KR101438532B1

KR101438532B1 - Pharmaceutical compositions for pregnosing or treating degenerative brain disease and method for screening the same

Info

Publication number: KR101438532B1
Application number: KR1020120089402A
Authority: KR
Inventors: 이창준; 조선미; 윤보은; 추현아; 김지윤; 김대수
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2011-08-18
Filing date: 2012-08-16
Publication date: 2014-09-12
Also published as: KR20140058480A; KR20130020949A

Abstract

본 발명은 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 일 구체예에 따른 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 후보 물질의 스크리닝 방법에 의하면, 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료 물질을 효과적으로 스크리닝할 수 있으며, 이에 따른 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 여러 퇴행성 뇌질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.The present invention relates to a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of degenerative brain diseases and a method for screening the same. According to the method for screening candidate substances for preventing or treating degenerative brain diseases according to one embodiment, a pharmaceutical composition for preventing or treating degenerative brain diseases can be effectively screened for a substance for preventing or treating degenerative brain diseases Several degenerative brain diseases can be effectively prevented or treated.

Description

퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이의 스크리닝 방법{Pharmaceutical compositions for pregnosing or treating degenerative brain disease and method for screening the same}TECHNICAL FIELD The present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating degenerative brain diseases and a method for screening the same,

본 발명은 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of degenerative brain diseases and a method for screening the same.

알츠하이머 병(Alzheimer's disease)를 비롯한 퇴행성 뇌질환은 대체로 기억력과 인지기능의 장애, 행동능력의 장애를 유발하며, 특히, 알츠하이머병은 수년 이상의 기간을 두고 점진적으로 악화되는 만성적 질환으로서, 환자뿐만 아니라 주위 가족들에게도 심각한 정신적 고통과 막대한 의료비 지출 등 여러 문제를 야기하고 있다. 하지만 현재까지 개발된 치료제들은 단지 일시적으로 증상만 완화시킬 뿐이므로, 병을 근본적으로 치료하거나 진행을 억제하는 약물의 개발이 절실히 요구되고 있다.Degenerative brain diseases including Alzheimer ' s disease generally cause disturbances in memory and cognitive functioning and behavioral disorders, and in particular, Alzheimer's disease is a chronic disease progressively worsening over a period of several years, It also causes serious problems such as serious mental suffering and huge medical expenses for the family. However, since the therapeutic agents developed so far only temporarily alleviate the symptoms, it is urgently required to develop a drug that essentially cures or inhibits the progress of the disease.

알츠하이머 병을 예로 들면, 현재까지 치료제 개발의 주 표적은 알츠하이머병에서 나타나는 신경전달물질로서, 특히 콜린성 신경세포를 표적으로 한 콜린에스테라제 억제제들(Aricept, Exelon, Reminyl 등)이 현재 시판 중이다. 최근 FDA 승인된 글루타메이트 수용체의 길항제인 메만틴(memantine)도 대표적 신경전달물질인 글루타메이트를 표적으로 한다. 하지만 이들 약물도 병의 진행 자체를 근원적으로 막을 수는 없으며, 최근에는 알츠하이머병의 주요 특징인 아밀로이드 플라크(amyloid plaque)를 이루는 β-아밀로이드(Αβ)를 주요 표적으로 하여 Αβ 생성에 중요한 역할을 하는 β-또는 γ-시크리테이즈를 억제하거나 생성된 Aβ를 분해하는 약물을 개발하려는 연구가 활발히 진행 중이다. 그러나, 이 경우는 인체 내에 정상적으로 존재하는 단백질을 표적으로 하므로 정상적인 기능을 저해할 수 있어 부작용이 발생할 수 있다.In the case of Alzheimer's disease, for example, cholinesterase inhibitors (Aricept, Exelon, Reminyl, etc.) targeting cholinergic neurons are currently on the market. Memantine, an FDA-approved glutamate receptor antagonist, also targets glutamate, a representative neurotransmitter. However, these drugs can not fundamentally prevent disease progression. In recent years, β-amyloid (Αβ), which is an amyloid plaque of Alzheimer's disease, is a major target and plays an important role in the generation of Αβ Studies are underway to develop drugs that inhibit [beta] - or [gamma] -secretase or degrade the produced A [beta]. However, in this case, since proteins normally present in the human body are targeted, they may interfere with normal functions and cause side effects.

따라서, 종래 기술에 의하더라도, 여러 퇴행성 뇌질환과 관련하여 새로운 단백질을 타겟으로 하는 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 대하여 요구된다.Therefore, even in the prior art, there is a need for a pharmaceutical composition for preventing or treating a novel protein in association with various degenerative brain diseases.

일 구체예는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 후보 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.One specific example is to provide a screening method for candidate substances for the prevention or treatment of degenerative brain diseases.

다른 구체예는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.Another embodiment is to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of degenerative brain diseases.

일 양상은 다음의 단계를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다:One aspect provides a method of screening a substance for the prevention or treatment of a degenerative brain disease comprising the steps of:

(a) 반응성 성상세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; 및 (a) contacting a sample to be analyzed with a reactive astrocytic cell; And

(b) 상기 분석하고자 하는 시료가 상기 반응성 성상세포 내의 GABA 농도를 감소시키거나 반응성 성상세포로부터의 GABA 방출을 감소시키는지 여부를 측정하는 단계; 상기 분석하고자 하는 시료가 상기 반응성 성상세포 내의 GABA 농도를 감소시키거나 반응성 성상세포로부터의 GABA 방출을 감소시키는 것으로 측정되는 경우에는 상기 시료를 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 후보 물질로 판단한다.(b) determining whether the sample to be analyzed reduces GABA concentration in the responsive astrocytic cells or reduces GABA release from reactive astrocytes; If the sample to be analyzed is determined to decrease the GABA concentration in the responsive astrocytic cells or decrease the GABA release from the reactive astrocytic cells, the sample is judged to be a candidate for the prevention or treatment of degenerative brain diseases.

다른 양상은 다음의 단계를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 후보 물질의 스크리닝 방법을 제공한다:Another aspect provides a method for screening candidate substances for the prevention or treatment of degenerative brain diseases comprising the steps of:

(b) 상기 반응성 성상세포 내의 MAO-B를 코딩하는 유전자의 발현량, MAO-B 단백질의 양 또는 MAO-B 단백질의 활성을 측정하는 단계; 상기 MAO-B를 코딩하는 유전자의 발현량, MAO-B 단백질의 양 또는 MAO-B 단백질의 활성이 감소-조절(down-regulation)되는 것으로 측정되는 경우에는 상기 시료를 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 후보 물질로 판단한다.(b) measuring the expression level of the MAO-B-encoding gene, the amount of the MAO-B protein or the activity of the MAO-B protein in the reactive astrocyte; When the amount of expression of the MAO-B-encoding gene, the amount of MAO-B protein or the activity of MAO-B protein is determined to be down-regulated, the sample is preferably used for the prevention or treatment of degenerative brain diseases It is judged to be a candidate for use.

또 다른 양상은 다음의 단계를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 후보 물질의 스크리닝 방법을 제공한다:Yet another aspect provides a method of screening candidate substances for the prevention or treatment of degenerative brain diseases comprising the steps of:

(b) 상기 반응성 성상세포에서 베스트로핀 1 채널의 세포 내 분포 양상을 측정하는 단계; 상기 베스트로핀 1 채널의 세포 내 분포 양상이 세포체와 주돌기로부터 마이크로도메인 방향으로 변화된 것으로 측정되는 경우에는 상기 시료를 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 후보 물질로 판단한다.(b) measuring the intracellular distribution pattern of the best lopin 1 channel in the reactive astrocytic cells; When the intracellular distribution pattern of the best lopin 1 channel is measured to be changed from the cell body and the main protrusion to the microdomain direction, the sample is judged to be a candidate for prevention or treatment of degenerative brain disease.

(b) 상기 반응성 성상세포 내의 베스트로핀 1(Best1)을 코딩하는 유전자의 발현량, Best1 단백질의 양 또는 Best1 단백질의 활성을 측정하는 단계; 상기 Best1을 코딩하는 유전자의 발현량, Best1 단백질의 양 또는 Best1 단백질의 활성이 감소-조절(down-regulation)되는 것으로 측정되는 경우에는 상기 시료를 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 후보 물질로 판단한다.(b) measuring the expression level of a gene encoding Bestlopin 1 (Best1), the amount of Best1 protein, or the activity of Best1 protein in the reactive astrocytic cells; When the amount of Expression of Best1-encoding gene, the amount of Best1 protein, or the activity of Best1 protein is measured to be down-regulated, the sample is judged as a candidate for prevention or treatment of degenerative brain disease .

(b) 상기 반응성 성상세포 내의 GABA 트랜스아미나아제를 코딩하는 유전자의 발현량, GABA 트랜스아미나아제 단백질의 양 또는 GABA 트랜스아미나아제 단백질의 활성을 측정하는 단계; 상기 GABA 트랜스아미나아제 유전자의 발현량, GABA 트랜스아미나아제 단백질의 양 또는 GABA 트랜스아미나아제 단백질의 활성이 증가-조절(up-regulation)되는 것으로 측정되는 경우에는 상기 시료를 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 후보 물질로 판단한다.(b) measuring the expression level of the gene encoding GABA transaminase in the responsive astrocytic cells, the amount of GABA transaminase protein or the activity of GABA transaminase protein; When the expression level of the GABA transaminase gene, the amount of GABA transaminase protein or the activity of GABA transaminase protein is measured as being up-regulation, the sample is preferably used for the prevention or treatment of a degenerative brain disease It is judged to be a candidate for use.

본 발명자들은 알츠하이머 질환을 비롯한 퇴행성 뇌질환의 발병과 관련된 예방 또는 치료제를 개발하고자 연구 노력하여, 결국 알츠하이머 질환을 갖는 동물 모델의 해마에 존재하는 반응성 성상세포 내에서 신경전달물질 중 하나인 감마-아미노부틸산(gamma-aminobutyric acid, GABA)의 농도가 증가함을 확인하였으며, 이는 GABA를 생성하는 과정에서 필수적인 효소인 MAO-B의 발현량 증가, 또는 GABA 트랜스아미나아제의 발현량 감소에 의한 것임을 최초로 규명하였다. 또한 반응성 성상세포에서 GABA가 통과할 수 있는 베스트로핀 1 채널의 세포 내 분포 양상 변화 또는 베스트로핀 1의 발현량 증가가 일어남을 확인하였다.The present inventors have made efforts to develop a preventive or therapeutic agent related to the onset of degenerative brain diseases such as Alzheimer's disease, and have found that, in an animal model having Alzheimer's disease, gamma-amino (GABA), which is an essential enzyme in the process of GABA production, is increased by increasing the expression level of MAO-B, or by decreasing the expression level of GABA transaminase. Respectively. In addition, it was confirmed that changes in intracellular distribution patterns of bestopin 1 channel through which GABA can pass through reactive astrocytic cells or increase of expression of vestrophin 1 are observed.

본 발명은 반응성 성상세포 내의 GABA 농도를 감소시키는 물질을 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 물질로 스크리닝하는 방법에 관한 것으로서, 퇴행성 뇌질환과 관련하여 MAO-B, 베스트로핀 1 채널 또는 GABA 트랜스아미나아제를 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료의 타겟으로 한다. 이와 같이, 퇴행성 뇌질환의 타겟으로서 상기 단백질들의 신규한 용도는 알츠하이머 질환을 갖는 마우스 모델의 해마에 존재하는 반응성 성상세포 내에서 정상 마우스 모델과 비교하여 MAO-B의 발현량이 증가하고, GABA 트랜스아미나아제의 발현량이 감소하여, 반응성 성상세포 내의 GABA 농도가 증가하고, 베스트로핀 1 채널의 세포 내 분포 양상이 변하며, 베스트로핀 1의 발현량이 증가하여 반응성 성상세포 외부로 GABA가 분비되어 지속성(tonic) GABA가 생성된다는 본 발명자들의 발견에 따른 것이다.The present invention relates to a method for screening a substance that decreases GABA concentration in reactive astrocytic cells with a substance for the prevention or treatment of degenerative brain diseases, Is targeted for the prevention or treatment of degenerative brain diseases. Thus, a novel use of these proteins as target of degenerative brain disease is that the expression level of MAO-B is increased in reactive astrocytic cells present in the hippocampus of a mouse model of Alzheimer's disease compared to the normal mouse model and that GABA transaminase The expression level of GABA in reactive astrocytes increased, and the distribution of vestropin 1 in the cell varied, and the expression of vestrophin 1 increased, releasing GABA to the outside of the responsive astrocytes, tonic < / RTI > GABA is produced.

