KR101897189B1 - 페니실리움 크리소게넘 균주 유래 리파제 및 이를 이용한 리파제의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 페니실리움 크리소게넘 균주 유래 리파제 및 이를 이용한 리파제의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 신규한 리파제에 의하면, 피키아 파스토리스 균주로부터 유래된 형질전환체로부터 우수한 효율로 리파제를 생산할 수 있으므로, 바이오디젤의 생산방법을 비롯한 리파제를 이용한 다양한 화합물의 생물학적 생산공정에 널리 활용될 수 있다.

Description

페니실리움 크리소게넘 균주 유래 리파제 및 이를 이용한 리파제의 제조방법{Lipase derived from Penicillium chrysogenum and preparation method of lipase using the same}

본 발명은 페니실리움 크리소게넘 균주 유래 리파제 및 이를 이용한 리파제의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 본 발명은 페니실리움 크리소게넘 균주 유래 리파제, 상기 리파제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체, 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 리파제의 제조방법에 관한 것이다.

바이오촉매용 효소시장은 다양한 산업분야에 파급효과를 보이면서도 빠른 성장수준을 보이고 있다. 산업용 효소와 신기능 효소류는 약 130여 종이 있으나, 실제 효소시장에서 공급 및 이용되는 효소는 30개 미만의 효소가 90% 이상을 차지하고 있다. 따라서 생촉매의 고효율성, 초정밀성, 고선택성의 장점을 이용하기 위해 공해유발 및 고에너지 요구성의 화학합성반응을 대체할 수 있는 청정 생물전환기술의 개발이 요구되고 있는 상황이다.

이러한 바이오촉매용 효소 중의 하나인 리파제(lipase, glycerol ester hydrolases)는 다양한 범위의 수용성 혹은 비수용성 카르복실산 에스테르(carboxylic acid ester)나 아마이드(amide)의 가수분해 혹은 합성을 촉매하는 효소를 의미하는데, 가수분해(hydrolysis), 알콜분해(alcoholysis), 산분해(acidolysis), 에스테르화(esterification), 아미노분해(aminolysis) 등과 같이 다양한 생물 촉매 반응에 관여하고, 수용액 상태에서 뿐 아니라 유기 용매에서도 활성을 유지할 수 있으며, 촉매반응 과정에 별도의 보조인자(cofactor)를 필요로 하지 않고, 다양한 기질에 대해 기질 특이성을 나타내며, 광학이성질체 중 어느 한쪽에 대해서만 활성을 나타내는 이성질체 선택성을 가지고 있다는 다양한 특성을 나타내어, 산업적이 유용성이 입증되고 있다. 또한, 에스테르 결합의 가수분해 뿐만이 아니고 그 역반응인 에스테르 합성작용 기능 또한 가지고 있어, 트리글리세리드를 이용한 식품, 의약품, 화장품 등의 원료 및 첨가물과 에스테르 결합으로 이루어진 여러 화학합성물질을 제조하기 위한 생촉매로서 다양한 활용성이 개발되고 있다.

예를 들어, 상기 리파제는 생체 내에서 지방대사의 중요한 역할을 할 뿐 아니라, 치즈 풍미 증진, 야채 발효시 유리지방산 증가, 육류 숙성시 향기 증진 및 어류 지방 분해에도 작용하고, 고가의 순수광학 이성질체 합성에도 사용될 수 있는 등의 폭넓은 활용범위를 갖고 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 산업적으로도 널리 활용되고 있는데, 구체적으로, 낙농산업 분야에서는 유지방 분해를 통한 치즈의 제조, 버터나 크림의 지방분해를 위해 사용되고, 세제산업 분야에서는 세탁 또는 세척세제의 제조, 환경오염 폐수 감소, 반응온도 감소 등에 사용되며, 유화학산업분야에서는 불포화 지방산 생산, 비누제조, 싼 팜유를 이용한 코코아 버터의 생산 등에 활용되고, 제지산업 분야에서는 나무의 송진 또는 수지 제거, 폐지의 잉크제거 등에 활용되며, 제약산업 분야에서는 R, S- 광학이성질체 구분 합성, 라세믹 혼합물의 분리, 약제조 등에 이용되고, 화장품산업 분야에서는 왁스를 비롯한 피부용품, 선탠크림, 목욕용품 등의 제조에 이용되며, 에너지산업 분야에서는 식물성 기름으로부터 바이오디젤의 생산에 활용되고 있다.

이러한 리파제는 다양한 동물, 식물, 미생물 등으로부터 생산되는 것으로 알려져 있는데, 최근에는 유전공학적 기법을 이용한 생물반응기(bioreactor)를 이용하여 리파제를 대량생산하는 방법이 개발되고 있다. 특히, 박테리오파지를 포함한 세균과 효모 등의 단세포 생물의 세포 표면에 리파제를 발현시키는 방법, 다양한 종류의 리파제를 하나의 미생물로부터 동시에 발현시켜서 산업적으로 유용한 생촉매를 제조하는 방법, 다양한 효모를 이용하여 리파제를 분비생산하는 방법 등이 개발되고 있다. 예를 들어, 대한민국 등록특허 제475133호(특허문헌 1)에는 효모 표면 발현벡터를 이용하여 변이 리파제를 스크리닝하는 방법이 개시되어 있고, 대한민국 등록특허 제658193호(특허문헌 2)에는 신규한 저온성 지질분해 활성을 나타내는 리파제 및 대장균을 이용하여 이를 대량생산하는 방법이 개시되어 있으며, 대한민국 공개특허 제2009-0065673호(특허문헌 3)에는 얄로위아 리포리티카(Yallowia lipolytica) 효모 균주를 배양하고, 이의 배양액으로부터 알칼리성 리파제를 수득하는 방법이 개시되어 있다.

