KR101543297B1 - 아스퍼질러스 니둘란스의 이수산화효소에 의한 5,8-이수산화 리놀레익산의 고수율 제조방법 및 그에 필요한 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 5,8-이수산화 리놀레익 산(5,8-Dihydroxylioleic acid)의 생산방법 및 그 조성물에 관한 것으로 산물의 정확한 명칭은 5,8-dihydroxy-9,12(Z,Z)-octadecadienoic acid이며, 더욱 상세하게는 아스퍼질러스 니둘란스( Aspergillus nidulans) 균 유래의 이수산화 합성효소(Diol synthase)를 이용하여 리놀레익산 (linoleic acid) 반응조건을 최적화하고 최적화된 조건에서 반응시켜 5,8-이수산화 리놀레익 산을 고 수율로 생산하는 방법 및 그에 필요한 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 높은 특이성과 친환경적인 방법으로 5,8-이수산화 리놀레익 산을 높은 수율로 생산할 수 있으며, 이렇게 생산된 5,8-이수산화 리놀레익 산은 다양한 산업분야의 원료물질로 사용될 수 있다.

Description

아스퍼질러스 니둘란스의 이수산화효소에 의한 5,8-이수산화 리놀레익산의 고수율 제조방법 및 그에 필요한 조성물 {Method for the production of 5,8-dihydroxylinoleic acid by diol synthase from Aspergillus nidulans and composition therefor}

본 발명은 5,8-이수산화 리놀레익 산(5,8-Dihydroxylioleic acid)의 생산방법 및 그에 필요한 조성물에 관한 것으로 산물의 정확한 명칭은 5,8-dihydroxy-9,12(Z,Z)-octadecadienoic acid이며, 더욱 상세하게는 아스퍼질러스 니둘란스( Aspergillus nidulans ) 균 유래의 이수산화 합성효소(Diol synthase)를 이용하여 리놀레익산 (linoleic acid) 반응조건을 최적화하고 최적화된 조건에서 반응시켜 5,8-이수산화 리놀레익 산을 고 수율로 생산하는 방법 및 그에 필요한 조성물에 관한 것이다.

수산화 지방산은 자연계에 존재하는 물질로서 트리글리세롤, 왁스, 세레브로시드, 그밖에 식물이나 곤충 그리고 미생물에 존재하는 지질 등에서 발견 된다. 미생물과 효소가 불포화 지방산을 생물학적인 전환을 통하여 생산하는 수산화 지방산은 수산화, 이수산화 그리고 삼수산화 지방산의 세 가지 유형이 있다. 수산화 지방산은 향료를 구성하는 락톤 (Lactone)의 전구체로서 중요한 산업적인 물질이며, 다른 하이드록시 지방산이 아닌 지방산에 비하여 반응성이 좋기 때문에 레진, 왁스, 나일론, 플라스틱, 윤활제 그리고 코팅제의 시작 물질로 사용되고 화장품 원료로도 사용된다.

또한 이수산화 합성효소의 경우 아스퍼질러스 유래의 곰팡이에서 발견되는 효소로 2가지의 도메인으로 구성되어 있는 효소이다. 그에 따른 기작은 첫 번째 도메인에 의하여 리놀레익 산으로부터 8-수산화 리놀레익 산 (8-Hydroxylinoleic acid)을 생성한 뒤 두 번째 도메인에 의하여 5,8-이수산화 리놀레익 산을 생성하게 된다.

기존에 5,8-이수산화 리놀레익 산을 생성하는 미생물로는 아스퍼질러스 니둘란스 (Aspergillus nidulans), 아스퍼질러스 푸미가투스 (Aspergillus fumigatus), 아스퍼질러스 나이거 (Aspergillus niger), 아스퍼질러스 클라바투스 (Aspergillus clavatus), 아스퍼질러스 테레우스 (Aspergillus terreus)가 있고 효소로는 이수산화 합성효소가 있지만 이들 미생물과 효소로는 5,8-이수산화리놀레익 산 생성을 양이 극히 미량으로 정성적인 확인만 하였고 5,8-이수산화 리놀레익 산의 전구물질인 8-수산화 리놀레익 산을 제외한 여러 가지의 부산물이 같이 생성되어 산업화와는 거리가 있다. 그러므로 5,8-이수산화 리놀레익 산을 정량적으로 생산한 경우가 없고 이수산화 합성효소의 재조합 미생물을 사용하여 5,8-이수산화 리놀레익 산의 생산성을 높인 경우는 지금까지 보고되지 않고 있다.

