KR101607643B1 - Ｂａｘ/ｃｏｍｐｌｅｘ-Ⅰ 복합체를 이용한 암전이 억제제의 스크리닝 방법 - Google Patents

Ｂａｘ/ｃｏｍｐｌｅｘ-Ⅰ 복합체를 이용한 암전이 억제제의 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 암세포에 암의 전이를 억제할 것으로 예상되는 후보물질을 처리하고, 상기 암세포에서 Bax/complex-I 복합체의 함량을 측정하는 단계를 포함하는 암전이 억제제의 스크리닝 방법 및 상기 복합체의 형성에 관여하는 p53, Bcl-w의 발현억제제 또는 Bax의 발현촉진제를 포함하는 암전이 억제용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 암 전이 억제제의 스크리닝 방법을 이용하면, 암세포에서 Bax/complex-I 복합체의 형성을 촉진시켜서 암세포의 침윤을 억제함으로써, 암의 전이를 사전에 방지할 수 있는 제제를 발굴할 수 있으므로, 보다 효과적인 암치료제의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

Ｂａｘ/ｃｏｍｐｌｅｘ-Ⅰ 복합체를 이용한 암전이 억제제의 스크리닝 방법{Method for screening agent against cancer metastasis using Bax/complex-I}
본 발명은 Bax/complex-I 복합체를 이용한 암전이 억제제의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 암세포에 암의 전이를 억제할 것으로 예상되는 후보물질을 처리하고, 상기 암세포에서 Bax/complex-I 복합체의 함량을 측정하는 단계를 포함하는 암전이 억제제의 스크리닝 방법 및 상기 복합체의 형성에 관여하는 Bcl-w의 발현억제제 또는 Bax의 발현촉진제를 포함하는 암전이 억제용 약학 조성물에 관한 것이다.
우리나라 암(악성신생물) 사망자 수는 2002년 우리나라 총 사망자 246,515명(조사망률 인구 10만 명당 512명) 가운데 25.5%(남성 사망자의 29.6%, 여성 사망자의 20.5%)인 62,887명으로 암으로 인한 사망(사망률 인구 10만 명당 130.7명)이 사망원인 1위를 차지하고 있다. 암 사망순위는 폐암, 위암, 간암, 대장암 및 췌장암 순으로, 이들 5대 암에 의한 사망이 전체 암 사망의 약 70%를 차지하고 있다. 또한, 남성에 있어 주요 암 사망원인은 폐암, 위암, 간암 및 대장암 등으로 이들 4대 암에 의한 사망자 수(28,147명)가 전체 남성 암 사망자 수(40,177명)의 70%를 차지하고 있으며, 여성에 있어 주요 암 사망원인은 위암, 폐암, 간암, 대장암 및 췌장암 등으로 이들 5대 암에 의한 사망자 수(13,630명)가 전체 여성 암 사망자 수(22,710명)의 60%를 차지하고 있다.
이러한 암은 치료후에도 전이 등의 과정을 통해 쉽게 재발할 수 있기 때문에, 이의 치료에 어려움을 겪고 있다. 전이는 악성 종양의 진행에 수반되는 현상으로, 악성 종양 세포가 증식하고 암이 진행함에 따라 전이에 필요한 새로운 유전 형질을 획득한 후 혈관과 림프선으로 침윤하고 혈액과 림프를 따라 순환하다가 다른 조직에 정착한 후 증식하게 된다. 이러한 전이의 작용기작을 규명하기 위하여 활발한 연구가 진행되고 있으며, 이와 관련된 연구결과에 따라, 전이를 예방하려는 연구가 추가로 진행되고 있다.
예를 들어, 한국공개특허 제2014-0049198호에는 hTERT mRNA를 표적하는 리보자임 및 ｐ53 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스를 이용하여 간으로 전이된 암을 치료하는 방법이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2014-0134818호에는 암세포의 전이 또는 침윤에 관여하는 Ei24, p53 및 p21의 발현을 증가시킴으로써 암세포의 항-전이 및 항-침윤 효능을 갖는 엉겅퀴 추출물이 개시되어 있다.
한편, 암치료 유전자로 알려진 p53은 인간에서 TP53 유전자에 의해 인코딩되는 종양 억제 단백질을 코딩하는 유전자로서, 세포 내 DNA를 손상시키는 신호에 반응하여 다양한 하위 유전자의 발현을 조절함으로써 세포 주기를 조절하고, 세포사멸을 유도함으로써 세포가 악성형질로 전환되지 않도록 보호한다고 알려져 있다.
현재까지는, 상기 암치료 유전자는 유전자 수준과 단백질 수준에서 서로 다른 기작을 통해 암을 치료하는 효과를 나타낸다고 알려져 있으나, 단백질 수준에서의 항암효과에 대하여는 그의 작용기작이 규명되지 않고 있다. 아울러, 최근의 연구결과에 의하면, 상기 암치료 유전자로 알려진 p53이 암의 전이를 억제할 수 있다고 보고되었으나, 이와 관련된 작용기작 역시 명확하게 규명되지 않고 있다. 이들 유전자의 암전이 억제기작을 규명할 수 있다면, 이를 이용한 다양한 암전이 억제제의 개발에 활용될 수 있을 것으로 기대되고 있으나, 아직까지는 별다른 연구성과가 보고되지 않고 있는 실정이다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 암치료 유전자로 알려진 p53의 암전이 억제기작을 규명하고, 이를 응용하여 다양한 암전이 억제제를 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 상기 p53이 핵 및 세포질에서 발현되어 암세포의 침윤을 억제하는 Bax/complex-I 복합체의 형성을 촉진함을 확인하였으며, 특히 Bax의 C-말단측 4개잔기와 complex-I의 ND5 서브유닛을 통하여 상기 복합체를 형성함을 규명하여, 위양성 암전이 억제제가 아닌, 암의 전이를 억제할 수 있다고 예상되는 후보물질을 암세포에 처리한 다음, 상기 복합체의 형성여부를 확인할 경우, 상기 후보물질이 암전이 억제제로서 사용될 수 있는지를 구별할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 암전이 억제효과를 나타낼 것으로 예상되는 후보물질을 암세포에 처리하고, 상기 암세포에서 p53에 의해 형성되는 Bax/complex-I 복합체의 형성여부를 확인하는 단계를 포함하는 암전이 억제제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 복합체의 형성에 관여하는 p53, Bcl-w의 발현억제제 또는 Bax의 발현촉진제를 포함하는 암전이 억제용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 암치료 유전자로 알려진 p53의 암전이 억제효과를 규명하고자, 다양한 연구를 수행하던 중, 암의 전이를 촉진하는 역할을 수행하는 것으로 알려진 Bcl-2 패밀리 단백질에 주목하게 되었다. 상기 Bcl-2 패밀리 단백질은 세포사멸을 조절하는 역할을 수행할 수 있는데, 예를 들어 Bcl-2, Bcl-XL 및 Bcl-w는 세포생존성을 증가시키고, Bax 및 Bak은 세포생존성을 감소시킨다고 알려져 있다. 암세포에 있어서, 세포침윤수준은 암세포의 생존성과 직접적으로 연관되는데, 암세포의 침윤수준이 증가할 수록 생존성 및 전이성 역시 증가하기 때문이다. 이에 따라, 본 발명자들은 암세포의 생존성을 증가시키는 Bcl-2 패밀리 단백질(Bcl-2, Bcl-XL 및 Bcl-w)이 암세포의 침윤성과 관련될 것으로 가정하고, p53의 암전이 억제활성과 상기 Bcl-2 패밀리 단백질이 연관될 것으로 가정하였다. 상기 가정을 확인하기 위한 연구를 수행한 결과, p53은 세포질에서 상기 Bcl-2 패밀리 단백질의 하나인 Bcl-w와 결합하여 암세포의 침윤수준을 감소시킴을 확인하였다. 이에, 상기 Bcl-w가 암세포의 침윤수준에 미치는 효과를 심층적으로 연구한 결과, 상기 Bcl-w가 p53과 결합하지 않을 경우에는, Bax와 결합하여 Bcl-w/Bax복합체를 형성할 수 있는데, 상기 Bax는 미토콘드리아의 외막에 위치하며, 미토콘드리아의 내막에 위치한 미토콘드리아 세포호흡에 관여하는 단백질인 complex-I과 결합하여 Bax/complex-I 복합체를 형성함으로써 complex-I을 불활성화시키는 역할을 수행한다. 상기와 같이, Bcl-w/Bax복합체가 형성되면, Bax와 결합되지 않은 complex-I이 활성화되어 세포내 ROS 수준을 증가시키고, 이에 의하여 암세포의 침윤수준이 증가함을 확인하였다.
이처럼, p53, Bcl-w 및 Bax는 서로의 연결관계에 따라 각각의 복합체를 형성하여, 최종적으로 complex-I을 활성화시키거나 또는 불활성화시켜서 암세포의 침윤수준을 증가시키거나 감소시킬 수 있다는 점은 지금까지 전혀알려져 있지 않고, 본 발명자에 의하여 최초로 규명되었다. 더욱이, Bax/complex-I 복합체의 형성함에 있어서, Bax의 C-말단측 4개잔기와 complex-I의 ND5 서브유닛을 통하여 상기 복합체를 형성함을 최초로 규명하여 위양성의 제제를 스크리닝할 위험성을 감소시킬 수 있는 방법을 규명하였다.
또한, 상기 규명된 바를 응용하면, 암전이를 억제할 수 있는 제제를 발굴하거나, 암전이를 억제할 수 있는 치료제를 개발할 수 있다. 하나의 예로서, 암의 전이를 억제할 수 있을 것으로 기대되는 후보물질을 암세포에 처리하고, 상기 암세포에서 최종적으로 암세포의 침윤수준을 결정하는 Bax/complex-I 복합체의 형성여부를 확인하면, 상기 후보물질이 암세포의 전이를 억제할 수 있는 지의 여부를 확인할 수 있다. 다른 예로서, 외부에서 투여되는 p53, Bcl-w의 발현을 억제시킬 수 있는 제제 또는 Bax의 발현을 촉진시킬 수 있는 제제는 최종적으로 암세포의 침윤수준을 결정하는 Bax/complex-I 복합체의 형성을 촉진할 수 있으므로, 암세포의 전이를 억제하는 약학 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있을 것으로 분석되었다. 상기 p53이 암세포의 전이를 억제할 수 있다는 것은 이미 공지되었으나, Bcl-w의 발현을 억제시킬 수 있는 제제 또는 Bax의 발현을 촉진시킬 수 있는 제제가 암세포의 전이를 억제할 수 있다는 것은 본 발명자에 의하여 최초로 규명되었다.
상술한 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 암전이 억제제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 제공하는 암전이 억제제의 스크리닝 방법은 (a) 암전이 억제활성을 나타낼 것으로 예상되는 후보물질을 암세포에 처리하는 단계; 및, (b) 상기 암세포에서 Bax/complex-I 복합체의 함량을 측정하는 단계를 포함한다.
상기 방법에 있어서, 사용되는 암세포는 세포내에서 p53/Bcl-w 복합체, Bcl-w/Bax 복합체 또는 Bax/complex-I 복합체를 형성하여 침윤 또는 전이될 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서 세포내에서 p53/Bcl-w 복합체, Bcl-w/Bax 복합체 또는 Bax/complex-I 복합체를 형성하여, 침윤 또는 전이될 수 있는 폐암, 유방암, 대장암, 위암, 뇌암, 췌장암, 갑상선암, 피부암, 골수암, 림프종, 자궁암, 자궁경부암 등의 암으로부터 유래된 세포가 될 수 있고, 다른 예로서 세포내에서 Bcl-w/Bax 복합체를 형성할 수 있는 폐암, 유방암, 대장암, 위암, 뇌암, 췌장암, 갑상선암, 피부암, 골수암, 림프종, 자궁암, 자궁경부암 등의 암으로부터 유래된 세포가 될 수 있으며, 또 다른 예로서 세포내에서 Bcl-w/Bax 복합체를 형성할 수 있는 폐암세포인 H460 세포 또는 H1299 세포가 될 수 있다.
상기 방법에 있어서, Bax/complex-I 복합체의 함량을 측정하는 방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서 면역침전법, GST 융합단백질 침전법, 웨스턴블럿 분석법 등의 다양한 면역학적 방법을 사용할 수 있다.
본 발명의 용어 "p53"이란, SDS-PAGE 상에서 53kDa의 크기를 나타내는 암억제 단백질로서 사람에서는 TP53 유전자에 의하여 코딩된다고 알려져 있다. 상기 p53은 다세포 생물에서 세포주기를 정지시키고, 암의 발생을 억제하며 게놈 유전자의 안정성을 향상시킨다고 알려져 있고, 단백질의 경우 대량의 프롤린잔기를 포함한다. 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 구체적인 염기서열 및 단백질 정보는 NCBI에 공지되어 있다(GenBank: NM_000546, NP_000537 등).
본 발명에 있어서, 상기 p53은 세포질에서 Bcl-w와 결합하여 Bax/complex-I 복합체의 형성을 유도함으로써, 목적하는 후보물질이 암전이 억제활성을 나타내는지의 여부를 확인하기 위한 수단으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서는, 상기 p53으로서 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 사용하였다.
본 발명의 용어 "Bcl-w"란, 주로 "BCL2L2(Bcl-2-like protein 2)"라고 호칭되는 Bcl-2 패밀리 단백질 중의 하나를 의미한다. 상기 Bcl-w는 세포가 사멸될 수 있는 수준의 열악한 조건에서 세포자멸 가능성을 억제시키는 효과를 나타낸다. 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 구체적인 염기서열 및 단백질 정보는 NCBI에 공지되어 있다(GenBank: NM_001199839, NP_001186768 등).
