JP5858596B2 - ボトリチスに対して高レベルの耐性を有するトマト植物 - Google Patents
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Description
本発明は、植物の育種および分子生物学に関する。より具体的には、本発明は、トマトにおけるボトリチス・シネレア(Botrytis cinerea)に対する耐性に関連する量的形質遺伝子座(QTL)を検出するための方法、それによってボトリチス耐性トマト植物を産生する方法、ならびにこのようにして得られたボトリチス耐性トマト植物およびその一部に関する。
ボトリチス・シネレアは、少なくとも235の可能性がある宿主を含む極めて広い宿主範囲を有する壊死栄養性病原性真菌である。その宿主範囲が広いために、および植物の経済的に重要な部分に罹患することから、B. シネレア(B. cinerea)は、多くの商業栽培される作物における主要な問題である。栽培者の中で、真菌は一般的にボトリチスと呼ばれている。栽培されたトマト(ソラナム・リコペルシカム(Solanum lycopersicum);以前はリコペルシコン・エスクレンタム(Lycopersicon esculentum))も同様に、ボトリチスによる感染に対して感受性があり、真菌は一般的に、トマト植物の茎、葉、および果実に罹患する。加温された温室では、茎におけるボトリチスによる感染の発生は、特に一般的である。
本発明は、S. ハブロカイテスのゲノムにおいて、ボトリチスに対する耐性に関係するとこれまで同定されていなかった多数の染色体に遺伝材料が存在することを見いだした。実際に、本発明者らは、トマト野生型近縁種の系統のゲノムにおいて、すなわちソラナム・ハブロカイテス(Solanum habrochaites)LYC 4/78において、量的形質遺伝子座(QTL)の同定に成功した。これらのさらなるQTLは遺伝子移入系統を用いることによって発見された。
(a) ボトリチス耐性ドナートマト植物、好ましくはS. ハブロカイテス種のボトリチス耐性植物、より好ましくはS. ハブロカイテスLYC 4/78系統のボトリチス耐性植物を提供する段階;
(b) 該ドナー植物からの核酸を一つまたは複数のボトリチス感受性レシピエントトマト植物、好ましくはS. リコペルシカム種の植物に移入する段階であって、移入によって、該一つまたは複数の感受性レシピエント植物のゲノムの対応する領域にドナー植物からのゲノム物質が導入される、段階;
(c) 該ボトリチス耐性ドナートマト植物に由来するボトリチス耐性に関する少なくとも一つのQTLをそのゲノムに含む植物を、該レシピエントトマト植物の中から(または該レシピエントトマト植物を用いて得られた戻し交配植物のさらなる自家受粉から、すなわち該移入後に得られた組み換え型植物から)選択する段階であって、選択が、ボトリチス耐性に関する該少なくとも一つのQTLに連鎖する少なくとも一つの遺伝子マーカーを該レシピエントトマト植物の第4、6、9、11、および/または12染色体上で検出することを含む、段階
を含む、ボトリチス耐性トマト植物を産生する方法であって、
- 該植物の第4染色体上の該QTLの位置が、S. ハブロカイテスの第4染色体上またはS. リコペルシカムの第4染色体上、より好ましくはS. ハブロカイテスLYC 4/78の第4染色体上またはS. リコペルシカム栽培品種Moneymakerの第4染色体上の、遺伝子マーカーCT50、C2At1g74970、P14M49-283e、P14M48-74e、P14M50-67e、CT1739、およびP14M50-85hを含むゲノム領域によって示される、方法に関する。
- 該植物の第4染色体上の該QTLの位置が、S. ハブロカイテスの第4染色体上またはS. リコペルシカムの第4染色体上、より好ましくは、S. ハブロカイテスLYC 4/78の第4染色体上またはS. リコペルシカム栽培品種Moneymakerの第4染色体上の遺伝子マーカーCT50、C2At1g74970、P14M49-283e、P14M48-74e、P14M50-67e、CT1739、およびP14M50-85hを含むゲノム領域によって示される、方法に関する。
[本発明101]
以下の段階を含む、ボトリチス(Botrytis)耐性トマト植物を産生する方法であって、該植物の第4染色体上のQTLの位置が、S. ハブロカイテス(S. habrochaites)の第4染色体上またはS. リコペルシカム(S. lycopersicum)の第4染色体上の遺伝子マーカーCT50、C2At1g74970、P14M49-283e、P14M48-74e、P14M50-67e、CT1739、およびP14M50-85hを含むゲノム領域によって示される、方法:
(a) S. ハブロカイテスLYC 4/78系統のボトリチス耐性植物である、ボトリチス耐性ドナートマト植物を提供する段階;
(b) ドナー植物からの核酸を一つまたは複数のボトリチス感受性レシピエントトマト植物、好ましくはS. リコペルシカム種の植物に移入する段階であって、該移入によって、一つまたは複数のレシピエント植物の対応するゲノム領域にドナー植物からのゲノム物質が導入される、段階;
(c) ボトリチス耐性ドナートマト植物に由来するボトリチス耐性に関する少なくとも一つのQTLをそのゲノム中に含む植物を、レシピエントトマト植物の中から選択する段階であって、該選択が、ボトリチス耐性に関する少なくとも一つのQTLに連鎖する少なくとも一つの遺伝子マーカーを該レシピエントトマト植物の第4、6、9、11、および/または12染色体上で検出することを含む、段階。
[本発明102]
前記植物の第6染色体上のQTLの位置が、S. ハブロカイテスの第6染色体上またはS. リコペルシカムの第6染色体上の遺伝子マーカーP22M50-188h、P14M48-521e、P15M48-386h、P18M51-199h、P18M51-103h、P22M50-103e、P18M51-388e、Pl5M48-395e、P22M50-124e、P14M48-160e、およびP22M50-513hを含むゲノム領域によって示され、
該植物の第9染色体上のQTLの位置が、S. ハブロカイテスの第9染色体上またはS. リコペルシカムの第9染色体上の遺伝子マーカーP18M50-141、P14M49-240、TG254、TG223、TG10、P18M50-134h、P14M49-243h、P18M50-599、P14M60-222h、P22M51-417h、P14M50-174h、P14M60-157h、P14M60-107h、P15M48-138h、P14M48-113h、Tm2a、P18M51-146h、Pl4M48-282h、およびP14M50-276hを含むゲノム領域によって示され、
該植物の第11染色体上のQTLの位置が、S. ハブロカイテスの第11染色体上またはS. リコペルシカムの第11染色体上の遺伝子マーカーP14M60-215e、P14M61-173h、P14M50-307h、TG47、P14M50-29xCD、P18M51-358h、P18M50-27xCD、P18M51-136h、P22M50-488h、TG393、P14M61-396h、P22M51-235h、およびP22M51-174eを含むゲノム領域によって示され、かつ
該植物の第12染色体上のQTLの位置が、S. ハブロカイテスの第12染色体上またはS. リコペルシカムの第12染色体上の遺伝子マーカーCT19、TG68、P14M48-411e、P18M50-244h、P18M50-273h、P14M61-420h、P14M61-406h、Pl4M61-223h、P14M60-193h、P22M51-314h、TG565、P14M48-172h、P22M50-321e、P14M60-219e、P14M48-153h、P22M50-97h、TG296、P22M50-131h、およびP22M51-135hを含むゲノム領域によって、好ましくは遺伝子マーカーP14M61-420h、P14M61-406h、P14M61-223h、P14M60-193h、P22M51-314h、TG565、P14M48-172h、P22M50-321e、P14M60-219e、P14M48-153h、P22M50-97h、TG296、およびP22M50-131hを含むゲノム領域によって示される、本発明101の方法。
[本発明103]
ボトリチス耐性に関する少なくとも一つのQTL、またはそのボトリチス耐性付与部分を含む核酸の移入が、遺伝子移入として該QTLを含む子孫植物を産生するためにボトリチス耐性ドナートマト植物をボトリチス感受性レシピエントトマト植物と交配させることによって行われ、かつ段階(c)が一つまたは複数の子孫植物に対して行われる、本発明101または102の方法。
[本発明104]
ボトリチス耐性に関する少なくとも一つのQTL、またはそのボトリチス耐性付与部分を含む核酸の移入が、トランスジェニック法によって(たとえば、形質転換によって)、プロトプラスト融合によって、ダブルハプロイド技術によって、または胚救出によって行われる、本発明101または102の方法。