[선행 특허문헌]

대한민국특허공개번호제1020080097122

본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 5,8-이수산화 리놀레익 산의 생물학적 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 5,8-이수산화 리놀레익 산의 생물학적 제조용 조성물을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 불포화지방산으로부터 이수산화 지방산을 생산하는 효소와 기질을 반응하여 생물 전환으로 5,8-이수산화 리놀레익 산 (5,8-dihydroxylinoleic acid, 5,8-dihydroxy-9,12(Z,Z)-octadecadienoic acid)을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서,상기 불포화지방산으로부터 이수산화 지방산을 생산하는 효소는 이수산화 합성효소인 것이 바람직하고, 상기 이수산화 합성효소는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 것이 바람직하나 해당 서열에 하나 이상의 돌연변이를 통하여 본 발명의 목적하고자 하는 효과를 달성하는 모든 돌연변이체도 본 발명의 보호범위에 포함된다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서,상기 기질은 리놀레익 산 (linoleic acid)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 이수산화 합성효소 (diol synthase)의 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 리놀레익 산과 반응하여 5,8-이수산화 리놀레익 산 (5,8-dihydroxylinoleic acid, 5,8-dihydroxy-9,12(Z,Z)-octadecadienoic acid)을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 방법은 유기 용매를 첨가하여 진행하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 이수산화 합성 효소를 유효성분으로 포함하는 5,8-이수산화 리놀레익 산 (5,8-dihydroxylinoleic acid, 5,8-dihydroxy-9,12(Z,Z)-octadecadienoic acid) 제조용 조성물을 제공한다.

또 본 발명은 이수산화 합성 효소를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 5,8-이수산화 리놀레익 산 (5,8-dihydroxylinoleic acid, 5,8-dihydroxy-9,12(Z,Z)-octadecadienoic acid) 제조용 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명자들은 불포화지방산인 리놀레익 산을 수산화 이수산화 지방산으로 전환할 수 있는 효소를 조사하였고, 8-수산화 리놀레익 산을 제외한 부산물 없이 5,8-이수산화 리놀레익 산을 고수율로 생산할 수 있는 효소를 선택하였다.

아스퍼질러스 니둘란스 (Aspergillus nidulans )로부터 유래한 이수산화 합성 유전자를 구축하고 이를 이용하여 이수산화 합성효소를 대량으로 제조하였고 효소를 사용하여 친환경적인 과정으로 부산물의 생성 없이 5,8-이수산화 리놀레산을 고 수율로 얻는 최적 반응 조건을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 이수산화 합성효소(diol synthase)를 5,8-이수산화 리놀레익 산 (5,8-dihydroxylinoleic acid) 생산에 사용하는 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 5,8-이수산화 리놀레익 산(5,8-dihydroxylinoleic acid)의 생산에 사용되는 이수산화 합성효소 (diol synthase)의 유전자를 지닌 재조합 미생물을 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 기질로서 리놀레익 산 (linoleic acid)를 사용하여 5,8-이수산화 리놀레익 산을 제조하는 것이 가능한 아스퍼질러스 니둘란스 (Aspergillus nidulans ) 균주로부터 유래한 이수산화 합성효소를 제공한다.

또한, 본 발명은 이수산화 합성효소를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 아스퍼질러스 니둘란스 (Aspergillus nidulans ) 균주로부터 유래하고 이수산화 합성효소 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터 pET 21a(+)/이수산화 합성효소를 제공한다.

또한, 본 발명은 다이올 수산화 합성효소를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환된 미생물을 제공한다. 아스퍼질러스 니둘란스 (Aspergillus nidulans ) 균주로부터 유래한 이수산화 합성효소 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 대장균 이알(ER) 2566 pET 21a(+)/이수산화 합성효소를 제공한다.

본 발명에 있어서, 재조합 발현 벡터를 5,8-이수산화 리놀레익 산의 생산에 사용될 수 있는 것이라면 발현 벡터 pET-21a(+)를 포함하여 유전자 재조합 방법에 이용되는 벡터라면 모두 사용 가능하고, 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환되는 미생물로는 대장균 ER 2566을 사용하는 것이 바람직하나 재조합 발현 벡터로 형질전환 되어 목적하는 유전자를 과발현하고 활성이 있는 효소 단백질을 생산할 수 있는 균주라면 어느 것이라도 사용가능하다.

또한, 본 발명은 (1) 이수산화 합성효소 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제작하고; (2) 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환 된 미생물을 배양하고; (3) 상기 이수산화 합성효소 유전자의 발현을 유도하여 (4) 발현된 재조합 단백질과 이를 포함한 효소의 제조방법을 제공한다.

배양된 이수산화 합성효소를 이용하여 5,8-이수산화 리놀레익 산을 고 수율로 얻는 생산방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 부산물의 생성 없이 5,8-이수산화 리놀레익 산만을 선별적으로 합성할 수 있는 상기 이수산화 합성효소를 이용한 5,8-이수산화 리놀레익 산의 생산방법을 제공한다.

상기 이수산화 합성효소는 상기와 같이 이수산화 합성효소 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환 된 대장균을 배양하여 재조합 효소 유전자의 발현을 유도한 다음 발현된 단백질을 회수하여 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 기질로서 지방산을 사용하는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 리놀레익 산(linoleic acid)를 사용하는 것이 좋다. 또한, 상기 기질의 농도는 1 g/ℓ 내지 7 g/ℓ 의 농도가 바람직하고 5g/ℓ 내외가 더욱 바람직하다.

또한, 상기 효소 반응은 pH 7.0 내지 8.0의 범위에서 이루어지는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 pH 7.5 내외 범위에서 이루어지는 것이 좋다.

또한, 상기 효소 반응은 온도 20℃ 내지 40℃ 범위에서 이루어지는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 35℃ 내외의 온도 범위에서 이루어지는 것이 좋다.

또한, 상기 효소 반응의 시간을 통상적인 방법에 따라 적절히 조절할 수 있다.