본 발명에 있어서, 상기 Bcl-w는 세포질에서 p53 또는 Bax와 결합하여 Bax/complex-I 복합체의 형성을 유도하거나 억제함으로써, 목적하는 후보물질이 암전이 억제활성을 나타내는지의 여부를 확인하기 위한 수단으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서는, 상기 Bcl-w로서 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 사용하였다.
본 발명의 용어 "Bax(Bcl-2-associated X protein)"란, "bcl-2-like protein 4"라고도 호칭되는 Bcl-2 패밀리 단백질 중의 하나를 의미한다. 상기 Bax는 세포의 세포자멸(apoptosis)를 촉진시키는 역할을 수행하는데, 주로 미토콘드리아의 외막에 결합된 상태로 존재하며, 그의 C-말단의 4개 잔기는 미토콘드리아 내막과 외막사이의 막간공간에 돌출된 상태로 존재한다. 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 구체적인 염기서열 및 단백질 정보는 NCBI에 공지되어 있다(GenBank: NM_001291428, NP_001278357 등).
본 발명에 있어서, 상기 Bax는 세포질에서 Bcl-w 또는 complex-I과 결합하여 Bax/complex-I 복합체를 형성하지 않거나 또는 형성함으로써, 목적하는 후보물질이 암전이 억제활성을 나타내는지의 여부를 확인하기 위한 수단으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서는, 상기 Bax로서 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 사용하였다.
본 발명의 용어 "complex-I"이란, "NADH:ubiquinone oxidoreductase"라고도 호칭되는 미토콘드리아의 세포호흡 연쇄에 관여하는 단백질 복합체를 의미한다. 인간의 complex-I은 두개의 도메인을 형성하는 45개의 서브유닛으로 구성되는데, 세포막 결합 도메인은 미토콘드리아 내막에 위치하고, 세포질 도메인은 미토콘드리아 간질에 돌출되어 있다고 알려져 있다.
본 발명에 있어서, 상기 complex-I은 이를 구성하는 세포막 결합 도메인의 ND5(NADH dehydrogenase 5) 서브유닛을 통하여 세포질에서 Bax와 결합하거나 또는 결합하지 않음으로써, 불활성화되거나 활성화되어, 암세포의 침윤수준을 감소시키거나 또는 증가시킬 수 있어, 암전이 억제활성을 나타내는 지의 여부를 확인하기 위한 직접적인 수단으로서, 사용될 수 있다. 이때, 상기 ND5 서브유닛을 코딩하는 유전자의 염기서열 및 단백질 정보는 NCBI에 공지되어 있다(GenBank: AIY61497.1 등). 예를 들어, 본 발명에서는, 상기 complex-I의 ND5로서 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 사용하였다.
상기 방법에 의하여 측정된 복합체의 함량을 상기 후보물질을 처리하지 않은 암세포(대조군)에서 측정된 복합체의 함량과 비교하여, 상기 후보물질이 복합체 형성을 촉진하는지의 여부를 확인하게 되는데, 대체로 대조군에서 측정된 함량보다 높은 수준을 나타낼 경우에는 상기 후보물질이 Bax/complex-I 복합체의 형성을 촉진하여 암전이를 억제하는 활성을 갖는다고 판단할 수 있다. 다만, 상기 후보물질이 비특이적으로 복합체의 형성을 촉진할 수 있는데(위양성), 이경우에는 상기 후보물질이 암전이를 억제하는 활성을 나타내는지의 여부를 명확하게 판단할 수 없다는 단점이 있다.
따라서, 상기 단점을 극복하기 위하여는, 상기 복합체를 형성하는 Bax 또는 complex-I의 변이체를 발현시켜서 정상상태에서도 상기 복합체를 형성하지 못하는 변이된 암세포에 상기 후보물질을 처리하고, 이로부터 상기 복합체의 함량을 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 즉, 정상적으로 상기 복합체를 형성하는 세포에서 복합체의 함량을 증가시키는 것으로 확인된 후보물질이 상기 변이된 암세포에서도 복합체를 형성하게 한다면, 상기 후보물질은 비특이적으로 상기 복합체의 형성을 촉진시킨다고 판단할 수 있다. 이때, 사용될 수 있는 Bax 또는 complex-I의 변이체는 상기 복합체의 형성을 억제하는 한 특별히 제한되지 않으나, 일 예로서, 상기 복합체 형성에 중요한 역할을 수행하는 C-말단의 4개 잔기가 결실 또는 치환된 변이체 Bax, ND5 서브유닛이 결실 또는 치환된 변이체 complex-I 등이 될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 본 발명자들은 세포질에 축적되는 변이체 p53을 발현시킬 경우, 암세포의 침윤수준이 감소함을 확인함에 따라, p53의 암세포 침윤억제 활성이 세포질에서 수행됨을 확인하고(도 1a), 세포질에서 p53의 암세포 침윤억제 활성을 연구하였다. 그 결과, p53에 의한 침윤억제 활성은 세포내 ROS를 감소시킴에 의하여 유발되고(도 1b), 세포내 ROS 수준, PI3K의 활성 및 인산화된 Akt와 MMP-2의 수준을 감소시킴에 의하여 유발되며(도 1c), p53과 Bcl-w의 결합 및 Bcl-w와 Bax의 결합이 관여함(도 1d 내지 1f)을 확인하였다.
또한, ROS 생성에 관여하고, Bax에 의하여 영향을 받는 미토콘드리아 호흡연쇄에 작용하는 4개의 다중체 단백질 복합체를 대상으로, 상기 세포침윤과 연관된 것을 연구한 결과, Bax와 연관된 미토콘드리아 호흡연쇄 연관 단백질은 complex-I이고, 상기 complex-I은 ROS의 생성에 직접적으로 연관되며(도 2a), Bax의 발현억제에 따라 complex-I의 활성이 가장 큰 수준으로 증가하고(도 2b 및 2c), ΔΨm과 ATP 수준이 모두 증가함(도 2d)을 확인하였다.
아울러, Bax 및 complex-I의 결합부위를 분석한 결과, Bax의 C-말단의 4개 잔기(도 3a) 및 complex-I의 ND5 서브유닛(도 3b 및 3c)을 통하여, 상호결합함(도 3d 및 3e)을 확인하였다.
다음으로, 암세포의 침윤에 미치는 Bcl-w와 complex-I의 효과를 분석한 결과, Bcl-w는 암세포의 침윤과정을 complex-I을 통하여 조절하고(도 4a), Bcl-w의 과발현에 따라 complex-I의 활성이 증가하며(도 4b), ΔΨm과 ATP 수준이 모두 증가하고(도 4c), 암세포내에서 Bax/complex-I(ND5) 복합체의 수준이 증가하며(도 4d), Bcl-w가 p53과 결합하면, Bax/complex-I(ND5) 복합체의 형성을 야기함(도 4e 및 4f)을 확인하였다.
또 다음으로, 상기 암세포의 침윤억제에 관여하는 Bcl-w 및 Bax의 효과를 다른 단백질로 대체할 수 있는지 연구한 결과, Bcl-XL의 과발현은 complex-I의 활성, ΔΨm의 수준 및 ATP 수준을 모두 증가시키고(도 6a), p53이 발현된 조건에서는 Bcl-XL이 Bax와 복합체를 형성할 수 있으며(도 6b), 전체적으로 ROS 수준 및 침윤수준이 증가하고(도 6c), Bak의 발현억제는 complex-I의 활성, ΔΨm의 수준 및 ATP 수준을 모두 증가시키고(도 6d), Bak는 C-말단 4개 잔기를 통하여 complex-I(ND5)과 결합체를 형성할 수 있으며(도 6e), Bak의 발현억제는 암세포의 침윤수준을 증가시키고(도 6f), p53의 발현여부에 따라 Bcl-w/Bak 복합체 또는 Bak/complex-I 복합체 형성이 야기됨(도 6g)을 확인하였다.
또 다음으로, 핵에서 발현된 p53이 암세포의 침윤에 미치는 효과를 분석한 결과, 핵에서 p53의 과발현은 세포내 Bax의 발현수준을 증가시키고(도 7a), 암세포의 침윤수준을 감소시켰으며(도 7b), Bcl-w의 발현이 억제될 경우에도 ROS 수준 및 침윤수준을 감소시키고(도 7c), Bax/complex-I 복합체 형성을 촉진하며(도 7d), complex-I의 활성, ΔΨm의 수준 및 ATP 수준을 모두 감소시킴(도 7e)을 확인하였다.
끝으로, 이식종양 동물모델을 제작하고, 이를 이용한 p53의 암세포 침윤억제효과를 검증한 결과, 상술한 암세포의 침윤억제에 관여하는 성분이 과발현된다 하여도 종양의 크기는 변하지 않고(도 8a), Bcl-w가 과발현될 경우, 종양세포의 혈관침투성이 증가하며(도 8b), p53과 Bcl-w이 동시에 과발현되면 종양세포의 혈관침투성이 감소함(도 8c)을 확인하였다.
따라서, 상기 결과를 종합하면, 암세포의 세포질에 축적된 p53은 미토콘드리아의 외막에서 Bcl-w와 결합하여 복합체를 형성하고, 핵에서 발현된 p53은 Bax의 발현을 촉진시키며, 상기 발현된 Bax는 미토콘드리아의 내막에 결합된 complex-I과 결합하여, complex-I을 불활성화 시킴으로써 암세포의 침윤수준을 감소시킴(도 9a)을 알 수 있었다.
상술한 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 Bax/complex-I 복합체의 형성에 관여하는 Bax 유전자, 상기 Bax 유전자의 발현을 촉진시킬 수 있는 제제 또는 Bcl-w의 발현을 억제시킬 수 있는 제제를 각각 개별적으로 또는 조합하여 포함하는 암전이 억제용 약학 조성물을 제공한다.
상술한 바와 같이, Bax/complex-I 복합체를 구성함에 있어서, 상기 Bax는 미토콘드리아의 내막에 결합된 comple-I과 Bax의 C-말단의 4개 잔기를 통하여 결합함으로써, 상기 complex-I을 불활성화시키지만, 세포질내에 Bcl-w가 존재할 경우에는, 결합친화도의 차이로 인하여, 상기 Bax가 complex-I 대신에 Bcl-w과 결합함으로써, 결과적으로는 complex-I을 활성화시킬 수 있고, 이로 인하여 암세포의 침윤수준이 증가하게 된다. 따라서, 상기 암세포에 Bax를 코딩하는 유전자를 도입하거나, 상기 Bax 유전자의 발현을 촉진시킬 수 있는 제제를 도입하거나 또는 상기 Bcl-w의 발현을 억제할 수 있는 제제를 도입한다면, Bax/complex-I 복합체의 형성을 촉진하여, 결과적으로는 암세포의 침윤수준을 감소시킴으로써, 암전이를 억제할 수 있으므로, 상기 Bax 유전자, 상기 Bax의 발현을 촉진시킬 수 있는 제제 또는 Bcl-w의 발현을 억제시킬 수 있는 제제는 본 발명에서 제공하는 암전이 억제용 약학조성물의 유효성분으로 사용될 수 있다.
먼저, 상기 약학조성물의 유효성분으로 사용될 수 있는, Bax 유전자는 서열번호 3의 아미노산 서열을 코딩할 수 있는 폴리뉴클레오티드가 될 수 있는데, 그 예로서 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드가 될 수 있다.
다음으로, 상기 약학조성물의 유효성분으로 사용될 수 있는, Bcl-w의 발현을 억제할 수 있는 제제는 Bcl-w/Bax 복합체의 형성을 억제시켜서, Bax/complex-I 복합체의 함량을 향상시킬 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 그 예로서, Bcl-w 유전자의 발현을 억제시킬 수 있는 siRNA, shRNA 등이 될 수 있다.
본 발명의 암전이 억제용 약학 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명에서, 상기 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물과 이의 분획물들에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에 포함된 각 유효성분의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 최종 조성물 총중량을 기준으로 0.0001 내지 50 중량%, 다른 예로서 0.01 내지 20 중량%의 함량으로 포함될 수 있다.
상기 본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
본 발명의 약학조성물의 투여량은 예를 들어, 본 발명의 약학적 조성물을 사람을 포함하는 포유동물에 하루 동안 1 내지 20 ㎎/㎏, 다른 예로서 1 내지 10 ㎎/㎏으로 투여할 수 있고, 본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 약제학적으로 유효한 양으로 암의 전이가 발생할 가능성이 있거나 또는 발생된 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 전이를 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
상술한 바와 같이, 본 발명에서 제공하는 약학 조성물은 암세포의 침윤수준을 감소시킬 수 있는 Bax/complex-I 복합체의 형성을 촉진시킬 수 있으므로, 상기 약학 조성물은 암의 전이를 예방 또는 치료하는데 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어 "개체"란 암의 전이가 발생될 가능성이 있거나 또는 발생된 쥐, 가축, 인간 등을 포함하는 포유동물을 제한 없이 포함한다.
본 발명의 암의 전이를 예방 또는 치료하는 방법에 있어서, 상기 약학적 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여도 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 목적하는 바에 따라 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있다. 다만, 경구 투여시에는 위산에 의하여 상기 약학 조성물에 포함된 유효성분이 변성될 수 있기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에서 제공하는 암 전이 억제제의 스크리닝 방법을 이용하면, 암세포에서 Bax/complex-I 복합체의 형성을 촉진시켜서 암세포의 침윤을 억제함으로써, 암의 전이를 사전에 방지할 수 있는 제제를 발굴할 수 있으므로, 보다 효과적인 암치료제의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1a는 Bcl-w가 발현되거나 또는 발현되지 않는 폐암세포(H1299)에서, 야생형 또는 변이체 p53(p53K305N 또는 p53K305N / R175H)의 발현에 따른 폐암세포의 침윤수준을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진 및 그래프이다.