상기 개발된 방법 중에서도, 효모를 이용하여 리파제를 분비생산하는 방법이 주목받고 있다. 종래의 유전공학적 생물반응기의 주된 숙주세포로 사용되어온 대장균은 다양한 동물, 식물, 미생물 유래의 유전자를 비교적 용이하게 발현시킬 수 있고, 균체의 생장속도가 빠르며, 숙주내에서 유전자의 변이확률이 낮다는 장점이 있으나, 도입된 유전자의 발현효율이 낮으며, 해독후 가공공정을 수행하기 어렵고, 도입된 유전자로부터 발현된 단백질을 분비생산하기가 용이하지 않다는 단점이 있어, 산업적인 생산에 적용할 수 없었다. 이에 반하여, 효모는 대장균에 비하여 도입된 유전자의 발현효율이 우수하고, 해독후 가공공정이 수행될 수 있으며, 도입된 유전자로부터 발현된 단백질을 용이하게 분비생산할 수 있다는 장점이 있을 뿐만, 아니라 대장균과 유사한 수준으로 기술수준이 축적되어 있어, 도입된 유전자를 이용한 산업적 생산이 용이하기 때문에, 효모를 이용하여 리파제를 분비생산하는 방법이 주목받고 있다. 다만, 대장균에 비하여, 도입된 외래 유전자를 발현시키는 것이 용이하지 않아, 사용되는 효모 균주에 따라 도입하는 유전자의 뉴클레오티드 서열을 최적화하여야 한다는 단점이 있으나, 산업적인 생산성이 우수하기 때문에, 효모에서 생산성을 최적화시킬 수 있는 도입 유전자의 뉴클레오티드 서열을 개발하는 연구가 활발히 진행되고 있다. 이에 대한 선행기술문헌으로 효모 균주의 일종인 피키아 파스토리스 균주를 이용한 리조푸스 오리재 균주 유래 리파제의 생산방법에 관한 대한민국 공개특허 제2016-0042253호(특허문헌 4)가 있으나, 새로운 뉴클레오티드의 서열을 개발하기 위한 지속적인 연구가 필요한 실정이다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 신규한 리파제 유전자를 개발하고자 예의 연구, 노력한 결과 페니실리움 크리소게넘(Penicillium chrysogenum) 균주로부터 신규한 리파제 유전자를 확인하여 본 발명을 완성하였다.

특허문헌 1. 대한민국 등록특허 제475133호 특허문헌 2. 대한민국 등록특허 제658193호 특허문헌 3. 대한민국 공개특허 제2009-0065673호 특허문헌 4. 대한민국 공개특허 제2016-0042253호

본 발명의 하나의 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 리파제를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 리파제를 코딩하는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 발현벡터를 포함하는 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 리파제의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 리파제를 이용한 PGFE(poly-glycerol fatty acid ester)의 생산방법을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 리파제를 제공한다.

본 발명의 용어 "리파제(lipase)"란, 다양한 범위의 수용성 혹은 비수용성 카르복실산 에스테르나 아마이드(amide)의 가수분해 혹은 합성을 촉매하는 효소를 의미하는데, 가수분해(hydrolysis), 알콜분해(alcoholysis), 산분해(acidolysis), 에스테르화(esterification), 아미노분해(aminolysis) 등과 같이 다양한 생물 촉매 반응에 관여하는 것으로 알려져 있다.

상기 리파제는 수용액 상태에서 뿐 아니라 유기 용매에서도 활성을 유지하고, 촉매반응 과정에 별도의 보조인자(cofactor)를 필요로 하지 않고, 다양한 기질에 대해 기질 특이성을 나타내며, 광학이성질체 중 어느 한 쪽에 대해서만 활성을 나타내는 이성질체 선택성을 가지고 있어 산업적 응용성이 높은 효소 중의 하나이다. 현재까지 많은 종류의 동물, 식물, 미생물이 리파제를 생산하는 것으로 알려져 있고, 리파제의 생화학적 특성에 대한 연구, 리파제 유전자를 확보하기 위한 연구가 진행되고 있다. 특히, 식품, 세제, 정밀화학, 화장품 및 대체에너지산업 등 산업 전반에 걸쳐서 리파제를 이용하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 특히, 의약품을 비롯한 부가가치가 높은 선도물질을 합성하는 정밀화학분야에서 리파제가 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있는데, 산업에 널리 쓰이는 키랄 소재에 에스테르 결합이 많이 포함되어 있기 때문이다. 키랄성(chirality)을 지닌 대부분의 의약품이나 농약들은 특정 에난티오머(enantiomer)만 약리활성을 가지고 다른 에난티오머는 활성이 없거나 심지어 독성을 보이기도 하므로 활성 에난티오머만을 생산하는 것이 중요한데, 최고 700 psi의 고압과 250℃ 이상의 고온 등의 극단적인 조건이 요구되는 비대칭 화학 합성법에 비하여 리파제를 사용할 경우에는 극단적인 조건이 요구되지 않아, 생산성을 향상시킬 수 있다.

상기 리파제는 페니실리움 크리소게넘(Penicillium chrysogenum) 균주로부터 유래된 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있다. 또한 상기 리파제는 지금까지 알려진 리파제의 아미노산 서열과 비교하여, 자연계에는 이와 동일한 아미노산 서열의 리파제가 아직까지 공지되지 않았으므로, 본 발명에서 제공하는 리파제는 본 발명자들에 의하여 최초로 규명된 것이라고 할 수 있다. 한편, 상기 리파제에 포함된 서열번호 1의 아미노산 서열을 종래의 Pc21g06680(Wisconsin 54-1255, GenBank : CAP95565.1)의 아미노산 서열과 비교하면, 상기 서열번호 1의 총 307개 아미노산과 비교하여 5개의 아미노산(K70Q, H110Y, K152E, S158T, E263Q)이 상이하여 전체적으로 98%의 동일성을 나타낸다. 그럼에도 불구하고 본 발명에 따른 리파제는 분비능/가수분해활성/PGFE 합성능이 현저히 개선되었다. 본 명세서에서 상기 리파제는 PCLB와 동일한 의미로 사용될 수 있다.