본 발명은 이수산화 합성효소 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터, 발현된 단백질을 이용하여 5,8-이수산화 합성효소 리놀레익 산을 고수율로 얻는 생산방법을 제공하는 효과가 있다.

본 발명의 아스퍼질러스 니둘란스 (Aspergillus nidulans) 로부터 유래한 다이올 수산화 합성효소는 높은 특이성과 친환경적인 방법으로 산업품의 원료 물질인 5,8-이수산화 리놀레익 산을 현재까지 보고된 논문들보다도 높은 고 수율과 다른 부산물 없이 생산할 수 있다.

또한, 본 발명은 아스퍼질러스 니둘란스 유래의 다이올 수산화 합성효소를 이용하여 나일론, 레진, 왁스, 천연계면활성제 등 여러 가지 산업분야의 시작물질로 사용되는 하이드록시 지방산을 대량 생산하는 방법에 관한 것으로, 기질은 리놀레익 산을 사용하고 아스퍼질러스 니둘란스 유래의 다이올 수산화 합성효소를 이용하여 재조합 세포 농도 및 온도 및 pH를 조절하여 특이적으로 5,8-이수산화 리놀레익 산을 높은 수율로 생산할 수 있으므로, 종래 화학적인 방법과 비교하여 환경 친화적인 조건으로 극복할 뿐만 아니라 식물체 및 오일에 다량 함유된 불포화 지방산을 원료로 사용하여 생물전환 공정에서도 생산 비용을 효과적으로 절감시키면서 생산 효율을 극대화시킬 수 있으며, 특이적으로 15,8-이수산화 리놀레익 산만을 고수율, 고 생산성으로 얻을 수 있다.

도 1a는 본 발명의 다이올 수산화 합성효소의 pH가 5,8-다이하이드록시 리놀레익 산 생산 활성에 미치는 영향을 나타낸 것이고 (●:HEPES buffer, ○:EPPSbuffer), 도 1b는 이수산화 합성효소의 온도가 5,8-다이하이드록시 리놀레익 산 생산 활성에 미치는 영향을 나타낸 것이고, 도 1c는 다이올 수산화 합성효소의 5,8-다이하이드록시 리놀레익 산 생산 활성에 미치는 열안정성을 나타낸 것이다.
도 2a는 본 발명의 이수산화 합성효소의 5,8-이수산화 리놀레익 산 생산에 있어 유기용매의 종류를, 도2b는 유기용매의 농도에　따른 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 이수산화 합성효소의 5,8-이수산화 리놀레익 산을 생산하는데 있어 최적의 교반 속도를 나타낸 것이다.
도 4a는 본 발명의 이수산화 합성효소의 5,8-이수산화 리놀레익 산을 생산하는데 있어서 최적의 재조합 세포 농도를, 도 4b는 기질의 농도 (● : 5,8-이수산화 리놀레익 산, ○:전환율) 를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 아스퍼질러스 니둘란스 (Aspergillus nidulans ) ATCC 10074 유래의 이수산화 합성효소를 이용한 5,8-이수산화 리놀레익 산의 시간별 생산량을 나타낸 것이다. (● : 5,8-이수산화 리놀레익 산 ○: 리놀레익 산)

이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 지방산업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 이수산화 합성효소 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터 및 단백질의 제조

본 발명의 이수산화 합성효소 유전자를 제조하기 위하여, 아스퍼질러스 니둘란스(Aspergillus nidulans ) 균주로부터 유래한 이수산화 합성효소 유전자를 먼저 분리하였다.

구체적으로, 유전자 염기서열과 아미노산 서열이 이미 특정되어 있는 아스퍼질러스 니둘란스(Aspergillus nidulans ) ATCC 10074와 같은 strain 번호인 KACC 41876에서 구입하여 균주를 선별하고, 이로부터 유래한 다이올 수산화 합성효소의 DNA 염기서열을 기초로 하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하기 위하여 아스퍼질러스 니둘란스(Aspergillus nidulans ) total RNA를 추출(GeneAll사 제품) 및 cDNA를 합성(TakaRa)하여 이를 PCR의 주형으로 사용하였다. 또한 유전자 크기가 큰 다이올 수산화 합성효소의 재조합 벡터를 만들기 위하여 Gibson assembly method을 이용하여 다이올 수산화 합성효소의 DNA 염기서열을 기초로 한 프라이머(primer)를 고안하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하였으며, 재조합 플라스미드 벡터 pET 21a(+) (Novagen사 제품) 또한 중합효소 연쇄반응을 실시하여 제한효소없이 ligation하여 pET 21(+)a/다이올 수산화 합성효소를 제작하였다.

상기와 같이 얻은 재조합 발현벡터는 통상적인 형질전환 방법에 의하여 New England Biolabs (Hertfordshire, UK)에서 구매한 대장균 ER 2566 균주에 형질 전환하고, 상기 형질전환 된 미생물은 20% 글리세린(glycerine) 용액을 첨가하여 5,8-이수산화 리놀레익 산의 생산을 위한 배양을 실시하기 전에 70℃에 냉동 보관하였다.