[本発明105]
段階(c)が、レシピエントトマト植物から単離されたDNA中の遺伝子マーカーを検出することによって行われる、本発明101〜104のいずれかの方法。
[本発明106]
段階(c)が、植物におけるボトリチス耐性を測定するためのバイオアッセイに植物を供することをさらに含む、本発明101〜105のいずれかの方法。
[本発明107]
段階(c)が、S. ハブロカイテスLYC 4/78の第1、2、および4染色体に存在するQTLから選択されるボトリチス耐性に関する少なくとも一つのQTLをそのゲノム内に含む植物を選択することをさらに含み、
- 該植物の第1染色体上のQTLの位置が、S. ハブロカイテスの第1染色体またはS. リコペルシカムの第1染色体上の遺伝子マーカーP22M50-412h、P14M50-349h、P14M60-69h、P14M49-192h、P14M49-232h、Pl4M49-260e、P14M50-503h、P18M50-124h、およびP14M49-114hを含むゲノム領域によって示され;
- 該植物の第2染色体上のQTLの位置が、S. ハブロカイテスの第2染色体またはS. リコペルシカムの第2染色体上の遺伝子マーカーPl4M60-537h、P15M48-257e、Pl4M49-327h、Pl4M49-325h、Pl4M61-286e、P14M61-125h、P18M51-134h、およびCT128を含むゲノム領域によって示され;かつ
- 該植物の第4染色体上のQTLの位置が、S. ハブロカイテスの第2染色体またはS. リコペルシカムの第2染色体上の遺伝子マーカーP18M51-169.5e、P18M51-305.4h、Pl4M60-262.9e、およびP14M61-292.7hを含むゲノム領域によって示される、本発明101〜106のいずれかの方法。
[本発明108]
段階(c)が、
- 本発明101、102、および107において定義されるQTLからなる群より選択されるボトリチス耐性に関する少なくとも四つのQTLをそのゲノム内に含む植物、または
- 本発明101および102において定義されたQTLからなる群より選択されるボトリチス耐性に関する少なくとも二つのQTLをそのゲノム内に含む植物
を選択する段階を含む、本発明101〜107のいずれかの方法。
[本発明109]
段階(c)において選択された植物を栽培トマト系統の植物と交配させて子孫植物を産生する段階(d)をさらに含む、本発明101〜108のいずれかの方法。
[本発明110]
本発明101〜109のいずれかの方法によって得ることができるボトリチス耐性トマト植物またはその一部。
[本発明111]
本発明101または102において定義されたボトリチス耐性に関連するソラナム・ハブロカイテス(Solanum habrochaites)LYC 4/78の第4、6、9、11、および12染色体上のQTLからなる群より選択される、S. リコペルシカムにおけるボトリチス耐性に関するQTL。
[本発明112]
本発明111のQTLを含むS. リコペルシカム種のトマト植物から得られる単離されたDNA試料。
[本発明113]
ボトリチス耐性が予想されるトマト植物の第4、6、9、11および/または12染色体上のS. ハブロカイテスLYC 4/78に由来するボトリチス耐性に関するQTLに連鎖する少なくとも一つの遺伝子マーカーを検出する段階を含む、ボトリチス耐性に関するQTLを検出するための方法であって:
- 該植物の第4染色体上のQTLの位置が、S. ハブロカイテスの第4染色体上またはS. リコペルシカムの第4染色体上の遺伝子マーカーCT50、C2At1g74970、P14M49-283e、P14M48-74e、P14M50-67e、CT1739、およびP14M50-85hを含むゲノム領域によって示され、
- 該植物の第6染色体上のQTLの位置が、S. ハブロカイテスの第6染色体上またはS. リコペルシカムの第6染色体上の遺伝子マーカー P22M50-188h、P14M48-521e、P15M48-386h、P18M51-199h、P18M51-103h、P22M50-103e、P18M51-388e、Pl5M48-395e、P22M50-124e、P14M48-160e、およびP22M50-513hを含むゲノム領域によって示され、
- 該植物の第9染色体上のQTLの位置が、S. ハブロカイテスの第9染色体上またはS. リコペルシカムの第9染色体上の遺伝子マーカーP18M50-141、P14M49-240、TG254、TG223、TG10、P18M50-134h、P14M49-243h、P18M50-599、P14M60-222h、P22M51-417h、P14M50-174h、P14M60-157h、P14M60-107h、P15M48-138h、P14M48-113h、Tm2a、P18M51-146h、Pl4M48-282h、およびP14M50-276hを含むゲノム領域によって示され、
- 該植物の第11染色体上のQTLの位置が、S. ハブロカイテスの第11染色体上またはS. リコペルシカムの第11染色体上の遺伝子マーカーP14M60-215e、P14M61-173h、P14M50-307h、TG47、P14M50-29xCD、P18M51-358h、P18M50-27xCD、P18M51-136h、P22M50-488h、TG393、P14M61-396h、P22M51-235h、およびP22M51-174eを含むゲノム領域によって示され、かつ
- 該植物の第12染色体上のQTLの位置が、S. ハブロカイテスの第12染色体上またはS. リコペルシカムの第12染色体上の遺伝子マーカーCT19、TG68、P14M48-411e、P18M50-244h、P18M50-273h、P14M61-420h、P14M61-406h、Pl4M61-223h、P14M60-193h、P22M51-314h、TG565、P14M48-172h、P22M50-321e、P14M60-219e、P14M48-153h、P22M50-97h、TG296、P22M50-131h、およびP22M51-135hを含むゲノム領域によって、好ましくは遺伝子マーカーP14M61-420h、P14M61-406h、P14M61-223h、P14M60-193h、P22M51-314h、TG565、P14M48-172h、P22M50-321e、P14M60-219e、P14M48-153h、P22M50-97h、TG296、およびP22M50-131hを含むゲノム領域によって示される、方法。
[本発明114]
ボトリチス耐性に関連するソラナム・ハブロカイテスの第4、6、9、11および12染色体上のQTLからなる群より選択される、少なくとも一つのQTL、またはそのボトリチス耐性付与部分をそのゲノム内に含む、S. リコペルシカム種のボトリチス耐性植物またはその一部であって、
- 該植物の第4染色体上のQTLの位置が、S. ハブロカイテスの第4染色体上またはS. リコペルシカムの第4染色体上の遺伝子マーカーCT50、C2At1g74970、P14M49-283e、P14M48-74e、P14M50-67e、CT1739、およびP14M50-85hを含むゲノム領域によって示され、該QTLまたはそのボトリチス耐性付与部分がその天然の遺伝的バックグラウンドに存在せず、かつ
- 該植物が任意で、ソラナム・ハブロカイテス、好ましくはソラナム・ハブロカイテスLYC 4/78系統の第1、2、および/または4染色体上のQTLから選択されるボトリチス耐性に関連する一つまたは複数のさらなるQTLまたはそのボトリチス耐性付与部分をさらに含み、該植物の第4染色体上のさらなるQTLの位置が、S. ハブロカイテスの第4染色体またはS. リコペルシカムの第4染色体、より好ましくはS. ハブロカイテスLYC 4/78の第4染色体上またはS. リコペルシカム栽培品種Moneymakerの第4染色体上の遺伝子マーカーP18M51-169.5e、P18M51-305.4h、P14M60-262.9e、Pl4M61-292.7h、TG609、P14M48-345e、P14M48-177e、およびP18M50-147eを含むゲノム領域によって示される、植物またはその一部。
[本発明115]
第1、2、6、9、11、および/または12染色体上のQTLの位置が、本発明101、102および/または107において定義されるとおりである、本発明114の植物。
[本発明116]
以下の段階を含む、ボトリチス耐性同系交配トマト植物を産生する方法:
(a) 本発明101〜109のいずれかのボトリチス耐性トマト植物を産生する段階;
(b) 該ボトリチス耐性トマト植物をそれ自身とまたは別のトマト植物と交配させて、子孫トマト種子を得る段階;
(c) 段階の子孫トマト植物種子を生育させて、さらなるボトリチス耐性トマト植物を得る段階;
(d) 交配および生育段階を0〜7回繰り返して、ボトリチス耐性同系交配トマト植物を作製する段階。
[本発明117]