본 명세서에서 서열과 관련하여 사용된 용어 "상동성"은 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 동일하거나 유사한 활성을 갖는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다. 예를 들면, 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 표준 소프트웨어, 구체적으로 BLAST 2.0를 이용하거나, 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고(Sambrook et al., 1989, Infra), 당업자에게 잘 알려진 방법으로 결정될 수 있다.

아울러, 종래의 리파제 보다도 효율적으로 발현될 수 있는 한, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단에 다양한 아미노산 서열이 부가된 모든 펩타이드를 포함할 수 있다. 뿐만 아니라, 표적화 서열, 태그(tag), 표지된 잔기, 반감기 또는 펩타이드의 안정성을 증가시키기 위한 특정 목적으로 고안된 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다.

아울러, 종래의 리파제 보다도 효율적으로 발현될 수 있다면, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 일부 아미노산이 부가, 치환, 결실 등의 방법으로 변이된 변이체 단백질도 본 발명에서 제공하는 리파제의 범주에 포함될 수 있다.

특히, 본 발명에서 제공하는 리파제는 서열번호 1의 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 서열을 가지는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 폴리펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 또한, 아미노산 서열상의 변이 또는 수식에 의해서 단백질의 열, pH등에 대한 구조적 안정성이 증가하거나 단백질 활성이 증가한 단백질을 포함할 수 있다.

또한 상기 리파제는 카프릴산(caprylic acid, C8), 데칸산(decanoic acid, C10), 라우르산(lauric acid, C12) 및 팔미트산(palmitic acid, C16)으로 이루어지는 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 기질로 한 가수분해 활성이 8 내지 14 unit/㎎일 수 있다.

본 발명에서 제공하는 리파제는 당해 분야에 공지된 화학적 펩티드 합성방법으로 제조하거나, 상기 리파제를 코딩하는 유전자를 PCR(polymerase chain reaction)에 의해 증폭하거나 공지된 방법으로 합성한 후 발현벡터에 클로닝하여 발현시켜서 제조할 수 있다.

상술한 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 리파제를 코딩하는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드를 구성하는 염기서열은 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩할 수 있는 염기서열 또는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단에 부가될 수 있는 다양한 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열이 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩할 수 있는 염기서열의 염기서열의 5'-말단 또는 3'-말단에 부가된 형태가 될 수 있다. 구체적으로는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩할 수 있는 서열번호 2의 염기서열 또는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단에 부가될 수 있는 다양한 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열이 상기 서열번호 2의 염기서열의 5'-말단 또는 3'-말단에 부가된 형태가 될 수 있다.

본 발명에서 제공하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열은 종래 폴리뉴클레오티드의 염기서열과 비교하여, 자연계에서는 이와 동일한 염기서열의 폴리뉴클레오티드가 아직까지 공지되지 않았으므로, 본 발명에서 제공하는 폴리뉴클레오티드는 본 발명자들에 의하여 최초로 규명된 것이라 할 수 있다.

한편, 상기 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있다. 뉴클레오티드 서열을 화학적으로 합성하여 제조하는 경우, 당업계에 널리 공지된 합성법, 예를 들어 문헌(Engels and Uhlmann, Angew Chem IntEd Engl., 37:73-127, 1988)에 기술된 방법을 이용할 수 있으며, 트리에스테르, 포스파이트, 포스포르아미다이트 및 H-포스페이트 방법, PCR 및 기타 오토프라이머 방법, 고체 지지체 상의 올리고뉴클레오타이드 합성법 등을 들 수 있다.

상술한 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공한다.

본 발명의 용어 "발현벡터"란, 적절한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있도록 유전자 삽입물을 포함하고, 상기 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 의미한다. 상기 발현벡터는 개시코돈, 종결코돈, 프로모터, 오퍼레이터 등의 발현조절 요소들을 포함하는데, 상기 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 제작물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다.

본 발명의 용어 "작동가능하게 연결(operably linked)"이란, 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 상태를 의미한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 발현벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용할 수 있다.

예를 들어, 상기 발현벡터는 본 발명에서 제공하는 신규한 리파제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 피키아 파스토리스 균주에 도입하여, 상기 피키아 파스토리스를 리파제를 생산할 수 있는 형질전환체로 변이시키는 역할을 수행할 수 있다.

이를 위하여, 상기 발현벡터는 세포 배양액으로부터 단백질의 분리를 촉진하기 위하여 리파제의 배출을 위한 시그널 서열을 포함할 수 있다. 특이적인 개시 시그널은 또한 삽입된 핵산 서열의 효율적인 번역에 필요할 수도 있다. 이들 시그널은 ATG 개시코돈 및 인접한 서열들을 포함한다. 어떤 경우에는, ATG 개시 코돈을 포함할 수 있는 외인성 번역 조절 시그널이 제공되어야 한다. 이들 외인성 번역 조절 시그널들 및 개시 코돈들은 다양한 천연 및 합성 공급원일 수 있다. 발현 효율은 적당한 전사 또는 번역 강화 인자의 도입에 의하여 증가될 수 있다.

