CN116004900A - 一种用于鉴定番茄耐铝基因型的分子标记at12及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及番茄耐铝技术领域,具体涉及一种用于鉴定番茄耐铝基因型的分子标记AT12及其应用。该分子标记是以番茄SL2.50基因组版本为参考基因,位于12号染色体上第1338779位点,多态性为G/A,该分子标记可以有效筛选当前番茄资源中的耐铝资源,同时可以结合常规育种手段将番茄耐铝主效控制基因快速准确地导入到优良番茄亲本中,创建新的耐铝种质资源,培育抗逆新品种。
Description
技术领域
本发明涉及番茄耐铝技术领域,具体涉及一种用于鉴定番茄耐铝基因型的分子标记AT12及其应用。
背景技术
铝(Al)是土壤中含量最丰富的金属元素之一,约占8%,虽然在中性和碱性条件下,铝存在于氧化物或氢氧化物中是无毒的,但当土壤pH低于5.5时,铝的溶解度急剧增加,溶解后的铝对大多数植物具有高毒性,部分三价铝离子(Al3+)被溶解出抑制植物根的生长,进而影响作物的生长发育,最终导致作物减产。因此,铝毒是作物在酸性土壤中的主要限制因子,也是仅次于干旱的第二大非生物逆境,并且随着过度频繁的耕作和氮肥的过度使用,土壤有进一步酸化的趋势,这也使得铝毒问题变得日益严重。
在农业上,通常靠在酸性土壤中施加生石灰来缓解铝毒,然而这种方法只能改良表层土壤,并不能改变深层土壤的pH值,且需要耗费大量的财力和人力。而植物在酸性的铝毒性土壤中生存,在发育的过程中会发生许多复杂的应对机制,这主要是由响应Al胁迫的转录调控控制的。因此,在降低土壤酸度的同时,挖掘植物自身的抗铝潜力,获得耐铝能力强的植物品种,或者利用基因工程手段增加植物的耐铝能力是解决酸性土壤中铝毒害和农业生产可持续发展的有效策略。
番茄是一种丰富的营养来源和肉质果实发育的模式植物,是重要的蔬菜作物之一。目前,番茄耐铝育种仍处于起步阶段,且主要使用的是常规育种方法,常规育种方法不仅耗时、准确度差,还易受环境干扰。分子标记辅助育种是利用分子标记与决定目标性状基因紧密连锁的特点,通过检测分子标记,达到选择目的性状的目的,具有快速、准确、不受环境条件干扰的优点,而目前关于番茄耐铝相关的分子标记鲜有报道。
发明内容
基于此,本发明通过对450余份番茄资源进行分析,首次发现了可用于番茄耐铝性鉴定的通用型分子标记,该标记是以番茄SL2.50基因组版本为参考基因,位于12号染色体上第1338779位点,多态性为G/A。其中G为基因组序列,A为突变碱基。该分子标记可以有效筛选当前番茄资源中的耐铝资源,同时可以结合常规育种手段将耐铝主效控制基因快速准确地导入到优良番茄亲本中,创建新的抗逆种质资源,选育抗逆新品种,具有重要的应用前景。
本发明的目的还在于保护用于扩增上述分子标记AT12的引物。
作为一种优选的实施方式,所述引物包括如SEQ ID NO:3所示的正向外引物,如SEQ ID NO:4所示的反向外引物,如SEQ ID NO:5所示的正向内引物,如SEQ ID NO:6所示的反向内引物。
本发明的目的还在于保护一种用于鉴定番茄耐铝基因型的试剂盒,该试剂盒包含上述引物。
本发明的目的还在于保护一种用于鉴定番茄耐铝基因型的方法,包括以下步骤:提取待测番茄样本的总DNA,以待测番茄的总DNA为模板,以序列如SEQ ID NO:3~6所示的特异性引物进行扩增,根据扩增片段的长度进行判定;
其中,扩增出199bp和439bp大小条带的为耐铝基因型,扩增出295bp和439bp大小条带的为不耐铝基因型,扩增出199bp、295bp、439bp大小条带的为杂合基因型。
作为一种优选的实施方式,扩增时的体系为:2×Tag mix 9.6μL、外引物各0.4μL,内引物各0.6μL,DNA模板1μL、ddH2O 7.4μL。
作为一种优选的实施方式,扩增时的程序为:94℃预变性3min,94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s、36个循环,72℃延伸5min,冷却至15℃。
本发明的目的还在于保护上述分子标记、引物在鉴定番茄耐铝基因型中的应用。
本发明的目的还在于保护上述分子标记、引物在选育耐铝番茄品种中的应用。
本发明的目的还在于保护上述分子标记、引物在培育耐铝番茄品种中的应用。
附图说明
图1A、1B为实施例1中全基因组关联分析解析结果;
图1C为实施例1中12号染色体上的显著位点上下游200kb的解析结果;
