KR101619337B1 - Method for screening agent against cancer metastasis using C-terminal region of p21 - Google Patents

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Abstract

The present invention relates to a method for screening a cancer metastasis inhibitor and a pharmaceutical composition for inhibiting cancer metastasis. The method for screening comprises a step of treating a candidate material anticipated to inhibit cancer metastasis on a cancer cell, and measuring a content of a composite consisting of p53, p21, Mdm2, and Slug produced through a C-terminal region of p21 in the cancer cell. The pharmaceutical composition comprises polypeptide in a C-terminal region of p53 or p21 involved in producing the composite. When the method for screening a cancer metastasis inhibitor provided according to the present invention is used, a formulation for inhibiting the infiltration of cancer and preemptively preventing cancer metastasis by promoting the decomposition of Slug expressed in a cancer cell, may be produced to be widely utilized in developing a more effective cancer treatment agent.

Description

ｐ21의 Ｃ-말단 영역을 이용한 암전이 억제제의 스크리닝 방법{Method for screening agent against cancer metastasis using C-terminal region of p21}The present invention relates to a method for screening for a cancer metastasis inhibitor using the C-terminal region of p21,

본 발명은 p21의 C-말단 영역을 이용한 암전이 억제제의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 암세포에 암의 전이를 억제할 것으로 예상되는 후보물질을 처리하고, 상기 암세포에서 p21의 C-말단 영역을 통해 형성되는 p53, p21, Mdm2 및 Slug로 구성된 복합체의 함량을 측정하는 단계를 포함하는 암전이 억제제의 스크리닝 방법 및 상기 복합체의 형성에 관여하는 p53 또는 p21의 C-말단 영역의 폴리펩티드를 포함하는 암전이 억제용 약학 조성물에 관한 것이다.
The present invention relates to a method for screening for an anti-cancer agent using the C-terminal region of p21. More specifically, the present invention relates to a method for screening a candidate substance expected to inhibit cancer metastasis to cancer cells, - measuring the content of the complex consisting of p53, p21, Mdm2 and Slug formed through the terminal region of the p53 or p21 polypeptide and the polypeptide of the C-terminal region of p53 or p21 involved in the formation of the complex And to a pharmaceutical composition for suppressing cancer metastasis.

우리나라 암(악성신생물) 사망자 수는 2002년 우리나라 총 사망자 246,515명(조사망률 인구 10만 명당 512명) 가운데 25.5%(남성 사망자의 29.6%, 여성 사망자의 20.5%)인 62,887명으로 암으로 인한 사망(사망률 인구 10만 명당 130.7명)이 사망원인 1위를 차지하고 있다. 암 사망순위는 폐암, 위암, 간암, 대장암 및 췌장암 순으로, 이들 5대 암에 의한 사망이 전체 암 사망의 약 70%를 차지하고 있다. 또한, 남성에 있어 주요 암 사망원인은 폐암, 위암, 간암 및 대장암 등으로 이들 4대 암에 의한 사망자 수(28,147명)가 전체 남성 암 사망자 수(40,177명)의 70%를 차지하고 있으며, 여성에 있어 주요 암 사망원인은 위암, 폐암, 간암, 대장암 및 췌장암 등으로 이들 5대 암에 의한 사망자 수(13,630명)가 전체 여성 암 사망자 수(22,710명)의 60%를 차지하고 있다.The number of cancer deaths in Korea was 62,887, or 25.5% (29.6% of male deaths and 20.5% of female deaths) among 246,515 deaths in Korea (512 deaths per 100,000 population in Korea) Death (130.7 deaths per 100 000 population) is the number one cause of death. Cancer death rankings are lung cancer, stomach cancer, liver cancer, colorectal cancer and pancreatic cancer, and deaths of these five cancer accounts for about 70% of all cancer deaths. The major causes of cancer death in males are lung cancer, stomach cancer, liver cancer, and colon cancer. These deaths from the four major cancers (28,147) account for 70% of all male cancer deaths (40,177) The major causes of cancer deaths are gastric cancer, lung cancer, liver cancer, colon cancer and pancreatic cancer. The death toll from these 5 major cancers (13,630) accounts for 60% of all female cancer deaths (22,710).

이러한 암은 치료후에도 전이 등의 과정을 통해 쉽게 재발할 수 있기 때문에, 이의 치료에 어려움을 겪고 있다. 전이는 악성 종양의 진행에 수반되는 현상으로, 악성 종양 세포가 증식하고 암이 진행함에 따라 전이에 필요한 새로운 유전 형질을 획득한 후 혈관과 림프선으로 침윤하고 혈액과 림프를 따라 순환하다가 다른 조직에 정착한 후 증식하게 된다. 이러한 전이의 작용기작을 규명하기 위하여 활발한 연구가 진행되고 있으며, 이와 관련된 연구결과에 따라, 전이를 예방하려는 연구가 추가로 진행되고 있다.These cancers are difficult to treat because they can easily recur through the process of metastasis after treatment. Metastasis is a phenomenon associated with the progression of malignant tumors. As malignant tumor cells proliferate and cancer progresses, they acquire new genetic traits necessary for metastasis, infiltrate into the blood vessels and lymph nodes, circulate along the blood and lymph, And then proliferate. In order to clarify the mechanisms of these metastases, active research is under way. According to the results of these studies, further studies are being conducted to prevent metastasis.

예를 들어, 한국공개특허 제2014-0049198호에는 hTERT mRNA를 표적하는 리보자임 및 ｐ53 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스를 이용하여 간으로 전이된 암을 치료하는 방법이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2014-0134818호에는 암세포의 전이 또는 침윤에 관여하는 Ei24, p53 및 p21의 발현을 증가시킴으로써 암세포의 항-전이 및 항-침윤 효능을 갖는 엉겅퀴 추출물이 개시되어 있다.For example, Korean Patent Laid-Open Publication No. 2014-0049198 discloses a method of treating cancer metastasized to liver by using recombinant adenovirus comprising a ribozyme and a p53 gene targeting hTERT mRNA, 2014-0134818 discloses a thistle extract having anti-metastasis and anti-infiltration effects of cancer cells by increasing the expression of Ei24, p53 and p21 that are involved in cancer cell metastasis or infiltration.

한편, 암치료 유전자로 알려진 p53은 인간에서 TP53 유전자에 의해 인코딩되는 종양 억제 단백질을 코딩하는 유전자로서, 세포 내 DNA를 손상시키는 신호에 반응하여 다양한 하위 유전자의 발현을 조절함으로써 세포 주기를 조절하고, 세포사멸을 유도함으로써 세포가 악성형질로 전환되지 않도록 보호한다고 알려져 있다. 또 다른 암치료 유전자로 알려진 p21은 사이클린-의존성 키나제(cyclin-dependent kinase)를 억제함으로써 p53과 함께 세포주기를 G1 단계에 멈추게 하여 세포증식을 억제하는 종양 억제 단백질을 코딩하는 유전자로 알려져 있는데, p53 유전자의 활성 증가로 인해 효소단백질이 생성되면 이것이 p21 유전자의 효소생성을 자극한다고 알려져 있어, 암치료 효과에 있어서, p53과 p21이 암치료에 있어서 밀접한 연관성이 있는 것으로 알려져 있다. 현재까지는, 상기 암치료 유전자는 유전자 수준과 단백질 수준에서 서로 다른 기작을 통해 암을 치료하는 효과를 나타낸다고 알려져 있으나, 단백질 수준에서의 항암효과에 대하여는 그의 작용기작이 규명되지 않고 있다. 아울러, 최근의 연구결과에 의하면, 상기 암치료 유전자로 알려진 p53과 p21이 암의 전이를 억제할 수 있다고 보고되었으나, 이와 관련된 작용기작 역시 명확하게 규명되지 않고 있다. 이들 유전자의 암전이 억제기작을 규명할 수 있다면, 이를 이용한 다양한 암전이 억제제의 개발에 활용될 수 있을 것으로 기대되고 있으나, 아직까지는 별다른 연구성과가 보고되지 않고 있는 실정이다.
On the other hand, p53, which is known as a cancer treatment gene, is a gene encoding a tumor suppressor protein encoded by the TP53 gene in humans. It regulates cell cycle by regulating the expression of various sub genes in response to a signal that damages intracellular DNA, It is known to protect cells from being converted into malignant traits by inducing apoptosis. P21, which is known as another cancer treatment gene, is known to be a gene encoding a tumor suppressor protein that inhibits cell proliferation by stopping the cell cycle in the G1 phase together with p53 by inhibiting cyclin-dependent kinase, It is known that when an enzyme protein is generated due to an increase in gene activity, it stimulates enzyme production of p21 gene. Therefore, it is known that p53 and p21 are closely related to cancer treatment in cancer treatment effect. It is known that the cancer treatment gene has the effect of treating cancer through different mechanisms at gene level and protein level, but its action mechanism at the protein level has not been elucidated. In addition, according to recent research results, it has been reported that p53 and p21, which are known as the cancer therapeutic genes, can inhibit metastasis of cancer, but the mechanism of action thereof has not been clearly clarified. Although it is expected that the inhibition mechanism of these genes may be used to develop various inhibitors of cancer metastasis using these genes, there have been no reports of research results.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 암치료 유전자로 알려진 p53 및 p21의 암전이 억제기작을 규명하고, 이를 응용하여 다양한 암전이 억제제를 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 상기 p53과 p21 유전자로부터 발현된 각 단백질이 암의 전이를 촉진하는 역할을 수행하는 것으로 알려진 Slug 단백질과 결합하여 복합체를 형성한 다음, 상기 Slug 단백질을 분해함을 규명하였는 바, 암의 전이를 억제할 수 있다고 예상되는 후보물질을 처리한 다음, 상기 복합체의 형성여부를 확인할 경우, 상기 후보물질이 암전이 억제제로서 사용될 수 있는지를 구별할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
Under these circumstances, the inventors of the present invention have made efforts to develop various inhibitors of cancer metastasis by identifying p53 and p21, which are known as cancer treatment genes, The present inventors have found that a compound capable of inhibiting cancer metastasis is formed by binding to a Slug protein which is known to play a role in promoting cancer metastasis, , Confirming that the candidate substance can be used as an inhibitor of cancer metastasis when confirming the formation of the complex, and completed the present invention.

본 발명의 하나의 목적은 암전이 억제효과를 나타낼 것으로 예상되는 후보물질을 암세포에 처리하고, 상기 암세포에서 p53 및 p21을 포함하는 복합체의 형성여부를 확인하는 단계를 포함하는 암전이 억제제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.One object of the present invention is to provide a method for screening a cancer metastasis inhibitor comprising treating cancer cells with a candidate substance expected to exhibit an inhibitory effect on cancer metastasis and confirming whether or not a complex comprising p53 and p21 is formed in the cancer cell .

본 발명의 다른 목적은 상기 복합체의 형성에 관여하는 p53 또는 p21의 C-말단 영역의 폴리펩티드를 포함하는 암전이 억제용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for suppressing cancer metastasis comprising a polypeptide of the C-terminal region of p53 or p21 involved in the formation of the complex.

본 발명자들은 암치료 유전자로 알려진 p53과 p21의 암전이 억제효과를 규명하고자, 다양한 연구를 수행하던 중, 암의 전이를 촉진하는 역할을 수행하는 것으로 알려진 Slug 단백질에 주목하게 되었다. 상기 Slug 단백질은 암세포의 침윤과 혈류침투를 촉진하여, 암세포의 전이를 유발하는 원인 단백질 중의 하나로서, 암세포에 방사선 등을 조사하여 암을 치료하고자 할 경우, 상기 Slug 단백질은 Mdm2 의존적으로 프로테아좀을 통하여 세포내에서 분해될 수 있다고 알려져 있으나, 구체적으로 어떠한 과정에 의하여 상기 Slug의 분해가 유발되는지에 대하여는 알려져 있지 않다. 다만, 다양한 연구를 통하여, p53 단백질이 상기 Slug와 결합할 수 있음이 보고되었다. 본 발명자들은 상기 Slug의 Mdm2 의존적 분해에 p53과 p21이 관여할 가능성이 있다고 가정하고, p53이 발현되는 폐암세포와 발현되지 않는 폐암세포를 대상으로 상기 각 성분의 발현수준을 비교하였다. 그 결과, 폐암세포의 침윤 뿐만 아니라 이를 유발하는 Slug의 세포내 분해를 촉진하기 위하여는, p53과 p21이 모두 필요함을 확인하였다. 특히, 지금까지 p21은 Slug와의 연관성이 전혀 보고되지 않았으나, 본 발명자들은 상기 p21이 p53 및 Mdn2와 함께 Slug와 결합하여 복합체를 형성하고, 상기 복합체에 포함된 Slug의 유비퀴틴화를 유발시키며, 이에 따라 상기 Slug가 프로데아좀을 통해 분해되는 것을 촉발시킬 수 있음을 규명하여, 이와 같은 작용기작을 암전이 억제제 스크리닝 방법에 적용할 수 있음을 최초로 규명하였다. 특히, 특정 변이체를 이용할 경우, 복합체가 형성되지 않으므로, 위양성 억제제를 효과적으로 제거할 수 있음을 확인하였다. 또한, 상기 p21의 C-말단은 p53 및 Slug와 결합할 수 있는 결합부위를 포함하므로, 상기 p21의 C-말단을 포함하는 폴리펩티드는 암전이를 유발하는 원인 중의 하나인 Slug의 분해를 촉진시켜서, 암전이를 억제할 수 있는 제제로서 사용될 수 있을 것으로 분석되었다.The present inventors have focused on Slug protein, which is known to play a role in promoting cancer metastasis, while carrying out various studies to investigate the inhibitory effect of p53 and p21, which are known as cancer treatment genes, in cancer metastasis. The Slug protein is one of the causative proteins that induce cancer cell infiltration and blood flow penetration and induces metastasis of cancer cells. When the cancer is treated by irradiating cancer cells with radiation, the Slug protein is Mdm2- , It is known that the degradation of the slug is caused by a specific process. However, through various studies, it has been reported that the p53 protein can bind to the Slug. The present inventors compared the expression levels of the above components with those of p53-expressing lung cancer cells and non-expressing lung cancer cells, assuming that p53 and p21 are involved in the Mdm2-dependent degradation of the above-mentioned slug. As a result, it was confirmed that both p53 and p21 are required to promote not only the invasion of lung cancer cells but also the intracellular degradation of the slug that induces them. In particular, although p21 has never been reported to be associated with a slug, the present inventors have found that the p21 binds with p53 and Mdn2 to form a complex to cause ubiquitination of the slug contained in the complex, The inventors of the present invention have confirmed that the above-mentioned action of the Slug can be triggered by degradation through the prodecrosomes, and it was firstly confirmed that such a mechanism can be applied to the method of screening for inhibitors of cancer metastasis. In particular, it has been confirmed that when a specific mutant is used, a complex can not be formed, and therefore the false positive inhibitor can be effectively removed. In addition, since the C-terminal of p21 contains a binding site capable of binding p53 and Slug, the polypeptide comprising the C-terminal of p21 promotes the degradation of Slug, which is one of the causes of cancer metastasis, It could be used as a preparation capable of inhibiting cancer metastasis.

이같은, 암전이 과정에서의 p53 및 p21의 효과는 지금까지 전혀 보고되지 않았고, 본 발명자에 의하여 최초로 규명되었다.
Such effects of p53 and p21 in the process of metastasis have not been reported so far and were first identified by the present inventors.

상술한 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 암전이 억제제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
In one embodiment for achieving the above-mentioned object, the present invention provides a method for screening for a cancer metastasis inhibitor.

본 발명에서 제공하는 암전이 억제제의 스크리닝 방법은 (a) 암전이 억제활성을 나타낼 것으로 예상되는 후보물질을 암세포에 처리하는 단계; 및, (b) 상기 암세포에서 Slug, p53, p21 및 Mdm2로 구성된 복합체의 함량을 측정하는 단계를 포함한다.
The present invention provides a method for screening for a cancer metastasis inhibitor comprising the steps of: (a) treating cancer cells with a candidate substance expected to exhibit a cancer metastasis inhibitory activity; And (b) measuring the content of the complex consisting of Slug, p53, p21 and Mdm2 in said cancer cells.