아울러, 상기 발현벡터는 리파제의 검출을 용이하게 하기 위하여, 임의로 엔도펩티아이제를 사용하여 제거할 수 있는 단백질 태그를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 용어 "태그(tag)"란, 정량가능한 활성 또는 특성을 나타내는 분자를 의미하며, 플로오레세인과 같은 화학적 형광물질(fluoracer), 형광 단백질(GFP) 또는 관련 단백질과 같은 폴리펩타이드 형광물질을 포함한 형광 분자일 수도 있고; Myc 태그, 플래그(Flag) 태그, 히스티딘 태그, 루신 태그, IgG 태그, 스트랩타비딘 태그 등의 에피톱 태그일 수도 있다. 특히, 에피톱 태그를 사용할 경우, 구체적으로는 6개 이상의 아미노산 잔기로 구성되고, 보다 구체적으로는 8개 내지 50개의 아미노산 잔기로 구성된 펩타이드 태그를 사용할 수 있다.

상술한 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 발현벡터를 포함하는 형질전환체를 제공한다.

본 발명에서 제공하는 형질전환체는 상기 본 발명에서 제공하는 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환시켜서 제작되고, 상기 발현벡터에 포함된 폴리뉴클레오티드를 발현시켜서, 본 발명의 리파제를 생산하는데 사용될 수 있다.

본 발명에서 제공하는 상기 발현벡터가 도입될 수 있는 숙주세포는 상기 폴리뉴클레오티드를 발현시켜서 상기 펩타이드를 생산할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 대장균(E. coli), 스트렙토마이세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 사카로마이세스 세레비지애, 스키조사카로마이세스 폼베, 피키아 파스토리스 등의 효모 세포; 드로소필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO, COS, NSO, 293, 보우 멜라노마 세포 등의 동물 세포; 또는 식물 세포가 될 수 있고, 구체적으로는 피키아 파스토리스 균주가 될 수 있다.

본 발명의 용어 "피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 균주"란, 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)와 함께 재조합 단백질 생산에 가장 널리 활용되는 효모균주를 의미하는데, 유전자 조작이 용이하며 다양한 발현시스템이 개발되어 있고 대량배양이 용이하다는 장점을 갖는다. 뿐만 아니라 인체단백질과 같은 고등세포 유래의 단백질을 재조합 생산할 때 단백질을 세포 밖으로 분비할 수 있는 분비기능과 당쇄부가 등과 같은 단백질의 번역 후 수식(post-translational modification) 기능을 수행할 수 있는 장점을 제공한다. 재조합 단백질의 분비 생산은 단백질 분비시그날과 목표단백질을 인위적으로 융합(fusion)함으로써 세포외 분비가 가능한 것으로, 단백질의 분비과정을 통해서 단백질의 폴딩이나 이황화 결합의 형성 및 당쇄부가 과정이 진행되며, 따라서 생물학적으로 완전한 활성을 갖는 재조합단백질을 생산할 수 있는 장점이 있다. 또한, 생물학적 활성을 갖는 단백질을 배지로부터 직접 얻을 수 있기 때문에 경제적으로 효율이 낮은 세포의 분쇄나 재접힘 단계를 필요로 하지 않아 매우 경제적이다.

아울러, 상기 형질전환은 다양한 방법에 의하여 수행될 수 있는데, 다양한 세포활성을 높은 수준으로 향상시킬 수 있는 효과를 나타내는 본 발명의 리파제를 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, CaCl₂ 침전법, CaCl₂ 침전법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 한나한(Hanahan) 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환방법 등이 사용될 수 있다.

한편, 본 발명에서 제공하는 형질전환체는 상기 발현벡터를 숙주세포인 피키아 파스토리스 균주에 도입하여 제작되는데, 상기 제작된 형질전환체 중에서 본 발명에서 제공하는 리파제의 생산효율을 증대된 형질전환체를 스크리닝 하는 단계를 추가로 수행하고, 이로부터 얻어진 형질전환체가 될 수 있다. 발현 벡터가 독립된 유전자로 존재하여 각 세포가 동일하게 도입된 유전자를 발현시키는 박테리아와는 달리, 효모 균주인 피키아 파스토리스 균주는 동일한 발현벡터를 도입한다 하여도, 각 형질전환체마다 도입된 유전자의 발현 수준이 상이하게 될 수 있다. 이에 따라, 상기 형질전환체 중에서 RhlA를 가장 효율적으로 생산하는 형질전환체를 선발하기 위한 스크리닝을 수행함으로써, 본 발명에서 제공하는 리파제의 생산효율을 증대된 형질전환체를 수득할 수 있다.

이에, 본 발명자들은 효모 균주인 피키아 파스토리스 균주에, 페니실리움 크리소게넘(Penicillium chrysogenum) 균주로부터 유래되고, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 신규한 리파제를 코딩하는 유전자를 도입한 형질전환체를 제작하고, 이를 " 피키아 파스토리스 KPC-B(Pichia pastoris KPC-B)"라 명명하였다.

또한, 상기 스크리닝 방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 효소활성측정결과, 리파제의 생산량측정결과 등을 기준으로 수행될 수 있는데, 보다 효과적으로 리파제를 생산할 수 있는 형질전환체를 수득하기 위하여는 효소활성측정결과 및 리파제의 생산량측정결과를 함께 측정기준으로 사용하여 스크리닝을 수행할 수 있다.

예를 들어, 상기 효소활성측정결과를 확인하기 위하여는, 상기 형질전환체에서 생산된 리파제를 포함하는 배양액에 트리글리세리드, pNP-에스터 등의 리파제 기질을 가하고, 상기 기질내의 에스테르 결합을 분해하는 활성을 측정하는 방법을 사용할 수 있고; 상기 리파제의 생산량측정결과를 확인하기 위하여는 상기 형질전환체로부터 생산된 리파제를 정제하여 단위 배양액당 생산된 리파제의 양을 비교하는 방법을 사용할 수 있다.

상술한 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 리파제의 제조방법을 제공한다.