지속성 GABA는 신경세포의 지속성 GABA 수용체에 결합하여 염소 이온(Cl^-)이 신경세포 내로 들어오도록 한다. 이는 신경세포의 세포막의 휴지전위를 낮추어 정상적인 신경신호 전달을 방해한다. 압상스 간질(absence epilepsy)에서는 지속성 GABA에 의해 신경신호 전달이 억제되어 있다는 것이 알려져 있고(David W. Cope, Giuseppe Di Giovanni, Sarah J. Fyson, Gergely Orban, Adam C. Errington, Magor L. Lorincz, Timothy M. Gould, David A. Carter, and Vincenzo Crunelli, Nat Med., 2009, 15(12):1392-1398), 뇌졸증의 경우 지속성 GABA를 억제하여 신경 회복을 촉진할 수 있다는 것이 알려져 있다(Andrew N. Clarkson, Ben S. Huang, Sarah E. MacIsaac, Istvan Mody and S. Thomas Carmichael, Nature, 2010, 468:305-309). 또한, 해마에 특이적으로 존재하는 지속성 GABA의 수용체를 억제했을 때 기억과 인지능력이 개선된다는 보고가 있다(G. R. Dawson, K. A. Maubach, N. Collinson, M. Cobain, B. J. Everitt, A. M. MacLeod, H. I. Choudhury, L. M. McDonald, G. Pillai, W. Rycroft, A. J. Smith, F. Sternfeld, F. D. Tattersall, K. A. Wafford, D. S. Reynolds, G. R. Seabrook and J. R. Atack, JPET, 2006, 316(3):1335-1345 및 H. Lal, B. Kumar, and M. J. Forster, The FASEB Journal, 1988, 2(11):2707-2711).Persistent GABA binds to persistent GABA receptors in neurons, allowing chlorine ions (Cl ^- ) to enter neurons. This lowers the resting potential of the cell membrane of the neuron and prevents normal neuronal signal transduction. In absence epilepsy, it is known that persistent GABA inhibits neurotransmission (David W. Cope, Giuseppe Di Giovanni, Sarah J. Fyson, Gergely Orban, Adam C. Errington, Magor L. Lorincz, Timothy M. Gould, David A. Carter, and Vincenzo Crunelli, Nat Med., 2009, 15 (12): 1392-1398), it is known that in the case of stroke, sustained GABA can be inhibited to promote neural recovery N. Clarkson, Ben S. Huang, Sarah E. MacIsaac, Istvan Mody and S. Thomas Carmichael, Nature, 2010, 468: 305-309). In addition, there is a report that memory and cognitive abilities are improved when inhibiting receptors of persistent GABA that are specifically present in hippocampus (GR Dawson, KA Maubach, N. Collinson, M. Cobain, BJ Everitt, AM MacLeod, HI Choudhury , L. McDonald, G. Pillai, W. Rycroft, AJ Smith, F. Sternfeld, FD Tattersall, KA Wafford, DS Reynolds, GR Seabrook and JR Atack, JPET, 2006, 316 (3): 1335-1345 and H. Lal , B. Kumar, and MJ Forster, The FASEB Journal, 1988, 2 (11): 2707-2711).

한편, 퇴행성 뇌질환은 중추신경계의 신경세포에 퇴행성 변화가 나타나면서 발생하는 뇌질환을 총칭하는 개념으로 해석된다. 퇴행성 뇌질환은 대부분 발병 원인이 알려져 있지 않지만, 연관 신경계를 선택적으로 침범하며, 질병의 발병이 천천히 시작해서 지속적인 진행을 보이는 것이 특징이다. 일 구체예에 따르면, 상기 퇴행성 뇌질환은 예를 들어, 알츠하이머병, 경도인지장애, 뇌졸증 및 혈관성치매, 전두측두엽치매, 루이소체 치매, 크로이츠펠트-야콥병, 외상성 두부 손상, 매독, 후천성 면역 결핍 증후군 및 기타 바이러스 감염, 뇌 농양, 뇌 종양, 다발성경화증, 대사성 질환에 의한 치매, 저산소증, 파킨슨병, 루게릭병, 헌팅턴병, 픽병, 근위축성 측색 경화증, 간질, 허혈, 중풍, 주의결결핍-과잉행동장애, 정신분열증, 우울증, 조울증, 외상후스트레스장애, 척수손상 및 척수염으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.On the other hand, degenerative brain disease is interpreted as a general term referring to brain diseases caused by degenerative changes in nerve cells of the central nervous system. Most of the degenerative brain diseases are unknown, but they are characterized by the selective involvement of the associated nervous system and the onset of the onset of the disease slowly. According to one embodiment, the degenerative brain disease is selected from the group consisting of Alzheimer ' s disease, mild cognitive impairment, stroke and vascular dementia, frontal temporal dementia, ruiocheche dementia, Creutzfeldt-Jakob disease, traumatic head injury, syphilis, acquired immune deficiency syndrome Parkinson's disease, Lou Gehrig's disease, Huntington's disease, Pick's disease, amyotrophic lateral sclerosis, epilepsy, ischemia, paralysis, insomnia, hyperactivity disorder, hyperactivity disorder, and other viral infections, brain abscess, brain tumor, multiple sclerosis, metabolic disease , Schizophrenia, depression, bipolar disorder, post-traumatic stress disorder, spinal cord injury, and myelitis.

본 발명의 방법에 따르면, 우선 반응성 성상세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시킨다. 일 구체예에 따르면, 상기 반응성 성상세포는 뇌손상 동물 모델의 뇌조직, 바이러스 감염 동물의 뇌조직, 파긴슨병 동물 모델의 뇌조직, 또는 알츠하이머 질환을 갖는 동물 모델의 뇌조직으로부터 유래한 것일 수 있다. 상기 동물 모델은 포유류 유래일 수 있으며, 예를 들어, 마우스, 래트와 같은 설치류 또는 원숭이와 같은 영장류일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다. 또한, 일 구체예에 따르면, 상기 뇌조직은 해마, 선조체, 흑색질 치밀부 또는 시상핵일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.According to the method of the present invention, first, the sample to be analyzed is brought into contact with the reactive astrocytic cells. According to one embodiment, the reactive astrocyte may be derived from the brain tissue of an animal model of brain injury, a brain tissue of a virus-infected animal, a brain tissue of an avian animal model, or an animal model of an animal model with Alzheimer's disease . The animal model may be mammal-derived and may be, but is not limited to, a primate such as a mouse, a rodent such as a rat, or a monkey. Further, according to one embodiment, the brain tissue may be a hippocampus, a striatum, a dense dense portion, or a thymocyte, but is not limited thereto.

상기 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어, "시료(sample)"는 상기 반응성 성상세포 내의 GABA 농도를 감소시키거나 반응성 성상세포로부터의 GABA 방출을 감소시키는 지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 GABA 농도를 감소시키거나 GABA 방출을 감소시키는 기작은, 예를 들어, ⅰ) 상기 반응성 성상세포 내의 MAO-B를 코딩하는 유전자의 발현량, MAO-B 단백질의 양 또는 MAO-B 단백질의 활성의 증가, ⅱ) 상기 반응성 성상세포에서 Best1을 코딩하는 유전자의 발현량, Best1 단백질의 양 또는 Best1 단백질의 활성의 증가, 혹은 베스트로핀 1 채널의 세포 내 분포 양상이 마이크로도메인으로부터 세포체와 주돌기 방향으로 변화, 또는 ⅲ) 상기 반응성 성상세포 내의 GABA 트랜스아미나아제를 코딩하는 유전자의 발현량, GABA 트랜스아미나아제 단백질의 양 또는 GABA 트랜스아미나아제 단백질의 활성의 감소에 의한 것일 수 있다. 상기 시료는 화학물질, 뉴클레오티드, 안티센스-RNA, shRNA(short hairpin RNA), siRNA(small interference RNA) 및 천연물 추출물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.The term "sample ", used in reference to the screening method, refers to the amount of an unknown compound used in screening in order to examine whether it reduces GABA concentration in the responsive astrocytic cells or reduces GABA release from reactive astrocytes Material. The mechanism by which the GABA concentration is reduced or the GABA release is reduced is, for example, i) the expression level of the gene encoding MAO-B in the responsive astrocytic cells, the amount of MAO-B protein or the activity of MAO- Ii) an increase in the expression level of Best1-encoding gene, the amount of Best1 protein or the activity of Best1 protein in the above-mentioned reactive astrocytic cells, or the distribution of intracellular distribution of the best lopin 1 channel, Or iii) the amount of expression of the gene encoding GABA transaminase in the responsive astrocytic cells, the amount of GABA transaminase protein or the activity of GABA transaminase protein. Such samples include, but are not limited to, chemicals, nucleotides, antisense-RNA, shRNA (short hairpin RNA), siRNA (small interference RNA) and natural extracts.

이어, 분석하고자 하는 시료가 처리된 반응성 성상세포 내에서 GABA 농도를 감소시키는지 여부를 측정한다. 이는 하기 3가지 방법으로 측정할 수 있다. Next, it is determined whether the sample to be analyzed reduces the GABA concentration in the treated astrocytes. This can be measured by the following three methods.

ⅰ) 상기 반응성 성상세포 내의 MAO-B를 코딩하는 유전자의 발현량, MAO-B 단백질의 양 또는 MAO-B 단백질의 활성을 측정한다. 측정 결과, 상기 MAO-B를 코딩하는 유전자의 발현량, MAO-B 단백질의 양 또는 MAO-B 단백질의 활성이 감소-조절(down-regulation)되는 것으로 측정되는 경우에는 상기 시료를 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 후보 물질로 판정될 수 있다.I) the amount of expression of MAO-B-encoding gene, amount of MAO-B protein, or activity of MAO-B protein in the responsive astrocytic cells is measured. When the measurement result indicates that the expression level of the MAO-B-encoding gene, the amount of MAO-B protein, or the activity of MAO-B protein is down-regulated, It can be judged as a candidate substance for prevention or treatment.

ii) 상기 반응성 성상세포 내의 Best1을 코딩하는 유전자의 발현량, Best1 단백질의 양 또는 Best1 단백질의 활성을 측정한다. 측정 결과, 상기 Best1을 코딩하는 유전자의 발현량, Best1 단백질의 양 또는 Best1 단백질의 활성이 감소-조절(down-regulation)되는 것으로 측정되는 경우에는 상기 시료를 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 후보 물질로 판정될 수 있다.ii) The expression level of Best1-encoding gene, the amount of Best1 protein or the activity of Best1 protein in the above-described reactive astrocytic cells is measured. When the result of the measurement indicates that the expression amount of the gene encoding Best1, the amount of Best1 protein, or the activity of Best1 protein is down-regulated, the sample is used as a candidate substance for the prevention or treatment of degenerative brain diseases . &Lt; / RTI >

iii) 상기 반응성 성상세포에서 베스트로핀 1 채널의 세포 내 분포 양상을 측정한다. 측정 결과, 상기 베스트로핀 1 채널의 세포 내 분포 양상이 세포체와 주돌기로부터 마이크로도메인 방향으로 변화된 것으로 측정되는 경우에는 상기 시료를 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 후보 물질로 판정될 수 있다.iii) The intracellular distribution pattern of the best lopin 1 channel is measured in the above-mentioned reactive astrocytes. As a result of the measurement, when the intracellular distribution pattern of the best lopin 1 channel is measured as a change from the cell body and the main protrusion to the microdomain direction, the sample can be judged as a candidate for prevention or treatment of degenerative brain diseases.

iv) 상기 반응성 성상세포 내의 GABA 트랜스아미나아제를 코딩하는 유전자의 발현량, GABA 트랜스아미나아제 단백질의 양 또는 GABA 트랜스아미나아제 단백질의 활성을 측정을 측정한다. 측정 결과, 상기 GABA 트랜스아미나아제 유전자의 발현량, GABA 트랜스아미나아제 단백질의 양 또는 GABA 트랜스아미나아제 단백질의 활성이 증가-조절(up-regulation)되는 것으로 측정되는 경우에는 상기 시료를 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 후보 물질로 판정될 수 있다.iv) Measuring the expression level of the gene encoding GABA transaminase in the above-mentioned reactive astrocytic cells, the amount of GABA transaminase protein or the activity of GABA transaminase protein. When the measurement result indicates that the expression level of the GABA transaminase gene, the amount of the GABA transaminase protein or the activity of the GABA transaminase protein is measured as up-regulation, It can be judged as a candidate substance for prevention or treatment.