段階(c)が、ボトリチス耐性を示しかつ商業的に望ましい特徴を保有する植物を同定する段階をさらに含む、本発明116の方法。
[本発明118]
ホモ接合同系交配トマト植物を選択する段階をさらに含む、本発明116または117の方法。
[本発明119]
本発明116〜118のいずれかの方法によって得ることができるボトリチス耐性同系交配トマト植物またはその一部。
[本発明120]
本発明116〜118のいずれかの方法によって得ることができるボトリチス耐性同系交配トマト植物を、商業的に望ましい特徴を示す同系交配トマト植物と交配させることによって得ることができる、ボトリチスに対する耐性を示すハイブリッドトマト植物またはその一部。
[本発明121]
再生可能な細胞が、葉、花粉、胚、根、根の先端、葯、花、果実、茎および種子からなる群より選択される組織から単離された細胞またはプロトプラストを好ましくは含む、本発明110、114、115、119、または120のいずれかのトマト植物の再生可能な細胞の組織培養物。
[本発明122]
ボトリチス耐性に関するQTLを検出するための、および/またはボトリチス耐性トマト植物を検出するための、表1〜5の遺伝子マーカーからなる群より選択される遺伝子マーカーの使用。
定義
本明細書において用いられる「ボトリチス」という用語は、トマトの茎、葉、および果実において一般的に見いだされる病気である灰色カビまたは灰色斑として知られるボトリチス・シネレアを意味する。一般的に、植物の病原性真菌スクレロチニア・スクレロチオラム(Sclerotinia sclerotiorum)は、B. シネレアと類似の感染メカニズムを有すると考えられる(Prins et al., 2000)。トマトにおけるS. スクレロチオラム感染はB. シネレア感染より経済的な重要度がはるかに低いが、いずれの真菌も広いスペクトルのプロテアーゼ、細胞壁分解酵素、毒素と共にシュウ酸を分泌する。これらの要因のいくつかは、双方の真菌の感染戦略において役割を有することが知られている。その結果、ボトリチスに対する耐性を付与するメカニズムおよび遺伝子は、S. スクレロチオラムによる感染に対する耐性を提供するために等しく有効であると考えられている。したがって、本明細書において「ボトリチス耐性」について参照する場合、そのような耐性は、菌核菌(Sclerotiniaceae)科の任意の真菌に対する耐性、好ましくはS. スクレロチオラムおよびB. シネレアに対する耐性、より好ましくはB. シネレアに対する耐性を含むと理解すべきである。
野生型トマト種は、病気および害虫耐性形質の適した起源を提供することが知られており、野生型トマト種の葉におけるB. シネレアに対する部分的耐性の存在が報告されている(Urbasch, 1986)。過去に、二つの要因によって、トマトにおけるB. シネレア耐性に関する育種が妨害された。第一に、商業的育種系統への部分的耐性の交雑は、限られた成功を収めたに過ぎなかった。第二に、耐性の付与に関与する遺伝材料の同定および局在を可能にするであろう、信頼できかつ再現可能な病気のアッセイが存在しなかった。
- 栽培トマトの一連の遺伝子移入系統を産生する段階であって、それぞれの遺伝子移入系統が、ボトリチス耐性野生型トマトアクセッション、好ましくはS. ハブロカイテスLYC 4/78からの特異的ゲノム遺伝子移入(染色体領域)を含有し、一連の系統は共に、該耐性野生型トマトアクセッションのゲノムの全範囲を含む、段階;
- 個々の遺伝子移入系統の各植物においてボトリチスに対する耐性を測定するための量的バイオアッセイを行うことによって、好ましくは、発病率および/または病変増殖速度を測定して、および観察されたボトリチス耐性を、該遺伝子移入系統における染色体マーカーの存在と連鎖させる遺伝子連鎖マップを確立して、耐性増大(たとえば、発病率の低減および/または病変増殖速度の低減)に連鎖する該マップ上の近接マーカーを量的形質遺伝子座に割り当てることによって、個々の遺伝子移入系統の各植物におけるボトリチス耐性に関連するQTLを同定する段階;ならびに
- ボトリチスに対して耐性である栽培トマト植物を産生するためにボトリチス耐性に関連するQTLを含有する遺伝子移入系統を用いる段階、または、ボトリチス耐性が予想されるトマト植物のマーカー補助選択において同定されたQTLに関するマーカー情報を用いる段階。
分子マーカーは、核酸配列における差を可視化するために用いられる。この可視化は、DNA-DNAハイブリダイゼーション技術(RFLP)によっておよび/またはポリメラーゼ連鎖反応(例えば、STS、マイクロサテライト、AFLP)を用いる技術によって可能となる。二つの親遺伝子型のあいだの差は全て、これらの親遺伝子型の交雑に基づいてマッピング集団(例えば、BC1、F2;図2を参照されたい)において分離するであろう。異なるマーカーの分離を比較してもよく、組換え頻度を計算することができる。異なる染色体上の分子マーカーの組換え頻度は一般的に50%である。同じ染色体に存在する分子マーカー間では、組換え頻度はマーカー間の距離に依存する。低い組換え頻度は、染色体上のマーカー間の短い距離に対応する。全ての組換え頻度を比較すると、染色体上の分子マーカーの最も論理的な順序が得られるであろう。この最も論理的な順序を、連鎖マップにおいて描写することができる(Paterson, 1996)。発病率の低減および/または病変増殖速度の低減に関連する連鎖マップにおける隣接または近接マーカー群は、QTLの位置を正確に示す。
1 マーカーの命名:AFLPプライマーの組み合わせが一般的に示されるコード、たとえばP18M51-156h、ここで、PおよびMは一般的なPstIおよびMseIプライマー配列または万能プライマー(Vos et al., 1995;Bai et al., 2003)であり、その後に二桁の拡張コードによって示される2または3個の余分の選択的塩基が続く。二桁の拡張コードは以下の通りである: 14:AT;15:CA;18:CT;22:GT;48:CAC;49:CAG;50:CAT;51:CCA;60:CTC;61:CTG。156hとは、得られた多型断片の塩基対(所与のサイズ±2塩基対)におけるおおよそのサイズである。サイズは通常、概数であるが、小数で与えられてもよい。この断片を、S. リコペルシカム栽培品種Moneymaker(e)またはS. ハブロカイテスLYC 4/78(h)のいずれかにおいて増幅する。マーカーの存在は、表記の起源の少なくとも一つの対立遺伝子が存在することを示している。プライマーおよびアダプター配列はBai et al. 2003によって詳細に記載されている。2 発病率および病変増殖速度は、実施例において詳細に説明されている方法を用いて決定する。3 TG609:表10を参照されたい。4 TG62:表11を参照されたい。5 T1405:表20を参照されたい。6 TG555:表12を参照されたい。7 CT50:表13を参照されたい。8 C2_At1g74970:表14を参照されたい。9 CT173:表21を参照されたい。
1 TG254:表22を参照されたい。2 TG223:表23を参照されたい。3 TG10:表17を参照されたい。4 Tm2a:表18またはSorbir, O.T. et al. (2000)を参照されたい。
1 TG47:表24を参照されたい。2 TG393:表25を参照されたい。
1 CT19:表26を参照されたい。2 TG68:表27を参照されたい。TG565:表28を参照されたい。TG296:表29を参照されたい。
本発明のもう一つの局面に従って、本発明の少なくとも一つのQTLまたはそのボトリチス耐性付与部分を含む核酸(好ましくはDNA)配列を、ボトリチス耐性トマト植物の産生のために用いてもよい。この局面において、本発明は、その使用がボトリチス感受性レシピエントトマト植物における該QTLを含む核酸配列の導入を伴う、ボトリチス耐性トマト植物を産生するために本発明のQTLまたはそのボトリチス耐性付与部分を用いることを提供する。先に述べたように、核酸配列は適したボトリチス耐性ドナートマト植物に由来してもよい。本明細書において先に記述したQTLの少なくとも一つ、またはそのボトリチス耐性付与部分を含む核酸配列を提供することができる二つの適切なボトリチス耐性ドナートマト植物は、S. ハブロカイテスLYC 4/78である。ボトリチスに対して耐性を示し、ボトリチス耐性をコードする一つまたは複数の遺伝子を含む他の関連するトマト植物も同様に、本発明がどのようにしてこの材料が同定されるかを記述することから、ボトリチス耐性ドナー植物として利用してもよい。リコペルシコン・セラシフォルム、リコペルシコン・チーズマニイ、リコペルシコン・キレンセ、リコペルシコン・クミリウスキイ、ソラナム・リコペルシカム、リコペルシコン・ヒルスータム、リコペルシコン・パルビフロラム、リコペルシコン・ペンネリイ、リコペルシコン・ペルビアナム、リコペルシコン・ピンピネリフォリウム、およびソラナム・リコペルシコイデスが含まれるがそれらに限定されるわけではないトマト種の他のアクセッションを、ボトリチス耐性に関して調べることができる。
