄質クロム親和性細胞腫）はコラーゲンコートした培養皿で１０％馬血清（hoese serum）、５％子牛血清（fetal bovine sreum）含有ＲＰＭＩ１６４０培地を用いて培養し、ＣＯＳ−７細胞、Ｃ６グリオーマ細胞は子牛血清含有ＤＭＥＭ培地を用いて培養した。また、一過性遺伝子導入実験では、リポフェクトアミン２０００（Invitrogen社製）を用いてリポフェクション法にて目的プラスミドをＣＯＳ−７細胞に導入し、ＥＡＡＣ１ペプチド、Ｃ９ＡペプチドをBioPORTER（GTS社製）を用いてＰＣ１２細胞へ導入した。なお、Ｔａｔ−ＥＡＡＣ１、Ｔａｔ−Ｃ９Ａペプチドは目的濃度になるよう培養上清に直接添加した。
[Cell culture]
PC12 cells (rat adrenal medullary pheochromocytoma) were cultured in a collagen-coated culture dish using RPMI 1640 medium containing 10% horse serum and 5% fetal bovine sreum, and COS-7. Cells and C6 glioma cells were cultured using a DMEM medium containing calf serum. In the transient gene introduction experiment, the target plasmid was introduced into COS-7 cells by lipofection using Lipofectamine 2000 (Invitrogen), and EAAC1 peptide and C9A peptide were bioported (GTS). And introduced into PC12 cells. The Tat-EAAC1 and Tat-C9A peptides were added directly to the culture supernatant so as to achieve the target concentrations.
［酵母ツーハイブリッドスクリーニング］
ＥＡＡＣ１Ｎ末端１−３４アミノ酸を含む領域を３回繰り返した配列をベイト（bait）としてマウスブレインライブラリー（クロンテック社製）を定法に従いスクリーニングした。
[Yeast two-hybrid screening]
A mouse brain library (manufactured by Clontech) was screened according to a standard method using a sequence containing a region containing EAAC1 N-terminal 1-34 amino acids repeated three times as a bait.
［免疫沈降法］
遺伝子導入した培養細胞に溶解バッファー（150mM NaCl, 20mM Tris-HCl (pH7.5), 10mM EDTA, 1% NP-40, 0.5% deoxycholate, 1.5% aporotinin, 1mM PMSF, Leupeptin .）を加え撹拌後３０分程度。遠心上清にＦＬＡＧ抗体（シグマ社製）を加え１時間程度４℃でインキュベートした。Protein sepharose G（Zymed社製）を加えローテーターで混合、５０００回転１分遠心後上清を除く操作を４回繰り返した。上清をすべて取り除きペレットにＳＤＳサンプルバッファーを加え煮沸後ウエスタンブロットを行った。
[Immunoprecipitation]
Lysis buffer (150mM NaCl, 20mM Tris-HCl (pH7.5), 10mM EDTA, 1% NP-40, 0.5% deoxycholate, 1.5% aporotinin, 1mM PMSF, Leupeptin.) Was added to the cultured cells after gene transfer, and the mixture was stirred 30 About minutes. FLAG antibody (manufactured by Sigma) was added to the centrifuged supernatant and incubated at 4 ° C. for about 1 hour. Protein sepharose G (manufactured by Zymed) was added, mixed with a rotator, centrifuged at 5000 rpm for 1 minute, and the operation of removing the supernatant was repeated 4 times. All the supernatant was removed, SDS sample buffer was added to the pellet, and the mixture was boiled and Western blotted.