图1D为GG、GA、AA三种基因型植株地上部的铝含量;
图1E为极端高材料和极端低材料的测序结果比较;
图2A为实施例3种四种材料的株高比较;
图2B为实施例3种四种材料的根长比较;
图2C为实施例3种四种材料的表型图片;
图3为实施例4中的部分检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明,以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。
以下各实施例,仅用于说明本发明,但不止用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下,所获得的其他所有实施例,都属于本发明的保护范围。
在本发明实施例中,若无特殊说明,所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品;在本发明实施例中,若未具体指明,所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1与番茄耐铝紧密相关的SNP位点的获得
利用450余份番茄重测序核心种质材料进行种植,针对苗期的番茄植株进行取样、消解、烘干、磨样以及铝离子测定,利用全基因组关联分析解析了番茄铝离子变异遗传基础,在12号染色体上检测到了1个显著位点,具体可参见图1A,B。在该显著位点上下游200kb进行分析,发现了SL2.50ch12:1338779处有个SNP极为显著,参见图1C。
随后,我们在该位点上下游设计引物,分别选择3个极端高材料和极端低材料为模板进行PCR,通过测序发现,极端高材料在该SNP位点均有G到A的突变,参见图1E,进一步对所有样本在该位点的基因型及地上部分铝离子测定结果进行分析,结果如图1D所示,其中该位点基因型为AA的材料其地上部分铝含量普遍高于基因型为GA的材料,基因型为GA的材料地上部分铝含量普遍高于基因型为GG的材料。极端高材料的基因序列如SEQ ID NO:1所示,极端低材料的基因序列如SEQ ID NO:2所示。
SEQ ID NO:1:CTATATAGTTTAAAGAGTTAAAAAAACATTTTATCA TTATTTTCGAAAGTTTCGTACCTTAACTATTCATTGTTCTCTTTTTTTACCCTCCATCACTTTGATGCTGAATTAGCCAAATATTTGTTTCCAATTGACTACAAACATGCGTACACTGATTCAACATCGAAGCGTGTTTTAATACTATAGTTATACCAGACCAACCTTTGTAGTATTTGCCTAGATGGATTCAGAATTTAATGTTTAAATATTTTGAACCACGACCTCTTTTCTATTTATTAAGTTTTGAATAGATACAAACAGATACAGAATTTGGACCAAAACTATTGAGTCATGACTTGTGTCAAAACTTGTAACTTCAACAGTAAATCCAGCCATATGCATACATCAATTGTATCAAAAAACAATAAAACTGTGATGTAAGTAAGTGCAACCAAATAACAGTTACATATCAAATGTAATCCGACAAGTGGAGTCTAAAGAAGGTAGAGTGTACGTAGACCTTACCCCGACCTCGTGGAGGTAGAGATAGAGAAACTGTTTCCGATACTTTGCGTTTACCTAGTGCAAGTGAGTGCAACCAAATGACTTATCTTTTTAAAAAGCCAAAAGAATAAGTAAATGGTAGTAGCAAGTCACTTAGCACAGCTTTGGGAAATAGTTGAAAATGTGAACATGATGCCTTGTGGCATCTCCCTATATACATCCATATTCCAAGACACAAAATCCTTACACTAAAGAAACAGGACATGCATGTTTCCTTTTTTTACTTCTTCACGAAATAAAAACCGCGTGAATGAGAACTAAAATGGTTCTTTCTATCGATCAAGATCAAATTAGCAAGAAACGAGACAGGTGGGGGGTTTAACGAGGCCTGGAATATTAGAAGGAACAGTAACAGGTTCATACTTGGCAGCAATTTCCAGACGCTCCCATGTCAACCTTCGTCTCTCCGCT;