ボトリチス耐性トマト植物を産生するためのもう一つの態様において、ドナー植物からレシピエント植物に核酸を移入するために、プロトプラスト融合を用いることができる。プロトプラスト融合は、体細胞ハイブリダイゼーションのような、二つまたはそれより多いプロトプラスト(その細胞壁が酵素処理によって除去されている)間の誘導または自然発生合体であり、一つの二核細胞または多核細胞を生じる。天然において品種間交雑することができない植物種についても得られる可能性がある融合された細胞は、望ましい形質の組み合わせを示すハイブリッド植物へと組織培養される。より具体的には、第一のプロトプラストを、ボトリチスによる感染症に対して耐性を示すトマト植物または他の植物系統から得ることができる。例えば、S. ハブロカイテスLYC 4/78からのプロトプラストを用いることができる。第二のプロトプラストは、第二のトマトまたは他の植物品種から、好ましくは耐病性、害虫耐性、貴重な果実特徴等のような、しかしこれらに限定されない商業的に望ましい特徴を含むトマト系統から得ることができる。次に、当技術分野で公知である従来のプロトプラスト融合技法を用いて、プロトプラストを融合させる。
本発明のボトリチス耐性トマト植物は、高レベルの耐性を有することを特徴とする。これは、感受性のある対照植物に関して観察されたレベルより高い耐性レベルであると定義される。実際に、本発明の植物は、任意の商業的トマト品種、すなわち今日まで知られている商業的に望ましい特徴を有する品種より高い耐性レベルを有する。本発明の植物は、バイオアッセイによって測定した場合に、感受性のある対照植物より少なくとも3倍低いボトリチス・シネレアに対する感受性を有する。例えば、成体植物におけるボトリチス・シネレア感染に起因する平均茎病変長が、実施例3.10および3.11においてより詳細に記述されるような標準的な実践条件で3週間のあいだ測定されるバイオアッセイによって測定した場合。典型的に、本発明の植物は、そのような特徴に基づいて耐性を決定するように設計された耐性バイオアッセイにおける標準的な実践条件を用いて、接種後3週間で成体植物においてボトリチス・シネレア病変の平均茎病変長が3.2 cm未満である耐性レベルを有する。より典型的に、本発明の植物は、2.9 cm未満の平均茎病変長を示す。本発明の植物の中には、平均茎病変長2.0 cmを示すものさえある。その数が初回接種創傷の2 cmを含む病変長を表すことを考慮すると、高レベルの耐性、およびいくつかのQTLの場合では十分な耐性が本発明の植物において観察されると推論されうる。比較すると、感受性のある対照植物は、同じ条件で約3.6 cm〜約6.0 cmの平均茎病変長を示し、平均値は4.85 cm(表7を参照されたい)である。同様に比較として、S. ハブロカイテスLA 1777、国際公開公報第02/085105号の部分的ボトリチス耐性起源を含むQTL-10は、同じ条件で約4.3 cmの平均茎病変長を示す。要約すると、本発明の植物は、一般的に、上記参照耐性バイオアッセイにおいて、感受性のある対照植物の真の長さの約30%(0.9/2.85×100%)未満である、および一般的に部分的耐性S. ハブロカイテスLA 1777の真の長さの約40%(0.9/2.3×100%)未満である真の茎病変を示す。
実施例1. ボトリチス・シネレアに対する耐性に関連するQTLを同定する方法
1.1. 緒言
本実施例は、野生型トマト遺伝子型のコレクションのボトリチス・シネレアに対する耐性を評価するための量的バイオアッセイの開発を紹介する。
試験した植物の遺伝子型を表6に記載する。
1 DRS:De Ruiter Seeds、ベルフスヘンフーク、オランダ;WU PPW:Plantkundig Proefcentrum Wageningen、ワーゲニンゲン大学、ワーゲニンゲン、オランダ;LoPB:Laboratory of Plant Breeding、ワーゲニンゲン大学、ワーゲニンゲン、オランダ;MPIZK:Max Planck Institut fur Zuchtungsforschung an Kulturpflanze、ケルン、ドイツ;TGRC:Tomato Genetics Resource Center、カリフォルニア大学デイビス校、カリフォルニア州デイビス、USA;IPK:Institut fur Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung、ガータースレーベン、ドイツ。
2 Yは遺伝子型を特定のアッセイにおいて調べたことを示し、Sは、感受性のある参照対照として役立つ遺伝子型を示す。
(3) B. シネレアに対して耐性であると既に公表されている。
B. シネレア株B05.10の接種物を、Benito(1998)に従って調製した。それぞれの個々の植物に関して、十分に枝を出した一つまたは複数の複合葉を主茎から鋭利なカミソリの刃で切り離し、予め湿らせた草花栽培フォームに移した。草花栽培フォームを、水道水を含むペトリ皿に入れて、湿らせた濾紙を含むスプレーによって湿らせた容器に入れた。次に、全体で接種物(2μl)6〜10滴をピペットによって葉の上表面に注意深く滴下することによって、複合葉にB. シネレアの分生子浮遊液を接種した。容器をスプレーによって湿らせた蓋によって閉じて100%RHの15℃の暗所で、本質的にBenito et al., 1998によって記述されるとおりにインキュベートした。一つの複合葉を適切に四つの小葉に分け、それぞれの小葉に分生子2000個を含む各2μlの10滴を接種した。強く拡大する病変の割合(発病率)および病変増殖速度の双方を数日間モニターした。
茎のアッセイは以下のように実施した:高さ約50 cmの植物の茎の上部5〜10 cmおよび下部5〜10 cmを除去して、残りの30 cmを5〜6 cmの等しい分節に切断した。それぞれの茎の分節を、茎の基部を湿らせた濾紙の上に載せて格子の上で直立に立てておく。接種の前に、創傷表面全体に接種物が確実に等しく散布されるように、茎の分節に水道水を噴霧する。接種物は葉のアッセイに関して記述したとおりに調製した。分生子約106個ml-1を含む約5μlの1滴をそれぞれの茎分節の上部に適用した。次に、茎分節を温度約15±2℃で、相対湿度100%の暗所でインキュベートする。感染の進行は、Vernierキャリパーによって接種後の様々な時間間隔で腐敗症状の最大進行を測定することによって量的に決定した。
切り落とされた葉の感染実験における発病率および病変増殖速度を、各遺伝子型に関して、通常感染後2〜4日から数日間決定した。参照として役立つS. リコペルシカム栽培品種Moneymakerの発病率は、これらの実験において15%〜78%のあいだで変動した。遺伝子型82/2577および83/2896(いずれもS. リコペルシカム種)を除き、試験した遺伝子型は、全ての実験において、Moneymakerより低い発病率を示した。遺伝子型G1.1556、G1.1560、およびG1.1601は、これらの独立した実験において、0〜21%の範囲のより低い発病率を示した。統計分析から、遺伝子型78/1604、91/4311、96/4326、G1.1556、GI 1558、G1.1560、Gl.1601、LA716およびLYC 4/78における発病率が、対照系統のS. リコペルシカム栽培品種Moneymakerより有意に低いことが示された(p<0.05)。しかし、週による変動が大きく、週/実験のあいだでの発病率の変動のために、切り離した葉のアッセイにおいて観察された差のいくつかは実際にはそれほど強くない可能性がある。
本実施例において、S. ハブロカイテスLYC 4/78を起源とするB. シネレアに対して部分的耐性を付与する二つのQTL遺伝子座を示す。結果の確認は、二つのQTL遺伝子座の一つに関してそれぞれ分離する二つのBC2S1集団においてB. シネレアに対する耐性レベルを評価することによって得た。
ソラナム・ハブロカイテスLYC 4/78(以降、LYC 4/78と呼ぶ)の種子は、Plant Genetics and Crop Plant Research, Gatersleben, Germanyに存在する遺伝子バンクから得た。
B. シネレア株B05.10からの接種物をBenito(1998)に従って調製した。茎のアッセイを実施例1に記述するように実施した。