구체적으로 본 발명의 리파제 제조방법은 (a) 상기 형질전환체를 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및, (b) 상기 배양물로부터 본 발명에서 제공하는 리파제를 회수하는 단계를 포함할 수 있다.

또 다른 방법으로서, 본 발명의 리파제를 제조하는 방법은 (a) 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 수득하는 단계; (b) 상기 수득한 폴리뉴클레오티드를 클로닝하여 발현벡터를 수득하는 단계; (c) 상기 수득한 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 수득하는 단계; 및, (d) 상기 형질전환체를 배양하고, 이로부터 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 리파제를 회수하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 용어 "배양"이란, 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 방법을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 형질전환체를 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 본 발명의 리파제를 발현시켜서 생산할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있다.

배양에 사용되는 배지는 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족시킬 수 있다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 글루코즈 및 자일로즈의 혼합당을 주 탄소원으로 사용하며 이외에 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민과 같은 아미노산 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 및 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다.

또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식, 유가식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다.

아울러, 배양물로부터 상기 리파제를 회수하는 단계는 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 회수 방법은 생산된 본 발명의 리파제를 회수할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 구체적으로는 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증방, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해(예를 들면 암모늄 설페이트 침전), 크로마토그래피(예를 들면 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기배제) 등의 방법을 사용할 수 있다.

상술한 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 리파제를 이용한 PGFE(ploy-glycerol fatty acid ester)의 생산방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명에서 제공되는 PGFE의 생산방법은 1) 상기 리파제, 상기 형질전환체 및 상기 형질전환체의 배양물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 다이글리세롤(diglycerol) 및 올레산(oleic acid)과 반응시켜 반응물을 수득하는 단계; 및 2) 상기 반응물로부터 PGFE를 회수하는 단계를 포함한다.

상기 리파제를 이용하는 경우 다른 리파제를 이용하는 경우에 비해 PGFE의 수득률을 현저히 향상시킬 수 있다. 구체적으로는, 상기 리파제로 인한 PGFE의 수득률은 70 내지 80%일 수 있다.

본 발명에 따른 신규한 리파제에 의하면, 우수한 효율로 리파제를 생산할 수 있으므로, 상기 리파제를 이용한 다양한 화합물의 생물학적 생산공정에 널리 활용될 수 있다.

도 1은 PCLB와 Pc21g06680의 아미노산 서열을 비교한 것이다.
도 2는 실시예 2에 따라 제작한 재조합 발현벡터 pPICZαA/PCLB의 벡터맵을 나타낸 것이다.
도 3은 PCLB와 Pc21g06680를 분비하는 형질전환체를 배양하여 효소 분비량을 비교한 것이다.
도 4는 PCLB, Pc21g06680 및 상용 효소의 가수분해 활성을 비교한 것이다.

이하 본 발명을 하기 예에 의해 상세히 설명한다. 다만, 하기 예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 하기 예에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

실시예

< 실시예 1: PCLB 유전자의 수득>

페니실리움 크리소게넘(Penicillium chrysogenum) 균주로부터 게놈 DNA를 추출하고, 추출된 게놈 DNA를 주형으로 사용하여 PCR을 수행함으로써, 페니실리움 크리소게넘으로부터 유래된 리파제(Penicillium chrysogenume Lipase, PCLB)(서열번호 1)를 코딩하는 유전자(서열번호 2)를 수득하였다. 이때, PCR용 프라이머는 PCLB의 N-말단 앞쪽으로 EcoR I 이 위치하도록 설계된 정방향 프라이머(서열번호 3)와 PCLB의 C-말단 뒤쪽으로 Not I이 위치하도록 설계된 역방향 프라이머(서열번호 4)를 사용하였다. 이때, PCR 조건은 95℃ 7분, 30회 반복(95℃ 30초, 56℃ 30초 및 72℃ 1분30초) 및 72℃ 7분으로 설정하였다.

정방향 프라이머 (서열번호 3)

5'-GAATTCATGCGTTTCTCTTTCTTTA-3'

(GAATTC : restriction enzyme 1, EcoR I)

역방향 프라이머 (서열번호 4)

5'-GCGGCCGCTCAAATTGAACCCCTC-3'

(GCGGCCGC : restriction enzyme 2 Not I)

위와 같은 조건의 PCR을 통해 수득한 PCLB의 유전자 서열을 NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov, National Center for Biotechnology Information, U.S. National Library of Medicine, USA) 데이터베이스 분석을 통해 선행 연구들과의 중복성을 검토하였으며, 그 결과는 아래 표 1 과 같다.

구분	상동성	진뱅크(GeneBank)
Pc21g06680 [Penicillium rubens Wisconsin 54-1255]	98%	CAP95565.1

표 1 의 효소는 본 발명의 PCLB 효소의 아미노산 서열과 동일성이 가장 높은 효소로 PCLB와 동일한 서열의 효소는 지금까지 보고된 사례가 없다. Pc21g06680(Wisconsin 54-1255, GenBank : CAP95565.1)는, PCLB의 307개 아미노산과 비교하여 5개의 아미노산이 상이하다(K70Q, H110Y, K152E, S158T, E263Q, 도 1).

한편, KR 1176802를 비롯한 많은 연구 논문들이, 수백개의 아미노산 서열 중 단 1개 혹은 2개의 아미노산 서열이 바뀌는 것 만으로도 효소의 활성 및 반응성이 크게 변화할 수 있다는 것을 보여주고 있다. 본 발명자들은 하기의 실험을 통하여, 표 1의 효소와 본 발명의 PCLB는 효소 활성 및 반응성이 크게 다르게 나타남을 확인하였다.

