KR102086235B1 - 리폭시게나아제 조합반응에 의한 레졸빈 d2 유사체 제조방법 및 이로부터 제조된 레졸빈 d2 유사체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 두 가지 종류의 리폭시게나아제를 이용하여 신규의 레졸빈 D2 유사체를 제조하는 방법 및 그 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, 무스 무스쿨루스(Mus musculus) 마우스 유래 8-리폭시게나아제 및 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 균주 유래 15-리폭시게나아제를 이용함으로써, 환경친화적인 방법으로 현재까지 보고되지 않은 새로운 레졸빈 유사체를 높은 생산성과 높은 수율로 제조할 수 있으므로, 의약, 식품 및 화장품 등 다양한 산업 분야에서 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 두 개의 리폭시게나아제(lipoxygenase)를 이용하여 신규한 레졸빈 D2 유사체를 제조하는 방법 및 그 조성물에 관한 것이다.
수산화 지방산은 일반적으로 지방산에 수산화기를 가지고 있는 물질을 의미하며 동물, 식물, 곤충 그리고 미생물 등 여러 생물체의 지질에 존재하는 자연계의 물질이다. 특히, 수산화지방산은 반응성이 뛰어나 산업적으로 원료물질로 사용되며, 수산화기의 작용으로 표면장력의 감소, 항균 및 항진균력 등의 활성이 높아 화장품의 원료물질로 사용된다. 또한 특징적으로 여러 생물체 중 동물에서 발견되는 수산화 지방산은 인체 내의 신호전달물질의 전구체로 이용되며, 단일 물질만으로도 다양한 생리활성에 관여한다. 인간 신호전달물질의 한 종류인 지질 조절제(lipid mediator) 중 레졸빈은 주로 다가불포화지방산으로부터 생산되는 물질로 리폭시게나아제와 에폭사이드 가수분해효소에 의해 전환된다. 레졸빈을 포함하는 지질 조절제들은 인간을 포함한 포유류 내에서 항상성 조절, 면역반응 등 다양한 생리활성 기능에 관여하는 중요한 물질이다.
구체적으로, 레졸빈(resolvin, RV)은 리폭시게나아제들(lipoxygenase, LOX)의 조합반응의 산물로 주로 오메가 3 다가불포화지방산인 에이코사펜타노익산(eicosapentaenoic acid, EPA) 또는 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid, DHA)산으로부터 LOX의 순차적인 반응으로 생성되는 trihydroxy fatty acid 형태의 에이코타노이드(eicosanoid)에 속하는 물질이다. 시작되는 기질에 따라 에이코사펜타노익산을 이용시 레졸빈 E, 도코사헥사엔산을 이용시 레졸빈 D로 분류되고 있다. 이러한 물질들은 급성 염증의 해소 단계에서 유래되는 내인성 지질 매개체로 여러 동물 모델에서 강력한 항염증 및 초기 염증 해소작용을 확인했다. 레졸빈 E1 및 레졸빈 D1의 경우 각각 소염작용과 수술 후 통증을 막을 수 있음을 확인할 수 있었는데 구체적으로 레졸빈 E1의 경우 염증성 물질을 처리한 동물모델에 나노그램(nanogram) 단위의 물질 처리로 강력한 진통 효능을 보임을 확인했다. 레졸빈 E1 및 레졸빈 D1는 절개로 유발되는 통증을 막는 것을 확인했고 특히 레졸빈 D1의 경우 랫 모델에서 수술 후에 생기는 통각과민상태와 이질통을 치유해주거나 막아주는 것을 확인하였으며 척수강에 직접 주사 했을 때 염증 해소 효과가 좀 더 효과적임을 확인한 결과가 있다. 또한 레졸빈 E1, 레졸빈 D1 및 레졸빈 D2는 각각 마우스 피부의 진피를 자극하여 호중구의 침투를 감소시키고 피부 재생을 촉진시키는 것이 보고되었고, 레졸빈 D 계열 중 D1, D2는 당뇨병 마우스 모델에서 상처 치유를 촉진시킨다는 것이 보고되었다. 이에 따라 지금까지 연구된 레졸빈류 외에 비슷한 물질 구조를 지닌 레졸빈류 유사체 (RV analogue)가 개발되면 기존의 레졸빈 류와 같이 강력한 생체 활성은 다른 염증 해소와 관련된 약물을 대체할 수 있는 가능성을 제시할 수 있다는 부분에서 연구 개발이 필요하다고 생각되며 다른 지질 매개체들과 같이 차세대 염증해소와 관련된 의료물질로의 가능성과 의학, 생물학, 생명공학 등 다양한 학문의 연구물질로 사용될 수 있다는 점에 있다고 제시한다.
리폭시게나아제(lipoxygenase, LOX)는 이산소화효소이며, 주로 탄소수 20개의 불포화지방산인 아리키돈산에 산화시키는 위치에 따라 위치특이적 산화효소로 명명되며 지금까지 밝혀진 LOX는 위치특이성에 따라 5-, 8-, 11-, 12-, 15-LOX가 존재한다. 이러한 이산화효소는 산화지방산 합성하는 반응을 촉매하며 철을 함유하는 효소로써 두 가지 반응을 촉매하는 다기능 효소이다. 특징적으로 하나 또는 다수의 시스, 시스-1,4-펜타디엔을 가지는 다가불포화지방산만을 기질로 이용하여 이산소화 반응을 통해 입체특이성과 반응특이성을 촉매한다. 그 중에서도 동물성 다가불포화지방산의 8번 위치에 수산기를 생성하는 아라키돈산 8-리폭시게나아제(이하, 8-리폭시게나아제로 명명)의 경우, 특이적으로 아라키돈산과 같은 탄소수 20개 이상의 불포화지방산에서 8번 탄소 위치에만 수산기를 형성한다. 또한, 탄소수 22개 이상의 불포화 지방산에서는 10번 탄소 위치에 수산기를 형성한다. 8-리폭시게나아제의 경우, 현재까지 마우스 외의 동물에서는 발견된 바가 없으며, 최근엔 해양생물인 산호(coral)류에서 존재가 보고되어 있다. 추가로 레졸빈류 생합성에 이용하고자 하는 리폭시게나아제인 아라키돈산 15-리폭시게나아제(이하, 15-리폭시게나아제로 명명)의 경우 아라키돈산과 같은 탄소수 20개 이상의 불포화지방산에서 15번 탄소 위치에만 수산기를 형성한다. 또한, 탄소수 22개 이상의 불포화 지방산에서는 17번 탄소 위치에 수산기를 형성한다.
현재까지 알려진 레졸빈류는 아세틸화된 cycloxygenase-2, P450 또는 인간유래의 5-리폭시게나아제 및 15-리폭시게나아제에 의해 생성되는 물질이 보고되어 있다. 하지만 위치특이적 산화효소들과 에폭사이드 가수분해효소를 조합하여 기존 보고된 물질이 아닌 새로운 위치특이적 레졸빈 및 그 유사체 합성된 바 없으며, 특히 8-리폭시게나아제, 15-리폭시게나아제 및 에폭사이드 가수분해효소를 조합하여 도코사헥사엔산으로부터 레졸빈 D2 유사체의 생산은 보고된 바가 없다.
본 발명자들은 기존에 보고되지 않은 새로운 레졸빈 유사체를 생합성하기 위하여 지속적으로 노력한 결과, 특정 리폭시게나아제의 조합반응을 통한 합성경로를 작성하고, 생물전환을 통해 새로운 형태의 레졸빈 D2 유사체가 합성되는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
이에 본 발명은 생물전환 공정으로 레졸빈 D2 유사체들을 고수율로 생산할 수 있는 조성물, 레졸빈 D2 유사체의 생산방법 및 이에 의해 생산된 레졸빈 D2 유사체 등을 제공하고자 한다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 무스 무스쿨루스(Mus musculus) 마우스 유래 8-리폭시게나아제; 및 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 균주 유래 15-리폭시게나아제;를 유효성분으로 포함하는, 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 10,17-이과수산화 지방산 제조용 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
[화학식 2]
상기 8-리폭시게나아제는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 15-리폭시게나아제는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있다.