도 1b는 Bcl-w가 발현되거나 또는 발현되지 않는 폐암세포(H1299)에서, 야생형 또는 변이체 p53(p53K305N 또는 p53K305N / R175H)의 발현에 따른 세포내 ROS 수준을 DCF 및 MitoSOX Red 프로브를 이용하여 분석한 결과를 나타내는 그래프로서, 상단은 DCF를 사용하여 유세포 분석을 수행한 결과를 나타내는 그래프이고, 하단의 좌측은 DCF를 사용하여 분석한 ROS의 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이며, 하단의 우측은 MitoSOX Red 프로브를 사용하여 분석한 ROS의 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 1c는 Bcl-w가 발현되거나 또는 발현되지 않는 폐암세포(H1299)에서, 야생형 또는 변이체 p53(p53K305N 또는 p53K305N / R175H)의 발현에 따른 세포내 PI3K의 활성 및 인산화된 Akt과 MMP-2의 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프 및 사진이다.
도 1d는 야생형 또는 변이체 p53와 GST, GST-Bcl-w 또는 GST-Bax 단백질을 반응시킨 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진으로서, 상단은 야생형 또는 변이체 p53와 GST 또는 GST-Bcl-w를 반응시킨 결과를 나타내고, 중단은 p53의 발현수준을 비교한 결과를 나타내며, 하단은 야생형 또는 변이체 p53와 GST 또는 GST-Bax를 반응시킨 결과를 나타낸다.
도 1e는 Bcl-w가 발현되지 않는 폐암세포(H1299)에서, 야생형 또는 변이체 p53(p53K305N 또는 p53K305N / R175H)의 발현에 따른 p53, Bcl-w 및 Bax 간의 결합활성을 분석한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다.
도 1f는 야생형 또는 변이체 p53와 Bcl-w 및 Bax를 동시에 반응시킨 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다.
도 2a는 Bax의 발현을 억제하거나 또는 억제하지 않는 조건에서, 암세포의 침윤과 관련된 미토콘드리아 호흡연쇄 연관 단백질을 검출한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2b는 Bax의 발현이 억제된 조건에서 complex-I, II, III 및 IV의 활성변화를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2c는 H1299 세포에서 Bax와 결합할 수 있는 미토콘드리아 호흡연쇄 연관 단백질을 검출한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다.
도 2d는 Bax의 발현억제에 따른 ΔΨm과 ATP 수준의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 3a는 야생형 또는 변이체 Bax가 도입된 LoVo 세포에서 상기 Bax의 종류에 따른 complex-I과의 결합활성(상단), ROS 수준(하단 좌측) 및 침윤수준(하단 우측)을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진 및 그래프이다.
도 3b는 암세포에서 면역침전분석을 통하여 Bax와 결합할 수 있는 complex-I을 구성하는 서브유닛을 선별한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다.
도 3c는 야생형 또는 변이체 Bax가 도입된 H1299 세포에서 Bax의 C-말단의 4개 잔기가 complex-I의 ND5 서브유닛과 결합할 수 있는지를 확인한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다.
도 3d는 ND5 또는 ND5G13289A이 발현되는 H1299 세포의 파쇄물을 대상으로 Bax가 외인성 ND5(Myc-WT) 또는 ND5G13289A(Myc-G13289A)와 결합체를 형성하는지의 여부를 확인한 결과를 나타내는 면역침전분석 사진 및 웨스턴블럿 분석사진이다.
도 3e은 야생형 또는 변이체 ND5의 발현에 따른 암세포에서 ROS 수준과 침윤수준의 변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4a는 Bcl-w가 발현되지 않거나 또는 발현되는 폐암세포(H1299)에서 다양한 암세포의 침윤과 관련된 미토콘드리아 호흡연쇄 연관 단백질의 활성억제에 따른, ROS 수준과 침윤수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4b는 야생형 또는 변이체 Bcl-w가 과발현된 조건에서 complex-I, II, III 및 IV의 활성변화를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4c는 야생형 또는 변이체 Bcl-w가 과발현된 조건에서 ΔΨm과 ATP 수준의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 4d는 야생형 또는 변이체 Bcl-w가 과발현된 조건에서 Bax와 complex-I(ND5)의 결합여부를 확인한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다.
도 4e는 Bcl-w와 결합할 수 있거나 또는 결합할 수 없는 변이체 p53(p53K305N 또는 p53K305N / R175H)의 발현에 따른 complex-I 활성(좌측), ΔΨm 수준(중간) 및 ATP 수준(우측)을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4f는 Bcl-w와 결합할 수 있거나 또는 결합할 수 없는 변이체 p53(p53K305N 또는 p53K305N / R175H)의 발현에 따른 Bax와 complex-I(ND5)의 결합여부를 확인한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다.
도 5a는 세포질에 p53이 축적되는 IMR-32 신경아세포종 세포에서 야생형 p53의 발현억제에 따른, 세포내 ROS 수준(좌측) 및 침윤수준(우측)의 변화를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5b는 세포질에 p53이 축적되는 IMR-32 신경아세포종 세포에서 야생형 p53의 발현억제에 따른, 세포질의 Bcl-w/Bax 복합체, Bax/complex-I(ND5) 복합체 수준의 변화를 분석한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다.
도 5c는 세포질에 p53이 축적되는 IMR-32 신경아세포종 세포에서 야생형 p53의 발현억제에 따른, complex-I 활성(좌측), ΔΨm 수준(중간) 및 ATP 수준(우측)을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5d는 세포질에 p53이 축적되는 IMR-32 신경아세포종 세포에서 야생형 p53와 Bcl-w(좌측) 또는 p53와 Bax(우측)의 동시 발현억제에 따른 침윤수준의 변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6a는 Bcl-XL의 발현에 따른, complex-I 활성(좌측), ΔΨm 수준(중간) 및 ATP 수준(우측)을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6b는 Bcl-XL의 발현에 따른, 야생형 또는 변이된 p53과 Bcl-XL를 포함하는 복합체의 수준을 분석한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다.
도 6c는 야생형 또는 변이체 p53과 Bcl-XL의 발현에 따른, 세포내 ROS 수준(좌측) 및 침윤수준(우측)의 변화를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6d는 Bak의 발현억제에 따른, complex-I 활성(좌측), ΔΨm 수준(중간) 및 ATP 수준(우측)을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6e는 Bak의 C-말단 4개 잔기의 존재여부에 따른, Bak와 complex-I(ND5) 결합체의 함량변화를 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다.
도 6f는 변이체 p53(p53K305N)의 발현과 Bak의 발현억제에 따른, 암세포의 침윤수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6g는 변이체 p53(p53K305N 또는 p53K305N / R175H)의 발현에 따른, Bcl-w/Bak 복합체 또는 Bak/complex-I 복합체의 수준을 분석한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다.
도 7a는 야생형 또는 변이체 p53(p53R175H 또는 p53K305N)의 발현에 따른, 세포침윤에 관여하는 단백질의 발현수준 변화를 분석한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다.
도 7b는 야생형 또는 변이체 p53(p53R175H)의 발현에 따른, 암세포의 침윤수준의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 7c는 야생형 p53이 과발현되는 조건에서, Bax 또는 Blc-w의 발현억제에 따른, 세포내 ROS 수준 및 침윤수준의 변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7d는 야생형 또는 변이체 p53(p53R175H)의 발현에 따른, Bax/complex-I 복합체 수준의 변화를 분석한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다.
도 7e는 야생형 또는 변이체 p53(p53R175H)의 발현에 따른, complex-I 활성(좌측), ΔΨm 수준(중간) 및 ATP 수준(우측)을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8a는 야생형 또는 변이체 p53 또는 Bcl-w가 도입된 이식종양 동물모델에서 시간의 경과에 따른 종양의 부피변화를 나타내는 그래프이다.
도 8b는 야생형 또는 변이체 Bcl-w(G94A)의 과발현에 따른, 종양세포의 혈관침투성을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8c는 야생형 Bcl-w와, 야생형 또는 변이체 p53(R175H, K305N 또는 K305N/R175H)의 과발현에 따른, 종양세포의 혈관침투성을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9a는 암세포의 침윤에 미치는 세포질 p53의 작용기작을 나타내는 개략도이다.
도 9b는 미토콘드리아 막에 위치한 Bax와 complex-I의 위치를 나타내는 개략도이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 암세포의 침윤에 미치는 Bcl -w와 p53 의 효과
실시예 1-1: 암세포 침윤억제 유발부위의 확인
pcDNA3 벡터 또는 Bcl-w를 코딩하는 pcDNA3 벡터를 p53이 발현되지 않는 폐암세포(H1299 세포)에 1차로 도입하고 배양한 다음, 상기 배양된 세포에 다시 p53, p53K305N 또는 p53K305N / R175H를 코딩하는 pcDNA3 벡터를 2차로 도입하고 배양하였다. 상기 2차로 도입된 세포에서 도입된 각 유전자의 발현수준을 웨스턴블럿 분석을 통해 확인하고, 각 세포의 침윤수준은 Matrigel 코팅필터를 이용하여 평가하였다(도 1a). 이때, 내부대조군으로 β-액틴을 사용하였다.
도 1a는 Bcl-w가 발현되거나 또는 발현되지 않는 폐암세포(H1299)에서, 야생형 또는 변이체 p53(p53K305N 또는 p53K305N / R175H)의 발현에 따른 폐암세포의 침윤수준을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진 및 그래프이다. 도 1a에서 보듯이, Bcl-w의 발현여부에 관계없이, 야생형 p53 및 변이체 p53(p53K305N)이 발현된 암세포는 대조군에 비하여 침윤수준이 감소하였으나, 변이체 p53(p53K305N / R175H)이 발현된 암세포는 대조군과 유사한 침윤수준을 나타냄을 확인하였다. 아울러, Bcl-w가 발현된 세포에서는 전체적인 침윤수준이 증가함을 확인하였다.
따라서, Bcl-w는 암세포의 침윤수준을 증가시킬 수 있고, p53은 암세포의 침윤수준을 감소시킬 수 있는데, 이러한 p53의 효과는 175번 아미노산 잔기가 관여함을 알 수 있었다. 특히, 변이체 p53(p53K305N)은 DNA 결합활성이 소멸되고, 세포질에 축적되는 것으로 알려져 있는데, 상기 변이체 p53(p53K305N)가 발현될 경우, 암세포의 침윤수준이 감소한다는 결과로부터, 상기 암세포의 침윤을 억제하는 작용기작은 세포질에서 작용하는 것임을 알 수 있었다.
실시예 1-2: ROS 의 수준에 미치는 Bcl -w와 p53 의 효과
상기 실시예 1-1의 결과로부터, 세포침윤을 억제하는 과정이 세포질에서 수행됨을 확인하였으므로, 암세포의 침윤에 작용한다고 알려진 세포내 ROS의 수준을 비교하고자 하였다. 즉, 상기 2차 도입된 세포를 대상으로, DCF 및 MitoSOX Red 프로브를 이용하여 세포성 ROS 및 미토콘드리아 ROS의 수준을 분석하였다(도 1b).
도 1b는 Bcl-w가 발현되거나 또는 발현되지 않는 폐암세포(H1299)에서, 야생형 또는 변이체 p53(p53K305N 또는 p53K305N / R175H)의 발현에 따른 세포내 ROS 수준을 DCF 및 MitoSOX Red 프로브를 이용하여 분석한 결과를 나타내는 그래프로서, 상단은 DCF를 사용하여 유세포 분석을 수행한 결과를 나타내는 그래프이고, 하단의 좌측은 DCF를 사용하여 분석한 ROS의 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이며, 하단의 우측은 MitoSOX Red 프로브를 사용하여 분석한 ROS의 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 1b에서 보듯이, Bcl-w의 발현여부에 관계없이, 야생형 p53 및 변이체 p53(p53K305N)이 발현된 암세포는 대조군에 비하여 ROS의 수준이 감소하였으나, 변이체 p53(p53K305N / R175H)이 발현된 암세포는 대조군과 유사한 ROS 수준을 나타냄을 확인하였다. 아울러, Bcl-w가 발현된 세포에서는 전체적인 ROS 수준이 증가함을 확인하였다.
상기 결과는 도 1a의 결과와 일치하므로, p53에 의한 침윤억제 활성은 세포내 ROS를 감소시킴에 의하여 유발됨을 알 수 있었다.
실시예 1-3: PI3K 의 활성 및 인산화된 Akt 과 MMP -2의 수준에 미치는 Bcl -w와 p53의 효과
상기 실시예 1-2의 결과로부터, p53에 의한 침윤억제 활성이 세포내 ROS를 감소시킴에 의하여 유발됨을 알 수 있었으므로, 상기 ROS의 수준에 영향을 줄 수 있는 조절인자인 PI3K의 활성 및 인산화된 Akt과 MMP-2의 수준을 비교하고자 하였다. 즉, 상기 2차 도입된 세포를 대상으로, 항-PI31K 항체를 이용한 면역침전분석을 수행한 다음, PI3K의 활성은 경쟁적 ELISA를 이용하여 분석하고, PI3K에 영향을 미치는 인산화된 Akt와 MMP-2의 수준은 웨스턴블럿 분석을 통하여 비교하였다(도 1c).
