KR101504368B1 - 보트리티스에 대한 높은 수준의 내성을 갖는 토마토 식물 - Google Patents

보트리티스에 대한 높은 수준의 내성을 갖는 토마토 식물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 토마토에서 보트리시스 시네리아에 대한 내성과 관련된 양적형질유전자자리(QTL)를 검출하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은, 보트리티스-내성 주게 토마토 식물을 비-내성 또는 보트리티스-감염 수용 토마토 식물과 교배하는 단계, 하나 이상의 자손 식물을 감염성 양의 보트리티스와 접촉하는 단계, 상기 하나 이상의 자손 식물에서 질병 발생 및/또는 병변 성장 속도를 정량적으로 결정하는 단계, 상기 하나 이상의 자손 식물에서 관찰된 질병 발생 및/또는 병변 성장 속도를 상기 주게 토마토 식물의 염색체성 마커의 존재와 연결하는 유전 연관 지도를 확립하는 단계, 그리고 QTL에 감소된 질병 발생 및/또는 감소된 병변 성장 속도에 연관되는 상기 지도상의 연속 마커를 배정하는 단계를 포함한다.
보트리시스 시네리아, 보트리티스-내성 토마토 식물,

Description

보트리티스에 대한 높은 수준의 내성을 갖는 토마토 식물{TOMATO PLANTS HAVING HIGHER LEVELS OF RESISTANCE TO BOTRYTIS}
본 발명은 식물 육종 및 분자 생물학에 관한 것이다. 더욱 특별히는, 본 발명은 토마토에서 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea)에 대한 내성과 관련된 양적 형질 유전자 자리(QTL)을 검출하는 방법, 그것과 함께 보트리티스-내성 토마토 식물을 생산하는 방법 및 그것에 의해 얻은 보트리티스-내성 토마토 식물 및 그것의 일부에 관한 것이다.
보트리티스 시네리아는 적어도 235개의 가능한 숙주를 포함하는, 예외적으로 광범위한 숙주를 갖는 괴사형(necrotrophic) 병원성 균류이다. 이들의 광범위한 숙주 범위로 인해 그리고 이것은 식물의 경제적으로 중요한 부분에 영향을 미치므로 보트리티스 시네리아는 많은 상업적으로 재배되는 곡물에서 중요한 문제이다. 재배자에게 있어서, 균류는 일반적으로 보트리티스로 불리운다. 경작 토마토(Solanum lycopersicum; 이전에는 Lycopersicon esculentum)는 보트리티스에 감염되기 쉽고 균류는 일반적으로 토마토 식물의 줄기, 잎 그리고 열매에 영향을 미친다. 난방된 온실에서 줄기에서 보트리티스에 의한 감염 발생이 특히 일반적이다.
보트리티스는 감염된 세포를 활발히 죽여, 연화, 마름, 잎 반점, 고사병 및 줄기 암을 일으킨다. 감염된 잎들은 분생자병(conidiophores) 및 분생자(conidia), 그리고 이어서 허탈과 시듦을 가져온다. 균류는 병든 잎으로부터 줄기로 성장하여, 길이가 수 밀리미터에서 수 센티미터인 마르고, 밝은 갈색의 병변을 생성한다. 병변은 또한 줄기의 전지 상처에서도 형성될 수 있다. 줄기 병변은 또한 회색 곰팡이병으로 덮힐 수 있다. 여러 경우에, 감염은 줄기를 띠로 묶고 식물을 죽인다.
토마토 식물의 오래되고 노화된 조직은 보통 어린 조직보다 보트리티스에 의해 공격받기 쉽다. 온실에서 성장하는 토마토에서 보트리티스의 전개를 막기위해, 온도와 상대 습도가 밀접하게 조절되어야 한다. 잎이 젖지않도록 물을 공급하는 것이 또한 중요하다. 야생 식물의 경우, 양호한 배수 및 잡초 조절이 적용되어야 한다. 더우기, 식물의 영양 수준이 높게 유지되어야 한다. 그러나, 이들 예방적 조치들은 감염의 경우에 상당한 수득률 손실의 발생을 완전히 막을 수 없다.
살균제는 온실과 야생 토마토 모두에서 보트리티스의 제어에 사용할 수 있다. 몇몇 살균제의 예는 Dowicide A® 및 클로로탈로닐을 포함하고, 이것은 수확 후 토마토에 적용될 수 있다. 그러나, 보트리티스는 몇몇 통상적으로 사용되는 살균제에 대해 내성을 갖는다고 알려져 있다. 이에 더하여, 살균제의 사용은 경제적인 면과 환경적 전망에서 모두 바람직하지 않다. 현재, 보트리티스에 내성을 나타내는 시판 토마토 변종에 대한 요구가 있다.
보트리티스에 대한 부분적인 내성이 토마토의 여러 야생 종에서 발견되어왔다(Egashira et al. 2000; Nicot et al. 2002; Urbasch 1986). 그러나 이들 식물들은 상업적 곡물 토마토를 생산하지 않는다.
WO 02/085105는 보트리티스에 대한 부분적인 내성에 관여한다고 믿어지는 솔라눔 해브로채티스(S. habrochaites)의 게놈의 염색체 10에 대한 유전적 영역을 기재한다. 배양된 토마토 변종으로의 이 유전적 물질의 유전질침투는 보트리티스에 대해 부분적으로 내성인 배양된 토마토 식물을 제공하는 것을 나타났다. 그러나, 지금까지는 토마토에서 보트리티스에 대한 내성을 제공하는 목적의 육종 프로그램은 제한적으로만 성공하였다. 이와 같은 불량한 결과의 이유는 현재 분명하지 않다. 일부는 보트리티스-내성의 유전적 기초 및 유전에 대한 불충분한 지식 때문인 듯하다. 또 다른 부분은, 육종 프로그램에서 얻어진 토마토 식물에서 보트리티스-내성 수준을 평가하기 위한 적절한 생물학적 정량의 결여에 기인할 것이다. 또한 지식과 방법에 대한 부족은 보트리티스에 대한 내성에 관여하는 유전자를 포함하는 야생 취득물과 후손 식물 모두로부터 식물체를 선택하는 것을 복잡하게 한다.
선행 연구에서, 본 발명자들은 토마토에서의 보트리티스 내성이 소유전적으로(polygenically) 상속되고, 이것은 부분적으로 내성 식물체의 육종에 대한 불량한 결과를 설명한다는 것을 발견하였다.
본 발명의 목적은 보트리티스에 대해 내성인 상업적 토마토 변종을 제공하는 것을 목적으로 하는 육종 프로그램의 성공을 개선하는 것이다. 본 발명의 추가의 목적은 상업적 토마토 변종에서 보트리티스에 대한 추가적 및/또는 개선된 내성을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 이와 같은 식물에서 보트리티스에 대한 내성에 관여하는 야생 토마토 수집종(accession)의 게놈에 추가적인 유전적 물질을 제공하는 것이다. 이와같은 추가의 유전적 물질은 배양된 토마토의 보트리티 스-내성 변이체의 생산을 위한 기본을 확장하는데 사용될 수 있다.
본 발명자들은 솔라눔 해브로채티스의 게놈에서, 유전 물질이 보트리티스에 대한 내성에 관여한다는 것이 이전에 확인되지 않았던 많은 염색체에 상에 존재하는 것을 발견하였다. 사실, 본 발명자들은 토마토의 야생 친족 계통의 게놈에서, 즉 솔라늄 해브로채티스 LYC 4/78에서, 양적 형질 유전자자리(QTL)를 성공적으로 동정하였다. 이들 추가의 QTL은 유전질침투 계통의 사용에 의해 발견되었다.
본 발명자들은 이어서 이들 보트리티스-내성 야생형(주게) 토마토 계통의 식물을 비-내성 이식편 토마토 식물과 교배하여 보트리티스-내성 토마토 식물을 생산할 수 있었다. 이들 식물들은 지금까지 생산된 어느 배양 토마토 식물들보다 더 높은 내성을 나타냈다.
육종 과정을 모니터하고 검출할 수 있는 추가의 스크리닝 기준의 이용가능성에 선행기술을 능가하는 개선이 있다. 내성 야생 솔라늄 해브로채티스와 감염성 배양 토마토 사이의 교배로부터 생산된 자손 식물은 야생 수집종에서 보트리티스에 대한 내성에 관여하는 하나 이상의 또는 모든 유전 영역을 갖도록 선택될 수 있다. 그 결과, 토마토 식물을 생성하는 방법은 요구되는 유전적 구성이 더 잘 조절되어 제공된다. 본 발명의 이점은, 유전적인 면에서 자손이 유전적 특질에 대해 야생 수집물을 더 밀접하게 닮도록 만들 수 있다는 것이다. 결론적으로, 배양된 토마토 식물에서 내성 특질은 그 안에 더욱 안전하게 도입될 수 있고, 즉 가능성은 유전적 영역이 쉽게 유전질침투될 수 있고, 후손 식물로 전달이 어렵고, 게놈 영역이 필수적이고, 협동적이고, 배양된 토마토의 부분적으로 내성 계통에서 내성 수준을 더욱 개선시키는데 사용될 수 있는지를 평가하는데 제공된다.
주게 식물의 분자 마커의 존재와 관련하여, 각각 솔라늄 해브로채티스 LYC 4/78로 부터의 특이 유전자의 유전질침투를 갖는 여러 유전질침투 계통에서 보트리티스 내성 수준을 평가함에 의해, 본 발명자들은 내성 야생 토마토 계통에서 보트리티스-내성과 연결된 추가의 QTL을 동정할 수 있었고 그것에 의해 게놈에서 다중 내성-제공 DNA 서열의 위치를 확립할 수 있었다. 하기에서, 토마토의 보트리티스에 대한 내성과 연관된 양적 형질 유전자자리(QTL)가 보트리티스-내성에 대한 QTL로서 또는 보트리티스-내성과 연관된 QTL로서 어드레스될 것이다.
보트리티스-내성에 대한 5개의 새로운 QTL 모두가 솔라늄 해브로채티스의 야생 유전자 계통에서 발견되었다. 하나의 QTL은 염색체 4에 위치하였고, 이것은 이미 보트리티스에 대한 내성과 연관된 QTL을 갖는 것으로 동정되었다. 이미 내성과 연관된 염색체 상의 영역이 사실 두개의 분리된 QTL을 함유한다는 것이 발견되었다. 다른 QTL은 염색체 6, 9, 11 및 12에서 동정되었다. 새로운 QTL은 이하 질병 발생(DI) 계수로 언급되는, 감염의 초기 정착을 줄이는 식물의 성능을 반영하는 정량적 계수 뿐 아니라, 이하 병변 성장(LG) 속도 계수로 언급되는, 감염의 진행을 느리게하는 식물의 성능을 반영하는 정량적 계수에 모두 관련될 수 있다. 즉, 선행기술에서 보고된 바와 같이, 염색체 10에서 QTL의 존재는 사용된 방법에 의해 확인될 수 없었다. 지금까지 시험된 모든 QTL은 조사하에 QTL에 대해 분리된 BC5S1 또는 BC5S2 (역교배 5, 자가 1 또는 2회) 자손에서 질병 내성을 평가함에 의해 확인될 수 있다.
본 발명의 첫번째 면은 보트리티스-내성 토마토 식물의 생산 방법에 관한 것으로, 상기 방법은
a) 보트리티스-내성 주게 토마토 식물, 바람직하기는 솔라늄 해브로채티스 종의 보트리티스-내성 식물, 더욱 바람직하기는 솔라늄 해브로채티스 LYC 4/78 계통의 보트리티스-내성 식물을 제공하는 단계;
b) 상기 주게 식물로부터 하나 이상의 보트리티스-감염 수용 토마토 식물, 바람직하기는 솔라늄 리코페르시쿰의 식물로 핵산을 전달하는 단계 (여기서 상기 전달은 주게 식물로부터 하나 이상의 감염 수용 식물의 게놈의 상응하는 영역으로 게놈성 물질의 도입을 가져온다);
c) 상기 수용 토마토 식물 (또는 추가의 상기 수용 토마토 식물과 얻어진 역교배 식물의 자가 교배; 즉 상기 전달 후 얻어진 재조합 식물) 중에서, 그것의 게놈에 상기 보트리티스-내성 주게 토마토 식물로부터 유래된 보트리티스-내성에 대한 적어도 하나의 QTL을 포함하는 식물을 선택하는 단계 (여기서, 상기 선택은 상기 수용 토마토 식물의 염색체 4, 6, 9, 11 및/또는 12에서 보트리티스-내성에 대한 상기 적어도 하나의 QTL에 연결된 적어도 하나의 유전 마커에서 를 검출한다)를 포함하고,
- 여기서 상기 식물의 염색체 4 상의 상기 QTL의 위치는 솔라늄 해브로채티스의 염색체 4에서 또는 또는 솔라늄 리코페르시쿰의 염색체 4에서, 더욱 바람직하기는 솔라늄 해브로채티스 LYC 4/78의 염색체 4 또는 솔라늄 리코페르시쿰 cv. 머니메이커 염색체 4에서 유전자 마커 CT50, C2At1g74970, P14M49-283e, P14M48-74e, P14M50-67e, CT173 및 P14M50-85h를 포함하는 게놈성 영역에 의해 표시된다.
바람직한 구현예에서, 상기 식물의 염색체 6에서 상기 QTL의 위치는 솔라늄 해브로채티스의 염색체 6 또는 솔라늄 리코페르시쿰의 염색체 6, 더욱 바람직하기는 솔라늄 해브로채티스 LYC 4/78의 염색체 6 또는 솔라늄 리코페르시쿰 cv. 머니메이커 염색체 6의 유전 마커 P22M50-188h, P14M48-521e, P15M48-386h, P18M51-199h, P18M51-103h, P22M50-103e, P18M51-388e, P15M48-395e, P22M50-124e, P14M48-160e 및 P22M50-513h를 포함하는 게놈성 영역에 의해 표시된다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 식물의 염색체 9의 상기 QTL의 위치는 솔라늄 해브로채티스의 염색체 9 또는 솔라늄 리코페르시쿰의 염색체 9, 더욱 바람직하기는 솔라늄 해브로채티스 LYC 4/78의 염색체 9 또는 솔라늄 리코페르시쿰 cv. 머니메이커 염색체 9의 유전 마커 P18M50-141, P14M49-240, TG254, TG223, TG1O, P18M50-134h, P14M49-243h, P18M50-599, P14M60-222h, P22M51-417h, P14M50-174h, P14M60-157h, P14M60-107h, P15M48-138h, P14M48-113h, Tm2a, P18M51-146h, Pl4M48-282h 및 P14M50-276를 포함하는 게놈성 영역에 의해 표시된다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 식물의 염색체 11의 상기 QTL의 위치는 솔라늄 해브로채티스의 염색체 11 또는 솔라늄 리코페르시쿰의 염색체 11, 더욱 바람직하기는 솔라늄 해브로채티스 LYC 4/78의 염색체 11 또는 솔라늄 리코페르시쿰 cv. 머니메이커 염색체 11의 유전 마커 P14M60-215e, P14M61-173h, P14M50-307h, TG47, P14M50-29xCD, P18M51-358h, P18M50-27xCD, P18M51-136h, P22M50-488h, TG393, P14M61-396h, P22M51-235h 및 P22M51-174e를 포함하는 게놈성 영역에 의해 표시된다
또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 식물체의 염색체 12의 상기 QTL의 위치는 솔라늄 해브로채티스의 염색체 12 또는 솔라늄 리코페르시쿰의 염색체 12, 더욱 바람직하기는 솔라늄 해브로채티스 LYC 4/78의 염색체 12 또는 솔라늄 리코페르시쿰 cv. 머니메이커 염색체 12의 유전 마커 CT19, TG68, P14M48-411e, P18M50-244h, P18M50-273h, P14M61-420h, P14M61-406h, P14M61-223h, P14M60-193h, P22M51-314h, TG565, P14M48-172h, P22M50-321e, P14M60-219e, P14M48-153h, P22M50-97h, TG296, P22M50-131h 및 P22M51-135h 바람직하기는 게놈성 마커 P14M61-420h, P14M61-406h, P14M61-223h, P14M60-193h, P22M51-314h, TG565, P14M48-172h, P22M50-321e, P14M60-2X9e, P14M48-153h, P22M50-97h, TG296, 및 P22M50-131h를 포함하는 게놈성 영역에 의해 표시된다.
보트리티스-내성에 대한 적어도 하나의 QTL 또는 그것의 보트리티스-내성-제공부를 포함하는 핵산의 전달은 후손 식물을 생산하기 위해 상기 보트리티스-내성 주게 토마토 식물을 보트리티스-감염 수용 토마토 식물과 교배함에 의해 적절히 수행될 수 있다.
그러므로, 바람직한 선택법은 상기 유전질침투된 DNA의 마커-연관 선택(MAS) (Tanksley et al. 1998 참조)을 포함하고, 여기서 상기 QTL과 연관된 하나 이상의 마커가 후손 식물에서 검출된다. MAS는 예를 들면 상기 후손 식물로부터 유전적 물질을 단리하고, 분자 기술에 의해, 그 안에 하나 이상의 주게 식물 마커의 존재를 결정함에 의해 수행될 것이다. 선택적으로, 분자 마커 검출법은 유전 물질의 선행 분리없이 사용될 수 있다. 임의로, 마커 검출에 더하여, 보트리티스 내성에 대한 표현형 시험이 적합한 식물을 선택하기 위해 수행될 수 있다. 그러므로, 매우 적합한 시험은 여기에 기재된 바와 같이 양적 생물학적 정량이고, 그것에 의해 질병 발생 및/또는 병변 성장 속도와 같은 계수들이 결정된다. 내성 표현형의 존재의 확립과 결합하여 보트리티스-내성에 대한 QTL로부터 적어도 하나의 마커의 존재의 확인은 주게 식물에서 수용 식물로의 적어도 하나의 QTL 또는 그것의 보트리티스-내성 제공부를 포함하는 핵산의 성공적인 전달의 증거를 제공한다.
보트리티스-내성 토마토 식물을 생산하는 방법의 선택적인 구현예에서, 핵산의 표시된 전달은 유전질침투법(예를 들면 형질전환)에 의해, 원형질체 융합에 의해, 이중 단배체(doubled haploid) 기술에 의해 또는 배아구조에 의해 적절히 수행될 수 있다.
보트리티스-내성 식물의 생산법의 바람직한 구현예에서, 주게 식물은 솔라늄 해브로채티스 LYC 4/78이고 이들 주게 식물로부터 수용 식물로 전달되는 핵산은 보트리티스 내성과 연관된 솔라늄 해브로채티스의 염색체 4, 6, 9, 11 및/또는 12 상의 QTL 또는 그것의 보트리티스-내성-제공부로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 보트리티스-내성에 대한 적어도 하나의 QTL을 포함한다.
보트리티스-내성 토마토 식물의 생산법의 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 방법은 1세대 후손 식물을 생성하기 위해 상기 보트리티스-내성 주게 토마토 식물과 보트리티스-감염 수용 토마토 식물을 교배하고; 1세대 후손 식물 중에서, 상기 주게 토마토 식물로부터 유전질침투된 핵산을 게놈에 포함하는 식물을 선택하고, 여기서 상기 유전질침투된 핵산은 본 발명에 따른 보트리티스-내성을 위한 적어도 하나의 QTL, 바람직하기는 두개, 더욱 바람직하기는 2개 보다 많은 QTL 또는 그것의 보트리티스-내성 제공부를 포함하고; 상기 선택된 후손 식물을 적합한 상업적 토마토 계통과 교배하여 2세대 후손 식물을 생산하고; 상기 2세대 후손 식물 중에서, 상기 1세대 후손 토마토 식물로부터 유전질침투된 핵산을 게놈에 포함하는 식물을 선택하고, 여기서 상기 유전질침투된 핵산은 본 발명에 따른 보트리티스-내성을 위한 적어도 하나의 QTL, 바람직하기는 2개, 더욱 바람직하기는 2개 보다 많은 QTL 또는 그것의 보트리티스-내성 제공부를 포함하고; 그리고 임의로 후손 식물의 추가 세대를 생산하는 것을 포함한다. 후손 식물에 유전질침투되는 보트리티스-내성에 대해, 언급된 바람직하기는 2개, 더욱 바람직하기는 2개 이상의 QTL은 질병 발생에 관한 QTL, 병변 성장률에 관한 QTL 또는 이들 유형의 조합일 수 있다.
가장 바람직한 구현예에서, 단계 c)는 솔라늄 해브로채티스 바람직하기는 보트리티스 내성과 연관된 계통 LYC 4/78의 염색체 1, 2, 4, 6, 9, 11 및 12 상의 QTL로 이루어진 군으로부터 선택되는 보트리티스-내성에 대한 적어도 4개의 QTL을 게놈에 포함하는 식물을 선택하는 것을 포함한다.
또 다른 면에서, 본 발명은 본 발명의 방법으로 얻을 수 있는 보트리티스-내성 토마토 식물 또는 그것의 일부과 관련된다.
본 발명은 추가로, 토마토에서 보트리티스-내성에 대한 QTL에 관한 것으로, 여기서 상기 QTL은 보트리티스-내성과 관련된 솔라늄 해브로채티스, 바람직하기는 계통 4/78의 유전자 4, 6, 9, 11 및 12 상의 QTL로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이들 QTL은 보트리티스에 대한 내성과 앞에서 연관되지 않은 게놈의 위치에 위치한다. 이들 QTL에 대한 상세한 내용은 하기에 더욱 상세히 기재하였다.
이들 QTL에 의해 표시된 게놈의 위치에 존재하는 대립형질은 본 발명의 한 면이다.
본 발명의 QTL은 상기 QTL을 포함하는 단리된, 바람직하기는 이중 가닥 핵산서열 또는 그것의 내성-제공부의 형태일 수 있다. 매우 적합하기는, 적합한 주게 식물의 염색체로부터 단리될 수 있는 핵산 서열의 크기는 상기 염색체에서 1-100cM, 바람직하기는 10-50 cM의 유전자 거리를 나타낼 것이다. 상기 핵산은 적어도 50, 더욱 바람직하기는 적어도 500, 더욱 바람직하기는 적어도 1000, 더욱 바람직하기는 적어도 5000개의 염기쌍을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 QTL 또는 그것의 내성-제공부를 포함하는 하나 이상의 핵산 서열은 차례로 핵산 구성물에 포함될 수 있고, 상기 구성물은 추가로 상기 하나 이상의 핵산 서열의 측면에 위치하는 영역을 포함할 수 있고, 상기 영역은 상기 하나 이상의 핵산 서열을 적합한 보트리티스-감염 수용 토마토 식물로 전달하기에 적합한 벡터에 병합될 수 있다. 벡터는 추가로 적합한 프로모터 영역 또는 다른 조절 서열을 포함할 수 있다. QTL은 또한 토마토 식물의 게놈 내에 존재하는 형태일 수 있다. 본 발명의 QTL은 바람직하기는 상기 QTL에 연결된 표 1 내지 5의 마커로 이루어진 군으로부터 선택되는, 적어도 하나의 마커, 바람직하기는 2개, 더욱 바람직하기는 3개, 더욱 바람직하기는 4개, 더욱 바람직하기는 4개보다 많은 보트리티스-내성과 연관된 마커를 포함한다.
또 다른 면에서 본 발명은 보트리티스-내성에 대한 QTL을 검출하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 의심된 보트리티스-내성 토마토 식물의 염색체 4, 6, 9, 11 및/또는 12의 보트리티스-내성에 대한 QTL에 연결된 적어도 하나의 마커를 검출하는 것을 포함하고,
- 여기서 상기 식물의 염색체 4에서 상기 QTL의 위치는 솔라늄 해브로채티스의 염색체 4 또는 솔라늄 리코페르시쿰의 염색체 4, 더욱 바람직하기는 솔라늄 해브로채티스 LYC 4/78의 염색체 4 또는 솔라늄 리코페르시쿰 cv. 머니메이커 염색체 4의 유전 마커 CT50, C2At1g74970, P14M49-283e, P14M48-74e, P14M50-67e, CT173 및 P14M50-85h를 포함하는 게놈성 영역에 의해 표시된다.