상기 조성물은 기질로 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid, DHA)을 더 포함할 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 무스 무스쿨루스(Mus musculus) 마우스 유래 8-리폭시게나아제; 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 균주 유래 15-리폭시게나아제; 및 믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus) 균주 유래 에폭사이드 가수분해효소를 유효성분으로 포함하는, 하기 화학식 3 또는 화학식 4 중 어느 하나로 표시되는 레졸빈 D2 유사체 제조용 조성물을 제공한다.
[화학식 3]
[화학식 4]
상기 8-리폭시게나아제는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 15-리폭시게나아제는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 에폭사이드 가수분해효소는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있다.
상기 조성물은 기질로 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid, DHA)을 더 포함할 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 무스 무스쿨루스(Mus musculus) 마우스 유래 8-리폭시게나아제를 코딩하는 유전자; 및 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 균주 유래 15-리폭시게나아제를 코딩하는 유전자;를 유효성분으로 포함하는 상기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 10,17-이과수산화 지방산 제조용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 무스 무스쿨루스(Mus musculus) 마우스 유래 8-리폭시게나아제를 코딩하는 유전자; 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 균주 유래 15-리폭시게나아제를 코딩하는 유전자; 및 믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus) 균주 유래 에폭사이드 가수분해효소를 코딩하는 유전자;를 유효성분으로 포함하는 상기 화학식 3 또는 화학식 4로 표시되는 레졸빈 D2 유사체 제조용 조성물을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 무스 무스쿨루스(Mus musculus) 마우스 유래 8-리폭시게나아제; 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 균주 유래 15-리폭시게나아제; 믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus) 균주 유래 에폭사이드 가수분해효소; 및 기질을 반응시켜서 생물 전환으로 상기 화학식 3 또는 화학식 4로 표시되는 레졸빈 D2 유사체를 생산하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 기질로 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid, DHA)을 0.5 mM 내지 5 mM 범위로 사용할 수 있다.
상기 방법은 반응을 pH 6.5 내지 7.5 범위에서 수행될 수 있다.
상기 방법은 반응을 온도 10℃ 내지 30℃ 범위에서 수행될 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 8-리폭시게나아제를 코딩하는 유전자; 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 15-리폭시게나아제를 코딩하는 유전자; 중에서 선택되는 어느 하나의 유전자; 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 에폭사이드 가수분해효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 레졸빈 D2 유사체 제조용 재조합 발현 벡터를 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 숙주세포에 상기 재조합 발현 벡터가 형질전환된 형질 전환체를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 형질 전환체를 기질에 처리하여 레졸빈 D2 유사체를 제조하는 방법을 제공한다.
상기 형질 전환체의 농도는 10 g/L 내지 50 g/L 범위에서 처리될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 화학식 1 또는 화학식 2 로 표시되는 10,17-이과수산화 지방산을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 3 또는 화학식 4로 표시되는 레졸빈 D2 유사체를 제공한다.
또한, 본 발명은 하기 화학식 5 또는 화학식 6으로 표시되는 에폭사이드 화합물을 제공한다.
[화학식 5]
[화학식 6]
본 발명에 따르면, 무스 무스쿨루스(Mus musculus) 마우스 유래 8-리폭시게나아제 및 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 균주 유래 15-리폭시게나아제를 이용함으로써, 현재까지 보고되지 않은 새로운 레졸빈 D2 유사체를 생산할 수 있다.
또한, 본 발명에 따르면 환경친화적인 방법으로 레졸빈 D2 유사체를 높은 생산성과 높은 수율로 제조할 수 있으므로, 의약, 식품 및 화장품 등 다양한 산업 분야에서 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따라 제조된 레졸빈 D2 유사체는 신호전달물질로서, 인간을 포함한 동물 내에서 다양한 생리활성 기능에 관여할 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 8-리폭시게나아제, 15-리폭시게나아제 및 에폭사이드 가수분해효소를 이용하여 도코사헥사엔산을 기질로 하여 생성되는 두 종류의 레졸빈 D2 유사체의 합성경로를 나타낸 것이다.
도 2a는 레졸빈 D2 유사체-1의 생성을 확인한 HPLC 크로마토그램이며, 도 2b는 레졸빈 D2 유사체-2의 생성을 확인한 HPLC 크로마토그램이며, 도 2c는 시간에 따른 레졸빈 D2 유사체의 합성정도를 나타낸 그래프이다.
도 3a는 레졸빈 D2 유사체-1의 물질동정을 위하여 LC-MS/MS를 이용한 물질동정을 진행한 도면이며, 도 3b는 레졸빈 D2 유사체-2의 물질동정 결과이다.
도 4는 본 발명의 무스 무스쿨루스(Mus musculus) 유래 8-리폭시게나아제, 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 유래 15-리폭시게나아제 및 믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus) 유래의 에폭사이드 가수분해효소를 각각 합성시킨 재조합 벡터를 나타낸 것이다.
도 2a는 레졸빈 D2 유사체-1의 생성을 확인한 HPLC 크로마토그램이며, 도 2b는 레졸빈 D2 유사체-2의 생성을 확인한 HPLC 크로마토그램이며, 도 2c는 시간에 따른 레졸빈 D2 유사체의 합성정도를 나타낸 그래프이다.
도 3a는 레졸빈 D2 유사체-1의 물질동정을 위하여 LC-MS/MS를 이용한 물질동정을 진행한 도면이며, 도 3b는 레졸빈 D2 유사체-2의 물질동정 결과이다.
도 4는 본 발명의 무스 무스쿨루스(Mus musculus) 유래 8-리폭시게나아제, 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 유래 15-리폭시게나아제 및 믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus) 유래의 에폭사이드 가수분해효소를 각각 합성시킨 재조합 벡터를 나타낸 것이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명자들은 생물전환 공정을 통해 보다 효과적으로 레졸빈 유사체를 제조하고자 지속적인 연구를 수행하였다. 구체적으로, 본 발명자들은 무스 무스쿨루스(Mus musculus) 마우스 유래 8-리폭시게나아제, 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 균주 유래 15-리폭시게나아제 및 믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus) 균주 유래 에폭사이드 가수분해효소를 클로닝하여 재조합 발현 벡터 및 이로부터 형질전환된 미생물을 제작하고, 이를 이용하여 전세포를 생산한 다음, 이를 기질에 처리함으로써 10, 17-이과수산화 지방산 및 두 가지 종류의 레졸빈 D2 유사체를 높은 생산성과 높은 수율로 제조할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 명세서 내 "10-수산화 지방산"이라 함은 지방산에 1개의 수산화기 또는 과산화기가 치환된 것을 의미하는 것으로, 탄소수가 22개인 불포화 지방산의 10번째 탄소에 수산화기 또는 과산화기를 가지는 것이 바람직하고, 보다 구체적으로, 10-수산화도코사헥사엔산(8-hydroxydocosahexaenoic acid)이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 명세서 내 "17-수산화 지방산"이라 함은 탄소수 20개인 불포화 지방산의 157번째 탄소에 수산화기 또는 과산화기를 가지는 것이 바람직하고, 보다 구체적으로 17-수산화도코사헥사엔산(8-hydroxydocosahexaenoic acid)이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본원 명세서 내 "10,17- 이과수산화 지방산(10,17-dihydroperoxydocosahexaenoic acid)"는 10-수산화, 17-이과수산화도코사헥사엔산(10,17(P)-DiHETE, 10-hydroxy&17-hydroperoxydocosahexaenoic acid) 또는 10-과수산화, 17-수산화도코사헥사엔산(10-hydroperoxy&17-docosahexaenoic acid)를 의미하고 신규 화합물로서, 각각 순서대로 하기 화학식 1 및 화학식 2로 표시된다:
[화학식 1]
[화학식 2]
본원 명세서 내 "레졸빈 D 유사체(resolvin D analogues, RV)는 레졸빈 D2 유사체-1 (resolvin D2 analogue-1, 10,16,17-trihydroxydocosahexaenoic acid) 또는 레졸빈 D2 유사체-2 (resolvin D2 analogue-2, 10,11,17-trihydroxydocosahexaenoic acid)를 의미하고, 신규 화합물로서, 각각 순서대로 하기 화학식 3 및 화학식 4로 표시된다.