ゲノムDNAを、1 ml micronicチューブ(Micronic BV, Lelystad, The Netherlands)を用いてハイスループットDNA単離に適合させた、Steward and Via(1993)による臭化セチルトリメチルアンモニウム(CTAB)に基づくプロトコールを用いて、若い葉(巻いた)2枚から単離して、Retsch 300 mmシェーカー(Retsch BV, Ochten, The Netherlands)を最高速度で用いてすりつぶした。F2、BC2、BC3、BC4、およびBC2S1集団のAFLP分析(Vos et al., 1995)を行って、本質的にMyburg(Myburg et al., 2001)によって公表された方法に従って、AFLP断片をLI-COR 4200 DNAシークエンサーにおいて分解した。選択的PstプライマーをIRD 700またはIRD 800蛍光標識によって標識した。AFLPゲル画像を、AFLP-Quantar Proソフトウェアパッケージ(Keygene BV, Wageningen, The Netherlands)を用いて採点した。Bai et al. (2003)によって記述されるように、以下の10個のプライマーの組み合わせおよびアダプター配列を遺伝子タイピングのために用いた:P14M48、P14M49、P14M50、P14M60、P14M61、P15M48、P18M50、P18M51、P22M50およびP22M51。
異なるボトリチスアッセイ間の発病率の変動が観察された(実施例1、前記を参照されたい)。したがって、7回の独立した連続的な茎の病気のアッセイを、Moneymaker×LYC 4/78との交雑に由来するF2集団の174個体中172個体に関して行った。これによって、ほぼそれぞれのF2遺伝子型に関する病気のバイオアッセイの少なくとも5個の独立した評価が得られた。それぞれの個々の病気のアッセイにおいて、茎分節6個が病変増殖の計算に貢献した。F2集団の発病率および病変増殖の平均値は、正規分布を示した(データは示していない)。Moneymakerに関する平均発病率は59%であり、病変増殖は9.2 mm/日であった。F2集団における平均発病率は10%〜97%の範囲であり、集団の平均値は48%であった。病変の増殖は、3.3 mm〜11.5 mm/日の範囲にわたり、平均値は7.8 mm/日であった。
Moneymaker×LYC 4/78の交雑に由来するF2集団(n=174)に関して遺伝連鎖マップを計算した。10個のプライマーの組み合わせを用いて、F2集団(n=174)において増幅断片長多型(AFLP)マーカー218個を得た。全体でマーカー69個(31.7%)を容易に相互優性であると採点することができ、このように統合されたF2遺伝連鎖マップの計算が可能となった。BC2、BC3、およびBC2S1遺伝子型に関して行ったマーカー分析により、さらに145個のAFLPマーカーの付加が可能となった。これらの145個のさらなるAFLPマーカーのうち合計102個は、これまでF2ゲルの複雑さのために採点されなかった。全体的な遺伝連鎖マップは連鎖群14個のAFLPマーカー315個からなり、全長958 cMを有する。種における同時移動AFLPマーカーは、一般的に対立遺伝子特異的であることから、他のAFLP連鎖マップとの共直線性を用いて連鎖群を染色体に割り当てた。いくつかのMoneymaker特異的AFLPマーカーは、公表された(Haanstra et al. 1999;Bai et al. 2003)遺伝連鎖マップと共通であり、したがっていくつかの連鎖群を、同定されたQTLを有する連鎖群を含む染色体に割り当てることができた。QTLインターバルにおける連鎖マップを改善するために、公表されたS. リコペルシカム×L. ペンネリイマップ(Tanksley et al. 1992;Haanstra et al. 1999)に基づいて診断的CAPSマーカーをこれらの領域に加えた。
マーカーデータを分析して、遺伝連鎖マップを項3.5に記載されるように計算した。
表現型およびマーカーデータを、インターバルマッピング(IM、項3.5を参照されたい)によるQTLの同定のために用いた。IMを、個々の複製物から得られたデータおよび複製物の平均値の双方に適用した。
平均発病率が50%未満である個々の病気の試験に関して、および全ての病気の試験から得られた平均値データに関して、F2集団における発病率に関するインターバルマッピングを行った。全ての試験の平均値データは、インターバルマッピング技法において、発病率に関して単一の有意なQTL(尤度比(LOD)スコアは、ゲノム全体の信頼レベルp<0.05に関して3.4より高くなければならない)を与えた。このQTLは、LODスコア4.5を有し、全ての表現型変動の13%を説明した。耐性に関与する対立遺伝子は、耐性の親LYC 4/78を起源とした。それぞれの個々の実験におけるQTLマッピングは、四つ全ての場合において同じQTL領域を与えた。それぞれの独立した実験において、時に他の「軽微なQTL」が観察された。
病変の増殖は、高い発病率を有する病気の試験において最善に測定することができる。QTLマッピングに関して、7個全ての病気の試験の平均値を用いて、B. シネレアの病変の増殖に関して閾値より高いQTL 1個を同定した(ゲノム全体の信頼レベルP<0.05に関してLOD 3.4)。このQTLは、LODスコア4.2を有し、全表現型変動の12%を説明した。正の効果は、耐性の親LYC 4/78を起源とした。1回のみの反復において、閾値を超えてLODプロフィールが見いだされたことから、多数の病気の試験を行う必要性が明らかにされる。
Moneymaker×LYC 4/78との交雑のF1植物をMoneymakerと2回戻し交雑して、AFLPマーカーを用いて、後代植物59個体を同定された二つのQTL領域(QTL-1hおよびQTL-2h)の存在に関してスクリーニングした。同定された二つのQTLの一つに関してヘテロ接合である植物を選択して、自家受粉させて、二つのBC2S1集団を得た。全体で4個の病気のバイオアッセイを、それぞれのBC2S1遺伝子型に関して行った。SPSSによって分析した双方のBC2S1亜集団のデータは、病変増殖に関して正規分布を示したが、いくつかのサブクラスとしての発病率に関しては観察されなかった。
B. シネレアに対する耐性を測定するためのバイオアッセイは、貴重なツールであることが証明された。しかし、なお大きい未知の変動が感染プロセスの発生に影響を及ぼすように思われる。この大きい非遺伝的変動は、標準化された技法を用いることによって、および多くの独立した複製を行うことによって最小限にすることができる。変動は、茎の生理的条件における差を引き起こす、週によって変化する温室条件(昼間の長さ、太陽光の時間および温度)によって引き起こされうる。同様に、真菌接種物の調製における小さい変動も感染プロセスの変動において役割を有する可能性がある。もう一つの知見は、茎小片が置かれるトレイにおける微小気候によって発病が影響されうる点である。異なる実験トレイ10個をBC2S1バイオアッセイのために用いた。統計分析を用いて、実験間および実験内の変動を補正した。最高の平均発病率を有する実験は、病変増殖を測定するために最も有益であったが、より中程度の発病率を有する実験はより有益であった。二つの形質のあいだに比例的相関が観察されなかったことから、発病率および病変増殖は独立した形質である。
先に記述されたQTLのいずれかを含む植物を、図2において記述される方法を用いて、S. リコペルシカムバックグラウンドに置いた。BC2S2系統を温室において土に入れて、オランダにおいて標準的な実践条件で生長させた。3ヶ月後、ボトリチスを含む寒天ディスクを主茎の創傷に載せることによって植物に接種した。創傷をその後Parafilm(登録商標)を用いて閉じた。接種3週間後、茎の病変の長さ(cm)を測定した(より詳しくは下記を参照されたい)。結果を表7に記載する。明らかに、病変増殖に関するQTLを含む系統は病変の大きさの極端な低減を示す。
***) a、b、c、およびdは、それぞれの繰り返しが植物5個体を表す繰り返しであり;eおよびfは、それぞれの繰り返しが植物3個体を表す繰り返しであり;GTはTMV耐性を有するMoneybergであり;Durinthaは、栽培者によれば部分的耐性を有するハイブリッドであり;Tradiroは、栽培者によればボトリチスに対して感受性のあるハイブリッドであり;BChirsは、S. ハブロカイテスLYC 4/78遺伝子移入に起因する戻し交配系統を示し;LA 1777は、野生種アクセッションS. ハブロカイテスLA 1777であり;BC chrs 10は、S. ハブロカイテスLA 1777からの第10染色体で遺伝子移入を有する戻し交配系統を示し;parvはS. ネオリキイ(S. neorickii)遺伝子移入に起因する系統を示す。
本明細書に記載のS. ハブロカイテスLYC 4/78 QTLを含有する植物における耐性レベルを、第10染色体上で部分的ボトリチス耐性に関するQTLを含有するWO02/085105の起源であるS. ハブロカイテスLA 1777の耐性レベル、およびそれに由来する、第10染色体で遺伝子移入を有する遺伝子移入系統の耐性レベルと比較した。
緒言
適当な遺伝的構成を有する候補親植物の選択を伴うより有効な育種プロセスを作製するために、候補親植物の少なくとも一つにおける遺伝的構成の存在を示す一つまたは複数の遺伝子マーカーを自由に使えることが必要である。選択された植物の交配を含む、マーカー補助選択(MAS)と呼ばれるこのプロセスにより、都合のよい親対立遺伝子がドナー集団からレシピエント集団へと効率よく移入され、かつまた、交配がもはや偶然の一致に依存せず、開発コストに関して費用的にずっとより効果的であることが確実となる。