실시예 2. 이수산화 합성효소의 제조 및 회수

효소의 단백질 발현을 위한 재조합 E. coli는 500 ml의 LB(Difco, Sparks, MD, USA) 배지와 50 μg/ml의 카나마이신을 가지는 플라스크에서 200 rev/min의 통기조건 하에서 37℃에서 배양하였다. 박테리아의 흡광도가 600 nm에서 0.6에서 0.8에 도달할 때, 이수산화 합성효소 발현을 유도하기 위하여 최종농도 0.1 mM IPTG를 첨가한 후 그 배양액을 12시간 동안 16℃에서 150 rev/min로 교반하면서 배양하였다.

배양된 이수산화 합성효소를 포함하는 대장균 세포를 모아서 사용하였다. 또한, 상기와 같이 과발현되어 생산된 이수산화 합성효소는 상기 형질전환된 균주의 배양액을 6,000xg로 4℃에서 30분 동안 원심분리하여 0.85% 염화나트륨(NaCl)으로 두 번 세척한 다음 5,8-이수산화 리놀레익 산을 생산하기 위한 재조합 세포로 사용하였다.

실시예 3. 이수산화 합성효소의 pH 가 5,8- 이수산화 리놀레익 산 생산 활성에 미치는 영향

상기 이수산화 합성효소의 5,8-이수산화 리놀레익 산 생산에 대한 pH 효과를 조사하기 위하여, 기질로서 0.28 g/L 리놀레익 산에 대하여 50 mM 헤페스 (HEPES buffer, pH 6.0-8.0), 이피피에스 (EPPS buffer, pH 8.0-8.5) 완충용액에서 10분 동안 재조합 전세포(whole cell) 반응을 실시하였다. 그 결과, 도 1a에 나타난 바와 같이, 최적 pH는 7.5인 것을 알 수 있었다.

실시예 4. 이수산화 합성효소의 온도가 5,8- 이수산화 리놀레익 산 생산 활성에 미치는 영향

상기 다이올 수산화 합성효소의 5,8-이수산화 리놀레익 산 생산에 대한 온도 효과를 조사하기 위하여, 0.28 g/L 리놀레익 산에 대하여 50 mM 헤페스 완충용액(HEPES buffer) pH 7.5에서 10-65℃ 까지 온도에서 각각 10분 동안 반응을 실시하였다.

그 결과, 도 1b에 나타난 바와 같이, 최적 온도는 35℃인 것을 알 수 있었다.

실시예 5. 이수산화 합성효소로부터 5,8- 이수산화 리놀레익 산 생산 활성에 미치는 열안정성

상기 이수산화 합성효소의 5,8-이수산화 리놀레익 산 생산에 대한 열안정성을 조사하기 위하여, 0.14 g/L 리놀레익 산에 대하여 50mM HEPES 완충용액(HEPES buffer) pH 7.5에서 20-50℃까지 3시간 동안 방치 한 뒤 최적 온도인 35 ℃에서 10분간 반응을 실시하였다.

그 결과, 도 1c에 나타난 바와 같이, 3시간 방치 후에도 80%이상의 활성을 유지하는 것을 확인하였다.

실시예 6. 이수산화 합성효소의 유기용매 종류 및 농도에 따른 생물 전환 활성 조사

본 발명은 아스퍼질러스 니둘란스 유래의 이수산화 합성효소를 이용하여 리놀레익 산으로부터 5,8-이수산화 리놀레익 산을 생산하는 활성을 조사하기 위하여, 상기 실시 예 2와 동일한 과정으로 세포를 준비하여 반응에 사용하였다.

유기용매 종류의 효과를 조사하기 위하여 반응은 에탄올, 메탄올, 다이메틸 설폭사이드, 아세톤, 에틸 아세테이트, 헥산, 아이소 옥탄을 선정하여 0.14 g/ℓ 리놀레익 산과 0.66 g/ℓ의 재조합 세포를 함유한 50 mM HEPES 완충용액을 pH 7.5 조건에서 각각 10분 동안 반응시켰으며, 이 때 반응액 양과 같은 양의 에틸 아세테이트를 반응을 종료시킨 다음 5,8-다이하이드록시 리놀레익 산의 생산량을 측정하여 그 상대적인 결과를 도 2a에 타내었고 다이메틸 설폭사이드가 가장 최적임을 확인하였다.

다이메틸 설폭사이드의 농도별 효과를 조사하기 위하여 0 %에서 30 %까지 범위에서 0.14 g/ℓ 리놀레익 산과 0.66 g/ℓ의 제조합 세포를 함유한 50 mM HEPES 완충용액을 pH 7.5 조건에서 각각 10분 동안 반응시켰으며 에틸 아세테이트를 이용하여 반응을 종료한 후 5,8-이수산화 리놀레익 산의 생산량을 측정하여 상대적인 결과를 도 2b에 나타냈고 다이메틸 설폭사이드 20 % 가 가장 최적임을 확인하였다.

실시예 7. 교반속도에 따른 이수산화 합성효소의 5,8- 이수산화 리놀레익 산 생산성 조사

본 발명은 아스퍼질러스 니둘란스 유래의 이수산화 합성효소를 이용하여 리놀레익 산으로부터 5,8-이수산화 리놀레익 산을 고 수율로 생산하기 위하여 교반속도에 따라 생성되는 5,8-이수산화 리놀레익 산의 생산량을 측정하기 위하여 재조합 세포 16.5 g/l, 리놀레익 산 5 g/l, 20% 다이메필 설폭사이트, 50 mM HEPES 완충용액 pH 7.5, 35 ℃에서 교반속도 0부터 300 rpm까지 변화를 주어 반응을 진행하였다.