< 실시예 2: 재조합 발현벡터( pPICZαA / PCLB ) 및 형질전환체의 제작>

상기 실시예 1에서 수득한 PCLB 유전자에 제한효소인 EcoR I/Not I을 처리하여 DNA 단편을 수득하고, 상기 수득한 DNA 단편을 벡터 pPICZαA의 다클론부위에 삽입하여 재조합 발현벡터(pPICZαA/PCLB)를 제작하였다(도 2). 이때, 재조합 발현 벡터 제작을 위한 숙주 세포로는 대장균을 사용하였다.

도 2는 본 발명에서 제작한 PCLB 유전자를 발현시키기 위한 재조합 발현벡터 pPICZαA/PCLB 의 벡터맵을 나타낸다.

한편, 상기 제작된 재조합 발현벡터(pPICZαA/PCLB)를 전기천공법(electroporation transformation)으로 피키아 파스토리스(Pichia pastoris X-33) 균주에 도입하여 형질전환체를 제작하였고, 이를 "피키아 파스토리스 KPC-B(Pichia pastoris KPC-B)"라 명명하였다.

< 실시예 3: PCLB를 생산하기 위한 최적 형질전환체 스크리닝>

발현 벡터가 독립된 유전자로 존재하여 각 세포가 동일하게 도입된 유전자를 발현시키는 박테리아와는 달리, 효모 균주인 피키아 파스토리스 균주는 동일한 발현벡터를 도입한다 하여도, 각 형질전환체마다 도입된 유전자의 발현수준이 상이하게 될 수 있다. 이에 따라, 상기 형질전환체 중에서 PCLB를 가장 효율적으로 생산하는 형질전환체를 선발하기 위한 스크리닝을 수행하였다.

구체적으로, BMMY 아가배지(1% 효모 추출물(yeast extract), 2% 펩톤(peptone), 100mM 인산칼륨(potassium phosphate), 1.34% YNB, 4x 10^-5% 바이오틴(biotin), 0.5% 메탄올(methanol), 2% 아가(agar), pH 6.0)에 0.8 %(v/v)가 되도록 트리부티린(tributyrin)을 가하고 초음파처리하여 불투명한 고체배지를 제작하였다. 상기 제작된 고체배지에 상기 실시예 2에서 제작된 형질전환체를 접종하고, 30℃에서 48시간 동안 배양하였다. 상기 접종된 형질전환체가 증식하면서 PCLB를 발현시키면, 발현된 PCLB에 의해 배지에 포함된 트리부티린이 분해되어 투명환이 형성된다. 따라서 PCLB의 발현량 또는 활성에 비례하여 상기 투명환의 면적 또는 반경이 증가하므로, 투명환의 면적 또는 반경을 기준으로 우수한 PCLB 발현량 또는 활성을 나타내는 20개의 균주를 1차 스크리닝하였다.

상기 1차 스크리닝을 통해 선별된 20여개의 형질전환체를 1㎖ BMMY 액체배지(1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 100mM 인산칼륨, 1.34% YNB, 4x 10^-5% 바이오틴, 0.5% 메탄올, pH 6.0)에 접종하고, 30℃ 및 200rpm 배양기에서 48시간 동안 배양하여 배양물을 수득하였다. 상기 수득한 배양물을 4000rpm으로 10분간 원심분리를 하여 배양 상등액을 수득하고, 상기 배양 상등액에 pNPC(para-nitrophenyl caprylate) 용액(100μM pNPC in 50 mM tris-HCl, pH 8.0)을 가하고, 10분간 반응시켰다. 상기 pNPC는 PCLB에 의해 분해되어 노란색을 나타내는 pNP(para-nitrophenol)를 분해산물로 생성하고, PCLB의 발현량 또는 활성이 증가할수록 pNP의 생성량이 증가하므로, 상기 반응이 종료된 후, 반응산물을 대상으로 405 nm에서 흡광도를 측정하여 가장 높은 흡광도를 나타내는 PCLB를 발현시키는 형질전환체를 2차 스크리닝하였다.

한편 본 발명자들은 본 발명의 PCLB 와 기존의 페니실리움(Penicillium) 균주 유래 리파제 효소의 비교 실험을 위하여, 실시예 1의 표 1에 나열된 페니실리움(Penicillium) 균주 유래 리파제 중 PCLB와 상동성이 가장 높았던 Pc21g06680 효소의 유전자를 합성하여 수득하였다. Pc21g06680 효소의 유전자는 상기 실시예 1, 2, 3 에 기술한 것과 동일한 방법을 통하여 피키아 파스토리스 균주에 도입하여 Pc21g06680 의 최적 형질전환체를 제작하였다.

실험예

< 실험예 1: 실험실-규모 발효(Lab-scale fermentation)을 통한 PCLB 및 Pc21g06680의 분비능 비교>

상기 2차 스크리닝을 통해 선별된 PCLB 및 Pc21g06680 의 형질전환체를 실험실적 규모로 배양하여 각 형질전환체의 효소 대량 생산능을 확인해 보았다. 이를 위하여 5L 자 발효조(jar fermenter)에 2L의 BSM(Basal Salts Medium)을 넣고 각 형질전환체를 접종하여 배양을 진행하였다. 배양에 사용된 영양배지와 배양 조건 등은 인비트로젠(Invitrogen)사의 PFPG(Pichia Fermentation Process Guidelines)에 따라 진행하였다.

PCLB와 Pc21g06680의 형질전환체를 배양한 결과 도 3과 같은 효소 분비 생산량을 보였다.