상기 방법에 있어서, 사용되는 암세포는 Slug를 발현시켜서, 침윤 또는 전이될 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서 Slug를 발현시켜서, 침윤 또는 전이될 수 있는 폐암, 유방암, 대장암, 위암, 뇌암, 췌장암, 갑상선암, 피부암, 골수암, 림프종, 자궁암, 자궁경부암 등의 암으로부터 유래된 세포가 될 수 있고, 다른 예로서 Slug, p53, p21 및 Mdm2가 발현될 수 있는 폐암, 유방암, 대장암, 위암, 뇌암, 췌장암, 갑상선암, 피부암, 골수암, 림프종, 자궁암, 자궁경부암 등의 암으로부터 유래된 세포가 될 수 있으며, 또 다른 예로서 Slug, p53, p21 및 Mdm2가 발현될 수 있는 폐암세포인 H460 세포, Slug, p21 및 Mdm2가 발현될 수 있는 폐암세포인 H1299 세포가 될 수 있다.
In the above method, the cancer cells to be used are not particularly limited as long as they can express the slug and can infiltrate or metastasize. Examples of the cancer agent include, but are not limited to, lung cancer, breast cancer, colon cancer, gastric cancer Pancreatic cancer, thyroid cancer, skin cancer, bone marrow cancer, lymphoma, uterine cancer, cervical cancer, and the like. Examples of such cells include lung cancer, breast cancer and colon cancer in which Slug, p53, p21 and Mdm2 can be expressed Pancreatic cancer, pancreatic cancer, thyroid cancer, skin cancer, bone marrow cancer, lymphoma, uterine cancer, uterine cervical cancer and the like. In another example, the cells may be Slug, p53, p21 and Mdm2, H460 cells, Slug, p21 and Hd99 cells, which are lung cancer cells in which Mdm2 can be expressed.

상기 방법에 있어서, Slug, p53, p21 및 Mdm2로 구성된 복합체의 함량을 측정하는 방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서 면역침전법, GST 융합단백질 침전법, 웨스턴블럿 분석법 등의 다양한 면역학적 방법을 사용할 수 있다.
In the above method, the method for measuring the content of the complex composed of Slug, p53, p21 and Mdm2 is not particularly limited, but examples include various immunological methods such as immunoprecipitation, GST fusion protein precipitation and Western blot analysis Can be used.

본 발명의 용어 "Slug"란, SNAI2 라고도 호칭되는 아연결합단백질(zinc finger protein) 또는 이를 코딩하는 유전자를 의미한다. 상기 Slug는 유방암에서 E-box 모티프와 결합하여 E-cadherin의 활성을 억제한다고 알려져 있다. 상기 유전자의 구체적인 염기서열 및 단백질 정보는 NCBI에 공지되어 있다(GenBank: NM_003068, NP_003059 등).The term "Slug " of the present invention means a zinc finger protein, also called SNAI2, or a gene encoding the zinc finger protein. It is known that Slug inhibits the activity of E-cadherin in combination with E-box motif in breast cancer. The specific base sequence and protein information of the gene are known from NCBI (GenBank: NM003068, NP003059, etc.).

본 발명에 있어서, 상기 Slug는 암세포에서 침윤을 유도하는 원인 물질중의 하나로서, 목적하는 후보물질이 암전이 억제활성을 나타내는지의 여부를 확인하기 위한 수단으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서는, 상기 Slug로서 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 사용하였다.
In the present invention, the slug is one of the causative substances inducing invasion in cancer cells, and can be used as a means for confirming whether a desired candidate substance exhibits an anti-metastatic activity. For example, in the present invention, a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 was used as the Slug.

본 발명의 용어 "p53"이란, SDS-PAGE 상에서 53kDa의 크기를 나타내는 암억제 단백질로서 사람에서는 TP53 유전자에 의하여 코딩된다고 알려져 있다. 상기 p53은 다세포 생물에서 세포주기를 정지시키고, 암의 발생을 억제하며 게놈 유전자의 안정성을 향상시킨다고 알려져 있고, 단백질의 경우 대량의 프롤린잔기를 포함한다. 상기 유전자의 구체적인 염기서열 및 단백질 정보는 NCBI에 공지되어 있다(GenBank: NM_000546, NP_000537 등).The term "p53" of the present invention is a cancer-inhibiting protein exhibiting a size of 53 kDa on SDS-PAGE and is known to be encoded by the TP53 gene in humans. The p53 is known to stop the cell cycle in multicellular organisms, inhibit the development of cancer and improve the stability of genomic genes, and proteins contain a large amount of proline residues. The specific base sequence and protein information of the gene are known from NCBI (GenBank: NM_000546, NP_000537, etc.).

본 발명에 있어서, 상기 p53은 상기 Slug의 분해를 유도하여 암세포의 전이를 억제하는 단백질로서, 상기 Slug와 복합체를 형성하여 목적하는 후보물질이 암전이 억제활성을 나타내는지의 여부를 확인하기 위한 수단으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서는, 상기 p53으로서 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 사용하였다.
In the present invention, the p53 is a protein which inhibits metastasis of cancer cells by inducing degradation of the slug, and is a means for confirming whether a desired candidate substance exhibits an anti-metastatic activity by forming a complex with the slug Can be used. For example, in the present invention, a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 was used as the p53.

본 발명의 용어 "p21"이란, "cyclin-dependent kinase ingibitor 1" 또는 "Cip 1(CDK-interacting protein 1)"이라고도 호칭되는 암억제 단백질을 의미하는데, 사람의 경우에는 CDKN1A 유전자에 의하여 코딩된다고 알려져 있다. 상기 p21은 p53의 하류에서 발현되고, p53과 유사하게 다세포 생물에서 세포주기를 정지시키고, 암의 발생을 억제한다고 알려져 있다. 상기 유전자의 구체적인 염기서열 및 단백질 정보는 NCBI에 공지되어 있다(GenBank: NM_000389, NP_000380 등).The term "p21 " of the present invention means a cancer-suppressing protein also called" cyclin-dependent kinase ingibitor 1 "or" Cip 1 (CDK-interacting protein 1) ". It is known to be coded by the CDKN1A gene in humans have. The p21 is expressed downstream of p53 and is known to stop the cell cycle in multicellular organisms similarly to p53 and to inhibit the development of cancer. Specific nucleotide sequences and protein information of the gene are known from NCBI (GenBank: NM_000389, NP_000380, etc.).

본 발명에 있어서, 상기 p21은 상기 Slug의 분해를 유도하여 암세포의 전이를 억제하는 단백질로서, 상기 Slug 및 p53과 복합체를 형성하여 목적하는 후보물질이 암전이 억제활성을 나타내는지의 여부를 확인하기 위한 수단으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서는, 상기 p21로서 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 사용하였다.
In the present invention, p21 is a protein that inhibits metastasis of cancer cells by inducing the degradation of the slug. In order to confirm whether or not a desired candidate substance exhibits an anti-metastatic activity by forming a complex with Slug and p53 Can be used as a means. For example, in the present invention, a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 was used as p21.

본 발명의 용어 "Mdm2(Mouse double minute 2 homolog)"란, "E3 ubiquitin-protein ligase Mdm2"라고도 호칭되고, 상기 p53의 음성조절자로서 알려진 단백질을 의미한다. 상기 Mdm2는 p53의 TAD(N-terminal trans-activation domain)를 인식하는 E3 ubiquitin ligase로서의 역할을 수행한다고 알려져 있다. 상기 유전자의 구체적인 염기서열 및 단백질 정보는 NCBI에 공지되어 있다(GenBank: NM_001145336, NP_001138809 등).The term "Mdm2 (mouse double minute 2 homolog) " of the present invention refers to a protein also known as " E3 ubiquitin-protein ligase Mdm2 " It is known that Mdm2 acts as an E3 ubiquitin ligase that recognizes the N-terminal trans-activation domain (TAD) of p53. The specific base sequence and protein information of the gene are known from NCBI (GenBank: NM_001145336, NP_001138809, etc.).

본 발명에 있어서, 상기 Mdm2는 상기 Slug의 분해를 유도하여 암세포의 전이를 억제하는 단백질로서, 상기 Slug, p53 및 p21과 복합체를 형성하여 목적하는 후보물질이 암전이 억제활성을 나타내는지의 여부를 확인하기 위한 수단으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서는, 상기 Mdm2로서 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 사용하였다.
In the present invention, the Mdm2 protein is a protein that inhibits metastasis of cancer cells by inducing degradation of the slug, and forms a complex with Slug, p53 and p21 to determine whether the desired candidate substance exhibits an anti- As shown in FIG. For example, in the present invention, a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 was used as Mdm2.

상기 방법에 있어서, 상기 복합체의 함량을 보다 효과적으로 측정하기 위하여, 상기 (a) 단계가 종료된 암세포에 프로테아좀 억제제를 처리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 복합체는 암세포내에서 유비퀴틴과 결합한 다음, 프로테아좀에 의하여 분해되기 때문에, 상기 후보물질이 Slug의 분해를 촉진하는 활성을 나타낼 경우, 암세포내에서 상기 복합체가 낮은 수준으로 나타나므로, 정확한 수준을 검출하기가 어려울 수 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여, 상기 후보물질을 처리한 암세포에 프로테아좀 억제제를 처리하면, 복합체를 형성한 후에 분해되지 않으므로, 보다 효과적으로 복합체의 함량을 측정할 수 있다. 이때, 사용되는 프로테아좀 억제제는 특별히 제한되지 않고 통상적으로 사용되는 프로테아좀 억제제를 모두 사용할 수 있으나, 일 예로서 MG132(N-(benzyloxycarbonyl)leucinylleucinylleucinal Z-Leu-Leu-Leu-al)를 사용할 수 있다.
In the above method, in order to more effectively measure the content of the complex, the step (a) may further comprise the step of treating the cancer cell with the proteasome inhibitor. Since the complex binds to ubiquitin in cancer cells and is then degraded by proteasome, when the candidate substance exhibits an activity of promoting the degradation of slug, the complex appears in a low level in cancer cells, It may be difficult to detect. In order to solve this problem, when the cancer cell treated with the candidate substance is treated with the proteasome inhibitor, it is not decomposed after forming the complex, so that the content of the complex can be more effectively measured. In this case, the proteasome inhibitor to be used is not particularly limited and any commonly used proteasome inhibitor may be used. For example, MG132 (N- (benzyloxycarbonyl) leucinylleucinylleucinal Z-Leu-Leu-Leu-al) .

상기 방법에 의하여 측정된 복합체의 함량은 상기 후보물질을 처리하지 않은 암세포(대조군)에서 측정된 복합체의 함량과 비교하여, 상기 후보물질이 복합체 형성을 촉진하는지의 여부를 확인하게 되는데, 대체로 대조군에서 측정된 함량보다 높은 수준을 나타낼 경우에는 상기 후보물질이 Slug의 분해를 촉진하여 암전이를 억제하는 활성을 갖는다고 판단할 수 있다. 다만, 상기 후보물질이 비특이적으로 복합체의 형성을 촉진할 수 있는데(위양성), 이경우에는 상기 후보물질이 암전이를 억제하는 활성을 나타내는지의 여부를 명확하게 판단할 수 없다는 단점이 있다.The content of the complex measured by the above method is compared with the content of the complex measured in the cancer cells not treated with the candidate substance (control group) to confirm whether or not the candidate substance promotes complex formation. In general, When the level is higher than the measured content, it can be judged that the candidate substance promotes the degradation of the slug and has the activity of inhibiting the metastasis. However, it is disadvantageous that the candidate substance can nonspecifically promote the formation of the complex (false positives), in which case it is not possible to clearly determine whether the candidate substance exhibits the activity of suppressing cancer metastasis.

따라서, 상기 단점을 극복하기 위하여는, 상기 복합체를 형성하는 Slug, p53, p21 또는 Mdm2의 변이체를 발현시켜서 정상상태에서도 Slug와 복합체를 형성하지 못하는 변이된 암세포에 상기 후보물질을 처리하고, 이로부터 상기 복합체의 함량을 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 즉, 정상적으로 상기 복합체를 형성하는 세포에서 복합체의 함량을 증가시키는 것으로 확인된 후보물질이 상기 변이된 암세포에서도 복합체를 형성하게 한다면, 상기 후보물질은 비특이적으로 상기 복합체의 형성을 촉진시킨다고 판단할 수 있다. 이때, 사용될 수 있는 Slug, p53, p21 또는 Mdm2의 변이체는 상기 복합체의 형성을 억제하는 한 특별히 제한되지 않으나, 일 예로서, 상기 복합체 형성에 중요한 역할을 수행하는 N-말단이 결실된 변이체 Slug, C-말단이 결실된 변이체 p53, C-말단이 결실된 변이체 p21 등이 될 수 있고, 다른 예로서 상기 복합체 형성에 중요한 역할을 수행하는 153번 또는 160번 세린이 결실되거나 또는 아스파르트산 등의 다른 아미노산으로 치환된 형태의 변이체 p21이 될 수 있다.
Therefore, in order to overcome the above disadvantages, the candidate substance is treated with mutated cancer cells which do not form a complex with Slug under normal conditions by expressing mutants of Slug, p53, p21 or Mdm2 forming the complex, And measuring the content of the complex. That is, if the candidate substance normally found to increase the content of the complex in the cells forming the complex forms a complex in the mutated cancer cells, it can be judged that the candidate substance nonspecifically promotes the formation of the complex . In this case, mutants of Slug, p53, p21 or Mdm2 that can be used are not particularly limited as long as they inhibit the formation of the complex. For example, mutants Slug in which the N-terminal is deleted, The mutant p53 in which the C-terminal is deleted, the mutant p21 in which the C-terminal has been deleted, and the like. As another example, the serine 153 or 160 which plays an important role in the complex formation may be deleted, or the aspartate It may be a mutant p21 in a form substituted with an amino acid.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 폐암세포(H460 또는 H1299)의 침윤을 억제하기 위하여는 p53과 p21이 모두 필요하고(도 1a 및 1b), 암세포 침윤에 관여하는 Slug의 발현을 억제하기 위하여는, p53과 p21이 모두 필요하며(도 1c 및 1d), p53 및 p21에 의한 Slug의 발현억제는, Mdm2-의존적으로 프로테아좀에 의하여 Slug가 분해됨에 따라 나타나고(도 2a 및 2b), Slug 단백질의 p53/Mdm2-의존성 유비퀴틴화에 p21이 필수적임(도 2c 및 2d)을 확인하였다. 또한, p21의 면역침전시에 p53, Slug 및 Mdm2도 함께 침전되고(도 3a), Slug의 N-말단이 p21과의 결합에 사용되며(도 3b), p53의 C-말단이 p21과의 결합에 사용되고(도 3c), p21의 C-말단이 Slug 또는 p53과의 결합에 사용(도 3d 및 3e)됨을 확인하였다. 특히, p21의 결합부위를 분석한 결과, p21의 153번 세린잔기는 p53과의 결합에 관여하고, 160번 세린잔기는 Slug와의 결합에 관여하며, 각 세린잔기의 인산화는 Slug 또는 p53과의 결합을 억제할 수 있고(도 3f 및 3g), 이에 따라, p21은 Slug 및 p53과 동시에 결합할 수 있음(도 3h)을 확인하였다. 다음으로, p21가 Slug 또는 p53에 결합하지 못하면, Slug의 분해를 유도하지 못하여, 결과적으로는 암세포의 침윤을 억제할 수 없고(도 4a), p53 및 p21은 생체내에서도 종양의 침윤을 억제하는 효과를 나타내며(도 4b 및 4c), p53, p21 또는 Mdm2의 발현이 억제된 폐암세포에는 방사선을 조사하여도 Slug가 분해되지 않고(도 4d), Slug 분해에 관여하는 p53이 유전자 수준이 아닌 단백질 수준에서 관여함(도 4e 및 4f)을 확인하였다.
According to one embodiment of the present invention, both p53 and p21 are required in order to inhibit invasion of lung cancer cells (H460 or H1299) (Figs. 1A and 1B), and to suppress the expression of slug involved in cancer cell infiltration , p53 and p21 are both required (Fig. 1c and 1d), and the inhibition of the expression of Slug by p53 and p21 is accompanied by the degradation of Slug by Mdm2-dependent proteasome (Figs. 2a and 2b) P21 is essential for the p53 / Mdm2-dependent ubiquitination of p53 (FIGS. 2c and 2d). In addition, p53, Slug and Mdm2 are also precipitated at the time of immunoprecipitation of p21 (Fig. 3a), and the N-terminal of Slug is used for binding to p21 (Fig. 3b), and the C- (Fig. 3C), and it was confirmed that the C-terminal of p21 was used for binding to Slug or p53 (Figs. 3D and 3E). Particularly, as a result of analyzing the binding site of p21, it was found that the serine residue at 153 of p21 is involved in binding to p53, the serine residue at 160 is involved in binding to Slug, and the phosphorylation of each serine residue is binding to Slug or p53 (Fig. 3f and 3g), confirming that p21 can bind simultaneously with Slug and p53 (Fig. 3h). Next, if p21 fails to bind to Slug or p53, it can not induce degradation of the slug, resulting in inhibition of cancer cell infiltration (Fig. 4A), and p53 and p21 inhibit tumor invasion in vivo (Fig. 4B and 4C). In the lung cancer cells in which the expression of p53, p21 or Mdm2 was inhibited, the slug was not degraded even when irradiated with radiation (Fig. 4D) (Figs. 4E and 4F).