도 1c는 Bcl-w가 발현되거나 또는 발현되지 않는 폐암세포(H1299)에서, 야생형 또는 변이체 p53(p53K305N 또는 p53K305N / R175H)의 발현에 따른 세포내 PI3K의 활성 및 인산화된 Akt과 MMP-2의 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프 및 사진이다. 도 1c에서 보듯이, Bcl-w의 발현여부에 관계없이, 야생형 p53 및 변이체 p53(p53K305N)이 발현된 암세포는 대조군에 비하여 PI3K의 활성 및 인산화된 Akt와 MMP-2의 수준이 감소하였으나, 변이체 p53(p53K305N / R175H)이 발현된 암세포는 대조군과 유사한 PI3K의 활성 및 인산화된 Akt와 MMP-2의 수준을 나타냄을 확인하였다. 아울러, Bcl-w가 발현된 세포에서는 전체적인 PI3K의 활성 및 인산화된 Akt와 MMP-2의 수준이 증가함을 확인하였다.
상기 결과는 도 1a 및 1b의 결과와 일치하므로, p53에 의한 침윤억제 활성은 세포내 ROS 수준, PI3K의 활성 및 인산화된 Akt와 MMP-2의 수준을 감소시킴에 의하여 유발됨을 알 수 있었다.
실시예 1-4: 암세포의 침윤억제 효과에 미치는 p53 과 Bcl -w의 결합활성 분석
실시예 1-4-1: 재조합 단백질 분석
상기 실시예 1-3에서 확인된 p53의 효과를 검증하기 위하여, 재조합 단백질을 사용한 결합활성 분석을 수행하였다.
구체적으로, 공지된 재조합 방법을 이용하여 상기 야생형 또는 변이체 p53을 각각 제작하고, GST, GST-Bcl-w 또는 GST-Bax 단백질과 반응시켰다. 반응이 종료된 후, 상기 반응물에 글루타티온이 결합된 세파로스 비드를 가하여 침전분석을 수행하고, 상기 침전분석에서 얻어진 침전물을 대상으로 항-p53 항체를 이용한 웨스턴블럿 분석을 수행하였다(도 1d).
도 1d는 야생형 또는 변이체 p53와 GST, GST-Bcl-w 또는 GST-Bax 단백질을 반응시킨 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진으로서, 상단은 야생형 또는 변이체 p53와 GST 또는 GST-Bcl-w를 반응시킨 결과를 나타내고, 중단은 p53의 발현수준을 비교한 결과를 나타내며, 하단은 야생형 또는 변이체 p53와 GST 또는 GST-Bax를 반응시킨 결과를 나타낸다. 도 1d에서 보듯이, 세포질의 p53은 Bcl-w와 특이적으로 결합하는데, 야생형 p53은 Bcl-w와 높은 특이성으로 결합하는 반면, 변이체 p53은 Bcl-w와 낮은 특이성으로 결합하며, 상기 p53의 175번 잔기가 변이된 경우에는 Bcl-w와 결합하지 않았고; 이에 반하여 Bax는 야생형 또는 변이체 p53과 유사한 수준으로 결합함을 확인하였다.
상기 도 1d의 결과를 도 1a 내지 1c의 결과와 비교하면, 상기 p53에 의한 암세포침윤 억제활성을 나타내기 위하여는 p53과 Bcl-w의 결합이 필수적으로 요구되고, 상기 결합에는 175번 잔기가 중요한 역할을 수행함을 알 수 있었다
실시예 1-4-2: 세포 파쇄물 분석
상기 실시예 1-3에서 확인된 p53의 효과를 검증하기 위하여, 상기 2차 도입된 암세포 중에서 Bcl-w가 발현되지 않는 암세포의 세포파쇄물을 사용한 결합활성 분석을 수행하였다. 즉, 상기 2차 도입된 암세포 중에서 Bcl-w가 발현되지 않는 암세포로부터 세포파쇄물을 수득하고, 상기 각각의 세포파쇄물을 대상으로, 항-Bcl-w 항체 또는 항-Bax 항체를 이용한 면역침전분석을 수행하였으며, 이로부터 얻어진 침전물을 대상으로 항-p53 항체 또는 항-Bcl-w 항체를 이용한 웨스턴블럿 분석을 수행하였다. 아울러, 상기 각각의 세포파쇄물을 대상으로, 항-p53 항체, 항-Bcl-w 항체 또는 항-Bax 항체를 이용한 웨스턴블럿 분석을 수행하였다(도 1e).
도 1e는 Bcl-w가 발현되지 않는 폐암세포(H1299)에서, 야생형 또는 변이체 p53(p53K305N 또는 p53K305N / R175H)의 발현에 따른 p53, Bcl-w 및 Bax 간의 결합활성을 분석한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다. 도 1e에서 보듯이, Bcl-w와 p53의 결합은 야생형 p53 및 변이체 p53(p53K305N)이 발현된 암세포에서 확인되었고, Bax와 p53의 결합은 변이체 p53(p53K305N 또는 p53K305N / R175H)이 발현된 암세포에서 확인되었으며, Bcl-w와 Bax의 결합은 야생형 p53 및 변이체 p53(p53K305N / R175H)이 발현된 암세포에서 확인되었다.
실시예 1-4-3: 재조합 단백질 분석
상기 실시예 1-4-2에서 확인된 결과를 명확히 하기 위하여, 재조합 단백질을 사용한 결합활성 분석을 수행하였다.
구체적으로, 공지된 재조합 방법을 이용하여 상기 야생형 또는 변이체 p53을 각각 제작하고, 재조합 방법으로 발현된 Bcl-w 및 Bax를 동시에 반응시켰다. 반응이 종료된 후, 상기 반응물에 항-Bax 항체를 가하여 면역침전분석을 수행하고, 상기 침전분석에서 얻어진 침전물을 대상으로, 항-Bcl-w 항체를 이용한 웨스턴블럿 분석을 수행하였다. 또한, 상기 반응물을 대상으로, 항-p53 항체, 항-Bcl-w 항체 또는 항-Bax 항체를 이용한 웨스턴블럿 분석을 수행하였다(도 1f).
도 1f는 야생형 또는 변이체 p53와 Bcl-w 및 Bax를 동시에 반응시킨 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다. 도 1f에서 보듯이, 야생형 p53 및 변이체 p53(p53K305N)는 Bcl-w 또는 Bax와 결합하는 반면, 변이체 p53(p53K305N / R175H)는 Bcl-w 또는 Bax와 결합하지 않아서, Bcl-w/Bax 결합체가 형성됨을 확인하였다.
Bcl-w는 Bax와 결합하여 세포침윤을 억제한다고 알려져 있기 때문에, Bcl-w에 대한 p53의 결합은 Bcl-w/Bax 복합체의 분해원인이 될 수 있다. 따라서, 암세포 침윤을 억제하지 못하는 변이체 p53(p53K305N / R175H)를 사용한 실험결과에서 Bcl-w/Bax 결합체가 형성되었다는 것은 상기 Bcl-w/Bax 결합체의 분해가 암세포의 침윤억제와 관련되고, 이는 p53에 의하여 유도됨을 알 수 있었다.
상기 실시예 1-1 내지 1-4의 결과를 종합하면, 세포질의 p53은 Bcl-w와 결합하여, Bcl-w/Bax 결합체의 형성을 억제함으로써, ROS 수준저하, PI3K의 활성감소, 인산화된 Akt와 MMP-2의 수준감소를 통해, 암세포의 침윤을 억제함을 알 수 있었다.
실시예 2: 암세포의 침윤에 미치는 Bax 와 complex -I의 효과
Bax는 MPT(mitochondrial permeability transition)를 유도하여 자멸세포에서 ROS의 생산을 촉진하지만, 건강한 세포에서는 ROS의 생성을 억제하는데, 이의 작용기작은 알려져 있지 않다. 다만, 세포내 ROS는 미토콘드리아의 호흡연쇄에 의하여 발생되므로, 상기 미토콘드리아 호흡연쇄에 작용하는 4개의 다중체 단백질 복합체(complex-I, II, III 및 IV)에 상기 Bax가 작용하는지의 여부를 확인하고자 하였다.
실시예 2-1: 암세포의 침윤 억제활성에 대한 Bax 와 연관된 complex 의 확인
대조군(cRNA) 또는 Bax siRNA를 H1299 세포에 도입하고 24시간동안 배양한 다음, complex-I의 억제제인 로테논(1 μM), complex-II의 억제제인 말로네이트(5 mM), complex-III의 억제제인 안티마이신 A(10 μM) 또는 complex-IV의 억제제인 KCN(500 μM)을 처리하거나 또는 처리하지 않고, 배양하였다. 배양이 종료된 후, ROS 수준과 침윤성을 평가하였다(도 2a).
도 2a는 Bax의 발현을 억제하거나 또는 억제하지 않는 조건에서, 암세포의 침윤과 관련된 미토콘드리아 호흡연쇄 연관 단백질을 검출한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 2a에서 보듯이, Bax의 발현이 억제되지 않은 상태에서는 모든 암세포가 대조군 보다 낮은 수준의 침윤수준을 나타내었고, Bax의 발현이 억제된 상태에서는 대부분의 암세포의 침윤수준이 증가하였으며, complex-I의 억제제인 로테논을 처리한 암세포는 Bax의 발현이 억제된 상태에서도 현저하게 낮은 ROS 수준 및 침윤수준을 나타냄을 확인하였다.
따라서, 암세포의 침윤 억제활성과 관련하여, Bax와 연관된 미토콘드리아 호흡연쇄 연관 단백질은 complex-I이고, 상기 complex-I은 ROS의 생성에 직접적으로 연관됨을 알 수 있었다.
실시예 2-2: complex 의 활성에 미치는 Bax 의 효과
상기 실시예 2-1의 결과로부터, Bax와 complex-I이 연관됨을 확인하였으므로, 상기 complex-I의 활성에 Bax가 어떠한 영향을 미치는지를 확인하고자 하였다.
서로다른 서열의 Bax siRNA를 H1299 세포에 처리하여 배양하고, 상기 배양된 각 세포로부터 complex-I, II, III 및 IV의 활성변화를 측정하였다(도 2b).
도 2b는 Bax의 발현이 억제된 조건에서 complex-I, II, III 및 IV의 활성변화를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 2b에서 보듯이, Bax의 발현억제에 따라 complex-I의 활성이 가장 큰 수준으로 증가함을 확인하였다.
실시예 2-3: Bax 와 complex -I의 결합활성 검증
H1299 세포 파쇄물을 대상으로 각 complex에 대한 항체를 사용하여 면역침전분석을 수행하여 각각의 침전물을 수득하였다. 상기 수득한 침전물을 대상으로 항-Bax 항체 또는 항-Bcl-w 항체를 사용한 웨스턴블럿 분석을 수행하고, 상기 H1299 세포 파쇄물을 대상으로 동일한 항체를 사용한 웨스턴블럿 분석을 수행하였다(도 2c). 이때, 내부대조군으로 β-액틴을 사용하였다.
도 2c는 H1299 세포에서 Bax와 결합할 수 있는 미토콘드리아 호흡연쇄 연관 단백질을 검출한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다. 도 2c에서 보듯이, Bcl-w와 결합되는 미토콘드리아 호흡연쇄 연관 단백질은 검출되지 않았고, Bax와 결합되는 미토콘드리아 호흡연쇄 연관 단백질은 complex-I임을 확인하였다.
실시예 2-4: ΔΨ m 과 세포내 ATP 수준에 미치는 Bax 의 효과
서로다른 서열의 Bax siRNA를 H1299 세포에 처리하고, 상기 처리된 세포를 JC-1에 적용하고, 유세포분석을 수행함으로써, ΔΨm과 ATP 수준의 변화를 분석하였다(도 2d). 이때, ΔΨm 수준은 JC-1 밀도의 형태로 표시하였는데, 상기 ΔΨm 수준이 증가할 수록 JC-1 밀도가 감소되도록 표시하였다.
도 2d는 Bax의 발현억제에 따른 ΔΨm과 ATP 수준의 변화를 나타내는 그래프이다. 도 2d에서 보듯이, Bax의 발현이 억제되면, ΔΨm과 ATP 수준이 모두 증가함을 확인하였다
상기 실시예 2-1 내지 2-4의 결과를 종합하면, 암세포에서 Bax는 complex-I의 활성을 억제하고, ΔΨm 를 감소시키며, ATP 생산을 감소시키는 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 3: Bax 및 complex -I의 결합부위 분석
실시예 3-1: Bax 의 결합부위 분석
일반적으로, Bax는 세포내에서 미토콘드리아의 막에 결합된 형태로 존재하는데, 그의 C-말단영역은 미토콘드리아 외막에 삽입되어 있고, C-말단의 4개 잔기(KKMG)는 미토콘드리아의 외막과 내막 사이에 존재하는 막간공간(intermembrane space)에 돌출된 형태로 존재한다고 알려져 있다.
이에, Bax로부터 상기 C-말단의 4개 잔기를 결실시킬 경우, complex-I과의 결합활성이 변화되는지를 확인하고자 하였다.
pTRE, pTRE-Bax 또는 pTRE-BaxΔC4 벡터가 도입된 LoVo 세포에 테트라사이클린(1 ㎍/㎖)을 16시간 동안 처리하여 유전자 발현을 유도하였다. 상기 외래유전자의 발현이 완료된 LoVo 세포를 파쇄하여 세포파쇄물을 수득하고, 상기 세포파쇄물에 항-complex-I 항체를 가하여 면역침전을 수행하였으며, 이로부터 침전물을 수득하였다. 상기 수득한 세포파쇄물과 침전물을 대상으로 항-Bax 항체를 이용한 웨스턴블럿 분석을 수행하였다. 또한, 상기 LoVo 세포를 대상으로 ROS 수준 및 침윤수준을 측정하였다(도 3a).