植物材料およびILの作製
S. リコペルシカム栽培品種Moneymaker(以降SLと呼ぶ)とS. ハブロカイテスLYC 4/78(以降SHと呼ぶ;1978年の種子のバッチ)のあいだの種間交配を行ってF1種子を産生した。SHの種子は、 Institute for Plant Genetics and Crop plant research, Gatersleben, Germanyにある遺伝子バンクから得た。一つのF1植物を自家受粉させてF2種子を得て、SLに戻し交配してBC1種子を得た。遺伝子連鎖マップの構築のためにF2種子を最初に用いた。ILを作製するためにBC1種子を用いた(図6)。
1 mlマイクロチューブ(Micronic BV, Lelystad, The Netherlands)を用いるハイスループットDNA単離のために適合させたSteward et al.(1993)によるCTABに基づくプロトコールを用いて、Retsch 300 mmシェーカー(Retsch BV, Ochten, The Netherlands)を最高速度で用いてすりつぶした2枚の若い葉(巻いた葉)から、ゲノムDNAを単離した。
それぞれの戻し交配およびILに関する遺伝子型図を、ソフトウェアプログラムGGT(van Berloo, 1999)を用いて得た。遺伝子移入サイズおよびゲノムパーセンテージの計算に関して、マーカー遺伝子座に隣接する半分の間隔は、GGTソフトウェアによって実行されるのと同じ遺伝子移入のものであると推定された。欠如マーカーデータは、隣接するマーカーから推定した;これらは、同一の遺伝子型を有する場合、二つの隣接するマーカーの同じ遺伝子型を有すると仮定された。二つの隣接するマーカーが対照的な遺伝子型を有した場合、データは欠如と記録された。
耐性を査定するために、不完全な無作為化ブロック16個を、各ILに関して計11の複製物について用いた。それぞれのブロックはSE植物少なくとも2個体とS. リコペルシカム栽培品種Durinta植物1個体を含んだ。Durintaは、保存寿命が長く、(高くはないが)一定レベルの耐性を示す房トマトを産生する、商業栽培品種である。播種後6週間で、植物を完全な土壌区画に移植して、夜間15℃/昼間19℃および照明期間16時間のレジメで生育させた。11週間後、キッチンナイフを用いておよそ15 mmの二つの病変をそれぞれの植物の茎に作製した。それぞれの傷にB. シネレアB05.10を含有する1 cm2の栓状寒天を接種して(Benito et al (1998))、テープで閉じた。2回目の接種は2週間後に行った。試験のあいだ、夜間の湿潤気候を維持するために、夕方の始めに植物に水をやった。病気の進行を接種後9、12、および22日目にカリパスを用いて測定した。病気の進行は以下のパラメータに従って記載した:12日後の補正病変サイズ(LS)(すなわち、病変の全長-傷15 mm)、派生病変の割合(DI)、ならびに9日目および12日目に測定した補正病変サイズの差として表記する、病変増殖速度(mm/日)。
統計分析は、SPSS 12.0ソフトウェアパッケージ(SPSS Inc, Chicago, U.S.A.)を用いて行った。一般的な線形モデル(GLM)技法を用いて、それぞれのIL/形質に関する平均値を推定した。測定された形質の平均値を、Dunnett検定(Dunnett、1955)を用いて対照の遺伝子型SLと比較して、0.05未満の確率は有意であると見なされた。LGおよびLSを分析するために平方根変換を適用し、双方の形質に関するデータを標準化した。形質間の相関は、Pearson相関係数を用いて計算した。
IL集団
S. リコペルシカム栽培品種Moneymaker(SL)の遺伝的バックグラウンドにおけるS. ハブロカイテスLYC 4/78(SH)の遺伝子移入系統(IL)集団を作製した。SLとSHの交配に由来するF1植物1個体をSLに戻し交配した(図6)。次に、無作為な組のBC1植物14個体をSLと戻し交配してBC2子孫(n=59)を得た。全BC2植物の遺伝子型決定を行い、選択された組をSLと戻し交配した。この組を、遺伝子移入の組み合わせにより、できるだけ多くのSHゲノムがカバーされるような様式で選択し、一方で、それぞれの異質の染色体が三つのILによって表されるような様式で組み換え体を選択した。選択および戻し交配のこのプロセスをBC5まで繰り返した。主に一つまたは二つの遺伝子移入を含有する選択された31個体のBC5植物を自家受粉させた。31個のBC5S1ファミリーそれぞれの植物最大12個体を自家受粉させてAFLPマーカーによってスクリーニングし、遺伝子移入に関してホモ接合性であるBC5S2子孫(n=44)を得た。IL 44個のマーカーをもう一度スクリーニングし、IL 30個の中心となる組(core set)を選択した。この中心となる組は、できるだけ少ないILにおいて最大範囲のSHゲノムを含むことを表す(図7)。中心となる組は、一つの遺伝子移入を保有するIL 15個、二つの遺伝子移入を含むIL 10個、三つの遺伝子移入を含むIL 4個からなるが、一つのILは四つのホモ接合遺伝子移入をさらに含有した。平均で、それぞれのILはSHゲノム60 cM(=5.2%)を含み、遺伝子移入の長さは20(1.7%)から122 cM(10.6%)まで変化した。本発明者らのIL集団は、元のF2連鎖マップの長さの95%をカバーする。しかし本発明者らは、このF2連鎖マップがゲノムを完全にカバーするものではないことを認識している。これは、第3染色体(短腕の上部)、第4染色体(短腕の上部)、第5染色体(長腕)、および第9染色体(短腕の上部)に関するさらなるCAPS分析によって図示され、ここで、CAPSマーカーは遺伝子移入を明らかにしたがAFLPに基づくF2連鎖マップにおけるマーカーは存在しなかった(Tanksley et al. 1992;http://www.sgn.cornell.edu)。これまでのスクリーニングは、第3染色体の上部に関して適用されなかったことから、この領域に関するILはヘテロ接合性である。IL 5-1および5-2に関してホモ接合SHであると選択された植物は種子を作ることができず、したがってこれらの系統はそのヘテロ接合状態で維持された。第8染色体の短腕の上部および第2染色体の長腕の下部を含有するILは存在しなかった。第7染色体および第9染色体の短腕の上部での遺伝子移入は、多数のILに存在する。第9染色体の上部に関する選択は、この領域に対して特異的なCAPSマーカーが開発された後に限って可能であった。
30 ILの集団を、不完全な無作為化ブロック設計において11個の複製物として生育させ、接種し、病気の症状に関して評価した。一組の相当な耐性および感受性を有する対照を試験に含めた。接種後9、12、および22日目に、疾患の進行を測定して、以下の三つのパラメータを採点することによって評価した:外部増殖感染の機会、または発病率(DI)、補正された外部増殖病変サイズ(LS)、および病変増殖速度(LG)。耐性親SHはいかなる症状もほとんど示さなかったが(表8、表9)、SL病変の73%は外部増殖していた。
a 測定可能な病変の初回観察は12日後であった。b 測定せず。
個々のIL系統に存在する様々な遺伝子移入を分析して(図7)、表9に示されるようにそれらを耐性に対するその個々の効果と比較する場合、積み重ねの効果が推測されうる。9-1、9-2、11-2、および12-3系統において見いだされうるように、遺伝子移入の積み重ねは効果を有する可能性がある。
温室でのバイオアッセイを用いて、本発明者らは、B. シネレアに対する耐性の増加の原因となる遺伝子移入を含有する一連のILを同定した。第2、4、および6染色体に存在する三つの領域は、耐性の増加に関する遺伝子を明白に含有する。他のILは多数の遺伝子移入を含有し、これによって、耐性遺伝子の目標を正確に定めることがより難しくなる。IL 9-2は第6および9染色体上で遺伝子移入を含有する。IL9-2における第6染色体での遺伝子移入は、SLと同等に感受性のあるILであるIL 6-3における第6染色体の遺伝子移入と類似している。したがって本発明者らは、IL 9-2の効果が、第6染色体ではなく第9染色体上での遺伝子移入によって引き起こされると予想する。IL 11-2は、IL 9-1に存在するよりも小さな第9染色体遺伝子移入を含有する。したがって、DI低下は、第11染色体上の遺伝子座によって引き起こされると予想される。二つのIL 1-4および12-3は、IL 9-2の第9染色体遺伝子移入と重複する遺伝子移入を含有する。IL 12-3のみがIL 9-2よりも有意に高い耐性を持つことは、第9染色体および第12染色体上での遺伝子移入の複合効果を示唆している。IL 1-4および11-2はIL 9-2よりも有意に高い耐性を持たないことから、本発明者らは、これらの二つの系統における耐性が第9染色体の遺伝子移入の結果である可能性を除外できない。