따라서, p53과 p21은 Mdm2와 함께 Slug에 결합하여 복합체를 형성할 수 있고, 상기 복합체는 Slug의 유비퀴틴화를 촉진하며, 유비퀴틴화된 Slug는 프로테아좀에 의하여 분해됨으로써, 암세포의 침윤을 억제할 수 있음(도 5)을 알 수 있었다.
Thus, p53 and p21 can bind to Slug together with Mdm2 to form a complex, which promotes ubiquitination of Slug, and ubiquitinated Slug is degraded by proteasome to inhibit the invasion of cancer cells (FIG. 5).

상술한 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 복합체의 형성에 관여하는 p53의 C-말단 영역의 폴리펩티드 또는 p21의 C-말단 영역의 폴리펩티드를 각각 개별적으로 또는 조합하여 포함하는 암전이 억제용 약학 조성물을 제공한다.
In another embodiment for achieving the above-mentioned object, the present invention provides a cancer vaccine comprising a polypeptide in the C-terminal region of p53 or a polypeptide in the C-terminal region of p21, which are involved in the formation of the complex, Or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

상술한 바와 같이, Slug, p53, p21 및 Mdm2로 구성된 복합체를 구성함에 있어서, p53과 p21의 C-말단은 상기 복합체를 구성하는 다른 구성요소와 결합할 수 있는 부위이기 때문에, p53과 p21의 전체 단백질을 사용하지 않고, 상기 결합부위를 포함하는 폴리펩타이드 단편만을 사용하여도 Slug와 상기 복합체를 구성하여 Slug의 유비퀴틴화 및 분해를 촉진시킬 수 있다. 특히, p53 또는 p21의 C-말단 영역의 폴리펩티드는 전체 단백질에 비하여 적은 분자량을 갖기 때문에, 암세포의 세포막을 투과할 수 있는 가능성이 높다는 장점이 있다.As described above, in constructing a complex composed of Slug, p53, p21 and Mdm2, since the C-terminal of p53 and p21 is a site capable of binding with other constituent elements composing the complex, Even if only a polypeptide fragment containing the binding site is used without using a protein, the slug and the complex can be constituted to promote ubiquitination and degradation of the slug. In particular, since the polypeptide of the C-terminal region of p53 or p21 has a smaller molecular weight than that of the whole protein, there is an advantage that it is highly likely to penetrate the cell membrane of cancer cells.

이때, 상기 p53 또는 p21의 C-말단 영역의 폴리펩티드는 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서 p53의 C-말단측 37 내지 101개의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 p21의 C-말단측 12 내지 25개의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드가 될 수 있고, 다른 예로서 p53의 C-말단측 37개의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 p21의 C-말단측 12개의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드가 될 수 있으며, 또 다른 예로서 p21의 153번 내지 160번 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드가 될 수 있다.In this case, the polypeptide of the C-terminal region of p53 or p21 is not particularly limited. However, for example, a peptide comprising 37 to 101 amino acid sequences on the C-terminal side of p53 or a peptide comprising 12 to 25 C- A peptide comprising the amino acid sequence of the C-terminal side of p53 or a peptide containing the amino acid sequence of the C-terminal side of p21 or a peptide containing the amino acid sequence of the C-terminal side of p21 as another example, For example, a peptide comprising the amino acid sequence 153 to 160 of p21.

본 발명자들은 p21의 153번 및 160번 아미노산 위치가 복합체 형성에 관여하는 주요부위임을 최초로 규명하였다.
We first identified that amino acid positions 153 and 160 of p21 are the major sites involved in complex formation.

본 발명의 암전이 억제용 약학 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명에서, 상기 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물과 이의 분획물들에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
The pharmaceutical composition for suppressing cancer metastasis of the present invention may further comprise an appropriate carrier, excipient or diluent conventionally used in the production of a pharmaceutical composition. Specifically, the pharmaceutical composition may be formulated in the form of oral, granule, tablet, capsule, suspension, emulsion, syrup, aerosol or the like oral preparation, external preparation, suppository and sterilized injection solution according to a conventional method Can be used. In the present invention, the carrier, excipient and diluent which may be contained in the pharmaceutical composition include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate , Calcium silicate, cellulose, methylcellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil. In the case of formulation, a diluent or excipient such as a filler, an extender, a binder, a wetting agent, a disintegrant, or a surfactant is usually used. Solid formulations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules and the like, which may contain at least one excipient such as starch, calcium carbonate, Sucrose, lactose, gelatin and the like. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc are also used. Liquid preparations for oral use may include various excipients such as wetting agents, sweetening agents, fragrances, preservatives, etc. in addition to water and liquid paraffin, which are simple diluents commonly used in suspension, liquid solutions, emulsions and syrups have. Formulations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories. Examples of the suspending agent include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like. Examples of the suppository base include witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin, glycerogelatin and the like.

본 발명의 약학적 조성물에 포함된 상기 p53 또는 p21의 C-말단 영역의 폴리펩티드의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 최종 조성물 총중량을 기준으로 0.0001 내지 50 중량%, 다른 예로서 0.01 내지 20 중량%의 함량으로 포함될 수 있다.
The content of the polypeptide of the C-terminal region of p53 or p21 contained in the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited, but is preferably 0.0001 to 50% by weight, more preferably 0.01 to 20% by weight, based on the total weight of the final composition .

상기 본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
The pharmaceutical composition of the present invention can be administered in a pharmaceutically effective amount. The term "pharmaceutically effective amount " of the present invention means a therapeutic or prophylactic treatment of a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment or prevention. And the effective dose level refers to the amount of the effective amount of the composition of the present invention, and the effective dose level is determined depending on the severity of the disease, the activity of the drug, the age, weight, health, sex, sensitivity of the patient to the drug, The duration of the treatment, the factors including the drugs used in combination or concurrently with the composition of the present invention used, and other factors well known in the medical field. The pharmaceutical composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with another therapeutic agent, and may be administered sequentially or simultaneously with a conventional therapeutic agent. And can be administered singly or multiply. It is important to take into account all of the above factors and administer an amount that will achieve the maximum effect in the least amount without side effects.

본 발명의 약학조성물의 투여량은 예를 들어, 본 발명의 약학적 조성물을 사람을 포함하는 포유동물에 하루 동안 1 내지 20 ㎎/㎏, 다른 예로서 1 내지 10 ㎎/㎏으로 투여할 수 있고, 본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다.
The dosage of the pharmaceutical composition of the present invention can be administered, for example, by administering the pharmaceutical composition of the present invention to a mammal, including a human, for 1 to 20 mg / kg, for example 1 to 10 mg / kg per day , The frequency of administration of the composition of the present invention is not particularly limited, but it may be administered once a day or divided into several doses.

상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 약제학적으로 유효한 양으로 암의 전이가 발생할 가능성이 있거나 또는 발생된 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 전이를 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
In yet another embodiment for accomplishing the above object, the present invention provides a method for preventing the metastasis of cancer comprising the step of administering the pharmaceutical composition to a subject in a pharmaceutically effective amount, Or < / RTI >

상술한 바와 같이, 본 발명에서 제공하는 상기 펩타이드는 암세포 내에서 암세포의 침윤 또는 전이를 유발할 수 있는 Slug를 분해할 수 있으므로, 상기 펩타이드를 포함하는 조성물은 암의 전이를 예방 또는 치료하는데 사용될 수 있다.
As described above, since the peptide provided in the present invention can degrade a slug capable of causing invasion or metastasis of cancer cells in cancer cells, the composition comprising the peptide can be used to prevent or treat cancer metastasis .

본 발명에서 용어 "개체"란 암의 전이가 발생될 가능성이 있거나 또는 발생된 쥐, 가축, 인간 등을 포함하는 포유동물을 제한 없이 포함한다.The term "individual" as used herein includes, without limitation, mammals, including, but not limited to, rats, cattle,

본 발명의 암의 전이를 예방 또는 치료하는 방법에 있어서, 상기 약학적 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여도 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 목적하는 바에 따라 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있다. 다만, 경구 투여시에는 위산에 의하여 상기 펩타이드가 변성될 수 있기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
In the method of preventing or treating cancer metastasis of the present invention, the administration route of the pharmaceutical composition may be administered through any conventional route as long as it can reach the target tissue. The pharmaceutical composition of the present invention may be administered intraperitoneally, intravenously, intramuscularly, subcutaneously, intradermally, orally, intranasally, intracorporally, rectally, as desired, though not particularly limited thereto . However, since the peptide may be denatured by gastric acid when orally administered, the oral composition should be formulated so as to be coated with an active agent or protected from decomposition at the top. In addition, the composition may be administered by any device capable of transferring the active agent to the target cell.

본 발명에서 제공하는 암 전이 억제제의 스크리닝 방법을 이용하면, 암세포에서 발현되는 Slug의 분해를 촉진시켜서, 암의 침윤을 억제함으로써, 암의 전이를 사전에 방지할 수 있는 제제를 발굴할 수 있으므로, 보다 효과적인 암치료제의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.
By using the screening method of the cancer metastasis inhibitor provided by the present invention, it is possible to find a preparation that can prevent the cancer metastasis by promoting the degradation of the slug expressed in the cancer cells and suppressing the invasion of the cancer, It can be widely used for the development of more effective cancer therapeutic agents.

도 1a는 폐암세포(H460)에서 p53 및 p21의 발현여부에 따른 폐암세포의 침윤성 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 1b는 폐암세포(H1299)에서 p53 및 p21의 발현여부에 따른 폐암세포의 침윤성 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 1c는 폐암세포(H460)에서 p53 및 p21의 발현억제에 따른 Slug의 발현수준을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다.
도 1d는 폐암세포(H1299) 및 p53이 발현되는 폐암세포(H1299-p53)에서 p21의 발현수준 변화에 따른 Slug의 발현수준의 변화를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다.
도 2a는 야생형 p53을 발현시키는 폐암세포(H460)와 p53을 발현시키지 않는 폐암세포(H1299)에서 해독억제제인 사이클로헥시미드의 처리시간 및 p21의 발현에 따른 Slug의 발현수준 변화를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다.
도 2b는 외인성 p53이 도입된 폐암세포(H1299-p53)에서 Mdm2의 발현억제 또는 프로테아좀 억제제(MG132)의 처리에 따른 Slug의 발현수준 변화를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다.
도 2c는 p53이 발현되는 암세포에서 p21의 과발현 여부에 따른 Slug의 유비퀴틴화 수준을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다.
도 2d는 p53이 발현되는 암세포에서 p21의 과발현 또는 발현억제에 따른 Slug의 유비퀴틴화 수준을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다.
도 3a는 프로테아좀을 통한 Slug의 분해가 억제된 조건하에서 p21의 면역침전물을 대상으로 웨스턴블럿 분석을 수행한 결과를 나타내는 사진이다.
도 3b는 다양한 형태의 Slug와 p21의 결합여부를 분석한 결과를 나타내는 자기방사법 분석결과를 나타내는 사진으로서, 우측의 측정값은 GST-p21을 처리하여 나타나는 측정값을 정량한 결과를 나타낸다.
도 3c는 다양한 형태의 p53과 p21의 결합여부를 분석한 결과를 나타내는 자기방사법 분석결과를 나타내는 사진으로서, 우측의 측정값은 GST-p21을 처리하여 나타나는 측정값을 정량한 결과를 나타낸다.
도 3d는 다양한 형태의 p21과, Slug의 결합여부를 분석한 결과를 나타내는 자기방사법 분석결과를 나타내는 사진으로서, 우측의 측정값은 GST-Slug 또는 GST-p53을 처리하여 나타나는 측정값을 정량한 결과를 나타낸다.
도 3e는 다양한 형태의 p21과, p53의 결합여부를 분석한 결과를 나타내는 자기방사법 분석결과를 나타내는 사진으로서, 우측의 측정값은 GST-Slug 또는 GST-p53을 처리하여 나타나는 측정값을 정량한 결과를 나타낸다.
도 3f는 각각의 변이체 p21(S153A, S153D, S160A 또는 S160D)과, p53의 결합여부를 분석한 결과를 나타내는 자기방사법 분석결과를 나타내는 사진으로서, 우측의 그래프는 GST-Slug 또는 GST-p53을 처리하여 나타나는 측정값을 정량분석한 결과를 나타낸다.
도 3g는 각각의 변이체 p21(S153A, S153D, S160A 또는 S160D)과, Slug의 결합여부를 분석한 결과를 나타내는 자기방사법 분석결과를 나타내는 사진으로서, 우측의 그래프는 GST-Slug 또는 GST-p53을 처리하여 나타나는 측정값을 정량분석한 결과를 나타낸다.
도 3h는 GST-p53을 사용하여 수득한 침전물의 단백질을 대상으로 다시 항-p21 항체를 이용한 면역침전을 수행한 결과를 나타내는 사진이다.
도 4a는 야생형 또는 변이체 p21에 따른 폐암세포(H460)의 침윤성의 변화를 분석한 결과를 나타내는 그래프 및 사진이다.
도 4b는 p53 shRNA, p21, p21Δ C12, p21S153D 또는 p21S160D를 발현하는 종양이 생성된 종양 마우스모델에서 측정된 종양의 크기를 나타내는 그래프 및 사진이다.
도 4c는 p53 shRNA, p21, p21Δ C12, p21S153D 또는 p21S160D를 발현하는 종양이 생성된 종양 마우스모델에서 측정된 종양의 혈류침투성을 분석한 결과를 나타내는 그래프 및 형광사진이다.
도 4d는 Slug의 분해에 관여하는 p53, p21 또는 Mdm2의 발현이 억제된 폐암세포(H460)에서 방사선 조사에 따른, Slug의 분해에 미치는 효과를 분석한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다.
도 4e는 변이체 p53(R273H)을 발현하는 형질전환된 H1299 세포에서 p21의 과발현여부에 따른, Slug, p53, p21 또는 Mdm2의 발현수준을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다.
도 4f는 변이체 p53(R273H)을 발현하는 형질전환된 H1299 세포에서 p21의 과발현여부에 따른 Slug의 유비퀴틴화 수준을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다.
도 5는 암세포의 침윤에 미치는 p53과 p21의 작용기작을 나타내는 개략도이다.FIG. 1A is a graph showing the results of comparing the level of invasiveness of lung cancer cells with the expression of p53 and p21 in lung cancer cells (H460). FIG.
FIG. 1B is a graph showing the results of comparing the level of invasiveness of lung cancer cells with the expression of p53 and p21 in lung cancer cells (H1299).
1C is a Western blot analysis image showing the results of comparing the expression levels of Slug with the inhibition of p53 and p21 expression in lung cancer cells (H460).
FIG. 1D is a Western blot analysis image showing the change in expression level of Slug according to the expression level of p21 in lung cancer cells (H1299-p53) in which lung cancer cells (H1299) and p53 are expressed.
2A shows the treatment time of cycloheximide as a detoxification inhibitor in lung cancer cells (H460) expressing wild-type p53 and lung cancer cells (H1299) not expressing p53 and Western blot showing the change in expression level of Slug according to the expression of p21 It is an analysis photograph.
FIG. 2b is a Western blot analysis image showing the expression level of Slug according to inhibition of Mdm2 expression or treatment with proteasome inhibitor (MG132) in lung cancer cells (H1299-p53) into which exogenous p53 has been introduced.
FIG. 2c is a Western blot analysis image showing a result of comparing the level of ubiquitination of slug according to overexpression of p21 in cancer cells expressing p53. FIG.
FIG. 2d is a Western blot analysis image showing a result of comparing the level of ubiquitination of Slug with the overexpression or expression inhibition of p21 in cancer cells expressing p53. FIG.
FIG. 3A is a photograph showing Western blot analysis of p21 immunoprecipitate under the condition that the degradation of slug through proteasome was inhibited. FIG.
FIG. 3B is a photograph showing the result of magnetic resonance analysis showing the result of analyzing whether or not various types of Slug and p21 are combined. The measurement value on the right side shows the result of quantifying the measurement value obtained by processing GST-p21.
FIG. 3c is a photograph showing the result of magnetic resonance analysis showing the result of analysis of various forms of p53 and p21 binding, and the measurement value on the right side shows the result of quantifying the measurement value obtained by treating GST-p21.
FIG. 3D is a photograph showing the results of magnetic resonance analysis showing the result of analysis of various forms of p21 and slug binding, and the measurement value on the right side was obtained by quantifying the measurement value obtained by treating GST-Slug or GST-p53 .
FIG. 3E is a photograph showing the results of the self-spin analysis showing the results of analysis of various forms of p21 and p53 binding. The measurement value on the right side was obtained by quantifying the measurement value obtained by treating GST-Slug or GST-p53 .
FIG. 3F is a photograph showing the result of magnetotactic analysis showing the result of analyzing whether p53 is combined with each mutant p21 (S153A, S153D, S160A or S160D). On the right graph, GST-Slug or GST- The results of quantitative analysis are shown.
FIG. 3G is a photograph showing the result of the self-spinning analysis showing the result of analyzing whether or not the mutant p21 (S153A, S153D, S160A or S160D) is combined with Slug, and the graph on the right hand side shows GST-Slug or GST- The results of quantitative analysis are shown.
FIG. 3h is a photograph showing the result of performing immunoprecipitation using anti-p21 antibody again on the protein of the precipitate obtained using GST-p53.
4A is a graph and a photograph showing the results of analyzing the change of invasiveness of lung cancer cells (H460) according to wild type or mutant p21.
4B is a graph and a photograph showing the size of tumor measured in a tumor mouse model in which tumors expressing p53 shRNA, p21, p21 ? C12 , p21 S153D or p21 S160D were generated.
FIG. 4C is a graph and fluorescence photograph showing the results of analysis of blood permeability of tumor measured in a tumor mouse model in which a tumor expressing p53 shRNA, p21, p21 ? C12 , p21 S153D or p21 S160D was generated.
FIG. 4D is a Western blot analysis image showing the effect of irradiation on the degradation of slug upon irradiation of lung cancer cells (H460) inhibiting the expression of p53, p21 or Mdm2 involved in the degradation of slug.
FIG. 4E is a Western blot analysis image showing a comparison of expression levels of Slug, p53, p21 or Mdm2 according to overexpression of p21 in transformed H1299 cells expressing mutant p53 (R273H).
FIG. 4f is a Western blot analysis image showing the result of comparing the level of ubiquitination of Slug according to overexpression of p21 in transformed H1299 cells expressing mutant p53 (R273H).
5 is a schematic diagram showing the mechanism of action of p53 and p21 on invasion of cancer cells.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, these examples are for illustrative purposes only, and the scope of the present invention is not limited to these examples.