도 3a는 야생형 또는 변이체 Bax가 도입된 LoVo 세포에서 상기 Bax의 종류에 따른 complex-I과의 결합활성(상단), ROS 수준(하단 좌측) 및 침윤수준(하단 우측)을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진 및 그래프이다. 도 3a에서 보듯이, Bax의 C-말단 4개 잔기가 결실되면 complex-I과 결합되지 않고, 이처럼 Bax가 complex-I과 결합되지 않으면, ROS 수준과 침윤수준이 증가함을 확인하였다. 반면, 야생형 Bax은 complex-I과 결합하고, 이에 따라 ROS 수준 및 침윤수준이 감소됨을 확인하였다.
따라서, Bax에 있어서, complex-I과의 결합은 C-말단의 4개 잔기를 통하여 수행됨을 알 수 있었다.
실시예 3-2: complex -I의 결합부위 분석
인간의 complex-I은 두개의 도메인을 형성하는 45개의 서브유닛으로 구성되는데, 세포막 결합 도메인은 미토콘드리아 내막에 위치하고, 세포질 도메인은 미토콘드리아 간질에 돌출되어 있다고 알려져 있다.
상기 세포막 결합 도메인을 구성하는 서브유닛의 일부는 상기 막간공간에 돌출되어 있으므로, 상기 돌출된 부위를 통하여 Bax의 C-말단의 4개 잔기와 결합할 것으로 가정하였다.
H1299 세포의 파쇄물을 대상으로 항-Bax 항체를 가하여 면역침전을 수행하였으며, 이로부터 침전물을 수득하였다. 상기 수득한 침전물을 대상으로 세포막 결합 도메인의 3개 서브유닛(ND1, ND2 또는 ND5)에 대한 각각의 항체 또는 세포질 도메인의 2개 서브유닛(NDUFS1 또는 NDUFV2)에 대한 각각의 항체를 사용한 웨스턴블럿 분석을 수행하였다(도 3b).
도 3b는 암세포에서 면역침전분석을 통하여 Bax와 결합할 수 있는 complex-I을 구성하는 서브유닛을 선별한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다. 도 3b에서 보듯이, Bax와 결합할 수 있는 complex-I을 구성하는 서브유닛은 ND5 임을 확인하였다.
상기 확인된 ND5 서브유닛이 Bax의 C-말단의 4개 잔기와 결합하는지의 여부를 확인하고자 하였다. 즉, pTRE, pTRE-Bax 또는 pTRE-BaxΔC4 벡터가 도입된 H1299 세포로부터 각각의 세포파쇄물을 수득하고, 상기 세포파쇄물을 대상으로 항-Bax 항체를 가하여 면역침전을 수행하였으며, 이로부터 침전물을 수득하였다. 상기 수득한 침전물을 대상으로 항-ND5 항체를 사용한 웨스턴블럿 분석을 수행하고, 비교군으로서 상기 세포파쇄물을 대상으로 항-Bax 항체 또는 항-ND5 항체를 사용한 웨스턴블럿 분석을 수행하였다(도 3c).
도 3c는 야생형 또는 변이체 Bax가 도입된 H1299 세포에서 Bax의 C-말단의 4개 잔기가 complex-I의 ND5 서브유닛과 결합할 수 있는지를 확인한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다. 도 3c에서 보듯이, C-말단의 4개 잔기가 결실된 변이체 Bax는 ND5 서브유닛과 결합하지 않았고, 정상적인 Bax만이 ND5 서브유닛과 결합함을 확인하였다.
따라서, complex-I에 있어서, Bax와의 결합은 ND5 서브유닛을 통하여 수행됨을 알 수 있었다.
실시예 3-3: 변이체을 이용한 ND5 서브유닛의 활성분석
폐암세포에서는 상기 ND5 서브유닛의 다양한 변이체가 발현되는 것으로 알려져 있는데, 상기 변이체 중의 하나가 ND5의 13829번 아미노산 잔기인 글리신이 알라닌으로 치환된 변이체(ND5G13289A)이다. 상기 변이체 ND5를 이용하여 암세포의 침윤에 관여하는 ND5의 활성을 분석하였다.
구체적으로, ND5 및 ND5G13289A을 코딩하는 pCMV/myc/mito 벡터를 H1299 세포에 도입하여 형질전환체를 수득하였다. 상기 형질전환체를 파쇄하여 파쇄물을 수득하고, 상기 파쇄물을 대상으로 면역침전분석 및 웨스턴블럿 분석을 수행하였다(도 3d).
도 3d는 ND5 또는 ND5G13289A이 발현되는 H1299 세포의 파쇄물을 대상으로 Bax가 외인성 ND5(Myc-WT) 또는 ND5G13289A(Myc-G13289A)와 결합체를 형성하는지의 여부를 확인한 결과를 나타내는 면역침전분석 사진 및 웨스턴블럿 분석사진이다. 도 3d에서 보듯이, Bax는 외인성 ND5(Myc-WT)와는 결합체를 형성하지만, 외인성 ND5G13289A(Myc-G13289A)와는 결합체를 형성하지 않음을 확인하였다.
실시예 3-4: 변이체 ND5 의 과발현이 암세포침윤에 미치는 효과
상기 실시예 3-3에서 수득한 형질전환체를 대상으로, ROS 수준과 침윤수준을 분석하였다(도 3e).
도 3e은 야생형 또는 변이체 ND5의 발현에 따른 암세포에서 ROS 수준과 침윤수준의 변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 3e에서 보듯이, 대조군에 비하여, 야생형 ND5가 도입된 암세포에서는 세포내 ROS 수준과 침윤수준이 증가하였고, 변이체 ND5가 도입된 암세포에서는 야생형 ND5가 도입된 암세포보다도 더욱 높은 수준으로 ROS 수준 및 침윤수준이 증가함을 확인하였다.
상기 결과는, 변이체 ND5가 Bax와 결합하지 못하기 때문인 것으로 분석되었다.
상기 실시예 3-1 내지 3-4의 결과를 종합하면, Bax의 C-말단의 4개 잔기와 complex-I의 ND5 서브유닛을 통하여, Bax와 complex-I이 결합하여, complex-I의 기능을 억제함으로써, ROS의 수준을 저하시키고, 암세포의 침윤을 억제함을 알 수 있었다.
실시예 4: 암세포의 침윤에 미치는 Bcl -w와 complex -I의 효과
상기 실시예 1의 결과를 통하여 Bcl-w와 Bax가 복합체를 형성할 수 있고, 상기 실시예 3의 결과를 통하여 Bax와 complex-I이 복합체를 형성할 수 있음을 확인하였다. 이에 따라, 상기 Bax/complex-I 복합체의 형성에 있어서, Bcl-w는 상기 복합체의 형성을 억제하는 효과를 나타낼 수 있을 것으로 가정하고, 이를 확인하고자 하였다.
실시예 4-1: Bcl -w의 발현조건 하에서 complex -I의 활성억제 효과
대조군과 Bcl-w가 도입된 H1299 세포를 대상으로 로테논(1 μM), 말로네이트(5 mM), 안티마이신 A(10 μM) 또는 KCN(500 μM)을 처리하거나 또는 처리하지 않고 배양하였으며, 상기 배양이 종료된 세포를 대상으로 세포내 ROS 수준과 침윤수준을 분석하였다(도 4a).
도 4a는 Bcl-w가 발현되지 않거나 또는 발현되는 폐암세포(H1299)에서 다양한 암세포의 침윤과 관련된 미토콘드리아 호흡연쇄 연관 단백질의 활성억제에 따른, ROS 수준과 침윤수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 4a에서 보듯이, Bcl-w가 발현되지 않을 경우에는 상기 미토콘드리아 호흡연쇄 연관 단백질의 활성을 억제하여도 ROS 수준 및 암세포의 침윤수준이 대조군보다 낮은 수준을 나타내었으나, Bcl-w가 발현될 경우에는 상기 미토콘드리아 호흡연쇄 연관 단백질의 활성을 억제할 경우 대부분 ROS 수준 및 암세포의 침윤수준이 증가함을 확인하였다. 다만, complex-I의 활성을 억제할 경우에는 이례적으로 ROS 수준 및 암세포의 침윤수준이 감소함을 확인하였다.
따라서, Bcl-w 역시 Bax와 마찬가지로 암세포의 침윤과정을 complex-I을 통하여 조절할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 4-2: complex -I의 활성에 대한 Bcl -w 과발현의 효과
상기 Bcl-w의 과발현이 complex-I의 활성에 직접적으로 어떠한 효과를 나타내는지 확인하고자, 대조군, Bcl-w 또는 Bcl-wG94A 유전자를 암세포에 도입하여 형질도입체를 각각 수득하고, 이를 배양하여 각각의 형질도입체를 수득한 다음, 상기 수득한 각각의 형질도입체를 파쇄하여, 각각의 세포파쇄물을 수득하였으며, 상기 수득한 각각의 세포파쇄물을 대상으로 complex I-IV의 활성을 비교하였다(도 4b).
도 4b는 야생형 또는 변이체 Bcl-w가 과발현된 조건에서 complex-I, II, III 및 IV의 활성변화를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 4b에서 보듯이, Bcl-w의 과발현에 따라 complex-I의 활성이 가장 큰 수준으로 증가함을 확인하였다.
실시예 4-3: ΔΨ m 및 ATP 수준에 대한 Bcl -w 과발현의 효과
상기 실시예 4-2에서 수득한 각각의 형질도입체를 JC-1에 적용하고, 유세포분석을 수행함으로써, ΔΨm과 ATP 수준의 변화를 분석하였다(도 4c). 이때, ΔΨm 수준은 JC-1 밀도의 형태로 표시하였는데, 상기 ΔΨm 수준이 증가할 수록 JC-1 밀도가 감소되도록 표시하였다.
도 4c는 야생형 또는 변이체 Bcl-w가 과발현된 조건에서 ΔΨm과 ATP 수준의 변화를 나타내는 그래프이다. 도 4c에서 보듯이, 야생형 Bcl-w가 과발현되면, ΔΨm과 ATP 수준이 모두 증가하였으나, 변이체 Bcl-w가 과발현되면, ΔΨm과 ATP 수준이 대조군과 유사한 수준을 나타냄을 확인하였다
실시예 4-4: ND5 와 Bax 의 결합에 미치는 Bcl -w 과발현의 효과
상기 실시예 4-2에서 수득한 각각의 세포파쇄물에 항-complex-I 항체 또는 항-Bax 항체를 가하고 면역침전을 수행하여 각각의 침전물을 수득하였으며, 상기 침전물 또는 세포파쇄물을 대상으로 항-Bcl-w 항체, 항-Bax 항체 또는 항-ND5 항체를 사용한 웨스턴블럿 분석을 수행하였다(도 4d).
도 4d는 야생형 또는 변이체 Bcl-w가 과발현된 조건에서 Bax와 complex-I(ND5)의 결합여부를 확인한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다. 도 4d에서 보듯이, 야생형 Bcl-w가 과발현되면, 암세포내에서 Bax/complex-I 복합체 또는 Bax/ND5 복합체의 수준이 극히 낮은 수준을 나타내었으나, 변이체 Bcl-w가 과발현되면, 암세포내에서 Bax/complex-I 복합체 또는 Bax/ND5 복합체의 수준이 현저하게 증가됨을 확인하였다.
이처럼, Bcl-w는 Bax와 결합하여 Bax/complex-I(ND5) 반응을 억제할 수 있으므로, Bcl-w는 Bax와 결합하여 complex-I을 활성화시키고, 상기 complex-I으로부터 Bax의 분리를 촉진시키는 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 4-5: complex -I의 활성에 미치는 p53 의 효과
상기 실시예 4-4의 결과로부터, Bcl-w가 간접적으로 complex-I의 활성을 조절함을 확인하였으므로, 상기 Bcl-w와 결합하여 이의 활성을 조절할 수 있는 p53 역시 간접적으로 complex-I의 활성을 조절할 수 있을 것으로 가정하고, 이를 확인하고자 하였다. 즉, 상기 실시예 1-1에서 수득한 Bcl-w와 결합할 수 있거나 또는 결합할 수 없는 변이체 p53이 2차로 도입된 각각의 세포를 대상으로, complex-I 활성, ΔΨm 수준 및 ATP 수준을 분석하였다(도 4e).
도 4e는 Bcl-w와 결합할 수 있거나 또는 결합할 수 없는 변이체 p53(p53K305N 또는 p53K305N / R175H)의 발현에 따른 complex-I 활성(좌측), ΔΨm 수준(중간) 및 ATP 수준(우측)을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 4e에서 보듯이, Bcl-w와 결합할 수 있는 변이체 p53(p53K305N)이 과발현된 세포에서는 complex-I의 활성이 저하되고, 이에 따라 ΔΨm과 ATP 수준이 모두 감소하였으나, Bcl-w와 결합할 수 없는 변이체 p53(p53K305N / R175H)이 과발현된 세포에서는 complex-I의 활성, ΔΨm 수준 및 ATP 수준이 모두 대조군과 유사한 수준을 나타냄을 확인하였다.