본 발명의 QTL을 검출하는 방법의 바람직한 구현예에서, 상기 식물의 염색체 6에서 상기 QTL의 위치는 솔라늄 해브로채티스의 염색체 6 또는 솔라늄 리코페르시쿰의 염색체 6, 더욱 바람직하기는 솔라늄 해브로채티스 LYC 4/78의 염색체 6 또는 솔라늄 리코페르시쿰 cv. 머니메이커 염색체 6의 유전 마커 P22M50-188h, P14M48-521e, P15M48-386h, P18M51-199h, P18M51-103h, P22M50-103e, P18M51-388e, P15M48-395e, P22M50-124e, P14M48-160e 및 P22M50-513h를 포함하는 게놈성 영역에 의해 표시된다.
본 발명의 QTL을 검출하는 방법의 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 식물의 염색체 9에서 상기 QTL의 위치는 솔라늄 해브로채티스의 염색체 9 또는 솔라늄 리코페르시쿰의 염색체 9, 더욱 바람직하기는 솔라늄 해브로채티스 LYC 4/78의 염색체 9 또는 솔라늄 리코페르시쿰 cv. 머니메이커 염색체 9의 유전 마커 P18M50-141, P14M49-240, TG254, TG223, TGlO, P18M50-134h, P14M49-243h, P18M50-599, P14M60-222h, P22M51-417h, P14M50-174h, P14M60-157h, P14M60-107h, P15M48-138h, P14M48-113h, Tm2a, P18M51-146h, P14M48-282h 및 P14M50-276h를 포함하는 게놈성 영역에 의해 표시된다.
본 발명의 QTL을 검출하는 방법의 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 식물의 염색체 11에서 상기 QTL의 위치는 솔라늄 해브로채티스의 염색체 11 또는 솔라늄 리코페르시쿰의 염색체 11, 더욱 바람직하기는 솔라늄 해브로채티스 LYC 4/78의 염색체 11 또는 솔라늄 리코페르시쿰 cv. 머니메이커 염색체 11의 유전 마커 P14M60-215e, P14M61-173h, P14M50-307h, TG47, P14M50-29xCD, P18M51-358h, P18M50-27xCD, P18M51-136h, P22M50-488h, TG393, P14M61-396h, P22M51-235h 및 P22M51-174e를 포함하는 게놈성 영역에 의해 표시된다.
본 발명의 QTL을 검출하는 방법의 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 식물의 염색체 12에서 상기 QTL의 위치는 솔라늄 해브로채티스의 염색체 12 또는 솔라늄 리코페르시쿰의 염색체 12, 더욱 바람직하기는 솔라늄 해브로채티스 LYC 4/78의 염색체 12 또는 솔라늄 리코페르시쿰 cv. 머니메이커 염색체 12의 유전 마커 CT19, TG68, P14M48-411e, P18M50-244h, P18M50-273h, P14M61-420h, P14M61-406h, P14M61-223h, P14M60-193h, P22M51-314h, TG565, P14M48-172h, P22M50-321e, P14M60-219e, P14M48-153h, P22M50-97h, TG296, P22M50-131h 및 P22M51-135h를 포함하는 게놈성 영역, 바람직하기는 유전 마커 P14M61-420h, P14M61-406h, P14M61-223h, P14M60-193h, P22M51-314h, TG565, P14M48-172h, P22M50-321e, P14M60-219e, P14M48-153h, P22M50-97h, TG296, 및 P22M50-131h을 포함하는 게놈성 영역에 의해 표시된다.
더욱 추가의 면에서, 본 발명은 게놈에 적어도 하나의 QTL 또는 보트리티스-내성-제공부를 포함하는 솔라늄 리코페르시쿰 종의 보트리티스-내성 식물 또는 그것의 일부에 관한 것으로, 여기서 상기 QTL은 보트리티스 내성과 연관된 솔라늄 해브로채티스, 바람직하기는 계통 LYC 4/78의 염색체 4, 6, 9, 11 및 12 상의 QTL로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 상기 식물의 염색체 4의 상기 QTL의 위치는 솔라늄 해브로채티스의 염색체 4 또는 솔라늄 리코페르시쿰의 염색체 4, 더욱 바람직하기는 솔라늄 해브로채티스 LYC 4/78의 염색체 4 또는 솔라늄 리코페르시쿰 cv. 머니메이커 염색체 4의 유전 마커 CT50, C2At1g74970, P14M49-283e, P14M48-74e, P14M50-67e, CT173 및 P14M50-85h를 포함하는 유전 영역에 의해 표시되고, 여기서 상기 QTL 또는 상기 그것의 보트리티스-내성-제공부는 그것의 천연 유전적 배경에는 없고, 여기서 상기 식물은 임의로 솔라늄 해브로채티스의, 바람직하기는 솔라늄 해브로채티스 계통 LYC 4/78의 염색체 1, 2, 및/또는 4 상의 QTL로부터 선택되는 보트리티스 내성과 연관된, 하나 이상의 추가의 QTL, 또는 그것의 보트리티스-내성-제공부를 추가로 포함하고, 여기서 상기 식물체의 염색체 4의 상기 추가의 QTL의 위치는 솔라늄 해브로채티스의 염색체 4 또는 솔라늄 리코페르시쿰의 염색체 4, 더욱 바람직하기는 솔라늄 해브로채티스 LYC 4/78의 염색체 4 또는 솔라늄 리코페르시쿰 cv. 머니메이커 염색체 4의 유전 마커 P18M51-169.5e, P18M51-305.4h, P14M60-262.9e, P14M61-292.7h, TG609, P14M48-345e, P14M48-177e 및 P18M50-147e를 포함하는 유전 영역에 의해 표시된다.
또 다른 면에서, 본 발명은 보트리티스-내성 근교배 토마토 식물을 생산하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 상기와 같이 본 발명의 방법에 따라 보트리티스-내성 토마토식물을 생산하고, 상기 식물을 자가교배하고, 상기 자가교배된 식물로부터 얻은 종자를 새로운 식물로 성장시키고; 상기 새로운 식물로부터 보트리티스 내성을 나타내고 그리고 상업적으로 바람직한 특징을 소유하는 식물을 동정하고, 그리고 보트리티스 내성을 나타내고 상업적으로 바람직한 특성을 소유하는 근교배 토마토 식물이 생산될 때까지 자가교배와 선택의 단계를 반복하는 것을 포함한다.
보트리티스-내성 근교배 토마토 식물을 생산하는 방법은, 보트리티스 내성을 나타내고 상업적으로 바람직한 특징을 소유하는 동형접합체 근교배 토마토 식물을 선택하는 추가의 단계를 더욱 포함할 수 있다.
추가의 면에서, 본 발명은 본 발명의 방법으로 얻을 수 있는 보트리티스-내성 근교배 토마토 식물, 또는 그것의 일부에 관한 것이다.
추가의 면에서, 본 발명은 보트리티스에 대한 내성을 나타내는 혼성화 토마토, 또는 그것의 일부에 관한 것으로, 여기서 상기 혼성화 토마토 식물은 본 발명의 방법으로 얻을 수 있는 보트리티스-내성 근교배 토마토 식물을 상업적으로 바람직한 특징을 나타내는 근교배 토마토 식물과 교배하여 얻을 수 있다.
본 발명은 추가로, 본 발명의 토마토 식물의 재생시킬 수 있는 세포의 조직 배양에 관한 것이다. 이와 같은 조직 배양물의 구현예는, 잎, 꽃가루, 배아, 뿌리, 근단, 꽃밥, 꽃, 열매, 및 줄기 그리고 종자로 이루어진 군으로부터 선택되는 조직으로부터 단리된 세포 또는 상기 세포의 원형질체이다.
본 발명은 추가로 본 발명에 따른 보트리티스-내성에 대한 QTL의 검출을 위한 및/또는 보트리티스-내성 토마토 식물의 검출을 위한 표 1~5의 마커들로 이루어진 군으로부터 선택된 마커의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 사용된 보트리티스-내성 주게 토마토 식물은 바람직하기는 리코페르시콘 세라시포름 (Lycopersicon cerasiforme), 리코페르시콘 치즈마니(Lycopersicon cheesmanii), 리코페르시콘 칠렌스(Lycopersicon chilense), 리코페르시콘 치미넬레스키(Lycopersicon chmielewskii), 리코페르시콘 라코페르시쿰(Lycopersicon lycopersicum), 리코페르시콘 해브로찰리츠(Lycopersicon habrochaites), 리코페르시콘 파르비플룸(Lycopersicon parviflorum), 리코페르시콘 페넬리(Lycopersicon pennellii), 리코페르시콘 퍼루비아눔(Lycopersicon peruvianum), 리코페르시콘 핌피넬리콜륨(Lycopersicon pimpinellifolium) 및 솔라늄 리코페르시코이드(Solanum lycopersicoides)로 이루어진 군으로부터 선택되고, 더욱 바람직하기는, 야생 토마토 수집종이 주게 식물로 사용된다. 매우 바람직한 주게 식물은 솔라늄 해브로채티스이고, 특히 솔라늄 해브로채티스 LYC 4/78이다.
본 발명의 방법에 사용되는 비트리티스-감염 수용 토마토 식물은 바람직하기는 상업적으로 바람직한 특징을 갖는 솔라늄 리코페르시쿰 종, 더욱 바람직하기는 솔라늄 리코페리시쿰 배양물, 또는 다른 상업적 토마토 계통이다.
도 1은 염색체 4를 나타내는 연관 지도(어두운 구획으로 제공된 QTL의 추정위치)와 함께 솔라늄 해브로채티스 LYC 4/78로부터 기원하는 보트리티스 시네리아에 대한 내성에 관한 양적 형질 유전자자리의 위치를 나타낸다. 지도 위치는 cM으로 주어진다. 자료는 두개의 개별적인 QTL의 연관 동정을 허용하고, 하나는 마커 TG62 주변에 중심을 두고 실시예 4의 IL-4에 동정되고, 다른 하나는 마커 TG62를 포함하지 않지만 마커 P14M49-283e 주변을 중심으로 하는 것과 구별되고 실시예 4의 IL 4-3에서 동정된다. 염색체 4에서 검출된 QTL은 병변 성장속도와 질병 발생을 모두 감소시킨다. AFLP 마커에 대한 코드는 표 1에 더욱 광범위하게 기재하였다. 본 발명에서 예시되는 도면에서 QTL과 관하여 표시된 모든 마커들은 개별적으로 뿐 아니라 조합하여 그 면에서 마커로서 사용될 것이다.
도 2는 염색체 6를 나타내는 연관 지도(어두운 구획으로 제공된 QTL의 추정위치)와 함께 솔라늄 해브로채티스 LYC 4/78로부터 기원하는 보트리티스 시네리아에 대한 내성에 관한 양적 형질 유전자 자리의 위치를 나타낸다. 염색체 6의 QTL은 병변성장 속도와 질병 발생 모두를 감소시킨다.
도 3은 염색체 9를 나타내는 연관 지도(어두운 구획으로 제공된 QTL의 추정위치)와 함께 솔라늄 해브로채티스 LYC 4/78로부터 기원하는 보트리티스 시네리아에 대한 내성에 관한 양적 형질 유전자 자리의 위치를 나타낸다. 염색체 9의 QTL은 병변성장 속도와 질병 발생 모두를 감소시킨다. 도면은 추가로 IL 계통 11-2와 12-3의 염색체 9에서의 유전질침투를 나타낸다.
도 4는 염색체 11을 나타내는 연관 지도(어두운 구획으로 제공된 QTL의 추정 위치)와 함께 솔라늄 해브로채티스 LYC 4/78로부터 기원하는 보트리티스 시네리아에 대한 내성에 관한 양적 형질 유전자 자리의 위치를 나타낸다. 염색체 11의 QTL은 병변성장 속도와 질병 발생 모두를 감소시킨다. 연관 지도는 실시예 4의 IL 계통 11-2를 나타낸다.
도 5는 염색체 12를 나타내는 연관 지도(어두운 구획으로 제공된 QTL의 추정위치)와 함께 솔라늄 해브로채티스 LYC 4/78로부터 기원하는 보트리티스 시네리아에 대한 내성에 관한 양적 형질 유전자 자리의 위치를 나타낸다. 염색체 12의 QTL은 병변성장 속도와 질병 발생 모두를 감소시킨다. 연관 지도는 실시예 4의 IL 계통 11-2를 나타낸다.
도 6은 실시예 4에 기재된 솔라늄 리코페르시쿰 cv 머니메이커 유전자 배경에서 유전질침투된 솔라늄 해브로체티그 LYC 4/78 IL 개체군을 얻기 위해 사용된 역교배 및 선택 전략을 나타낸다.
도 7은 실시예 4에 사용된 솔라늄 리코페르시쿰 cv. 머니메이커 x 솔라늄 해브로채티스 LYC 4/78 유전질침투 계통 개체군의 그래프로 나타낸 유전자형을 나타낸다. 모든 염색체는 F2 유전자 연관 지도에 따라 20cM 세그먼트의 크기로 그렸다. 몇몇 영역은 염색체 4, 5 및 9(CAP 마커)의 말단에 첨가되었다. 솔라늄 해브로채티스 축으로부터 동형접합 유전질침투는 검게 나타내었고, 반면 이형접합 유전질침투는 사선 패턴(회색)으로 나타내었다.
도 8은 염색체 1, 2, 및 4를 나타내는 연관 지도를 갖는 솔라늄 해브로채티스 LYC 4/78로부터 기원하는 보트리티스 시네리아에 대한 내성에 관한 양적 형질 유전자자리(QTL)의 위치를 나타내고 QTL-Ih, QTL-2h 및 QTL-4hA로서 본 출원에 표시된 QTL을 나타낸다.
정의
본 명세서에 사용되는 바에 따르면, 용어 "보트리티스"는 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea)를 의미하며, 또한 토마토의 줄기, 잎 그리고 열매에 일반적으로 발견되는 질병으로, 회색곰팡이병 또는 회색반점병으로도 알려져 있다. 일반적으로 식물 병원성 균류 Sclerotinia sclerotiorum 은 보트리티스 시네리아의 감염 메카니즘과 유사한 메카니즘을 갖는다고 간주된다(Prins et al., 2000). 비록 토마토에서의 S. sclerotiorum-감염이 경제적으로 보트리티스 시네리아-감염보다 덜 중요하지만, 두 균류는 프로테아제의 스펙트럼, 식물 세포벽 열화효소, 톡신 뿐 아니라 옥살산을 분비한다. 이들 인자의 몇몇은 두 균류의 감염 전술에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 그 결과, 보트리티스에 대한 내성을 제공하는 메카니즘과 유전자는 솔라늄. 스클레로디오룸에 의한 감염에 대한 내성을 제공하는데 동등하게 효과적일 것으로 믿어진다. 그러므로, 여기서 참조가 "보트리티스-내성"에 대해 이루어질때, 이와 같은 내성은 Sclerotiniaceae류의 어느 균류에 대한 내성, 바람직하기는 S. sclerotiorum과 보트리티스 시네리아에 대한 내성, 더욱 바람직하기는 보트리티스 시네리아에 대한 내성을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에 사용되는 바에 따르면, 용어 "대립형질"은 유전자의 하나 이상의 대안적인 형태를 의미하고, 모든 대립형질은 적어도 하나의 형질 또는 특성에 관한 것이다. 이배체 세포 또는 유기물에서, 주어진 유전자의 2개의 대립형질은 동종 염색체의 쌍의 상응하는 유전자 자리를 점유한다. 본 발명은 QTL, 즉 하나 이상의 유전자를 포함하는 유전 영역 뿐 아니라 조절 서열에 관한 것이므로, 이것은 어느 경우에는 "대립형질" 대신에 "일배체형"(즉, 염색체 세그먼트의 대립형질)으로 불리는 것이 더 정확하고, 이 경우, 용어 "대립형질"은 "일배체형"을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
"유전자"는 염색체 상의 특정 부위를 점유하고 유기체에서 특정한 특징 또는 형질에 대한 유전적 지시를 함유하는 DNA 서열로 이루어진 유전적 단위로 정의된다
"유전자 자리"는 주어진 종의 염색체에서 주어진 유전자가 점유하는 위치를 말한다.
여기서 사용된 바에 따르면, 용어 "이형접합체"는 다른 대립형질이 동형 염색체상의 상응하는 유전자 자리에 있을 때 존재하는 유전 조건을 의미한다.
여기서 사용된 바에 따르면, 용어 "동형접합체"는 동일한 대립형질이 동형 염색체상의 상응하는 유전자 자리에 있을 때 존재하는 유전 조건을 의미한다.
여기서 사용된 바에 따르면, 용어 "혼성화"는 두개의 유전적으로 다른 개개 사이의 교배 자손을 의미하고 두 근교배 계통간의 교배를 포함하지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
여기서 사용된 바에 따르면, 용어 "근교배"는 실질적으로 동형접합체 개체 또는 계통을 말한다.
본 명세서에서 "재조합 사상"은 여기서 감수분열 교차를 의미하는 것으로 이 해된다.
여기서 사용된 바에 따르면, 용어 "유전질침투", " 유전자 침투된" 그리고 "유전자 침투하는"은 그것에 의해 하나의 종, 변종 또는 재배변종 식물의 게놈 영역이 이들 종들의 이종교배에 의해 또 다른 종, 변종 또는 재배변종 식물의 게놈으로 이동하는 천연 및 인공적 공정 모두를 말한다. 이 공정은 임의로 순환 부모로의 역교배에 의해 완전해질 수 있다.
"유전공학" "변형" 및 "유전적 변경"은 모두 여기서 단리되고 암호화된 유전자의 DNA, 보통은 다른 기관의 염색체 DNA 또는 게놈으로의 전달과 동의어로 사용된다.
본 명세서에 사용되는 바에 따르면, 용어 "분자 마커"는 핵산 서열의 특성의 차이를 가시화하기 위한 방법에 사용되는 표시기를 말한다. 이와 같은 표시기의 예는 제한 단편 길이 다형(RFLP) 마커, 증폭된 단편 길이 다형(AFLP) 마커, 단일 뉴클레오티드 다형 (SNPs), 삽입 돌연변이, 미세 부수체부분 마커 (SSRs), 서열 특성화 증폭 영역(SCARs), 쪼개진 증폭 다형성 서열(CAPS) 마커 또는 이소자임 마커 또는 특이 유전 및 염색체의 위치를 한정하는 것으로 본 명세서에 기재된 마커들의 조합이다.
용어 "내성의" 및 "내성"은 감염에 대한 부분적인 그리고 완전한 내성 모두를 의미한다. 보트리티스-감염성 토마토 식물은 보트리티스에 의한 감염에 대해 내성이 없거나 또는 내성 수준이 낮을 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바에 따르면, 용어 "식물 일부"는 단일세포와, 식 물, 세포 덩어리 및 토마토 식물이 재생될 수 있는 조직 배양물 중의 손상되지 않은 식물 세포와 같은 세포 조직을 포함하는 토마토 식물의 일부를 가리킨다. 식물 일부의 예는 단일 세포 및 꽃가루, 배주, 잎, 배아, 뿌리, 근단, 꽃밥, 꽃, 열매, 줄기 발아, 및 종자와 같은 조직; 및 이에 더하여 꽃가루, 배주, 잎, 배아, 뿌리, 근단, 꽃밥, 꽃, 열매, 줄기, 발아, 접순, 근경, 종자, 원형질체, 캘리 등을 포함하지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
여기서 사용되는 바에 따르면, 용어 "개체군"는 일반적인 유전적 기원을 공유하는 식물의 유전적으로 이형적인 수집종을 의미한다.
여기서 사용되는 바에 따르면, 용어 "토마토"는 리코페르시콘의 속(genus) 이름으로 알려진 어느 식물, 계통 또는 개체군을 의미하고, 리코페르시콘 세라시포른(Lycopersicon cerasiforrne), 리코페르시콘 치즈마니(Lycopersicon cheesmanii), 리코페르시콘 칠렌스(Lycopersicon chilense), 리코페르시콘 크밀레위스키(Lycopersicon chmielewskii), 리코페르시콘 세스쿨렌툼(Lycopersicon esculentum) (현재 Solanum lycopersicum), 리코페르시콘 히르수툼(Lycopersicon hirsutum), 리코페르시콘 파르비플로룸(Lycopersicon parviflorum), 리코페르시쿰 펜넬리(Lycopersicon pennellii), 리코페르시쿰 페루비아눔(Lycopersicon peruvianum), 리코페르시콘 핌피넬리폴리움(Lycopersicon pimpinellifolium), 또는 솔라늄 리코페르시코이즈(Solanum lycopersicoides)를 포함하지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 히코페르시콘 에스쿨렌툼의 새롭게 제안된 과학적 명칭은 솔라늄 리코페르시쿰이다. 유사하기는, 야생종의 이름은 변경될 수 있다. 리코페르시쿰 펜넬리는 솔라늄 펜넬리(Solanum pennellii)가 될 수 있고, 리코페르시콘 히르수툼은 솔라늄 파브로카이츠(S. habrochaites)가 될 수 있고, 리코페르시쿰 페루비아눔은 솔라늄 '엔 페루비아눔'과 솔라늄 '칼레존 데 휴알레(Callejon de Huayles)', 솔라늄 페루비아늄, 그리고 솔라늄 코르넬로뮤엘레리(S.corneliomuelleri)로 나뉠 수 있고, 리코페르시콘 파르비플로륨(L. parviflorum)은 솔라늄 네오리키(S.neorickii)가 될 수 있고, 리코페르시콘 크밀레위스키는 솔라늄 크밀레위스키가 될 수 있고, 리코페르시콘 칠렌스는 솔라늄 칠렌스가 될 수 있고, 리코페르시콘 치즈마니는 솔라늄 치즈마니 또는 솔라늄 갈라파겐스(S. galapagense)가 될 수 있고, 그리고 리코페르시콘 핌피넬리폴리움은 솔라늄 핌피넬리포리움이 될 수 있다(Solanacea Genome Network (2005) Spooner and Knapp; http://www.sgn.cornell.edu /help/about/solanum nomenclature.html). 솔라늄 해브로채티스가 털이 있는 열매를 산출하는 토마토 종으로 정의될 수 있는 반면, 솔라늄 리코페르시쿰은 털이 없는 열매를 산출하는 토마토 종으로 정의될 수 있다는 것을 명심해야 한다.
여기서 사용되는 바에 따르면, 용어 "변종" 또는 "재배 변종 식물"은 동일 종 내에서 구조 또는 유전적 특성 및/또는 성능에 의해 다른 변종과 구별될 수 있는 유사 식물의 군을 의미한다.
용어 "QTL"은 여기서 그것의 분야-인식(art-recognized) 의미로 사용된다. 용어 "토마토에서 보트리티스 시네리아에 대한 내성과 연관된 QTL"과 더 짧은 용어 "보트리티스-내성 QTL"은 보트리티스-내성에 대해 암호화하는 적어도 하나의 유전 자와 연관된 토마토의 특정 염색체에 위치하는 영역 또는 적어도 하나의 조절 영역, 즉 보트리티스-내성에 관여된 하나 이상의 유전자의 발현을 조절하는 염색체의 영역을 말한다. 그 유전자의 표현형 발현은 예를 들면, 병변성장의 감소된 속도로서 및/또는 감소된 질병 발생으로 관찰될 수 있다. QTL은 예를 들면, 그 산물이 유전적 내성을 제공하는 하나 이상의 유전자를 포함할 수 있다. 선택적으로, QTL은 예를 들면, 그것의 산물이 그것에 의해 보트리티스-내성을 제공하는 식물의 유전자의 다른 유전자 자리에서의 유전자의 발현에 영향을 미치는 조절 유전자 또는 서열을 포함한다. 본 발명의 QTL은 하나 이상의 분자 유전자 마커를 사용하여 각각의 야생 토마토 자손의 게놈에서의 그들의 유전자 위피를 표시함으로써 정의된다. 차례로 하나 이상의 마커는 측정 유전자 자리를 표시한다. 유전자 자리들 간의 거리는 보통 동일한 염색체상의 유전자 자리간의 교배의 빈도에 의해 측정된다. 두 유전자 자리가 멀리 떨어질 수록 그들간의 교배가 더 잘 일어나는 것 같다. 다시말하면, 두 유전자 자리가 서로 밀접하면, 그들 사이의 교배는 덜 일어나는 것 같다. 일반적으로, 1 센티모간(cM)은 유전자 자리(마커) 간의 1% 재조합과 동등하다. QTL이 다중 마커에 의해 표시될 수 있으면, 말단 지점 마커들 사이의 유전자 거리는 QTL의 크기를 나타낸다.