[화학식 3]
[화학식 4]
본 발명은 무스 무스쿨루스(Mus musculus) 마우스 유래 8-리폭시게나아제; 및 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 균주 유래 15-리폭시게나아제;를 유효성분으로 포함하는 10,17-이과수산화 지방산 제조용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 무스 무스쿨루스(Mus musculus) 마우스 유래 8-리폭시게나아제; 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 균주 유래 15-리폭시게나아제; 및 믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus) 균주 유래 에폭사이드 가수분해효소를 유효성분으로 포함하는 레졸빈 D2 유사체 제조용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 무스 무스쿨루스(Mus musculus) 마우스 유래 8-리폭시게나아제를 코딩하는 유전자; 및 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 균주 유래된 15-리폭시게나아제를 코딩하는 유전자;를 유효성분으로 포함하는 10,17-이과수산화 지방산 제조용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 무스 무스쿨루스(Mus musculus) 마우스 유래 8-리폭시게나아제를 코딩하는 유전자; 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 균주 유래 15-리폭시게나아제를 코딩하는 유전자; 및 믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus) 균주 유래 에폭사이드 가수분해효소를 코딩하는 유전자;를 유효성분으로 포함하는 레졸빈 D2 유사체 제조용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 무스 무스쿨루스(Mus musculus) 마우스 유래의 8-리폭시게나아제는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것; 상기 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 균주 유래 15-리폭시게나아제는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 것이 바람직하나 상기 서열에 하나 이상의 치환, 결손, 부가 등으로 본 발명이 목적하고자 하는 효과를 달성할 수 있는 돌연변이체 효소 모두 본 발명의 범위에 포함된다. 상기 8-리폭시게나아제는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 유전자로부터 발현된 산물일 수 있고, 상기 15-리폭시게나아제는 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 유전자로부터 발현된 산물일 수 있다.
또한, 상기 믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus) 균주 유래 에폭사이드 가수분해효소는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 것뿐만 아니라, 이의 기능적 동등물, 즉 상기 서열에 하나 이상의 치환, 결손 등의 돌연변이를 유발하여 본 발명의 목적을 달성하는 모든 돌연변이체를 포함하는 것을 의미하며, 상기 에폭사이드 가수분해효소는 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 유전자로부터 발현된 산물일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 기질로 탄소수가 20~22개인 불포화 지방산, 특히, 하나 이상의 cis, cis-1,4 펜타디엔을 가지고 탄소수가 22개인 불포화 지방산, 바람직하게는 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid, DHA)을 포함하는 기질에 처리하기 위한 것일 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 무스 무스쿨루스(Mus musculus) 마우스 유래 8-리폭시게나아제; 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 균주 유래 15-리폭시게나아제; 믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus) 균주 유래 에폭사이드 가수분해효소; 및 기질을 반응시켜서 생물 전환으로 레졸빈 D2 유사체를 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 무스 무스쿨루스(Mus musculus) 마우스 유래의 8-리폭시게나아제는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것; 상기 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 균주 유래 15-리폭시게나아제는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 것이 바람직하나 상기 서열에 하나 이상의 치환, 결손, 부가 등으로 본 발명이 목적하고자 하는 효과를 달성할 수 있는 돌연변이체 효소 모두 본 발명의 범위에 포함된다. 상기 8-리폭시게나아제는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 유전자로부터 발현된 산물일 수 있고, 상기 15-리폭시게나아제는 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 유전자로부터 발현된 산물일 수 있다.
또한, 상기 믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus) 균주 유래 에폭사이드 가수분해효소는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 것뿐만 아니라, 이의 기능적 동등물, 즉 상기 서열에 하나 이상의 치환, 결손 등의 돌연변이를 유발하여 본 발명의 목적을 달성하는 모든 돌연변이체를 포함하는 것을 의미하며, 상기 에폭사이드 가수분해효소는 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 유전자로부터 발현된 산물일 수 있다.
본 발명의 다른 구현 예에 있어서, 상기 기질은 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid, DHA)인 것이 바람직하고, 상기 방법은 기질로 도코사헥사엔산을 0.1 mM 내지 3 mM 범위로 사용하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 실시 예에 있어서, 상기 방법은 반응을 pH 6.5 내지 7.5 범위에서 수행하는 것이 바람직하고, 상기 방법은 반응을 온도 10℃ 내지 30℃ 범위에서 수행하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
다른 측면에서, 본 발명은 8-리폭시게나아제, 15-리폭시게나아제 및 에폭사이드 가수분해효소를 각각 포함하는 재조합 발현 벡터; 및 상기 효소를 모두 포함하는 발현 벡터;를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 의하면, 본 발명은 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 8-리폭시게나아제를 코딩하는 유전자; 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 15-리폭시게나아제를 코딩하는 유전자; 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 에폭사이드 가수분해효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 레졸빈 D2 유사체(resolvin D2 analogue) 제조용 재조합 발현 벡터와, 숙주 세포에 상기 재조합 발현 벡터가 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
상기 8-리폭시게나아제 및 15-리폭시게나아제를 코딩하는 유전자는 각각 서열번호 2 및 서열번호 4로 기재되는 염기 서열로 이루어진 것뿐만 아니라, 이의 기능적 동등물, 즉, 상기 서열에 하나 이상의 치환, 결손 등의 돌연변이를 유발하여 본 발명의 목적을 달성하는 모든 돌연변이체를 포함하는 것을 의미한다.
또한, 에폭사이드 가수분해효소를 코딩하는 유전자는 서열번호 6으로 기재되는 염기 서열로 이루어진 것뿐만 아니라, 이의 기능적 동등물, 즉, 상기 서열에 하나 이상의 치환, 결손 등의 돌연변이를 유발하여 본 발명의 목적을 달성하는 모든 돌연변이체를 포함하는 것을 의미한다.
구체적으로, 상기 8-리폭시게나아제를 포함하는 전세포는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 암호화하는 유전자; 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체를 배양하고, 이를 수득하여 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 15-리폭시게나아제를 포함하는 전세포는 서열번호 3로 기재되는 아미노산 서열을 암호화하는 유전자; 또는 서열번호 4의 염기서열로 이루어지는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체를 배양하고, 이를 수득하여 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 에폭사이드 가수분해효소를 포함하는 전세포는 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열을 암호화하는 유전자; 또는 서열번호 6의 염기서열로 이루어지는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질 전환체를 배양하고, 이를 수득하여 사용하는 것이 바람직하다.