［ウエスタンブロット］
遺伝子導入した培養細胞に溶解バッファー(50 mM Pipes/NaOH [pH 6.5], 2 mM EDTA, 0.1% CHAPS, and 5 mM DTT, 20 μg/mL leupeptin, 10 μg/mL pepstatin, 10 μg/mL aprotinin, 1 mM PMSF)を加え３回凍結融解を繰り返し遠心後上清を回収した。BCA protein assay reagent kit（Pierce社製）にて蛋白濃度を測定し３０μｇを電気泳動に使用した。ブロッティング後５％のmilk-TBSTにてブロッキングを室温下１時間行い、１０００〜２０００倍の濃度のcleaved caspase3抗体（Cell signaling社製）、HA抗体（Roche社製）を用いて４℃でオーバーナイトで反応させた。２次抗体反応後ECLdetection kit（アマシャム社製）にて目的バンドを検出した。
[Western blot]
A lysis buffer (50 mM Pipes / NaOH [pH 6.5], 2 mM EDTA, 0.1% CHAPS, and 5 mM DTT, 20 μg / mL leupeptin, 10 μg / mL pepstatin, 10 μg / mL aprotinin, 1 mM PMSF) was added, freeze-thawing was repeated three times, and the supernatant was recovered after centrifugation. The protein concentration was measured with a BCA protein assay reagent kit (Pierce) and 30 μg was used for electrophoresis. After blotting, blocking with 5% milk-TBST is performed at room temperature for 1 hour, and overnight at 4 ° C. using cleaved caspase 3 antibody (manufactured by Cell signaling) and HA antibody (manufactured by Roche) at a concentration of 1000 to 2000 times. It was made to react with. After the secondary antibody reaction, the target band was detected with an ECLdetection kit (Amersham).
［ＥＡＡＣ１過剰発現動物の作製］
ラットＥＡＡＣ１を傷害運動ニューロンに過剰発現させる目的で、ＤＩＮＥプロモーター下流にＥＡＡＣ１翻訳領域配列をつなげ、さらに外来性ＥＡＡＣ１を検出するためｉｒｅｓ−ＧＦＰ配列をつなげた。Ｉｒｅｓ（internal ribosomal entry site）とは、ＤＩＮＥプロモーター制御下に転写されたｍＲＮＡから同時にＥＡＡＣ１蛋白とＧＦＰ蛋白の２種類の蛋白の合成を可能にする配列である。以上の６．４Ｋｂ遺伝子断片はアガロース電気泳動後、ゲルより抽出し精製した。この遺伝子断片をＢＤＦ由来の受精卵にマイクロインジェクションし状態の良好な卵（２００個以上）を仮親（ＩＣＲ）の卵管に移植し自然分娩させる過程はＳＬＣ社に受託した。生まれたマウスの遺伝子導入を確認するため尾よりゲノムを抽出しＰＣＲにて確認した。ＰＣＲ用プライマーとして５'−ｏｌｉｇｏ（５'−ＧＣＡＧＡＣＡＧＡＡＧＣＡＧＣＣＴＡＴＡＡＴＣＧＡＣＣ−３'）、３'−ｏｌｉｇｏ（５'−ＴＴＣＣＴＧＡＴＣＡＧＡＴＣＣＡＡＣＡＴＧＧＣＧＴＣＣ−３'）を使用した。ＰＣＲの条件は：９４℃で１分，６４℃で１分，及び７２℃で１分を３０サイクル行い、７２℃で７分伸長した。
[Production of animals overexpressing EAAC1]
In order to overexpress rat EAAC1 in injured motor neurons, an EAAC1 translation region sequence was connected downstream of the DINE promoter, and an ires-GFP sequence was connected to detect exogenous EAAC1. Ires (internal ribosomal entry site) is a sequence that enables the synthesis of two types of proteins, EAAC1 protein and GFP protein, simultaneously from mRNA transcribed under the control of the DINE promoter. The above 6.4 Kb gene fragment was extracted from a gel and purified after agarose electrophoresis. The process of microinjecting this gene fragment into a BDF-derived fertilized egg, transplanting eggs (at least 200) in good condition into the oviduct of the temporary parent (ICR), and delivering them naturally was entrusted to SLC. In order to confirm the gene transfer of the born mouse, the genome was extracted from the tail and confirmed by PCR. As a primer for PCR, 5′-oligo (5′-GCAGACAGAGAGGCAGCCTATAATCGACC-3 ′) and 3′-oligo (5′-TTCCTGATCAGATCCAACATGGCGTCC-3 ′) were used. The PCR conditions were: 94 ° C for 1 minute, 64 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 1 minute for 30 cycles, and extension at 72 ° C for 7 minutes.