실시예Example 1: 암세포의 침윤에 대한  1: For cancer cell infiltration p53p53 및  And p21p21 의 효과Effect of

p53의 암세포의 침윤을 억제하는 p53의 활성에 p21이 관여하는지를 확인하기 위하여, 야생형 p53을 발현시키는 폐암세포(H460)와 p53을 발현시키지 않는 폐암세포(H1299)를 대상으로 암세포 침윤성을 비교하였다.
In order to confirm whether p21 is involved in the activity of p53 inhibiting the invasion of cancer cells of p53, cancer cell infiltration was compared with wild type p53 expressing lung cancer cells (H460) and p53 not expressing lung cancer cells (H1299).

먼저, 야생형 p53을 발현시키는 폐암세포(H460)에 p53의 발현을 억제하는 siRNA를 처리하거나 또는 처리하지 않는 조건에서, p21을 코딩하는 발현벡터(pcDNA3-p21)를 도입하거나 또는 도입하지 않고, 24시간 동안 배양한 다음, 상기 폐암세포를 Matrigel-coated Transwell chambers (BD Biosciences)에 접종하여 그들의 침윤성을 분석하고, 그 결과를 웨스턴블럿 분석을 통해 비교하였다(도 1a). 이때, 내부대조군으로는 β-액틴을 사용하였다.First, the expression vector (pcDNA3-p21) encoding p21 was introduced or not introduced into the lung cancer cell (H460) expressing the wild-type p53 under the condition that the siRNA inhibiting the expression of p53 was treated or not treated. , And the lung cancer cells were inoculated on Matrigel-coated Transwell chambers (BD Biosciences) to analyze their invasiveness, and the results were compared by Western blot analysis (FIG. 1A). At this time, β-actin was used as an internal control group.

도 1a는 폐암세포(H460)에서 p53 및 p21의 발현여부에 따른 폐암세포의 침윤성 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 1a에서 보듯이, p21의 발현여부에 관계없이 p53의 발현이 억제되면 폐암세포(H460)의 침윤수준이 현저하게 증가되었고, p53의 발현이 억제되지 않는 조건에서 p21가 추가로 발현되면 폐암세포(H460)의 침윤수준이 더욱 감소됨을 확인하였다.
FIG. 1A is a graph showing the results of comparing the level of invasiveness of lung cancer cells with the expression of p53 and p21 in lung cancer cells (H460). FIG. As shown in FIG. 1A, when the expression of p53 was suppressed regardless of the expression of p21, the level of invasion of lung cancer cells (H460) was remarkably increased, and when p21 was further expressed under the condition that the expression of p53 was not inhibited, (H460) was further reduced.

다음으로, p53을 발현시키지 않는 폐암세포(H1299)에 p53의 발현을 억제하는 siRNA를 처리하거나 또는 처리하지 않는 조건에서, p21을 코딩하는 발현벡터를 도입하거나 또는 도입하지 않으면서, 24시간 동안 배양한 다음, p21의 발현을 억제하는 siRNA를 처리하거나 또는 처리하지 않는 조건에서 상기 폐암세포의 침윤수준을 웨스턴블럿 분석을 통해 비교하였다(도 1b). 이때, 내부대조군으로는 β-액틴을 사용하였다.Next, culturing for 24 hours without introducing or introducing an expression vector encoding p21 under the condition of treating or not treating siRNA that inhibits the expression of p53 in lung cancer cells (H1299) that do not express p53 Then, the level of invasion of the lung cancer cells was compared by Western blot analysis under the condition of treating or not treating the expression of p21 (Fig. 1B). At this time, β-actin was used as an internal control group.

도 1b는 폐암세포(H1299)에서 p53 및 p21의 발현여부에 따른 폐암세포의 침윤성 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 1b에서 보듯이, p53이 결실된 암세포에서는 외인성 p21을 발현시키거나 내재적인 p21의 발현을 억제하여도 침윤성에 큰 영향을 미치지 못 하였으며, 외인성 p53을 발현시킬 경우 p21의 발현수준도 함께 증가하면서 침윤성을 억제 하였고, 이 상태에서 p21의 발현을 억제하면 p53이 침윤을 억제 하지 못하는 것을 확인하였다.
FIG. 1B is a graph showing the results of comparing the level of invasiveness of lung cancer cells with the expression of p53 and p21 in lung cancer cells (H1299). As shown in FIG. 1B, expression of exogenous p21 or intrinsic inhibition of p21 expression did not significantly affect invasiveness in cancer cells in which p53 was deleted, and when expression of exogenous p53 was expressed, p21 expression level also increased Inhibition of invasiveness and inhibition of p21 expression in this condition confirmed that p53 did not inhibit invasion.

따라서, 암세포의 침윤은 p53과 p21에 의하여 영향을 받음을 알 수 있었다.
Therefore, the invasion of cancer cells was affected by p53 and p21.

실시예Example 2:  2: SlugSlug 의 발현에 대한 For the expression of p53p53 및  And p21p21 의 효과Effect of

상기 실시예 1의 결과로부터, 암세포의 침윤은 p53과 p21에 의하여 영향을 받음을 확인하였으므로, 상기 p53과 p21이 암세포의 침윤을 조절하는 동일한 표적에 작용하는 지의 여부를 확인하고자, 공지된 암세포 침윤에 관여하는 촉진자인 Slug를 대상으로 p53과 p21의 작용을 검증하였다.
From the results of Example 1, it was confirmed that the infiltration of cancer cells was affected by p53 and p21. Therefore, in order to confirm whether the p53 and p21 act on the same target that regulates the infiltration of cancer cells, And Slug, a promoter involved in p53 and p21.

먼저, 야생형 p53을 발현시키는 폐암세포(H460)에 p53에 대한 siRNA 및 p21에 대한 siRNA를 조합하여 처리한 다음, Slug, p53 및 p21의 발현수준을 웨스턴블럿 분석을 통해 확인하였다(도 1c). 이때, 내부대조군으로는 β-액틴을 사용하였다.First, siRNA against p53 and siRNA against p21 were treated in combination with lung cancer cells (H460) expressing wild-type p53, and expression levels of Slug, p53 and p21 were confirmed by western blot analysis (Fig. 1C). At this time, β-actin was used as an internal control group.

도 1c는 폐암세포(H460)에서 p53 및 p21의 발현억제에 따른 Slug의 발현수준을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다. 도 1c에서 보듯이, p53 및 p21이 모두 발현되는 경우에는 Slug가 낮은 수준으로 발현되었으나, p53 또는 p21의 어느 하나의 발현이 억제될 경우에는 Slug의 발현수준이 증가함을 확인하였다.
1C is a Western blot analysis image showing the results of comparing the expression levels of Slug with the inhibition of p53 and p21 expression in lung cancer cells (H460). As shown in FIG. 1C, when p53 and p21 were all expressed, slug was expressed at a low level, but when expression of either p53 or p21 was inhibited, the expression level of slug was increased.

또한, p53을 발현시키지 않는 폐암세포(H1299)와 상기 폐암세포에서 외인성 p53이 도입된 폐암세포(H1299-p53)를 대상으로, p21을 코딩하는 발현벡터(pcDNA3-p21)를 도입하거나 또는 내재적인 p21의 발현을 억제하면서 배양하고, Slug, p53 및 p21의 발현수준을 웨스턴블럿 분석을 통해 확인하였다(도 1d). 이때, 내부대조군으로는 β-액틴을 사용하였다.In addition, p21-expressing expression vector (pcDNA3-p21) was introduced into lung cancer cells (H1299) not expressing p53 and lung cancer cells (H1299-p53) into which exogenous p53 was introduced from the lung cancer cells, p21, and expression levels of Slug, p53 and p21 were confirmed by Western blot analysis (Fig. 1d). At this time, β-actin was used as an internal control group.

도 1d는 폐암세포(H1299) 및 p53이 발현되는 폐암세포(H1299-p53)에서 p21의 발현수준 변화에 따른 Slug의 발현수준의 변화를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다. 도 1d에서 보듯이, p53을 발현시키지 않는 폐암세포(H1299)에서는 p21의 발현수준에 상관없이 Slug의 발현수준에 큰 변화가 없었으나, p53이 발현되는 폐암세포(H1299-p53)에서는 p21의 발현수준이 증가하면, Slug의 발현수준이 감소하고, p21의 발현수준이 감소하면, Slug의 발현수준이 증가함을 확인하였다.
FIG. 1D is a Western blot analysis image showing the change in expression level of Slug according to the expression level of p21 in lung cancer cells (H1299-p53) in which lung cancer cells (H1299) and p53 are expressed. As shown in FIG. 1d, in the lung cancer cell (H1299) not expressing p53, there was no significant change in the expression level of Slug regardless of the expression level of p21, but in the p53 expressing lung cancer cell (H1299-p53) As the level increased, the level of expression of Slug decreased and the level of expression of Slug decreased as the level of expression of p21 decreased.

따라서, 상기 Slug는 p53과 p21의 동일한 표적으로 작용하고, 상기 Slug의 발현을 억제하기 위하여는, p53과 p21이 모두 필요함을 알 수 있었다.
Therefore, the Slug acts as the same target of p53 and p21, and it is found that both p53 and p21 are required to suppress the expression of the slug.

실시예Example 3:  3: SlugSlug 의 분해에 대한 For decomposition of p53p53 및  And p21p21 의 효과Effect of

빈 벡터(pcDNA3) 또는 p21을 코딩하는 발현벡터(pcDNA3-p21)가 도입된 H460 세포 및 H1299 세포에 0 내지 5시간 동안 해독억제제인 사이클로헥시미드(10 μM)를 처리하고 배양한 다음, Slug의 발현수준을 웨스턴블럿 분석을 통해 비교하고, 내부대조군인 β-액틴의 발현수준 대비 Slug의 상대적인 발현수준을 비교하였다(도 2a).H460 cells and H1299 cells into which an empty vector (pcDNA3) or p21-encoding expression vector (pcDNA3-p21) had been introduced were treated with cycloheximide (10 μM) as a detoxification inhibitor for 0 to 5 hours, Were compared by western blot analysis and the relative expression levels of Slug versus the expression level of the beta-actin, an internal control, were compared (Fig. 2a).

도 2a는 야생형 p53을 발현시키는 폐암세포(H460)와 p53을 발현시키지 않는 폐암세포(H1299)에서 해독억제제인 사이클로헥시미드의 처리시간 및 p21의 발현에 따른 Slug의 발현수준 변화를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다. 도 2a에서 보듯이, 야생형 p53을 발현시키는 폐암세포(H460)에서는 p21이 발현되는 조건에서 사이클로헥시미드의 처리시간이 경과함에 따라, Slug의 발현수준이 감소하였으나, p53을 발현시키지 않는 폐암세포(H1299)에서는 p21이 발현되어도 사이클로헥시미드의 처리시간과 관계없이 Slug의 발현수준이 일정한 수준을 유지함을 확인하였다.
2A shows the treatment time of cycloheximide as a detoxification inhibitor in lung cancer cells (H460) expressing wild-type p53 and lung cancer cells (H1299) not expressing p53 and Western blot showing the change in expression level of Slug according to the expression of p21 It is an analysis photograph. As shown in FIG. 2A, in the lung cancer cell (H460) expressing the wild-type p53, the expression level of the slug decreased with the passage of the cycloheximide under the condition that p21 was expressed, but the expression level of the p53- (H1299), it was confirmed that even when p21 was expressed, the expression level of slug remained constant regardless of the treatment time of cycloheximide.

이에, Slug의 Mdm2-의존성 분해에 미치는 p53과 p21의 효과를 확인하고자, 외인성 p53이 도입된 폐암세포(H1299-p53)를 대상으로, 외인성 p21(pcDNA3-p21)을 발현시키거나 또는 발현시키지 않은 조건에서, Mdm2의 발현억제(Mdm2 siRNA) 또는 프로테아좀 억제제(MG132)를 처리하거나 처리하지 않음에 따른, Slug의 발현수준 변화를 웨스턴블럿 분석을 통해 비교하였다(도 2b). 이때, 내부대조군으로는 β-액틴을 사용하였다.To investigate the effect of p53 and p21 on Mdm2-dependent degradation of slug, we examined the expression of exogenous p21 (pcDNA3-p21) in lung cancer cells (H1299-p53) , The expression levels of Slug were compared by western blot analysis (Fig. 2b), with or without Mdm2 expression inhibition (Mdm2 siRNA) or proteasome inhibitor (MG132) treatment. At this time, β-actin was used as an internal control group.

도 2b는 외인성 p53이 도입된 폐암세포(H1299-p53)에서 Mdm2의 발현억제 또는 프로테아좀 억제제(MG132)의 처리에 따른 Slug의 발현수준 변화를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다. 도 2b에서 보듯이, Mdm2의 발현이 억제되거나 또는 프로테아좀의 기능이 억제된 경우에는 p53과 p21이 발현되더라도 Slug의 발현수준이 높은 수준을 나타냄을 확인하였다.
FIG. 2b is a Western blot analysis image showing the expression level of Slug according to inhibition of Mdm2 expression or treatment with proteasome inhibitor (MG132) in lung cancer cells (H1299-p53) into which exogenous p53 has been introduced. As shown in FIG. 2B, when the expression of Mdm2 was suppressed or the proteasome function was suppressed, it was confirmed that the expression level of slug was high even when p53 and p21 were expressed.

따라서, p53 및 p21에 의한 Slug의 발현억제는, Mdm2-의존적으로 프로테아좀에 의하여 Slug가 분해됨에 따라 나타남을 알 수 있었다.
Therefore, the inhibition of the expression of slug by p53 and p21 was found to be caused by the degradation of Slug by Mdm2-dependent proteasome.