상기 재조합 발현 벡터로서, 유전자 재조합을 위하여 당업계에서 사용되고 있는 플라스미드 벡터라면 어느 벡터를 사용해도 무방하고, 구체적으로 pET-28a(+) 또는 pACYC duet 플라스미드를 사용하는 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 형질전환된 형질전환체로써, 재조합 발현 벡터로 형질전환 되어 목적하는 유전자를 과발현하고 활성이 있는 효소 단백질을 생산할 수 있는 미생물이라면 어느 미생물을 사용해도 무방하고, 구체적으로 대장균 ER 2566 균주를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 (1) 8-리폭시게나아제, 15-리폭시게나아제와 에폭사이드 가수분해효소 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제작하고; (2) 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환 된 미생물을 배양하고; (3) 8-리폭시게나아제, 15-리폭시게나아제와 에폭사이드 가수분해효소 유전자의 발현을 유도하여 (4) 발현된 재조합 단백질과 이를 포함한 균주의 제조방법을 제공한다.
상기 8-, 15리폭시게나아제 및/또는 에폭사이드 가수분해효소를 포함하는 전세포는 i) 상기 미생물의 배양액을 원심분리하여 1차 전세포를 회수하는 단계; ii) 상기 회수한 전세포를 생리식염수(saline solution)으로 세척하는 단계; iii) 상기 세척된 전세포를 2차 원심분리하여 상등액을 제거하고 전세포를 얻는 단계; 및 iv) 상기 2차로 회수한 전세포를 다시 한번 생리식염수로 세척하는 단계를 포함할 수 있다. 구체적으로, i) 단계에서 전세포의 회수는 원심분리기 등 당업계 공지된 기기를 사용하여 13,000 g 내외의 범위에서 수행될 수 있고, ii) 단계에서 전세포의 세척은 0.9% 이하의 염화나트륨 용액으로 수행하는 것이 적당하다.
본 발명은 배양된 8-리폭시게나아제, 15-리폭시게나아제와 에폭사이드 가수분해효소 포함한 세포를 이용하여 10,17-이과수산화 지방산 및 레졸빈 D2 유사체를 합성하는 생산방법을 제공한다.
상기 8-리폭시게나아제, 15-리폭시게나아제 및 에폭사이드 가수분해효소의 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환 된 대장균을 배양하여 재조합 효소 유전자의 발현을 유도한 다음 발현된 단백질 포함한 균주를 회수하여 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 기질로서 지방산을 사용하는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid, DHA)을 사용하는 것이 좋다. 또한, 상기 기질의 농도는 0.5 mM 내지 5 mM 의 농도가 바람직하고 1 mM 내외가 더욱 바람직하다.
또한, 상기 효소 반응은 pH 6.5 내지 pH 7.5의 범위에서 이루어지는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 pH 7.0 내외 범위에서 이루어지는 것이 좋다. 이러한 pH 조건을 유지하기 위해서 반응용매로 HEPES 완충용액을 사용할 수 있다.
또한, 상기 효소 반응은 온도 10℃ 내지 30℃ 범위에서 이루어지는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 25℃ 내외의 온도 범위에서 이루어지는 것이 좋다. 이러한 조건을 유지함으로써, 10,17-이과수산화 지방산 및 레졸빈 D2 유사체 생산 활성을 향상시킬 수 있다.
또한, 상기 전세포 반응의 시간을 통상적인 방법에 따라 적절히 조절할 수 있다.
본 발명의 다른 실시 예에 있어서, 상기 방법은 불포화지방산으로부터 10,17-이과수산화 지방산 및 레졸빈 D2 유사체들을 생산하는 효소인 리폭시게나아제와 에폭사이드 가수분해효소를 지닌 세포의 농도를 10 g/ℓ 내지 50 g/ℓ 범위에서 처리하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
상기한 바와 같이, 본 발명에 따르면, 무스 무스쿨루스(Mus musculus) 마우스 유래 8-리폭시게나아제; 및 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 균주 유래 15-리폭시게나아제를 이용함으로써, 새로운 레졸빈 D2 유사체를 높은 생산성과 높은 수율로 제조할 수 있으므로, 의약, 식품 및 화장품 등 다양한 산업 분야에서 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
본 발명에 따라 제조된, 레졸빈 D2 유사체는 신호전달물질로서, 인간을 포함한 동물 내에서 다양한 생리활성 기능에 관여할 것으로 기대된다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 8-리폭시게나아제, 15-리폭시게나아제 또는 에폭사이드 가수분해효소의 발현을 위한 재조합 발현 벡터 및 형질전환 미생물의 제작
본 발명에서는 8-리폭시게나아제, 15-리폭시게나아제 또는 에폭사이드 가수분해효소를 제조하기 위하여, 마우스, 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 균주 및 믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus) 균주의 유전자로부터 각각 8-리폭시게나아제, 15-리폭시게나아제 및 에폭사이드 가수분해효소를 코딩하는 유전자를 분리하고, 이를 과발현하기 위한 재조합 발현 벡터를 제작하였다.
구체적으로, 한국미생물보존센터(서울)에서 유전자 염기서열 및 아미노산 서열이 이미 특정되어 있는 무스 무스쿨루스(Mus musculus), 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 및 믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus)를 구입하여 선별하고, 이로부터 유래한 8-리폭시게나아제, 15-리폭시게나아제 또는 에폭사이드 가수분해효소의 DNA 염기서열을 기초로 하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하기 위하여 마우스 cDNA, 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 또는 믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus)의 genomic DNA를 추출하였고, 이를 PCR의 주형으로 사용하였으며, 8-리폭시게나아제, 15-리폭시게나아제 또는 에폭사이드 가수분해효소의 DNA 염기서열을 기초로 한 프라이머(primer)를 각각 고안하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하였다. 각 유전자들의 제한효소로 Nde I과 XhoI을 이용하였으며 클로닝 방법은 Gibson assembly 방법을 이용하였고 각각의 primer는 다음과 같다.
마우스 유래 8-리폭시게나아제 서열의 프라이머는 F: AGC GGC CTG GTG CCG CGC GGC AGC CAT ATG GCG AAA TGC AGG GTG AGA GTA TCC ACG(서열번호 7), R: ATC TCA GTG GTG GTG GTG GTG GTG CTC GAG TTA GAT GGA GAC ACT GTT CTC AAT GAG GGG(서열번호 8)로 구성하였고, 버콜데리아 타일렌덴시스(Burkholderia thailandensis) 유래 15-리폭시게나아제 서열의 프라이머는 F: AGC GGC CTG GTG CCG CGC GGC AGC CAT ATG GTC AAT CAC AAA ACC GGG TCA AAT ATG(서열번호 9), R: ATC TCA GTG GTG GTG GTG GTG GTG CTC GAG TCA AAT GTT CGT GCT TGC CGG AAT CCG GCT(서열번호 10)로 구성하였으며, 믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus) 유래 에폭사이드 가수분해효소 서열의 프라이머는 F: AGC GGC CTG GTG CCG CGC GGC AGC CAT ATG GCT GAC ATC ACG CAT CGA ACC GTA AAG(서열번호 11), R: ATC TCA GTG GTG GTG GTG GTG GTG CTC GAG TCA GGC CGG CAG CTT CTT CAG GAA GGC CAG(서열번호 12)로 구성하였다. 또한, 각 유전자를 pET 28a에 클로닝하기 위하여 각각의 벡터들 또한 PCR을 이용하여 준비 후 isothermal buffer를 이용하여 라이게이션하여 재조합 8-리폭시게나아제, 15-리폭시게나아제 및 에폭사이드 가수분해효소를 제작하였다.
이후, 상기와 같이 얻은 재조합 발현벡터는 통상적인 형질전환 방법에 의하여 New England Biolabs (Hertfordshire, UK)에서 구매한 대장균 ER 2566 균주에 형질 전환하고, 형질전환 된 미생물들은 20% 글리세린(glycerine) 용액을 첨가하여 10-수산화지방산, 17-수산화지방산 및 레졸빈 D2 유사체들의 시생산을 위하여 배양한 뒤 사용 전에 -70℃에 냉동 보관하였다.