상기 단백질들(MAO-B, Best1, 또는 GABA 트랜스아미나아제)을 코딩하는 유전자의 발현량 변화의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있다. 예를 들어, RT-PCR, 노던 블롯팅, cDNA 마이크로어레이를 이용한 혼성화 반응 또는 인 시투(in situ) 혼성화 반응을 이용하여 실시할 수 있다. 예를 들어. RT-PCR 프로토콜에 따라 실시하는 경우에는 우선, 시료를 처리한 세포에서 총 RNA를 분리한 다음, 올리고 dT 프라이머 및 역전사효소를 이용하여 제1쇄 cDNA를 제조한다. 이어, 제1쇄 cDNA를 주형으로 이용하고, 상기 단백질을 코딩하는 유전자-특이적 프라이머 세트를 이용하여 PCR 반응을 실시한다. 이후, PCR 증폭 산물을 전기영동하고, 형성된 밴드를 분석하여 상기 단백질들을 코딩하는 유전자의 발현량 변화를 측정한다.The measurement of the change in the expression level of the gene encoding the above proteins (MAO-B, Best1, or GABA transaminase) can be performed through various methods known in the art. For example, RT-PCR, Northern blotting, cDNA microarray hybridization or in situ with (in situ hybridization reaction. E.g. When carrying out according to the RT-PCR protocol, first, total RNA is isolated from the cells treated with the sample, and first strand cDNA is prepared using oligo dT primer and reverse transcriptase. Next, PCR is performed using a first-strand cDNA as a template and a gene-specific primer set encoding the protein. Thereafter, the PCR amplification product is electrophoresed, and the band formed is analyzed to measure changes in the expression amount of the gene encoding the proteins.

상기 단백질들(MAO-B, 베스트로핀 1 채널 또는 GABA 트랜스아미나아제)의 양 또는 세포 내 분포 변화는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있다. 예를 들어, 상기 MAO-B, Best1 또는 GABA 트랜스아미나아제 양의 변화는 면역조직화학법, 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, Western Blot, ELISA, 캡쳐-ELISA, 샌드위치 분석법에 의해 확인할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 단백질(베스트로핀 1 채널)의 세포 내 분포 변화는 면역조직화학법 및 투과전자현미경(TEM)을 통해 확인할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다. 한편, 상기 단백질들의 활성 변화는 당업계에 알려진 효소활성분석(enzyme activity assay in vitro) 방법에 의해 측정할 수 있다.Changes in the amount or intracellular distribution of the proteins (MAO-B, bestropine 1 channel or GABA transaminase) can be accomplished through a variety of methods known in the art. For example, changes in the amount of MAO-B, Best1 or GABA transaminase can be determined by immunohistochemistry, radioimmunoassay, radioimmunoprecipitation, immunoprecipitation, Western blot, ELISA, capture-ELISA, sandwich assay However, the present invention is not limited thereto. Changes in intracellular distribution of the protein (best-pinin 1 channel) can be confirmed by immunohistochemistry and transmission electron microscopy (TEM), but are not limited thereto. Meanwhile, the activity change of the above proteins can be measured by an enzyme activity assay in vitro method known in the art.

다른 양상은 반응성 성상세포 내에서 GABA 농도를 감소시키는 물질을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.Another aspect provides a pharmaceutical composition for preventing or treating a degenerative brain disease comprising a substance that reduces GABA concentration in reactive astrocytes as an active ingredient.

또 다른 양상은 반응성 성상세포 내에서 MAO-B를 코딩하는 유전자의 발현을 억제하거나 또는 MAO-B 단백질의 활성을 감소시키는 물질을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.Another aspect is a pharmaceutical composition for preventing or treating degenerative brain diseases comprising, as an active ingredient, a substance that inhibits the expression of a gene encoding MAO-B in reactive astrocytic cells or reduces the activity of MAO-B protein to provide.

일 구체예에 따르면, 상기 MAO-B 단백질의 활성을 감소시키는 물질은 하기 화학식 I로 표시되는 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이성질체, 용매화물, 수화물 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물일 수 있다.According to one embodiment, the substance that decreases the activity of the MAO-B protein is selected from the group consisting of a compound represented by the following formula (I), a pharmaceutically acceptable salt, isomer, solvate, hydrate thereof and combinations thereof Lt; / RTI >

화학식 IFormula I

상기 식에서, 상기 R₁ 및 R₂는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, 니트로, 시아노, 카르복실, 히드록시, 치환 또는 비치환된 C₁-C₁₂ 알킬, 치환 또는 비치환된 C₂-C₁₂ 알케닐, 치환 또는 비치환된 C₂-C₁₂ 알키닐, 치환 또는 비치환된 C₃-C₁₅ 시클로알킬, 치환 또는 비치환된 핵원자수 3 내지 40의 헤테로시클로알킬, (치환 또는 비치환된 C₆-C₂₀ 아릴)C₁-C₁₂ 알킬, 치환 또는 비치환된 C₁-C₁₂ 알콕시, 치환 또는 비치환된 C₆-C₂₀ 아릴아민, 치환 또는 비치환된 C₆-C₃₀ 디아릴아민, 치환 또는 비치환된 C₆-C₂₀ 아릴옥시, 치환 또는 비치환된 C₆-C₂₀ 아릴, 혹은 치환 또는 비치환된 핵원자수 5 내지 20의 헤테로아릴이며, 상기 X는 -O-, -S-, 또는 -N(H)-이다.Wherein R ₁ and R ₂ are each independently selected from the group consisting of hydrogen, halogen, nitro, cyano, carboxyl, hydroxy, substituted or unsubstituted C ₁ -C ₁₂ alkyl, substituted or unsubstituted C ₂ -C ₁₂ Substituted or unsubstituted C ₂ -C ₁₂ alkynyl, substituted or unsubstituted C ₃ -C ₁₅ cycloalkyl, substituted or unsubstituted heterocycloalkyl having 3 to 40 nucleus atoms, (substituted or unsubstituted Substituted or unsubstituted C ₆ -C ₂₀ aryl) C ₁ -C ₁₂ alkyl, substituted or unsubstituted C ₁ -C ₁₂ alkoxy, substituted or unsubstituted C ₆ -C ₂₀ arylamine, substituted or unsubstituted C ₆ -C ₃₀ diallyl amine, substituted or unsubstituted C ₆ -C ₂₀ aryloxy, substituted or unsubstituted C ₆ -C ₂₀ aryl, or a heteroaryl, a substituted or unsubstituted 5 to 20 nuclear atoms, wherein X is - O-, -S-, or -N (H) -.

본 명세서에서 용어, "알킬"은 모 알칸의 단일 탄소 원자로부터 1개의 수소 원자를 제거하는 것에 의해 유도된 포화, 분기된 또는 직쇄 1가 탄화수소기를 지칭한다. 전형적인 알킬기는, 예를 들어, 메틸, 에틸, 프로판-1-일, 프로판-2-일, 및 시클로프로판-1-일과 같은 프로필, 부탄-1-일, 부탄-2-일, 2-메틸-프로판-1-일, 2-메틸-프로판-2-일, 시클로부탄-1-일, tert-부틸과 같은 부틸 등을 포함하나 이에 한정하지는 않는다. 특정 구체예에서, 알킬기는 1 내지 12개 탄소 원자를 포함한다. 상기 알킬기에 존재하는 하나 이상의 수소원자는 할로겐, 히드록시, 저급알킬기 등으로 치환될 수 있다. 용어 "저급 알킬"은 1 내지 6개의 탄소 원자를 포함하는 알킬기를 지칭한다. As used herein, the term "alkyl" refers to a saturated, branched or straight chain monovalent hydrocarbon group derived by removing one hydrogen atom from a single carbon atom of a parent alkane. Typical alkyl groups include but are not limited to propyl, butan-1-yl, butan-2-yl, 2-methyl- Propyl-2-yl, cyclobutan-1-yl, tert-butyl, and the like. In certain embodiments, the alkyl group contains from 1 to 12 carbon atoms. The at least one hydrogen atom present in the alkyl group may be substituted with a halogen, a hydroxy, a lower alkyl group or the like. The term "lower alkyl" refers to an alkyl group containing from one to six carbon atoms.

용어 “알케닐"은 모 알켄의 단일 탄소 원자로부터 1개의 수소 원자를 제거하여 유도된 적어도 1개의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 불포화 분기된, 직쇄 또는 시클릭 알킬기를 지칭한다. 상기 기는 이중 결합 근처에서 Z- 또는 E-형태(또는 시스 또는 트랜스 입체형태)일 수 있다. 전형적 알케닐 기는, 예를 들어, 에테닐; 프로프-1-엔-1-일, 프로프-1-엔-2-일, 프로프-2-엔-1-일(알릴), 프로프-2-엔-2-일, 시클로프로프-1-엔-1-일과 같은 프로펜일; 시클로프로프-2-엔-1-일; 부트-1-엔-1-일, 부트-1-엔-2-일, 2-메틸-프로프-1-엔-1-일, 부트-2-엔-1-일, 부트-2-엔-2-일, 부타-1,3-디엔-1-일, 부타-1,3-디엔-2-일, 시클로부트-1-엔-1-일, 시클로부트-1-엔-3-일, 시클로부타-1,3-디엔-1-일과 같은 부테닐 등을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다. 특정 구체예에서, 알케닐 기는 2 내지 12개 탄소 원자를 갖고 또는 다른 구체예에서, 2 내지 6개 탄소 원자를 가지며, 즉 "저급 알케닐"이다. The term " alkenyl "refers to an unsaturated branched, straight-chain or cyclic alkyl group having at least one carbon-carbon double bond derived by the removal of one hydrogen atom from a single carbon atom of a parent alkene. Typical alkenyl groups may be, for example, ethenyl, prop-1-en-1-yl, prop-1-en- 2-yl, cycloprop-1-en-1-yl, cycloprop-2-ene 1-en-1-yl, but-2-en-1-yl, 1-yl, but-1-en-2-yl, buta- En-3-yl, butenyl, such as cyclobuta-1,3-dien-1-yl, etc. In certain embodiments, the alkenyl group has 2 to 12 carbon atoms Or have in other embodiments, it has from 2 to 6 carbon atoms, i.e., a "lower alkenyl".

용어 "알키닐"은 모 알킨의 단일 탄소 원자로부터 1개의 수소 원자를 제거하는 것에 의해 유도된 적어도 1개의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖는 불포화 분기된 또는 직쇄를 지칭한다. 전형적인 알키닐 기는, 예를 들어, 에티닐; 프로피닐; 부티닐, 2-펜티닐, 3-펜티닐, 2-헥시닐, 3-헥시닐 등을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다. 일 구체예에서, 알키닐 기는 2 내지 12개 탄소 원자를 갖고 또 다른 구체예에서, 2 내지 6개 탄소 원자(즉 "저급 알키닐")를 갖는다. The term "alkynyl" refers to an unsaturated branched or straight chain having at least one carbon-carbon triple bond derived by removing one hydrogen atom from a single carbon atom of the parent alkyne. Typical alkynyl groups include, for example, ethynyl; Propynyl; Butynyl, 2-pentynyl, 3-pentynyl, 2-hexynyl, 3-hexynyl, and the like. In one embodiment, the alkynyl group has from 2 to 12 carbon atoms and in another embodiment, from 2 to 6 carbon atoms (i.e., "lower alkynyl").

용어 "알콕시"는 라디칼 -OR을 지칭하며, 이때 R은 알킬이다. 예를 들어, 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 부톡시, 시클로헥실옥시 등을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다. The term "alkoxy" refers to the radical -OR, wherein R is alkyl. But are not limited to, for example, methoxy, ethoxy, propoxy, butoxy, cyclohexyloxy, and the like.

용어 "아릴"은 모 방향족 고리 계의 단일 탄소 원자로부터 1개의 수소 원자를 제거하여 유도된 일가의 방향족 탄화수소 기를 지칭한다. 아릴은 5- 및 5-원 카보시클릭 방향족 고리를 포함하며, 예를 들어, 벤젠; 바이시클릭(bicyclic) 고리 계, 이때 적어도 1개의 고리는 카보시클릭 및 방향족, 예를 들어, 나프탈렌, 인단, 및 테트랄린임; 및 트라이시클릭 고리 계, 이때 적어도 1개의 고리는 카보시클릭 및 방향족, 예를 들어, 플루오렌이다. 예를 들어, 아릴은 N, O 및 S로부터 선택된 1 이상의 헤테로원자를 함유하는 5- 내지 7-원 헤테로시클로알킬 고리에 융합된 5- 및 5-원 카보시클릭 방향족 고리를 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 아릴 기는 6 내지 10개 탄소 원자를 포함할 수 있다. 그러나, 아릴은 이하에 개별적으로 정의된 헤테로아릴을 포함하지 않거나 또는 중첩되지 않는다. 따라서, 1 이상의 카보시클릭 방향족 고리가 헤테로시클로알킬 방향족 고리와 융합되면, 생성한 고리 계는 본 명세서에 정의한 바와 같이 헤테로아릴이고, 아릴이 아니다. The term "aryl" refers to a monovalent aromatic hydrocarbon group derived by removing one hydrogen atom from a single carbon atom of a parent aromatic ring system. Aryl includes 5- and 5-membered carbocyclic aromatic rings and includes, for example, benzene; A bicyclic ring system wherein at least one ring is carbocyclic and aromatic, such as naphthalene, indan, and tetralinyl; And a tricyclic ring system, wherein at least one ring is carbocyclic and aromatic, for example, fluorene. For example, aryl may include a 5- and 5-membered carbocyclic aromatic ring fused to a 5- to 7-membered heterocycloalkyl ring containing one or more heteroatoms selected from N, O and S. In certain embodiments, the aryl group may comprise from 6 to 10 carbon atoms. However, the aryls do not include or are not overlapping the heteroaryls individually defined below. Thus, if one or more carbocyclic aromatic rings are fused to a heterocycloalkyl aromatic ring, the resulting ring system is heteroaryl as defined herein and is not aryl.