이러한 Slug의 프로테아좀에 의한 분해를 수행하기 위하여는, Slug의 유비퀴틴화가 선행되어야 하므로, 상기 Slug의 유비퀴틴화에 p53과 p21이 어떠한 영향을 미치는지를 확인하고자 하였다.In order to carry out the degradation by the proteasome of such a slug, the effect of p53 and p21 on the ubiquitination of the above slug was investigated because the ubiquitination of the slug was to be preceded.

구체적으로, HA-표지된 유비퀴틴, Flag-표지된 Slug, p21 및 Mdm2 siRNA를 코딩하는 벡터를 조합하여 도입된 H1299-p53 세포에 MG132를 5시간 동안 처리하였다. 이어, 상기 세포를 파쇄하여 세포파쇄물을 수득하고, 이를 대상으로 항-Flag-아가로스 비드를 사용한 면역침전을 수행한 다음, 침전물을 대상으로 웨스턴블럿 분석을 수행하였다(도 2c). 이때, 내부대조군으로는 β-액틴을 사용하였다.Specifically, MG132 was treated for 5 hours with H1299-p53 cells introduced in combination with HA-labeled ubiquitin, Flag-tagged Slug, vector encoding p21 and Mdm2 siRNA. Then, the cells were disrupted to obtain cell lysates. Immunoprecipitation with anti-Flag-agarose beads was performed on the cells, and western blot analysis was performed on the precipitates (Fig. 2C). At this time, β-actin was used as an internal control group.

도 2c는 p53이 발현되는 암세포에서 p21의 과발현 여부에 따른 Slug의 유비퀴틴화 수준을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다. 도 2c에서 보듯이, H1299-p53 세포에서는 p21가 과발현될 경우, 유비퀴틴화된 Slug의 수준이 증가되었으나, Mdm2의 발현이 억제된 경우에는 유비퀴틴화된 Slug의 수준이 증가하지 않음을 확인하였다.
FIG. 2c is a Western blot analysis image showing a result of comparing the level of ubiquitination of slug according to overexpression of p21 in cancer cells expressing p53. FIG. As shown in FIG. 2C, when p21 was overexpressed in H1299-p53 cells, the level of ubiquitinated slug was increased, but when the expression of Mdm2 was inhibited, the level of ubiquitinated slug was not increased.

또한, H1299 세포와 H1299-p53 세포를 대상으로, HA-표지된 유비퀴틴, Flag-표지된 Slug, p21 및 p21 siRNA를 코딩하는 벡터를 조합하여 도입한 것을 제외하고는, 상술한 바와 동일한 실험을 수행하였다(도 2d).In addition, the same experiment as described above was carried out, except that H1299 cells and H1299-p53 cells were used in combination with vectors encoding HA-labeled ubiquitin, Flag-labeled Slug, p21 and p21 siRNA (Fig. 2d).

도 2d는 p53이 발현되는 암세포에서 p21의 과발현 또는 발현억제에 따른 Slug의 유비퀴틴화 수준을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다. 도 2d에서 보듯이, H1299 세포에서는 p21의 과발현 또는 발현억제에 의하여 유비퀴틴화된 Slug의 수준이 변화되지 않았으나, H1299-p53 세포에서는 p21의 발현이 억제된 경우에는, 유비퀴틴화된 Slug의 수준이 감소함을 확인하였다.
FIG. 2d is a Western blot analysis image showing a result of comparing the level of ubiquitination of Slug with the overexpression or expression inhibition of p21 in cancer cells expressing p53. FIG. As shown in FIG. 2d, the level of ubiquitinated slug was not changed by over-expression or suppression of p21 expression in H1299 cells, but when the expression of p21 was suppressed in H1299-p53 cells, the level of ubiquitinated slug decreased Respectively.

따라서, Slug 단백질의 p53/Mdm2-의존성 유비퀴틴화 및 프로테아좀 분해에 p21이 필수적임을 알 수 있었다.
Therefore, p21 is essential for p53 / Mdm2-dependent ubiquitination and proteasome degradation of Slug protein.

실시예Example 4:  4: p53p53 , , p21p21 , , Mdm2Mdm2 및  And SlugSlug 의 결합관계 분석Analysis of Coupling Relationships

상기 실시예 3의 결과로부터, Slug 단백질의 p53/Mdm2-의존성 유비퀴틴화 및 프로테아좀 분해에 p21이 필수적임을 확인하였으므로, 상기 p53, p21, Mdm2 및 Slug가 하나의 복합체를 형성하는지의 여부를 확인하고자 하였다.
From the results of Example 3, it was confirmed that p21 is essential for p53 / Mdm2-dependent ubiquitination and proteasome degradation of Slug protein. Therefore, it is confirmed whether p53, p21, Mdm2 and Slug form a complex .

실시예Example 4-1:  4-1: p53p53 , , p21p21 , , Mdm2Mdm2 및  And SlugSlug 의 결합관계 확인Confirmation of association of

구체적으로, p21 또는 Flag-표지된-p21 발현벡터가 도입된 H1299-p53 세포에 MG132을 5시간 동안 처리하면서 배양하였다. 상기 배양된 세포를 파쇄하여 세포파쇄물을 수득하고, 상기 세포파쇄물에 항-Flag 비드를 처리하여 면역침전을 수행하였다. 상기 면역침전을 통해 수득한 침전물을 대상으로 웨스턴블럿 분석을 수행하였다(도 3a).Specifically, H1299-p53 cells into which p21 or Flag-labeled-p21 expression vector had been introduced were cultured with MG132 for 5 hours. The cultured cells were disrupted to obtain cell lysates, and the cell lysates were treated with anti-Flag beads to perform immunoprecipitation. Western blot analysis was performed on the precipitate obtained through the immunoprecipitation (Fig. 3a).

도 3a는 프로테아좀을 통한 Slug의 분해가 억제된 조건하에서 p21의 면역침전물을 대상으로 웨스턴블럿 분석을 수행한 결과를 나타내는 사진이다. 도 3a에서 보듯이, 상기 p21의 면역침전시에 p53, Slug 및 Mdm2도 함께 침전됨을 확인하였다.
FIG. 3A is a photograph showing Western blot analysis of p21 immunoprecipitate under the condition that the degradation of slug through proteasome was inhibited. FIG. As shown in FIG. 3A, it was confirmed that p53, Slug, and Mdm2 precipitated at the time of immunoprecipitation of p21.

실시예Example 4-2:  4-2: p53p53 , , p21p21 , , Mdm2Mdm2 및  And SlugSlug 의 재조합 Recombination of 변이체를Mutant 사용한 결합관계 검증 Verification of used binding relationships

상기 실시예 4-1의 결과로부터, p21이 p53, Slug 및 Mdm2과 함께 하나의 복합체를 형성하는 것으로 예측되었으므로, 이를 확인하고자 재조합 단백질을 사용하여 검증하였다.
From the results of Example 4-1, p21 was predicted to form one complex with p53, Slug, and Mdm2, and thus, it was verified using recombinant proteins to confirm this.

실시예Example 4-2-1:  4-2-1: SlugSlug 의 재조합 Recombination of 변이체Mutant 및  And p21p21 을 사용한 결합관계 검증Verification of the coupling relationship using

Slug의 야생형 단백질(FL), N-말단측 9개 잔기가 결실된 변이체(ΔN9), N-말단측 26개 잔기가 결실된 변이체(ΔN26) 또는 C-말단측 34개 잔기가 결실된 변이체(ΔC34)를 각각 제작하고 이들 각각에 35S를 표지하였다. 상기 표지된 각각의 Slug와 GST가 결합된 재조합 p21(GST-p21)를 반응시키고, 상기 반응물에 글루타티온이 결합된 비드를 가한 다음, 원심분리하여 침전물을 수득하였으며, 상기 수득한 침전물을 SDS-PAGE 및 35S를 이용한 자기방사법으로 분석하였다(도 3b).The wild type protein (FL) of Slug, mutant (DELTA N9) in which N-terminal 9 residues were deleted, mutant (DELTA N26) in which N-terminal 26 residues were deleted or mutant in which 34 residues in C- ΔC34) were labeled with 35 S in the manufacture and each of them respectively. Recombinant p21 (GST-p21) conjugated with each of the above labeled slugs and GST was reacted, and glutathione-conjugated beads were added to the reaction mixture, followed by centrifugation to obtain a precipitate. The obtained precipitate was subjected to SDS-PAGE and analyzed in a self-process using a 35 S (Fig. 3b).

도 3b는 다양한 형태의 Slug와 p21의 결합여부를 분석한 결과를 나타내는 자기방사법 분석결과를 나타내는 사진으로서, 우측의 측정값은 GST-p21을 처리하여 나타나는 측정값을 정량한 결과를 나타낸다. 상기 도 3b에서 보듯이, Slug의 N-말단측 9개 잔기가 결실된 변이체(ΔN9) 및 N-말단측 26개 잔기가 결실된 변이체(ΔN26)는 p21과 결합하지 않음을 확인하였다.FIG. 3B is a photograph showing the result of magnetic resonance analysis showing the result of analyzing whether or not various types of Slug and p21 are combined. The measurement value on the right side shows the result of quantifying the measurement value obtained by processing GST-p21. As shown in FIG. 3B, it was confirmed that a mutant (ΔN9) in which nine residues at the N-terminal side of Slug was deleted and a mutant (ΔN26) in which 26 residues at the N-terminal side were deleted did not bind to p21.

따라서, Slug의 N-말단이 p21과의 결합에 사용됨을 알 수 있었다.
Thus, it was found that the N-terminus of Slug was used for binding to p21.

실시예Example 4-2-2:  4-2-2: p53p53 의 재조합 Recombination of 변이체Mutant 및  And p21p21 을 사용한 결합관계 검증Verification of the coupling relationship using

p53의 야생형 단백질(FL), N-말단측 43개 잔기가 결실된 변이체(ΔN43), N-말단측 101개 잔기가 결실된 변이체(ΔN101), C-말단측 37개 잔기가 결실된 변이체(ΔC37) 또는 C-말단측 101개 잔기가 결실된 변이체(ΔC101)를 각각 제작하고 이들 각각에 35S를 표지하였다. 상기 표지된 각각의 p53과 GST가 결합된 재조합 p21를 반응시키고, 상기 반응물에 글루타티온이 결합된 비드를 가한 다음, 원심분리하여 침전물을 수득하였으며, 상기 수득한 침전물을 SDS-PAGE 및 35S를 이용한 자기방사법으로 분석하였다(도 3c).(FL) of p53, a mutant (DELTA N43) in which 43 residues in the N-terminal side are deleted, a mutant (DELTA N101) in which 101 residues in the N-terminal side are deleted, and a mutant in which 37 residues in the C- ? C37) or a variant (? C101) in which 101 residues at the C-terminal side were deleted, and 35 S was labeled on each of them. Reacting the labeled individual p53 and recombinant p21 of GST is a chemical bond, was added to the glutathione binding beads to the reaction to give the next precipitate by centrifugation, the obtained precipitate with SDS-PAGE and 35 S (Figure 3c).

도 3c는 다양한 형태의 p53과 p21의 결합여부를 분석한 결과를 나타내는 자기방사법 분석결과를 나타내는 사진으로서, 우측의 측정값은 GST-p21을 처리하여 나타나는 측정값을 정량한 결과를 나타낸다. 상기 도 3c에서 보듯이, p53의 C-말단측 37개 잔기가 결실된 변이체(ΔC37) 또는 C-말단측 101개 잔기가 결실된 변이체(ΔC101)는 p21과 결합하지 않음을 확인하였다.FIG. 3c is a photograph showing the result of magnetic resonance analysis showing the result of analysis of various forms of p53 and p21 binding, and the measurement value on the right side shows the result of quantifying the measurement value obtained by treating GST-p21. As shown in FIG. 3C, it was confirmed that a mutant (? C37) in which 37 residues at the C-terminal of p53 was deleted or a mutant (? C101) in which 101 residues at the C-terminal was deleted did not bind to p21.

따라서, p53의 C-말단이 p21과의 결합에 사용됨을 알 수 있었다.
Therefore, it was found that the C-terminal of p53 was used for binding to p21.

실시예Example 4-2-3:  4-2-3: p21p21 의 재조합 Recombination of 변이체Mutant 및  And SlugSlug // p53p53 을 사용한 결합관계 검증Verification of the coupling relationship using

p21의 야생형 단백질(FL), N-말단측 26개 잔기가 결실된 변이체(ΔN26), C-말단측 12개 잔기가 결실된 변이체(ΔC12) 또는 C-말단측 25개 잔기가 결실된 변이체(ΔC25)를 각각 제작하고 이들 각각에 35S를 표지하였다. 상기 표지된 각각의 p21과 GST가 결합된 재조합 Slug(GST-Slug) 또는 p53(GST-p53)을 반응시키고, 상기 반응물에 글루타티온이 결합된 비드를 가한 다음, 원심분리하여 침전물을 수득하였으며, 상기 수득한 침전물을 SDS-PAGE 및 35S를 이용한 자기방사법으로 분석하였다(도 3d 및 3e).a wild-type protein (FL) of p21, a mutant (DELTA N26) in which 26 residues on the N-terminal side are deleted, a mutant (DELTA C12) in which 12 residues on the C-terminal side are deleted or a mutant in which 25 residues on the C- ΔC25) were labeled with 35 S in the manufacture and each of them respectively. Recombinant Slug (GST-Slug) or p53 (GST-p53) conjugated with each of the labeled p21 and GST was reacted, and glutathione-conjugated beads were added to the reactant, followed by centrifugation to obtain a precipitate. the resultant precipitate was analyzed in a self-process using a SDS-PAGE and 35 S (Fig. 3d and 3e).

도 3d는 다양한 형태의 p21과, Slug의 결합여부를 분석한 결과를 나타내는 자기방사법 분석결과를 나타내는 사진으로서, 우측의 측정값은 GST-Slug 또는 GST-p53을 처리하여 나타나는 측정값을 정량한 결과를 나타낸다. 또한, 도 3e는 다양한 형태의 p21과, p53의 결합여부를 분석한 결과를 나타내는 자기방사법 분석결과를 나타내는 사진으로서, 우측의 측정값은 GST-Slug 또는 GST-p53을 처리하여 나타나는 측정값을 정량한 결과를 나타낸다. FIG. 3D is a photograph showing the results of magnetic resonance analysis showing the result of analysis of various forms of p21 and slug binding, and the measurement value on the right side was obtained by quantifying the measurement value obtained by treating GST-Slug or GST-p53 . FIG. 3 (e) is a photograph showing the result of the self-spin analysis showing the results of analysis of various forms of p21 and p53 binding. The measurement value on the right side was determined by treating GST-Slug or GST-p53 .

도 3d 및 3e에서 보듯이, p21의 C-말단측 12개 잔기가 결실된 변이체(ΔC12) 또는 C-말단측 25개 잔기가 결실된 변이체(ΔC25)는 Slug 및 p53과 결합하지 않음을 확인하였다.As shown in Figs. 3d and 3e, it was confirmed that the mutant (? C12) in which 12 residues at the C-terminal side of p21 was deleted or the mutant (? C25) in which 25 residues at the C-terminal side were deleted did not bind to Slug and p53 .

따라서, p21의 C-말단이 Slug 또는 p53과의 결합에 사용됨을 알 수 있었다.
Thus, it was found that the C-terminal of p21 was used for binding to Slug or p53.

실시예Example 4-2-4:  4-2-4: SlugSlug // p53p53 에 대한 For p21p21 의 결합부위 확인Confirmation of binding site

상기 실시예 4-2-1 내지 4-2-3의 결과로부터, Slug의 N-말단이 p21과의 결합에 사용되고, p53의 C-말단이 p21과의 결합에 사용되며, p21의 C-말단이 Slug 또는 p53과의 결합에 사용됨을 확인하였으므로, p21의 C-말단에서 Slug 또는 p53과의 결합에 사용되는 부위를 검색하고자 하였다.From the results of Examples 4-2-1 to 4-2-3, the N-terminal of Slug was used for binding to p21, the C-terminal of p53 was used for binding to p21, and the C- Was used for binding to Slug or p53, it was searched for a site used for binding to Slug or p53 at the C-terminus of p21.

이에, 상기 p21의 C-말단의 아미노산 서열을 분석한 결과, 153번 및 160번 위치에 각각의 인산화된 세린잔기가 포함되어 있음을 확인하고, 이들 인산화된 세린잔기가 Slug 또는 p53과의 결합에 관여할 것으로 가정하였다.Analysis of the amino acid sequence at the C-terminus of p21 revealed that the phosphorylated serine residues were contained at positions 153 and 160, and these phosphorylated serine residues were found to bind to Slug or p53 .