도 3의 사진은 당 연구분야에서 효소 단백질의 분석에 일반적으로 사용되는 SDS-페이지(SDS-PAGE) 분석법을 통해 각 형질전환체의 배양액을 분석한 것으로 최종 96시간 배양시 Pc21g06680 효소보다 PCLB효소의 분비 생산량이 더 높은 것을 알 수 있다. 배양액에 분비 생산된 효소의 양을 보다 정량적으로 알아보기 위하여 단백질 정량에 일반적으로 사용되는 브래드포드(Bradford) 방법으로 효소 단백질 양을 정량한 결과 PCLB 효소의 분비 생산량은 3.4 g/L 로 2.6 g/L 의 생산량을 보인 Pc21g06680 효소에 비하여 30% 이상 높은 생산량을 보였다.

< 실험예 2: PCLB 및 Pc21g06680의 가수분해 활성 비교>

또한 상기 Pc21g06680, PCLB효소, 및 상용 페니실리움(Penicillium) 균주 유래 리파제의 활성을 비교하였다. 이를 위하여, 기질로 pNP-에스테르(pNP-ester)를 사용하여 세 가지 효소의 가수분해 활성을 측정하였다(도 4). 이때 상기 pNP-에스테르는 pNP와 뷰티르산(butyric acid, C4), 카프릴산(caprylic acid, C8), 데칸산(decanoic acid, C10), 라우르산(lauric acid, C12), 팔미트산(palmitic acid, C16), 스테아르산(stearic acid, C18)가 각각 에스테르 결합을 이룬 것으로서, 총 6개의 pNP-에스테르가 사용되었다.

그 결과, 도 4에 나타난 것과 같이, 본 발명에 따른 PCLB 효소는 6 종의 pNP-에스테르 모두에 대한 가수분해 활성이 상용 효소와 Pc21g06680 효소에 비하여 매우 높았으며, 적게는 1.4배에서 크게는 16배 이상의 높은 활성을 보이는 것으로 확인되었다.

또한 도 4를 기질 특이성 측면에서 보았을 때, Pc21g06680 효소의 경우 C16 기질에 대한 가수분해 활성이 가장 높았고 C16을 기준으로 탄소수가 감소하거나 증가할수록 활성이 감소하는 경향을 보였으나, PCLB 효소의 경우 C8 기질에서 가장 높은 가수분해 활성을 보였다. 이러한 기질 특이성의 차이는 두 효소가 유전자 서열의 유사성은 크지만 서로 다른 종류의 리파제 효소로 작용함을 보여주고 있는 것이다.

< 실험예 3: PCLB 및 Pc21g06680 효소를 이용한 산업용 폴리 -글리세롤 지방산 에스테르(poly-glycerol fatty acid ester) 유화제 합성 성능 비교>

폴리-글리세롤 지방산 에스테르(Poly-glycerol fatty acid ester, PGFE)는 식품 및 화장품 등의 첨가제로 사용되는 유화제로 산업적 활용도가 높은 물질이다. 이에 본 발명자들은 본 발명의 PCLB 효소를 비롯해 Pc21g06680 효소와 다양한 상용 효소를 이용하여 PGFE를, 구체적으로는 DGMO(di-glycerol mono-oleate)를 합성하는 연구를 진행하였다.

DGMO합성을 위하여 다이글리세롤(diglycerol), 올레산(oleic acid)과 각 효소들을 혼합하였고, 48시간 합성 반응 후 가스 크로마토그래피(gas chromatography, GC) 장비를 이용하여 합성 생성물을 분석하였다.

다이글리세롤 올레인산염(Diglycerol oleate)	상업용 캔디다 리파제(Commercial Candida Lipase)	상업용 리조무코르 리파제(Commercial Rhizomucor Lipase)	상업용 페니실리움 리파제(Commercial Penicillium Lipase)	Pc21g06680	PCLB
모노-올레인산염	23%	22%	24%	30%	50%
다이-올레인산염	25%	24%	24%	10%	25%
트리-올레인산염	6%	5%	2%	-	-
수득률	54%	51%	50%	40%	75%

표 2는 DGMO 합성 생성물의 GC 분석 결과로, 50% 정도의 전체 수득률(total yield)에 트리-올레인산염(tri-oleate)이 생성되는 상용 효소들과, 트리-올레인산염은 생성되지 않지만 40% 의 수득률에 그친 Pc21g06680 효소와 비교하였을 때, PCLB의 경우 트리-올레인산염이 생성되지 않지만 75%의 DMGO 수득률을 보임으로써 Pc21g06680 효소보다 90%가 증가한 DGMO 합성 효율을 나타냈다. 실제 산업 공정에서 사용되는 DGMO는 모노-올레인산염(mono-oleate)이 고순도로 정제된 형태가 아닌 다이-올레인산염(di-oleate)이 적절히 섞여 있는 중순도의 형태로 사용된다. 따라서 본 발명의 PCLB 효소가 상용 효소를 비롯한 다른 효소에 비하여 DGMO 합성을 위한 산업용 효소로써 큰 효용성이 있는 우수한 효소임을 알 수 있다. 참고로, 상기 표 2에서 상업용 페니실리움 리파제는 페니실리움 카멤베르티(Penicillium camembertii) 균주에서 유래한 리파제로 일본 아마노(Amano) 사의 리파제 G 효소를 가지고 실험하였다.