QTLが最初に欠如していた理由についての考えられる解釈を見つけるために、遺伝子移入とB. シネレアに対する耐性の増加とのあいだに関連が認められる全ての領域に関して、元のF2データセットを確認した。マーカーデータおよびQTL分析からの結果の双方のひずみ度を確認した。第1染色体(1:6:6)、第2染色体(1:3:2)および第9染色体(1:6)上での遺伝子移入は、予想される1:2:1または1:3比から有意に逸脱していた。三つ全ての領域に関して、ホモ接合S. リコペルシカム対立遺伝子の欠如が観察される。インターバルマッピングおよびクラスカル・ウォリス技法を用いる単一マーカー分析の双方に関するQTL分析データを確認したが、第6、9、11、および12染色体上でF2集団のデータセットにおける有意なQTLの存在に関する証拠は見いだされなかった。
以下の表は、様々な連鎖マップにおいて示されかつ本発明のQTLとの関連に関して示される、様々なRFLPおよびCOS-IIマーカーに関する詳細な情報を提供する。情報は、Cornell UniversityをホストとするSOL Genomic Network(SGN)データベースの2005年10月7日バージョンから直接複写した。
* SL=ソラナム・リコペルシカム、SH=ソラナム・ハブロカイテス。ヘテロ接合植物において、SLおよびSHの双方の消化産物が見いだされる。表30および表31の双方において、観察されたPCR産物長はアガロースゲルバンドから推定する。
Claims (15)
- (a) ソラナム・ハブロカイテスLYC 4/78系統のボトリチス耐性植物である、ボトリチス耐性ドナートマト植物を提供する段階;
(b) ドナー植物からの核酸を一つまたは複数のボトリチス感受性レシピエントソラナム・リコペルシカムトマト植物に移入する段階であって、該移入によって、一つまたは複数のレシピエント植物の対応するゲノム領域にドナー植物からのゲノム物質が導入される、段階;
(c) ボトリチス耐性ドナートマト植物に由来するボトリチス耐性に関する少なくとも一つのQTLをそのゲノム中に含む植物を、レシピエントトマト植物の中から選択する段階であって、該選択が、ボトリチス耐性に関する少なくとも一つのQTLに連鎖する遺伝子マーカーのセットを用いて、該QTLを該レシピエントトマト植物の第4、6、9、11、および/または12染色体上で検出することを含む、段階
を含む、ボトリチス耐性トマト植物を産生する方法であって、
- 該植物の第4染色体上のQTLは、第4染色体上の66.9〜125.3cM間に位置し、該QTLは、S. ハブロカイテスの第4染色体上またはS. リコペルシカムの第4染色体上の遺伝子マーカーCT50、C2At1g74970、P14M49-283e、P14M48-74e、P14M50-67e、CT173、およびP14M50-85hのセットによって検出され、
- 該植物の第6染色体上のQTLは、第6染色体上の0.0〜37.6cM間に位置し、該QTLは、S. ハブロカイテスの第6染色体上またはS. リコペルシカムの第6染色体上の遺伝子マーカーP22M50-188h、P14M48-521e、P15M48-386h、P18M51-199h、P18M51-103h、P22M50-103e、P18M51-388e、P15M48-395e、P22M50-124e、P14M48-160e、およびP22M50-513hのセットによって検出され、
- 該植物の第9染色体上のQTLは、第9染色体上の5.2〜32.4cM間に位置し、該QTLは、S. ハブロカイテスの第9染色体上またはS. リコペルシカムの第9染色体上の遺伝子マーカーP18M50-141、P14M49-240、TG254、TG223、TG10、P18M50-134h、P14M49-243h、P18M50-599、P14M60-222h、P22M51-417h、P14M50-174h、P14M60-157h、P14M60-107h、P15M48-138h、P14M48-113h、Tm2a、P18M51-146h、P14M48-282h、およびP14M50-276hのセットによって検出され、
- 該植物の第11染色体上のQTLは、第11染色体上の21.6〜93.1cM間に位置し、該QTLは、S. ハブロカイテスの第11染色体上またはS. リコペルシカムの第11染色体上の遺伝子マーカーP14M60-215e、P14M61-173h、P14M50-307h、TG47、P18M51-358h、P18M51-136h、P22M50-488h、TG393、P14M61-396h、P22M51-235h、およびP22M51-174eのセットによって検出され、および/または
- 該植物の第12染色体上のQTLは、第12染色体上の14.3〜89.7cM間に位置し、該QTLは、S. ハブロカイテスの第12染色体上またはS. リコペルシカムの第12染色体上の遺伝子マーカーCT19、TG68、P14M48-411e、P18M50-244h、P18M50-273h、P14M61-420h、P14M61-406h、P14M61-223h、P14M60-193h、P22M51-314h、TG565、P14M48-172h、P22M50-321e、P14M60-219e、P14M48-153h、P22M50-97h、TG296、P22M50-131h、およびP22M51-135hのセットによって検出され、
ボトリチス耐性に関する少なくとも一つのQTLを含む核酸の移入が、ボトリチス耐性ドナートマト植物をボトリチス感受性レシピエントS. リコペルシカムトマト植物と交配させることによって、プロトプラスト融合によって、ダブルハプロイド技術によって、または胚救出によって行われる、方法。 - ボトリチス耐性に関する少なくとも一つのQTLを含む核酸の移入が、遺伝子移入として該QTLを含む子孫植物を産生するためにボトリチス耐性ドナートマト植物をボトリチス感受性レシピエントソラナム・リコペルシカムトマト植物と交配させることによって行われ、かつ段階(c)が一つまたは複数の子孫植物に対して行われる、請求項1記載の方法。
- 段階(c)が、レシピエントトマト植物から単離されたDNA中の遺伝子マーカーを検出することによって行われる、請求項1〜2のいずれか一項記載の方法。
- 段階(c)が、植物におけるボトリチス耐性を測定するためのバイオアッセイに植物を供することをさらに含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
- 段階(c)において選択された植物を栽培トマト系統の植物と交配させて子孫植物を産生する段階(d)をさらに含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
- ボトリチス耐性が予想されるトマト植物の第4、6、9、11および/または12染色体上のソラナム・ハブロカイテスLYC 4/78に由来するボトリチス耐性に関するQTLに連鎖する遺伝子マーカーのセットを用いて、該QTLを検出する段階を含む、ボトリチス耐性に関するQTLを検出するための方法であって:
- 該植物の第4染色体上のQTLは、第4染色体上の66.9〜125.3cM間に位置し、該QTLは、S. ハブロカイテスの第4染色体上またはS. リコペルシカムの第4染色体上の遺伝子マーカーCT50、C2At1g74970、P14M49-283e、P14M48-74e、P14M50-67e、CT173、およびP14M50-85hのセットによって検出され、
- 該植物の第6染色体上のQTLは、第6染色体上の0.0〜37.6cM間に位置し、該QTLは、S. ハブロカイテスの第6染色体上またはS. リコペルシカムの第6染色体上の遺伝子マーカー P22M50-188h、P14M48-521e、P15M48-386h、P18M51-199h、P18M51-103h、P22M50-103e、P18M51-388e、P15M48-395e、P22M50-124e、P14M48-160e、およびP22M50-513hのセットによって検出され、
- 該植物の第9染色体上のQTLは、第9染色体上の5.2〜32.4cM間に位置し、該QTLは、S. ハブロカイテスの第9染色体上またはS. リコペルシカムの第9染色体上の遺伝子マーカーP18M50-141、P14M49-240、TG254、TG223、TG10、P18M50-134h、P14M49-243h、P18M50-599、P14M60-222h、P22M51-417h、P14M50-174h、P14M60-157h、P14M60-107h、P15M48-138h、P14M48-113h、Tm2a、P18M51-146h、P14M48-282h、およびP14M50-276hのセットによって検出され、
- 該植物の第11染色体上のQTLは、第11染色体上の21.6〜93.1cM間に位置し、該QTLは、S. ハブロカイテスの第11染色体上またはS. リコペルシカムの第11染色体上の遺伝子マーカーP14M60-215e、P14M61-173h、P14M50-307h、TG47、P18M51-358h、P18M51-136h、P22M50-488h、TG393、P14M61-396h、P22M51-235h、およびP22M51-174eのセットによって検出され、および/または