상기 가정을 확인하기 위하여, 인산화된 세린을 모사할 수 있는 아스파르트산으로 상기 153번 또는 160번 위치의 세린을 치환시킨 변이체 p21(S153D 또는 S160D)을 각각 제작하였고, 대조군으로서, 알라닌으로 상기 153번 또는 160번 위치의 세린을 치환시킨 변이체 p21(S153A 또는 S160A)을 각각 제작하였으며, 제작된 각 변이체 p21에 35S를 표지하였다.In order to confirm the above assumption, mutant p21 (S153D or S160D) in which serine at position 153 or 160 was substituted with aspartic acid capable of simulating phosphorylated serine was prepared. As a control group, or it was produced 160 times in which the mutant p21 (S153A or S160A) replacement of the serine of position, respectively, and the cover 35 S to the respective production mutant p21.

상기 표지된 각각의 p21과 GST가 결합된 재조합 Slug(GST-Slug) 또는 p53(GST-p53)을 반응시키고, 상기 반응물에 글루타티온이 결합된 비드를 가한 다음, 원심분리하여 침전물을 수득하였으며, 상기 수득한 침전물을 SDS-PAGE 및 35S를 이용한 자기방사법으로 분석하였다(도 3f 및 3g).Recombinant Slug (GST-Slug) or p53 (GST-p53) conjugated with each of the labeled p21 and GST was reacted, and glutathione-conjugated beads were added to the reactant, followed by centrifugation to obtain a precipitate. the resultant precipitate was analyzed in a self-process using a SDS-PAGE and 35 S (Fig. 3f and 3g).

도 3f는 각각의 변이체 p21(S153A, S153D, S160A 또는 S160D)과, p53의 결합여부를 분석한 결과를 나타내는 자기방사법 분석결과를 나타내는 사진으로서, 우측의 그래프는 GST-Slug 또는 GST-p53을 처리하여 나타나는 측정값을 정량분석한 결과를 나타낸다. 또한, 도 3g는 각각의 변이체 p21(S153A, S153D, S160A 또는 S160D)과, Slug의 결합여부를 분석한 결과를 나타내는 자기방사법 분석결과를 나타내는 사진으로서, 우측의 그래프는 GST-Slug 또는 GST-p53을 처리하여 나타나는 측정값을 정량분석한 결과를 나타낸다. FIG. 3F is a photograph showing the result of magnetotactic analysis showing the result of analyzing whether p53 is combined with each mutant p21 (S153A, S153D, S160A or S160D). On the right graph, GST-Slug or GST- The results of quantitative analysis are shown. FIG. 3G is a photograph showing the result of magnetic resonance analysis showing the result of analyzing whether or not each mutant p21 (S153A, S153D, S160A or S160D) is combined with Slug, and the graph on the right side shows GST-Slug or GST-p53 And the result of quantitative analysis of the measured value is shown.

도 3f 및 3g에서 보듯이, p21의 C-말단측 153번 잔기가 아스파르트산으로 치환된 변이체(S153D)는 p53과 결합하지 않았고, p21의 C-말단측 160번 잔기가 아스파르트산으로 치환된 변이체(S160D)는 Slug와 결합하지 않음을 확인하였다. 이에 반하여 상기 각 잔기가 알라닌으로 치환된 변이체는 Slug 또는 p53과의 결합을 억제하지 않음을 확인하였다.As shown in FIGS. 3F and 3G, the mutant (S153D) in which the C-terminal side 153 residue of p21 was substituted with aspartic acid did not bind to p53 and the mutant in which the C-terminal side 160 residue of p21 was substituted with aspartic acid (S160D) did not bind to Slug. On the contrary, it was confirmed that mutants in which each residue was substituted with alanine did not inhibit binding to Slug or p53.

따라서, p21의 153번 세린잔기는 p53과의 결합에 관여하고, 160번 세린잔기는 Slug와의 결합에 관여하며, 각 세린잔기의 인산화는 Slug 또는 p53과의 결합을 억제할 수 있음을 알 수 있었다.
Therefore, it was found that the 153th serine residue of p21 is involved in binding to p53, the 160th serine residue is involved in binding to Slug, and the phosphorylation of each serine residue can inhibit the binding to Slug or p53 .

실시예Example 4-2-5:  4-2-5: SlugSlug // p53p53 에 대한 For p21p21 의 동시결합 확인Simultaneous coupling of

상기 실시예 4-2-4의 결과로부터, p21이 서로다른 부위에서 Slug 또는 p53과 결합함을 확인하였으므로, 상기 p21이 Slug 및 p53과 동시에 결합할 수 있는지를 확인하고자 하였다.
From the results of Example 4-2-4, it was confirmed that p21 binds to Slug or p53 at different sites. Therefore, it was examined whether p21 could bind to Slug and p53 at the same time.

구체적으로, 35S-표지된 Slug 및 p21을 포함하는 혼합물에 GST 또는 GST-p53을 처리하여 반응시킨 다음, 상기 반응물에 다시 글루타티온이 결합된 비드를 가한 다음, 원심분리하여 침전물을 수득하였으며, 상기 수득한 침전물을 SDS-PAGE 및 35S를 이용한 자기방사법으로 분석하였다(도 3h의 GST pull-down). 상기 침전물로부터 단백질을 추출하여, 수득하고, 상기 추출된 단백질을 대상으로 IgG 또는 항-p21 항체를 이용한 면역침전을 수행하였다. 상기 면역침전된 단백질을 SDS-PAGE 및 35S를 이용한 자기방사법으로 분석하였다(도 3h의 2nd IP).Specifically, a mixture containing 35 S-labeled Slug and p21 was treated with GST or GST-p53, reacted again with glutathione-conjugated beads, and centrifuged to obtain a precipitate. the resultant precipitate was analyzed in a self-process using a SDS-PAGE and 35 S (GST pull-down in Fig. 3h). The protein was extracted from the precipitate, and the extracted protein was subjected to immunoprecipitation using an IgG or anti-p21 antibody. The immunological precipitated proteins were analyzed in a self-process using a SDS-PAGE and 35 S (2nd IP of Fig. 3h).

도 3h는 GST-p53을 사용하여 수득한 침전물의 단백질을 대상으로 다시 항-p21 항체를 이용한 면역침전을 수행한 결과를 나타내는 사진이다. 도 3h에서 보듯이, 35S-표지된 Slug는 p53에 의하여도 검출될 수 있고, p21에 대한 항체로도 검출될 수 있음을 확인하였다.FIG. 3h is a photograph showing the result of performing immunoprecipitation using anti-p21 antibody again on the protein of the precipitate obtained using GST-p53. As shown in FIG. 3h, it was confirmed that 35 S-labeled Slug could be detected by p53 and also by p21 antibody.

따라서, 상기 p21이 Slug 및 p53과 동시에 결합할 수 있음을 알 수 있었다.
Thus, it was found that the p21 could bind to both Slug and p53 at the same time.

상술한 바를 종합하면, Slug의 N-말단이 p21과의 결합에 사용되고, p53의 C-말단이 p21과의 결합에 사용되며, p21의 C-말단의 153번 세린이 p53과의 결합에 사용되고, 상기 p21의 C-말단의 160번 세린이 Slug와의 결합에 사용되며, 이를 통하여 p21이 Slug 및 p53과 동시에 결합하여 복합체를 형성하는 것으로 분석되었다.
Taken together, the N-terminal of Slug is used for binding to p21, the C-terminal of p53 is used for binding to p21, the C-terminal 153 of serine of p21 is used for binding to p53, Serine 160 at the C-terminal of p21 was used for binding to Slug, and it was analyzed that p21 binds simultaneously with Slug and p53 to form a complex.

실시예Example 5: 암세포 침윤에 대한 연관성 분석 5: Association analysis of cancer cell infiltration

실시예Example 5-1:  5-1: SlugSlug 또는  or p53p53 에 대한 For p21p21 의 of 결합여부가Whether to combine 암세포의 침윤에 미치는 효과 Effect on cancer cell infiltration

야생형 p21(WT) 또는 상기 실시예 4-2-3 및 4-2-4에서 제조된 각각의 변이체 p21(ΔC12, S153A, S153D, S160A 또는 S160D)를 코딩하는 발현벡터(pcDNA3)를 각각 야생형 p53을 발현시키는 폐암세포(H460)에 도입하여, 각각의 형질전환 폐암세포를 제작하고, 상기 제작된 각 형질전환 폐암세포의 침윤성을 비교하였다(도 4a). 이때, 내부대조군으로는 β-액틴을 사용하였다.(PcDNA3) coding for wild type p21 (WT) or each of the mutants p21 (ΔC12, S153A, S153D, S160A or S160D) prepared in the above Examples 4-2-3 and 4-2-4 were transformed into wild type p53 (H460) expressing the respective transgenic lung cancer cells to prepare transformed lung cancer cells, and the invasiveness of each of the transgenic lung cancer cells prepared was compared (FIG. 4A). At this time, β-actin was used as an internal control group.

도 4a는 야생형 또는 변이체 p21에 따른 폐암세포(H460)의 침윤성의 변화를 분석한 결과를 나타내는 그래프 및 사진이다. 도 4a에서 보듯이, 침윤성이 감소되는 야생형 p21이 도입된 페암세포에 비하여, Slug 또는 p53과 결합할 수 없는 변이체 p21(ΔC12, S153D 또는 S160D)이 도입된 페암세포에서는 침윤성이 감소되지 않음을 확인하였다.4A is a graph and a photograph showing the results of analyzing the change of invasiveness of lung cancer cells (H460) according to wild type or mutant p21. As shown in FIG. 4A, it was confirmed that invasiveness was not decreased in parenchymal cells in which p21 (ΔC12, S153D or S160D), which is not able to bind to Slug or p53, was introduced, compared with parenchymal cells in which wild type p21 was reduced in invasiveness Respectively.

따라서, p21가 Slug 또는 p53에 결합하지 못하면, Slug의 분해를 유도하지 못하며, 결과적으로는 암세포의 침윤을 억제할 수 없음을 알 수 있었다.
Therefore, if p21 does not bind to the slug or p53, it can not induce the degradation of the slug, and as a result, the infiltration of cancer cells can not be inhibited.

실시예Example 5-2: 마우스모델을 이용한  5-2: Using the mouse model p21p21 의 암세포 침윤억제효과 분석Of cancer cell infiltration inhibition

먼저, pEGFP-C1 벡터가 도입된 H460 세포를 G418 설페이트(1 mg/㎖)를 사용하여 형질도입된 H460 세포를 1차 선발하였다. 상기 1차 선발된 H460 세포에, pSUPERIOR.puro 벡터 또는 p53 shRNA를 코딩하는 벡터를 추가로 도입하거나; 또는 야생형 또는 변이형 p21을 코딩하는 pFLAG-C1 벡터를 도입함으로써, 야생형 p21(WT) 또는 상기 실시예 4-2-3 및 4-2-4에서 제조된 각각의 변이체 p21(ΔC12, S153A, S153D, S160A 또는 S160D)를 발현시키는 형질전환된 H460 세포를 제작하고, 퓨로마이신(500 ng/㎖)을 사용하여 2차 선발하였다. 상기 2차 선발된 각각의 H460 세포(5 × 106)를 6주령의 자성 BALB/cAnNCrj-nu/nu 마우스의 옆구리 부분에 경피주사하고 사육하여, 각각의 종양 마우스모델을 제작하였다.
First, H460 cells transfected with pEGFP-C1 vector were firstly screened for H460 cells transfected with G418 sulfate (1 mg / ml). Further introducing into said primary selected H460 cells a vector encoding pSUPERIOR.puro vector or p53 shRNA; Alternatively, wild-type p21 (WT) or each of the mutants p21 (ΔC12, S153A, S153D) prepared in Examples 4-2-3 and 4-2-4 by introducing pFLAG-C1 vector encoding wild type or mutant p21 , S160A or S160D) was prepared, and secondary selection was carried out using puromycin (500 ng / ml). Each of the second-selected H460 cells (5 × 10 6 ) was transdermally injected into the side of a 6-week-old magnetic BALB / cAnNCrj-nu / nu mouse and cultured to prepare respective tumor mouse models.

다음으로, 상기 제작된 각각의 종양 마우스모델에서 생성된 종양의 크기를 측정하였다(도 4b).Next, the sizes of the tumors produced in each of the above-prepared tumor mouse models were measured (FIG. 4B).

도 4b는 p53 shRNA, p21, p21Δ C12, p21S153D 또는 p21S160D를 발현하는 종양이 생성된 종양 마우스모델에서 측정된 종양의 크기를 나타내는 그래프 및 사진이다. 도 4b에서 보듯이, 종양의 크기는 p53 또는 p21의 발현억제 여부에 따라 별다른 차이를 나타내지 않았다.
4B is a graph and a photograph showing the size of tumor measured in a tumor mouse model in which tumors expressing p53 shRNA, p21, p21 ? C12 , p21 S153D or p21 S160D were generated. As shown in FIG. 4B, the size of the tumor did not show any significant difference depending on the inhibition of p53 or p21 expression.

또한, 상기 제작된 각각의 종양 마우스모델을 대상으로 종양의 혈류침투성을 분석하였다,In addition, the blood permeability of tumor was analyzed for each of the tumor mouse models prepared above.

구체적으로, 상기 제작된 각각의 종양 마우스모델을 2주동안 사육한 다음, 상기 마우스를 마취시키고, 심장을 천공하여 혈액을 수득하였으며, 수득한 혈액 0.2㎖와 RBC lysis buffer(Intron Biotech) 4㎖를 혼합하였다. 상기 혼합물을 원심분리(350 × g, 5 분)하여 세포를 수득하고, 수득한 세포를 PBS에 현탁시켰으며, DAPI로 염색한 다음, 공초점 현미경으로 분석하였다(도 4c). 이때, GFP-양성 및 DAPI-양성을 나타내는 세포를 혈류에 침투한 종양세포로 간주하였다.Specifically, each of the prepared tumor mouse models was cultivated for 2 weeks, the mice were anesthetized, and the heart was punctured to obtain blood, and 0.2 ml of the obtained blood and 4 ml of RBC lysis buffer (Intron Biotech) . The mixture was centrifuged (350 xg, 5 min) to obtain cells, and the obtained cells were suspended in PBS, stained with DAPI and analyzed by confocal microscopy (Fig. 4C). At this time, cells showing GFP-positive and DAPI-positive were regarded as tumor cells that penetrated into the bloodstream.

도 4c는 p53 shRNA, p21, p21Δ C12, p21S153D 또는 p21S160D를 발현하는 종양이 생성된 종양 마우스모델에서 측정된 종양의 혈류침투성을 분석한 결과를 나타내는 그래프 및 형광사진이다. 도 4c에서 보듯이, 야생형 p21을 발현하는 H460 세포가 이식된 종양 마우스모델은 종양의 혈류침투성이 매우 낮은 수준을 나타내었으나, p53의 발현이 억제되거나(p53 shRNA), 변이체 p21을 발현하는 H460 세포가 이식된 종양 마우스모델은 종양의 혈류침투성이 대조군보다도 매우 높은 수준을 나타냄을 확인하였다.FIG. 4C is a graph and fluorescence photograph showing the results of analysis of blood permeability of tumor measured in a tumor mouse model in which a tumor expressing p53 shRNA, p21, p21 ? C12 , p21 S153D or p21 S160D was generated. As shown in FIG. 4C, tumor model mice transplanted with wild-type p21 expressing H460 cells showed very low blood permeability of tumor, but the expression of p53 was suppressed (p53 shRNA) or H460 cells expressing mutant p21 Transplanted tumor mouse model showed that blood permeability of the tumor was much higher than that of the control group.

따라서, p53 및 p21은 생체내에서도 종양의 침윤을 억제하는 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
Therefore, it was found that p53 and p21 suppress the tumor invasion even in vivo.

실시예Example 5-3:  5-3: SlugSlug 분해에 미치는  On degradation 세포외Extracellular 자극의 효과 Effect of stimulation

Flag-Slug를 코딩하는 벡터가 도입된 H460 세포에 p53, p21 또는 Mdm2에 대한 siRNA를 추가로 도입하여, 각각의 형질전환된 H460 세포를 수득하였다. 상기 수득한 각각의 형질전환된 H460 세포를 48시간 동안 배양하고, 방사선(c-rays, 1 Gy)을 조사한 다음, 다시 4시간 동안 배양하였다. 배양이 종료된 후, 각각의 세포를 대상으로 웨스턴블럿 분석을 수행하였다(도 4d).SiRNA for p53, p21 or Mdm2 was further introduced into H460 cells into which a vector encoding Flag-Slug was introduced to obtain respective transformed H460 cells. Each of the transformed H460 cells obtained above was cultured for 48 hours, irradiated with c-rays (1 Gy), and then cultured again for 4 hours. After incubation, western blot analysis was performed on each cell (Fig. 4d).