이처럼, p53은 Bcl-w와 결합하여 Bax/complex-I(ND5) 복합체를 형성할 수 있고, 이에 따라 complex-I을 불활성화시켜서, 결과적으로는 암세포의 침윤을 억제하는 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 4-6: ND5 와 Bax 의 결합에 미치는 p53 의 효과
상기 실시예 1-1에서 수득한 Bcl-w와 결합할 수 있거나 또는 결합할 수 없는 변이체 p53이 2차로 도입된 각각의 세포로부터 수득한 세포파쇄물에 항-complex-I 항체 또는 항-Bax 항체를 가하고 면역침전을 수행하여 각각의 침전물을 수득하였으며, 상기 침전물 또는 세포파쇄물을 대상으로 항-p53 항체, 항-Bax 항체 또는 항-ND5 항체를 사용한 웨스턴블럿 분석을 수행하였다(도 4f).
도 4f는 Bcl-w와 결합할 수 있거나 또는 결합할 수 없는 변이체 p53(p53K305N 또는 p53K305N / R175H)의 발현에 따른 Bax와 complex-I(ND5)의 결합여부를 확인한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다. 도 4f에서 보듯이, Bcl-w와 결합할 수 있는 변이체 p53(p53K305N)이 과발현된 세포에서는 Bax/complex-I(ND5) 결합체가 검출되었으나, Bcl-w와 결합할 수 없는 변이체 p53(p53K305N / R175H)이 과발현된 세포에서는 Bax/complex-I(ND5) 결합체가 검출되지 않음을 확인하였다.
상기 실시예 4-1 내지 4-6의 결과를 종합하면, 암세포내에서 p53은 Bcl-w와 함께 p53/Bcl-w 복합체를 형성하고, 이에 따라 미토콘드리아에서 Bax는 complex-I과 함께 Bax/complex-I 복합체를 형성하며, 결과적으로 세포침윤을 억제함을 알 수 있었다.
실시예 5: 암세포 침윤활성에 대한 야생형 p53 의 효과
상기 실시예 1 내지 4에서는, 암세포의 침윤활성에 있어서, 핵에서 발현되는 p53이 세포질에서 작용하는 효과를 검증하기 위하여, 세포질에 축적되는 변이체 p53(p53K305N)을 이용하여 수행하였고, 상기 변이체 p53(p53K305N)이 세포질에서 암세포의 침윤을 억제하는 효과를 나타냄을 확인하였다. 이에, 상기 변이체 p53(p53K305N)이 아닌 야생형 p53도 세포질에서 동일한 효과를 나타낼 수 있는지의 여부를 확인하고자 하였다.
실시예 5-1: 세포내 ROS 수준에 미치는 야생형 p53 의 효과
세포질에 야생형 p53이 축적되는 IMR-32 신경아세포종 세포에 2종류의 p53 siRNA를 도입하여 형질도입체를 수득하고, 이를 배양한 다음, 세포내 ROS 수준 및 침윤수준을 비교하였다(도 5a). 이때, 대조군으로는 p53 siRNA가 포함되지 않은 빈 벡터(cRNA)가 도입된 형질도입체를 사용하였다.
도 5a는 세포질에 p53이 축적되는 IMR-32 신경아세포종 세포에서 야생형 p53의 발현억제에 따른, 세포내 ROS 수준(좌측) 및 침윤수준(우측)의 변화를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 5a에서 보듯이, 세포질에 축적되는 야생형 p53의 발현이 억제되면, 세포내 ROS 수준 및 침윤수준이 증가함을 확인하였다.
따라서, 변이체 p53(p53K305N)이 아닌 야생형 p53도 세포질에서 ROS 의존적인 세포침윤을 억제하는 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 5-2: 세포내 Bax / complex -I( ND5 ) 복합체의 형성에 미치는 야생형 p53 의 효과
상기 실시예 5-1에서 얻어진 각각의 형질도입체로부터 각각의 세포파쇄물을 수득한 다음, 상기 수득한 각각의 세포파쇄물에 항-Bax 항체 또는 항-complex-I 항체를 처리하여 면역침전을 수행하고, 이로부터 각각의 침전물을 수득하였으며, 상기 수득한 침전물을 대상으로 항-Bcl-w 항체, 항-Bax 항체, 항-p53 항체 또는 항-ND5 항체를 사용한 웨스턴블럿 분석을 수행하였다(도 5b).
도 5b는 세포질에 p53이 축적되는 IMR-32 신경아세포종 세포에서 야생형 p53의 발현억제에 따른, 세포질의 Bcl-w/Bax 복합체, Bax/complex-I(ND5) 복합체 수준의 변화를 분석한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다. 도 5b에서 보듯이, 야생형 p53이 발현된 경우에는 세포질에서 Bax/complex-I(ND5) 복합체가 형성되는 반면, 야생형 p53이 발현되지 않는 경우에는 세포질에서 Bcl-w/Bax 복합체가 형성됨을 확인하였다.
따라서, 변이체 p53(p53K305N)이 아닌 야생형 p53도 세포질에서 Bcl-w와 결합하여 p53/Bcl-w 복합체를 형성하고, 이에 따라 Bax/complex-I(ND5) 복합체 형성을 통하여 세포침윤을 억제하는 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 5-3: complex -I 활성에 미치는 야생형 p53 의 효과
상기 실시예 5-1에서 얻어진 각각의 형질도입체를 대상으로, complex-I 활성, ΔΨm 수준 및 ATP 수준을 분석하였다(도 5c).
도 5c는 세포질에 p53이 축적되는 IMR-32 신경아세포종 세포에서 야생형 p53의 발현억제에 따른, complex-I 활성(좌측), ΔΨm 수준(중간) 및 ATP 수준(우측)을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 5c에서 보듯이, 야생형 p53의 발현이 억제되면, complex-I의 활성이 증가되고, 이에 따라 ΔΨm과 ATP 수준이 모두 증가함을 확인하였다.
따라서, 변이체 p53(p53K305N)이 아닌 야생형 p53도 Bcl-w로부터 Bax의 분리를 촉진시켜서, Bax과 complex-I(ND5)의 결합을 야기시키고, 이에 따라 complex-I 활성, ΔΨm 및 ATP 수준을 감소시킬 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 5-4: Bcl -w 및 Bax 의 기능에 미치는 야생형 p53 의 효과
상기 실시예 5-1에서 얻어진 각각의 형질도입체에 Bcl-w siRNA 또는 Bax siRNA를 도입하여 각각의 2차 형질도입체를 제작하고, 이를 배양한 다음, 침윤수준을 비교하였다(도 5d).
도 5d는 세포질에 p53이 축적되는 IMR-32 신경아세포종 세포에서 야생형 p53와 Bcl-w(좌측) 또는 p53와 Bax(우측)의 동시 발현억제에 따른 침윤수준의 변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 5d에서 보듯이, p53의 발현이 억제된 경우에는 침윤수준이 증가함에 반하여, p53와 Bcl-w의 발현이 억제된 경우에는 세포침윤수준이 저하되고, p53와 Bax의 발현이 억제된 경우에는 세포침윤수준이 증가됨을 확인하였다.
따라서, 변이체 p53(p53K305N)이 아닌 야생형 p53도 complex-I의 활성화에 관여하고, 이에 따라, 세포침윤이 조절됨을 알 수 있었다.
상기 실시예 5-1 내지 5-4의 결과를 종합하면, 암세포의 침윤활성의 조절에 대하여는, 야생형 p53도 변이체 p53(p53K305N)과 동일한 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 6: 암세포 침윤활성에 대한 Bcl - X L 및 Bak 의 효과
상기 실시예 5의 결과로부터, 야생형 p53이 Bcl-w 및 Bax의 상류에서 암세포 침윤활성을 조절함을 확인하였으므로, 상기 Bcl-w 및 Bax의 효과를 다른 단백질로 대체할 수 있는지의 여부를 확인하고자 하였다.
실시예 6-1: complex -I 활성에 미치는 Bcl - X L 의 효과
H1299 세포에 Bcl-XL을 코딩하는 벡터를 도입하여 형질도입체를 수득하고, 상기 형질도입체를 대상으로 complex-I 활성, ΔΨm 수준 및 ATP 수준을 분석하였다(도 6a).
도 6a는 Bcl-XL의 발현에 따른, complex-I 활성(좌측), ΔΨm 수준(중간) 및 ATP 수준(우측)을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 6a에서 보듯이, Bcl-XL이 발현되면, complex-I의 활성이 증가되고, 이에 따라 ΔΨm과 ATP 수준이 모두 증가함을 확인하였다.
실시예 6-2: p53 에 대한 Bcl - X L 의 효과
상기 실시예 6-1에서 수득한 형질도입체에 다시 야생형 또는 변이체 p53(p53K305N 또는 p53K305N / R175H)을 코딩하는 벡터를 2차로 도입하여 각각의 형질도입체를 수득하고, 이를 배양후 파쇄하여 각각의 세포파쇄물을 수득하였다. 상기 수득한 각각의 세포파쇄물에 항-Bcl-XL 항체를 가하고 면역침전분석을 수행하여, 침전물을 수득하였다. 상기 수득한 침전물을 대상으로 항-p53 항체 또는 항-Bax 항체를 사용한 웨스턴블럿 분석을 수행하였다(도 6b).
도 6b는 Bcl-XL의 발현에 따른, 야생형 또는 변이된 p53과 Bcl-XL를 포함하는 복합체의 수준을 분석한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다. 도 6b에서 보듯이, 상기 Bcl-XL은 야생형 p53 및 변이체 p53(p53K305N / R175H)과 복합체를 형성하지 않고, 변이체 p53(p53K305N)과 복합체를 형성함을 확인하였다. 또한, 야생형 p53 및 변이체 p53(p53K305N / R175H)이 발현된 조건에서는 상기 Bcl-XL이 Bax와 복합체를 형성함을 확인하였다.
실시예 6-3: 세포내 ROS 수준에 미치는 야생형 또는 변이체 p53 과 Bcl - X L 의 효과
상기 실시예 6-2에서 수득한 형질도입체를 대상으로 세포내 ROS 수준 및 침윤수준을 비교하였다(도 6c).
도 6c는 야생형 또는 변이체 p53과 Bcl-XL의 발현에 따른, 세포내 ROS 수준(좌측) 및 침윤수준(우측)의 변화를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 6c에서 보듯이, 야생형 또는 변이체 p53의 발현과는 상관없이, Bcl-XL이 발현된 세포에서는 전체적으로 ROS 수준 및 침윤수준이 증가함을 확인하였다.
실시예 6-4: complex -I 활성에 미치는 Bak 의 효과
LoVo 세포에 Bak siRNA를 코딩하는 벡터를 도입하여 형질도입체를 수득하고, 상기 형질도입체를 대상으로 complex-I 활성, ΔΨm 수준 및 ATP 수준을 분석하였다(도 6d).
도 6d는 Bak의 발현억제에 따른, complex-I 활성(좌측), ΔΨm 수준(중간) 및 ATP 수준(우측)을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 6d에서 보듯이, Bak의 발현이 억제되면, complex-I의 활성이 증가되고, 이에 따라 ΔΨm과 ATP 수준이 모두 증가함을 확인하였다.
실시예 6-5: complex -I과의 결합활성에 미치는 Bak 의 C-말단 4개 잔기의 효과
야생형 Bak 또는 Bak의 C-말단 4개 잔기가 결실된 변이체 Bak(BakΔC4)를 코딩하는 pTRE 발현벡터를 LoVo 세포에 도입하여 형질도입체를 수득하고, 상기 수득한 형질도입체에 테트라사이클린(1 ㎍/㎖)을 24시간 동안 처리하면서 배양하여, 도입된 유전자의 발현을 유도하였다. 배양이 종료된 후, 상기 배양된 형질도입체를 파쇄하여 각각의 세포파쇄물을 수득하고, 상기 세포파쇄물에 항-Bak 항체를 가하여 면역침전분석을 수행하였으며, 이로부터 침전물을 수득하였다. 상기 수득한 침전물 또는 세포파쇄물을 대상으로 항-Bak 항체 또는 항-ND5 항체를 사용하여 웨스턴블럿 분석을 수행하였다(도 6e).
도 6e는 Bak의 C-말단 4개 잔기의 존재여부에 따른, Bak와 complex-I(ND5) 결합체의 함량변화를 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다. 상기 도 6e에서 보듯이, 야생형 Bak는 complex-I(ND5)과 결합체를 형성할 수 있으나, Bak의 C-말단 4개 잔기가 결실된 변이체 Bak(BakΔC4)는 complex-I(ND5)과 결합체를 형성하지 못함을 확인하였다.
따라서, Bak는 Bak와 동일하게 C-말단 4개 잔기를 통하여 complex-I(ND5)과 결합체를 형성할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 6-6: 암세포 침윤활성에 대한 변이체 p53 및 Bak 의 효과
상기 실시예 6-4에서 수득한 형질전환체에 변이체 p53(p53K305N)을 코딩하는 벡터를 2차로 도입하여 각각의 2차 형질도입체를 수득하고, 상기 수득한 각각의 2차 형질도입체를 대상으로 침윤수준을 비교하였다(도 6f).
도 6f는 변이체 p53(p53K305N)의 발현과 Bak의 발현억제에 따른, 암세포의 침윤수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 6f에서 보듯이, Bak가 정상적으로 발현될 경우에는 변이체 p53의 발현에 의하여 침윤수준이 감소하였으나, Bak의 발현이 억제되면, 변이체 p53의 발현과는 상관없이 침윤수준이 증가함을 확인하였다.
따라서, 변이체 p53(p53K305N)은 Bak 의존적으로 암세포의 침윤을 억제함을 알 수 있었다.