용어 "보트리티스-감염 수용 토마토 식물"은 본 명세서에서 보트리티스-내성을 위한 QTL을 포함하는 주게 토마토 식물로부터 얻어진 DNA를 수용하기 위한 토마토 식물을 나타낸다. 상기 "보트리티스-감염 수용 토마토 식물"은 이미 보트리티스-내성을 위한 하나 이상의 QTL을 포함할 수도 포함하지 않을 수도 있고, 여기서 용 어는 추가의 QTL을 수용하기 위한 식물체를 표시한다.
용어 "천연 유전적 배경"은 여기서 QTL의 원래 유전적 배경을 나타내는데 사용된다. 이와 같은 배경은 예를 들면, 토마토의 보트리티스-내성 야생 자손의 유전자일 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 QTL은 솔라늄 해브로채티스 LYC 4/78의 염색체 4, 6, 9, 11 및 12의 특정 위치에서 발견되었다. 예를 들면, 솔라늄 해브로채티스 LYC 4/78은 솔라늄 해브로채티스 LYC 4/78의 염색체 4, 6, 9, 11 및 12의 QTL의 천연 유전적 배경을 나타낸다. 또한, 솔라늄 해브로채티스 LYC 4/78은 상기 QTL의 천연 유전적 배경을 나타낸다. 바뀌말하면, 솔라늄 해브로채티스 LYC 4/78의 염색체 4로부터 다른 토마토 종, 특히 솔라늄 리코페르시쿰의 염색체 4의 동일위치로, QTL을 포함하는 DNA 또는 그것의 내성-제공부의 이동을 포함하는 방법은 QTL 또는 그것의 상기 내성-제공부가 그것의 천연 유전적 배경이 아니도록 할 것이다.
용어 "질병 발생"은 본 명세서에서 감염의 확립을 감소시키기 위한 식물의 능력을 반영하는 계수로서 정의되고 그리고 감염성 약제와 접촉 후 식물의 감염 달성의 성공을 결정하는 것으로 확립된다.
용어 "병변 성장 속도" 또는 "병변 성장률"은 감염의 진행을 느리게 또는 감소시킬 수 있는 식물의 능력을 반영하는 계수로서 정의되고, 예를 들면, 확장된 병변의 성장속도를 측정함에 의해 확립될 수 있다.
용어 "정량적 결정"은 측정, 특히 양과 수의 면에서 측정가능한 면의 측정을 포함하는 방법으로 확립 또는 평가되는 것으로 정의된다. 심각성의 정도, 크기의 더 큰, 더욱, 덜 또는 증가 또는 감소의 표시는 본 용어 "정량적 결정"에 포함되지 않고, 이 용어는 궁극적으로 절대값을 결정하기 위한 물체 계수 메카니즘의 존재를 의미한다. 그러므로, "질병 발생 및/또는 병변성장 속도의 정량적 결정"은 바람직하기는 (질병 발생을 평가하기 위해) 측정가능한 병변을 가져오는, 식물과 감염성 약제의 모든 잠재적 염증성 접촉의 퍼센트를 측정하는 것, 및/또는 (병변 성장 속도를 평가하기 위해) 균류 성장에 호의적인 조건하에 시간에 걸쳐 상기 병변의 하나 이상의 직경, 원주, 표면적 또는 부피의 증가를 측정하는 것을 포함한다.
용어 "표준 실행 조건", "표준 온실 조건" 및 "표준 조건"은 빛, 습도, 온도 등, 예를 들면, 표준으로서 질병 내성의 표현형 특징화의 목적으로 식물이 성장 또는 배양될 수 있는 조건을 말한다. 예를 들면, 온실의 경우, 이것은 16시간-일, 15℃-25℃를 말한다. 더욱 일반적으로, 이 용어는 8~24시간의 광기간(광합성 광량자속(PPF) 50 ~1000μmol m-2s-1) , 바람직하기는 16시간 빛과 8시간 암의 광체계, 낮 약 19℃와 밤 15℃의 공기 온도, 상대습도 약 60~85%에 상응하는 약 4.4gm-3의 수증기압 부족 및 대기 O2 농도와 대기 공기압(일반적으로 1008 hPa)의 표준 및 참조 성장조건을 말한다. 물과 영양분은 줄기 근처에 적가되거나 분사 또는 연무의 형태일 수 있다. 줄기 병변 길이 조사, 질병 발생 및 병변 성장속도 측정과 같은 표준 생물학적 정량 실험 조건은 하기 실시예에 더 상세히 기재하였다. 더욱 상세히는 평균 줄기 병변 길이 조사는 실시예 3.10과 3.11에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
토마토의 보트리티스 에 대한 내성과 연관된 QTL의 동정
야생형 토마토 종이 질병과 해충 내성 형질에 대한 적합한 기원을 제공하는 것이 알려졌고 야생 토마토 종의 잎에서 B. cinerea에 대한 부분적 내성의 존재가 문서화되었다(Urbasch, 1986). 지금까지 두 인자가 토마토에서 B. cinerea 내성에 대한 육종을 방해하여왔다. 첫째로, 상업적 육종 계통으로의 부분적 내성을 교배하는 것은 제한적으로 성공되었다. 둘째, 신뢰할만한 그리고 재생가능한 질병 조사가 내성을 제공하는데 책임이 있는 유전자 물질을 확인하고 국지화할 수 있는 것이 부족하였다.
예를 들면, Urbasch (Urbasch, 1986)은 과영양의 균류를 제공하는 아가 충전물을 이용하여 잎을 균사체로 감염시켰고, 이것은 감염 과정에 큰 영향을 미쳤다. 다른 연구자들은 독자적인 식물 질병 지수를 사용하였고, 이것은 양적형질 유전자 자리에 요구되는 정량 분석에 부적합하다.
실험실 조건 하에서 솔라늄 리코페르시쿰 중의 보트리티스 시네리아 감염은 비교적 잘 연구되었다(예를 들면, Benito et al., 1998). 잎의 비말 접종과 보통 온도(15-20℃)에서의 순차적 배양은 접종 부위에서 괴사점의 빠른 전개를 가져온다(감염 후 16-24시(hpi)). 감염은 약 48시간 지점에서 일시적으로 제한된다. 이 시점으로부터 병변의 일부(대개 5-10%)가 확장되기 시작한다. 소위 "확장된 병변"으로 불리는 이들의 결과는 균류 생물량의 증가를 수반하고 이후의 48시간에 완전한 소엽의 군락화를 가져온다.
본 발명자들은 토마토에서 보트리티스-내성과 연관된 특정 QTL이, 내성을 측정하기 위해 생물학적 정량이 사용될 때 동정될 수 있다는 것을 발견하였고, 여기 서 감염의 진행과 감염성 약제와 접촉 후 감염을 얻는 성공의 비율은 토마토 식물의 일부, 바람직하기는 독립된 부분, 더욱 바람직하기는 줄기 세그먼트에서 측정된다.
이에 더하여, 시험은 실시예 4에 기재된 바와 같이 사용될 수 있고, 여기서, 전제 식물의 내성이 연구되고 그리고 여기서 줄기는 기계적으로 손상되고, 그리고 보트리티스 이노쿨룸이 상처에 적용되었다.
유전질침투 계층을 사용한 후, 각각은 솔라윰 리코페르시쿰 cv. 머니메이커 배경에서 솔라늄 해브로채티스 LYC 4/78의 게놈의 특정 유전질침투 세그먼트를 함유하고, 본 발명자들은 놀랍게도 솔라늄 해브로채티스 LYC 4/78에서 보트리티스에 대한 내성과 연관된 추가의 QTL을 발견할 수 있었다. 그러므로, 본 발명은 보트리티스에 대해 내성인 배양된 토마토 식물을 생산하는 방법을 제공하고, 상기 방법은:
- 재배된 토마토의 일련의 유전질침투 계통을 생산하고, 여기서 각각의 유전질침투 계통은 보트리티스-내성 야생 토마토 후손, 바람직하기는 솔라늄 해브로채티스 LYC 4/78로부터 특정 게놈성 유전질침투(염색체 영역)를 함유하고, 이 시리즈는 상기 내성 야생 토마토 후손의 게놈을 함께 지니고;
- 상기 개개의 유전질침투 계통의 각각의 식물체에서 보트리티스에 대한 내성을 측정하기 위한 정량적 생물학적 정량을 실시함에 의해, 바람직하기는 질병 발생 및/또는 병변 성장 속도를 측정하고, 그리고 상기 유전질침투 계통에서 염색체 마커의 존재와 보트리티스에 대한 관찰된 내성을 연결하는 유전자 연관 지도를 확 립하고 그리고 양적 형질 유전자 자리에 대한 강화된 내성(예를 들면 감소된 질병 발생 및/또는 감소된 병변성장 속도)과 연관된 상기 지도에 연속 마커를 할당함에 의해, 상기 개개의 유전질침투의 각각의 식물체에서 보트리티스-내성과 연관된 QTL을 동정하고;
- 그리고 보트리티스에 대한 내성을 갖는 배양된 토마토 식물의 생산을 위해 보트리티스 내성과 연관된 QTL을 함유하는 유전질침투 계통을 사용하거나, 의심되는 보트리티스-내성 토마토 식물의 마커-보조 선택에 이와 같이 동정된 QTL에 대한 마커 정보를 이용하는 것을 포함한다.
놀랍게도 보트리티스-내성에 대한 다중 QTL이 보트리티스-내성 토마토 식물의 게놈에 존재하였고, 반면 선행기술의 방법은 염색체 1, 2, 4 및 10의 QTL의 시험적 동정을 가져왔다는 것을 발견하였다. 더우기 본 발명의 방법을 사용함에 의해 발견된 QTL은, 유사한 유전적 배경을 사용한 경우에도(WO 02/085105) 토마토 식물의 보트리티스-내성과 미리 연관되지 않은 염색체에 존재하였다. 그러므로, 본 발명의 방법은 ILs의 사용이 토마토에서의 보트리티스 내성의 유전적 기원의 더욱 상세한 조사를 가져올 수 있고 미리 동정되지 않은 내성에 포함되는 염색체 재료의 동정을 가져올 수 있다는 추가의 면을 제공하였다.
본 발명에 따른 토마토에서 보트리티스에 대한 내성과 연관된 양적 형질 유전자자리(QTL)을 검출하는, 그렇지 않으면 양적 형질 유전자 자리를 동정하거나 위치화하는 방법으로 어드레스할 수 있는 방법은 (부분적으로) 토마토 식물체의 이용가능성을 요구한다. 이와 같은 식물은 본 분야의 어느 공지의 수단에 의해, 및 상 기 식물의 상기 (부분적)내성의 존재를 결정하는 어느 방법을 사용함에 의해 제공될 수 있다. (부분적으로) 보트리티스-내성 토마토 식물(이것은 추가로 본 발명의 방법에서 주게 식물로서 작용할 것이다)의 조건은 상기 식물의 적어도 하나 그러나 바람직하기는 모든 염색체에 대한 염색체 마커, 바람직하기는 AFLP, CAPS 및/또는 SCAR 마커, 가장 바람직하기는 CAPS 및/또는 SCAR 마커의 확립 또는 준비이다. 상기 염색체의 전장에 걸친 염색체 마커의 수집을 확립함에 의해, 상기 염색체의 여러 위치는 효과적으로 표시될 것이다. 이와 같은 방법은 본 분야에 잘 알려져 있고 예시적인 방법은 아래에 더욱 상세히 기재된다
본 발명에 따른 토마토에서 보트리티스에 대한 내성과 연관된 양적 형질 유전자 자리(QTL)의 검출 방법은 식물에서 보트리티스에 대한 내성을 측정하는 단계를 포함할 것이다. 이 일에 관하여, 식물은 보트리티스의 감염가능한 양과 접촉된다. 이와 같은 양은 시험될 식물들 사이와 균류 사이에 변할 것이다. 보통 상기 균류의 약 1~10의 양 내지 약 500~5000의 분생자 양이 충분할 것이다.
보트리티스에 대한 내성 측정은 식물에서 질병 발생 및/또는 병변 성장의 속도를 정량적으로 측정하는 것을 포함할 것이다.
식물을 감염성 양의 보트리티스와 접촉시키고 내성을 정량적으로 측정하는 단계는 바람직하기는 여기에 기재된 바에 따라 줄기 세그먼트 또는 잎의 내성 생물학적 정량, 바람직하기는 줄기 세그먼트상에서, 더욱 바람직하기는 실시예 4에 기재된 바와 같이 식물 전체에서의 내성 생물학적 정량의 일부로서 수행된다. 당업자는 이하 기재된 바와 같이 이들 조사의 변형이 가능하다는 것을 이해할 것이다.
줄기 세그먼트 상의 내성 생물학적 정량은 본질적으로 다음과 같이 수행된다: 우선, 자손 식물을 위한 종자를 뿌리고 높이가 약 50cm의 묘목/식물로 성장시킨다. 식물의 상부 5~10cm와 저부 5~10cm를 제거하고 남은 30cm를 5~6cm의 동일한 세그먼트로 절단한다. 줄기 세그먼트는 바람직하기는 줄기 밑을 젖은 필터지에 격자 모양으로 세워 놓는다. 접종 전에, 줄기 세그먼트들에 물을 적절히 분사하여 상처 표면에 접종원이 동등하게 분사되도록 한다. 그리고 나서 각각의 줄기 세그먼트를 보트리티스 시네리아의 코디날 현탁액으로 접종시킨다. 접종원의 적절한 양, 예를 들면, 약 106 분생자ㆍml-1을 포함하는, 약 5㎕ 방울이 각각의 줄기 세그먼트의 상부에 적용될 수 있다. 그리고 나서 줄기 세그먼트를 약 16℃의 적절한 온도에서, 바람직하기는 암실에서, 그리고 바람직하기는 높은 습도(예를 들면, 100%RH)에서 배양한다. 감염 진행은 버니어 캘리퍼스로 접종 후 여러 시간 간격에서 부패 증상의 최대 진행을 측정함에 의해 정량적으로 결정될 수 있다. 적합한 여러 시간 간격에서, 예를 들면, 96, 120 및 144 시간 후-감염 (hpi), 줄기는 병변 형성(질병 발생)및 병변 성장에 대해 정량적인 방법으로 조사된다. 여러 적합한 계수들이, 예를 들면 캘리퍼스를 사용함에 의해 병변의 크기를 측정하는 것을 포함한다. 계절과 식물 재배에 의해 야기되는 변화를 정정하기 위해, 생물학적 정량의 정량적 측정은 감염성 대조 또는 참조 계통에서의 비교 측정과 관련된다. 질병 발생은 확장하는 병변의 총수를 접종 방울의 수로 나누어 결정하는 것이 바람직하다. 그리고 나서 특정 유전자형에 대한 확정된 병변의 비율은 대조 도는 참조 유전자형에서 관찰된 확장하는 병변의 비율로 나누어지고 백분률로 표시된다. 선택적으로, 또는 부가적으로, 병변 성장 속도는 적절한 기간, 예를 들면 24시간을 넘도록 병변 크기의 증가를 산출(예를 들면 mm)하여 결정될 것이다. 비-확장 병변의 자료는 정량적인 분석으로부터 삭제될 수 있다. 얻어진 병변 성장 속도는 그리고 나서 임의로 대조 또는 참조 유전자형에서 관찰된 병변 성장속도로 나누어지고 백분률 또는 절대값, 예를 들면 mm로 표시된다.
선택적으로, 식물은 다음과 같은 잎 감염 생물학적 정량을 사용하여 스크린될 수 있다: 우선, 토마토 종자를 심고 묘목/식물로 성장시킨다. 각각의 개별적인 식물의 경우, 하나 또는 두개의 화합물 잎이 주 줄기로부터 절단되고 미리-적신 플로리스트 거품으로 전달된다. 플로리스트 거품을 수도물이 함유된 페트리 접시에 놓고 이어서 습식 필터 종이를 함유하는 분사-습식 용기에 놓았다. 보트리티스 시네리아 분생자를 포함하는 적절한 접종원은 공지의 방법, 예를 들면, Benito et al., 1998에 기재된 바와 같이 제조한다. 그리고 나서 화합물 잎을, 잎의 위 표면에 각각 2㎕의 방울을 적절히, 예를 들면 6~10개를 놓음으로써 보트리티스 시네리아의 코디날 현탁액으로 접종한다. 그리고 나서 용기를 닫고 잎을 약 15~20℃의 적절한 온도, 바람직하기는 암실에서, 그리고 바람직하기는 높은 습도에서 배양한다. 적절한 시간 간격, 예를 들면 96, 120 및 144 hpi에서, 잎을 질병 발생과 병변 성장에 대해, 줄기 생물학적 정량에 대한 상기 정량적 방법으로 검사한다.
본 발명에 따른 토마토의 보트리티스에 대한 내성과 연관된 양적 형질 유전자자리(QTL)의 검출 방법은 관찰된 내성을 ILs의 수용 식물에서 주게 토마토 식물 의 염색체 마커의 존재와 연결된 유전자 연관 지도를 확립하고 그리고 양적 형질 유전자 자리에 대한 강화된 내성과 관련된 상기 지도에 연속 마커를 할당하는 단계를 포함한다.
상기 IL 식물에서 주게 토마토 식물의 염색체 마커의 존재와 관찰된 강화된 내성을 연관하는 유전자 연관 지도는 공지의 방법으로 제작될 수 있다. 당업자는 내성 양적 형질 유전자 자리(QTL)에 연결된 분자 마커를 동정하는 방법과 유전자 관련 지도에서 이들 마커의 매핑을 이해한다(예를 들면, Bai et al., 2003; Foolad et al., 2002; van Heusden et al., 1999을 참조). 보트리티스-내성 표현형과 마커 유전자형 간의 연관은 JoinMap® and MapQTL® (see Examples)과 같은 소프트웨어 패키지 또는 변동분석의 분석을 수행할 수 있는 어느 표준 통계적 패키지를 사용하여 적절히 수행될 수 있다. 분자 마커는 보트리티스 내성에 대한 유전자 연관 지도를 구성하고 양적 형질 유전자 자리(QTL)를 동정하는데 사용할 수 있다. 이들을 얻기위한 분자 마커의 적합한 타입과 방법들은 하기에 더욱 상세히 기재된다.
분자 마커와 QTLs
핵산 서열에서의 차이를 시각화하기 위해 분자 마커가 사용된다. 이 시각화는 DNA-DNA 혼성화 기술 (RFLP) 덕분에 및/또는 폴리머라제 사슬 반응을 이용한 기술(e.g. STS, microsatellites, AFLP) 덕분에 가능하다. 두 부모 유전자형간의 모든 차이는 이들 부모 유전자형을 기준으로 하는 매핑 개체에서 분리될 것이다(예를 들면, BC1, F2; 도 2 참조). 다른 마커들의 분리는 비교될 것이고 재조합 빈도를 산출할 수 있다. 다른 염색체 상에서 분자 마커들의 재조합 빈도는 일반적으로 50% 이다. 동일한 염색체상에 위치하는 분자 마커들 간에 재조합 빈도는 마커들 간의 거리에 의존한다. 낮은 재조합 빈도는 염색체 상의 마커들 사이의 낮은 거리에 상응한다. 모든 재조합 빈도의 비교는 염색체 상의 분자 마커의 가장 논리적 순서를 가져온다. 이 가장 논리적 순서는 연관 지도에 표시될 수 있다(Paterson, 1996). 감소된 질병 발생 및/또는 감소된 병변 성장 속도와 연관되는 연관 지도에서의 이웃의 또는 연속적인 마커의 군은 QTL의 위치를 정확히 지적한다.
QTL의 동정 후, QTL 효과(내성)은 예를 들면, 조사하에서 QTL에 대해 분리된 BC2S1 자손에서의 보트리티스-내성을 평가함에 의해 확인될 수 있다. 보트리티스-내성의 평가는 여기에 기재된 바와 같이 줄기 또는 잎 생물학적 정량을 사용하여 수행되는 것이 적합하다.
본 발명의 방법을 사용하여 얻을 수 있는 토마토의 보트리티스에 대한 내성에 관한 QTL은 본 발명의 한 면이다. 이와 같은 QTL의 특징은, 식물에 존재할 때, 상기 식물이 감염가능한 양의 보트리티스 물질과 접촉한 후 감소된 질병 발생 및/또는 감소된 병변 성장 속도의 존재를 가리키고, 이 물질은 분생자 또는 균사체 형태와 같이, 어느 형태로도 제공될 수 있다.
본 발명은 또한 토마토에서 보트리티스에 대한 내성에 관한 QTL에 관한 것으로, 여기서 상기 QTL은 보트리티스 내성과 연관되는 솔라늄 해브로채티스 LYC 4/78의 염색체 4, 6, 9, 11 및 12에서의 QTL로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이들 QTL은 표 1 내지 5에 기재된 마커들에 의해 더욱 명백히 정의되거나 표시된다. 이 들 표에서, QTL에 위치하는 유전적 영역을 기재된 AFLP-마커로 나타내었다. 본 발명의 QTL은 토마토 식물에서 (부분적) 보트리티스 질병 발생 및/또는 보트리티스 병변 성장의 감소된 속도의 제공에 책임이 있는 DNA의 형태로 유전 정보를 포함한다. 유전 정보는 예를 들면, 유전자 또는 조절 요소를 포함할 것이다.
표 1. 솔라늄 리코페르시쿰 cv 머니메이커 x 솔라늄 해브로채티스 LYC 4/78의 교배의 자손의 염색체 4에서 발견된 QTL 및 관련된 양적 내성 정보. 감염성 솔라늄 리코페르시쿰 cv. 머니메이커 식물은 평균 4.6mm/일의 병변 성장 속도와 평균 73 ± 6.4%의 질병 발생을 나타내었다.
Figure 112008079805292-pct00001
1 마커 명명: AFLP 프라이머 조합이 일반적으로 표시되는 코드, 예를 들면, P18M51-156h, 여기서 P와 M은 공통 Pstl 및 Msel 프라이머 서열 또는 유니버설 프라이머(Vos et al., 1995; Bai et al., 2003)로 2자리의 확장 코드로 표시되는 2 또는 3 여분 선택적 염기가 따른다. 두자리 확장 코드는 다음과 같다: 14: AT; 15: CA; 18: CT; 22: GT; 48: CAC; 49: CAG; 50: CAT; 51: CCA; 60: CTC; 61: CTG. 156h 은 생성된 다형성 단편의 염기쌍의 대략적 크기이다(주어진 크기 ± 2 염기쌍). 이 크기는 보통 반올림되지만 소수점으로 표시될 수도 있다. 이 단편은 솔라늄 리코페르시쿰 cv 머니메이커(e) 또는 솔라늄 해브로채티스 LYC 4/78 (h)에서 증폭된다. 마커의 존재는 표시된 기원의 대립형질이 적어도 하나 존재한다는 것을 나타낸다. 프라이머와 어댑터 서열은 Bai et al. 2003에 의해 상세히 기재된다.
2 질병 발생과 병변 성장은 실시예들에 상세히 설명된 바와 같은 방법을 사용하여 결정된다.
3TG609: 표 10 참조. 4TG62: 표 11 참조. 5Tl405: 표 20 참조. 6TG555: 표 12 참조. 7CT50: 표 13 참조. 8C2_At1g74970:표 14 참조. 9CT173: 표 21 참조.
표 2. 솔라늄 리코페르시쿰 cv 머니메이커 x 솔라늄 해브로채티스 LYC 4/78의 교배의 자손의 염색체 6에서 발견된 QTL 및 관련된 양적 내성 정보. 감염성 솔라늄 리코페르시쿰 cv. 머니메이커 식물은 평균 4.6mm/일의 병변 성장 속도와 평균 73 ± 6.4%의 질병 발생을 나타내었다. 주목(remark)에 관하여는 표 1을 참조하라.
Figure 112008079805292-pct00002
표 3. 솔라늄 리코페르시쿰 cv 머니메이커 x 솔라늄 해브로채티스 LYC 4/78의 교배의 자손의 염색체 9에서 발견된 QTL 및 관련된 양적 내성 정보. 감염성 솔라늄 리코페르시쿰 cv. 머니메이커 식물은 평균 4.6mm/일의 병변 성장 속도와 평균 73 ± 6.4%의 질병 발생을 나타내었다. 주목(remark)에 관하여는 표 1을 참조하라.