도 4d는 Slug의 분해에 관여하는 p53, p21 또는 Mdm2의 발현이 억제된 폐암세포(H460)에서 방사선 조사에 따른, Slug의 분해에 미치는 효과를 분석한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다. 도 4d에서 보듯이, 정상적인 폐암세포에 방사선을 조사하면, p53, p21 및 Mdm2의 발현이 증가되고 이에 따라 Slug의 발현이 감소되었으나, p53, p21 또는 Mdm2의 발현이 억제된 폐암세포에는 방사선을 조사하여도 Slug가 분해되지 않음을 확인하였다.
FIG. 4D is a Western blot analysis image showing the effect of irradiation on the degradation of slug upon irradiation of lung cancer cells (H460) inhibiting the expression of p53, p21 or Mdm2 involved in the degradation of slug. As shown in FIG. 4D, when irradiated with normal lung cancer cells, the expression of p53, p21 and Mdm2 was increased and thus the expression of slug was decreased. However, lung cancer cells in which expression of p53, p21 or Mdm2 was inhibited were irradiated with radiation It was confirmed that the slug was not decomposed.

실시예Example 5-4:  5-4: SlugSlug 분해에 미치는  On degradation p53p53 과 and p21p21 의 상호작용 검증Verification of interaction

p53의 발현이 억제된 폐암세포(H1299)에 야생형 p53, p53의 DNA 결합능을 제거하여 전사촉진 활성이 소멸된 자연발생적 변이체 p53인 R273H 또는 p21을 코딩하는 벡터를 도입하여 각각의 형질전환된 H1299 세포를 수득하였다. 상기 수득한 각각의 형질전환된 H1299 세포를 대상으로 웨스턴블럿 분석을 수행하여, Slug, p53, p21 또는 Mdm2의 발현수준을 분석하였다(도 4e).The DNA binding ability of wild-type p53 and p53 was removed in lung cancer cells (H1299) in which expression of p53 was suppressed, and a vector encoding R273H or p21, which is a naturally occurring mutant p53, in which the transcriptional promoting activity has disappeared, was introduced into each transformed H1299 cell ≪ / RTI > Western blot analysis was performed on each of the transformed H1299 cells obtained above to analyze expression levels of Slug, p53, p21 or Mdm2 (Fig. 4E).

도 4e는 변이체 p53(R273H)을 발현하는 형질전환된 H1299 세포에서 p21의 과발현여부에 따른, Slug, p53, p21 또는 Mdm2의 발현수준을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다. 도 4e에서 보듯이, 정상적인 H1299세포는 Slug가 높은 수준으로 발현되고, p53, p21 및 Mdm2는 낮은 수준으로 발현되는 반면, 야생형 p53(WT)이 발현되는 H1299세포는 Slug가 낮은 수준으로 발현되고, p53, p21 및 Mdm2는 높은 수준으로 발현됨을 확인하였다. 또한, 변이체 p53(R273H)을 발현하는 H1299 세포는 정상적인 H1299 세포와 동일한 양상을 나타내었으나, 상기 변이체 p53(R273H)와 p21을 함께 발현하는 H1299 세포는 야생형 p53(WT)이 발현되는 H1299세포와 유사한 양상을 나타내었다.
FIG. 4E is a Western blot analysis image showing a comparison of expression levels of Slug, p53, p21 or Mdm2 according to overexpression of p21 in transformed H1299 cells expressing mutant p53 (R273H). As shown in FIG. 4E, normal H1299 cells express high levels of Slug, p53, p21 and Mdm2 are expressed at low levels, whereas H1299 cells expressing wild-type p53 (WT) p53, p21 and Mdm2 were expressed at high levels. In addition, H1299 cells expressing mutant p53 (R273H) showed the same pattern as normal H1299 cells, but H1299 cells expressing mutant p53 (R273H) and p21 together were similar to H1299 cells expressing wild-type p53 (WT) Respectively.

한편, 상기 수득한 각각의 형질전환된 H1299 세포에 MG132를 5시간 동안 처리한 후, 이의 세포파쇄물을 수득하고, 상기 세포파쇄물을 대상으로 항-Flag 비드를 이용한 면역침전을 수행하였다. 침전된 단백질을 대상으로 웨스턴블럿 분석을 수행함으로써, Slug, p53 및 p21의 수준을 비교하였다(도 4f). Meanwhile, MG132 was treated with each of the transformed H1299 cells obtained above for 5 hours, and cell lysates thereof were obtained. Immunoprecipitation with anti-Flag beads was performed on the cell lysates. Western blot analysis was performed on the precipitated proteins to compare the levels of Slug, p53 and p21 (Figure 4f).

도 4f는 변이체 p53(R273H)을 발현하는 형질전환된 H1299 세포에서 p21의 과발현여부에 따른 Slug의 유비퀴틴화 수준을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다. 도 4f에서 보듯이, 상기 변이체 p53(R273H)가 p21과 동시에 발현된 경우에는 Slug의 유비퀴틴화 수준이 야생형 p53을 처리한 것과 유사한 수준으로 증가됨을 확인하였다.
FIG. 4f is a Western blot analysis image showing the result of comparing the level of ubiquitination of Slug according to overexpression of p21 in transformed H1299 cells expressing mutant p53 (R273H). As shown in FIG. 4F, when the mutant p53 (R273H) was simultaneously expressed with p21, it was confirmed that the ubiquitination level of the slug was increased to a level similar to that of wild-type p53.

상기 결과를 종합하면, 상기 변이체 p53(R273H)는 DNA에 결합하지 못하여 전사인자로서의 역할을 수행하지 못함에도 불구하고, p21과 동시에 발현된 경우에, 야생형 p53(WT)과 유사한 효과를 나타내었는데, 이는 Slug 분해에 관여하는 p53이 유전자 수준이 아닌 단백질 수준에서 관여함을 시사하는 것으로 분석되었다.
As a result, the mutant p53 (R273H) did not bind to DNA and did not play a role as a transcription factor. However, when expressed at the same time as p21, it showed an effect similar to wild-type p53 (WT) This suggests that p53 involved in slug degradation is involved at the protein level rather than the gene level.

상술한 실시예 1 내지 5의 결과를 종합하면, 도 5에 도시된 바와 같이, p53과 p21이 암세포의 침윤을 억제할 수 있음을 알 수 있었다.As can be seen from the results of Examples 1 to 5, it can be seen that p53 and p21 can inhibit the infiltration of cancer cells, as shown in Fig.

도 5는 암세포의 침윤에 미치는 p53과 p21의 작용기작을 나타내는 개략도이다. 도 5에서 보듯이, p53과 p21은 Mdm2와 함께 Slug에 결합하여 복합체를 형성할 수 있고, 상기 복합체는 Slug의 유비퀴틴화를 촉진하며, 유비퀴틴화된 Slug는 프로테아좀에 의하여 분해됨으로써, 암세포의 침윤을 억제할 수 있다.5 is a schematic diagram showing the mechanism of action of p53 and p21 on invasion of cancer cells. As shown in FIG. 5, p53 and p21 can bind to Slug together with Mdm2 to form a complex, which promotes ubiquitination of Slug, and ubiquitinated Slug is degraded by proteasome, Invasion can be suppressed.

따라서, 상기 복합체의 형성을 촉진할 수 있는 물질이 있다면, 이는 암세포의 침윤을 억제하는 암전이 치료제로 이용될 수 있음을 뒷받침하는 것이다.
Therefore, if there is a substance capable of promoting the formation of the complex, it is supported that cancer metastasis suppressing invasion of cancer cells can be used as a therapeutic agent.