용어 "카르복시"는 라디칼 -C(O)OH을 지칭한다. The term "carboxy" refers to the radical -C (O) OH.

용어 "시아노"는 라디칼 -CN을 지칭한다. The term "cyano" refers to a radical -CN.

용어 "시클로알킬"은 포화 또는 불포화이지만, 비방향족, 시클릭 알킬기를 지칭한다. 특정 수준의 포화를 목적하는 경우, 명칭 "시클로알칸일" 또는 "시클로알케닐"이 사용된다. 전형적 시클로알킬기는, 비제한적으로, 시클로프로판, 시클로부탄, 시클로펜탄, 시클로헥산, 등으로부터 유도된 기를 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 시클로알킬기는 C3-10 시클로알킬, 예를 들어, C3-6 시클로알킬일 수 있다.The term "cycloalkyl" refers to a saturated or unsaturated, non-aromatic, cyclic alkyl group. When a certain level of saturation is desired, the name "cycloalkanyl" or "cycloalkenyl" is used. Typical cycloalkyl groups include, but are not limited to, groups derived from cyclopropane, cyclobutane, cyclopentane, cyclohexane, and the like. In certain embodiments, the cycloalkyl group may be C3-10 cycloalkyl, for example, C3-6 cycloalkyl.

용어 "헤테로시클로알킬"은 포화 또는 불포화이지만, 비방향족, 시클릭 알킬기며, 1 이상의 탄소원자(및 관련 수소원자)는 독립적으로 적절하게는 동일하거나 상이한 헤테로원자 및 그의 관련 수소원자에 의해 치환된다. 탄소 원자(들)을 치환할 전형적인 헤테로원자는, 비제한적으로, N, P, O, S, 및 Si를 포함한다. 전형적 헤테로시클로알킬기는, 비제한적으로, 에폭사이드, 이미다졸리딘, 모폴린, 피페라진, 피페리딘, 피라졸리딘, 피롤리딘, 퀴누클리딘, 테트라히드로퓨란, 테트라히드로피란 등으로부터 유도된 기를 포함한다. 치환된 헤테로시클로알킬은 또한 피페리딘일 N-옥사이드, 모폴리닐-N-옥사이드, 1-옥소-1-티오모폴리닐 및 1,1-디옥소-1-티오모폴리닐과 같은 1 이상의 옥소(=0) 또는 옥사이드(-O-) 치환기에 의해 치환된 고리 계를 포함한다. The term "heterocycloalkyl" is a saturated or unsaturated, but non-aromatic, cyclic alkyl group, wherein one or more carbon atoms (and related hydrogen atoms) are independently substituted by suitably the same or different heteroatoms and their associated hydrogen atoms . Typical heteroatoms for substituting the carbon atom (s) include, but are not limited to, N, P, O, S, and Si. Typical heterocycloalkyl groups include, but are not limited to, those derived from epoxides, imidazolidine, morpholine, piperazine, piperidine, pyrazolidine, pyrrolidine, quinuclidine, tetrahydrofuran, tetrahydropyran, Lt; / RTI > Substituted heterocycloalkyl is also optionally substituted with one or more substituents such as piperidinyl N-oxide, morpholinyl-N-oxide, 1-oxo-1-thiomorpholinyl and 1,1-dioxo-1- Or a ring system substituted by an oxo (= O) or oxide (-O-) substituent.

용어 "할로"는 플루오로, 클로로, 브로모, 또는 요오도기를 지칭한다.The term "halo" refers to a fluoro, chloro, bromo, or iodo group.

용어 "헤테로아릴"은 모 헤테로방향족 고리 계의 단일 원자로부터 1개의 수소 원자를 제거하는 것에 의해 유도된 일가 헤테로방향족기를 지칭한다. 헤테로아릴은 N, O, 및 S로부터 선택된 1 이상의, 예를 들어 1 내지 4개의, 또는 특정 구체예에서, 1 내지 3개의 헤테로원자를 함유하고 나머지 고리 원자는 탄소인 5- 내지 7-원 방향족, 모노시클릭 고리; N, O 및 S로부터 선택되는 1 이상의, 예를 들어, 1 내지 4개의, 또는 특정 구체예에서 1 내지 3개의 헤테로원자를 함유하고 나머지 고리 원자는 탄소이고 또 적어도 1개의 헤테로원자가 방향족 고리에 존재하는 폴리시클릭 헤테로시클로알킬 고리를 포함한다. 예를 들어, 헤테로아릴은 5- 내지 7-원 시클로알킬 고리에 융합된 5- 내지 7-원 헤테로방향족 고리 및 5- 내지 7-원 헤테로시클로알킬 고리에 융합된 5- 내지 7-원 헤테로방향족 고리를 포함한다. 고리의 오직 하나가 1 이상의 헤테로원자를 함유하는 이러한 융합된 바이시클릭 헤테로아릴 고리의 경우, 부착점은 헤테로방향족 고리 또는 시클로알킬 고리에서 일 수 있다. 헤테로아릴 기 중의 S 및 O 원자의 전체 수가 1을 초과하면, 헤테로원자는 서로 인접하지 않는다. 특정 구체예에서, 헤테로아릴 기 중의 S 및 O 원자의 전체 수는 2 이하이다. 특정 구체예에서, 헤테로아릴 기 중의 S 및 O 원자의 전체 수는 1 이하이다. 헤테로아릴은 상기 정의한 바와 같은 아릴을 포함하지 않거나 또는 그와 중첩되지 않는다. 전형적 헤테로아릴 기는, 비제한적으로, 아크리딘, 아르신돌, 카바졸, β-카볼린, 크로만, 크로멘, 신놀린, 퓨란, 이미다졸, 인다졸, 인돌,, 인돌린, 인돌리진, 이소벤조퓨란, 이소크로멘, 이소인돌, 이소인돌린, 이소퀴놀린, 이소티아졸, 이소옥사졸, 나프티리딘, 옥사디아졸, 옥사졸, 페리니딘, 페난트리딘, 페난트롤린, 페나진, 프탈아진, 프테리딘, 퓨린, 피란, 피라진, 피라졸, 피리다진, 피리딘, 피리미딘, 피롤, 피롤리진, 퀸아졸린, 퀴놀린, 퀴놀리진, 퀸옥살린, 테트라졸, 티아디아졸, 티아졸, 티오펜, 트리아졸, 크산텐, 등으로부터 유도된 기를 포함한다. 특정 구체예에서, 헤테로아릴 기는 예를 들어, 5 내지 10원 헤테로아릴과 같은 5 내지 20원 헤테로아릴일 수 있다. 특정 구체예에서, 헤테로아릴 기는 티오펜, 피롤, 벤조티오펜, 벤조퓨란, 인돌, 피리딘, 퀴놀린, 이미다졸, 옥사졸, 및 피라진으로부터 유도된 기일 수 있다. The term "heteroaryl" refers to monovalent heteroaromatic groups derived by removing one hydrogen atom from a single atom of a heteroaromatic ring system. Heteroaryl is optionally substituted with one or more, for example one to four, or, in certain embodiments, one to three heteroatoms selected from N, O, and S, and the remaining ring atoms are carbon, , Monocyclic ring; For example, 1 to 4, or 1 to 3 heteroatoms in a particular embodiment, the remaining ring atoms are carbon and at least one heteroatom is present in the aromatic ring Lt; RTI ID = 0.0 > heterocycloalkyl < / RTI > For example, heteroaryl is a 5-to 7-membered heteroaromatic ring fused to a 5- to 7-membered cycloalkyl ring and a 5- to 7-membered heteroaromatic ring fused to a 5- to 7-membered heterocycloalkyl ring. Rings. In the case of such a fused bicyclic heteroaryl ring in which only one of the rings contains one or more heteroatoms, the point of attachment may be in a heteroaromatic ring or a cycloalkyl ring. When the total number of S and O atoms in the heteroaryl group exceeds 1, the heteroatoms are not adjacent to each other. In certain embodiments, the total number of S and O atoms in the heteroaryl group is 2 or less. In certain embodiments, the total number of S and O atoms in the heteroaryl group is 1 or less. Heteroaryl does not include or overlap with an aryl as defined above. Typical heteroaryl groups include, but are not limited to, acridine, arsindole, carbazole,? -Carboline, chroman, chromene, cinnoline, furan, imidazole, indazole, indole, indolin, indolizine, Isoindolin, isoindoline, isothiazole, isoxazole, naphthyridine, oxadiazole, oxazole, ferrinidine, phenanthridine, phenanthroline, phenazine, A pyridine, a pyrazine, a pyridine, a pyridine, a pyrrole, a pyrrolidine, a quinazoline, a quinoline, a quinolizine, a quinoxaline, a tetrazole, a thiadiazole, a thia Sol, thiophene, triazole, xanthene, and the like. In certain embodiments, the heteroaryl group may be, for example, 5 to 20 membered heteroaryl, such as 5 to 10 membered heteroaryl. In certain embodiments, the heteroaryl group may be a group derived from thiophene, pyrrole, benzothiophene, benzofuran, indole, pyridine, quinoline, imidazole, oxazole, and pyrazine.

일 구체예에 따르면, 상기 화학식 I로 표시되는 화합물에서, 상기 R₁ 및 R₂는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, 니트로, 시아노, 치환 또는 비치환된 C₁-C₁₂ 알킬, 혹은 치환 또는 비치환된 C₁-C₁₂ 알콕시이며, 상기 X는 -O-, 또는 -S-일 수 있다.According to one embodiment, in the compound of formula I, R ₁ and R ₂ are each independently selected from the group consisting of hydrogen, halogen, nitro, cyano, substituted or unsubstituted C ₁ -C ₁₂ alkyl, C ₁ -C ₁₂ alkoxy, and X may be -O- or -S-.

일 구체예에 따르면, 상기 MAO-B 단백질의 활성을 감소시키는 물질은 N-시클로헥실-2-페닐옥사졸로[5,4-b]피리딘, 2-페닐-5-(피롤리딘-1-일)옥사졸로[5,4-b]피리딘, 2-페닐-5-(피롤리딘-1-일)티아졸로[5,4-b]피리딘, 2-(2-클로로페닐)-5-(피롤리딘-1-일)옥사졸로[5,4-b]피리딘, 2-(3-클로로페닐)-5-(피롤리딘-1-일)옥사졸로[5,4-b]피리딘, 2-(4-플루오로페닐)-5-(피롤리딘-1-일)옥사졸로[5,4-b]피리딘, 2-페닐-5-(피페리딘-1-일)옥사졸로[5,4-b]피리딘, 2-페닐-5-(피페리딘-1-일)티아졸로[5,4-b]피리딘, 2-(2-클로로페닐)-5-(피페리딘-1-일)옥사졸로[5,4-b]피리딘, 2-(3-플루오로페닐)-5-(피페리딘-1-일)옥사졸로[5,4-b]피리딘, 2-(3-클로로페닐)-5-(피페리딘-1-일)옥사졸로[5,4-b]피리딘, 3-(5-(피페리딘-1-일)옥사졸로[5,4-b]피리딘-2-일)벤조니트릴, 2-(4-플루오로페닐)-5-(피페리딘-1-일)옥사졸로[5,4-b]피리딘, 2-(4-브로모페닐)-5-(피페리딘-1-일)옥사졸로[5,4-b]피리딘, 2-(4-메톡시페닐)-5-(피페리딘-1-일)옥사졸로[5,4-b]피리딘, 2-(3-클로로페닐)-N-메틸옥사졸로[5,4-b]피리딘-5-아민 또는 2-(4-클로로페닐)-N-메틸옥사졸로[5,4-b]피리딘-5-아민일 수 있다.According to one embodiment, the substance that reduces the activity of the MAO-B protein is selected from the group consisting of N-cyclohexyl-2-phenyloxazolo [5,4- b] pyridine, 2- phenyl- 5- (pyrrolidin- 5- (pyrrolidin- 1 -yl) thiazolo [5,4-b] pyridine, 2- (2-chlorophenyl) -5- (5,4-b] pyridine, 2- (3-chlorophenyl) -5- (pyrrolidin- 1 -yl) oxazolo [ (5-fluorophenyl) -5- (pyrrolidin- 1 -yl) oxazolo [5,4-b] pyridine, [5,4-b] pyridine, 2- (2-chlorophenyl) -5- (piperidin- 5-yl) oxazolo [5,4-b] pyridine, 2- (3-fluorophenyl) -5- (piperidin- (5-fluorophenyl) -5- (piperidin-1-yl) oxazolo [5,4- b] pyridine, 3- b] pyridin-2-yl) benzonitrile, 2- (4-fluorophenyl) -5- (piperidin- 1 -yl) oxazolo [ Oxazolo [5,4-b] pyridine, 2- (4-methoxyphenyl) -5- (piperidin- 1 -yl) oxazolo [ 5,4-b] pyridin-5-amine or 2- (4-chlorophenyl) -N-methyloxazolo [ 5,4-b] pyridin-5-amine.