Figure 112008079805292-pct00003
1 TG254: 표 22 참조. 2 TG223: 표 23 참조. 3 TGlO: 표 17 참조. 4 Tm2a: 표 18 또는 Sorbir, O.T. et al. (2000) 참조.
표 4. 솔라늄 리코페르시쿰 cv 머니메이커 x 솔라늄 해브로채티스 LYC 4/78의 교배의 자손의 염색체 11에서 발견된 QTL 및 관련된 양적 내성 정보. 감염성 솔라늄 리코페르시쿰 cv. 머니메이커 식물은 평균 4.6mm/일의 병변 성장 속도와 평균 73 ± 6.4%의 질병 발생을 나타내었다. 주목(remark)에 관하여는 표 1을 참조하라.
Figure 112008079805292-pct00004
1TG47: 표 24 참조. 2TG393: 표 25 참조.
표 5. 솔라늄 리코페르시쿰 cv 머니메이커 x 솔라늄 해브로채티스 LYC 4/78의 교배의 자손의 염색체 12에서 발견된 QTL 및 관련된 양적 내성 정보. 감염성 솔라늄 리코페르시쿰 cv. 머니메이커 식물은 평균 4.6mm/일의 병변 성장 속도와 평균 73 ± 6.4%의 질병 발생을 나타내었다. 주목(remark)에 관하여는 표 1을 참조하라.
Figure 112008079805292-pct00005
1CT19: 표 26 참조. 2TG68: 표 27 참조. TG565: 표 28 참조. TG296: 표 29 참조.
가장 확실하기는, QTL-4hA에 위치하는 유전적 영역은 도 1에 나타낸 바와 같이 마커 P18M51-156h과 C2_At1g74970 (표 14) 사이에 위치한다. 그러므로, 그 영역에 위치하는 어느 마커가 식물의 게놈의 QTL의 존재를 평가하는데 사용될 수 있고, 마찬가지로 그 영역에 존재한다고 알려진 어느 마커는, 공통 지도 토마토-EXPEN 1992 (Tanksley et al, 1992), 토마토-EXHIR 1997 (Bernacchi and Tanksley, 1997), 토마토-EXPEN 2000 (Fulton et al, 2002) 또는 토마토-EXPIMP 2001 (Grandillo and Tanksley, 1996; Tanksley et al. 1996, Doganlar et al. 2002)와 같은, 공개적으로 이용가능한 정보를 근거로 한다.
가장 확실하기는, QTL-4KB이 위치하는 유전적 영역은 도 1에 나타낸 바와 같이 마커 CT50 (표 13)와 P14M50-85h 사이에 위치한다. 그러므로, 그 영역 내에 위치하는 어느 마커는 식물의 게놈에서 QTL의 존재를 평가하는데 사용될 수 있고, 뿐만 아니라 그 영역에 존재한다고 알려진 어느 마커는 공개적으로 이용가능한 정보를 근거로 한다.
가장 확실하기는, QTL-6h가 위치하는 유전적 영역은 도 2에 나타낸 바와 같이 마커 P22M50-188h와 P22M50-513h 사이에 위치한다. 그러므로, 그 영역 내에 위치하는 어느 마커는 식물의 게놈에서 QTL의 존재를 평가하는데 사용될 수 있고, 뿐만 아니라 그 영역에 존재한다고 알려진 어느 마커는 공개적으로 이용가능한 정보를 근거로 한다.
가장 확실하기는, QTL-9h가 위치하는 유전적 영역은 도 3에 나타낸 바와 같이 마커 P18M50-141와 P14M50-276h 사이에 위치한다. 그러므로, 그 영역 내에 위치하는 어느 마커는 식물의 게놈에서 QTL의 존재를 평가하는데 사용될 수 있고, 뿐만 아니라 그 영역에 존재한다고 알려진 어느 마커는 공개적으로 이용가능한 정보를 근거로 한다.
가장 확실하기는, QTL-11h가 위치하는 유전적 영역은 도 4에 나타낸 바와 같이 마커 P14M60-215e와 P22M51-174e 사이에 위치한다. 그러므로, 그 영역 내에 위치하는 어느 마커는 식물의 게놈에서 QTL의 존재를 평가하는데 사용될 수 있고, 뿐 만 아니라 그 영역에 존재한다고 알려진 어느 마커는 공개적으로 이용가능한 정보를 근거로 한다.
가장 확실하기는, QTL-12h가 위치하는 유전적 영역은 도 5에 나타낸 바와 같이 마커 P14M61-420h와 P22M50-131h 사이에 위치한다. 그러므로, 그 영역 내에 위치하는 어느 마커는 식물의 게놈에서 QTL의 존재를 평가하는데 사용될 수 있고, 뿐만 아니라 그 영역에 존재한다고 알려진 어느 마커는 공개적으로 이용가능한 정보를 근거로 한다.
바람직하기는, 본 발명의 QTL은 상기 QTL과 연관된 표 1~5의 마커를 적어도 하나 포함한다. 보트리티스 내성을 제공하는데 책임이 있는 QTL의 핵산 서열은 여기에 동정된 전체 QTL의 분획일 수 있고, 마커는 주로 유전자 영역의 연결된 유전 또는 이와 같은 유전적 영역 내에서 관찰된 재조합의 부재를 나타낸다. 그러므로, 표 1~5에 기재된 마커는 특정된 솔라늄 계통의 게놈에 위치하는 본 발명의 QTL이 위치하는 염색체 영역을 나타내고 이들 마커는 그 QTL의 경계나 구조를 한정할 필요는 없다는 것이 확인된다. 그러므로, 필수 내성-제공 핵산 서열(들)을 포함하는 QTL의 일부는 특정 QTL에 대해 기록된 연속 마커에 의해 표시되는 것보다 상당히 작을 것이다. 이와 같은 부분은 본 명세서에서 QTL의 "내성-제공부"로 언급될 것이다. 그 결과, QTL의 내성-제공부는 상기 기록된 마커 중 어느 것을 반드시 포함해야할 필요가 없다. 또는 다른 마커가, 이와 같은 마커가 QTL에 유전적으로 연결되고 당업자가 본 발명의 것과 유사한 QTL을 발견하고 사용할 수 있지만, 여기서 표 1~5에 기록되고 상기 QTL에 연결되는 것으로 표시되는 하나 이상의 마커가 없는 한, 여러 QTL을 나타내는데 사용될 수 있다.
토마토에서 보트리티스에 대한 내성에 관한 QTL의 보트리티스-내성-제공부는 예를 들면, 상기 QTL에 연결되는 표 1~5에 기재된 QTL에 대한 하나 이상의 마커를 사용하는 분자 마커 기술을, 바람직하기는 내성 생물학적 정량과 함께 사용하여 동정될 수 있다. 본 발명의 QTL의 보트리티스-내성-제공부를 포함하지 않는 토마토 식물은 비교적 보트리티스에 의해 감염되기 쉽다.
본 발명에 의해 제공되는 마커는 감염된 보트리티스-내성 토마토 식물에서 본 발명의 하나 이상의 QTL의 존재를 검출하는데 사용될 수 있고, 그러므로, 보트리티스 내성 토마토 식물의 마커-도움 육종 및 선택 방법에 사용될 수 있다. 바람직하기는 본 발명의 QTL의 존재를 검출하는 것은 상기 QTL에 연결된 바와 같은 표 1~5에 나타낸 QTL에 대한 적어도 하나의 마커로 수행된다. 그러므로, 본 발명은 또 다른 면에서, 보트리티스-내성에 대한 QTL의 존재를 검출하는 방법에 관한 것으로,상기 방법은 감염된 보트리티스-내성 토마토 식물에서 상기 QTL의 핵산 서열의 존재를 검출하고, 존재는 상기 마커의 사용에 의해 검출될 수 있다.
본 발명의 QTL의 핵산 서열은 당업자에게 공지된 방법으로 결정될 수 있다. 예를 들면, 상기 QTL 또는 그것의 내성-제공부를 포함하는 핵산 서열은 상기 식물의 게놈을 분해하고 상기 QTL를 나타내는 하나 이상의 마커를 수확하는 이들 단편을 선택함에 의해 보트리티스-내성 주게 식물로부터 단리할 수 있다. 이어서, 또는 선택적으로, 상기 QTL을 나타내는 마커 서열(또는 그것의 일부)는 상기 식물로부터 얻은 게놈성 핵산 샘플 또는 게놈 단편으로부터 상기 QTL을 포함하는 핵산 서열을 증폭시키기 위해, (PCR) 증폭 프라이머로서 사용될 수 있다. 증폭된 서열은 그리고 나서 단리된 QTL을 얻기 위해 정화될 것이다. QTL의, 및/또는 그 안에 포함된 추가의 마커의 뉴클레오티드 서열은 그리고 나서 표준 서열화법에 의해 얻을 수 있다.
그러므로, 본 발명은 본 발명의 QTL을 포함하는 단리된 핵산 (바람직하기는 DNA) 서열 또는 그것의 보트리티스-내성-제공부에 관한 것이다. 그러므로, 여기에 기재된 여러 QTL을 정확히 지적하는 마커가 보트리티스 내성에 대해 암호화하는 토마토로부터 하나 이상의 유전자를 동정하고, 단리하고 정제하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 QTL의 뉴클레오티드 서열은 예를 들면, 상기 QTL과 연관된 하나 이상의 마커의 뉴클레오티드 서열을 결정하고 상기 마커 서열 이외의 QTL의 서열을 추가로 결정하는데 사용될 수 있는 상기 마커 서열의 내부 프라이머를 고안함에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 표 1~5의 AFLP 마커의 뉴클레오티드 서열은 주게 식물의 게놈에서 상기 마커의 존재를 결정하는데 사용된 전기영동 겔로부터 상기 마커를 단리하고, 그리고 예를 들면 본 분야에 잘 알려진 디데옥시 사슬 종결법에 의해 상기 마커의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 것으로 얻을 수 있다.
감염된 보트리티스-내성 토마토 식물에서 QTL의 존재를 결정하는 이와같은 방법의 구현예에서, 상기 방법은 또한 바람직하기는 상기 QTL에 연결될 수 있는 표 1~5의 마커로부터 선택되는, 상기 QTL에 연결된 마커의 핵산 서열에 스트린전트 혼성화 조건하에서 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계, 상기 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 감염된 보트리티스-내성 토마토 식물의 게놈성 핵산과 접촉시키는 단계, 및 상기 게놈성 핵산에 대한 상기 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 특이적 혼성화의 존재를 결정하는 단계를 포함한다. 비록 인 시츄 혼성화방법이 또한 적용될 수 있지만, 바람직하기는 상기 방법은 상기 감염된 보트리티스-내성 토마토 식물로부터 얻은 핵산 샘플에 대해 수행될 수 있다. 선택적으로, 그리고 더욱 바람직한 구현예에서, 당업자는, 일단 QTL의 뉴클레오티드 서열이 결정되면, 스트린전트 혼성화 조건하에서 상기 QTL의 핵산 서열로 혼성화될 수 있는 특정 혼성화 프로브 또는 올리고뉴클레오티드를 고안할 수 있고 그리고, 감염된 보트리티스-내성 토마토 식물에서 본 발명의 QTL의 존재를 검출하기 위한 방법에 이와 같은 혼성화 프로브를 사용할 수 있다.
용어 "스트린전트 혼성화 조건"은 프로브 또는 폴리뉴클레오티드가 통상적으로 착물 혼합물로, 그러나 본질적으로 다른 서열없이, 그것의 표적 서브서열과 혼성화되는 조건을 말한다. 스트린전트 조건은 서열-의존이고 다른 환경에서는 다를 것이다. 서열이 길수록 특이적으로 더 높은 온도에서 혼성화된다. 핵산의 혼성화에 대한 광범위한 안내는 Tijssen(Thijssen, 1993)에서 발견된다. 일반적으로, 스트린전트 조건은 정해진 이온 강도 pH에서 측정 서열의 열적 녹는점(Tm)보다 약 5~10℃ 낮도록 선택된다. Tm은 표적에 상보적인 프로브의 50%가 평형에서(표적 서열이 과량으로 존재하므로, Tm에서, 프로브의 50%는 평형을 차지한다), (정해진 이온 강도, pH, 및 핵산 농도에서) 표적 서열로 혼성화되는 온도이다. 스트린전트 조건은 pH 7.0 내지 8.3에서 염 농도가 약 1.0M 미만 나트륨 이온, 통상적으로 약 0.01 내지 1.0M 나트륨 이온 농도(또는 다른 염)이고 온도는 짧은 프로브(예를 들면, 10~50 뉴클레오티드)의 경우 적어도 약 30℃이고 그리고 긴 프로브(예를 들면 50 초과 뉴클레오티드)의 경우 적어도 약 60℃이다. 스트린전트 조건은 또한 포름아미드와 같은 탈안정화제의 첨가에 의해 얻을 수 있다. 선택적 또는 특이적 혼성화를 위해, 양의 신호는 적어도 배경의 2배이고, 바람직하기는 배경 혼성화의 10배이다. 예시적인 스트린전트 혼성화조건은 종종 다음과 같다: 50% 포름아미드, 5xSSC, 및 1% SDS, 42℃에서 배양, 또는 5xSSC, 1% SDS, 65℃에서 배양, 0.2xSSC, 및 0.1% SDS at 65℃에서 세척. PCR의 경우, 약 36℃의 온도가 낮은 스트린전트 증폭에 통상적이고, 어닐링 온도는 프라이머 길에 따라 약 32℃~48℃에서 변할 수 있다. 혼성화 계수를 결정하는 추가의 지침은 여러 참조, 예를 들면 Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel, et al. 1995)에서 제공된다.
"핵산" 또는 "올리고뉴클레오티드" 또는 "폴리뉴클레오티드" 또는 본 명세서에 사용되는 문법상 같은 의미의 용어는 함께 공유결합으로 연결된 적어도 두개의 뉴클레오티드를 의미한다. 올리고뉴클레오티드는 통상적으로 길이가 약 7, 8, 9, 10, 12, 15, 1820 25, 30, 40, 50 또는 최대 약 100까지의 뉴클레오티드이다. 핵산과 뉴클레오티드는 더 긴 길이, 예를 들면 200, 300, 500, 1000, 2000, 3000, 5000, 7000, 10,000 등의 어느 길이의 폴리머이다. 본 발명의 핵산은, 비록 몇몇 경우, 교대 백본을 갖는 핵산 상사형, 예를 들면, 포스포하미데이트, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 또는 메틸포스포로아미디트 결합((Eckstein, 1991 참조), 및 펩티드 핵산 백본과 결합을 포함하지만, 일반적으로 포스포디에스테르 결합을 포함한다. 천연적으로 발생하는 핵산과 상사형의 혼합물이 사용될 수 있다. 올리고펩티드에 대한 특히 바람직한 상사형은 펩티드 핵산이다(PNA).
유전자도입법에 의한 보트리티스 -내성 토마토 식물의 생산
본 발명의 또 다른 면에 따라, 본 발명의 적어도 하나의 QTL를 포함하는 핵산(바람직하기는 DNA) 서열 또는 그것의 보트리티스-내성-제공부가 보트리티스-내성 토마토 식물의 생산에 사용될 수 있다. 이 면에서, 본 발명은 본 발명의 QTL 또는 그것의 보트리티스-내성-제공부의, 보트리티스-내성 토마토 식물의 생산을 위한 용도를 제공하고, 그 용도는 보트리티스-감염 수용 토마토 식물에서 상기 QTL을 포함하는 핵산의 도입을 포함한다. 언급한 바와 같이, 상기 핵산 서열은 적합한 보트리티스-내성 주게 토마토 식물로부터 유래될 수 있다. 이전에 기재된 QTL 중 적어도 하나를 포함하는 핵산 서열을 제공할 수 있는 2개의 적절한 보트리티스-내성 주게 토마토 식물은 솔라늄 해브로채티스 LYC 4/78이다. 보트리티스에 대한 내성을 나타내고 보트리티스에 대해 암호화하는 하나 이상의 유전자를 포함하는 다른 관련된 토마토 식물이, 본 발명이 이 물질을 동정하는 방법을 기재하는 바에 따라, 보트리티스-내성 주게 식물로서 사용될 수 있다. 키로페르시콘 세라시포름, 리코페르시콘 치즈마니, 리코페르시콘 칠렌스, 리코페르시콘 필레위스키, 솔라늄 리코페르시굼, 리오페르시콘 히르수툼, 리코페르시콘 파르비플룸, 리코페르시콘 펜넬리, 리코페르시콘 페루비아눔, 리코페르시콘 핌피넬리포리움 및 솔라늄 리코페르시코이드를 포함하는 토마토 종에 대한 자손이 보트리티스 내성에 대해 조사될 수 있지만 이것으로 제한되는 것은 아니다.
적합한 주게 토마토 식물에서 일단 동정되면, 본 발명에 따른 보트리티스-내 성을 위한 QTL을 포함하는 핵산서열, 또는 그것의 보트리티스-내성-제공부는 어느 이용가능한 방법에 의해 적절한 수용 식물로 전달된다. 예를 들면, 상기 핵산 서열은 보트리티스-내성 주게 토마토 식물과 감염 수용 토마토 식물을 교배함에 의해 (예를 들면, 유전질침투에 의해), 형질전환에 의해, 원형질체 융합에 의해, 이중 단배체 기술에 의해, 또는 배아 구조에 의해, 또는 임의로 QTL을 포함하고 보트리티스-내성을 나타내는 자손 식물의 선택이 따르는 다른 핵산 전달 시스템에 의해 전달될 수 있다. 전달의 유전자도입의 경우, 본 발명에 따른 보트리티스-내성을 위한 QTL을 포함하는 핵산 서열, 또는 그것의 보트리티스-내성-제공부는 공지의 방법에 의해 상기 주게 식물로부터 단리될 수 있고 그러므로 단리된 핵산 서열은 생식체 또는 상기 핵산서열로 코팅된 탄도입자와 같은, 어느 적합한 전달 요소에서, 예를 들면, 벡터에 의해, 유전자도입법에 의해 수용 식물로 전달될 수 있다.
식물 형질 전환은 일반적으로 식물 세포에서 융합될 발현 벡터의 구축을 포함한다. 본 발명에서, 이와 같은 벡터는 본 발명의 보트리티스-내성에 대한 QTL를 포함하는 핵산 또는 그것의 보트리티스-내성-제공부를 포함하고, 이 벡터는 프로모터와 같은, 조절 요소에 기능적으로 연결된 또는 조절하의 보트리티스-내성-제공부를 포함할 수 있다. 발현 벡터는 조합물에 함유된 유전자 중 적어도 하나가 보트리티스-내성에 대해 암호화한다면, 하나 이상의 이와 같이 기능적으로 연결된 유전자/조절 요소 조합물을 함유할 수 있다. 벡터는 플라즈미드 형태일 수 있고, 그리고 아그로박테리움 형질전환 시스템과 같은 본 분야에 알려진 형질전환 방법을 사용하여, 보트리티스에 대해 내성인 유전자도입 식물을 제공하기 위해 단독으로, 또는 다른 플라즈미드와 결합하여 사용될 수 있다.
발현 벡터는, 마커를 함유하는 형질전환된 세포가 (선택가능한 마커 유전자를 함유하지 않는 세포의 성장을 억제함에 의한) 음성 선택에 의해 또는 (마커 유전자에 의해 암호화된 생성물을 스크리닝 함에 의한) 양성 선택에 의해 회수되도록 하는 (프로모터와 같은) 조절 요소에 기능적으로 연결된 적어도 하나의 마커 유전자를 포함한다. 식물 형질전환을 위해 많은 일반적으로 사용된 선택가능한 마커 유전자는 본 분야에 알려져 있고, 예를 들면, 항생제 또는 살균제, 또는 억제자에 민감하지 않은 변형된 표적을 암호화하는 유전자일 수 있는 선택가능한 화학약제를 대사적으로 해독하는 유전자를 포함한다. 만노스 선택과 같은, 여러 양성 선택법이 본 분야에 알려져 있다. 선택적으로, 마커-없는 형질전환은 언급된 마커 유전자 없는 식물을 얻는데 사용될 수 있고, 그 기술은 본 분야에 알려져 있다.
식물에 발현벡터를 도입하는 하나의 방법은 아그로박테리움의 천연 형질전환 시스템을 근거로 한다(예를 들면, Horsch et al., 1985 참조). A. tumefaciens과 A. rhizogenes은 식물 세포를 유전적으로 형질전환하는 식물 병원성 토양 박테리아이다. A. tumefaciens 및 A. rhizogenes의 Ti와 Ri 플라즈미드는 각각, 식물의 유전적 형질전환에 책임있는 유전자를 나른다(예를 들면, Kado, 1991 참조). 식물 조직에 발현벡터를 도입하는 방법은 아그로박테리움 투메파신으로 식물을 직접 감염 또는 공동-재배를 포함한다(Horsch et al., 1985). 아그로박테리움-매개 유전자 전이를 위한 아그로박테리움 벡터 시스템 및 방법의 설명은 Gruber 및 Crosby, 1993 그리고 Moloney et αl., 1989에 의해 제공된다. 또한 U. S. Pat. No. 5,591,616 참조. 식물 발현 벡터와 수용체 유전자 및 형질전환 프로토콜의 일반적인 설명과 아그로박테리움 벡터 시스템 및 아그로박테리움-매개 유전자 전이 방법의 설명은 Gruber 및 Crosby, 1993에 의해 제공된다. 식물 조직을 재배하는 일반적인 방법은 예를 들면, Miki et αl., 1993과 Phillips, et αl., 1988에 의해 제공된다. 분자 클로닝 기술과 적합한 발현 벡터에 대한 바람직한 참조 핸드북은 Sambrook and Russell (2001)이다.
식물에 발현벡터를 도입하기 위한 또 다른 방법은 DNA가 미세입자 투사법의 표면에서 운반되는 미세입자투사-조절 형질전환법을 기초로 한다. 발현 벡터는 미세입자투사의 속도를 식물 세포벽과 막을 통과하기에 충분한 300~600m/s까지 가속하는 입자총(biolistic device) 장비로 식물 조직에 도입된다(Sanford et αl., 1987, 1993; Sanford, 1988, 1990; Klein et al.,1988, 1992 참조). DNA를 식물체 도입하는 또 다른 방법은 표적 세포의 고주파분해를 통한 것이다(Zhang et αl., 1991 참조). 선택적으로, 리포솜 또는 구상원시세포 융합이 발현 벡터를 식물에 도입하는데 사용된다(예를 들면, Deshayes et al, 1985 및 Christou et al, 1987 참조). CaCl2 침전, 폴리비닐 알콜 또는 폴리-L-오르니틴을 이용한 DNA의 원형질체의 직접 섭취가 보고되어 있다(예를 들면, Hain et al. 1985 and Draper et al., 1982). 원형질체 및 전세포 그리고 조직의 전기천공(electroporation)이 또한 기재되어 있다(D'Halluin et al., 1992 and Laursen et al, 1994).
토마토 표적 조직의 형질전환에 이어서, 상기 선택가능한 마커 유전자의 발 현은 본 분야에 잘 알려진 재생과 선택 방법을 이용한 형질 전환된 세포, 조직 및/또는 식물의 우선적인 선택을 허용한다. 표 1~5의 마커들은 또한 이 목적에 사용될 수 있다.
비-유전자 도입법에 의한 보트리티스 -내성 토마토 식물의 생산
보트리티스-내성 토마토 식물을 생산하기 위한 선택적인 구현예에서, 원형질체 융합이 주게 식물에서 수용 식물로 핵산의 전달을 위해 사용될 수 있다. 원형질체 융합은 단일의 이중- 또는 다중-핵이 있는 세포를 생산하기 위해 두개 이상의 원형질체(세포벽이 효소처리에 의해 제거된 세포) 사이에, 체세포 혼성화와 같은 유도된 또는 자연발생적 결합이다. 융합된 세포는, 천연에서 이종교배될 수 없는 식물 종들로도 얻어질 수 있는데, 원하는 형질의 결합을 나타내는 혼성화된 식물로 조직배양된다. 더욱 특별히는, 처음의 원형질체는 보트리티스에 의한 감염에 내성을 나타내는 토마토 식물 또는 다른 식물 계통으로부터 얻을 수 있다. 예를 들면, 솔라늄 해브로채티스 LYC 4/78로부터의 원형질체가 사용될 수 있다. 제2의 원형질체는 제2의 토마토 또는 다른 식물 변이체, 바람직하기는 질병 내성, 곤충 내성, 가치 있는 열매 특징 등과 같은 상업적으로 바람직한 특징을 포함하는 토마토 계통으로부터 얻을 수 있지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 그리고 나서 원형질체는 통상의 원형질 융합 공정을 이용하여 융합되고, 이것은 본 분야에 알려져 있다.