그 결과, 교반속도 250 rpm에서 가장 높은 전환율을 보였으며 교반을 하지 않았을 때 보다 약 30배 정도 높은 전환율을 보였다. (도 3)

실시 예 8. 이수산화 합성효소의 농도 및 리놀레익 산의 농도 변화에 생물 전환 활성 조사

본 발명은 아스퍼질러스 니둘란스 유래의 이수산화 합성효소를 이용하여 리놀레익 산으로부터 5,8-이수산화 리놀레익 산의 생산량을 조사하기 위하여, 상기 실시 예 2와 동일한 과정으로 재조합 세포를 준비하였다.

본 발명에서는 아스퍼질러스 니둘란스 유래의 다이올 수산화 합성효소를 이용하여 리놀레익 산으로부터 기존의 전환과 비교하였을 때 가장 높은 5,8-이수산화 리놀레익산의 생산률을 보이는 조건을 조사하기 위하여, 다양한 재조합 세포농도 및 기질농도 조건에서 재조합 세포와 기질을 반응시키고 5,8-이수산화 리놀레익산의 생산량을 비교하였다.

먼저 아스퍼질러스 니둘란스 유래의 다이올 수산화 합성효소의 농도에 따른 효과를 조사하기 위하여, 5 g/ℓ 리놀레익 산과 20 % 다이메틸 설폭사이드 및 pH 7.5, 50 mM HEPES 완충용액에서 3 g/ℓ에서부터 30 g/ℓ의 범위의 재조합 세포 농도로 250 rpm에서 반응시켰다. 상기의 반응양은 2.5 ㎖으로 50 ㎖의 플라스틱용기에서 이루어졌다. 이 때 반응 온도는 35 ℃이고, 반응 시간은 60분으로 조정하였다. 그 다음 5 ㎖의 에틸아세테이트를 첨가하여 반응을 종료하고, 생산된 5,8-다이하이드록시 리놀레익산의 양을 측정하여 그 결과를 도 3에 나타내었고 23 g/ℓ의 재조합 세포 농도에서 최대전환을 보였다. (도 4a)

리놀레익 산의 농도에 따른 효과를 조사하기 위하여 반응은 리놀레익 산의 농도 1 g/ℓ에서 12 g/ℓ까지의 범위에서 23 g/ℓ 재조합 세포, 20% 다이메틸 설폭사이드을 함유한 50 mM HEPES 완충용액을 pH 7.5, 250 rpm 조건에서 반응시켰으며, 이 때 5 ㎖의 에틸아세테이트를 첨가하여 반응을 종료시킨 다음 5,8-다이하이드록시 리놀레익산 생산량을 측정하여 5 g/l 까지 95 % 전환됨을 확인하였다.

도 4b는 본 발명의 pH 7.5 및 35 ℃의 조건에서 아스퍼질러스 니둘란스 유래의 다이올 수산화 합성효소를 이용하여 리놀레익 산 농도에 따른 5,8-이수산화 리놀레익산의 생산량을 확인하여 생산량을 나타낸 것이다.

실시예 9. 이수산화 합성효소를 이용한 5,8- 이수산화 리놀레익산의 생산

본 발명의 아스퍼질러스 니둘란스 유래의 이수산화 합성효소를 이용한 5,8-이수산화 리놀레익산의 생산성을 확인하기 위하여, 재조합 세포의 최적 pH 7.5, 온도35℃, 250 rpm에서 5 g/ℓ의 올레산을 기질로 하여 5,8-이수산화 리놀레익산의 시간별 생산량을 측정하였다.

그 결과, 5 g/ℓ의 5,8-이수산화 리놀레익산을 생산하여 시간당 2 g/ℓ의 생산성과 95%의 전환수율을 나타내었다.(도 5)