SEQ ID NO:2:CTATATAGTTTAAAGAGTTAAAAAAACATTTTATCATTATTTTCGAAAGTTTCGTACCTTAACTATTCATTGTTCTCTTTTTTTACCCTCCATCACTTTGATGCTGAATTAGCCAAATATTTGTTTCCAATTGACTACAAACATGCGTACACTGATTCAACATCGAAGCGTGTTTTAATACTATAGTTATACCAGACCAACCTTTGTAGTATTTGCCTAGATGGATTCAGAATTTAATGTTTAAATATTTTGAACCACGACCTCTTTTCTATTTATTAAGTTTTGAATAGATACAAACAGATACAGAATTTGGACCAAAACTATTGAGTCATGACTTGTGTCAAAACTTGTAACTTCAACAGTAAATCCAGCCATATGCATACATCAATTGTATCAAAAAACAATAAAACTGTGATGTAAGTAAGTGCAACCAAATAACAGTTACATATCAAATGTAATCCGACAAGTGGAGTCTAGAGAAGGTAGAGTGTACGTAGACCTTACCCCGACCTCGTGGAGGTAGAGATAGAGAAACTGTTTCCGATACTTTGCGTTTACCTAGTGCAAGTGAGTGCAACCAAATGACTTATCTTTTTAAAAAGCCAAAAGAATAAGTAAATGGTAGTAGCAAGTCACTTAGCACAGCTTTGGGAAATAGTTGAAAATGTGAACATGATGCCTTGTGGCATCTCCCTATATACATCCATATTCCAAGACACAAAATCCTTACACTAAAGAAACAGGACATGCATGTTTCCTTTTTTTACTTCTTCACGAAATAAAAACCGCGTGAATGAGAACTAAAATGGTTCTTTCTATCGATCAAGATCAAATTAGCAAGAAACGAGACAGGTGGGGGGTTTAACGAGGCCTGGAATATTAGAAGGAACAGTAACAGGTTCATACTTGGCAGCAATTTCCAGACGCTCCCATGTCAACCTTCGTCTCTCCGCT。
根据该SNP位点进行分子标记分型引物的设计,设计的ARMS-PCR引物中,正向外引物的序列如SEQ ID NO:3所示,反向外引物的序列如SEQ IDNO:4所示,正向内引物的序列如SEQ ID NO:5所示,反向内引物的序列如SEQ ID NO:6所示。
正向外引物:5’-TTTGCCTAGATGGATTCAGAATTTAATG-3’(SEQ IDNO:3);
反向外引物:5’-CAAAGCTGTGCTAAGTGACTTGCTACTA-3’(SEQ IDNO:4);
正向内引物:5’-AATGTAATCCGACAAGTGGAGTCGAA-3’(SEQ ID NO:5);反向内引物:5’-GGGTAAGGTCTACGTACACTCTACCTTATC-3’(SEQ IDNO:6)。
扩增全长为439bp,若该SNP位点有G到A的突变时,会出现199bp和439bp的条带,若无突变时,则会出现295bp和439bp的条带,若为杂合,则会出现199bp、295bp和439bp的条带,该标记命名为AT12。
扩增的199bp的序列如SEQ ID NO:7所示,扩增的295bp的序列如SEQ ID NO:8所示。
SEQ ID NO:7:AATGTAATCCGACAAGTGGAGTCTAAAGAAGGTAG AGTGTACGTAGACCTTACCCCGACCTCGTGGAGGTAGAGATAGAGAAACTGTTTCCGATACTTTGCGTTTACCTAGTGCAAGTGAGTGCAACCAAATGACTTATCTTTTTAAAAAGCCAAAAGAATAAGTAAATGGTAGTAGCAAGTCACTTAGCACAGCTTTG;
SEQ ID NO:8:TTTGCCTAGATGGATTCAGAATTTAATGTTTAAATAT TTTGAACCACGACCTCTTTTCTATTTATTAAGTTTTGAATAGATACAAACAGATACAGAATTTGGACCAAAACTATTGAGTCATGACTTGTGTCAAAACTTGTAACTTCAACAGTAAATCCAGCCATATGCATACATCAATTGTATCAAAAAACAATAAAACTGTGATGTAAGTAAGTGCAACCAAATAACAGTTACATATCAAATGTAATCCGACAAGTGGAGTCTAGAGAAGGTAGAGTGTACGTAGACCTTACCC。