선택적으로, 배아 회생이 주게 식물로부터 수용 식물로 본 발명의 하나 이상의 QTL을 포함하는 핵산의 전달에 적용될 수 있다. 배아 회생은 또한 식물이 실용적인 종자를 생산하는데 실패한 교배로부터 배아를 단리하는 공정에 사용될 수 있 다. 이 공정에서, 식물의 수정된 씨방 또는 미성숙 종자는 새로운 식물을 생성하기 위해 조직 배양된다(Pierik, 1999).
본 발명은 또한 보트리티스-내성 토마토 식물의 생산방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기와 같이 발명에 따른 주게 식물에서 보트리티스 시네리아에 대한 내성과 관련된 양적 형질 유전자 자리의 존재를 검출하는 방법을 수행하는 단계, 및 이와 같이 검출된 적어도 하나의 QTL 또는 그것의 보트리티스-내성-제공부를 포함하는 핵산 서열을 상기 주게 식물로부터 보트리티스-내성 수용 토마토 식물로 전달하는 단계를 포함한다. 상기 핵산 서열의 전달은 이미 본 발명에 기재된 방법 중 어느 것에 의해 수행될 수 있다.
이와 같은 방법의 바람직한 구현예는, 보트리티스-내성 주게 토마토 식물로부터 보트리티스-감염 수용 토마토 식물로 상기 식물의 교배에 의해 상기 핵산 서열의 유전질 침투에 의한 전달을 포함한다. 그러므로, 이 전달은 통상의 육종 기술을 사용하여 수행하기에 적합하다. QTL은 바람직하기는 마커-도움 육종(MAS)을 사용함에 의해 상업적 토마토 변종로 유전질 침투된다. 마커-도움 육종 또는 마커-도움 선택은 원하는 형질을 암호화하는 하나 이상의 유전자를 함유하는 이들 자손 식물의 동정 및 선택을 위한 하나 이상의 분자 마커의 사용을 포함한다. 현재의 경우, 이와 같은 동정 및 선택은 본 발명의 QTL 또는 그와 연관된 마커의 선택을 기초로 한다. MAS는 또한 각각의 QTL 효과의 더욱 상세한 연구를 허용하는, 관심의 QTL을 수확하는 근-동종 계통을 개발하는데 사용될 수 있고, 역교배 근계통(BIL)을 개발하는 효과적인 방법이다(예를 들면, Nesbitt et al., 2001; van Berloo et al., 2001 참조). 이런 바람직한 구현예에 따라 개발된 토마토 식물은 유리하기는 수용 식물로부터 그들의 형질의 대부분을 유도할 수 있고, 그리고 주게 식물로부터 보트리티스-내성을 유도할 수 있다.
보트리티스 시네리아에 대한 내성은 다유전적으로(polygenically) 유전되므로, 적어도 2개, 바람직하기는 3개 QTL 또는 그것의 보트리티스-내성 제공부가 단일 수용체 식물에 적합한 전달 방법으로 삽입되고, 즉 다중 QTL이 수용식물의 게놈에 쌓인다.
본 발명의 두개 이상의 QTL의 더미는 보트리티스에 대한 증가된 내성을 가져올 수 있다. 당업자가 쉽게 이해하는 바와 같이, 더미는 어느 방법으로 얻을 수 있고, 예를 들면, 본 발명의 다중 QTL을 포함하는 핵산 구조물을 갖는 식물을 형질 전환하는 것이다. 선택적으로, 적어도 하나의 QTL이 교배의 각 부모 식물에 존재할 수 있고 따라서 적어도 두개의 QTL이 생성된 혼성물에 포함될 수 있다. 이들 내성 형질을 쌓음으로 매우 내성화된 식물이 얻어질 수 있다. 이와 같은 식물은 본 발명의 매우 바람직한 구현예이다.
상기 간단히 논의된 바와 같이, 통상의 육종 기술이 보트리티스 내성을 암호화하는 핵산 서열을 보트리티스-감염 수용 토마토 식물에 유전질 침투하는데 사용될 수 있다. 한 방법에서, 이것은 혈통 육종으로 언급되는데, 보트리티스에 대한 내성을 나타내고 보트리티스 내성을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 주게 토마토 식물은, 질병 내성, 곤충 내성, 가치있는 열매 특징과 같은, 그러나 이것은 제한되는 것을 아닌, 상업적으로 바람직한 특질을 나타내는 보트리티스-감염 수용 토마토 식물과 교배된다. 생성된 식물개체(F1 혼성물로 표시)는 그리고 나서 자가-수분되어 종자를 뿌린다(F2 종자). F2 종자로부터 성장된 F2 식물은 그리고 나서 보트리티스에 대한 내성에 관하여 스크리닝된다. 개체군은 수 많은 다양한 방법으로 스크리닝될 수 있다.
우선, 개체군은 전통적인 질병 스크린을 이용하여 스크리닝될 수 있다. 이와 같은 질병 스크린은 본 분야에 알려져 있다. 바람직하기는 정량적 줄기 또는 잎 감염 생물학적 정량이 사용되고, 바람직하기는 상기와 실시예에 더욱 상세히 설명된 바와 같은 본 발명의 방법에 사용된 줄기 생물학적 정량이 사용된다. 두번째, 마커-도움 선택은 보트리티스-내성을 암호화하기 위한 핵산 서열을 포함하는 이들 자손을 이용하여 수행될 수 있다. 한편, QTL의 존재를 검출하기 위한 방법에 의해 상기 언급된 다른 방법이 사용될 수 있다. 또한, 마커-도움 선택은 정량적 생물학적 정량으로부터 얻은 결과를 확인하는데 사용될 수 있고, 그러므로, 여러 방법들이 결합하여 사용될 수도 있다.
보트리티스 -내성 토마토 식물과 종자
본 발명의 보트리티스-내성 토마토 식물은 높은 수준의 내성을 갖는 것을 특징으로 한다. 이것은 감염성 대조 식물에서 관찰된 것보다 높은 내성 수준을 갖는것으로 정의된다. 사실, 본 발명의 식물은 지금까지 알려진, 상업적으로 바람직한 특징을 갖는 변종인, 어느 상업적 토마토 변종의 내성보다 높은 내성 수준을 갖는다. 본 발명의 식물은 생물학적 정량에 의해 측정되었을 때, 예를 들면, 성인 식물에서 보트리티스 시네리아에 의한 줄기 병변의 평균 길이는 실시예 3.10과 3.11에 더욱 상세히 기재된 바와 같은 표준 실시 조건하에서 3주 기간 동안 측정될 때, 감염성 대조 식물보다 최소한 3배 낮은 보트리티스 시네리아에 대한 감염성을 갖는다. 통상적으로, 본 발명의 식물은 이와 같은 특성을 기초로 내성을 측정하도록 고안된 내성 생물학적 정량에서 표준 실시 조건을 사용하여, 성인 식물에서의 보트리티스 시네리아의 평균 줄기 병변 길이가 접종 후 3주에 3.2cm 미만인 내성 수준을 갖는다. 더욱 통상적으로, 본 발명의 식물은 평균 줄기 병변 길이가 2.9cm 미만이다. 본 발명의 몇몇 식물은 평균 줄기 병변 길이가 2.0cm이기도 하다. 상기 숫자들이 2cm 초기 접종 상처를 포함하는 병변의 길이를 나타내는 것을 고려하여, 높은 수준의 내성 그리고 심지어 몇몇 QTL의 경우는 완전한 내성이 본 발명의 식물에서 관찰되었다고 언급할 수 있다. 비교에서, 감염성 대조 식물은 동일한 조건에서 약 3.6cm 내지 약 6.0cm, 평균 4.85cm의 평균 줄기 병변길이를 나타낸다(표 7 참조). 또한, 비교로서, 솔라늄. 해브로채티스 LA 1777, WO02/085105의 부분적으로 보트리티스 내성 기원을 함유하는 QTL-10은 동일한 조건 하에서 약 4.3cm의 평균 줄기 병변을 나타낸다. 요약하면, 본 발명의 식물은 일반적으로, 감염성 대조 식물의 순 길이의 약 30% 미만(0.9/2.85 xlOO%)이고, 그리고 일반적으로 솔라늄 해브로채티스 LA 1777에 대한 부분적 내성의 순 길이의 약 40% 미만(0.9/2.3 x 100%)인 상기 내성 생물학적 정량에서의 순 줄기 병변을 나타낸다.
그러므로, 본 발명의 식물은 보트리티스 시네리아에 대해 민감하고, 이것은 생물학적 정량에 의해 측정되었을때 감염성 대조 식물보다 3배 낮고 또는 그것의 1/3 미만 수준이다. 상호적으로, 본 발명의 식물은 본 명세서에 정의된 바와 같이, 그리고 기재된 생물학적 정량으로 결정된 바와 같이, 감염성 대조 식물보다 내성이 3배 이상이다. QTL-1h으로 완전 내성이 관찰된다. 감염성 대조 식물은 보트리티스 시네리아 감염에 대한 정상적인 감염성을 나타내거나 또는 내성이 없는 식물을 말한다. 감염성 대조 식물의 예는 혼성 솔라늄 리코페르시콤 cv. "Moneyberg"이다 (드 루이터 씨즈 알 앤 디 비.브이., 베르크쉐엔후크, 네덜란드).
본 발명의 방법에 의해 얻을 수 있는 보트리티스-내성 토마토 식물, 또는 그것의 일부는 또한 본 발명의 한면이다. 본 발명의 또 다른 면은 그것의 게놈에서, 보트리티스 내성과 연관된 솔라늄 해브로채티스 LYC 4/78의 염색체 4, 6, 9, 11 및 12에서의 QTL로 이루어진 군으로부터 선택되는, 적어도 하나의 QTL 또는 그것의 보트리티스-내성-제공부를 포함하는 보트리티스-내성 토마토 식물 또는 그것의 일부에 관한 것으로, 여기서 상기 QTL 또는 상기 그것의 보트리티스-내성 제공부는 천연 유전 배경에 존재하지 않는다. 본 발명의 보트리티스-내성 토마토 식물은 근교배, 혼성, 단배체, 이배체, 단위결실 또는 유전자 삽입과 같은 어느 유전형일 수 있다. 추가로, 본 발명의 식물은 내성 형질에 대해 이형접합 또는 동형접합일 수 있고, 바람직하기는 동형접합이다. 비록 본 발명의 QTL, 뿐 아니라 본 발명의 방법에 따라 얻을 수 있는 이들 QTL, 그것의 보트리티스-내성-제공부는 보트리티스-내성 식물을 제공하기 위해 어느 식물에 전달될 수 있고, 본 발명의 방법과 식물은 바람직하기는 솔라나세아 과(family)의 식물과 관련되고, 더욱 바람직하기는 토마토이다.
여기에 동정된 바와 같은 보트리티스 내성과 연관된 솔라듐 래브로채티스의 염색체 4(QTL-4hB), 6, 9, 11 및 12의 QTL에 더하여, 본 발명의 식물은 임의로 여기에 QTL-1h, QTL-2h 및 QTL-4hA로 동정되고, 그리고 함께-출원중이고, 명백히 본 내용에 참조되는 출원PCT/NL2005/000762 및 EP 1 652 930 A (European patent application 04077931.6)에 더욱 상세히 기재된 바와 같이, 하나 이상의 솔라늄. 해브로채티스-유도 QTL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 QTL 또는 PCT/NL2005/000762에 기재된 바와 같은 QTL인 QTL의 결합은 이와같은 결합을 수확하는 식물에서 질병 내성을 증가시킬 것이라고 진술된다. 그러나, QTL의 각각은 또한 배경 조상 솔라늄 해브로채티스로부터의 유전적 정보를 따르고, 이것은 지나친 이 배경의 유전 정보를 갖는 후손에서, 원하는 최적의 작물학적 특징을 갖는 식물을 얻는 것이 불가능할 것이라는 것을 의미한다.
근교배 보트리티스-내성 토마토 식물 계통은 회기 선택 및 역교배, 자가생식 및/또는 이배체의 기술 또는 부모 계층을 만드는데 사용되는 다른 기술을 사용하여 개발될 수 있다. 선택 및 역교배 방법에서, 보트리티스-내성은 회기 부모를 첫번째 주게 식물(이것은 회기 부모와 다르고 "비-회기 부모"로 불리운다)과 교배함에 의해 표적 수용 식물(이것은 회기 부모로 불리운다)에 유전질 침투될 수 있다. 회기 부모는 보트리티스에 대해 비-내성이거나 또는 낮은 내성 수준을 갖고 질병 내성, 곤충 내성, 가치있는 열매 특성 등과 같은, 그러나 이것으로 제한되는 것은 아닌, 상업적으로 바람직한 특징을 소유한다. 비-회기 부모는 보트리티스 내성을 나타내고 보트리티스 내성에 대해 암호화하는 핵산을 포함한다. 비-회기 부모는 회기 부 모와 교배-수정되는 어느 식물 변종 또는 근교배 계통일 수 있다. 회기 부모와 비-회기 부모의 교배로 생성된 자손은 회기부모에 대해 역교배된다. 생성된 식물 개체군을 그리고 나서 스크리닝한다. 개체군은 여러 다양한 방법으로 스크리닝될 수 있다. 예를 들면, 개체군은 위에 기재된 바와 같이 줄기 정량적 생물학적 정량을 사용하여 스크리닝될 수 있다. 보트리티스-내성 표현형을 나타내는 F1 혼성 식물은 보트리티스-내성에 대해 암호화하는 필수 핵산 서열을 포함하고, 그리고 상업적으로 바람직한 특징을 가지며, 그리고 나서 선택되고 자가 수정되고 그리고 토마토 식물이 점점 더 근교배 되도록 하기 위해 수 많은 세대에 대해 선택된다. 연속적인 자가수정 및 선택 공정은 2 내지 5 세대 또는 그 이상의 세대에 대해 수행될 수 있다. 이와 같은 육종 및 선택의 결과는 상업적 관심의 형질과 관련된 다른 유전자들 뿐 아니라 보트리티스 내성과 연관된 유전자에 대해 유전적으로 균질인 계통의 생산이다. 생물학적 정량의 표현형 병리학 스크린을 이용하는 대신, 보트리티스-내성에 대해 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 자손을 동정하기 위해, 지금까지 기재된 분자 마커, 혼성화 프로브 또는 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상을 사용하여 MAS를 수행할 수 있다. 선택적으로, MAS는 정량적 생물학적 정량으로부터 얻은 결과를 확인하는데 사용될 수 있다. 일단 적절한 선택이 이루어지면, 그 공정이 반복된다. 회기 부모로의 역교배와 보트리티스-내성을 위한 선택의 방법은 약 5 세대 이상동안 반복된다. 이 공정으로부터 부터 생성된 후손은 보트리티스-내성에 대해 암호화하는 하나 이상의 유전자에 대해 이형접합체이다. 그리고 나서 마지막 역교배 세대는 보트리티스-내성에 대한 자손을 동형접합 순수 육종을 제공하기 위해 자가수정 된다.
본 명세서에 기재된 보트리티스-내성 근교배 토마토 계통은 보트리티스-내성 혼성 식물을 생성하기 위한 추가의 교배에 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 첫번째 보트리티스-내성 근교배 토마토 식물은 질병내성, 곤충 내성, 바람직한 열매 특징 등과 같은, 그러나 이것으로 제한되는 것은 아닌, 상업적으로 바람직한 형질을 소유하는 제2 근교배 토마토 식물과 교배될 수 있다. 이 제2 근교배 토마토 계통은 보트리티스 내성일 수도 또는 아닐 수도 있다.
본 발명의 또 다른 면은 보트리티스-내성 토마토 식물로 성장될 수 있는 종자를 생산하는 방법에 관한 것이다. 한 구현예에서, 이 방법은 본 발명의 보트리티스-내성 토마토 식물을 제공하는 단계, 상기 보트리티스-내성 식물을 솔라윰 리코페르시쿰 식물과 교배하는 단계, 그리고 상기 교배로 생긴, 심었을 때 보트리티스-내성 토마토 식물을 생성하는 종자를 수집하는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 방법은 본 발명의 보트리티스-내성 토마토 식물을 제공하는 단계, 상기 보트리티스-내성 식물을 솔라늄 리코페르시쿰 식물과 교배하는 단계, 상기 교배로부터 생긴 종자를 수집하는 단계, 상기 종자를 식물로 재생하는 단계, 여기에 기재된 어느 방법에 의해 보트리티스-내성 식물을 선택하는 단계, 식물에 보트리티스-내성을 제공하는 대립형질에 대해 고정된 식물을 얻기 위해 충분한 수의 세대에 대해 선택된 식물을 자가-교배하는 단계, 이와 같이 생성된 식물을, 보트리티스-내성이고 원하는 표현형 형질을 갖는 솔라늄 리코페르시쿰 식물과 역교배하는 단계, 및 최종 역교배로부터 생성된, 심었을 때 보트리티스-내성인 토마토 식물을 생산하는 종자를 수집하는 단계를 포함한다.
예로서, 본 발명의 실시예를 하기에 제공하지만, 그것으로 제한하는 것은 아니다.
실시예
실시예 1.
보트리티스 시네리아에 대한 내성과 연관된 QTL을 동정하는 방법.
1.1. 도입
본 실시예는 야생 토마토 유전형의 수집종의 보트리티스 시네리아에 대한 내성을 평가하기 위한 정량적 생물학적 정량의 개발을 나타낸다.
보트리티스 시네리아에 대한 부분적 내성은 야생 토마토 종에서 보고되었지만, 이들 보고는 대부분 설명이고 정성적이다. 부분적으로 내성 유전형의 동정은 내성을 조절가능한 내성 수준을 갖는 계통을 얻기 위한 상업적 육종 계통으로 유전질 침투하기 위한 투시를 제공한다. 재생가능하고, 객관적일고 정량적인 분석의 이용가능성은, 유전적으로 결정된 (부분적) 회색 곰팡이 내성을 갖는 유전자형의 동정과 마찬가지로, 배양된 토마토 변종에서 육종된 내성에 대한 방법을 개시한다.
본 실시예는 정량적 질병 분석을 기재한다. 본 분석은 잎(잎 접종 분석) 및줄기 세그먼트(줄기 접종 분석)에서 적용되었다. 질병 감염성에 대해 두 파라미터를 시험하였다. 측정된 첫번째 파라미터는 질병 발생(DI), 즉 확장된 병변을 가져오는 접종비율이다. 특정 숙주 유전형에서 확장하는데 중요한 보트리티스 시네리아의 (부분적) 실패가 식물의 유전적 형질이면, 이와 같은 형질은 곡물에서 질병 촛 점의 수를 직접 제한하기 때문에 중요하다. 시험된 두번째 파라미터는 24시간에 걸친 변병 성장 속도이다(병변 성장, LG). 중요한 접종점으로부터 확장된 병변은, 병변이 잎의 가장자리 또는 줄기 세그먼트의 저부 끝까지 도달될 때까지 시간에 걸쳐 동일한 속도(mm/day)로 확장되는 것으로 보였다. 본 분석은 보트리티스 시네리아 감염의 발생(질병 발생)과 전개(병변 성장) 모두를 정량화할 수 있고 정량적 형질 자료의 두 세트를 가져온다. 분석을 그 안의 내성의 존재에 대해 토마토 종의 수집종(이하 "수집종"으로 명명)을 스크린하는데 사용하였다
1.2. 식물
시험된 식물 유전자형을 표 6에 나타내었다.
표 6. 시험된 솔라늄 유전자형의 리스트
Figure 112008079805292-pct00006
1 De Ruiter Seeds, Bergschenhoek, The Netherlands; WU PPW: Plantkundig Proefcentrum Wageningen, Wageningen University, Wageningen, The Netherlands; LoPB: Laboratory of Plant Breeding, Wageningen University, Wageningen, The Netherlands; MPIZK: Max Planck Institut fur Zuchtungsforschung an Kulturpflanze, Koln, Germany; TGRC: Tomato Genetics Resource Center, University of California at Davis, Davis CA, USA; IPK: Institut fur Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung, Gatersleben, Germany.
2 Y 는 그 유전형이 특정 분석에서 시험되었음을 나타내고, S는 감염성 참조 대조로서 사용된 유전형을 나타낸다.
(3) 보트리티스 시네리아에 대한 내성이 이미 알려져 있다.
식물들을 최저 온도가 15℃인 온실에서 12cm 단지에서 영양토에서 성장시켰다. 인공 나트륨 램프를 10월부터 3월까지 적용시켰다(16시간/일). 발아 후 5~7일 후에, FeNaEDTA 용액(3.5 g/ℓ) 10㎖를 첨가하고, 이어서 3일 후 미세영양용액(0.286 g/ℓ H3BO3; 0.1558 g/ℓ MnSO4-H2O; 0.008 g/ℓ CuO4-H2O; 0.022 g/ℓ ZnSO4; 0.00196 (NH4)6Mo7O24.4H2O) 10㎖를 첨가하였다. 발아 이후 2 주로부터, 호오글랜드 용액 (5 mM Ca(NO3)2; 5 mM KNO3; 2 mM MgSO4; 1 mM KH2PO4) 5㎖를 매주 첨가하였다.
1.3. 잎 분석
보트리티스 시네리아 균주 B05.10로부터의 접종물을 Benito에 따라 제조하였다(1998). 각각의 개별 식물에 대해 완전히 뻗친 하나 이상의 복합잎(compound leaf)을 날카로운 안전 면도날로 기본 줄기로부터 분리시키고 미리-적신 플로리스트 폼으로 옮겼다. 플로리스트 폼을 수도물을 함유하는 페트리 접시에 놓고 이어서 습식 필터지를 함유하는 분사-습식 용기에 놓았다. 그리고 나서 복합잎을 보트리티스 시네리아의 분생자 현탁액으로 잎의 상부 표면에 접종액 총 6~10 방울을 조심스럽게 피펫으로 접종하였다(2 ㎕). 용기를 분사-습식 뚜껑으로 닫고, 본질적으로 Benito et al, 1998에 의해 기재된 바와 같이 15℃ 암실 100% RH에서 배양하였다. 적절히는, 하나의 복합잎을 4개의 소잎으로 나누고, 모든 소잎을 각각 2000 분생자를 함유하는 2㎕의 10 방울로 접종시켰다. 공격적인 확장 병변의 비율(질병 발생)과 병변 성장 속도 모두를 수일에 걸쳐 모니터하였다.
계절과 식물 재배 상태에 따른 변동을 보정하기 위해, 각 실험에서 특정 유전자형의 질병 발생을 동일 실험에서 시험된 머니메이커의 질병발생에 관하여 말하였다.
병변 크기를 칼리퍼를 사용하여 96, 120 및 144 hpi에서 측정하였다. 질병 발생을 확장된 병변의 총수를 접종 방울 총수로 나눠 결정하였다. 병변 성장 속도는 24시간에 걸친 병변 크기의 증가에 의해 결정하였다(mm). 비-확장 병변에 대한 자료는 정량 분석에서 제하였다.
1.4. 줄기 분석(표준화 공정)
줄기 분석을 다음과 같이 수행하였다: 약 50cm 높이의 식물의 줄기의 상부 5~10cm와 하부 5~10cm를 제거하고 남은 30cm를 5~6cm의 동일한 세그먼트로 절단하였다. 각각의 줄기 세그먼트를 습식 필터지 상의 줄기 저부를 갖는 격자에 세워놓았다. 접종 전에, 줄기 세그먼트에 수도물을 분사하여 상처 표면에 접종물의 동일한 분사가 보장되도록 하였다. 접종물은 잎 분석에서 기재한 바와 동일하게 제조하 였다. 약 106ㆍ㎖-1 분생자를 함유하는 5㎕ 접종물 한방울을 각각의 줄기 세그먼트의 상부에 적용하였다. 배양을 15±2℃, 100% 상태습도를 갖는 암실에서 수행하였다. 감염 진행을 Vernier 칼리퍼로 접종 후 다양한 시간 간격에서 뿌리 증상의 최대 전진을 측정하여 평가하였다.
각 유전자형에 대해, 감염된 줄기 조각들의 백분률을 산출하였다. 질병 발생을 확장된 병변을 갖는 줄기 세그먼트의 총수를 접종된 세그먼트의 총수로 나눠 결정하였다. 병변성장 속도는 24시간에 걸쳐 병변 크기의 증가를 산출하여 결정하였고, 그것에 의해 비-확장 병변에 대한 자료는 분석에서 제외시켰다.