다른 양상은 반응성 성상세포 내에서 베스트로핀 1 채널의 세포 내 분포 양상을 세포체와 주돌기로부터 마이크로도메인 방향으로 변화시키는 물질을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating degenerative brain diseases comprising, as an active ingredient, a substance that changes the intracellular distribution pattern of the best lopin 1 channel in the responsive astrocytic cells from the cell body and the major protrusion toward the microdomain direction do.

또 다른 양상은 반응성 성상세포 내에서 GABA 트랜스아미나아제를 코딩하는 유전자의 발현을 유도하거나 또는 GABA 트랜스아미나아제 단백질의 활성을 증가시키는 물질을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.Another aspect is a pharmaceutical composition for preventing or treating degenerative brain diseases comprising, as an active ingredient, a substance that induces the expression of a gene encoding GABA transaminase in a reactive astrocytic cell or increases the activity of a GABA transaminase protein Lt; / RTI >

본 발명의 약학적 조성물은 화학물질, 뉴클레오티드, 안티센스, shRNA, siRNA 올리고뉴클레오티드 및 천연물 추출물을 유효성분으로 포함할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may contain chemical substances, nucleotides, antisense, shRNA, siRNA oligonucleotides and extracts of natural products as active ingredients.

일 구체예에 따르면, 상기 퇴행성 뇌질환은 알츠하이머병, 경도인지장애, 뇌졸증 및 혈관성치매, 전두측두엽치매, 루이소체 치매, 크로이츠펠트-야콥병, 외상성 두부 손상, 매독, 후천성 면역 결핍 증후군 및 기타 바이러스 감염, 뇌 농양, 뇌 종양, 다발성경화증, 대사성 질환에 의한 치매, 저산소증, 파킨슨병, 루게릭병, 헌팅턴병, 픽병, 근위축성 측색 경화증, 간질, 허혈, 중풍, 주의결결핍-과잉행동장애, 정신분열증, 우울증, 조울증, 외상후스트레스장애, 척수손상 및 척수염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.According to one embodiment, the degenerative brain disease is selected from the group consisting of Alzheimer's disease, mild cognitive impairment, stroke and vascular dementia, frontal temporal dementia, rheisome dementia, Creutzfeldt-Jakob disease, traumatic head injury, syphilis, acquired immune deficiency syndrome and other viral infections Parkinson's disease, Lou Gehrig's disease, Huntington's disease, Pick's disease, amyotrophic lateral sclerosis, epilepsy, ischemia, paralysis, insomnia-hyperactivity disorder, schizophrenia, schizophrenia, Depression, bipolar disorder, post-traumatic stress disorder, spinal cord injury, and myelitis, but the present invention is not limited thereto.

상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 상기 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.The pharmaceutical composition may comprise a pharmaceutically acceptable carrier. The pharmaceutically acceptable carrier to be contained in the pharmaceutical composition is one usually used in the present invention, and includes lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate , Microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methylcellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, no. The pharmaceutical composition may further contain a lubricant, a wetting agent, a sweetening agent, a flavoring agent, an emulsifying agent, a suspending agent, a preservative, etc. in addition to the above components. Suitable pharmaceutically acceptable carriers and formulations are described in Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995).

상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여(예를 들어, 정맥내 투여, 복강내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 또는 국부 투여)할 수 있다.The pharmaceutical composition may be administered orally or parenterally (for example, intravenous, intraperitoneal, intramuscular, subcutaneous, or topical).

상기 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 상기 약학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001-100 mg/kg(체중)일 수 있다.The appropriate dosage of the pharmaceutical composition may be variously prescribed depending on factors such as the formulation method, administration method, age, body weight, sex, pathological condition, food, administration time, administration route, excretion rate and responsiveness of the patient have. On the other hand, the dosage of the pharmaceutical composition may preferably be 0.001-100 mg / kg (body weight) per day.

상기 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.The pharmaceutical composition may be prepared in a unit dose form by formulating it using a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to a method which can be easily carried out by a person having ordinary skill in the art to which the present invention belongs. Into a multi-dose container. The formulations may be in the form of solutions, suspensions or emulsions in oils or aqueous media, or in the form of excipients, powders, granules, tablets or capsules, and may additionally contain dispersing or stabilizing agents.

일 구체예에 따른 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 후보 물질의 스크리닝 방법에 의하면, 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료 물질을 효과적으로 스크리닝할 수 있으며, 이에 따른 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 여러 퇴행성 뇌질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.According to the method for screening candidate substances for preventing or treating degenerative brain diseases according to one embodiment, a pharmaceutical composition for preventing or treating degenerative brain diseases can be effectively screened for a substance for preventing or treating degenerative brain diseases Several degenerative brain diseases can be effectively prevented or treated.

도 1은 알츠하이머 마우스 모델의 해마에서 관찰한 반응성 성상세포 및 반응성 성상세포 내에서의 GABA를 나타내는 공초점 형광 이미지이다.
도 2는 알츠하이머 마우스 모델의 해마에서 관찰한 반응성 성상세포 내에서의 MAO-B의 발현량을 나타내는 공초점 형광 이미지이다.
도 3은 알츠하이머 마우스 모델의 해마에서 관찰한 반응성 성상세포 내에서의 베스트로핀 1 채널의 세포 내 분포를 나타내는 공초점 형광 이미지이다.
도 4는 알츠하이머 마우스 모델의 해마에서 관찰한 반응성 성상세포 내에서의 GABA 트랜스아미나아제의 발현량을 나타내는 공초점 형광 이미지이다.
도 5는 알츠하이머 마우스 모델의 해마 조직에서 관찰한 GABA의 분포를 나타낸 공초점 형광 이미지이다.
도 6은 뇌손상 마우스 모델의 해마에서 관찰한 반응성 성상세포 내에서의 베스트로핀 1 채널의 세포 내 분포를 나타내는 공초점 형광 이미지이다.
도 7은 뇌손상 마우스 모델의 해마에서 관찰한 반응성 성상세포 내에서의 MAO-B의 발현량을 나타내는 공초점 형광 이미지이다.
도 8은 뇌손상 마우스 모델의 해마에서 관찰한 반응성 성상세포 내에서의 GABA 트랜스아미나아제의 발현량을 나타내는 공초점 형광 이미지이다.
도 9는 사람 알츠하이머 환자의 사후 대뇌 조직에서 관찰한 반응성 성상세포 내에서의 GABA를 나타내는 광학현미경 이미지이다.
도 10은 사람 알츠하이머 환자의 사후 대뇌 조직에서 관찰한 반응성 성상세포 내에서의 MAO-B 발현량과 GABA를 나타내는 공초점 형광 이미지와, GFAP와 MAO-B mRNA 발현량 증가를 나타내는 그래프이다.
도 11은 바이러스 감염 모델 생쥐의 시상핵에서 관찰한 반응성 성상세포 및 반응성 성상세포 내에서의 GABA를 나타내는 공초점 형광 이미지이다.
도 12는 파킨슨병 모델 랫트의 흑색질 치밀부에서 관찰한 반응성 성상세포 및 반응성 성상세포 내에서의 MAO-B와 GABA를 나타내는 공초점 형광 이미지이다.
도 13은 파킨슨병 모델 마우스의 흑색질 치밀부에서 관찰한 반응성 성상세포 및 반응성 성상세포 내에서의 Best1과 GABA를 나타내는 공초점 형광 이미지이다.
도 14는 알츠하이머 모델 마우스의 해마 추출물의 MAO-B효소 활성 정도를 나타내는 그래프이다.
도 15는 알츠하이머 모델 마우스의 해마 조직내 세포에 존재하는 GABA의 농도를 나타내는 고성능액체크로마토그래피 결과 그래프이다.
도 16은 알츠하이머 모델 마우스의 해마 치아이랑 과립세포가 지속성 가바에 의해 받는 억제성 전류의 크기를 비교한 자취 그림과 그래프이다.1 is a confocal fluorescence image showing GABA in reactive astrocytes and reactive astrocytes observed in the hippocampus of an Alzheimer's mouse model.
FIG. 2 is a confocal fluorescence image showing the amount of MAO-B expressed in the responsive astrocytes observed in the hippocampus of the Alzheimer's mouse model.
FIG. 3 is a confocal fluorescence image showing the intracellular distribution of the best-pinin 1 channel in the responsive astrocytic cells observed in the hippocampus of the Alzheimer's mouse model.
Fig. 4 is a confocal fluorescence image showing the expression amount of GABA transaminase in the reactive astrocyte observed in the hippocampus of the Alzheimer's mouse model.
Figure 5 is a confocal fluorescence image showing the distribution of GABA observed in hippocampal tissue of the Alzheimer's mouse model.
FIG. 6 is a confocal fluorescence image showing the intracellular distribution of the best-pinin 1 channel in the reactive astrocytes observed in the hippocampus of a brain-injured mouse model.
FIG. 7 is a confocal fluorescence image showing the expression amount of MAO-B in the reactive astrocyte observed in the hippocampus of a brain injury mouse model.
Fig. 8 is a confocal fluorescence image showing the expression amount of GABA transaminase in reactive astrocyte cells observed in the hippocampus of a brain injury mouse model.
9 is an optical microscope image showing GABA in reactive astrocyte cells observed in posterior cerebral tissue of a human Alzheimer's patient.
FIG. 10 is a graph showing the amount of MAO-B expressed in reactive astrocytes observed in the posterior cerebral tissues of human Alzheimer's patients, the confocal fluorescence image showing GABA, and the amount of GFAP and MAO-B mRNA expression.
11 is a confocal fluorescence image showing GABA in reactive astrocytes and reactive astrocytes observed in the thalamus of virus-infected model mice.
12 is a confocal fluorescence image showing MAO-B and GABA in the reactive astrocytes and reactive astrocytes observed in the black granules of the Parkinson's model rat.
Fig. 13 is a confocal fluorescence image showing Best1 and GABA in the reactive astrocytes and reactive astrocytes observed in the black granules of the Parkinson's disease model mouse.
14 is a graph showing the degree of MAO-B enzyme activity of hippocampal extract of Alzheimer model mouse.
FIG. 15 is a graph of high performance liquid chromatography showing the concentration of GABA present in cells in hippocampal tissue of Alzheimer model mice. FIG.
FIG. 16 is a plot and graph comparing the inhibitory current magnitudes of the hippocampal granule cells of the Alzheimer model mouse by the persistent governing.

이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, one or more embodiments will be described in more detail by way of examples. However, these embodiments are intended to illustrate one or more embodiments, and the scope of the present invention is not limited to these embodiments.

실시예Example 1-1: 알츠하이머 모델 마우스에서 반응성 성상세포 내 1-1: Alzheimer's model mice in reactive astrocytes GABAGABA 증가 확인 Confirm increase

알츠하이머병에서 정상 성상세포가 반응성 성상세포로 변하면서 세포 내 GABA의 양이 증가하는지 여부를 확인하기 위하여, 잘 알려진 알츠하이머병 모델인 APPswe/PSEN1 형질 전환 마우스(구입처: The Jackson Laboratory, http://www.jax.org) 에서 면역조직화학법을 수행하였다. 또한, 면역염색을 마친 조직에 티오플라빈-S 염색을 추가로 수행하여 알츠하이머 병의 특징인 아밀로이드 플라크(plaque)를 함께 관찰하였다.In order to determine whether the amount of intracellular GABA increases in normal astrocytes in Alzheimer's disease, APPswe / PSEN1 transgenic mouse, a well known Alzheimer's disease model (purchased from The Jackson Laboratory, http: www.jax.org) And immunohistochemistry was performed. In addition, the immunostained tissue was further subjected to thioflavin-S staining to observe amyloid plaques characteristic of Alzheimer's disease.