实施例2
本实施例提供一种耐铝番茄的鉴定方法,其是利用上述设计的分子标记的引物,对筛选出来的极端材料在番茄群体中进行鉴定,具体步骤如下:
提取番茄材料的DNA,以番茄基因DNA为模板,浓度为80~120ng/μL,采用实施例1中所述的分子标记及其引物进行扩增,其中,PCR反应总体积为20μL,具体成分如下:2×Tagmix 9.6μL、外引物各0.4μL,内引物各0.6μL,DNA模板1μL(100-200ng/μL)、ddH2O 7.4μL。
PCR反应程序为:94℃预变性3min,94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s、36个循环,72℃延伸5min,冷却至15℃。
凝胶电泳检测:将PCR产物用2%琼脂糖在100v电压条件下电泳40min,最终结果在凝胶成像***上显示。
基因分型的判断:扩增全长为439bp,若该SNP位点有G到A的突变时,会出现199bp和439bp的条带,对应的耐铝基因型,若无突变,则会出现295bp和439bp的条带,对应的为不耐铝基因型,若同时出现,199bp、295bp和439bp的条带,则为杂合基因型。
实施例3
选择TS-25、TS-181、TS-4、TS-9四种番茄材料(见Ye J,Wang X,Wang W,Yu H,AiG,Li C,Sun P,Wang X,Li H,Ouyang B,Zhang J,Zhang Y,Han H,Giovannoni JJ,Fei Z,Ye Z.Genome-wide association study reveals the genetic architecture of27agronomic traits in tomato.Plant Physiol.2021Aug3;186(4):2078-2092.doi:10.1093/plphys/kiab230.PMID:34618111;PMCID:PMC8331143.)进行正常营养液处理28天后,分别进行正常营养液和含有50mM AlCl3(PH=4.5左右)的营养液处理10天。四种材料在不同条件下的株高和根长情况如图2所示,其中2C为表型观察结果,图2A为株高统计结构,图2B为根长统计结果,由图可知,TS-4和TS-9两种材料在铝处理下株高显著变矮根长显著变短,而TS-25和TS-181在铝处理下株高和跟长没有明显变化,判定TS-4和TS-9两种材料为不耐铝材料,TS-25和TS-181两种材料为耐铝材料。其中营养液为:0.8mM Ca(NO3)2·4H2O,0.83mM KH2PO4·3H2O,0.75mM MgSO4·7H2O,1.5mM K NO3,11.6μM H3BO3,2.4μM MnSO4·H2O,0.2μM ZnSO47·H2O,0.1μM CuSO4·5H2O,0.1μMNaMoO4·2H2O,50μM FeSO4·7H2O,50μMEDTA-Na2。
提取上述四种材料的DNA,按照实施例2所述的方法进行检测,结果发现,TS-4和TS-9两种材料中均出现了295bp和439bp的条带,TS-25和TS-181两种材料种均出现了199bp和439bp的条带,分子标记检测结果与表型结果一致,说明该分子标记用于耐铝番茄和不耐铝番茄材料的判断准确可靠。
实施例4
选择180份实验室已经重测序的番茄TS群体材料(Ye et al.,2021),其中包括17份突变型(TS-8、TS-35、TS-37、TS-41、TS-56、TS-131、TS-133、TS-154、TS-162、TS-181、TS-182、TS-184、TS-196、TS-198、TS-218、TS-222、TS-233),161份野生型(TS-1、TS-2、TS-3等),2份杂合型(TS-38、TS-105),利用实施例2的方法对上述180份材料进行DNA的提取、PCR鉴定以及凝胶电泳检测,通过分析凝胶电泳成像***显示的跑胶分型结果进行分析,结果显示,该分子标记分析结果对比重测序结果,计算百分比得到,该标记鉴定番茄耐铝准确性达到89.4%。说明该标记具有一定的通用性和准确性,可以用于番茄耐铝材料的筛选。