1.5. 결과
분리된 잎 감염 실험에서 질병 발생과 병변 성장을 각각의 유전자형에 대해 수일에 걸쳐, 보통 감염 후 2~4일 후 결정하였다. 참조로서 사용되는 솔라늄 리코페르시쿰 cv. 머니메이커에서의 질병 발병은 이번 실험에서 15와 78%로 불안정하였다. 유전자형 82/2577과 83/2896 (둘 다 S. lycopersicum 종)를 제외하고, 시험된 유전자형은 모든 실험에서 머니메이커 보다 낮은 질병 발병을 나타내었다. 유전자형 G1.1556, G1.1560 및 G1.1601은 3개의 독립적인 실험에서, 0 내지 21% 범위의 낮은 질병 발생을 나타내었다. 통게적 분석은 유전자형 78/1604, 91/4311, 96/4326, G1.1556, GI 1558, G1.1560, G1.1601, LA716 및 LYC 4/78에서의 질병 발생이 대조 계통 솔라늄 리코페르시쿰 cv. 머니메이커 (p<0.05)보다 상당히 낮음을 나타낸다. 그러나, 주마다의 큰 변화와 분리된 잎 분석에서 관찰된 차이의 몇몇은 실험/주 사이의 질병 발생에서의 변동(15-78%)으로 인해 실질적으로 매우 확고한 것은 아니다
이들 내성 유전자형 내에서(머니메이커 참조에서의 질병 발생보다 질병발생이 상당히 낮은), 종종 성공적으로 확장된 병변은 머니메이커에서와 유사한 속도로 확장한다(예를 들면, 96/4326, G1.1560, LA716). 반대 상황은 발견되지 않았다: 머니메이커의 질병 발생과 유사한 질병 발생을 나타내지만, 머니 마커보다 병변 성장 속도가 느린 유전형은 없었다.
대부분의 유전자형에서 24시간(48 내지 72 hpi)에 걸친 병변 성장 속도는 머니메이커와 동일한 범위였다. 5개의 수집종(91/4311, 160/79, G1.1556, G1.1601 및 LYC 4/78)은 더 늦은 병변 성장 속도를 나타냈고, 이것은 솔라늄 리코페르시쿰 cv. 머니메이커의 병변성장 속도와 통계적으로 상당히 달랐다. 줄기 세그먼트 감염 분석은 다른 계절에서 수행된 시험들 간에 재생가능성 면에서 잎 분석보다 더 확고한 것으로 나타났다. 줄기 세그먼트의 자료 지점의 수(식물 당 5~8 세그먼트)가 잎 분석보다 크게 작지만(복합잎 당 40 접종 방울, 식물 당 하나 또는 두개의 잎이 시험될 수 있다), 실험간의 변동가능성은 줄기 세그먼트 분석에서 일반적으로 낮다. 대조 유전형 솔라늄 리코페르시쿰 cv. 머니메이커에 대한 줄기 분석에서의 질병은 52-95%의 범위이다. 17 유전자형에서 질병 발생을 동일한 실험/주에서 결정된 대조 계통 솔라늄 리코페르시쿰 cv. 머니메이커의 질병 발생과 비교하였다. 유전자형 G1.1556 (29% 및 41%) 및 Gl1.1560 (28% 및 7%)는 감소된 질병발생을 나타낸다. 오직 G1.1560만이 대조와 통계적으로 의미있는 차이를 나타냈다(p<0.05)
대조 유전자형 솔라늄 리코페르시쿰 cv. 머니메이커에 대한 줄기 분석에서의 병변 성장 속도는 5.4 내지 9.2 mm/day. 많은 유전자형의 병변성장 속도는 대조와 유사한 범위였다. 그러나, 수집종 89/3793, G1.1601, LYC 4/78, T566-81에서 병변 성장 속도는 대조 cv. 머니메이커와 통계적으로 의미있는 차이를 나타냈다(p<0.01).
줄기 세그먼트 분석에서 부분적으로 내성으로 평가된 많은 유전자형에서, 정성 분석이 Rockwool® 상의 온실에서 성장된 전체 식물에서 수행되었다. 목적은 실험실 조건에서 줄기 세그먼트에서 내성을 나타내는 유전자형이 반-상업적 작물 시스템에서의 대조 계통 보다 참으로 더 내성인가를 평가하는 것이다. 식물은 Rockwool®의 열에 임의의 순서이고, 온실 구획은 포자분열 덤에서 보트리티스 시네리아에 의해 크게 감염된 감귤류 열매로 채웠다. 온실 구획은 하루 2회 수도물을 바닥에 분사하고 문과 창문을 닫음으로써 고습으로 유지하였다. 규칙적인 간격으로 전지된 상처를 모든 식물에 만들었고 회색 곰팡이의 발현을 시간에 따라 모니터하였다. 많은 수의 야생 토마토 수집종은 두 파라미터의 심각한 감소를 나타내는 것으로 확인되었고, 그러므로, 솔라늄 리코페르시쿰으로 두개의 부분적 내성의 잠재적인 독립적 매카니즘의 유전질 침투에 대한 잠재적 기원을 제공한다.
실시예 3. 종간 토마토 개체군에서 보트리티스 시네리아 에 대한 부분적 내성의 지도화(솔라늄 리코페르시쿰 cv. 머니메이커 x 솔라늄 해브로채티스 수집종 LYC 4/78)
이 실험에서, 솔라늄 해브로채티스 LYC 4/78로부터 기원하는 보트리티스 시 네리아에 대한 부분적인 내성을 제공하는 두개의 QTL 유전자 자리가 제공된다. 그 결과의 확인은 두개의 QTL 유전자 자리 중 하나에 대해 분리된 두개의 BC2S1 개체군에서 보트리티스 시네리아에 대한 내성 수준을 평가함으로써 얻어졌다.
3.1. 식물 재료
솔라늄 해브로채티스 LYC 4/78 (이하 LYC 4/78로 명명)의 종자를 식물 유전 및 곡물 연구소, 가터슬레벤, 독일에 위치한 유전자 뱅크로부터 얻었다
솔라늄 리코페르시쿰 cv 머니메이커(이하 머니메이커로 명명)의 종자를 De Ruiter Seeds R&D BV, Bergschenhoek, 네덜란드의 유전자 뱅크로부터 얻었다.
머니메이커와 LYC 4/78 사이의 종간 교배로 F1 종자를 만들었다. F1 종자를 F1 식물로 성장시켰다. 하나의 F1 식물의 자가교배로부터 유도된 F2 종자를 174 개개의 F1 개체군을 얻기위해 거두었다. 59 개개의 BC2 (역교배 2) 개체군을 회기와 암컷 부모로서 머니메이커와 역교배 2회에 의해 발생시켰다. MAS를 사용하여, BC2, BC3, 및 BC4 유전자형을 두개의 동정된 QTL중 하나를 함유하도록 선택하였고 몇몇의 BC2는 자가수분되어 BC1S1 종자를 생산하였다(도 2 참조). 두개의 BC2S1 개체군을 성장시켰다: 질병 발생에 대한 QTL에 대해 분리된 60개의 BC2S1 개개 중 하나 그리고 병변 성장에 대한 QTL에 대해 분리된 47개 BC2S1 개개 중 다른 하나.
3.2. 줄기 분석
보트리티스 시네리아 균주 B05.10로부터의 접종물을 Benito (1998)에 따라 제조하였다. 줄기 분석을 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행하였다.
3.3. DNA 단리 및 마커 분석
게놈성 DNA를 두개의 젊은(감겨진)잎으로부터, 1㎖ 미크론성 튜브(Micronic BV, Lelystad, The Netherlands)를 이용하여 높은 산물 DNA 단리를 위해 조절된, Steward 및 Via (1993)에 따른 프로토콜을 기준으로 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB)를 사용하여 단리하고, 그리고 Retsch 300 mm 세이커를 이용하여 최대 속도로 연마하였다(Retsch BV, Ochten, The Netherlands). F2, BC2, BC3, BC4 및 BC2S1 개체군의 AFLP 분석(Vos et al., 1995)을 수행하고 그리고 AFLP 단편을 LI-COR 4200 DNA 시퀀서로 분해하고, 필수적으로 Myburg (Myburg et al. 2001)의 법을 따랐다. 선택적인 Pst 프라이머는 IRD 700로 또는 IRD 800 형광 라벨로 라벨화하였다. AFLP 겔 영상을 AFLP-Quantar Pro software package (Keygene BV, Wageningen, The Netherlands)로 기록하였다. Bai et al. (2003)에 기재된 바와 같이, 다음의 10개의 프라이머 조합물과 어뎁터 서열을 유전자형화에 사용하였다: P14M48, P14M49, P14M50, P14M60, P14M61, P15M48, P18M50, P18M51, P22M50 및 P22M51.
3.4. F 2 개체의 표현형 분석
다양한 보트리티스 분석간의 질병 발생의 변화를 관찰하였다(실시예 1 참조). 그러므로, 7개의 독립적이고 연속적인 줄기 질병 분석을 머니메이커와 LYC 4/78 사이의 교배로부터 유래된 F2 개체군의 174 개개 중 172개에서 수행하였다. 이것은 각각의 F2 유전자형 대부분에 대한 질병 생물학적 정량의 적어도 5개의 독립적인 평가를 가져왔다. 각각의 개별적인 질병 생물학적 정량에서, 6개의 줄기 세그먼트가 병변 성장의 산출에 기여하였다. F2 개체군에 대한 질병 발생과 병변 성장의 평균값은 정상 분포를 나타냈다(자료는 나타내지 않음). 머니메이커에 대한 평균 질병 발생은 59% 이고 병변성장은 9.2 mm/일이었다. F2 개체군에서 평균 질병 발생은 10%과 97%의 범위이고 개체 평균은 48%였다. 병변 성장은 3.3 mm 내지 11.5 mm/일 이고, 평균은 7.8 mm/일이었다.
각각의 개별적인 평균 질병 발생은 31% 내지 73%였고, 평균 병변 성장은 6.2 내지 7.9 mm/일이었다(자료는 나타내지 않음). 병변 성장은 6개의 줄기 조각 중 하나에서 적어도 감염이 되었을 때만 산출될 수 있었다. 결론적으로, 병변 성장에 대한 정보를 제공하는 유전자형의 수의 증가는 높아진 질병 발생으로 관찰될 수 있었다. 예를 들면, 낮은 평균 질병 발병(31%)를 갖는 유전자형의 오직 52% 만이 병변 성장에 대한 정보를 제공하였다.
3.5. 분자 마커와 유전 관련 지도
머니메이커와 LYC 4/78의 교배로부터 유래된 F2 개체군(n=174)에 대해 유전자 관련 지도를 산출하였다. 10개 프라이머 결합물을 사용하여 F2 개체군에서(n=174) 218개의 증폭된 단편 길이 다형성(AFLP) 마커를 얻었다. 총 69개의 마커(31.7%)를 쉽게 함께 우세하게 점수화할 수 있었고, 그러므로, 병합된 F2 유전자 관련 지도의 산출이 가능하였다. BC2, BC3 및 BC2S1 유전자형에서 수행된 마커 분석은 추가의 145 AFLP 마커의 첨가를 허용하였다. 이들 145 추가 AFLP 마커에서 총 102개는 F2 겔의 복잡성으로 인해 미리 점수화되지 않았다. 전체 유전 관련 지도는 14 연결기의 315 AFLP 마커로 구성되고 총 길이가 958 cM이다. 종 내의 공동-이동 AFLP 마커는 일반적으로 대립형질종이고, 다른 AFLP 관련 지도와의 공동-선형성은 관련 기를 염색체에 할당하는데 사용되었다. 몇몇 머니메이커 특이 AFLP 마커가 알려진 바와 같이(Haanstra et al. 1999; Bai et al. 2003)일반적으로 유전 관련 지도를 갖고 그러므로 동정된 QTL을 수확하는 연결기를 포함하여, 몇몇 연관기는 염색체에 할당될 수 있었다.
QTL 구간에서 연결 지도를 개선하기 위해, 진단 CAPS 마커를 공개된 S. lycopersicum x L. pennellii 지도 (Tanksley et al. 1992; Haanstra et al. 1999)을 참조로 하여 이들 영역에 첨가하였다.
3.6. 연관 분석 및 QTL 지도화
마커 자료를 분석하였고 유전자 연관 지도를 3.5에 기재된 방법과 같이 산출하였다.
F2 연관지도의 총 길이는 958 cM였고, 이것은, 유전자 길이 범위가 1200 ~ 1400 cM인 다른 공지의 종간 리코페르시쿰 지도보다 짧다(Foolad et al. 2002; Haanstra et al. 1999; Tanksley et al. 1992). 추가의 AFLP 마커들을 역교배와 BC2S1 개체군으로부터 얻어진 AFLP 마커 자료를 사용하여 점수화하였다. 비록 46% 이상의 마커들이 연결 지도에 놓이지만, 유전자 연관 지도의 길이는 증가하지 않았다. 이 이유는 사용된 자료가 여러 작은 서브-류로부터 얻어졌고 그러므로 유전적 거리의 산출에는 정보를 제공하지 않고, 위치의 평가는 그래프성 유전자형의 시각적 조사에 의해 가능하였다(Van Berloo, 1999).
3.7. F 2 개체군에서 QTL 지도화
표현형 및 마커 자료를 구간 지도화에 의해 QTL을 동정하기 위해 사용하였다(IM, 3.5 참조). IM은 개개의 복제로부터 얻어진 자료와 복제의 평균값에 모두 적용되었다.
질병 발병
F2 개체군에서 질병 발병에 대한 구간 지도화를, 평균 질병 발병이 50% 더 낮은 이들 개개의 질병 시험에 대해, 그리고 모든 질병 시험으로부터 얻은 평균 자료에 대해 수행하였다. 모든 시험의 평균 자료는 구간 지도화 과정에 제공되었고 질병 발병에 대한 단일 중요 QTL(likelihood of odds (LOD) 점수는 게놈-광범위 확인 수준에 대해 3.4보다 높아야 한다(P<0.05). 이 QTL은 LOD 점수가 4.5이고 전체 표현형 변화의 13%를 설명한다. 내성에 기여하는 대립형질은 내성 부모 LYC 4/78로부터 기원한다. 각각의 개별 실험에서 QTL 지도화는 모든 네 경우에 동일한 QTL 영역에 제공된다. 각각의 독립적인 실험에서 때때로 다른 "저급 QTL"이 관찰된다.
병변 길이
병변 길이는 높은 질병 발병을 갖는 질병 시험에서 측정되는 것이 가장 좋 다. QTL 지도화를 위해, 모두 7개의 질병 시험의 평균을 사용하였고 보트리티스 시네리아의 병변 성장에 대한 하나의 QTL을 역가 이상으로 동정하였다(P<0.05의 게놈-확장 확인 수준에 대해 LOD 3.4). 이 QTL은 LOD 점수가 4.2이고 총 표현형 변화의 12%를 설명한다. 긍정적 효과는 내성 부모 LYC 4/78로부터 기원한다. 다중 질병 시험을 수행할 필요는 오직 하나의 단일 반복에서 역가 이상의 LOD 프로파일이 발견되는 것으로 설명된다.
병변 성장에 대한 QTL을 염색체 1 (QTL-1h)에서 발견하였고, 질병 발병에 대한 QTL을 염색체 2 (QTL-2h)에서 발견하였다. 이들 QTL은 QTL4hA로 표시되는 QTL과 마찬가지로 공동-출원된 PCT/NL2005/000762의 주제이다.
3.8. 생물학적 정량에서 QTL의 확인
교배 머니메이커 x LYC 4/78의 F1 식물을 머니메이커와 두번 역교배시키고 59 자손을 APLP 마커를 사용하여 2개의 동정된 QTL-영역(QTL-1h 및 QTL-2h)의 존재에 대해 스크리닝하였다. 두개의 동정된 QTL 중 하나에 이형접합인 식물을 선택하고 자가교배하여 2개의 BC2S1 개체군을 얻었다. 총 4회 질병 생물학적 정량을 각각의 BC2S1 유전자형으로 수행하였다.
SPSS로 분석된 두 BC2S1 서브 개체군의 자료는 병변 길이의 정상적 분포를 나타내었니만, 몇몇 서브클라스에서 관찰된 바에 따르면 질병 발병에 대해서는 아니다.
모든 BC2S1 식물은 상기 3.3의 F2 개체군에 대해 기재된 바와 같은 동일한 10 프라이머 결합물을 갖는 유전형의 AFLP이었다. 병변 성장 부위에 대해 분리된 개체군에서 평균 병변 성장은 5.3 mm/일이었고 다른 개체군에서 평균 병변 성장은 6.3 mm/일이었다. 단일 식물은 내성 부모 LYC 4/78 만큼 낮은 병변 성장을 갖지 않았다. 그러나 질병 발생의 경우, 내성 부모 LYC 4/78 보다 낮은 질병 발생을 갖는 식물이 발견되었다. 두 BC2S1 개체군에 대한 평균 질병 발병은 동일하였다(57-59%).
각각의 QTL의 양성 효과는 BC2S1 개체군에서 확인되었다. 질병 발생에 대한 QTL은 감염 기회를 17% 감소시켰고(부모 변종의 46%), 병변 성장에 대한 QTL은 균류 성장을 1.3mm/일로 감소시켰다(부모 변종의 33%).
변이의 오직 일부는 두개 모두의 QTL의 효과로 설명될 수 있다. 몇몇 추가의 ("부") QTL 유전자자리를 동정하였다. F2와 BC2S1 유전자형으로부터 얻은 질병 실험의 자료를 분석하는 동안, 질병 발생에 대한 하나의 주 QTL을 동정하였다(QTL- 2h). 이 QTL 이외에, 질병 발생에 대한 다른 "추정" QTL 유전자 자리를 동정하였다, 이 정보를 사용하여, F2 자료세트상에서 제한된 '다중 QTL 지도화'(MQM) 과정을 수행하기 위한 공동인자를 선택하였다. 이 분석에서, 질병 발생에 대한 하나의 추가의 "부" QTL 유전자 자리를 동정하였다(QTL-4hA). QTL은 그것의 점수가 LQD 3.4의 유의 역가 이하일 때 "부"로 지정된다. 그러나 효과는 참된 QTL 효과가 된다고 믿어진다. QTL-4hA는 염색체 4에 위치하고 질병 발생을 감소시킨다.
3.9 질병 분석 및 QTL 지도화의 결론
보트리티스 시네리아에 대한 내성을 측정하는 생물학적 정량은 가치있는 도 구라는 것이 증명되었다. 그러나, 여전히 크고 알려지지 않은 변화가 감염 과정의 전개에 영향을 미치는 것으로 보인다. 이러한 큰 비-유전적 변이는 표준화된 공정의 사용과 많은 독립적 반복실험의 실행에 의해 최소화될 수 있다. 변이는 줄기의 생리적 조건의 변화를 야기하는, 주마다 변하는 온실 조건(낮의 길리, 주광시간 및 온도)에 의해 발생될 수 있다. 또한, 균류 접종원의 제조에서의 작은 변화는 감염 과정의 변이에 중요한 역할을 할 수 있다. 또 다른 관찰은 질병의 전개가 줄기 조각이 놓이는 트레이의 미기후(microclimate)에도 영향을 받을 수 있다는 것이다. BC2S1에 대해 10개의 다른 실험 트레이가 사용되었다. 통계적 분석을 실험간 그리고 실험 내에서의 변이를 상쇄하는데 사용하였다. 가장 높은 평균 질병 발병을 갖는 실험은 병변 성장의 측정에 가장 정보를 제공하였고, 반면 질병 발병이 온건할 수록 더 정보를 제공하였다. 질병 발병 및 병변 성장은, 두 형질간에 직접적인 상호관계는 관찰되지 않았으므로, 독립적 형질이다.
토마토에서 보트리티스 시네리아에 대한 내성에 관한 양적 형질 유전자자리는 F2에서 동정되었다. 이들 동정된 QTL을 BC2S1 개체군에서 확인하였고 질병 발생과 병변 성장에 대해 각각 부모 변종의 46% 과 33%로 설명되었다. 이러한 결과는 보트리티스 시네리아에 대한 내성을 제공하는 모든 QTL이 원래의 F2 지도화 개체군에서 검출되지 않는다는 것을 제안한다. BC2S1 개체군 둘 다에서 내성 부모 LYC 4/78보다 더 높은 내성 수준을 갖는다는 것을 발견하였다. 이것은 BC2S1 개체군에서 분리된 추가의 내성 유전자 자리의 존재를 나타낸다. 내성의 추가의 분리는 놀라운데, 왜냐하면, 두개의 BC2S1 개체군의 게놈의 이미 큰 부분이 이형접합 머니메이커라고 예상되었기 때문이다.
3.10 온실 조건에서 개개의 QTL 효과의 확인
상기 QTL 중 어느 것을 함유하는 식물들을 도 2에 기재된 방법을 사용하여 솔라늄. 리코페르시쿰 배경에 놓았다. BC2S2 계통을 네덜란드의 표준 실시 조건하의 토양의 온실에 놓고 성장시켰다. 3개월 후, 식물들을 주요 줄기의 상처에 보트리티스를 함유하는 아가 디스크에 놓아 접종시켰다. 상처를 Parafilm®를 사용하여 닫았다. 접종 3주 후, 줄기 병변 길이를 측정하였다(cm) (더욱 상세한 것은 아래를 참조하라). 결과를 표 7에 나타내었다. 분명하기는, 병변 성장에 대한 QTL을 함유하는 계통은 병변 크기의 상당한 감소를 나타내었다.
표 7: 솔라늄 해브로채티스 수집종 LYC 4/78 및 솔라늄 해브로채티스 LA 1777의 성인 식물에서, 접종 3주 후, 보트리티스 시네리아 병변의 줄기 병변 길이의 평균.
Figure 112008079805292-pct00007
***) a, b, c 및 d는 복제이고 그것에 의해 각각의 복제는 5 식물을 나타낸다; e와 f는 복제이고 그것에 의해 각각의 복제는 3 식물을 나타낸다; GT는 TMV 내성을 갖는 머니버그인다; Durintha는 식물에 따른 부분 내성을 갖는 혼성물이다; Tradiro는 혼성물이고, 식물에 따른 보트리티스에 대한 감염성을 갖는다; BChirs 는 솔라늄 해브로채티스 LYC 4/78 유전질 침투로부터의 역교배 계통을 나타낸다; LA 1777 는 야생 종 수집종 솔라늄 해브로채티스 LA 1777이다; BC chrs 10은 솔라늄 해브로채티스 LA 1777에서 유전질 침투를 갖는 역교배 계통을 나타낸다; parv는 솔라늄 네오리키 유전질침투로부터의 계통을 나타낸다.
3.11. 염색체 10에서, 솔라늄 해브로채티스 LYC 4/78 QTL에 의해 제공된 보트리티스에 대한 내성 수준은 솔라늄 해브로채티스 LA 1777 QTL에 의해 제공된 내성의 수준보다 높다.
본 명세서에 기재된 솔라늄 해브로채티스 LYC 4/78을 함유하는 식물에서 내성의 수준을 염색체 10에서 부분적 보트리티스 내성에 대한 QTL을 함유하는 WO02/085105 기원의 솔라늄 해브로채티스 LA1777의 것, 그리고 염색체 10에서 유전질 침투로부터 유도된 유전질침투 계통의 것과 비교하였다. 계통을 네덜란드의 표준 실행 조건하에서 토양의 온실에 놓고 성장시켰다. 3개월 후, 식물을 주요 줄기의 길이 2cm의 상처난 수직 줄기에 보트리티스를 함유하는 0.5 cm x 0.5 cm 아가 디스크에 놓아 접종시켰다. 상처를 Parafilm®를 사용하여 닫았다. 접종 3주 후, 줄기 병변 길이(균류 성장으로 얼룩된 탈색된 조직의 길이)를 병변의 상부에서 병변의 하부까지 측정하였다(cm). 결과를 표 7에 나타내었다. 솔라늄 해브로채티스 LYC 4/78로부터 QTL을 함유하는 계통은 LA 1777 기원과 IL-계통보다 보트리티스에 대한 높은 수준의 내성을 나타낸다는 것을 관찰하였다. 전자의 계통은 줄기에서의 병변성장이 줄었음을 나타내고 그러므로 LA 1777로부터 유래된 계통보다 보트리티스에 대한 높은 수준의 내성을 나타낸다(표 7 참조). 2.0cm의 병변길이가 기록된 경우, 오직 원래의 상처만이 측정될 수 있었고 균류 성장은 관찰되지 않았고, 이것은 높은 수준의 내성을 가리킨다. 그러므로, 2cm의 줄기 병변 길이는 순 성장이 없음을 가리킨다.