［動物の手術および切片作製］
ペントバルビタール麻酔下、右側舌下神経を眼科手術用はさみで切断した。術後５週間経過後、断頭し脳をドライアイスにて凍結した。クリオスタットにて約16μｍの厚さの凍結切片を作製し−３０℃に保存した。切片は風乾後、４％パラホルムアルデヒドにて固定し、ＰＢＳで洗浄後サイオニン染色を行い、脱水系列後、封入した。２４枚の舌下神経核の連続切片を用いて健常側と損傷側の神経細胞数を光学顕微鏡下でカウントした。
[Animal surgery and section preparation]
Under pentobarbital anesthesia, the right sublingual nerve was cut with scissors for ophthalmic surgery. After 5 weeks from the operation, the brain was decapitated and the brain was frozen with dry ice. A frozen section having a thickness of about 16 μm was prepared with a cryostat and stored at −30 ° C. The sections were air-dried, fixed with 4% paraformaldehyde, washed with PBS, stained with thionin, and sealed after dehydration. The number of healthy and injured neurons was counted under an optical microscope using 24 slices of sublingual nerve nuclei.
［ＥＡＡＣ１とＨＣＣＳの結合］
ＥＡＡＣ１のＮ末結合蛋白を探索する目的で、ＥＡＡＣ１のＮ末端をベイトとしてマウスブレインライブラリー酵母ツーハイブリッドを行った。この結果、ミトコンドリアに存在するミトコンドリア膜間腔に存在する呼吸鎖関連蛋白ＨＣＣＳをＥＡＡＣ１のＮ末端結合蛋白として得ることができた。
[Combination of EAAC1 and HCCS]
For the purpose of searching for an N-terminal binding protein of EAAC1, mouse brain library yeast two-hybrid was performed using the N-terminus of EAAC1 as a bait. As a result, the respiratory chain-related protein HCCS present in the mitochondrial intermembrane space present in mitochondria could be obtained as the N-terminal binding protein of EAAC1.
哺乳類細胞でのＥＡＡＣ１蛋白とＨＣＣＳ蛋白との結合を調べるため免疫沈降を行った。ＨＡタグを付加したＥＡＡＣ１とＦＬＡＧタグ付加したＨＣＣＳの翻訳領域を哺乳類細胞発現ベクターｐＭＥ１８Ｓに組み込み、ＣＯＳ−７細胞にトランスフェクションし共発現させた。トランスフェクション４８時間後細胞を回収し蛋白を抽出した。ＦＬＡＧタグ特異的抗体（ＦＬＡＧ）を用いた免疫沈降により抽出蛋白中のＦＬＡＧタグを有する蛋白が濃縮された。さらにこのサンプルを用いてウエスタンブロットを行うことにより、ＦＬＡＧ付加蛋白に結合している蛋白（ＨＡタグ付加蛋白）をＨＡタグ特異的抗体（ＨＡ）にて検出した。結果を図２に示す。その結果ＥＡＡＣ１とＨＣＣＳを共発現させたサンプルにおいて強いバンドが認められ、これら２つの蛋白は哺乳類細胞内でも結合することが明らかになった。 Immunoprecipitation was performed to examine the binding of EAAC1 protein and HCCS protein in mammalian cells. The translation regions of EAAC1 with HA tag and HCCS with FLAG tag were incorporated into mammalian cell expression vector pME18S and transfected into COS-7 cells for co-expression. 48 hours after transfection, the cells were recovered and the protein was extracted. The protein having the FLAG tag in the extracted protein was concentrated by immunoprecipitation using a FLAG tag specific antibody (FLAG). Further, by performing Western blotting using this sample, a protein (HA-tagged protein) bound to the FLAG-tagged protein was detected with a HA tag-specific antibody (HA). The results are shown in FIG. As a result, a strong band was observed in the sample in which EAAC1 and HCCS were co-expressed, and it was clarified that these two proteins also bind in mammalian cells.