실시예 2. 8-리폭시게나아제, 15-리폭시게나아제 또는 에폭사이드 가수분해효소의 발현
효소들의 단백질 발현을 위하여, (1)에서 냉동 보관시킨 형질전환 된 미생물들은 500 ml의 LB(Difco, Sparks, MD, USA) 배지와 20 μg/ml의 카나마이신을 가지는 플라스크에서 200 rev/min의 통기조건 하에서 37℃에서 배양하였다. 박테리아의 흡광도가 600 nm에서 0.6에서 0.8에 도달할 때, 효소들의 단백질 발현을 유도하기 위하여 최종농도 0.1 mM IPTG를 첨가한 후 그 배양액을 16시간 동안 16℃에서 150 rev/min로 교반하면서 배양하였다.
배양된 8-리폭시게나아제, 15-리폭시게나아제 또는 에폭사이드 가수분해효소를 포함하는 대장균 세포를 모아서 사용하였다. 또한, 상기와 같이 과발현되어 생산된 8-리폭시게나아제, 15-리폭시게나아제 또는 에폭사이드 가수분해효소는 상기 형질전환 된 균주의 배양액을 6,000xg로 4℃에서 30분 동안 원심분리하여 0.85% 염화나트륨(NaCl)으로 두 번 세척한 다음 10,17-이과수산화지방산 및 2개의 레졸빈 D2 유사체들을 생산하기 위한 재조합 세포로 사용하였다.
실시예 3. 8-리폭시게나아제, 15-리폭시게나아제 및 에폭사이드 가수분해효소를 이용한 도코사헥사엔산으로부터 레졸빈 D2 유사체의 합성경로 구축
상기 8-리폭시게나아제, 15-리폭시게나아제 및 에폭사이드 가수분해효소를 이용하여 레졸빈 D2 유사체의 합성경로를 구축하기 위하여 도코사헥사엔산(DHA)을 기질로 하였으며, 레졸빈 D2 유사체-1 합성경로의 경우 8-리폭시게나아제로부터 10-수산화 도코사헥사엔산을 제조하여 사용하였고, 레졸빈 D2 유사체-2의 합성경로의 경우 15-리폭시게나아제로부터 17-수산화 도코사헥사엔산을 제조하여 사용하였다. 레졸빈 D2 유사체-1은 1 mM의 10-수산화 도코사헥사엔산으로부터 40 g/L의 재조합 8-리폭시게나아제를 사용하였으며, 레졸빈 D2 유사체-2는 1 mM의 17-수산화 도코사헥사엔산으로부터 40 g/L의 재조합 8-리폭시게나아제를 사용하였으며 두 반응 모두 에폭사이드 가수분해 효소와 함께 pH 7.0, 25 ℃에서 1 시간 동안 전세포 반응 (whole cell reaction)을 실시하였다.
그 결과 [도 1]와 같은 합성경로를 구축하였다. 상기 제시된 반응 조건에서 전환된 두 종류의 레졸빈 D2 유사체는 HPLC를 이용하여 확인하고(도 2). 물질동정의 경우 LC-MS/MS를 통해 레졸빈 D2 유사체임을 확인하였다(도 3).
상술한 바와 같이, 본 발명은 마우스 유래 8-리폭시게나아제, 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 유래 15-리폭시게나아제 및 믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus) 유래의 에폭사이드 가수분해효소를 이용하여 인간을 포함한 동물에서 지질 매개체 (lipid mediator)로 작용할 수 있는 수산화 지방산과 지금까지 보고되지 않은 레졸빈 D2 유사체를 생물전환법을 이용하여 생산하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로 기질은 도코사헥사엔산을 사용하고 마우스 유래 8-리폭시게나아제, 버콜데리아 타일란덴시스(Burkholderia thailandensis) 유래 15-리폭시게나아제와 믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus) 유래의 에폭사이드 가수분해효소를 포함하는 형질전환 된 세포를 이용하여 특이적으로 10,17-이과수산화지방산 및 레졸빈 D2 유사체를 생물전환법을 이용하여 생산할 수 있으므로, 종래 화학적인 방법과 비교하여 환경 친화적인 조건으로 극복할 뿐만 아니라 기존에 보고되지 않은 지질 조절제의 생산과 생물전환법에 의한 특이적인 생산이 큰 의미를 가진다.
이상, 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 지방산업계 및 의료계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp
<120> Method for producing resolvin D2 analogues by combination
reaction using recombinant lipoxigenases and resolvin D2
analogues therefrom
<130> 1064118
<160> 12
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 677
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 1
Met Ala Lys Cys Arg Val Arg Val Ser Thr Gly Glu Ala Cys Gly Ala
1 5 10 15
Gly Thr Trp Asp Lys Val Ser Val Ser Ile Val Gly Thr His Gly Glu
20 25 30
Ser Pro Leu Val Pro Leu Asp His Leu Gly Lys Glu Phe Ser Ala Gly
35 40 45
Ala Glu Glu Asp Phe Glu Val Thr Leu Pro Gln Asp Val Gly Thr Val
50 55 60
Leu Met Leu Arg Val His Lys Ala Pro Pro Glu Val Ser Leu Pro Leu
65 70 75 80
Met Ser Phe Arg Ser Asp Ala Trp Phe Cys Arg Trp Phe Glu Leu Glu
85 90 95
Trp Leu Pro Gly Ala Ala Leu His Phe Pro Cys Tyr Gln Trp Leu Glu
100 105 110
Gly Ala Gly Glu Leu Val Leu Arg Glu Gly Ala Ala Lys Val Ser Trp
115 120 125
Gln Asp His His Pro Thr Leu Gln Asp Gln Arg Gln Lys Glu Leu Glu
130 135 140
Ser Arg Gln Lys Met Tyr Ser Trp Lys Thr Tyr Ile Glu Gly Trp Pro
145 150 155 160
Arg Cys Leu Asp His Glu Thr Val Lys Asp Leu Asp Leu Asn Ile Lys
165 170 175
Tyr Ser Ala Met Lys Asn Ala Lys Leu Phe Phe Lys Ala His Ser Ala
180 185 190
Tyr Thr Glu Leu Lys Val Lys Gly Leu Leu Asp Arg Thr Gly Leu Trp
195 200 205
Arg Ser Leu Arg Glu Met Arg Arg Leu Phe Asn Phe Arg Lys Thr Pro
210 215 220
Ala Ala Glu Tyr Val Phe Ala His Trp Gln Glu Asp Ala Phe Phe Ala
225 230 235 240
Ser Gln Phe Leu Asn Gly Ile Asn Pro Val Leu Ile Arg Arg Cys His
245 250 255
Ser Leu Pro Asn Asn Phe Pro Val Thr Asp Glu Met Val Ala Pro Val
260 265 270
Leu Gly Pro Gly Thr Ser Leu Gln Ala Glu Leu Glu Lys Gly Ser Leu
275 280 285
Phe Leu Val Asp His Gly Ile Leu Ser Gly Val His Thr Asn Ile Leu
290 295 300
Asn Gly Lys Pro Gln Phe Ser Ala Ala Pro Met Thr Leu Leu His Gln
305 310 315 320
Ser Ser Gly Ser Gly Pro Leu Leu Pro Ile Ala Ile Gln Leu Lys Gln
325 330 335
Thr Pro Gly Pro Asp Asn Pro Ile Phe Leu Pro Ser Asp Asp Thr Trp
340 345 350
Asp Trp Leu Leu Ala Lys Thr Trp Val Arg Asn Ser Glu Phe Tyr Ile