이상, 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 지방산업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구 항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> KONKUK UNIVERSITY INDUSTRIAL COOPERATION CORP. <120> Method for the production of 5,8-dihydroxylinoleic acid by diol synthase from Aspergillus nidulans and composition therefor <130> HY131318 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1080 <212> PRT <213> Aspergillus nidulans <400> 1 Met Gly Glu Asp Lys Glu Thr Asn Ile Leu Ala Gly Leu Gly Asn Thr 1 5 10 15 Ile Ser Gln Val Glu Asn Val Val Ala Ala Ser Leu Arg Pro Leu Pro 20 25 30 Thr Ala Thr Gly Asp Gly Thr Tyr Val Ala Glu Ser Thr Gln Thr Gly 35 40 45 Leu Ala Lys Asp Leu Ser His Val Asp Leu Lys Asp Val Arg Thr Leu 50 55 60 Ala Glu Val Val Lys Ser Ala Ala Thr Gly Glu Pro Val Asp Asp Lys 65 70 75 80 Gln Tyr Ile Met Glu Arg Val Ile Gln Leu Ala Ala Gly Leu Pro Ser 85 90 95 Thr Ser Arg Asn Ala Ala Glu Leu Thr Lys Ser Phe Leu Asn Met Leu 100 105 110 Trp Asn Asp Leu Glu His Pro Pro Val Ser Tyr Leu Gly Ala Asp Ser 115 120 125 Met His Arg Lys Ala Asp Gly Ser Gly Asn Asn Arg Phe Trp Pro Gln 130 135 140 Leu Gly Ala Ala Gly Ser Ala Tyr Ala Arg Ser Val Arg Pro Lys Thr 145 150 155 160 Met Gln Ser Pro Ser Leu Pro Asp Pro Glu Thr Ile Phe Asp Cys Leu 165 170 175 Leu Arg Arg Lys Glu Tyr Arg Glu His Pro Asn Lys Ile Ser Ser Val 180 185 190 Leu Phe Tyr Leu Ala Ser Ile Ile Ile His Asp Leu Phe Gln Thr Asp 195 200 205 Pro Lys Ile Ile Pro Cys Pro Arg His Arg His Ile Trp Thr Ser His 210 215 220 Leu Cys Met Ala Ile Ile Lys Thr Ser Arg Thr Leu Phe Val Arg Ser 225 230 235 240 Arg Met Glu Ser Leu Ser Gln Ile Val Ser Leu Pro Ser Glu Cys Trp 245 250 255 Ala Phe Leu Pro Ala Ser Ala Phe Tyr Glx Ser Cys Ser Thr Ala Ser 260 265 270 Thr Thr Met Trp Leu Ile Asn Trp Arg Arg Ser Thr Asn Ala Ala Asp 275 280 285 Ser Pro Asn Leu Thr Ser Pro Thr Leu Met Ser Met Leu Asn Thr Ile 290 295 300 Thr Ile Ser Ser Lys Pro Gly Asp Trp Glx Leu Val Gly Cys Thr Gln 305 310 315 320 Ile Leu Ser Glx Lys Ile Met Ser Glu Arg Phe Glx Ile Glx Thr Gly 325 330 335 Gln Ile Ala Pro Gly Val Trp Thr Pro Glu Trp Lys Glx Arg Met Val 340 345 350 Tyr Glx Val Lys Gln Gln Gln Trp Gln Pro Gly Thr Arg Cys Gln Pro 355 360 365 Asn Leu Met Ser Cys Thr Gly Gly Thr Leu Ala Phe Pro Ser Ala Met 370 375 380 Lys Asn Gly Gln Arg Ile Phe Thr Val Lys Ser Cys Arg Glu Trp Ile 385 390 395 400 Gln Ala His Tyr Arg Cys Lys Ile Leu Ser Arg Val Leu Asp Gly Gly 405 410 415 Arg Gln Asp Ser His Lys Ser His Leu Ser Ala His Ser Leu Ala Tyr 420 425 430 Ser Val Ser Arg Thr Val His Ser Thr Thr Met Thr Trp Leu Ile Cys 435 440 445 Leu Arg Arg Val Leu Lys Thr Ala Gln Val His Leu Val Arg Leu Thr 450 455 460 Phe Gln Pro Ser Ser Arg Ala Leu Lys Leu Ser Val Glx Cys Arg Leu 465 470 475 480 Gly Asp Gly Thr Trp Glu Arg Ser Met Ser Ser Ala Asn Ile Ser Ile 485 490 495 Trp Leu Leu Ile Arg Pro Leu Arg Ile Ser Thr Pro Ile Arg Thr Leu 500 505 510 Arg Ile Ser Ser Ser Asp Cys Met Ile Ile Gln Ile Leu Trp Arg Phe 515 520 525 Thr Leu Val Leu Leu Trp Lys Lys Pro Lys Thr Pro Trp Ser Leu Glu 530 535 540 Ala Ala Phe Ala Arg Thr Ser Leu Tyr Pro Gly Gln Ser Phe Arg Met 545 550 555 560 Arg Trp His Trp Phe Ala Val Ile Asp Phe Thr Leu Ser Thr Thr Leu 565 570 575 Arg Ser Thr Leu Arg Ile Gly Pro Thr Thr Arg Phe Ser Leu Thr Thr 580 585 590 Pro Ser Ile Lys Val Arg Tyr Ser Thr Ser Trp Phe Phe Ala His Ser 595 600 605 Gln Thr Ile Leu Met Glu Ile Leu Ser Met Leu Ile Ser Pro Leu Ser 610 615 620 Phe Pro Arg Lys Met Arg Lys Tyr Glx Arg Ala Leu Gly Leu Pro Arg 625 630 635 640 Ser Ile Ala Gly Lys Ser Pro Val Val Ser Leu Ile Arg Phe Ser Ser 645 650 655 Ala Leu Met Pro Arg Ala Cys Pro Ser Ser Lys Ile Lys Lys Arg Ser 660 665 670 Arg Glx Leu Gly Val Gly Arg Leu Ser Ser Leu Cys Asn Ala Ile Ser 675 680 685 Thr Asn Thr Gly Arg Thr Ser Cys Cys Leu Glu Thr Gly His Pro Thr 690 695 700 Leu His Arg Ala Arg Glx Trp Val Pro Pro Cys Ile Ala Met Asn Gly 705 710 715 720 Arg Leu Arg Ser Lys Thr Ser Thr Ser Lys Gln Leu Glx Asn Ser Cys 725 730 735 Ile Arg Thr Pro Thr Asn Leu Arg Ala Leu Thr Lys Ser Ile Ser Phe 740 745 750 Val Met Trp Pro Ile Ser Pro Lys Ser Thr Ser Ala Leu Ala Ser Ser 755 760 765 His Cys His Glx Lys Gln Thr Leu Ile Leu Gly Val Ser Ser Gln Ser 770 775 780 Arg Asn Cys Thr Arg Glx Trp Leu Gln Phe Ser Leu Pro Ser Ser Thr 785 790 795 800 Thr Gln Ile Leu Gly Asn Arg Ser Ser Glx Thr Arg Pro Pro Val Leu 805 810 815 Glx Arg Ser Ser Trp Ala Ser Glx Leu Trp Pro Thr Ser Arg Ser Glx 820 825 830 Pro Lys Pro Ala Glx Ser Leu Thr Ser Glx Thr Ala Phe Thr Gly Ala 835 840 845 Thr Cys Leu Ala Asn Met Ala Ser Ile Glx Ser Ser Val Tyr Trp Ile 850 855 860 Val Val Ser Gln Arg Gln Arg Leu Tyr Gly Leu Ile Ser Phe Leu Arg 865 870 875 880 Pro Val Glu Trp Trp Gln Thr Lys His Asn Cys Phe Arg Asn Val Trp 885 890 895 Thr Ile Ile Ser Arg