8~9개월령의 APPswe/PSEN1 마우스를 애버틴(Avertin)으로 깊이 마취시킨 후, 4% 파라포름알데히드로 관류 교정시켰다. 뇌를 꺼내어 해마의 30 ㎛ 두께의 관상 초냉동 박절 박편(coronal cryostat sections)을 얻어 PBS로 3회 헹구고, 블로킹 용액(0.3% Triton-X, 2% normal serum in 0.1M PBS, sigma)에서 1시간 동안 반응시켰다. 닭 항-GFAP 항체(1:500, Chemmicon) 및 기니아피그 항-GABA 항체(1:1000, Chemicon)의 혼합물과 함께 4℃에서 밤새 진탕 배양하였다. PBS로 3회 세척하고, 이어서 대응하는 이차항체가 접합된 항-닭 Alexa 488 (1:200, Invitrogen) 및 항-기니아피그 Alexa 647(1:200, Invitrogen)로 3시간 동안 반응시킨 후 다시 PBS로 3회 세척하였다. 50% 에탄올 수용액에 녹인 1 mM 티오플라빈-S(thioflavin-S)에 8분 동안 반응시키고, 80% 에탄올에 10초 동안 2번, 3차 증류수에 10초 동안 3번 세척하였다. 염색이 끝난 조직은 PBS로 옮기고 슬라이드 글라스 위에 올려서 마운팅 배지(Dako)로 마운팅하였다. FV1000 공초점 현미경(Olympus)을 사용하여 일련의 공초점 형광 이미지를 얻었다. 상기 이미지는 Olympus FLUOVIEW software ver.2.1로 가공하였다.8-9 month old APPswe / PSEN1 mice were deeply anesthetized with Avertin and perfused with 4% paraformaldehyde. Brains were taken out and hippocampal 30 μm thick coronal cryostat sections were obtained and rinsed three times with PBS and incubated in blocking solution (0.3% Triton-X, 2% normal serum in 0.1 M PBS, Lt; / RTI > Were incubated with a mixture of chicken anti -GFAP antibody (1: 500, Chemmicon) and guinea pig anti-GABA antibody (1: 1000, Chemicon) at 4 ° C overnight. Washed three times with PBS and then reacted with the corresponding secondary antibody conjugated anti-chicken Alexa 488 (1: 200, Invitrogen) and anti-guinea pig Alexa 647 (1: 200, Invitrogen) for 3 hours, &Lt; / RTI > The reaction was carried out with 1 mM thioflavin-S dissolved in 50% aqueous ethanol solution for 8 minutes and washed three times for 10 seconds in 80% ethanol for 10 seconds and for 10 seconds in the third distilled water. The stained tissue was transferred to PBS, mounted on a slide glass and mounted with a mounting medium (Dako). A series of confocal fluorescence images were obtained using an FV1000 confocal microscope (Olympus). The image was processed with Olympus FLUOVIEW software ver.2.1.

상기에서 얻어진 APPswe/PSEN1 형질전환 마우스 해마에서의 GFAP 및 GABA에 대한 항체를 이용한 고배율(x40) 면역조직화학 공초점 이미지를 도 1에 나타내었다. 도 1에서 알츠하이머 모델 마우스 해마에서는 정상 마우스에서는 없는 아밀로이드 플라크(파란색)가 관찰되었다. 성상세포 마커인 GFAP(초록색)로 염색된 세포는 알츠하이머 모델에서 반응성 성상세포로 변화하면서 GFAP로 염색된 정도가 크게 증가하였고 세포체의 크기와 주돌기의 굵기가 증가한 것을 볼 수 있다. 정상 성상세포 내부에는 GABA(붉은색)가 없거나 거의 없는 반면, 알츠하이머 모델에서는 세포 내 GABA의 양이 극적으로 증가함을 확인할 수 있었다. 반면, GFAP로는 염색되지 않지만 GABA로 염색된 인터뉴런(interneuron)은 정상 마우스와 알츠하이머 모델 마우스에서 크기나 GABA 염색 정도에 차이가 없었다.
A high magnification (x40) immunohistochemical confocal image using the antibody against GFAP and GABA in the APPswe / PSEN1 transgenic mouse hippocampus obtained above is shown in Fig. In FIG. 1, amyloid plaques (blue) not observed in the normal mouse were observed in the Alzheimer model mouse hippocampus. Cells stained with GFAP (green), which is an astrocytic marker, changed from Alzheimer's model to reactive astrocytes, and the degree of GFAP staining was greatly increased, and the size of the cell body and the thickness of the main protrusion were increased. While there is no or almost no GABA (red color) in normal astrocytes, the amount of intracellular GABA in the Alzheimer's model is dramatically increased. On the other hand, interneurons stained with GABA but not stained with GFAP showed no difference in size or GABA staining between normal and Alzheimer model mice.

실시예Example 1-2: 알츠하이머 환자 뇌에서 반응성 성상세포 내 1-2: Reactive astrocytes in Alzheimer's patient brain GABAGABA 증가 확인 Confirm increase

알츠하이머병에 걸린 환자에서 정상 성상세포가 반응성 성상세포로 변하면서 세포 내 GABA의 양이 증가하는지 여부를 확인하기 위하여, 정상인과 알츠하이머병 환자의 사후 뇌 조직 (출처: 보스턴 의과대학) 대뇌 부분에서 면역조직화학법을 수행하였다. 고정된 사후 뇌 조직을 30 ㎛ 두께의 관상 초냉동 박절 박편(coronal cryostat sections)을 얻어 과산화수소수 용액에 반응시켜 조직내에 남아있는 페록시다아제 효소의 활성을 억제한 후 PBS로 3회 헹구고, 블로킹 용액(0.3% Triton-X, 2% normal serum in 0.1M PBS, sigma)에서 1시간 동안 반응시켰다. 다음으로, 기니아피그 항-GABA 항체(1:1000, Chemicon)의 혼합물과 함께 4℃에서 밤새 진탕 배양하였다. PBS로 3회 세척하고, 이어서 대응하는 이차항체가 접합된 항-기니아피그 HRP (1:200, Invitrogen)로 3시간 동안 반응시킨 후 다시 PBS로 3회 세척하였다. 다음으로 DAB용액과 반응시켜 HRP 활성에 의해 갈색의 염색 반응이 나오도록 한 후, 염색이 끝난 조직은 PBS로 옮기고 슬라이드 글라스 위에 올려서 마운팅 배지(Dako)로 마운팅하여 광학현미경으로 관찰하였다. 정상인과 알츠하이머 환자 사후 대뇌조직에서 GABA에 대한 항체를 이용한 고배율(x40) 면역조직화학 광학 이미지를 도 9에 나타내었다. 도 9에서 정상인의 대뇌 성상세포 내부에는 GABA(갈색)가 없거나 거의 없는 반면, 알츠하이머 환자의 대뇌 성상세포 내부에는 세포 내 GABA의 양이 극적으로 증가함을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터 GABA를 축적하는 반응성 성상세포가 나타나는 현상이 알츠하이머 모델 생쥐 뿐만 아니라 실제 사람 환자에서도 동일하게 나타나므로, 본 기술이 알츠하이머 병 예방과 치료에 적용될 수 있음을 뒷받침한다.
In order to determine whether the amount of intracellular GABA increases in normal astrocytes and normal astrocytes in patients with Alzheimer's disease, the posterior cerebral tissues of normal subjects and Alzheimer's patients (source: Boston Medical College) Histochemical method was performed. Fixed posterior cerebral tissues were obtained by coronal cryostat sections of 30 μm thickness and reacted with aqueous hydrogen peroxide solution to inhibit the activity of the peroxidase enzyme remaining in the tissue, rinsed 3 times with PBS, (0.3% Triton-X, 2% normal serum in 0.1 M PBS, Sigma) for 1 hour. Next, the mixture was incubated with a mixture of guinea pig anti-GABA antibody (1: 1000, Chemicon) at 4 ° C overnight. Washed three times with PBS, then reacted with the corresponding secondary antibody conjugated anti-guinea pig HRP (1: 200, Invitrogen) for 3 hours and then washed three times with PBS. Next, the cells were reacted with DAB solution to induce a brown staining reaction by HRP activity. The stained tissue was transferred to PBS, mounted on a slide glass, mounted on a mounting medium (Dako), and observed with an optical microscope. FIG. 9 shows high magnification (x40) immunohistochemical optical images using antibodies against GABA in post-cerebral tissue of normal subjects and Alzheimer's patients. FIG. 9 shows that the amount of GABA in the cerebral astrocytes of the Alzheimer's patients was dramatically increased in the absence of GABA (brown) in normal cerebral astrocytes. From the above results, it is confirmed that the present invention can be applied to the prevention and treatment of Alzheimer's disease because the appearance of GABA-accumulating reactive astrocytes appears in both Alzheimer model mice as well as actual human patients.

실시예Example 2-1: 반응성 성상세포의 2-1: of the reactive astrocyte MAOMAO -B, -B, 베스트로핀Best rofin 1 및 1 and GABAGABA 트랜스아미나아제의 발현 변화 확인 Identification of expression of transaminase

반응성 성상세포 내의 MAO-B, 베스트로핀 1 및 GABA 트랜스아미나아제의 발현 변화를 확인하기 위해, 하기와 같이, 항체의 종류를 추가 한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법을 사용하여, 면역조직화학염색을 수행하였다.To confirm the expression changes of MAO-B, bestropin 1 and GABA transaminase in the reactive astrocytic cells, the same method as in Example 1 was used, except that the kind of antibody was added as described below, Immunohistochemical staining was performed.

일차 항체는 닭 항-GFAP 항체(1:500, Chemmicon) 및 기니아피그 항-GABA 항체(1:1000, Chemicon)를 기본으로 하여 토끼 항-MAO-B 항체 (1:50, Sigma) 또는 토끼 항-Best1 항체 (1:100, Soria et al. 2006) 또는 토끼 항-GABA 트랜스아미나아제 항체 (1:100 Epitomics)를 추가하였다. 이차 항체는 항-닭 DyLight 488 (1:200, JacksonIR) 및 항-기니아피그 Alexa 647(1:200, Invitrogen)에 항-토끼 Alexa 555 (1:200 Invitrogen) 항체를 추가하여 반응시켰다.Primary antibodies were prepared using rabbit anti-MAO-B antibody (1:50, Sigma) or rabbit anti-GABA antibody (1: 500, Chemmicon) and guinea pig anti- -Best1 antibody (1: 100, Soria et al. 2006) or rabbit anti-GABA transaminase antibody (1: 100 Epitomics). Secondary antibodies were reacted by adding anti-rabbit Alexa 555 (1: 200 Invitrogen) antibody to anti-chicken DyLight 488 (1: 200, Jackson IR) and anti-guinea pig Alexa 647 (1: 200, Invitrogen).

그 결과, 도 2에서 보는 바와 같이, 반응성 성상세포 내에서 MAO-B가 증가하였음을 확인할 수 있었고, 도 3에서 보는 바와 같이, 반응성 성상세포 내의 GABA 트랜스아미나아제가 감소함을 확인할 수 있었으며, 이와 같은 MAO-B의 발현량 증가 및 GABA 트랜스아미나아제의 발현량 감소에 의해 반응성 성상세포 내에 GABA의 양이 증가함을 알 수 있었다. 또한, 도 4에서 보는 바와 같이, 대조군(wild type)과 비교하여 베스트로핀 1 채널의 세포내 분포 위치(subcellular localization)가 변화하였음을 확인할 수 있었으며, 이에 의해 GABA의 분비 양상이 변화하여 알츠하이머 질환을 유도한다는 것을 알 수 있었다.
As a result, as shown in FIG. 2, it was confirmed that MAO-B was increased in the reactive astrocytes, and as shown in FIG. 3, it was confirmed that the GABA transaminase in the reactive astrocytes decreased Increased expression of the same MAO-B and decreased expression of GABA transaminase increased the amount of GABA in the responsive astrocytes. In addition, as shown in FIG. 4, it was confirmed that the subcellular localization of the best rofin 1 channel was changed in comparison with the wild type, and the secretion pattern of GABA was changed, .

실시예Example 2-2: 알츠하이머 모델 생쥐의 뇌에서 2-2: Alzheimer's model in the brain of mice MAOMAO -B의 단백질 활성 증가 확인-B to confirm increased protein activity

본 실험은 알드리치에서 구매한 휴먼 MAO-B 효소와 Amplex® Red monoamine oxidase assay kit를 이용하여 스탁 용액 준비는 매뉴얼에 따랐다. 이 키트 안에는 5X reaction buffer, Amplex®red reagent(1mg), HRP(horseradish peroxidase), DMSO, H2O2, p-타이라민(MAO-A,B의 기질), 벤질아민(MAO-B의 기질), 클로길린(MAO-A의 저해제), 파길린(MAO-B의 저해제)가 들어있다. 그 중에서 우리는 MAO-B 기질로 벤질아민을 사용하였고, MAO-B의 저해제로는 파길린을 사용하였다. 전체 기질로 작용할 용액의 준비과정은 다음과 같다. This test was followed by manual preparation of Stock solution using human MAO-B enzyme purchased from Aldrich and Amplex® Red monoamine oxidase assay kit. In this kit, 5X reaction buffer, Amplex®red reagent (1mg), horseradish peroxidase (HRP), DMSO, H2O2, p-Tyramine (substrate of MAO-A, B), benzylamine Guanine (an inhibitor of MAO-A), pagiline (an inhibitor of MAO-B). Among them, we used benzylamine as the MAO-B substrate and pagyline as the inhibitor of MAO-B. The preparation of the solution to serve as the whole substrate is as follows.