［ｔａｔ−ＥＡＡＣ１ペプチドによる殺細胞効果］
ミトコンドリア膜間腔のＨＣＣＳを標的として、株化細胞にＴａｔ配列付加ＥＡＡＣ１のＮ末端ペプチドを添加した。Ｔａｔ配列はそれが結合したペプチドを細胞質をはじめ核やミトコンドリアへも局在させることが知られている。２４時間後に細胞生存率を生細胞数測定試薬にて測定した。結果を図３に示す。図３のグラフの縦軸はコントロール（無添加）に対する細胞生存率を示す。ＰＣ１２細胞では最終濃度１０μＭになるようＴａｔ（Ｔａｔ配列のみ；配列番号１５）、Ｔａｔ−ＥＡＡＣ１（Ｔａｔ配列にＥＡＡＣ１のＮ末１７アミノ酸を繋いだもの；配列番号２０）、Ｔａｔ−Ｃ９Ａ（Ｔａｔ配列にＥＡＡＣ１のＮ末１７アミノ酸を繋いだもので、９番目のシステインをアラニンに置換したもの；配列番号２１）の３種類のペプチドを添加した。ＣＯＳ−７細胞では最終濃度５０μＭで同様のペプチドを添加した。Ｃ６グリオーマ細胞では最終濃度０〜５０μＭの範囲でのＴａｔ−ＥＡＡＣ１ペプチドによる殺細胞効果を検討した。２４時間後には各種の株化腫瘍細胞で６０〜８０％の細胞数の現象が見られた。このように、Ｔａｔ−ＥＡＡＣ１は各種株化細胞に対して強い細胞死誘導効果を示した。また、Ｎ末端から９番目のアミノ酸であるシステインをアラニンに置換したＣ９Ａペプチドではこのような殺細胞効果は認められなかった。このことから本ペプチドの９番目のアミノ酸システインは殺細胞作用を得る上で必須のアミノ酸であることが明らかになった。
[Cell-killing effect by tat-EAAC1 peptide]
Targeting HCCS in the mitochondrial intermembrane space, an N-terminal peptide of Tat sequence-added EAAC1 was added to the cell line. The Tat sequence is known to localize the peptide to which it is bound not only in the cytoplasm but also in the nucleus and mitochondria. After 24 hours, the cell viability was measured with a living cell number measuring reagent. The results are shown in FIG. The vertical axis of the graph in FIG. 3 indicates the cell viability relative to the control (no addition). In PC12 cells, Tat (Tat sequence only; SEQ ID NO: 15), Tat-EAAC1 (Tat sequence linked to N-terminal 17 amino acids of EAAC1; SEQ ID NO: 20), Tat-C9A (Tat sequence) Three peptides of EAAC1 with the N-terminal 17 amino acids linked and the 9th cysteine substituted with alanine; SEQ ID NO: 21) were added. In COS-7 cells, the same peptide was added at a final concentration of 50 μM. In C6 glioma cells, the cell killing effect by Tat-EAAC1 peptide in the final concentration range of 0-50 μM was examined. After 24 hours, a cell number phenomenon of 60 to 80% was observed in various established tumor cells. Thus, Tat-EAAC1 exhibited a strong cell death inducing effect on various cell lines. In addition, such a cell-killing effect was not observed with the C9A peptide in which cysteine, which is the ninth amino acid from the N-terminal, was substituted with alanine. This revealed that the ninth amino acid cysteine of this peptide is an essential amino acid for obtaining a cell killing action.