Lys Arg Ala Leu Gly Ile Phe Leu Arg Ser Thr 900 905 910 Asp Trp Pro Arg Lys Ile Pro Arg Lys Leu Met Ser Tyr Leu His Ala 915 920 925 Ile Ser Trp Lys Val Leu Gly Tyr Gly His Pro Leu Pro Cys Leu Glu 930 935 940 Glx Leu Arg Ser Pro Arg Ser Glx Lys Thr Met Ala Lys Asn Ser Pro 945 950 955 960 Ser Lys Leu Ala Arg Ser Leu Cys Val Thr Trp Ser Leu Arg Ala Trp 965 970 975 Ile Leu Leu Pro Phe Gln Ile Gln Arg Arg Ser Asn Leu Thr Val Thr 980 985 990 Glx Thr Tyr Thr Pro Thr Leu Ala Leu Gly Pro Thr Ser Val Trp Ala 995 1000 1005 Glx Thr Tyr Ala Arg Gln Gly Glx Ala Arg Cys Glx Lys Tyr Leu Asp 1010 1015 1020 Ala Trp Thr Ile Ser Val Val Leu Leu Glu Arg Arg Asp Ser Glx Arg 1025 1030 1035 1040 Ser Phe Leu Asp Leu Ala Gly Ser Leu Ser Ile Glx Met Arg Ile Lys 1045 1050 1055 Ala Ala Ser Leu Pro Ser Arg Gln Leu Glx Arg Ser Asn Gly Thr Ala 1060 1065 1070 Asn Cys Pro Asn Glx Arg Lys Ile 1075 1080 <210> 2 <211> 3240 <212> DNA <213> Aspergillus nidulans <400> 2 atgggtgaag acaaagaaac aaatatcctc gccggcctcg gaaacaccat ttcccaagta 60 gaaaacgttg ttgcggcatc gttacgacct ttgccaacgg caacgggtga tggaacctac 120 gttgccgaat ccactcagac gggcttagcc aaagatctga gccatgtcga cctcaaggat 180 gtccgcacac tcgccgaagt cgtcaagagt gcggctacgg gagagccggt tgatgacaag 240 cagtatatca tggaaagagt gattcagtta gctgctggct taccatcgac atctcgcaac 300 gctgcagagc taaccaagtc atttttgaac atgctgtgga atgacttgga acatccacca 360 gtttcttatc taggagctga ttctatgcac cgcaaagccg acggctcggg taataatcgt 420 ttctggcctc aacttggcgc tgctggtagc gcgtacgcaa gatctgttcg gcccaagacg 480 atgcagtctc catccctgcc cgatcctgag actattttcg attgcctgct ccgccggaaa 540 gagtacaggg agcatcctaa taagatatca agcgttctat tctacctcgc ttcaatcatt 600 attcatgacc tattccagac agaccctaaa gataattccg tgtccaagac atcgtcatat 660 ttggacctct cacctttgta tggcaataat caagacgagc agaaccttgt tcgtacgttc 720 aaggatggaa agcttaagcc agattgtttc gctaccaagc gagtgttggg ctttcctccc 780 ggcgtcggcg ttctactgat catgttcaac cgcttccaca actatgtggt tgatcaattg 840 gcggcgatca acgaatgcgg ccgattcacc aaacctgacg agtccaacgt tgatgagtat 900 gctaaatacg ataacaatct cttccaaacc gggcgactgg tgacttgtgg gttgtacgca 960 aatattatcc taaaagatta tgtccgaacg attttgaata taaaccggac agatagcacc 1020 tggagtttgg accccagaat ggaaatgaag gatggtttat taggtgaagc agcagcaatg 1080 gcaaccggga accaggtgtc agccgaattt aatgtcgtgt accggtggca cgcttgcatt 1140 tccaagcgcg atgaaaaatg gacagaggat tttcaccgtg aaatcatgcc gggagtggat 1200 ccaagcacac tatcgatgca agattttgtc gcgggtcttg gacggtggca ggcaggactc 1260 ccacaagagc cacttgagcg cccattctct ggcttacagc gtaagccgga cggtgcattc 1320 aacgacgatg acctggttaa tctgtttgag aagagtgttg aagactgcgc aggtgcattt 1380 ggtgcgtctc acgttccagc catcttcaag agcgttgaag ctctcggtat aatgcaggct 1440 cggagatgga acttgggaac gctcaatgag ttccgccaat atttcaatct ggctcctcat 1500 aagacctttg aggatatcaa ctccgatccg tacattgcgg atcagctcaa gcgactgtat 1560 gatcatccag atcttgtgga gatttaccct ggtgttgttg tggaagaagc caaagactcc 1620 atggtccctg gaagcggcct ttgcacgaac ttcactatat ccagggcaat cctttcggat 1680 gcggtggcat tggttcgcgg tgatagattt tacactgtcg actacactcc gaagcacctt 1740 acgaattggg cctacaacga gattcagcct aacaacgccg tcgatcaagg tcaggtattc 1800 tacaagctgg ttcttcgcgc attcccaaac cattttgatg gaaattctat ctatgctcat 1860 ttcccccttg tcgttccctc ggaaaatgag aaaatattga agagccttgg ggttgccgag 1920 aagtatagct gggaaaagcc cagtcgtatc tctcatccga ttttcatcag ctctcatgcc 1980 gcgtgcatgt ccatcctcga aaatcaagaa acgttcaagg tgacttgggg taggaagatt 2040 gagttcctta tgcaacgcga taagcaccaa tacgggaagg acttcatgct gtctggagac 2100 cggccaccca acgctgcatc gcgcaagatg atgggttccg ccttgtatcg cgatgaatgg 2160 gaggctgagg tcaaaaactt ctacgagcaa acaactctaa aactcttgca taagaactcc 2220 tacaaacttg cgggcgttaa ccaagtcgat atcgttcgtg atgtggccaa tctcgcccaa 2280 gtccacttct gctctagcgt cttctcattg ccactgaaaa cagactctaa tcctaggggt 2340 atcttcgcag agtcggaact gtacaagata atggctgcag ttttcactgc catcttctac 2400 gacgcagata ttgggaaatc gttcgagcta aaccaggccg cccgtactgt aacgcagcag 2460 ctgggccagc taactatggc caacgtcgag atcatagcca aaaccggctt gatcgctaac 2520 ctcgtgaacc gccttcaccg gcgcgacgtg cttagcgaat atggcatcca tatgatccag 2580 cgtctactgg atagtggtct cccagcgaca gagattgtat ggactcatat ccttcctacg 2640 gccggtggaa tggtggcaaa ccaagcacaa ctgttttcgc aatgtctgga ctattatctc 2700 tcggaagagg gctctgggca tcttcctgag atcaaccgac tggccaagga aaataccccg 2760 gaagctgatg agctacttac acgctatttc atggaaggtg ctcggctacg gtcatccgtt 2820 gccctgcctc gagtagctgc gcagcccacg gtcgtagaag acaatggcga aaaactcacc 2880 atcaaagctg gccaggtcgt tatgtgtaac ctggtctctg cgtgcatgga tcctactgcc 2940 tttccagatc cagagaaggt caaacttgac cgtgacatga acttatacgc ccactttggc 3000 tttgggcccc acaagtgttt gggcttagac ctatgcaaga cagggctgag cacgatgcta 3060 aaagtacttg gacgcttgga caatctccgt cgtgctcctg gagcgcaggg acagttgaag 3120 aagctttctg gacctggcgg gatcgctaag tatatgaatg aggatcaaag cggcttcact 3180 cccttcccgt caactatgaa gatccaatgg gacggcgaat tgccccaact gaaggaagat 3240 3240