在此有必要指出的是,以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明,并不是对本发明的技术方案的进一步的限制,本发明的方法仅为较佳的实施方案,并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于鉴定番茄耐铝基因型的分子标记AT12,其特征在于,所述分子标记AT12是以番茄SL2.50基因组版本为参考基因,位于12号染色体上第1338779位点,多态性为G/A。
2.用于扩增权利要求1所述的分子标记AT12的引物。
3.根据权利要求2所述的用于扩增权利要求1所述的分子标记AT12的引物,其特征在于,所述引物包括如SEQ ID NO:3所示的正向外引物,如SEQ ID NO:4所示的反向外引物,如SEQ ID NO:5所示的正向内引物,如SEQ ID NO:6所示的反向内引物。
4.一种用于鉴定番茄耐铝基因型的试剂盒,其特征在于,包括权利要求2或3所述的引物。
5.一种用于鉴定番茄耐铝基因型的方法,其特征在于,包括以下步骤:
提取待测番茄样本的总DNA,以待测番茄的总DNA为模板,以序列如SEQ ID NO:3~6所示的特异性引物进行扩增,根据扩增片段的长度进行判定;
其中,扩增出199bp和439bp大小条带的为耐铝基因型,扩增出295bp和439bp大小条带的为不耐铝基因型,扩增出199bp、295bp、439bp大小条带的为杂合基因型。
6.根据权利要求5所述的用于鉴定番茄耐铝基因型的方法,其特征在于,扩增时的体系为:2×Tag mix 9.6μL、外引物各0.4μL,内引物各0.6μL,DNA模板1μL、ddH2O 7.4μL。
7.根据权利要求5所述的用于鉴定番茄耐铝基因型的方法,其特征在于,扩增时的程序为:94℃预变性3min,94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s、36个循环,72℃延伸5min,冷却至15℃。
8.权利要求1所述的分子标记、权利要求2或3所述的引物在鉴定番茄耐铝基因型中的应用。
9.权利要求1所述的分子标记、权利要求2或3所述的引物在选育耐铝番茄品种中的应用。
10.权利要求1所述的分子标记、权利要求2或3所述的引物在培育耐铝番茄中的应用。
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CN202211719196.0A Pending CN116004900A (zh) | 2022-12-30 | 2022-12-30 | 一种用于鉴定番茄耐铝基因型的分子标记at12及其应用 |
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Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1849871A1 (en) * | 2006-04-25 | 2007-10-31 | De Ruiter Seeds R&D B.V. | Tomato plants having higher levels of resistance to Botrytis |
CN105624328A (zh) * | 2016-04-08 | 2016-06-01 | 山东寿光蔬菜种业集团有限公司 | 鉴定番茄叶霉病抗性的高通量分子标记及其标记方法与应用 |
CN107058342A (zh) * | 2017-06-21 | 2017-08-18 | 华中农业大学 | 调控番茄果实苹果酸积累的关键基因SlALMT9的克隆及应用 |
CN108271389A (zh) * | 2015-05-20 | 2018-07-10 | 拉瓦尔大学 | 具有增加的硅摄取的植物 |
CN109234422A (zh) * | 2017-07-03 | 2019-01-18 | 华中农业大学 | 一种与番茄耐盐性紧密连锁的分子标记及应用 |
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2022
- 2022-12-30 CN CN202211719196.0A patent/CN116004900A/zh active Pending
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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