［ＥＡＡＣ１のＮ末ペプチドによる細胞保護効果］
Ｔａｔ配列を持たないペプチドは主に細胞質へ導入されるがミトコンドリアや核へは移行しない。このような性質を利用しＮＧＦ除去により細胞死を引き起こす分化ＰＣ１２細胞に、ＥＡＡＣ１ Ｎ末端ペプチドを導入した。本実験はミトコンドリアではなく細胞質中に存在することによりカスパーゼ依存型の細胞死（アポトーシス）を加速させる細胞質型ＨＣＣＳを標的としており、ＥＡＡＣ１Ｎ末端ペプチドによる細胞保護効果を検討するものである。ＮＧＦ除去と同時にペプチドを導入し６時間後、細胞死のマーカー蛋白であるカスパーゼ３の活性化を、活性型カスパーゼ３特異的認識抗体を用いて評価した。活性化型カスパーゼ３抗体を用いたウエスタンブロットの結果を図４に示す。ＥＡＡＣ１ Ｎ末ペプチド（ＥＡＡＣ１ペプチド１−１７）導入時には活性化型カスパーゼ３を示すバンドが薄くなっており、カスパーゼ３の活性が低下していることが示された。このことから本ペプチドをミトコンドリアではなく細胞質に導入することにより明らかな細胞保護効果が認められた。
[Cytoprotective effect of N-terminal peptide of EAAC1]
Peptides that do not have a Tat sequence are mainly introduced into the cytoplasm but do not migrate to the mitochondria or nucleus. Using these properties, EAAC1 N-terminal peptide was introduced into differentiated PC12 cells that caused cell death by NGF removal. This experiment targets cytoplasmic HCCS that accelerates caspase-dependent cell death (apoptosis) by being present in the cytoplasm, not mitochondria, and examines the cytoprotective effect of the EAAC1 N-terminal peptide. The peptide was introduced simultaneously with NGF removal, and 6 hours later, activation of caspase 3, which is a cell death marker protein, was evaluated using an active caspase 3-specific recognition antibody. The results of Western blotting using activated caspase 3 antibody are shown in FIG. When EAAC1 N-terminal peptide (EAAC1 peptide 1-17) was introduced, the band indicating activated caspase 3 was thin, indicating that the activity of caspase 3 was reduced. From these results, it was confirmed that the present cytoprotective effect was observed by introducing this peptide into the cytoplasm instead of mitochondria.
［生体内でのＥＡＡＣ１による細胞死防御効果］
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）舌下神経（末梢運動神経）を切断すると、起始核である舌下神経核の運動神経細胞は数週間かけて緩徐な神経細胞死を引き起こす。この現象はヒトの筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の大変良い動物モデルとなる。マウスの場合神経切断により運動神経細胞内でのＥＡＡＣ１の発現は著しく低下した。同様の実験をラットで行なうとＥＡＡＣ１の発現は逆に上昇し、損傷運動神経細胞は生存した。このことから、この神経細胞死はＥＡＡＣ１の発現抑制が原因であると考えられた。そこで軸索切断を受けた舌下神経核運動神経細胞でＥＡＡＣ１の発現が抑制されず逆に発現上昇されるようなトランスジェニックマウスの作製を試みた。具体的には、神経損傷に対して発現応答するDamage Induced Neuroendopeptidase（ＤＩＮＥ）（Kiryu-Seo et al 2000 PNAS）のプロモーター制御下にＥＡＡＣ１が発現するようＥＡＡＣ１トランスジェニックマウスを作製した（ＥＡＡＣ１ Ｔｇマウス）。図５（左）は、野生型（ＷＴ）とＥＡＡＣ１トランスジェニックマウス（ＥＡＡＣ１ Ｔｇ）の舌下神経切断後５週目の舌下神経核のサイオニン染色像を示す。写真の左側部分が健常側、右側部分が損傷側の舌下神経核を示す。野生型の損傷側運動神経細胞は健常側に比べ顕著に減少しているのに対し、ＥＡＡＣ１トランスジェニックマウスでは右側損傷側の運動神経細胞が比較的残っていることが示されている。図５（右）は健常側に対する損傷側の運動神経細胞数をパーセントで示したグラフである。この結果、野生型マウスでは舌下神経切断後５週目には健常側に対して細胞生存率が４２％であるのに比べ、ＥＡＡＣ１ Ｔｇマウスの細胞生存率は８５％であることが明らかになった。これはＥＡＡＣ１による生体内での神経細胞死保護効果を示すものである。
[Cell death prevention effect of EAAC1 in vivo]
When the mouse (C57BL / 6) hypoglossal nerve (peripheral motor nerve) is cut, the motor neurons of the hypoglossal nucleus, which is the source nucleus, cause slow neuronal death over several weeks. This phenomenon is a very good animal model for human amyotrophic lateral sclerosis (ALS). In the case of mice, the expression of EAAC1 in motor neurons was remarkably reduced by nerve cutting. When a similar experiment was conducted in rats, the expression of EAAC1 increased conversely, and damaged motor neurons survived. From this, it was considered that this neuronal cell death was caused by suppression of EAAC1 expression. Therefore, an attempt was made to produce a transgenic mouse in which the expression of EAAC1 was not suppressed but the expression was increased in the sublingual nucleus motor neurons that had undergone axotomy. Specifically, an EAAC1 transgenic mouse (EAAC1 Tg mouse) was prepared so that EAAC1 was expressed under the control of a promoter of Damage Induced