실시예 6-7: Bak / complex -I 복합체의 형성에 미치는 변이체 p53 ( p53K305N )의 효과
상기 실시예 6-4에서 수득한 형질전환체에 변이체 p53(p53K305N 또는 p53K305N/R175H)을 코딩하는 벡터를 2차로 도입하여 각각의 2차 형질도입체를 수득하고, 이로부터 각각의 세포파쇄물을 수득하였다. 상기 수득한 각각의 세포파쇄물에 항-Bcl-w 항체 또는 항-complex-I 항체를 가하여 면역침전분석을 수행하고, 이로부터 각각의 침전물을 수득하였다. 상기 수득한 침전물 또는 세포파쇄물을 대상으로 항-p53 항체 또는 항-Bak 항체를 사용한 웨스턴블럿 분석을 수행하였다(도 6g).
도 6g는 변이체 p53(p53K305N 또는 p53K305N / R175H)의 발현에 따른, Bcl-w/Bak 복합체 또는 Bak/complex-I 복합체의 수준을 분석한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다. 도 6g에서 보듯이, 변이체 p53(p53K305N)가 발현된 경우에는 Bak/complex-I 복합체가 형성되는 반면, 변이체 p53(p53K305N / R175H)가 발현된 경우에는 Bcl-w/Bak 복합체가 형성됨을 확인하였다.
따라서, Bak는 변이체 p53(p53K305N)과 결합하여 complex-I을 활성화시킴을 알 수 있었다.
상기 실시예 6-1 내지 6-7의 결과를 종합하면, 암세포의 침윤억제활성에 관여하는 Bcl-w 및 Bax의 기능은 각각 Bcl-XL 및 Bak로 대체할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 7: 핵에서 발현되는 p53 의 암세포의 침윤에 미치는 효과
p53은 전사조절인자로서 알려져 있으므로, 핵에서 암세포의 침윤에 대하여 어떠한 조절효과를 나타내는지를 확인하고자 하였다.
실시예 7-1: 핵에서 발현되는 p53 의 암세포의 침윤에 관여하는 단백질의 발현수준에 미치는 효과
H1299세포에 야생형 또는 변이체 p53(p53R175H 또는 p53K305N)을 코딩하는 벡터를 도입하여, 각각의 형질도입체를 수득하고, 상기 수득한 각각의 형질도입체의 핵에서 상기 야생형 또는 변이체 p53을 발현시켰다. 이어, 상기 각각의 형질도입체로부터 세포파쇄물을 수득하고, 항-p53 항체, 항-Bax 항체, 항-Bak 항체, 항-Bcl-w 항체 또는 항-Bcl-XL 항체를 이용한 웨스턴블럿 분석을 수행하였다(도 7a).
도 7a는 야생형 또는 변이체 p53(p53R175H 또는 p53K305N)의 발현에 따른, 세포침윤에 관여하는 단백질의 발현수준 변화를 분석한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다. 도 7a에서 보듯이, 야생형 p53이 과발현된 경우에는 세포내 Bax의 발현수준이 특이적으로 증가하였으나, Bak, Bcl-w 또는 Bcl-XL의 수준은 증가되지 않음을 확인하였다.
실시예 7-2: 핵에서 발현되는 p53 의 암세포의 침윤에 미치는 효과
상기 실시예 7-1에서 수득한 야생형 또는 변이체 p53(p53R175H)을 코딩하는 벡터를 도입하여 수득한 형질도입체를 대상으로 침윤수준을 비교하였다(도 7b).
도 7b는 야생형 또는 변이체 p53(p53R175H)의 발현에 따른, 암세포의 침윤수준의 변화를 나타내는 그래프이다. 도 7b에서 보듯이, 야생형 p53의 발현은 암세포의 침윤수준을 감소시켰으나, 변이체 p53은 암세포의 침윤수준을 오히려 증가시킴을 확인하였다.
상기 결과로부터, 암세포의 침윤에 Bax의 발현이 필요함을 알 수 있었다.
실시예 7-3: 핵에서 발현되는 p53 과, Bcl -w 또는 Bax 의 발현억제가 암세포의 침윤에 미치는 효과
상기 실시예 7-1에서 수득한 야생형 p53을 코딩하는 벡터를 도입하여 수득한 형질도입체에 다시 Bax siRNA 또는 Blc-w siRNA를 코딩하는 벡터를 도입하여 각각의 2차 형질도입체를 제작하고, 상기 각각의 2차 형질도입체를 대상으로 ROS 수준과 침윤수준을 측정하였다(도 7c).
도 7c는 야생형 p53이 과발현되는 조건에서, Bax 또는 Blc-w의 발현억제에 따른, 세포내 ROS 수준 및 침윤수준의 변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 7c에서 보듯이, 야생형 p53이 과발현되는 조건에서, Bax의 발현이 억제되면 ROS 수준과 침윤수준이 증가되는 반면, Bcl-w의 발현이 억제되면, ROS 수준과 침윤수준이 감소됨을 확인하였다.
앞서 검토한 세포질 p53의 기능은 세포내 Bcl-w와 결합하여, Bax와 Complex-I의 복합체 형성을 촉진시키고, 이에 의하여 complex-I의 기능을 불활성화시키는 것으로 파악하였으므로, p53과 Bax의 연결고리 역할을 수행하는 Bcl-w의 발현이 억제되면, p53의 발현수준에 의하여 ROS 수준 및 침윤수준이 변화되지 않을 것으로 예상되었다. 그러나, 실제로는 Bcl-w의 발현이 억제된 암세포의 핵에서 p53이 과발현되면, ROS 수준 및 침윤수준이 감소하는 결과를 얻었으므로, 핵에서 발현되는 p53은 세포질내 작용기작과는 다른 방식으로 ROS 수준 및 침윤수준에 관여함을 알 수 있었다.
실시예 7-4: 핵에서 발현되는 p53 의 Bax / complex -I 복합체 형성에 미치는 효과
상기 실시예 7-1에서 수득한 야생형 또는 변이체 p53(p53R175H)을 코딩하는 벡터를 도입하여 수득한 형질도입체를 파쇄하여 각각의 세포파쇄물을 수득하고, 상기 수득한 각각의 세포파쇄물에 항-complex-I 항체를 가하여 면역침전분석을 수행하였으며, 이로부터 침전물을 수득하였다. 상기 수득한 침전물 또는 세포파쇄물을 대상으로 항-p53 항체 또는 항-Bax 항체를 이용한 웨스턴블럿 분석을 수행하였다(도 7d).
도 7d는 야생형 또는 변이체 p53(p53R175H)의 발현에 따른, Bax/complex-I 복합체 수준의 변화를 분석한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다. 도 7d에서 보듯이, 야생형 p53이 과발현되면 Bax/complex-I 복합체가 형성되었으나, 변이체 p53이 과발현되면, Bax/complex-I 복합체가 형성되지 않음을 확인하였다.
실시예 7-5: 핵에서 발현되는 p53 의 complex -I 활성에 미치는 효과
상기 실시예 7-4에서 수득한 형질도입체를 대상으로 complex-I 활성, ΔΨm 수준 및 ATP 수준을 분석하였다(도 7e).
도 7e는 야생형 또는 변이체 p53(p53R175H)의 발현에 따른, complex-I 활성(좌측), ΔΨm 수준(중간) 및 ATP 수준(우측)을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 7e에서 보듯이, 야생형 p53이 과발현되면 complex-I의 활성이 감소되고, 이에 따라 ΔΨm과 ATP 수준이 모두 감소하였으나, 변이체 p53이 과발현되면, complex-I의 활성이 증가되고, 이에 따라 ΔΨm과 ATP 수준이 모두 증가함을 확인하였다.
상기 실시예 7-1 내지 7-5의 결과를 종합하면, 핵에서 발현된 p53은 Bax의 발현을 유도한 다음, Bax/complex-I 복합체 형성을 유발시키고, ROS의 생성을 억제함으로써 세포침윤을 억제함을 시사한다.
실시예 8: 이식종양 동물모델을 통한 검증
실시예 8-1: 이식종양 동물모델의 제작
야생형 또는 변이체 Bcl-w(G94A)를 코딩하는 pEGFP-C 벡터, 야생형 Bcl-w와 p53을 코딩하는 pEGFP-C 벡터, 야생형 Bcl-w와 변이체 p53(R175H)를 코딩하는 pEGFP-C 벡터, 야생형 Bcl-w와 변이체 p53(K305N)를 코딩하는 pEGFP-C 벡터 또는 야생형 Bcl-w와 변이체 p53(K305N/R175H)를 코딩하는 pEGFP-C 벡터가 각각 도입된 H460 세포를 마우스에 도입하여 각각의 이식종양 동물모델을 제작하였다.
실시예 8-2: 이식종양 동물모델의 종양부피 변화 분석
상기 실시예 8-1에서 제작된 각각의 이식종양 동물모델을 14일 동안 사육하면서, 이식된 종양의 부피변화를 측정하였다(도 8a).
도 8a는 야생형 또는 변이체 p53 또는 Bcl-w가 도입된 이식종양 동물모델에서 시간의 경과에 따른 종양의 부피변화를 나타내는 그래프이다. 도 8a에서 보듯이, 도입된 유전자에 따른 종양부피의 변화는 나타나지 않음을 확인하였다.
실시예 8-3: 이식종양 동물모델에서 Bcl -w와 관련된 종양세포의 혈관침투성 분석
상기 실시예 8-2에서 사육된 각 이식종양 동물모델 중에서, 야생형 또는 변이체 Bcl-w(G94A)를 코딩하는 pEGFP-C 벡터가 도입된 이식종양 동물모델로부터 혈액을 채취하고, 상기 혈액에 포함된 세포의 핵을 DAPI로 염색한 다음, GFP-양성 및 DAPI-양성을 나타내는 세포를 혈관에 침투한 종양세포로 간주하였으며, 상기 혈액에 포함된 종양세포를 계수하여, 종양세포의 혈관침투성을 분석하였다(도 8b).
도 8b는 야생형 또는 변이체 Bcl-w(G94A)의 과발현에 따른, 종양세포의 혈관침투성을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 8b에서 보듯이, 야생형 Bcl-w가 과발현된 이식종양 동물모델에서는 종양세포의 혈관침투성이 대조군에 비하여 높은 수준으로 증가하였으나, 변이체 Bcl-w가 과발현된 이식종양 동물모델에서는 종양세포의 혈관침투성이 대조군과 유사한 수준을 나타냄을 확인하였다.
앞서 확인된 바와 같이, Bcl-w는 Bax와 결합하여 Bcl-w/Bax 복합체를 형성함으로써, complex-I을 활성화시키고, 이에 따라 암세포의 침윤수준을 증가시킴을 확인하였으므로, 상기 증가된 종양세포의 혈관침투성은 이러한 암세포 침윤수준의 증가에 의하여 야기된 것임을 알 수 있었다.
실시예 8-4: 이식종양 동물모델에서 Bcl -w 및 p53 과 관련된 종양세포의 혈관 침투성 분석
상기 실시예 8-2에서 사육된 각 이식종양 동물모델 중에서, 야생형 Bcl-w와, 야생형 또는 변이체 p53(R175H, K305N 또는 K305N/R175H)을 코딩하는 pEGFP-C 벡터가 도입된 이식종양 동물모델로부터 혈액을 채취하고, 상기 혈액에 포함된 세포의 핵을 DAPI로 염색한 다음, GFP-양성 및 DAPI-양성을 나타내는 세포를 혈관에 침투한 종양세포로 간주하였으며, 상기 혈액에 포함된 종양세포를 계수하여, 종양세포의 혈관침투성을 분석하였다(도 8c).
도 8c는 야생형 Bcl-w와, 야생형 또는 변이체 p53(R175H, K305N 또는 K305N/R175H)의 과발현에 따른, 종양세포의 혈관침투성을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 8c에서 보듯이, 야생형 Bcl-w가 과발현됨과 동시에 야생형 또는 변이체 p53(K305N)이 과발현된 이식종양 동물모델에서는 종양세포의 혈관침투성이 대조군보다 현저히 감소하였으나, 야생형 Bcl-w가 과발현됨과 동시에 변이체 p53(R175H 또는 K305N/R175H)이 과발현된 이식종양 동물모델에서는 종양세포의 혈관침투성이 대조군과 유사한 수준을 나타냄을 확인하였다.
앞서 확인된 바와 같이, p53은 Bcl-w와 결합하여 p53/Bcl-w 복합체를 형성하고, 이에 따라 Bax는 complex-I과 함께 Bax/complex-I 복합체를 형성하여 complex-I을 불활성화시키며, 이에 따라 암세포의 침윤수준을 감소시킴을 확인하였으므로, 상기 감소된 종양세포의 혈관침투성은 이러한 암세포 침윤수준의 감소에 의하여 야기된 것임을 알 수 있었다.
상술한 실시예 1 내지 8의 결과를 종합하면, 도 9a 및 9b에 도시된 바와 같이, p53이 암세포의 침윤을 억제할 수 있음을 알 수 있었다.
도 9a는 암세포의 침윤에 미치는 세포질 p53의 작용기작을 나타내는 개략도이다. 도 9a에서 보듯이, 암세포의 세포질에 축적된 p53은 미토콘드리아의 외막에서 Bcl-w와 결합하여 복합체를 형성하고, 핵에서 발현된 p53은 Bax의 발현을 촉진시키며, 상기 발현된 Bax는 미토콘드리아의 내막에 결합된 complex-I과 결합하여, complex-I을 불활성화 시킴으로써 암세포의 침윤수준을 감소시킨다, 반면, 세포질내 p53이 존재하지 않은 경우에는 미토콘드리아의 외막에서 Bcl-w와 Bax가 결합하여 복합체를 형성하여 complex-I을 활성화시키고, 이에 따라 세포내 ROS 수준이 증가하여 암세포의 침윤수준을 증가시킨다.