- 該植物の第12染色体上のQTLは、第12染色体上の14.3〜89.7cM間に位置し、該QTLは、S. ハブロカイテスの第12染色体上またはS. リコペルシカムの第12染色体上の遺伝子マーカーCT19、TG68、P14M48-411e、P18M50-244h、P18M50-273h、P14M61-420h、P14M61-406h、P14M61-223h、P14M60-193h、P22M51-314h、TG565、P14M48-172h、P22M50-321e、P14M60-219e、P14M48-153h、P22M50-97h、TG296、P22M50-131h、およびP22M51-135hのセットによって検出される、方法。 - ボトリチス耐性に関連するソラナム・ハブロカイテスLYC 4/78系統の第4、6、9、11および12染色体上のQTLからなる群より選択される、少なくとも一つのQTLをそのゲノム内に含む、ソラナム・リコペルシカム種のボトリチス耐性植物またはその植物の、花粉、胚珠、葉、胚、根、根の先端、葯、花、果実、茎のシュート、および種子からの単細胞および組織、花粉、胚珠、葉、胚、根、根の先端、葯、花、果実、茎、シュート、接ぎ木、台木、種子、プロトプラスト、または、カルスであって、
- 該植物の第4染色体上のQTLは、第4染色体上の66.9〜125.3cM間に位置し、該QTLの存在が、S. ハブロカイテスの第4染色体上またはS. リコペルシカムの第4染色体上の遺伝子マーカーCT50、C2At1g74970、P14M49-283e、P14M48-74e、P14M50-67e、CT173、およびP14M50-85hのセットによって示され、
- 該植物の第6染色体上のQTLは、第6染色体上の0.0〜37.6cM間に位置し、該QTLの存在が、S. ハブロカイテスの第6染色体上またはS. リコペルシカムの第6染色体上の遺伝子マーカー P22M50-188h、P14M48-521e、P15M48-386h、P18M51-199h、P18M51-103h、P22M50-103e、P18M51-388e、P15M48-395e、P22M50-124e、P14M48-160e、およびP22M50-513hのセットによって示され、
- 該植物の第9染色体上のQTLは、第9染色体上の5.2〜32.4cM間に位置し、該QTLの存在が、S. ハブロカイテスの第9染色体上またはS. リコペルシカムの第9染色体上の遺伝子マーカーP18M50-141、P14M49-240、TG254、TG223、TG10、P18M50-134h、P14M49-243h、P18M50-599、P14M60-222h、P22M51-417h、P14M50-174h、P14M60-157h、P14M60-107h、P15M48-138h、P14M48-113h、Tm2a、P18M51-146h、P14M48-282h、およびP14M50-276hのセットによって示され、
- 該植物の第11染色体上のQTLは、第11染色体上の21.6〜93.1cM間に位置し、該QTLの存在が、S. ハブロカイテスの第11染色体上またはS. リコペルシカムの第11染色体上の遺伝子マーカーP14M60-215e、P14M61-173h、P14M50-307h、TG47、P18M51-358h、P18M51-136h、P22M50-488h、TG393、P14M61-396h、P22M51-235h、およびP22M51-174eのセットによって示され、および/または
- 該植物の第12染色体上のQTLは、第12染色体上の14.3〜89.7cM間に位置し、該QTLの存在が、S. ハブロカイテスの第12染色体上またはS. リコペルシカムの第12染色体上の遺伝子マーカーCT19、TG68、P14M48-411e、P18M50-244h、P18M50-273h、P14M61-420h、P14M61-406h、P14M61-223h、P14M60-193h、P22M51-314h、TG565、P14M48-172h、P22M50-321e、P14M60-219e、P14M48-153h、P22M50-97h、TG296、P22M50-131h、およびP22M51-135hのセットによって示される、
植物またはその植物の、花粉、胚珠、葉、胚、根、根の先端、葯、花、果実、茎のシュート、および種子からの単細胞および組織、花粉、胚珠、葉、胚、根、根の先端、葯、花、果実、茎、シュート、接ぎ木、台木、種子、プロトプラスト、または、カルス。 - 以下の段階を含む、ボトリチス耐性近交系トマト植物を産生する方法:
(a) 請求項1〜5のいずれか一項記載の方法によってボトリチス耐性トマト植物を産生する段階;
(b) 該ボトリチス耐性トマト植物をそれ自身とまたは別のトマト植物と交配させて、子孫トマト種子を得る段階;
(c) 該子孫トマト植物種子を生育させて、さらなるボトリチス耐性トマト植物を得る段階;
(d) 交配および生育段階を0〜7回繰り返して、ボトリチス耐性近交系トマト植物を作製する段階。 - 段階(c)が、ボトリチス耐性を示し、かつ、耐病性および害虫耐性から選択される商業的に望ましい特徴を保有する植物を同定する段階をさらに含む、請求項8記載の方法。
- ホモ接合近交系トマト植物を選択する段階をさらに含む、請求項8または9記載の方法。
- 近交系植物である、請求項7記載のソラナム・リコペルシカム種のボトリチス耐性植物。
- ハイブリッド植物である、請求項7記載のソラナム・リコペルシカム種のボトリチス耐性植物。
- 請求項7、11または12のいずれか一項記載のトマト植物の再生可能な細胞の組織培養物。
- 該再生可能な細胞が、葉、花粉、胚、根、根の先端、葯、花、果実、茎および種子からなる群より選択される組織から単離された細胞またはプロトプラストを含む、請求項13記載の組織培養物。
- ボトリチス耐性に関するQTLを検出するための、および/またはボトリチス耐性トマト植物を検出するための、第4、6、9、11、および/または12染色体上の遺伝子マーカーのセットの使用であって、
遺伝子マーカーのセットは、ソラナム・ハブロカイテスの第4染色体上またはソラナム・リコペルシカムの第4染色体上の66.9〜125.3cM間のQTLを検出するための遺伝子マーカーCT50、C2At1g74970、P14M49-283e、P14M48-74e、P14M50-67e、CT173、およびP14M50-85hを含み、
遺伝子マーカーのセットは、S. ハブロカイテスの第6染色体上またはS. リコペルシカムの第6染色体上の0.0〜37.6cM間のQTLを検出するための遺伝子マーカーP22M50-188h、P14M48-521e、P15M48-386h、P18M51-199h、P18M51-103h、P22M50-103e、P18M51-388e、P15M48-395e、P22M50-124e、P14M48-160e、およびP22M50-513hを含み、
遺伝子マーカーのセットは、S. ハブロカイテスの第9染色体上またはS. リコペルシカムの第9染色体上の5.2〜32.4cM間のQTLを検出するための遺伝子マーカーP18M50-141、P14M49-240、TG254、TG223、TG10、P18M50-134h、P14M49-243h、P18M50-599、P14M60-222h、P22M51-417h、P14M50-174h、P14M60-157h、P14M60-107h、P15M48-138h、P14M48-113h、Tm2a、P18M51-146h、P14M48-282h、およびP14M50-276hを含み、
遺伝子マーカーのセットは、S. ハブロカイテスの第11染色体上またはS. リコペルシカムの第11染色体上の21.6〜93.1cM間のQTLを検出するための遺伝子マーカーP14M60-215e、P14M61-173h、P14M50-307h、TG47、P14M50-29xCD、P18M51-358h、P18M50-27xCD、P18M51-136h、P22M50-488h、TG393、P14M61-396h、P22M51-235h、およびP22M51-174eを含み、および/または
遺伝子マーカーのセットは、S. ハブロカイテスの第12染色体上またはS. リコペルシカムの第12染色体上の14.3〜89.7cM間のQTLを検出するための遺伝子マーカーCT19、TG68、P14M48-411e、P18M50-244h、P18M50-273h、P14M61-420h、P14M61-406h、P14M61-223h、P14M60-193h、P22M51-314h、TG565、P14M48-172h、P22M50-321e、P14M60-219e、P14M48-153h、P22M50-97h、TG296、P22M50-131h、およびP22M51-135hを含む、使用。
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