Neuroendopeptidase (DINE) (Kiryu-Seo et al 2000 PNAS) that responds to nerve damage. . FIG. 5 (left) shows a thynin-stained image of the sublingual nerve nucleus at 5 weeks after sublingual nerve transection of wild type (WT) and EAAC1 transgenic mice (EAAC1 Tg). The left part of the photograph shows the healthy side and the right part shows the damaged hypoglossal nucleus. It has been shown that while the wild-type damaged side motor neurons are markedly reduced compared to the healthy side, in the EAAC1 transgenic mice, the right side damaged motor cells remain relatively. FIG. 5 (right) is a graph showing the number of motor neurons on the damaged side as a percentage relative to the healthy side. As a result, it is clear that the cell survival rate of the EAAC1 Tg mouse is 85% in the wild-type mouse, compared with the cell survival rate of 42% with respect to the healthy side at 5 weeks after the sublingual nerve transection. became. This shows the nerve cell death protecting effect in vivo by EAAC1.
Claims (32)
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列；
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるペプチドがホロチトクロームC合成酵素（ＨＣＣＳ）結合活性を有するアミノ酸配列；
（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるペプチドがホロチトクロームC合成酵素（ＨＣＣＳ）結合活性を有するアミノ酸配列； The peptide which consists of an amino acid sequence in any one of the following (A)-(C).
(A) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2;
(B) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added, and a peptide comprising the amino acid sequence is a horocytochrome C synthase (HCCS) An amino acid sequence having binding activity;
(C) an amino acid sequence having at least 60% homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and the peptide comprising the amino acid sequence has a horocytochrome C synthase (HCCS) binding activity;
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードする塩基配列；
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつホロチトクロームC合成酵素（ＨＣＣＳ）結合活性を有するペプチドをコードする塩基配列；
（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつホロチトクロームC合成酵素（ＨＣＣＳ）結合活性を有するペプチドをコードする塩基配列；
（Ｄ）配列番号１に示される塩基配列；
（Ｅ）配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつホロチトクロームC合成酵素（ＨＣＣＳ）結合活性を有するペプチドをコードする塩基配列；
（Ｆ）配列番号１に示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつホロチトクロームC合成酵素（ＨＣＣＳ）結合活性を有するペプチドをコードする塩基配列； DNA comprising any of the following base sequences (A) to (F):
(A) a base sequence encoding a peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2;
(B) The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added, and encodes a peptide having horocytochrome C synthase (HCCS) binding activity Base sequence;
(C) a base sequence encoding a peptide consisting of an amino acid sequence having at least 60% homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having a horocytochrome C synthase (HCCS) binding activity;
(D) the base sequence represented by SEQ ID NO: 1;
(E) In the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, encodes a peptide having a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted or added, and having a horocytochrome C synthase (HCCS) binding activity Base sequence;
(F) a nucleotide sequence that hybridizes with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 under a stringent condition and encodes a peptide having a horocytochrome C synthase (HCCS) binding activity;