이를 통해 본 발명에 따른 리파제가 본 발명과 유사한 유전자로 이루어진 다른 효소나 기존의 상용 효소에 비해 리파제 활성이 우수할 뿐만 아니라, 가수분해 활성 및 DGMO 합성 효율도 우수함을 확인하였다. 또한 기질특이성도 전혀 다른 효소로써 사용분야 또한 상이함을 확인하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF CHEMICAL TECHNOLOGY/ILSHINWELLS Co., LTD. <120> Lipase derived from Penicillium chrysogenum and preparation method of lipase using the same <130> KPA160687-KR <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 307 <212> PRT <213> Penicillium chrysogenum <400> 1 Met Arg Phe Ser Phe Phe Thr Ala Leu Ser Ala Val Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 His Ala Leu Pro Gly Lys Val Gln Thr Arg Asp Val Ser Thr Ser Glu 20 25 30 Leu Asn Gln Phe Gly Phe Trp Val Gln Tyr Ala Ala Ala Thr Tyr Tyr 35 40 45 Ile Glu Asn Tyr Asp Ala Gln Val Gly Asp Lys Ile Ser Cys Ser Lys 50 55 60 Gly Asn Cys Pro Glu Val Glu Lys Thr Gly Ala Thr Val Phe Tyr Asp 65 70 75 80 Phe Ser Lys Thr Thr Ile Thr Asp Thr Ala Gly Phe Ile Ala Val Asp 85 90 95 His Thr Asn Ala Ala Val Val Leu Ala Phe Arg Gly Ser His Ser Val 100 105 110 Arg Asn Trp Val Ser Asp Ala Thr Phe Ile His Thr Asn Pro Asp Leu 115 120 125 Cys Asp Gly Cys Leu Ala Glu Leu Gly Phe Trp Ser Ser Trp Glu Leu 130 135 140 Val Arg Asp Asp Ile Ile Lys Lys Leu Lys Asp Ala Val Ser Gln Asn 145 150 155 160 Pro Asp Tyr Glu Leu Val Val Val Gly His Ser Leu Gly Ala Ala Val 165 170 175 Ala Thr Leu Ala Ala Ala Asp Leu Arg Gly Lys Gly Tyr Pro Ser Ala 180 185 190 Lys Leu Tyr Ala Tyr Ala Ser Pro Arg Val Ala Asn Ala Ala Leu Ala 195 200 205 Lys Tyr Ile Thr Ala Gln Gly Asn Asn Tyr Arg Phe Thr His Thr Asn 210 215 220 Asp Pro Val Pro Lys Leu Pro Leu Leu Ser Met Gly Tyr Val His Val 225 230 235 240 Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Thr Ser Pro Asn Asn Ala Thr Val Ser Thr 245 250 255 Ser Asp Ile Lys Val Ile Glu Gly Asp Val Ser Phe Asp Gly Asn Thr 260 265 270 Gly Thr Gly Leu Pro Leu Leu Thr Asp Phe Glu Ala His Val Trp Tyr 275 280 285 Phe Val His Val Asp Ala Gly Lys Gly Pro Gly Leu Pro Phe Lys Arg 290 295 300 Gly Ser Ile 305 <210> 2 <211> 924 <212> DNA <213> Penicillium chrysogenum <400> 2 atgcgtttct ctttctttac ggccctatcc gcagtggctt cgttgggtca tgccctcccc 60 gggaaagtgc agactcgaga tgtttcgacc agcgaactaa accagttcgg cttctgggtt 120 cagtacgccg ccgcgacata ctatatcgag aactatgacg ctcaagtggg cgacaagatc 180 agttgttcga aaggcaactg ccccgaagtc gagaaaaccg gcgcgactgt attctatgac 240 ttttccaaga ccacaatcac agataccgcc ggcttcattg cagtagacca caccaacgcg 300 gcagttgttc tggccttccg cgggtcccac tcagtgcgca actgggtcag cgatgccaca 360 ttcatacaca caaaccctga tctctgtgac ggatgcctcg ccgagctcgg cttctggagc 420 tcatgggagc tagtccgcga cgacatcatc aagaaattga aagatgccgt ctctcagaac 480 cccgactacg agctagtcgt agtaggccac agccttggcg ccgccgtcgc aacccttgct 540 gccgctgatc tccggggcaa aggctacccg tcggctaagc tgtacgcgta tgcctcgcct 600 cgcgtggcca atgcggcttt ggccaagtat attacggcgc agggaaacaa ctaccgtttc 660 actcatacca atgacccggt ccccaagttg ccgttgttgt ccatgggcta tgttcatgtc 720 agtcctgagt attggatcac atcgcctaac aatgccactg tcagtacttc tgatattaag 780 gttattgagg gagatgtctc ctttgacgga aacactggaa ctggtttgcc gttgctgacg 840 gactttgagg cgcatgtctg gtactttgtg cacgttgatg ccggtaaggg ccctgggctg 900 ccgttcaaga ggggttcaat ttga 924 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Forward primer <400> 3 gaattcatgc gtttctcttt cttta 25 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Reverse primer <400> 4 gcggccgctc aaattgaacc cctc 24

Claims (10)

1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 리파제.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 리파제는 페니실리움 크리소게넘(Penicillium chrysogenum) 균주로부터 유래한 것인 리파제.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 리파제는 카프릴산(caprylic acid, C8), 데칸산(decanoic acid, C10), 라우르산(lauric acid, C12) 및 팔미트산(palmitic acid, C16)으로 이루어지는 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 기질로 한 가수분해 활성이 8 내지 14 unit/㎎인 것을 특징으로 하는 리파제.
   
4. 제1항의 리파제를 코딩하는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
   
5. 제4항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.
   
6. 제5항의 발현벡터를 포함하는 형질전환체.
   
7. 제6항에 있어서,
   상기 형질전환체는 피키아 파스토리스( Pichia pastoris) 균주인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
   
8. 제6항의 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 리파제의 제조방법.
   
9. 1) 제1항의 리파제, 제6항의 형질전환체 및 상기 형질전환체의 배양물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 다이글리세롤(diglycerol) 및 올레산(oleic acid)과 반응시켜 반응물을 수득하는 단계; 및
   2) 상기 반응물로부터 PGFE(poly-glycerol fatty acid ester)을 회수하는 단계;
   를 포함하는 PGFE의 생산방법.
   
10. 제9항에 있어서,
    상기 리파제로 인한 PGFE의 수득률은 70 내지 80%인 것을 특징으로 하는 PGFE의 생산방법.
    

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