355 360 365
His Glu Ala Val Thr His Leu Leu His Ala His Leu Ile Pro Glu Val
370 375 380
Phe Ala Leu Ala Thr Leu Arg Gln Leu Pro Arg Cys His Pro Leu Phe
385 390 395 400
Lys Leu Leu Ile Pro His Ile Arg Tyr Thr Leu His Ile Asn Thr Leu
405 410 415
Ala Arg Glu Leu Leu Val Ala Pro Gly Lys Leu Ile Asp Lys Ser Thr
420 425 430
Gly Leu Gly Thr Gly Gly Phe Ser Asp Leu Ile Lys Arg Asn Met Glu
435 440 445
Gln Leu Asn Tyr Ser Val Leu Cys Leu Pro Glu Asp Ile Arg Ala Arg
450 455 460
Gly Val Glu Asp Ile Pro Gly Tyr Tyr Tyr Arg Asp Asp Gly Met Gln
465 470 475 480
Ile Trp Gly Ala Ile Lys Ser Phe Val Ser Glu Ile Val Ser Ile Tyr
485 490 495
Tyr Pro Ser Asp Thr Ser Val Gln Asp Asp Gln Glu Leu Gln Ala Trp
500 505 510
Val Arg Glu Ile Phe Ser Glu Gly Phe Leu Gly Arg Glu Ser Ser Gly
515 520 525
Met Pro Ser Leu Leu Asp Thr Arg Glu Ala Leu Val Gln Tyr Ile Thr
530 535 540
Met Val Ile Phe Thr Cys Ser Ala Lys His Ala Ala Val Ser Ser Gly
545 550 555 560
Gln Phe Asp Ser Cys Val Trp Met Pro Asn Leu Pro Pro Thr Met Gln
565 570 575
Leu Pro Pro Pro Thr Ser Lys Gly Gln Ala Arg Pro Glu Ser Phe Ile
580 585 590
Ala Thr Leu Pro Ala Val Asn Ser Ser Ser Tyr His Ile Ile Ala Leu
595 600 605
Trp Leu Leu Ser Ala Glu Pro Gly Asp Gln Arg Pro Leu Gly His Tyr
610 615 620
Pro Asp Glu His Phe Thr Glu Asp Ala Pro Arg Arg Ser Val Ala Ala
625 630 635 640
Phe Gln Arg Lys Leu Ile Gln Ile Ser Lys Gly Ile Arg Glu Arg Asn
645 650 655
Arg Gly Leu Ala Leu Pro Tyr Thr Tyr Leu Asp Pro Pro Leu Ile Glu
660 665 670
Asn Ser Val Ser Ile
675
<210> 2
<211> 2034
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 2
atggcgaaat gcagggtgag agtatccacg ggggaagcct gtggggctgg cacatgggac 60
aaagtgtctg tcagcatcgt gggaacccac ggagagagcc ccttagtacc tctggaccat 120
ctgggcaagg agttcagcgc cggtgctgaa gaagacttcg aggtgacgct tccccaggac 180
gtaggcactg tgctgatgct gcgagtccac aaagcacccc cggaagtgtc cctcccgctt 240
atgtctttcc gttctgatgc ctggttctgc cgctggttcg agctggagtg gctacctggg 300
gctgcactcc acttcccctg ttatcagtgg ctggaagggg cgggggagct ggtgctgaga 360
gagggagcag caaaggtgtc ctggcaagac catcacccta cactgcagga tcagcgccag 420
aaggagcttg agtccaggca gaagatgtac agctggaaga cttacattga aggttggcct 480
cgctgccttg accacgagac tgtgaaagac ttggacctca acatcaagta ctctgcgatg 540
aagaatgcca aactcttctt taaagcccac tccgcgtata cggagctgaa agtcaaaggg 600
ctcctggacc gcacaggact ctggaggagt ctgagggaga tgagaaggct gtttaacttc 660
cgcaagactc cagcagcaga gtatgtgttt gcacactggc aggaagatgc cttcttcgcc 720
tcccagttcc taaatggcat caacccggtc ctgattcgcc gctgtcacag tctcccaaac 780
aacttcccgg tcactgatga aatggtggcc ccagtgctgg gccctggaac cagtctgcag 840
gctgagttgg agaagggctc cctgttcttg gtggatcatg gcattctttc tggagtccac 900
accaacatcc tcaatggaaa gcctcagttc tctgcagccc cgatgaccct gttacaccag 960
agctcagggt ccggacccct gcttcccatt gccatccagc tcaaacagac tcccgggcca 1020
gacaacccca tcttcctgcc cagcgatgac acgtgggact ggttgctggc caagacctgg 1080
gttcgcaatt ctgagtttta catccatgag gctgtcacac atctgctgca tgcccatctg 1140
attccagaag tctttgcctt ggccacatta cgtcagctgc ctaggtgtca ccctctcttc 1200
aagctattga ttcctcacat tcggtacaca ctgcacatca acacgcttgc ccgggagctg 1260
ctcgttgccc ctgggaagtt gatagacaag tccacaggcc ttggcactgg gggattctct 1320
gacctgataa agagaaacat ggagcagctg aactactctg tcctgtgtct ccctgaagat 1380
atccgagccc gaggtgtgga agacatccca ggctactatt accgagatga tgggatgcag 1440
atctgggggg caataaagag ctttgtctct gaaatagtca gcatctacta tccaagtgac 1500
acatccgtcc aagatgacca agagctccag gcctgggtga gggagatctt ctctgagggc 1560
ttcctcggcc gagaaagctc aggtatgccc tccttgttgg atacccggga agccctggtc 1620
cagtatatca ccatggtgat attcacctgc tcagccaagc atgcagctgt cagttcaggc 1680
cagttcgact cttgtgtttg gatgcccaat ctgccaccta ccatgcagct accaccacct 1740
acttccaaag gccaggcccg gcctgagagt ttcatagcca cgctcccagc agttaattcg 1800
tcaagttatc acatcattgc tctctggctg ctaagcgcag aacctgggga ccaaaggccc 1860
ctgggccact atccagatga acacttcaca gaggatgccc cccggcgaag cgtggctgcc 1920
ttccagagaa agctgatcca gatctccaag ggcatcaggg agaggaaccg aggcctggca 1980
ctgccctaca cctacctgga tcctcccctc attgagaaca gtgtctccat ctaa 2034
<210> 3
<211> 695
<212> PRT
<213> Burkholderia sp.