<110> KOREA INSTITUTE OF RADIOLOGICAL & MEDICAL SCIENCES <120> Method for screening agent against cancer metastasis using C-terminal region of p21 <130> KPA141227-KR <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 268 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant Slug <400> 1 Met Pro Arg Ser Phe Leu Val Lys Lys His Phe Asn Ala Ser Lys Lys 1 5 10 15 Pro Asn Tyr Ser Glu Leu Asp Thr His Thr Val Ile Ile Ser Pro Tyr 20 25 30 Leu Tyr Glu Ser Tyr Ser Met Pro Val Ile Pro Gln Pro Glu Ile Leu 35 40 45 Ser Ser Gly Ala Tyr Ser Pro Ile Thr Val Trp Thr Thr Ala Ala Pro 50 55 60 Phe His Ala Gln Leu Pro Asn Gly Leu Ser Pro Leu Ser Gly Tyr Ser 65 70 75 80 Ser Ser Leu Gly Arg Val Ser Pro Pro Pro Pro Ser Asp Thr Ser Ser 85 90 95 Lys Asp His Ser Gly Ser Glu Ser Pro Ile Ser Asp Glu Glu Glu Arg 100 105 110 Leu Gln Ser Lys Leu Ser Asp Pro His Ala Ile Glu Ala Glu Lys Phe 115 120 125 Gln Cys Asn Leu Cys Asn Lys Thr Tyr Ser Thr Phe Ser Gly Leu Ala 130 135 140 Lys His Lys Gln Leu His Cys Asp Ala Gln Ser Arg Lys Ser Phe Ser 145 150 155 160 Cys Lys Tyr Cys Asp Lys Glu Tyr Val Ser Leu Gly Ala Leu Lys Met 165 170 175 His Ile Arg Thr His Thr Leu Pro Cys Val Cys Lys Ile Cys Gly Lys 180 185 190 Ala Phe Ser Arg Pro Trp Leu Leu Gln Gly His Ile Arg Thr His Thr 195 200 205 Gly Glu Lys Pro Phe Ser Cys Pro His Cys Asn Arg Ala Phe Ala Asp 210 215 220 Arg Ser Asn Leu Arg Ala His Leu Gln Thr His Ser Asp Val Lys Lys 225 230 235 240 Tyr Gln Cys Lys Asn Cys Ser Lys Thr Phe Ser Arg Met Ser Leu Leu 245 250 255 His Lys His Glu Glu Ser Gly Cys Cys Val Ala His 260 265 <210> 2 <211> 393 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant p53 <400> 2 Met Glu Glu Pro Gln Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro Pro Leu Ser Gln 1 5 10 15 Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu 20 25 30 Ser Pro Leu Pro Ser Gln Ala Met Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp 35 40 45 Asp Ile Glu Gln Trp Phe Thr Glu Asp Pro Gly Pro Asp Glu Ala Pro 50 55 60 Arg Met Pro Glu Ala Ala Pro Pro Val Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro 65 70 75 80 Thr Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser Trp Pro Leu Ser Ser Ser 85 90 95 Val Pro Ser Gln Lys Thr Tyr Gln Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly 100 105 110 Phe Leu His Ser Gly Thr Ala Lys Ser Val Thr Cys Thr Tyr Ser Pro 115 120 125 Ala Leu Asn Lys Met Phe Cys Gln Leu Ala Lys Thr Cys Pro Val Gln 130 135 140 Leu Trp Val Asp Ser Thr Pro Pro Pro Gly Thr Arg Val Arg Ala Met 145 150 155 160 Ala Ile Tyr Lys Gln Ser Gln His Met Thr Glu Val Val Arg Arg Cys 165 170 175 Pro His His Glu Arg Cys Ser Asp Ser Asp Gly Leu Ala Pro Pro Gln 180 185 190 His Leu Ile Arg Val Glu Gly Asn Leu Arg Val Glu Tyr Leu Asp Asp 195 200 205 Arg Asn Thr Phe Arg His Ser Val Val Val Pro Tyr Glu Pro Pro Glu 210 215 220 Val Gly Ser Asp Cys Thr Thr Ile His Tyr Asn Tyr Met Cys Asn Ser 225 230 235 240 Ser Cys Met Gly Gly Met Asn Arg Arg Pro Ile Leu Thr Ile Ile Thr 245 250 255 Leu Glu Asp Ser Ser Gly Asn Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val 260 265 270 Arg Val Cys Ala Cys Pro Gly Arg Asp Arg Arg Thr Glu Glu Glu Asn 275 280 285 Leu Arg Lys Lys Gly Glu Pro His His Glu Leu Pro Pro Gly Ser Thr 290 295 300 Lys Arg Ala Leu Pro Asn Asn Thr Ser Ser Ser Pro Gln Pro Lys Lys 305 310 315 320 Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile Arg Gly Arg Glu 325 330 335 Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp 340 345 350 Ala Gln Ala Gly Lys Glu Pro Gly Gly Ser Arg Ala His Ser Ser His 355 360 365 Leu Lys Ser Lys Lys Gly Gln Ser Thr Ser Arg His Lys Lys Leu Met 370 375 380 Phe Lys Thr Glu Gly Pro Asp Ser Asp 385 390 <210> 3 <211> 164 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant p21 <400> 3 Met Ser Glu Pro Ala Gly Asp Val Arg Gln Asn Pro Cys Gly Ser Lys 1 5 10 15 Ala Cys Arg Arg Leu Phe Gly Pro Val Asp Ser Glu Gln Leu Ser Arg 20 25 30 Asp Cys Asp Ala Leu Met Ala Gly Cys Ile Gln Glu Ala Arg Glu Arg 35 40 45 Trp Asn Phe Asp Phe Val Thr Glu Thr Pro Leu Glu Gly Asp Phe Ala 50 55 60 Trp Glu Arg Val Arg Gly Leu Gly Leu Pro Lys Leu Tyr Leu Pro Thr 65 70 75 80 Gly Pro Arg Arg Gly Arg Asp Glu Leu Gly Gly Gly Arg Arg Pro Gly 85 90 95 Thr Ser Pro Ala Leu Leu Gln Gly Thr Ala Glu Glu Asp His Val Asp 100 105 110 Leu Ser Leu Ser Cys Thr Leu Val Pro Arg Ser Gly Glu Gln Ala Glu 115 120 125 Gly Ser Pro Gly Gly Pro Gly Asp Ser Gln Gly Arg Lys Arg Arg Gln 130 135 140 Thr Ser Met Thr Asp Phe Tyr His Ser Lys Arg Arg Leu Ile Phe Ser 145 150 155 160 Lys Arg Lys Pro <210> 4 <211> 444 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant Mdm2 <400> 4 Met Cys Asn Thr Asn Met Ser Val Pro Thr Asp Gly Ala Val Thr Thr 1 5 10 15 Ser Gln Ile Pro Ala Ser Glu Gln Glu Thr Leu Val Arg Pro Lys Pro 20 25 30 Leu Leu Leu Lys Leu Leu Lys Ser Val Gly Ala Gln Lys Asp Thr Tyr 35 40 45 Thr Met Lys Glu Val Leu Phe Tyr Leu Gly Gln Tyr Ile Met Thr Lys 50 55 60 Arg Leu Tyr Asp Glu Lys Gln Gln His Ile Val Tyr Cys Ser Asn Asp 65 70 75 80 Leu Leu Gly Asp Leu Phe Gly Val Pro Ser Phe Ser Val Lys Glu His 85 90 95 Arg Lys Ile Tyr Thr Met Ile Tyr Arg Asn Leu Val Val Val Asn Gln 100 105 110 Gln Glu Ser Ser Asp Ser Gly Thr Ser Val Ser Glu Asn Arg Cys His 115 120 125 Leu Glu Gly Gly Ser Asp Gln Lys Asp Leu Val Gln Glu Leu Gln Glu 130 135 140 Glu Lys Pro Ser Ser Ser His Leu Val Ser Arg Pro Ser Thr Ser Ser 145 150 155 160 Arg Arg Arg Ala Ile Ser Glu Thr Glu Glu Asn Ser Asp Glu Leu Ser 165 170 175 Gly Glu Arg Gln Arg Lys Arg His Lys Ser Asp Ser Ile Ser Leu Ser 180 185 190 Phe Asp Glu Ser Leu Ala Leu Cys Val Ile Arg Glu Ile Cys Cys Glu 195 200 205 Arg Ser Ser Ser Ser Glu Ser Thr Gly Thr Pro Ser Asn Pro Asp Leu 210 215 220 Asp Ala Gly Val Tyr Gln Val Thr Val Tyr Gln Ala Gly Glu Ser Asp 225 230 235 240 Thr Asp Ser Phe Glu Glu Asp Pro Glu Ile Ser Leu Ala Asp Tyr Trp 245 250 255 Lys Cys Thr Ser Cys Asn Glu Met Asn Pro Pro Leu Pro Ser His Cys 260 265 270 Asn Arg Cys Trp Ala Leu Arg Glu Asn Trp Leu Pro Glu Asp Lys Gly 275 280 285 Lys Asp Lys Gly Glu Ile Ser Glu Lys Ala Lys Leu Glu Asn Ser Thr 290 295 300 Gln Ala Glu Glu Gly Phe Asp Val Pro Asp Cys Lys Lys Thr Ile Val 305 310 315 320 Asn Asp Ser Arg Glu Ser Cys Val Glu Glu Asn Asp Asp Lys Ile Thr 325 330 335 Gln Ala Ser Gln Ser Gln Glu Ser Glu Asp Tyr Ser Gln Pro Ser Thr 340 345 350 Ser Ser Ser Ile Ile Tyr Ser Ser Gln Glu Asp Val Lys Glu Phe Glu 355 360 365 Arg Glu Glu Thr Gln Asp Lys Glu Glu Ser Val Glu Ser Ser Leu Pro 370 375 380 Leu Asn Ala Ile Glu Pro Cys Val Ile Cys Gln Gly Arg Pro Lys Asn 385 390 395 400 Gly Cys Ile Val His Gly Lys Thr Gly His Leu Met Ala Cys Phe Thr 405 410 415 Cys Ala Lys Lys Leu Lys Lys Arg Asn Lys Pro Cys Pro Val Cys Arg 420 425 430 Gln Pro Ile Gln Met Ile Val Leu Thr Tyr Phe Pro 435 440 <110> KOREA INSTITUTE OF RADIOLOGICAL & MEDICAL SCIENCES <120> Method for Screening Agent Against Cancer Metastasis using          C-terminal region of p21 <130> KPA141227-KR <160> 4 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 268 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant Slug <400> 1 Met Pro Arg Ser Phe Leu Val Lys Lys His Phe Asn Ala Ser Lys Lys   1 5 10 15 Pro Asn Tyr Ser Glu Leu Asp Thr His Thr Val Ile Ile Ser Pro Tyr              20 25 30 Leu Tyr Glu Ser Tyr Ser Met Pro Val Ile Pro Gln Pro Glu Ile Leu          35 40 45 Ser Ser Gly Ala Tyr Ser Pro Ile Thr Val Trp Thr Thr Ala Ala Pro      50 55 60 Phe His Ala Gln Leu Pro Asn Gly Leu Ser Pro Leu Ser Gly Tyr Ser  65 70 75 80 Ser Ser Leu Gly Arg Val Ser Pro Pro Pro Ser Ser Asp Thr Ser Ser                  85 90 95 Lys Asp His Ser Gly Ser Glu Ser Pro Ile Ser Asp Glu Glu Glu Arg             100 105 110 Leu Gln Ser Lys Leu Ser Asp Pro His Ala Ile Glu Ala Glu Lys Phe         115 120 125 Gln Cys Asn Leu Cys Asn Lys Thr Tyr Ser Thr Phe Ser Gly Leu Ala     130 135 140 Lys His Lys Gln Leu His Cys Asp Ala Gln Ser Arg Lys Ser Phe Ser 145 150 155 160 Cys Lys Tyr Cys Asp Lys Glu Tyr Val Ser Leu Gly Ala Leu Lys Met                 165 170 175 His Ile Arg Thr His Thr Leu Pro Cys Val Cys Lys Ile Cys Gly Lys             180 185 190 Ala Phe Ser Arg Pro Trp Leu Leu Gln Gly His Ile Arg Thr His Thr         195 200 205 Gly Glu Lys Pro Phe Ser Cys Pro His Cys Asn Arg Ala Phe Ala Asp     210 215 220 Arg Ser Asn Leu Arg Ala His Leu Gln Thr His Ser Asp Val Lys Lys 225 230 235 240 Tyr Gln Cys Lys Asn Cys Ser Lys Thr Phe Ser Arg Met Ser Leu Leu                 245 250 255 His Lys His Glu Glu Ser Gly Cys Cys Val Ala His             260 265 <210> 2 <211> 393 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant p53 <400> 2 Met Glu Glu Pro Gln Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro Pro Leu Ser Gln   1 5 10 15 Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu              20 25 30 Ser Pro Leu Pro Ser Gln Ala Met Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp          35 40 45 Asp Ile Glu Gln Trp Phe Thr Glu Asp Pro Gly Pro Asp Glu Ala Pro      50 55 60 Arg Met Pro Glu Ala Pro Pro Ala Pro Pro Ala Pro Pro Ala Pro Pro  65 70 75 80 Thr Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser Trp Pro Leu Ser Ser Ser                  85 90 95 Val Ser Ser Gln Lys Thr Tyr Gln Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly             100 105 110 Phe Leu His Ser Gly Thr Ala Lys Ser Val Thr Cys Thr Tyr Ser Pro         115 120 125 Ala Leu Asn Lys Met Phe Cys Gln Leu Ala Lys Thr Cys Pro Val Gln     130 135 140 Leu Trp Val Asp Ser Thr Pro Pro Gly Thr Arg Val Arg Ala Met 145 150 155 160 Ala Ile Tyr Lys Gln Ser Gln His Met Thr Glu Val Val Arg Arg Cys                 165 170 175 Pro His His Glu Arg Cys Ser Asp Ser Asp Gly Leu Ala Pro Pro Gln             180 185 190 His Leu Ile Arg Val Glu Gly Asn Leu Arg Val Glu Tyr Leu Asp Asp         195 200 205 Arg Asn Thr Phe Arg His Ser Val Val Val Pro Tyr Glu Pro Pro Glu     210 215 220 Val Gly Ser Asp Cys Thr Thr Ile His Tyr Asn Tyr Met Cys Asn Ser 225 230 235 240 Ser Cys Met Gly Gly Met Asn Arg Arg Pro Ile Leu Thr Ile Ile Thr                 245 250 255 Leu Glu Asp Ser Ser Gly Asn Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val             260 265 270 Arg Val Cys Ala Cys Pro Gly Arg Asp Arg Arg Thr Glu Glu Glu Asn         275 280 285 Leu Arg Lys Lys Gly Glu Pro His His Glu Leu Pro Pro Gly Ser Thr     290 295 300 Lys Arg Ala Leu Pro Asn Asn Thr Ser Ser Ser Pro Gln Pro Lys Lys 305 310 315 320 Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile Arg Gly Arg Glu                 325 330 335 Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp             340 345 350 Ala Gln Ala Gly Lys Glu Pro Gly Gly Ser Ser Ala His Ser Ser His         355 360 365 Leu Lys Ser Lys Lys Gly Gln Ser Thr Ser Arg His Lys Lys Leu Met     370 375 380 Phe Lys Thr Glu Gly Pro Asp Ser Asp 385 390 <210> 3 <211> 164 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant p21 <400> 3 Met Ser Glu Pro Ala Gly Asp Val Arg Gln Asn Pro Cys Gly Ser Lys   1 5 10 15 Ala Cys Arg Arg Leu Phe Gly Pro Val Asp Ser Glu Gln Leu Ser Arg              20 25 30 Asp Cys Asp Ala Leu Met Ala Gly Cys Ile Gln Glu Ala Arg Glu Arg          35 40 45 Trp Asn Phe Asp Phe Val Thr Glu Thr Pro Leu Glu Gly Asp Phe Ala      50 55 60 Trp Glu Arg Val Gly Leu Gly Leu Pro Lys Leu Tyr Leu Pro Thr  65 70 75 80 Gly Pro Arg Arg Gly Arg Asp Gly Leu Gly Gly Gly Arg Arg Pro Gly                  85 90 95 Thr Ser Pro Ala Leu Leu Gln Gly Thr Ala Glu Glu Asp His Val Asp             100 105 110 Leu Ser Leu Ser Cys Thr Leu Val Pro Arg Ser Gly Glu Gln Ala Glu         115 120 125 Gly Ser Pro Gly Gly Pro Gly Asp Ser Gln Gly Arg Lys Arg Arg Gln     130 135 140 Thr Ser Met Thr Asp Phe Tyr His Ser Lys Arg Arg Leu Ile Phe Ser 145 150 155 160 Lys Arg Lys Pro                 <210> 4 <211> 444 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant Mdm2 <400> 4 Met Cys Asn Thr Asn Met Ser Val Pro Thr Asp Gly Ala Val Thr Thr   1 5 10 15 Ser Gln Ile Pro Ala Ser Glu Gln Glu Thr Leu Val Arg Pro Lys Pro              20 25 30 Leu Leu Leu Lys Leu Leu Lys Ser Val Gly Ala Gln Lys Asp Thr Tyr          35 40 45 Thr Met Lys Glu Val Leu Phe Tyr Leu Gly Gln Tyr Ile Met Thr Lys      50 55 60 Arg Leu Tyr Asp Glu Lys Gln Gln His Ile Val Tyr Cys Ser Asn Asp  65 70 75 80 Leu Leu Gly Asp Leu Phe Gly Val Pro Ser Phe Ser Val Lys Glu His                  85 90 95 Arg Lys Ile Tyr Thr Met Ile Tyr Arg Asn Leu Val Val Val Asn Gln             100 105 110 Gln Glu Ser Ser Asp Ser Gly Thr Ser Val Ser Glu Asn Arg Cys His         115 120 125 Leu Glu Gly Gly Ser Asp Gln Lys Asp Leu Val Gln Glu Leu Gln Glu     130 135 140 Glu Lys Pro Ser Ser Ser His Leu Val Ser Arg Pro Ser Thr Ser Ser 145 150 155 160 Arg Arg Arg Ala Ser Glu Thr Glu Glu Asn Ser Asp Glu Leu Ser                 165 170 175 Gly Glu Arg Gln Arg Lys Arg His Lys Ser Asp Ser Ile Ser Leu Ser             180 185 190 Phe Asp Glu Ser Leu Ala Leu Cys Val Ile Arg Glu Ile Cys Cys Glu         195 200 205 Arg Ser Ser Ser Ser Glu Ser Thr Gly Thr Pro Ser Asn Pro Asp Leu     210 215 220 Asp Ala Gly Val Tyr Gln Val Thr Val Tyr Gln Ala Gly Glu Ser Asp 225 230 235 240 Thr Asp Ser Phe Glu Glu Asp Pro Glu Ile Ser Leu Ala Asp Tyr Trp                 245 250 255 Lys Cys Thr Ser Cys Asn Glu Met Asn Pro Pro Leu Pro Ser His Cys             260 265 270 Asn Arg Cys Trp Ala Leu Arg Glu Asn Trp Leu Pro Glu Asp Lys Gly         275 280 285 Lys Asp Lys Gly Glu Ile Ser Glu Lys Ala Lys Leu Glu Asn Ser Thr     290 295 300 Gln Ala Glu Glu Gly Phe Asp Val Pro Asp Cys Lys Lys Thr Ile Val 305 310 315 320 Asn Asp Ser Arg Glu Ser Cys Val Glu Glu Asn Asp Asp Lys Ile Thr                 325 330 335 Gln Ala Ser Gln Ser Gln Glu Ser Glu Asp Tyr Ser Gln Pro Ser Thr             340 345 350 Ser Ser Ile Ile Tyr Ser Ser Gln Glu Asp Val Lys Glu Phe Glu         355 360 365 Arg Glu Glu Thr Gln Asp Lys Glu Glu Ser Val Glu Ser Ser Leu Pro     370 375 380 Leu Asn Ala Ile Glu Pro Cys Val Ile Cys Gln Gly Arg Pro Lys Asn 385 390 395 400 Gly Cys Ile Val His Gly Lys Thr Gly His Leu Met Ala Cys Phe Thr                 405 410 415 Cys Ala Lys Lys Leu Lys Lys Arg Asn Lys Pro Cys Pro Val Cys Arg             420 425 430 Gln Pro Ile Gln Met Ile Val Leu Thr Tyr Phe Pro         435 440

Claims (16)

(a) 암전이 억제활성을 나타낼 것으로 예상되는 후보물질을 분리된 암세포를 포함하는 시료에 처리하는 단계; 및,
(b) 상기 암세포에서 Slug, p53, p21 및 Mdm2로 구성된 단백질 복합체의 함량을 측정하는 단계를 포함하는, 암전이 억제제의 스크리닝 방법.
(a) treating a candidate material suspected of exhibiting a suppression activity of cancer metastasis to a sample containing an isolated cancer cell; And
(b) measuring the content of a protein complex composed of Slug, p53, p21 and Mdm2 in said cancer cells.
제1항에 있어서,
(a) 단계에서, 상기 암세포는 침윤 또는 전이될 수 있는 폐암, 유방암, 대장암, 위암, 뇌암, 췌장암, 갑상선암, 피부암, 골수암, 림프종, 자궁암 및 자궁경부암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
The method according to claim 1,
wherein said cancer cell is selected from the group consisting of lung cancer, breast cancer, colon cancer, stomach cancer, brain cancer, pancreatic cancer, thyroid cancer, skin cancer, bone cancer, lymphoma, uterine cancer and cervical cancer which may be invasive or metastatic.
제1항에 있어서,
(b) 단계에서, 상기 단백질 복합체의 함량은 면역침전법, GST 융합단백질 침전법 또는 웨스턴블럿 분석법을 통하여 측정하는 것인 방법
The method according to claim 1,
wherein in step (b), the content of the protein complex is measured by an immunoprecipitation method, a GST fusion protein precipitation method, or a Western blot analysis method
제1항에 있어서,
(a) 단계와 (b) 단계 사이에, 암세포에 프로테아좀 억제제를 처리하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
The method according to claim 1,
wherein the method further comprises the step of treating the cancer cell with a proteasome inhibitor between steps (a) and (b).
제4항에 있어서,
상기 프로테아좀 억제제는 MG132인 것인 방법.
5. The method of claim 4,
Wherein said proteasome inhibitor is MG132.
제1항에 있어서,
(b) 단계에서 측정된 복합체의 함량이, 후보물질이 처리되지 않은 암세포에서 측정된 복합체의 함량보다 높은 수준을 나타낼 경우, 상기 후보물질이 암전이 억제활성을 갖는다고 판정하는 것인 방법.
The method according to claim 1,
wherein the candidate substance is determined to have an anti-metastatic activity when the content of the complex measured in step (b) is higher than the content of the complex measured in the cancer cell not treated with the candidate substance.
제1항에 있어서,
상기 복합체를 형성하지 못하는 변이된 암세포에 후보물질을 처리하고, 복합체의 함량을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
The method according to claim 1,
Further comprising the step of treating the candidate substance to mutated cancer cells which do not form the complex and measuring the content of the complex.
제7항에 있어서,
상기 변이된 암세포는 Slug, p53, p21 또는 Mdm2의 변이체를 발현시켜서 상기 복합체의 형성을 억제하는 것인 방법.
8. The method of claim 7,
Wherein said mutated cancer cells express mutants of Slug, p53, p21 or Mdm2 to inhibit the formation of said complex.
제8항에 있어서,
상기 변이체는 N-말단이 결실된 변이체 Slug, C-말단이 결실된 변이체 p53 또는 C-말단이 결실된 변이체 p21인 것인 방법.
9. The method of claim 8,
Wherein said mutant is a mutant Slug in which the N-terminal has been deleted, a mutant p53 in which the C-terminal has been deleted, or a mutant p21 in which the C-terminal has been deleted.
제8항에 있어서,
상기 변이체는 153번 또는 160번 세린이 결실되거나 또는 아스파르트산으로 치환된 형태의 변이체 p21인 것인 방법.
9. The method of claim 8,
Wherein said variant is a variant p21 in which the serine 153 or 160 is deleted or replaced with aspartic acid.
제7항에 있어서,
상기 후보물질이 처리된, 복합체를 형성하지 못하는 변이된 암세포에서 측정된 복합체의 함량이 후보물질이 처리되지 않은, 복합체를 형성하지 못하는 변이된 암세포에서 측정된 복합체의 함량보다 높은 수준을 나타낼 경우, 상기 후보물질이 위양성 암전이 억제활성을 갖는다고 판정하는 것인 방법.
8. The method of claim 7,
When the content of the complex measured in the mutated cancer cells in which the candidate substance has been treated does not form a complex shows a level higher than the content of the complex in the mutated cancer cells in which the candidate substance is not treated and does not form a complex, Wherein the candidate substance is determined to have a false positive metastasis inhibitory activity.
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