실시예 4. 종간 토마토 개체군(솔라늄 이브코페르시쿰 cv 머니메이커 x 솔라늄 해브로채티스 수집종 LYC 4/78)에서 보트리티스 시네리아 에 대한 부분 내성의 지도화
도입
적합한 유전자 구성물을 갖는 후보 부모 식물의 선택을 포함하는, 더욱 효과적인 육종과정을 제작하기 위해, 후보 부모 식물중 적어도 하나에서 유전적 구성물의 존재를 확인하는 하나 이상의 유전적 마커를 원하는대로 갖는 것이 필요하다. 이 과정은, 선택된 식물들의 교배를 포함하고 마커 도움 선택(MAS)으로 명명되고, 주게로부터 수용 개체군으로 바람직한 부모 대립형질을 효과적을 전달하고 육종이 더이상 우연에 의존하지 않으며 개발 비용의 면에서 훨씬 경제적임이 확실하다. 보트리티스 시네리아에 대한 내성을 야생 수집종 솔라늄 해브로채티스 LYC 4/78에서 확인되었다(Urbasch, 1986; 실시예 1). 이 내성 배후의 유전을 연구하기 위해, 솔라늄 리코페르시쿰 cv. 머니메이커와 솔라늄 해브로채티스 LYC 4/78 사이의 교배의 개체군의 F2 지도화(n=174)를 개발하였다(실시예 3 참조). 처음에, 보트리티스 시네리아에 대한 내성에 대한 2개의 QTL을 F2 지도화 연구에서 동정하였다(QTL-1h 및 QTL- 2h). 나중에 3번째 QTL (QTL-4hA)을 분리된 BC2S1 자손에서 검출하였고, QTL로 부터의 효과는 QTL-2h의 부재시에만 관찰할 수 있었다. 2-방향 ANOVA 분석을 이용하여, 둘 다의 QTLs 사이의 상당한 상위 유전자(epistatic)를 F2 자료세트에서 확인하였다. 몇몇 유전자형류는 낮은 빈도로 표시되고, 그러므로 많은 F2 개체군이 QTL 상호작용을 검출하는데 필요하다(Tanksley 1993). 본 발명자들의 F2 개체군에서, 3개의 식물은 QTL-1h과 QTL-2h에 대해 동형접합 솔라늄 리코페르시쿰이었고 반면 12개의 식물은 둘다에 대해 동형접합 솔라늄 해브로채티스였다. 2-방향 ANOVA를 이용하여, 상당한 상호작용을 둘 다의 유전자 자리 사이에서 검출하였다. 각각의 류의 평균 관찰의 분석은 QTL2가 동형접합의 솔라늄 해브로채티스일때 QTL-4hA의 추가의 효과는 없다.
종간 분리된 F2 개체군에서 QTK-지도화의 하나의 단점은, 부 효과와 쉽게 QTL을 흉내내는 표현형의 야생 변이이다. 또 다른 단점은 각각 F2 식물이 독특한 유전자형이므로 반복 시험을 실행할 수 없다는 것이다. 선택적으로, 유전질침투 계통(IL)의 세트로 구성된 유전 라이브러리는 지도화 목적에 사용될 수 있다. 각각의 IL은 이상적으로, 주게 종으로부터 기원하고 한편으로는 균일한 유전배경의, 단일의, 한정된 염색체 세그먼트를 수확한다(Zamir 2001). 이와 같은 계통은 다음과 같은 이유로 QTL을 동정하는 증가된 능력을 갖는다: I)계통과 대조 재배변종식물 사이의 표현형 변화는 유전질 침투된 세그먼트와 관련된다; II) 각 계통은 대부분 회기 배양된 부모 유전자의 95% 이상과 작은 정량적 효과는 회기 부모와 비교하여 쉽 게 확인될 수 있다; III) 야생 게놈의 다른 영역에 의해 야기되는 상위유전자 효과는 존재하지 않는다. 연결이 풀린 음성 상위유전자 상호작용은 그러므로, 신규한 QTL의 동정을 가져올 수 있다(Eshed et al.1995); IV) 각각의 계통은 동형접합이고 불멸이고 그러므로 다중 시험(다중 환경에서)을 허용한다; 그리고 V) 열매를 맺지 않는 문제는, 각각의 계통의 유전적 구성이 재배된 변종과 거의 동일하므로, 거의 없다.
첫번째 개발된 IL 개체군은 이미 1965년으로 거슬러 올라가고(Wehrhahn et al), IL 개체군의 대부분은 지난 10년간 개발되었다. 토마토 이외에, IL 개체군은 보리(von Korff et al. 2004), 캐비지(Ramsay et al. 1996), 상추(Jeuken et al. 2004), 멜론(Eduardo et al. 2005), 벼(Lin et al. 1998) 및 밀(Pestsova et al. 2001)에 대해 개발되었다. 이들 IL 개체군 모두는 마커 도움 선택(MAS)를 사용하여 개발되었지만, 다른 횟수의 역교배와 육종 세대로 나타나는 다양한 전략이 IL 개체군을 얻기위해 사용되었다. 전략의 두번째 차이는 IL 개체군을 개발하는데 사용된 마커 시스템(즉, 마커 타입)의 선택이다. 상기 4개의 개체군을 SSR 마커를 사용하여 개발하였다.
솔라늄 내에서, IL은 솔라늄 페넬리 LA716 (Eshed et al. 1994), 솔라늄 해브로채티스 LA1777 (Monforte et al. 2000a) 및 솔라늄 리코페르시쿰 LA2951 (Canady et al. 2005)에 대해 개발되었다. 이와 같은 개체군은 양적 형질의 동정(Eshed et al. 1995; Rousseaux et al. 2005), QTL의 미세 지도화(Fridman et al. 2004; Monforte et al. 2001; Monforte et al. 2000b) 및 QTL 클로닝(Frary et al. 2000; Fridman et al. 2000; Ku et al. 2001)에 극히 유용한 것으로 나타났다.
현재, 하나의 솔라늄 해브로채티스 LA1777 IL 개체군은 한정 성장 솔라늄 리코페르시쿰 E6203에 존재한다(Monforte et al. 2000a). 이 실험에서, 본 발명자들은 비한정 성장 배양된 토마토 솔라늄 리코페르시쿰 cv. 머니메이커의 배경에서 솔라늄 해브로채티스 LYC 4/78로부터 유전질침투를 기재로하는, 솔라늄 해브로채티스의 두번째 IL 개체군의 개발, 및 보트리티스 시네리아에 대한 내성에 관한 QTL을 동정하는데 있어서의 상기 계통의 사용을 기재한다.
재료 및 방법
식물 재료 및 IL의 개발
솔라늄 리코페르시쿰 cv. 머니메이커(이하 SL로 명명)과 솔라늄 해브로채티스LYC 4/78(이하 SH로 명명; 1978의 종자 배치) 사이의 종간 교배로 F1 종자를 생산하였다. SH의 종자를 Institute for Plant Genetics and Crop plant research, Gatersleben, Germany의 유전자 뱅크로부터 얻었다. 하나의 F1 식물을 자가 수분하여 F2 종자를 얻고 그리고 역교배하여 BC1 종자를 얻었다. F2 종자를 초기에 사용하여 유전 연관 지도를 구성하였다. BC1 종자를 사용하여 IL을 개발하였다(도 6).
마커 분석
게놈성 DNA를 2개의 젊은(말려진) 잎으로부터 Steward et al. (1993)에 따른 CTAB 기재 프로토콜을 사용하여 단리하고, 1㎖ 미크론성 튜브를 사용하여 고산출 DNA 단리를 위해 조절하고(Micronic BV, Lelystad, The Netherlands) 그리고 Retsch 300mm 혼합기를 사용하여 고속으로 연마하였다(Retsch BV, Ochten, The Netherlands).
각각의 역교배 및 IL의 AFLP™ 분석(Vos et al. 1995)을 수행하고 AFLP 단편을 LI-COR 4200 DNA 시퀀서에서 해상하고, 필수적으로 Myburg의 방법을 따랐다(2001). 선택적인 Pst 프라이머를 IRD700 또는 IRD 800 형광 라벨로 라벨화하였다. AFLP 겔상을 AFLP-Quantar™ 프로 소프트웨어 패키지를 사용하여 점수화하였다(http://www.keygene-products.com). 프라이머 및 어댑터 서열이 Bai et al (2003)에 의해 기재되었다.
CAPS 프라이머의 세트를 "Solanaceae Genomics Website"(http:// sgn.cornell.edu)로 부터 얻었고 또는 동일한 기원으로부터 얻을 수 있는 게놈성 또는 cDNA 클론의 서열 상에 고안하였다. 솔라늄 해브로채티스와 솔라늄 리코페르시쿰 사이의 다형성을 Brugmans et al (2003)에 의해 기재된 CAP 소화법을 이용하여 결정하였다. 마커 서열, PCR 조건, 및 유전형에 사용된 특정 제한 엔도뉴클레아제를 표 30에 나타내었다. PCR 산물을 2.5% 아가로스 겔을 사용하여 일반적으로 분리하였다. 표 31에, 솔라늄 리코페르시쿰과 솔라늄 해브로채티스 사이를 구별하는 다양한 소화 생성물은 관심의 QTL에서 발견된 표 30의 마커의 각각을 나타낸다.
그래프 유전자형
각각의 역교배와 IL에 대한 그래프 유전자형을 소프트 프로그램 GGT (van Berloo, 1999)을 사용하여 얻었다. 유전질 침투 크기와 게놈 백분률을 계산하기 위해, 반-간격 플랭크된 마커 유전자자리를 GGT 소프트웨어에 의해 도움이 되는 바와 같이 동일한 유전질 침투로 간주하였다. 사라진 마커 자료를 플랭크된 마커로부터 평가하였고; 이들이 동일한 유전자형을 갖는다면, 그들을 2개의 플랭크된 마커의 동일한 유전자형을 갖는다고 가정하여다. 2개의 플랭크된 마커가 반대의 유전자형을 갖는다면, 자료를 사라진 것으로 기록하였다.
질병 평가
내성을 평가하기 위해, 16개의 불완전 임의의 블록을 각각의 IL에 대한 총 11번의 복제에서 사용하였다. 각각의 블록은 최소한 2개의 SE 식물과 하나의 솔라윰 리코페르시쿰 cv. 두린타를 함유하였다. 두린타는 저장기간이 길고 상당한(그러나 높지는 않은) 내성 수준을 나타내는 송이 토마코를 생산하는 상업적 재배변종식물이다. 파종 6주 후, 식물을 완전 토양 구획으로 옮기고 밤에 15℃/ 낮에 19℃의 영역에서 주광시간 16 시간의 영역에서 성장시켰다. 11주 후, 약 15mm의 두개의 병변 부엌칼을 사용하여 각각의 식물의 줄기로 자랐다. 각각의 상처를 보트리티스 시네리아 B05.10 함유 아가의 1cm2 플러스로 접종하였고(Benito et al (1998)), 그리고 테이프로 밀봉하였다. 두번째 접종은 2주일 후 수행되었다. 시험 중, 식물은 밤새 습도를 유지하기 위해 초저녁에 물을 주었다. 질병 진행을 칼리퍼를 사용하여 접종 후 9, 12 및 22일에 측정하였다. 질병 진행은 다음 계수에 따라 기재하였다: 12일 후 수집된 병변 크기(LS)(즉, 상처의 병변의 총 길이 빼기 15mm), 과성장 병변의 백분률(DI), 및 제 9일과 12일에 측정되고 mm/일로 표시된 보정된 병변 크기의 차로 ㅍ표시된 병변 성장(LG).
통계적 분석
통계적 분석을 SPSS 12.0 소프트웨어 패키지(SPSS Inc, Chicago, U.S.A.)를 사용하여 수행하였다. 일반 선형 모델(GLM)과정을 이용하여, 각각의 IL/형질에 대한 평균을 평가하였다. 측정된 형질의 평균값을 Dunnett 시험(Dunnett, 1955)을 사용하여 대조 유전형 SL과 비교하였고 0.05 보다 작은 확률을 중요하다고 고려하였다. LG와 LS를 분석하기 위해, 제곱근 변형을 두 형질의 자료를 정상화하는데 적용하였다. 형질간의 상관관계를 피어슨-보정 계수를 사용하여 산출하였다.
결과
IL 개체군
솔라늄 리코페르시쿰 cv 머니메이커(SL)의 유전 배경에서 솔라늄 해브로채티스 LYC 4/78(SH)의 유전질침투 계통(IL) 개체군을 전개하였다. SL과 SH 사이의 교배로부터 유래된 하나의 F1 식물을 SL로 역교배하였다(도 6). 이어서, 14 BC1 식물의 임의의 세트를 SL로 역교배하여 BC2 자손을 얻었다(n=59). 모든 BC2 식물은 유전자형이고 선택된 세트는 SL로 역교배하였다. 이 세트를, 결합된 유전질침투가 가능한 한 SH 게놈을 포함하는 방법으로 선택하고 반면 선택된 재조합은 각각의 이질적인 염색체가 3개의 IL로 표현되는 방법으로 선택하였다. 이 선택 및 역교배 과정을 BC5까지 반복하였다. 주로 하나 또는 두개의 유전질침투를 함유하는 31개의 선택된 BC5 식물을 자가수분하였다. 13 BC5S1 류의 각각의 최대 12개 식물을 자가수분하고 AFLP 마커로 스크리닝하여 유전질침투를 위해 동형접합 BC5S2 자손 (n=44)을 얻었다. 44 IL 마커를 한번 더 스크리닝하고 30 IL의 코어 세트를 선택하였다. 이 코어 세트는 가능한 한 적은 IL에서 SH 게놈의 최대 범위를 나타낸다(도 7). 코어 세트는 단일 유전질침투를 수확하는 15개의 IL, 2개의 유전질 침투를 함유하는 10 IL, 3개의 유전질침투를 함유하는 4 IL로 이루어지며, 반면 하나의 IL은 여전히 4개의 동형접합 유전질침투를 함유한다. 평균 각각이 IL은 SH 게놈의 60 cM (= 5.2 %)을 함유하고 유전질침투의 길이는 20 (1.7%) 내지 122 cM (10.6%)에서 변한다. 본 발명자들의 IL 개체군은 원 F2 연관 지도의 길이의 95%를 커버한다. 그러나, 본 발명자들은 이 F2 연관 지도가 게놈을 완전히 커버하지 않는다는 것을 인식하였다. 이것은 염색체 3(짧은 암의 상부), 4 (짧은 암의 상부), 5 (긴 암) 그리고 9 (짧은 암의 상부) 상의 추가의 CAPS 분석에 의해 설명되고, 여기서 CAPS 마커는 AFLP 기재 F2 연관 지도에서 마커를 갖지 않는 유전질침투를 드러낸다. 이들 유전질침투의 크기는 고밀도 RFLP 지도(Tanksley et al. 1992; http://www.sgn.cornell.edu)를 기준으로 평가하였다. 염색체 3에 적용된 선행 스크리닝이 없었기 때문에, 이 영역에 대한 IL은 이형접합이다. IL5-1과 5-2에 동형 접합 SH가 되도록 선택된 식물은 종자를 맺는 것에 실패하였고, 그러므로 이들 계통은 이형접합 상태로 유지되었다.
염색체 8의 짧은 암의 상부와 염색체 2의 긴 암(arm) 하부를 함유하는 IL은 존재하지 않았다. 염색체 7과 9의 짧은 암의 상부에 유전질침투는 다중 IL에 존재하였다. 염색체 9의 상부에 대한 선택은 이 영역에 특이적인 CAPS 마커의 개발 후 에만 가능하였다.
질병 평가
30 IL의 개체군을 불완전한 임의의 블록 디자인에서 11회 반복하여 성장시키고, 접종하고 그리고 질병 증상에 대해 평가하였다. 상당히 내성이고 감염성인 대조 세트를 시험에 포함시켰다. 접종 후 9, 12 및 22일에 질병 진행을 측정하고 다음의 계수에 따라 점수로 평가하였다: 과성장 감염의 변화 또는 질병 성장(DI), 과성장 병변의 보정된 크기(LS) 및 병변 성장 속도(LG). 내성 부모 SH는 어느 증상도 나타나지 않은 반면(표 8, 표 9) SL 병변의 73%는 과성장하였다.
표 8: 가장 내성인 IL의 LS, LG 및 DI와 대조 계통에 대한 평균 표현형 관찰형질 당 각각의 IL의 평균을 솔라늄 리코페르시쿰 cv 머니메이커(SL)의 평균과 Dunnett 시험을 이용하여 비교하였고 중요한 차이는 * 또는 **로 표시하였다(각각 p<0.05, p<0.01).
Figure 112008079805292-pct00008
a측정 가능한 병변의 첫 관찰은 12시간후 였다. b측정되지 않음.
표 9: LS, LG 및 DI에 대한 평가된 평균 표현형 관찰. 표는 DI로 정렬하였다. 형질 당 각각의 IL의 평균을 솔라늄 리코페르시쿰 cv 머니메이커(SL)의 평균과 Dunnett 시험을 이용하여 비교하였고 중요한 차이는 * 또는 **로 표시하였다(각각 p<0.05, p<0.01).
Figure 112008079805292-pct00009
IL 개체군 내에서, 14 ILs은 감소된 질병 증상을 갖는 것으로 확인되었다 (표 9). 총 12개의 IL은 상당히 감소된 DI를 나타내었다. 7개는 상당히 감소된 LS를 5개는 상당히 감소된 LG을 나타내었다. IL4-1과 IL 1-3/3-3은 모든 3개의 계수에 대해 상당한 감소를 나타내었다(DI, LG 및 LS). IL의 DI에 대한 상당한 감소에 서, 과성장 병변의 백분률 범위는 24~49%였다. LS와 LG는 IL로부터 상당히 벗어나 변하였고 각각 21~34 mm 및 1.7~3.0mm/일 이었다. 일정 수준의 내성을 갖는, 대조 솔라늄 리코페르시쿰 cv 두린타는 또한 모든 3개의 계수에 대해 상당히 낮았고 7개의 동정된 IL의 각각에서의 내성은 이 수준과 다소 비교할 수 있다. 선행 실험에서 매우 내성인 BC2S2 유전자형을 선택하였다 (DRS 5, 표 8 및 9 참조). 이 계통은 SH 게놈의 총 18%를 나타내는 3개의 동형접합 유전질침투를 함유한다(도 7). 이 계통은 상기 시험에서 가장 중요한 내성 계통이었다. 이것은 상당히 낮은 DI (15 %)를 가졌고 LS 또한 상당히 감소하였다. 솔라늄 cv.Durinta와 비교하여, 이 계통의 2.8배 감소된 DI는 상당히 낮고 이것은 보트리티스 시네리아에 대한 내성을 제공하는 피라미드 다중 대립형질의 가능성을 나타낸다.
유전질침투 스태킹 효과
개개의 IL 계통에 존재하는 여러 유전질침투를 분석하고(표 7) 그들을 표 9에 나타낸 바와 같이 내성에 대한 그들의 개별적인 효과와 분석할 때, 스태킹 효과를 추론할 수 있다. 계통 9-1, 9-2, 11-2 및 12-3에서 볼 수 있는 바와 같이, 유전질침투의 스태킹은 효과적이다.
예를 들면, 계통 IL6-3의 동일한 유전질침투는 내성을 제공하지 못하므로, 계통 9-2의 염색체 6에서 유전질침투는 효과가 없다고 결론낼 수 있다.
한편, 계통 11-2의 염색체 7에서의 유전질침투는 효과가 없다 (계통 7-1 및d 8-2과 비교).
11-2에 존재하는 바와 같은 2가지 내성 패턴(DI 및 LS)은 염색체 11 만에서 의 유전질침투의 결과가 아니다. 이 계통에서 병변 크기(LS)의 감소는 염색체 9로부터의 유전질침투 때문일 수 있다(9-1에서의 유사한 유전질침투와 비교, 반면 질병 발생의 감소는 9-1 단독의 유전질침투와 관련하여 발견되지 않았다). 그러므로, 질병 발생의 감소는 염색체 1로부터의 유전질침투로 기인해야만 한다. 그러므로, 계통 11-2에서 총 내성은 여러 유전질침투의 결과이다.
유사하기는, 계통 9-1과 비교하여 계통 12-3에서 감소된 % 과성장 병변은 염색체 12에서의 유전질침투 때문이고, 반면 감소된 정확한 병변 크기는 염색체 9로부터의 유전질침투 때문일 것이다. 따라서, 다중 유전질침투의 결합된 존재는 개선된 내성을 가져온다.
IL과 질병 자료와의 연관
온실 생물학적 정량을 사용하여, 본 발명자들은 보트리티스 시네리아에 대한 증가된 내성에 대해 책임이 있는 유전질침투를 함유하는 IL의 세트를 확인하였다. 염색체 2, 4 및 6에 위치한, 3개의 영역은 분명히 증가된 내성에 관한 유전자를 함유한다. 다른 IL들은 내성 유전자를 정확히 지적하는 것을 더 어렵게하는 다중 유전질침투를 함유한다. IL9-2는 염색체 6과 9에 유전질침투를 함유한다. IL9-2에서 염색체 6의 유전질침투는 SL 만큼 감염성이 있는 IL인, IL6-2에서 염색체 6 유전질침투와 유사하다. 그러므로, 본 발명자들은 IL9-2의 효과는 염색체 6이 아니라 염색체 9에서의 유전질침투 때문이라고 예상한다. IL11-2는 IL9-1에 존재하는 것보다 작은 염색체 9 유전질침투를 함유한다. 그러므로, 감소된 ID는 염색체 11 상의 유전자자리에 의해 야기되는 것으로 예상된다. 두개의 IL1-4와 12-3은 IL9-2의 염색 체 9 유전질침투와 겹치는 유전질침투를 함유한다. 오직 IL12-3만이 염색체 9와 12의 유전질침투의 결합효과를 제안하는 IL9-2보다 상당히 더 내성이다. IL1-4와 11-2는 IL9-2보다 상당히 더 내성이 아니므로, 본 발명자들은 이들 두 계통내의 내성이 염색체 9의 유전질침투의 결과라고 제외할 수 없다.
요약: 본 발명자들은 염색체 1, 2, 4 (2x), 6, 9, 11 및 12에 위치하는 유전질침투가 보트리티스 시네리아에 대한 증가된 내성에 책임이 있다고 확인하였다. 염색체 2에서 효과와 염색체 4에서의 효과는 이미 이 교배의 F2 및 BC2S1의 분리 개체군의 분석 중 이미 검출하였다(실시예 1- 3을 참조).
확인된 유전자자리의 F2에서의 분리
유전질 침투와 보트리티스 시네리아에 대한 증가된 내성 사이에 연관이 발견된 모든 영역에 대해, QTL이 처음에 놓쳐진 이유의 가능한 설명을 찾기 위해, 원래 F2 자료 세트를 확인하였다. 마커 자료의 왜곡과 QTL 분석의 결과 모두를 확인하였다. 염색체 1 (1:6:6), 염색체 2 (1:3:2) 및 염색체 9 (1:6)에서의 유전질침투는 예상된 1:2:1 또는 1:3 비율로부터 상당히 벗어났다. 3개의 영역 모두에서, 동형접합 솔라늄 리코페르시쿰 대립형질의 부족이 관찰되었다. 간격 지도화와 Kruskal-Wallis 공정을 이용한 단일 마커 분석 모두에 대한 QTL 분석 자료를 확인하였지만 염색체 6, 9, 11 및 12에서의 F2 개체군의 자료세트에서 중요한 QTL의 존재에 관한 증거는 발견되지 않았다.
본 명세서에서 사용된 마커 서열
이어진 표들은 다양한 연관 지도에서 표시되고 본 발명의 QTL과 관련된다고 표시된 바와 같은 여러 RFLP와 COS-II 마커에 대한 상세한 정보를 제공한다. 이 정보는 코넬 대학의 SOL Genomic Network (SGN) 데이타 베이스, 2005년 10월 7일자 판을 직접 복사하였다.