Amplex® red 1mg에 DMSO 200 ul을 넣어 충분히 녹인 200 ul, HRP와 1ml의 1X buffer 을 섞은 100 ul, 벤질아민과 1.2 ml의 dH2O에 녹인 200 ul를 9.5 ml의 1X buffer에 넣어 총 10 ml를 만든다. 이 양은 100개의 well에 사용할 수 있다. MAO-B 저해제인 파길린에 1 ml의 dH2O을 섞어 각 well 당 0.5 ul를 넣는다. Add 200 μl of DMSO to 1 μl of Amplex® red, add 100 μl of a mixture of 1 μl of HRP and 1 μl of 1 × buffer, 200 μl of benzylamine and 1.2 μl of dH 2 O dissolved in 9.5 ml of 1 × buffer to make a total of 10 ml . This amount can be used in 100 wells. Add 1 ml of dH2O to the MAO-B inhibitor, pazirin, and add 0.5 ul per well.

먼저, 준비한 96well 의 첫번째 줄과 두번째 줄에 알츠하이머 생쥐로부터 분리한 해마 추출물을 넣고, 세번째 줄과 네번째 줄에 와 정상 생쥐로부터 분리한 해마 추출물을 넣는다. 생쥐를 마취시킨 후 뇌를 꺼내어 해마를 적출하고, 해마에서 CA1 부위와 DG 부위를 따로 분리하였다. 분리한 조직은 신선한 상태로 균질화용액에 넣고 갈아서 균질화시켰다. 원심분리기에 약하게 돌려 큰 덩어리를 제거하고 상층액만 채취한 다음 고속 원심분리 (13000rpm 20분)하여 미토콘드리아가 농축된 침전물을 얻었다. 해마에서 추출한 이 침전물을 50 마이크로그램씩 MAO-B효소활성 측정에 이용하였다.First, add the hippopotamus extracts from the Alzheimer's mouse in the first and second rows of the 96 wells prepared, and the hippocampus extracts in the third and fourth rows and from the normal mice. After the mice were anesthetized, the brains were removed and the hippocampus was harvested and the CA1 and DG regions were separated from the hippocampus. The separated tissues were homogenized by grinding in a homogenizing solution in a fresh state. The supernatant was removed by centrifugation at high speed (13000 rpm for 20 minutes) to obtain a thickened mitochondria precipitate. The sediment extracted from hippocampus was used to measure MAO-B enzyme activity by 50 micrograms.

두 번째 줄과 네 번째 줄에는 파길린 저해제제를 0.5 ul씩 추가로 넣어준다. 실험의 오차를 줄이고 정확성을 높이기 위해 한 화합물당 3번씩 실험을 반복 하였다. 30분 뒤, 암실에서 기질로 작용할 용액을 100 ul씩 넣어준다. Amplex® reagent가 빛에 민감하기 때문에 암실에서 실험을 한다. 결국, 각 well 당 200 ul의 양이 되는 것이다. 2~3 시간 뒤, 발색의 정도를 측정하면 첫번째 줄과 두번째 줄의 데이터 값의 차가 알츠하이머 생쥐의 해마에서 순수하게 MAO-B 효소와 그의 기질과의 반응에 의한 활성이고, 세번째 줄과 네번째 줄의 데이터 값의 차가 정상 생쥐의 해마에서 순수하게 MAO-B 효소와 그의 기질과의 반응에 의한 활성이다. Add 0.5 μl of pazirine inhibitor to the second and fourth lines. The experiment was repeated three times per compound to reduce the error of the experiment and to improve the accuracy. After 30 minutes, add 100 μl of the solution to serve as a substrate in the dark room. Because the Amplex® reagent is sensitive to light, it is tested in the darkroom. Eventually, it will be 200 ul per well. After 2-3 hours, the difference between the data values of the first line and the second line is measured by the reaction between the MAO-B enzyme and its substrate in the hippocampus of Alzheimer's mouse, and the activity of the third and fourth lines The difference in data values is due to the reaction of the MAO-B enzyme with its substrate in the hippocampus of normal mice.

도 14로부터, 알츠하이머 생쥐에서 정상 생쥐에 비해 해마의 MAO-B 활성이 증가되어있음을 알 수 있다. 전체 해마 추출물은 물론이고 특히 해마의 DG 부분에서 MAO-B의 활성이 25% 가량 증가되었다. 이로부터 MAO-B의 활성이 증가하여 알츠하이머 질환을 유도한다는 것을 알 수 있었다.
From Fig. 14, it can be seen that the MAO-B activity of hippocampus is increased in Alzheimer's mice compared to normal mice. The activity of MAO-B was increased by 25% in the hippocampus DG part as well as the whole hippocampus. From these results, it was found that the activity of MAO-B is increased and induces Alzheimer's disease.

실시예Example 2-3: 알츠하이머 환자 뇌에서 반응성 성상세포의 2-3: Alzheimer's disease in the brain of reactive astrocytes MAOMAO -B 발현 증가 확인-B Confirmation of increased expression

반응성 성상세포 내의 MAO-B의 발현 변화를 확인하기 위해, 하기와 같이, 항체의 종류를 추가한 것을 제외하고는, 실시예 2과 동일한 방법을 사용하여, 알츠하이머 환자의 사후 대뇌 조직에서 면역조직화학염색을 수행하였다. In order to confirm the change in the expression of MAO-B in the responsive astrocytic cells, the same method as in Example 2 was used except that the kinds of antibodies were added as described below. In the post-cerebral tissue of Alzheimer's patients, Staining was performed.

일차 항체는 닭 항-GFAP 항체(1:500, Chemmicon) 와 기니아피그 항-GABA 항체(1:1000, Chemicon) 및 토끼 항-MAO-B 항체 (1:50, Sigma) 를 사용하였다. 이차 항체는 항-닭 DyLight 488 (1:200, JacksonIR) 및 항-기니아피그 Alexa 647(1:200, Invitrogen)에 항-토끼 Alexa 555 (1:200 Invitrogen) 항체를 추가하여 반응시켰다.The primary antibody was a chicken anti -GFAP antibody (1: 500, Chemmicon), guinea pig anti-GABA antibody (1: 1000, Chemicon) and rabbit anti-MAO-B antibody (1:50, Sigma). Secondary antibodies were reacted by adding anti-rabbit Alexa 555 (1: 200 Invitrogen) antibody to anti-chicken DyLight 488 (1: 200, Jackson IR) and anti-guinea pig Alexa 647 (1: 200, Invitrogen).

그 결과, 도 10A에서 보는 바와 같이, 반응성 성상세포 내에서 MAO-B가 증가하였음을 확인할 수 있었다. 이와 같은 MAO-B의 발현량 증가에 의해 반응성 성상세포 내에 GABA의 양이 증가함을 알 수 있었다. 이로부터 사람 알츠하이머 환자에서도 반응성 성상세포 내의 MAO-B의 발현량 증가에 의해 GABA가 증가하여 알츠하이머 질환을 유도한다는 것을 알 수 있었다.As a result, as shown in FIG. 10A, it was confirmed that MAO-B increased in the reactive astrocytes. The increase in the expression level of MAO-B indicates that the amount of GABA increases in the responsive astrocytes. From these results, it was also found that GABA is induced by the increase of MAO-B expression in reactive astrocytes in human Alzheimer's patients, leading to Alzheimer's disease.

또한 quantitative RT-PCR 방법을 이용하여 알츠하이머 환자 뇌에서 MAO-B의 mRNA 발현량이 증가한 것을 확인하였다. 알츠하이머 환자 사후 뇌 조직으로부터 총 RNA를 채취하여, 올리고 dT 프라이머 및 역전사효소를 이용하여 제 1쇄 cDNA를 제조한다. 이어, 제1쇄 cDNA를 주형으로 이용하고, MAO-B 단백질과 GFAP 단백질을 코딩하는 유전자-특이적 프라이머 세트를 이용하여 PCR 반응을 실시한다. 이후, PCR 증폭 산물을 전기영동하고, 형성된 밴드를 분석하여 상기 단백질들을 코딩하는 유전자의 발현량 변화를 측정한다. In addition, quantitative RT-PCR was used to confirm the increase in mRNA expression of MAO-B in Alzheimer's patient brain. Total RNA is collected from post-brain tissue of Alzheimer's patients, and first strand cDNA is prepared using oligo dT primer and reverse transcriptase. Next, PCR is performed using a first-strand cDNA as a template and a gene-specific primer set encoding MAO-B protein and GFAP protein. Thereafter, the PCR amplification product is electrophoresed, and the band formed is analyzed to measure changes in the expression amount of the gene encoding the proteins.

그 결과, 도 10B에서 보는 것과 같이 성상세포 마커인 GFAP의 발현량이 알츠하이머 환자의 뇌에서 증가하였으며, 도 10C에서와 같이 GABA를 만드는 효소인 MAO-B의 발현량도 알츠하이머 환자의 뇌에서 증가해 있었다. 도 10D는 각 환자 샘플의 GFAP와 MAO-B 발현량의 상관관계를 나타낸 것이다. 이로부터 알츠하이머 환자의 뇌에서 MAO-B 단백질의 양뿐만 아니라 mRNA 발현량도 증가되어 있음을 알 수 있었다.
As a result, the expression level of GFAP, an astrocyte marker, was increased in the brain of Alzheimer's patients as shown in FIG. 10B, and the expression level of MAO-B, an enzyme for producing GABA, was also increased in the brain of Alzheimer's patients . Figure 10D shows the correlation between GFAP and MAO-B expression levels in each patient sample. This indicates that not only the amount of MAO-B protein but also the amount of mRNA expression is increased in the brain of Alzheimer's patients.

실시예Example 3-1: 알츠하이머 모델 마우스에서 반응성 성상세포의 3-1: In the Alzheimer model mouse, GABAGABA 생산에 의한 해마 조직 내 지속성 Persistence in hippocampal tissue by production GABAGABA 의 증가 확인Confirmation of increase

실시예 1에 의해 제작된 슬라이드로부터 FV1000 공초점 현미경 (Olympus)을 사용하여 저배율(x10)에서 공초점 형광 이미지를 얻었다. 도 5에서 보는 바와 같이, 알츠하이머 모델 마우스의 해마에서 치아이랑(dentate gyrus)의 분자층(molecular layer) 부분에 GABA 염색이 전체적으로 증가되었다(흰색 화살표). 이는 세포 내외의 GABA 양이 늘어났음을 의미하는 것으로, 실시예 2의 결과와 같이, 반응성 성상세포 내에서 MAO-B가 증가함으로써, 세포 내부의 GABA가 축적되고, 베스트로핀 1 채널의 세포내 분포 위치(subcellular localization)가 변화함으로써, 세포 외로 GABA가 분비되어 지속성 GABA가 됨을 확인할 수 있었다. 이러한 GABA의 분비 양상 변화에 의해 알츠하이머 질환을 유도한다는 것을 예상할 수 있었다.
Confocal fluorescence images were obtained at low magnification (xlO) using a FV1000 confocal microscope (Olympus) from the slides prepared according to Example 1. [ As shown in FIG. 5, GABA staining was increased in the molecular layer portion of the dentate gyrus in the hippocampus of Alzheimer's model mouse (white arrow). This means that the amount of GABA inside and outside the cell is increased. As shown in Example 2, by increasing MAO-B in the reactive astrocytes, GABA inside the cell accumulates and the intracellular distribution of the best lopin 1 channel As the location (subcellular localization) changes, it is confirmed that GABA is secreted extracellularly to become persistent GABA. These changes in the secretion pattern of GABA could be expected to induce Alzheimer's disease.

실시예Example 3-2: 알츠하이머 모델 마우스에서 반응성 성상세포의 3-2: In the Alzheimer model mouse, GABAGABA 생산에 의한 해마 조직 내 세포 밖 Out-of-cell hippocampal formation by production GABAGABA 농도의 증가 확인 Confirmation of increase in concentration

알츠하이머 모델 마우스의 해마에서 microdialysis 미세투석법과 HPLC 고성능액체크로마토그래피 방법을 이용하여 조직 내 세포 밖 GABA 농도가 증가함을 확인하였다. 상기의 모델 마우스를 isoflurane으로 마취 후 stereotaxic에 고정시키고 도15a,b와 같이 해마에서 아밀로이드 플라크가 많이 생기는 부위에 guide cannula와 미세투석 프로브를 이식하였다. 마우스가 마취에서 완전히 깨어난 뒤 probe를 통해 인공뇌척수액을 흘려주면서 미세투석되어 나온 액체를 20분 간격으로 채집하고, 이 액체에 들어있는 GABA의 양을 고성능액체크로마토그래피로 분석했다. In the hippocampus of Alzheimer 's model mice, the extracellular GABA concentration was increased by microdialysis microdialysis and HPLC high performance liquid chromatography. The above model mouse was anesthetized with isoflurane and fixed to the stereotaxic, and a guide cannula and a microdialysis probe were implanted in the hippocampus where amyloid plaque was generated as shown in FIG. 15a, b. After the mouse was completely awakened from the anesthesia, the microdialysis fluid was collected at intervals of 20 minutes while flowing the artificial cerebrospinal fluid through the probe, and the amount of GABA contained in the liquid was analyzed by high performance liquid chromatography.