32. The method for the prophylaxis or treatment of a disease requiring cell killing action according to claim 31, wherein the disease requiring cell killing action is a malignant tumor / cancer.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2004108220A JP2005287418A (en) | 2004-03-31 | 2004-03-31 | Peptide having both cell killing and apoptosis defense property |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2004108220A JP2005287418A (en) | 2004-03-31 | 2004-03-31 | Peptide having both cell killing and apoptosis defense property |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2005287418A true JP2005287418A (en) | 2005-10-20 |
Family
ID=35321070
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2004108220A Pending JP2005287418A (en) | 2004-03-31 | 2004-03-31 | Peptide having both cell killing and apoptosis defense property |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2005287418A (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012020566A1 (en) | 2010-08-10 | 2012-02-16 | 国立大学法人旭川医科大学 | Highly functionalized stem cell/progenitor cell by ape1 gene transfection |
-
2004
- 2004-03-31 JP JP2004108220A patent/JP2005287418A/en active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012020566A1 (en) | 2010-08-10 | 2012-02-16 | 国立大学法人旭川医科大学 | Highly functionalized stem cell/progenitor cell by ape1 gene transfection |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5490343B2 (en) | Cell penetrating peptide inhibitors of the JNK signal transduction pathway | |
| JP4145314B2 (en) | Compositions and methods for tumor cell growth inhibition | |
| AU761577B2 (en) | Human interferon-epsilon: a type I interferon | |
| JP2001524301A (en) | New therapeutic molecules | |
| JP2010053136A (en) | Cell permeable peptide inhibitor of jnk signal channel | |
| JP2010053136A5 (en) | ||
| JPH11506907A (en) | Novel peptides and compositions that modulate apoptosis | |
| JP4314386B2 (en) | Bcl-2 regulator (BMF) sequences and their use in the regulation of apoptosis | |
| JP2003508011A (en) | Compositions, kits and methods relating to a novel tumor suppressor gene that is the human FEZ1 gene | |
| JP2023133582A (en) | Peptide, and cell fusion agent and pharmaceutical composition for cancer therapy containing the same | |
| CN109593123B (en) | Polypeptide derived from RPS23RG1 and application thereof | |
| US7408028B2 (en) | Peptides, antibodies thereto, and their use in treatment of central nervous system, damage | |
| JP4280444B2 (en) | Compositions and methods for inhibiting neoplastic cell growth | |
| CA2387541A1 (en) | Short segments of dap-kinase | |
| EP1044217A2 (en) | Sag: sensitive to apoptosis gene | |
| JP3924330B2 (en) | Novel protein, its gene, apoptosis-inducing reagent and anticancer agent | |
| JP2005287418A (en) | Peptide having both cell killing and apoptosis defense property | |
| KR20010085816A (en) | Compositions and Methods for the Treatment of Immune Related Diseases | |
| KR100898866B1 (en) | A composition and a method for inducing apotosis of cancer cell using dek overexpression and a drosophila melanogaster overexpressing dek | |
| JP2002503466A (en) | Retinoblastoma protein complex and retinoblastoma interacting protein | |
| JP4488720B2 (en) | Apoptosis-related proteins and uses thereof | |
| JPWO2002064770A1 (en) | Novel scavenger receptor class A protein | |
| KR101607643B1 (en) | Method for screening agent against cancer metastasis using Bax/complex-I | |
| JP3929744B2 (en) | Novel polypeptide, novel DNA, novel antibody and novel genetically modified animal | |
| KR101478395B1 (en) | Method for inducing apoptosis and the Composition |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20060301 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20081023 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20090305 |