Claims (11)

1. 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 이수산화 합성효소와 리놀레익 산 (linoleic acid)을 반응하는 단계를 포함하고, 상기 반응은 다이메틸 설폭사이드를 첨가한 조건에서 수행되는 것을 특징으로 하는 5,8-이수산화 리놀레익 산 (5,8-dihydroxylinoleic acid, 5,8-dihydroxy-9,12(Z,Z)-octadecadienoic acid)을 제조하는 방법.
2. 제 1항에 있어서, 상기 방법은 pH 7.0 내지 8.0 범위에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1항에 있어서, 상기 방법은 20℃ 내지 40℃ 범위에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 1항에 있어서, 상기 방법은 pH 7.5 및 35℃에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 서열번호 2에 기재된 염기 서열로 이루어진 이수산화 합성효소 (diol synthase)의 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 리놀레익 산과 반응하는 단계를 포함하고, 상기 반응은 다이메틸 설폭사이드를 첨가한 조건에서 수행되는 것을 특징으로 하는 5,8-이수산화 리놀레익 산 (5,8-dihydroxylinoleic acid, 5,8-dihydroxy-9,12(Z,Z)-octadecadienoic acid)을 제조하는 방법.
6. 제 5항에 있어서, 상기 방법은 pH 7.0 내지 8.0 및 20℃ 내지 40℃ 범위에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제 5항에 있어서,
   상기 방법은 pH 7.5, 및 온도 35℃에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
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