표 10
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표 31
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Claims (38)

  1. 보트리티스-내성 토마토 식물의 생산방법으로, 상기 방법은:
    a) 보트리티스-내성 주게 토마토 식물을 제공하는 단계;
    b) 상기 주게 식물로부터 하나 이상의 보트리티스-감염 수용 토마토 식물로 핵산을 전달하는 단계 (여기서 상기 전달은 주게 식물로부터 상기 하나 이상의 수용 식물의 게놈의 상응하는 영역으로 게놈성 물질의 도입을 가져온다);
    c) 상기 수용 토마토 식물 중에서, 그것의 게놈 내에 상기 보트리티스-내성 주게 토마토 식물로부터 유래된 보트리티스-내성에 대한 하나 이상의 QTL을 포함하는 식물을 선택하는 단계 (여기서, 상기 선택은 상기 수용 토마토 식물의 염색체 4, 6, 9, 11 및 12로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 염색체에서 보트리티스-내성에 대한 상기 하나 이상의 QTL에 연결된 하나 이상의 유전 마커를 검출하는 것을 포함한다)를 포함하고,
    - 여기서 상기 식물의 염색체 4에서 상기 QTL의 위치는 솔라늄 해브로채티스의 염색체 4에서 또는 솔라늄 리코페르시쿰의 염색체 4에서 유전자 마커 CT50, C2At1g74970, P14M49-283e, P14M48-74e, P14M50-67e, CT173 및 P14M50-85h를 포함하는 게놈성 영역에 의해 표시되고,
    - 여기서 상기 식물의 염색체 6 상의 상기 QTL의 위치는 솔라늄 해브로채티스의 염색체 6에서 또는 솔라늄 리코페르시쿰의 염색체 6에서 유전자 마커 P22M50-188h, P14M48-521e, P15M48-386h, P18M51-199h, P18M51-103h, P22M50-103e, P18M51-388e, P15M48-395e, P22M50-124e, P14M48-160e 및 P22M50-513h을 포함하는 게놈성 영역에 의해 표시되고,
    - 여기서 상기 식물의 염색체 9 상의 상기 QTL의 위치는 솔라늄 해브로채티스의 염색체 9에서 또는 솔라늄 리코페르시쿰의 염색체 9에서 유전자 마커 P18M50-141, P14M49-240, TG254, TG223, TG1O, P18M50-134h, P14M49-243h, P18M50-599, P14M60-222h, P22M51-417h, P14M50-174h, P14M60-157h, P14M60-107h, P15M48-138h, P14M48-113h, Tm2a, P18M51-146h, P14M48-282h 및 P14M50-276h을 포함하는 게놈성 영역에 의해 표시되고,
    - 여기서 상기 식물의 염색체 11 상의 상기 QTL의 위치는 솔라늄 해브로채티스의 염색체 11에서 또는 솔라늄 리코페르시쿰의 염색체 11에서 유전자 마커 P14M60-215e, P14M61-173h, P14M50-307h, TG47, P14M50-29xCD, P18M51-358h, P18M50-27xCD, P18M51-136h, P22M50-488h, TG393, P14M61-396h, P22M51-235h 및 P22M51-174e를 포함하는 게놈성 영역에 의해 표시되고, 그리고
    - 여기서 상기 식물의 염색체 12 상의 상기 QTL의 위치는 솔라늄 해브로채티스의 염색체 12에서 또는 솔라늄 리코페르시쿰의 염색체 12에서 유전자 마커 CT 19, TG68, P14M48-411e, P18M50-244h, P18M50-273h, P14M61-420h, P14M61-406h, P14M61-223h, P14M60-193h, P22M51-314h, TG565, P14M48-172h, P22M50-321e, P14M60-219e, P14M48-153h, P22M50-97h, TG296, P22M50-131h 및 P22M51-135h를 포함하는 게놈성 영역에 의해 표시되는 방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 보트리티스-내성에 대한 하나 이상의 QTL, 또는 그것의 보트리티스-내성-제공부를 포함하는 핵산의 전달은 유전질 침투로서 상기 QTL을 포함하는 자손 식물을 생산하기 위해 상기 보트리티스-내성 주게 토마토 식물을 보트리티스-감염 수용 토마토 식물과 교배함으로써 수행되고, 여기서 상기 단계 c)는 하나 이상의 자손 식물에서 수행되는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 보트리티스-내성에 대한 하나 이상의 QTL, 또는 그것의 보트리티스-내성-제공부를 포함하는 상기 핵산의 전달은 유전자 도입법에 의해, 원형질체 융합에 의해, 이중 단배체(doubled haploid) 기술에 의해 또는 배아 구조에 의해 수행되는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 단계 c)는 상기 수용 토마토 식물로부터 단리된 DNA에서 상기 유전자 마커를 검출함에 의해 수행되는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 단계 c)는 추가로 상기 식물에서 보트리티스-내성을 측정하기 위한 생물학적 정량을 상기 식물에서 행하는 것을 포함하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 단계 c)는 추가로 식물의 게놈에 솔라늄 해브로채티스 LYC 4/78의 염색체 1, 2 및 4에 위치한 QTL로부터 선택된 보트리티스-내성에 대한 하나 이상의 QTL을 포함하는 식물을 선택하는 것을 포함하고,
    - 여기서, 상기 식물의 염색체 1 상의 상기 QTL의 위치는 솔라늄 해브로채티스의 염색체 1에서 또는 솔라늄 리코페르시쿰의 염색체 1에서 유전자 마커 P22M50-412h, P14M50-349h, P14M60-69h, P14M49-192h, P14M49-232h, P14M49-260e, P14M50-503h, P18M50-124h 및 P14M49-114h를 포함하는 게놈성 영역에 의해 표시되고,
    - 여기서, 상기 식물의 염색체 2 상의 상기 QTL의 위치는 솔라늄 해브로채티스의 염색체 2에서 또는 솔라늄 리코페르시쿰의 염색체 2에서 유전자 마커 P14M60-537h, P15M48-257e, P14M49-327h, P14M49-325h, P14M61-286e, P14M61-125h, P18M51-134h 및 CT128를 포함하는 게놈성 영역에 의해 표시되고, 그리고
    - 여기서, 상기 식물의 염색체 4 상의 상기 QTL의 위치는 솔라늄 해브로채티스의 염색체 4에서 또는 솔라늄 리코페르시쿰의 염색체 4에서 유전자 마커 P18M51-169.5e, P18M51-305.4h, P14M60-262.9e, 및 P14M61-292.7h를 포함하는 게놈성 영역에 의해 표시되는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 단계 c)는
    - 제1항에 정의된 QTL로 이루어진 군으로부터 선택되는, 보트리티스-내성에 대한 최소한 4개의 QTL을 게놈 내에 포함하는 식물, 또는
    - 제1항에 정의된 QTL로 이루어진 군으로부터 선택되는 보트리티스-내성에 대한 최소한 2개의 QTL을 게놈 내에 포함하는 식물을 선택하는 것을 포함하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 방법은 자손 식물을 생산하기 위해, 단계 c)에서 선택된 상기 식물을 배양된 토마토 계통의 식물과 교배하는 단계 d)를 추가로 포함하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 보트리티스-내성 토마토 식물이 솔라늄 해브로채티스(S. habrochaites) 종 또는 솔라늄 해브로채티스(S. habrochaites) LYC 4/78 계통인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 보트리티스-감염 수용 토마토 식물이 솔라늄 리코페르시쿰(S. lycopersicum) 종의 식물인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 식물의 염색체 12 상의 상기 QTL의 위치는 솔라늄 해브로채티스의 염색체 12에서 또는 솔라늄 리코페르시쿰의 염색체 12에서 유전자 마커 P14M61-420h, P14M61-406h, P14M61-223h, P14M60-193h, P22M51-314h, TG565, P14M48-172h, P22M50-321e, P14M60-219e, P14M48-153h, P22M50-97h, TG296, 및 P22M50-131h를 포함하는 게놈성 영역에 의해 표시되는 방법.
  13. 제1항 및 제3항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 얻을 수 있는 보트리티스-내성 토마토 식물.
  14. 제13항에 따른 보트리티스-내성 토마토 식물의 일부로서,
    상기 식물의 일부는 꽃가루, 배주, 잎, 배아, 뿌리, 근단, 꽃밥, 꽃, 열매, 줄기 발아 및 종자의 세포 또는 조직; 및 꽃가루, 배주, 잎, 배아, 뿌리, 근단, 꽃밥, 꽃, 열매, 줄기, 발아, 접순, 근경, 종자, 원형질체, 및 캘리로부터 선택되는 것인, 보트리티스-내성 토마토 식물의 일부.
  15. 솔라늄 리코페르시쿰에서 보트리티스-내성에 대한 QTL로, 여기서 상기 QTL은 제1항에 정의된 보트리티스-내성과 관련된 솔라늄 해브로채티스 LYC 4/78의 염색체 4, 6, 9, 11 및 12에서의 QTL로 이루어진 군으로부터 선택되는 QTL.
  16. 삭제
  17. 보트리티스-내성을 위해 시험되는 토마토 식물의 염색체 4, 6, 9, 11 및 12로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 염색체 상의 솔라늄 해브로채티스 LYC 4/78로부터 유래된 보트리티스-내성에 대한 QTL에 연결된 최소한 하나의 유전자 마커를 검출하는 것을 포함하는, 보트리티스-내성에 대한 QTL을 검출하는 방법으로,
    - 여기서 상기 식물의 염색체 4에서 상기 QTL의 위치는 솔라늄 해브로채티스의 염색체 4에서 또는 솔라늄 리코페르시쿰의 염색체 4에서 유전자 마커 CT50, C2At1g74970, P14M49-283e, P14M48-74e, P14M50-67e, CT173 및 P14M50-85h를 포함하는 게놈성 영역에 의해 표시되고,
    - 여기서 상기 식물의 염색체 6에서 상기 QTL의 위치는 솔라늄 해브로채티스의 염색체 6에서 또는 솔라늄 리코페르시쿰의 염색체 6에서 유전자 마커 P22M50-188h, P14M48-521e, P15M48-386h, P18M51-199h, P18M51-103h, P22M50-103e, P18M51-388e, P15M48-395e, P22M50-124e, P14M48-160e 및 P22M50-513h를 포함하는 게놈성 영역에 의해 표시되고,
    -여기서 상기 식물의 염색체 9에서 상기 QTL의 위치는 솔라늄 해브로채티스의 염색체 9에서 또는 솔라늄 리코페르시쿰의 염색체 9에서 유전자 마커 P18M50-141, P14M49-240, TG254, TG223, TG1O, P18M50-134h, P14M49-243h, P18M50-599, P14M60-222h, P22M51-417h, P14M50-174h, P14M60-157h, P14M60-107h, P15M48-138h, P14M48-113h, Tm2a, P18M51-146h, P14M48-282h 및 P14M50-276h를 포함하는 게놈성 영역에 의해 표시되고,
    -여기서 상기 식물의 염색체 11에서 상기 QTL의 위치는 솔라늄 해브로채티스의 염색체 11에서 또는 솔라늄 리코페르시쿰의 염색체 11에서 유전자 마커 P14M60-215e, P14M61-173h, P14M50-307h, TG47, P14M50-29xCD, P18M51-358h, P18M50-27xCD, P18M51-136h, P22M50-488h, TG393, P14M61-396h, P22M51-235h 및 P22M51-174e를 포함하는 게놈성 영역에 의해 표시되고,
    -여기서 상기 식물의 염색체 12에서 상기 QTL의 위치는 솔라늄 해브로채티스의 염색체 12에서 또는 솔라늄 리코페르시쿰의 염색체 12에서 유전자 마커 CT19, TG68, P14M48-411e, P18M50-244h, P18M50-273h, P14M61-420h, P14M61-406h, P14M61-223h, P14M60-193h, P22M51-314h, TG565, P14M48-172h, P22M50-321e, P14M60-219e, P14M48-153h, P22M50-97h, TG296, P22M50-131h 및 P22M51-135h를 포함하는 게놈성 영역에 의해 표시되는 검출방법.
  18. 제17항에 있어서 상기 식물의 염색체 12에서 상기 QTL의 위치는 솔라늄 해브로채티스의 염색체 12에서 또는 솔라늄 리코페르시쿰의 염색체 12에서 유전 마커 P14M61-420h, P14M61-406h, P14M61-223h, P14M60-193h, P22M51-314h, TG565, P14M48-172h, P22M50-321e, P14M60-219e, P14M48-153h, P22M50-97h, TG296, 및 P22M50-131h를 포함하는 게놈성 영역에 의해 표시되는 검출방법.
  19. 게놈 내에 하나 이상의 QTL 또는 그것의 보트리티스-내성-제공부를 포함하는, 솔라늄 리코페르시쿰의 종의 보트리티스-내성 식물로, 여기서 상기 QTL은 보트리티스-내성과 연관된, 솔라늄 해브로채티스의 염색체 4, 6, 9, 11 및 12에서의 QTL들로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    - 여기서, 상기 식물의 염색체 4에서 상기 QTL의 위치는 솔라늄 해브로채티스의 염색체 4에서 또는 솔라늄 리코페르시쿰의 염색체 4에서 유전자 마커 CT50, C2At1g74970, P14M49-283e, P14M48-74e, P14M50-67e, CT173 및 P14M50-85h를 포함하는 게놈성 영역에 의해 표시되고, 여기서 상기 QTL 또는 상기 그것의 보트리티스-내성-제공부는 그것의 천연 유전 배경에는 존재하지 않고, 그리고
    - 여기서 상기 식물의 염색체 6 상의 상기 QTL의 위치는 솔라늄 해브로채티스의 염색체 6에서 또는 솔라늄 리코페르시쿰의 염색체 6에서 유전자 마커 P22M50-188h, P14M48-521e, P15M48-386h, P18M51-199h, P18M51-103h, P22M50-103e, P18M51-388e, P15M48-395e, P22M50-124e, P14M48-160e 및 P22M50-513h을 포함하는 게놈성 영역에 의해 표시되고,
    - 여기서 상기 식물의 염색체 9 상의 상기 QTL의 위치는 솔라늄 해브로채티스의 염색체 9에서 또는 솔라늄 리코페르시쿰의 염색체 9에서 유전자 마커 P18M50-141, P14M49-240, TG254, TG223, TG1O, P18M50-134h, P14M49-243h, P18M50-599, P14M60-222h, P22M51-417h, P14M50-174h, P14M60-157h, P14M60-107h, P15M48-138h, P14M48-113h, Tm2a, P18M51-146h, P14M48-282h 및 P14M50-276h을 포함하는 게놈성 영역에 의해 표시되고,
    - 여기서 상기 식물의 염색체 11 상의 상기 QTL의 위치는 솔라늄 해브로채티스의 염색체 11에서 또는 솔라늄 리코페르시쿰의 염색체 11에서 유전자 마커 P14M60-215e, P14M61-173h, P14M50-307h, TG47, P14M50-29xCD, P18M51-358h, P18M50-27xCD, P18M51-136h, P22M50-488h, TG393, P14M61-396h, P22M51-235h 및 P22M51-174e를 포함하는 게놈성 영역에 의해 표시되고, 그리고
    - 여기서 상기 식물의 염색체 12 상의 상기 QTL의 위치는 솔라늄 해브로채티스의 염색체 12에서 또는 솔라늄 리코페르시쿰의 염색체 12에서 유전자 마커 CT 19, TG68, P14M48-411e, P18M50-244h, P18M50-273h, P14M61-420h, P14M61-406h, P14M61-223h, P14M60-193h, P22M51-314h, TG565, P14M48-172h, P22M50-321e, P14M60-219e, P14M48-153h, P22M50-97h, TG296, P22M50-131h 및 P22M51-135h를 포함하는 게놈성 영역에 의해 표시되고, 그리고
    - 여기서 상기 식물은 선택적으로 솔라늄 해브로채티스의 염색체 1, 2, 및 4로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 염색체 상의 QTL들로부터 선택된 보트리티스-내성과 연관된, 하나 이상의 추가의 QTL 또는 그것의 보트리티스-내성-제공부를 추가로 포함하고, 여기서 상기 식물의 염색체 4에서의 상기 추가의 QTL의 위치는 솔라늄 해브로채티스의 염색체 4에서 또는 솔라늄 리코페르시쿰의 염색체 4에서 유전자 마커 P18M51-169.5e, P18M51-305.4h, P14M60-262.9e, P14M61-292.7h, TG609, P14M48-345e, P14M48-177e 및 P18M50-147e를 포함하는 게놈성 영역에 의해 표시되는 식물.
  20. 제19항에 따른 보트리티스-내성 식물의 일부로서,
    상기 식물의 일부는 꽃가루, 배주, 잎, 배아, 뿌리, 근단, 꽃밥, 꽃, 열매, 줄기 발아 및 종자의 세포 또는 조직; 및 꽃가루, 배주, 잎, 배아, 뿌리, 근단, 꽃밥, 꽃, 열매, 줄기, 발아, 접순, 근경, 종자, 원형질체, 및 캘리로부터 선택되는 것인, 보트리티스-내성 식물의 일부.
  21. 제19항에 있어서, 염색체 1 및 2 에서 상기 QTL들의 위치는 제7항에 정의된 바와 같은 것인 식물.
  22. 제19항에 있어서, 상기 식물은 솔라늄 해브로채티스 LYC 4/78의 염색체 1, 2, 및 4로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 염색체 상의 QTL들로부터 선택된 보트리티스-내성과 연관된, 하나 이상의 추가의 QTL 또는 그것의 보트리티스-내성-제공부를 포함하고,
    여기서 상기 식물의 염색체 4에서의 상기 추가의 QTL의 위치는 솔라늄 해브로채티스의 염색체 4, 솔라늄 리코페르시쿰의 염색체 4, 솔라늄 해브로채티스 LYC 4/78의 염색체 4, 또는 솔라늄 리코페르시쿰 cv. 머니메이커의 염색체 4에서 유전자 마커 P18M51-169.5e, P18M51-305.4h, P14M60-262.9e, P14M61-292.7h, TG609, P14M48-345e, P14M48-177e 및 P18M50-147e를 포함하는 게놈성 영역에 의해 표시되는 식물.
  23. 보트리티스-내성 근교배 토마토 식물의 생산방법으로,
    a) 제1항 및 제3항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 방법에 따라 보트리티스-내성 토마토 식물을 생산하고;
    b) 상기 보트리티스-내성 토마토 식물을 그 자신과 또는 다른 토마토 식물과 교배하여 자손 토마토 종자를 수확하고;
    c) 상기 단계의 자손 토마토 종자를 성장시켜 추가의 보트리티스-내성 토마토 식물을 수확하고;
    d) 교배 및 성장 단계를 0 내지 7회 반복하여 보트리티스-내성 근교배 토마토 식물을 발생시키는 것을 포함하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 단계 c)는 보트리티스 내성을 나타내고
    질병 내성, 곤충 내성, 및 가치 있는 열매 특징으로 구성되는 군으로부터 선택되는 상업적으로 바람직한 특징을 소유하는 식물을 동정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  25. 제23항에 있어서, 상기 방법은 동형접합체 근교배 토마토 식물을 선택하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  26. 제23항에 따른 방법으로 얻을 수 있는, 보트리티스-내성 근교배 토마토 식물.
  27. 제26항에 따른 보트리티스-내성 근교배 토마토 식물의 일부로서,
    상기 식물의 일부는 꽃가루, 배주, 잎, 배아, 뿌리, 근단, 꽃밥, 꽃, 열매, 줄기 발아 및 종자의 세포 또는 조직; 및 꽃가루, 배주, 잎, 배아, 뿌리, 근단, 꽃밥, 꽃, 열매, 줄기, 발아, 접순, 근경, 종자, 원형질체, 및 캘리로부터 선택되는 것인, 보트리티스-내성 근교배 토마토 식물의 일부.
  28. 보트리티스에 대한 내성을 나타내는 혼성 토마토 식물로, 여기서 상기 혼성 토마토 식물은, 제23항에 따른 방법으로 얻을 수 있는 보트리티스-내성 근교배 토마토 식물을 질병 내성, 곤충 내성, 및 가치 있는 열매 특징으로 구성되는 군으로부터 선택되는 상업적으로 바람직한 특징을 나타내는 근교배 토마토 식물과 교배하여 얻을 수 있는 것인 혼성 토마토 식물.
  29. 제28항에 따른 혼성 토마토 식물의 일부로서,
    상기 식물의 일부는 꽃가루, 배주, 잎, 배아, 뿌리, 근단, 꽃밥, 꽃, 열매, 줄기 발아 및 종자의 세포 또는 조직; 및 꽃가루, 배주, 잎, 배아, 뿌리, 근단, 꽃밥, 꽃, 열매, 줄기, 발아, 접순, 근경, 종자, 원형질체, 및 캘리로부터 선택되는 것인, 혼성 토마토 식물의 일부.
  30. 제13항에 따른 토마토 식물의 재생가능한 세포의 조직 배양물.
  31. 제19항에 따른 식물의 재생가능한 세포의 조직 배양물.
  32. 제26항에 따른 토마토 식물의 재생가능한 세포의 조직 배양물.
  33. 제28항에 따른 토마토 식물의 재생가능한 세포의 조직 배양물.
  34. 제30항에 있어서, 상기 재생가능한 세포는 잎, 화분, 배아, 뿌리, 근단, 꽃밥, 꽃, 열매, 및 줄기와 종자로 이루어진 군으로부터 선택되는 조직으로부터 단리된 세포 또는 원형질체를 포함하는 조직 배양물.
  35. 제31항에 있어서, 상기 재생가능한 세포는 잎, 화분, 배아, 뿌리, 근단, 꽃밥, 꽃, 열매, 및 줄기와 종자로 이루어진 군으로부터 선택되는 조직으로부터 단리된 세포 또는 원형질체를 포함하는 조직 배양물.
  36. 제32항에 있어서, 상기 재생가능한 세포는 잎, 화분, 배아, 뿌리, 근단, 꽃밥, 꽃, 열매, 및 줄기와 종자로 이루어진 군으로부터 선택되는 조직으로부터 단리된 세포 또는 원형질체를 포함하는 조직 배양물.
  37. 제33항에 있어서, 상기 재생가능한 세포는 잎, 화분, 배아, 뿌리, 근단, 꽃밥, 꽃, 열매, 및 줄기와 종자로 이루어진 군으로부터 선택되는 조직으로부터 단리된 세포 또는 원형질체를 포함하는 조직 배양물.
  38. 표 1 내지 5의 유전자 마커로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자 마커를 사용하여 보트리티스-내성에 대한 QTL을 검출하거나 또는 보트리티스-내성 토마토 식물을 검출하는 방법.
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1652930A1 (en) * 2004-10-25 2006-05-03 De Ruiter Seeds R&D B.V. Botrytis-resistant tomato plants
EP2442636B1 (en) * 2009-06-17 2019-12-25 Monsanto Invest B.V. Tomato plants resulting from the introgression of a trait from Solanum pennellii into S. lycopersicum and having an increased yield
EP2292774A1 (en) * 2009-08-17 2011-03-09 Syngenta Participations AG. Disease resistant tomato plants
EP3257944A1 (en) 2016-06-14 2017-12-20 Nunhems B.V. Tomato plants having alterations in the dmr6 gene
JP7057746B2 (ja) * 2018-01-15 2022-04-20 カゴメ株式会社 低グルタミン酸トマト
CA3103821A1 (en) 2018-07-20 2020-01-23 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Tomato plants with improved disease resistance
CN113424766A (zh) * 2021-05-31 2021-09-24 上海交通大学 远缘杂交技术创制番茄新种质的方法及其在番茄改良中应用
CN116004900A (zh) * 2022-12-30 2023-04-25 华中农业大学 一种用于鉴定番茄耐铝基因型的分子标记at12及其应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994000977A1 (en) 1992-07-07 1994-01-20 Japan Tobacco Inc. Method of transforming monocotyledon
AR030360A1 (es) * 2001-01-05 2003-08-20 Monsanto Technology Llc Metodos para la cria y la seleccion de plantas de soja con rendimientos mejorados
KR100755576B1 (ko) * 2001-04-25 2007-09-06 세미니스 베저터블 시즈 인코포레이티드 보트리티스 시네리아에 내성을 나타내는 토마토 식물
RU2261275C2 (ru) * 2002-10-24 2005-09-27 Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской Академии Наук Способ получения трансгенных растений с повышенной устойчивостью к фитопатогенам
EP1652930A1 (en) * 2004-10-25 2006-05-03 De Ruiter Seeds R&D B.V. Botrytis-resistant tomato plants

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Katherine J. Denby 등. The Plant Journal. Vol. 38, No. 3, 페이지 473-486 (2004.) *
국제공개공보 WO02/085105(2002.10.31.) *

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