<400> 3
Met Val Asn His Lys Thr Gly Ser Asn Met Asn Arg Arg Asp Leu Ile
1 5 10 15
Lys Phe Leu Ser Phe Ala Ala Ser Gly Thr Ala Phe Ala Gly Leu Val
20 25 30
Arg Ser Thr Leu Ser Ser Pro Ala Ala Ser Ser Ile Thr Ala Ser Pro
35 40 45
Arg Thr Leu Asp Ala Gly Ile Gly Ile Ser Ser Pro Gln Ala Val Arg
50 55 60
Ala Ala Ala Pro Val Leu Pro Gln Lys Asp Thr Ala Ala Gly Arg Ile
65 70 75 80
Ala Arg Ala Gly Phe Leu Ala Thr Gln Arg Leu Ser Tyr Ile Trp Thr
85 90 95
Glu His Val Pro Thr Ala Ser Gly Ile Pro Leu Ala Leu Val Thr Pro
100 105 110
Gln Asp Leu Pro Thr Ile Glu Trp Leu Ile Lys Phe Ile Ala Ile Val
115 120 125
Val Gly Val Ile Glu Asn Phe Leu Gly Ser Ala Pro Ala Thr Ala Val
130 135 140
Ala Leu Trp Arg Asp Gln Phe Ala Lys Ile Arg Val Asp Leu Leu Ser
145 150 155 160
Leu Glu Asn Leu Tyr Ser Asp Leu Thr His Asp Pro Asn Leu Gln Asp
165 170 175
Pro Val Ala Ile Ala Gln Ala Ala Ser Ile Gln Ala Ala Leu Ile Ala
180 185 190
Leu Leu Ala Asn Val Gly Val Leu Ser Lys Asp Ile Ile Ser Arg Leu
195 200 205
Gly Glu Ile Val Ser Asn His Asp Thr Arg Ser Glu Glu Asn Phe Lys
210 215 220
Ala Leu Phe Ser Thr Phe Pro Leu Pro Asp Ile Ser Ala Ala Tyr Gln
225 230 235 240
Arg Asp Asp His Phe Ala Ser Leu Arg Val Ala Gly Gln Asn Pro Val
245 250 255
Leu Ile Lys Arg Ile Ser Gly Leu Pro Ser Lys Phe Pro Leu Thr Asn
260 265 270
Ala Gln Phe Gln Gln Val Met Gly Pro Ala Asp Asn Leu Val Ser Ala
275 280 285
Ala Ala Glu Asn Arg Leu Tyr Leu Leu Asp Tyr Val Asp Asn Gly Leu
290 295 300
Leu Ala Thr Ser Arg Ala Val Ala Lys Pro Leu Thr Gly Ile Gly Tyr
305 310 315 320
Ser Tyr Ala Pro Ile Ala Leu Phe Ala Leu Pro Arg Gly Gly Ala Ser
325 330 335
Leu Val Pro Val Ala Ile Gln Cys Asp Gln Asp Pro Ala Thr Asn Pro
340 345 350
Leu Phe Leu Pro Ala Asp Pro Ser Gln Glu Ser Ala Tyr Trp Ala Trp
355 360 365
Gln Met Ala Lys Thr Val Val Gln Cys Ala Glu Glu Asn Tyr His Glu
370 375 380
Met Phe Val His Leu Ala Arg Thr His Leu Val Thr Gly Ala Ile Cys
385 390 395 400
Val Ala Thr His Arg Asn Leu Ala Ser Thr His Pro Leu Tyr Ala Leu
405 410 415
Leu Met Pro His Phe Glu Gly Thr Leu Tyr Ile Asn Glu Leu Ala Ala
420 425 430
Leu Thr Leu Leu Pro Pro Leu Met Phe Ile Asp Thr Leu Phe Ala Ala
435 440 445
Pro Ile Gln Gln Thr Gln Gln Met Val Ala Ser Asp Arg Leu Ala Phe
450 455 460
Asp Phe Tyr Asp His Met Leu Pro Asn Asp Ile Glu Met Arg Gly Val
465 470 475 480
Gly Ala Ala Asn Leu Pro Asp Tyr Pro Tyr Arg Asp Asp Gly Leu Leu
485 490 495
Ile Trp Asn Ala Ile Ala Glu Trp Ala Lys Ala Tyr Val Asp Val Tyr
500 505 510
Tyr Lys Ser Asp Gln Asp Val Val Asp Asp Tyr Glu Leu Arg Ser Trp
515 520 525
Ala Ala Asp Ile Ile Ala Asn Gly Lys Val Lys Gly Phe Arg Pro Val
530 535 540
Arg Ser Lys Ala Gln Leu Ile Asp Val Leu Thr Met Ile Ile Phe Thr
545 550 555 560
Ala Ser Ala Gln His Ala Ala Val Asn Phe Ser Gln Ser Asp Phe Ser
565 570 575
Thr Tyr Ala Pro Ala Leu Ser Ala Leu Leu Ser Ala Pro Ala Pro Thr
580 585 590
Ser Ala Val Gly Lys Ser Lys Ala Asp Trp Leu Lys Met Leu Pro Pro
595 600 605
Leu Val Ser Gly Ile Glu Arg Val Ala Ile Tyr Glu Ile Leu Ala Gly
610 615 620
Val Gln His Ser Ala Leu Gly Gln Tyr Arg Ser Asn Val Phe Pro Tyr
625 630 635 640
Arg Pro Leu Ile Thr Asp Pro Ala Ile Thr Gly Ser Asn Gly Pro Leu
645 650 655
Glu His Phe Arg Gln Ala Leu Gly Asp Val Glu Ser Gln Ile Asn Ala
660 665 670
Arg Asn Ser Ile Arg Lys Thr Pro Tyr Glu Tyr Leu Leu Pro Ser Arg
675 680 685
Ile Pro Ala Ser Thr Asn Ile
690 695
<210> 4
<211> 2088
<212> DNA
<213> Burkholderia sp.
<400> 4
atggtcaatc acaaaaccgg gtcaaatatg aaccgaaggg atttaattaa attcttgagc 60
ttcgccgcca gcggaaccgc gtttgcgggg ctcgtcaggt cgactctgtc gtcaccggcc 120
gcgtcgtcga tcaccgcaag ccctcgcacg ctcgacgccg gcatcggcat ttcgtcgccg 180
caggcggttc gcgcagccgc gccggtgctg ccgcaaaaag acacggccgc aggcaggatc 240
gcacgggcgg gttttctcgc cacgcaaaga ctgagttaca tctggacgga acatgtgccg 300
accgcgagcg gcattccact tgcgctggtc acgccgcaag atcttccaac cattgaatgg 360
ctgatcaaat tcatcgcgat cgttgtgggc gtcatcgaga attttctcgg ctccgcaccc 420
gcgacggcgg ttgccctctg gcgcgatcag ttcgccaaga tcagggtgga tctgctttcc 480
ctcgaaaacc tgtattcgga tctcacccac gatccgaact tgcaagaccc ggttgccatt 540
gctcaggcag cgagcattca ggcggccttg atcgcgctgt tggcgaacgt cggcgtcttg 600
tcgaaggaca tcatttcaag attgggcgaa atcgtctcca accacgacac tcgaagcgaa 660
gagaacttca aggcgctgtt ttccaccttc ccgcttcccg acatctccgc cgcgtaccag 720
cgggacgatc atttcgcgtc tctccgggtt gccggccaga atccggtgtt gatcaagcgc 780
atctccggct tgccgtcgaa gttcccactg acgaacgctc aattccagca agtcatgggg 840
cccgccgaca atctcgtcag cgccgccgcg gagaatcggc tgtatctcct cgattacgtc 900
gacaacggtc tgttggcgac gtcgcgggcc gtggccaaac cactcacggg catcggctac 960
tcctatgcgc ccatcgcact tttcgcgctg ccgaggggcg gcgcgtccct cgttcccgtg 1020
gcgattcaat gcgatcagga tcccgcgacg aatcccctgt tcctccctgc cgatcccagt 1080
caggaatccg cctattgggc gtggcaaatg gccaagacgg tcgttcaatg cgcggaggaa 1140
aactatcacg agatgtttgt tcatctcgcg cgaacgcacc tggtgaccgg cgcgatttgc 1200
gtcgccactc accggaatct cgcgtcgacg catccgctct acgcgcttct gatgccgcac 1260
ttcgagggca ctttgtacat caacgaactc gccgcgctca cgctgcttcc accgttgatg 1320
ttcatcgata cgctgtttgc cgcgcccatc cagcagacgc aacagatggt cgcaagcgat 1380
cggctcgcgt tcgatttcta cgatcacatg ttgcccaacg acatcgaaat gcgcggagtc 1440
ggcgcggcca acctgccgga ctatccgtat cgcgacgacg gcctcctgat ttggaacgcc 1500
atcgccgaat gggcgaaggc gtatgtcgat gtctattaca agtccgatca ggatgtcgtc 1560
gatgactacg agctcaggtc ctgggccgcc gacatcatcg ccaacggcaa ggtcaaggga 1620
ttccggccgg tgcgttcgaa ggcgcaattg atcgacgtgc tgaccatgat catctttacc 1680
gcaagcgccc agcacgccgc cgtcaacttc tcgcagtcgg atttttcgac ctacgcgccc 1740