도 9b는 미토콘드리아 막에 위치한 Bax와 complex-I의 위치를 나타내는 개략도이다. 도 9b에서 보듯이, Bax는 미토콘드리아의 외막에 위치하고, C-말단의 4개 잔기를 미토콘드리아의 외막과 내막사이의 막간공간에 노출시키며, complex-I은 미토콘드리아의 내막에 위치하고, 이에 포함된 ND5 서브유닛은 상기 Bax의 C-말단 4개 잔기와 결합가능한 위치에 존재한다. 따라서, Bax의 C-말단의 4개 잔기와 complex-I의 ND5 서브유닛을 통하여, Bax/complex-I 복합체를 형성할 수 있다.
따라서, 상기 복합체의 형성을 억제할 수 있는 물질이 있다면, 이는 암세포의 침윤을 억제하는 암전이 치료제로 이용될 수 있음을 뒷받침하는 것이다.
<110> KOREA INSTITUTE OF RADIOLOGICAL & MEDICAL SCIENCES <120> Method for screening agent against cancer metastasis using Bax/complex-I <130> KPA141228-KR <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 393 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant p53 <400> 1 Met Glu Glu Pro Gln Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro Pro Leu Ser Gln 1 5 10 15 Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu 20 25 30 Ser Pro Leu Pro Ser Gln Ala Met Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp 35 40 45 Asp Ile Glu Gln Trp Phe Thr Glu Asp Pro Gly Pro Asp Glu Ala Pro 50 55 60 Arg Met Pro Glu Ala Ala Pro Pro Val Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro 65 70 75 80 Thr Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser Trp Pro Leu Ser Ser Ser 85 90 95 Val Pro Ser Gln Lys Thr Tyr Gln Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly 100 105 110 Phe Leu His Ser Gly Thr Ala Lys Ser Val Thr Cys Thr Tyr Ser Pro 115 120 125 Ala Leu Asn Lys Met Phe Cys Gln Leu Ala Lys Thr Cys Pro Val Gln 130 135 140 Leu Trp Val Asp Ser Thr Pro Pro Pro Gly Thr Arg Val Arg Ala Met 145 150 155 160 Ala Ile Tyr Lys Gln Ser Gln His Met Thr Glu Val Val Arg Arg Cys 165 170 175 Pro His His Glu Arg Cys Ser Asp Ser Asp Gly Leu Ala Pro Pro Gln 180 185 190 His Leu Ile Arg Val Glu Gly Asn Leu Arg Val Glu Tyr Leu Asp Asp 195 200 205 Arg Asn Thr Phe Arg His Ser Val Val Val Pro Tyr Glu Pro Pro Glu 210 215 220 Val Gly Ser Asp Cys Thr Thr Ile His Tyr Asn Tyr Met Cys Asn Ser 225 230 235 240 Ser Cys Met Gly Gly Met Asn Arg Arg Pro Ile Leu Thr Ile Ile Thr 245 250 255 Leu Glu Asp Ser Ser Gly Asn Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val 260 265 270 Arg Val Cys Ala Cys Pro Gly Arg Asp Arg Arg Thr Glu Glu Glu Asn 275 280 285 Leu Arg Lys Lys Gly Glu Pro His His Glu Leu Pro Pro Gly Ser Thr 290 295 300 Lys Arg Ala Leu Pro Asn Asn Thr Ser Ser Ser Pro Gln Pro Lys Lys 305 310 315 320 Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile Arg Gly Arg Glu 325 330 335 Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp 340 345 350 Ala Gln Ala Gly Lys Glu Pro Gly Gly Ser Arg Ala His Ser Ser His 355 360 365 Leu Lys Ser Lys Lys Gly Gln Ser Thr Ser Arg His Lys Lys Leu Met 370 375 380 Phe Lys Thr Glu Gly Pro Asp Ser Asp 385 390 <210> 2 <211> 193 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant Bcl-w <400> 2 Met Ala Thr Pro Ala Ser Ala Pro Asp Thr Arg Ala Leu Val Ala Asp 1 5 10 15 Phe Val Gly Tyr Lys Leu Arg Gln Lys Gly Tyr Val Cys Gly Ala Gly 20 25 30 Pro Gly Glu Gly Pro Ala Ala Asp Pro Leu His Gln Ala Met Arg Ala 35 40 45 Ala Gly Asp Glu Phe Glu Thr Arg Phe Arg Arg Thr Phe Ser Asp Leu 50 55 60 Ala Ala Gln Leu His Val Thr Pro Gly Ser Ala Gln Gln Arg Phe Thr 65 70 75 80 Gln Val Ser Asp Glu Leu Phe Gln Gly Gly Pro Asn Trp Gly Arg Leu 85 90 95 Val Ala Phe Phe Val Phe Gly Ala Ala Leu Cys Ala Glu Ser Val Asn 100 105 110 Lys Glu Met Glu Pro Leu Val Gly Gln Val Gln Glu Trp Met Val Ala 115 120 125 Tyr Leu Glu Thr Arg Leu Ala Asp Trp Ile His Ser Ser Gly Gly Trp 130 135 140 Ala Glu Phe Thr Ala Leu Tyr Gly Asp Gly Ala Leu Glu Glu Ala Arg 145 150 155 160 Arg Leu Arg Glu Gly Asn Trp Ala Ser Val Arg Thr Val Leu Thr Gly 165 170 175 Ala Val Ala Leu Gly Ala Leu Val Thr Val Gly Ala Phe Phe Ala Ser 180 185 190 Lys <210> 3 <211> 221 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant Bax <400> 3 Met Asp Gly Ser Gly Glu Gln Pro Arg Gly Gly Gly Pro Thr Ser Ser 1 5 10 15 Glu Gln Ile Met Lys Thr Gly Ala Leu Leu Leu Gln Gly Phe Ile Gln 20 25 30 Asp Arg Ala Gly Arg Met Gly Gly Glu Ala Pro Glu Leu Ala Leu Asp 35 40 45 Pro Val Pro Gln Asp Ala Ser Thr Lys Lys Leu Ser Glu Cys Leu Lys 50 55 60 Arg Ile Gly Asp Glu Leu Asp Ser Asn Met Glu Leu Gln Arg Met Ile 65 70 75 80 Ala Ala Val Asp Thr Asp Ser Pro Arg Glu Val Phe Phe Arg Val Ala 85 90 95 Ala Asp Met Phe Ser Asp Gly Asn Phe Asn Trp Gly Arg Val Val Ala 100 105 110 Leu Phe Tyr Phe Ala Ser Lys Leu Val Leu Lys Ala Leu Cys Thr Lys 115 120 125 Val Pro Glu Leu Ile Arg Thr Ile Met Gly Trp Thr Leu Asp Phe Leu 130 135 140 Arg Glu Arg Leu Leu Gly Trp Ile Gln Asp Gln Gly Gly Trp Gly Leu 145 150 155 160 Pro Leu Ala Glu Ser Leu Lys Arg Leu Met Ser Leu Ser Pro Gly Arg 165 170 175 Pro Pro Leu Leu Leu Trp Asp Ala His Val Ala Asp Arg Asp His Leu 180 185 190 Cys Gly Gly Ser Ala His Arg Leu Thr His His Leu Glu Glu Asp Gly 195 200 205 Leu Arg Pro Pro Ala Ala Leu Asp Cys Val Phe Pro Pro 210 215 220 <210> 4 <211> 577 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant ND5 <400> 4 Met Lys Asn Met Ile Cys Leu Ile Ser Phe Phe Phe Leu Phe Leu Phe 1 5 10 15 Ser Leu Met Asn Phe Met Phe Phe Ile Tyr Phe Ile Met Asn Asp Leu 20 25 30 Met Tyr Phe Leu Glu Trp Glu Ile Ile Cys Phe Asn Ser Met Asn Ile 35 40 45 Leu Tyr Ser Val Leu Leu Asp Trp Met Ser Phe Leu Phe Met Met Phe 50 55 60 Val Ser Leu Ile Ser Ser Val Val Ile Tyr Tyr Ser Lys Ser Tyr Met 65 70 75 80 Ser Ser Glu Lys Asn Leu Ile Arg Phe Ile Ile Leu Val Leu Leu Phe 85 90 95 Val Phe Ser Met Met Met Leu Ile Ile Ser Pro Asn Ile Ile Ser Ile 100 105 110 Leu Leu Gly Trp Asp Gly Leu Gly Leu Val Ser Tyr Cys Leu Val Ile 115 120 125 Tyr Tyr Gln Asn Ile Lys Ser Tyr Asn Ala Gly Met Leu Thr Ala Leu 130 135 140 Ser Asn Arg Val Gly Asp Val Phe Ile Leu Ile Val Ile Ser Trp Met 145 150 155 160 Met Asn Tyr Gly Ser Trp Asn Tyr Ile Phe Tyr Leu Asn Phe Met Lys 165 170 175 Asn Asp Phe Ser Met Met Met Val Met Phe Met Ile Ile Ile Ala Ser 180 185 190 Met Thr Lys Ser Ala Gln Ile Pro Phe Ser Ser Trp Leu Pro Ala Ala 195 200 205 Met Ala Ala Pro Thr Pro Val Ser Ala Leu Val His Ser Ser Thr Leu 210 215 220 Val Thr Ala Gly Val Tyr Leu Leu Ile Arg Phe Asn Glu Leu Leu Val 225 230 235 240 Met Ser Ile Phe Phe Lys Ile Leu Leu Ile Leu Ser Gly Leu Thr Met 245 250 255 Phe Met Ala Gly Val Ser Ala Asn Tyr Glu Phe Asp Leu Lys Lys Ile 260 265 270 Ile Ala Leu Ser Thr Leu Ser Gln Leu Gly Leu Met Met Ser Ile Leu 275 280 285 Ser Met Gly Phe Ser Asp Leu Ala Phe Phe His Leu Leu Thr His Ala 290 295 300 Met Phe Lys Ala Leu Leu Phe Met Cys Ala Gly Val Ile Ile His Met 305 310 315 320 Met Val Asp Ile Gln Asp Ile Arg Phe Met Gly Lys Met Ser Asn Phe 325 330 335 Ile Pro Leu Thr Cys Leu Cys Leu Asn Ile Ser 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Lys Ile Tyr Leu 545 550 555 560 Phe Ser Phe Phe Met Trp Met Leu Phe Tyr Leu Ile Ile Phe Met Met 565 570 575 Tyr <210> 5 <211> 621 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant Bax <400> 5 tcacgtgacc cgggcgcgct gcggccgccc gcgcggaccc ggcgagaggc ggcggcggga 60 gcggcggtga tggacgggtc cggggagcag cccagaggcg ggggatgatt gccgccgtgg 120 acacagactc cccccgagag gtctttttcc gagtggcagc tgacatgttt tctgacggca 180 acttcaactg gggccgggtt gtcgcccttt tctactttgc cagcaaactg gtgctcaagg 240 ccctgtgcac caaggtgccg gaactgatca gaaccatcat gggctggaca ttggacttcc 300 tccgggagcg gctgttgggc tggatccaag accagggtgg ttgggacggc ctcctctcct 360 actttgggac gcccacgtgg cagaccgtga ccatctttgt ggcgggagtg ctcaccgcct 420 cactcaccat ctggaagaag atgggctgag gcccccagct gccttggact gtgtttttcc 480 tccataaatt atggcatttt tctgggaggg gtggggattg ggggacgtgg gcatttttct 540 tacttttgta attattgggg ggtgtgggga agagtggtct tgagggggta ataaacctcc 600 ttcgggacac aaaaaaaaaa a 621

Claims (12)

  1. (a) 암전이 억제활성을 나타낼 것으로 예상되는 후보물질을 암세포에 처리하는 단계; 및,
    (b) 상기 암세포에서 Bax(Bcl-2-associated X protein)/complex-I(NADH:ubiquinone oxidoreductase) 복합체의 함량을 측정하는 단계를 포함하는, 암전이 억제제의 스크리닝 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    (a) 단계에서, 상기 암세포는 침윤 또는 전이될 수 있는 폐암, 유방암, 대장암, 위암, 뇌암, 췌장암, 갑상선암, 피부암, 골수암, 림프종, 자궁암 및 자궁경부암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    (b) 단계에서, 상기 복합체의 함량은 면역침전법, GST 융합단백질 침전법 또는 웨스턴블럿 분석법을 통하여 측정하는 것인 방법
  4. 제1항에 있어서,
    (b) 단계에서 측정된 복합체의 함량이, 후보물질이 처리되지 않은 암세포에서 측정된 복합체의 함량보다 높은 수준을 나타낼 경우, 상기 후보물질이 암전이 억제활성을 갖는다고 판정하는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 복합체를 형성하지 못하는 변이된 암세포에 후보물질을 처리하고, 복합체의 함량을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  6. 삭제
  7. 제5항에 있어서,
    상기 변이된 암세포는 C-말단의 4개 잔기가 결실 또는 치환된 변이체 Bax 또는 ND5 서브유닛이 결실 또는 치환된 변이체 complex-I을 발현시켜서 상기 복합체의 형성을 억제하는 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 복합체를 형성하지 못하는 변이된 암세포에 후보물질을 처리하여 측정된 복합체의 함량이 후보물질이 처리되지 않은 암세포에서 측정된 복합체의 함량보다 높은 수준을 나타낼 경우, 상기 후보물질이 위양성 암전이 억제활성을 갖는다고 판정하는 것인 방법.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
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