gcgctttccg cactgctgtc cgcgccggcc ccgacaagcg ccgtgggaaa aagcaaggcc 1800
gattggctga agatgctccc tcccctcgtt tcagggatcg agcgggttgc gatctacgag 1860
atcttggcgg gcgtccagca cagcgcgttg ggccagtatc gcagcaacgt atttccatat 1920
cggccgctca tcacggaccc cgcgatcacc ggaagcaacg ggccgctcga gcatttccga 1980
caggcgctcg gcgacgtcga atcgcagatc aacgctcgca acagcatacg caagacgcct 2040
tatgaatatc tgctgccgag ccggattccg gcaagcacga acatttga 2088
<210> 5
<211> 319
<212> PRT
<213> Myxococcus xanthus
<400> 5
Met Ala Asp Ile Thr His Arg Thr Val Lys Thr Asn Gly Ile Asn Leu
1 5 10 15
His Leu Ala Glu Ala Gly Ser Gly Pro Leu Val Leu Leu Leu His Gly
20 25 30
Trp Pro Glu Ser Trp Tyr Ser Trp Arg His Gln Leu Pro Ala Leu Ala
35 40 45
Ala Ala Gly Tyr His Ala Val Ala Pro Asp Val Arg Gly Tyr Gly Gln
50 55 60
Ser Asp Lys Pro Glu Ala Ile Glu Ala Tyr Ser Met Lys Gln Leu Val
65 70 75 80
Gly Asp Ala Val Gly Leu Leu Asp Ala Leu Gly Glu Arg Thr Ala Ile
85 90 95
Val Ile Gly His Asp Trp Gly Ser Ala Ile Ala Trp Asn Cys Ala Ala
100 105 110
Leu His Pro Asp Arg Phe Arg Ala Val Val Gly Met Ser Val Pro His
115 120 125
Leu Gly Arg Ala Pro Met Pro Pro Met Gln Leu Phe Gln Arg Met Phe
130 135 140
Gly Glu Lys Trp Phe Tyr Ile Leu Tyr Phe Gln Glu Pro Gly Val Ala
145 150 155 160
Glu Ala Glu Phe Glu Ala Asp Val Pro Arg Thr Val Arg Ala Ile Leu
165 170 175
Thr Gly Thr Pro Gly Phe Asp Val Thr Asn Pro Ala Val Leu Ala Lys
180 185 190
Lys Lys Gly Glu Gly Phe Leu Ala Arg Leu Asp Val Pro Glu Thr Leu
195 200 205
Pro Gly Trp Leu Thr Glu Ala Asp Val Ala Tyr Phe Ala Lys Glu Leu
210 215 220
Ala Gly Ser Gly Phe Arg Gly Gly Leu Asn Arg Tyr Arg Asn Met Asp
225 230 235 240
Arg Asp Trp His Glu Leu Pro Glu Leu Ala Thr Ala Val Ile Ser Gln
245 250 255
Pro Ala Leu Tyr Ile Val Gly Glu Lys Asp Pro Val Arg Ala Phe Ser
260 265 270
Pro Val Asp Pro Met Lys Ala Leu Val Pro Asn Leu Ala Asp Ile His
275 280 285
Val Ile Pro Gly Ala Gly His Trp Val Gln Gln Glu His Ala Ala Glu
290 295 300
Val Asn Ala Ala Leu Leu Ala Phe Leu Lys Lys Leu Pro Ala Glx
305 310 315
<210> 6
<211> 957
<212> DNA
<213> Myxococcus xanthus
<400> 6
atggctgaca tcacgcatcg aaccgtaaag acgaatggca tcaacctgca cctcgcggag 60
gcgggttcag ggccgctcgt gttgctcctg catggttggc cggagtcctg gtactcgtgg 120
cgccatcagc ttccggcgtt ggcggcggcg gggtaccacg cggtggcccc agacgtccgt 180
ggctacggcc agagcgacaa gccggaggcc atcgaggcgt acagcatgaa gcagttggtg 240
ggtgatgcgg ttggcctgct ggatgcgctg ggggagagga cggccatcgt catcggccac 300
gactggggct cggcgattgc ctggaactgt gccgccctgc atcccgaccg cttccgcgcg 360
gtggtgggaa tgagcgttcc ccatctgggg cgcgcgccca tgccgcccat gcagttgttt 420
cagcgcatgt tcggtgagaa gtggttctac atcctctact tccaggagcc cggcgtggcc 480
gaggccgagt tcgaggcgga cgtcccgagg acggtccggg cgattctcac gggcaccccc 540
ggcttcgatg tgacgaatcc cgccgtgctg gcgaagaaga agggggaagg cttcctcgcg 600
aggctcgacg tacctgagac gttgcccggc tggctcaccg aggcggacgt cgcgtacttc 660
gcgaaggagc tcgccggcag tggattccgg ggcgggctca atcgctaccg caacatggac 720
cgggactggc acgaactgcc ggagctggcg acggcggtca tctcgcagcc ggccctctac 780
atcgtcggag agaaggaccc ggtgcgtgcc ttctctcccg ttgacccgat gaaggccctg 840
gtgccgaacc tggccgacat ccacgtcatt cccggcgcgg gtcattgggt tcagcaggag 900
cacgccgccg aggtgaatgc cgcgctgctg gccttcctga agaagctgcc ggcctga 957
<210> 7
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 7
agcggcctgg tgccgcgcgg cagccatatg gcgaaatgca gggtgagagt atccacg 57
<210> 8
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 8
atctcagtgg tggtggtggt ggtgctcgag ttagatggag acactgttct caatgagggg 60
60
<210> 9
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 9
agcggcctgg tgccgcgcgg cagccatatg gtcaatcaca aaaccgggtc aaatatg 57
<210> 10
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 10
atctcagtgg tggtggtggt ggtgctcgag tcaaatgttc gtgcttgccg gaatccggct 60
60
<210> 11
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 11
agcggcctgg tgccgcgcgg cagccatatg gctgacatca cgcatcgaac cgtaaag 57
<210> 12
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 12
atctcagtgg tggtggtggt ggtgctcgag tcaggccggc agcttcttca ggaaggccag 60
60
Claims (19)
- 제1항에 있어서,
상기 8-리폭시게나아제는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 15-리폭시게나아제는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 것인 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 조성물은 기질로 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid, DHA)을 더 포함하는 조성물.
- 제4항에 있어서,
상기 8-리폭시게나아제는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 15-리폭시게나아제는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 에폭사이드 가수분해효소는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지는 조성물.
- 제4항에 있어서,
상기 조성물은 기질로 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid, DHA)을 더 포함하는 조성물.
- 제9항에 있어서,
상기 방법은 기질로 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid, DHA)을 0.5 mM 내지 5 mM 범위로 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제9항에 있어서,
상기 방법은 반응을 pH 6.5 내지 7.5 범위에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제9항에 있어서,
상기 방법은 반응을 온도 10℃ 내지 30℃ 범위에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 숙주세포에 제13항에 따른 재조합 발현 벡터가 형질전환된 형질 전환체.
- 제14항의 형질 전환체를 기질에 처리하여 레졸빈 D2 유사체를 제조하는 방법.
- 제15항에 있어서,
상기 형질 전환체의 농도를 10 g/L 내지 50 g/L 범위에서 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 삭제
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Butovich et al., Lipids, 2005, Vol. 40, No. 3, pp. 249-257* |
THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 2003, Vol. 278, No. 17, pp. 14677-14687 |
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