도 15에서 알츠하이머 모델 마우스는 조직 내 세포 밖 GABA의 농도가 정상 생쥐에 비해 2배 가량 증가되어있음을 알 수 있었다. 이는 반응성 성상세포 내에서 만들어진 GABA가 축적된 후 세포 밖으로 분비되어 지속성 GABA를 형성하고 있음을 의미하는 것으로 이러한 GABA의 분비 증가에 의해 알츠하이머 질환을 유도한다는 것을 예상할 수 있었다.
In FIG. 15, it was found that the concentration of extracellular GABA in the tissues of the Alzheimer model mice was twice as much as that of the normal mice. This suggests that GABA secreted from the reactive astrocytes is secreted out of the cell after accumulation to form persistent GABA, which can be expected to induce Alzheimer 's disease by increasing secretion of GABA.

실시예Example 3-3: 알츠하이머 모델 마우스에서 반응성 성상세포의 3-3: In the Alzheimer model mice, GABAGABA 생산에 의한 해마 신경세포가 받는 억제신호의 증가 확인 Production of hippocampal neurons in the increase of suppression signal confirmation

알츠하이머 모델 마우스의 해마에 있는 신경세포가 GABA에 의해 매개된 억제신호를 받는 정도를 전세포 패치 클램프 기록 (whole-cell patch clamp) 방법으로 측정하였다.The extent to which neurons in the hippocampus of Alzheimer's model mice received GABA-mediated inhibitory signals was measured by whole-cell patch clamp method.

알츠하이머 모델 마우스를 halothane으로 마취시킨 후 머리를 자르고 두개골로부터 뇌를 신속하게 꺼내어, 절단 용액(ice-cold cutting solution)에 침지시켰다: 상기 용액은 250 mM 슈크로오스, 26 mM NaHCO₃, 10 mM D(+)-글루코오스, 4 mM MgCl₂, 3 mM myo-inositol, 2.5 mM KCl, 2 mM Sodium pyruvate, 1.25 mM NaH₂PO₄, 0.5 mM Ascorbic acid, 0.1 mM CaCl₂, 및 1 mM Kynurenic acid (pH 7.4) 포함. 모든 용액을 95% O₂-5% CO₂로 가스처리하였다. 뇌 앞부분과 소뇌부분을 칼로 잘라 제거한 후 해마를 포함하는 300 마이크로미터 두께의 박편을 마이크로톰(Leica VT 1000)으로 절단하고, 인공뇌척수액으로 옮겼다; 상기 용액은 126 mM NaCl, 24 mM NaHCO₃, 1 mM NaH₂PO₄, 2.5 mM KCl, 2.5 mM CaCl₂, 2 mM MgCl₂, 및 10 mM D(+)-Glucose (pH 7.4)를 포함. 박편들을 적어도 상온에서 40분 동안 인큐베이팅하였다. 전세포 패치 기록을 위하여 해마 박편들을 flow controller (Synaptosoft)와 진공펌프 (Charles Austen, model Capex 8C)에 의하여 조절되는 인공뇌척수액으로 계속적으로 흘려주는(superfusing, flow rate; 2ml/min) 전자생리학적 기록 챔버(RC-26G, Warner Instruments)로 옮겼다. 슬라이스 챔버를 정립현미경 (upright microscope, Olympus, Japan)의 재물대 위에 올려놓고, 미분간섭대비(differential interference contrast) 및 적외선 옵틱으로 X60 수침체 (water immersion objective)로 관찰하였다. 세포 형태를 Imaging Workbench 6.0 (INDEC Systems, Inc), camera controller (Hamamatsu, C4742-95), 및 light microscope controller (Olympus, TH4-200)를 통하여 시각적으로 확인하였다. 대부분 해마의 치아이랑 부분에 위치하는 신경세포인 과립세포(granule cell) 몸체(somata)로부터 전세포 전압-클램프 기록을 얻었다.Alzheimer's model mice were anesthetized with halothane and then the head was cut and the brain was quickly removed from the skull and immersed in an ice-cold cutting solution. The solution was washed with 250 mM sucrose, 26 mM NaHCO ₃ , 10 mM D (+) - _{glucose, 4 mM MgCl 2, 3 mM} myo-inositol, 2.5 mM KCl, 2 mM Sodium pyruvate, 1.25 mM NaH 2 PO 4, 0.5 mM Ascorbic acid, 0.1 mM CaCl 2, and 1 mM Kynurenic acid (pH 7.4) included. All solutions were gas treated with 95% O ₂ -5% CO ₂ . The anterior part of the brain and the cerebellum were cut off with a knife, and a 300 micrometer-thick slice containing hippocampus was cut with a microtome (Leica VT 1000) and transferred to artificial cerebrospinal fluid; The solution is _{126 mM NaCl, 24 mM NaHCO 3} , 1 mM NaH 2 PO 4, 2.5 mM KCl, 2.5 mM CaCl 2, 2 mM MgCl 2, and 10 mM D (+) - Glucose include (pH 7.4). The flakes were incubated at least at room temperature for 40 minutes. To record the whole cell patches, the hippocampal flaps were electrophysiologically recorded with superfusing (flow rate: 2 ml / min) continuously flowed into artificial cerebrospinal fluid controlled by a flow controller (Synaptosoft) and a vacuum pump (Charles Austen, model Capex 8C) Chamber (RC-26G, Warner Instruments). The slice chamber was placed on a platform of an upright microscope (Olympus, Japan) and observed with differential interference contrast and X60 water immersion objective with an infrared optic. Cell morphology was visually confirmed by Imaging Workbench 6.0 (INDEC Systems, Inc), camera controller (Hamamatsu, C4742-95), and light microscope controller (Olympus, TH4-200). We obtained full-cell voltage-clamp recordings from the somata of the granule cell, which is a nerve cell located mostly in the dorsal part of the hippocampus.

과립세포 기록을 위하여, 후벽 보로실리케이트 유리 모세관(thick-walled borosilicate glass capillaries, SC150F-10, Warner instrument Corp)으로부터 패치 피펫(8-12 MΩ)를 만들고, 피펫을 다음의 조성을 갖는 내부 용액으로 충전시켰다: 135 mM CsCl, 4 mM NaCl, 0.5 mM CaCl₂, 10 mM HEPES, 5 mM EGTA, 2 mM Mg-ATP, 0.5 mM Na₂-GTP 및 10 mM QX-314, CsOH로 pH 7.2로 조정 (278-285 mOsmol) (Rossi, et al., 2003). 이와 같은 내부 용액, 전압 클램프 E_cl=0 mV, 및 유지전위 -70 mV로 내향전류(inward current)가 유도되었다. 과립세포를 패치 피펫으로 전세포 패치 클램프 기록을 하면서 흥분성 물질인 glutamate에 의한 신경신호 전달을 억제 하기 위해 AP-5와 CNQX를 포함한 인공뇌척수액을 5분 이상 흘려주어 억제성 물질인 GABA에 의한 신경신호만 선택적으로 기록하였다. 5분이 경과하면 GABA에 의한 신경신호 전달을 억제하는 bicuculline을 포함한 인공뇌척수액을 3분간 흘려주어 GABA 신호를 억제했다. bicuculilline으로 억제되기 전과 후의 baseline을 비교하면 과립세포가 받는 지속성 GABA 신호의 양을 알 수 있었다. For granulocyte recording, a patch pipette (8-12 MΩ) was made from thick-walled borosilicate glass capillaries (SC150F-10, Warner instrument Corp.) and the pipette was filled with an internal solution having the following composition : Adjusted to pH 7.2 with 135 mM CsCl, 4 mM NaCl, 0.5 mM CaCl ₂ , 10 mM HEPES, 5 mM EGTA, 2 mM Mg-ATP, 0.5 mM Na ₂ -GTP and 10 mM QX- 285 mOsmol) (Rossi, et al., 2003). An inward current was induced at this internal solution, a voltage clamp E _cl = 0 mV, and a holding potential of -70 mV. In order to inhibit glutamate-mediated neurotransmission by stimulating granulocyte-patch clamping with whole-cell patch clamps, artificial cerebrospinal fluid containing AP-5 and CNQX was infused over 5 minutes to inhibit neuronal signaling by GABA Were recorded selectively. After 5 minutes, artificial cerebrospinal fluid containing bicuculline, which inhibits GABA - mediated neurotransmission, was administered for 3 minutes to inhibit GABA signaling. Comparing baseline before and after suppression with bicuculilline, we could detect the amount of persistent GABA signal that granule cells received.

상기 얻어진 신호를 계수화하고, pCLAMP 10.2 software (Molecular Devices)를 사용하여 Digidata 1440A (Molecular Devices) 및 Multiclamp 700B amplifier (Molecular Devices)으로 50 μs 간격으로 샘플링하였다. Clampfit 10.2 (Molecular Devices), SigmaPlot 10.0 (SPSS) 및 Excel 2003 (Microsoft)를 이용하여 오프라인 분석을 수행하였다. The resulting signal was digitized and sampled at 50 μs intervals on Digidata 1440A (Molecular Devices) and Multiclamp 700B amplifiers (Molecular Devices) using pCLAMP 10.2 software (Molecular Devices). Off-line analysis was performed using Clampfit 10.2 (Molecular Devices), SigmaPlot 10.0 (SPSS) and Excel 2003 (Microsoft).

본 실시예에서 사용된 모든 약물과 화학물질은 다음과 같은 별도의 언급이 없는 한 SIGMA사로부터 구입한 것이다: QX-314 (Tocris), AP-5(Tocris), CNQX(Tocris), bicuculline methobromide (Tocris).All drugs and chemicals used in this example were purchased from SIGMA unless otherwise noted as follows: QX-314 (Tocris), AP-5 (Tocris), CNQX (Tocris), bicuculline methobromide Tocris).

수치 데이터는 means±S.E.M로 나타내었다. 비교용 데이터의 유의성은 Student's two-tailed unpaired t test에 의하여 구하였고, 유의수준은 * (p < 0.05), ** (p < 0.01), 및 ***(p < 0.001)로 나타내었다. 데이터는 2kHz에서 필터링하였다. The numerical data are shown as means ± SEM. The significance of the comparison data was determined by Student's two-tailed unpaired t test. The significance levels were expressed as * (p <0.05), ** (p <0.01), and *** (p <0.001). Data was filtered at 2 kHz.

실험 결과, 알츠하이머 모델 생쥐의 해마 치아이랑 과립세포는 정상생쥐에서와 비교하여 더 많은 지속성 GABA에 의한 억제를 받고 있었다.(도 16) GABA에 의한 세포내 염소이온의 유입을 나타내는 전류의 크기는 알츠하이머 모델 생쥐에서 평균 12pA, 정상 생쥐에서 8pA였다. 세포의 면적을 고려한 지속성 전류 밀도 또한 알츠하이머 생쥐에서 정상에 비해 2개 정도 증가해 있었다. 이로부터 알츠하이머 병의 해마 내의 반응성 성상세포 가 만든 GABA가 세포밖 조직내로 분비되어 신경세포를 억제함을 알 수 있다. 이는 결과적으로 신경세포의 원활한 신호전달을 억제하여 정상적인 뇌 기능을 방해하고 알츠하이머 병의 주된 증상인 기억력 감퇴 등으로 나타나는 것이라 예상할 수 있다.
As a result, the hippocampal and granular cells of Alzheimer model mice were inhibited by more persistent GABA than in normal mice (Fig. 16). The magnitude of the current indicating the influx of intracellular chlorine ions by GABA was higher in Alzheimer ' 12 pA in model mice and 8 pA in normal mice. The persistent current density in consideration of the cell area was also increased by about 2 in the Alzheimer mouse compared to the normal. This suggests that GABA produced by reactive astrocytes in the hippocampus of Alzheimer's disease is secreted into extracellular tissues and inhibits neurons. As a result, it can be expected that it inhibits smooth signal transmission of nerve cells and interferes with normal brain function, and declines in memory, which is the main symptom of Alzheimer's disease.

실시예Example 4-1: 바이러스 감염 모델 마우스에서 반응성 성상세포 내 4-1: In viral infection model mice, reactive astrocytes GABAGABA 증가 확인 Confirm increase

알츠하이머 모델 마우스 대신 wildtype C57BL/6 마우스 (구입처: The Jackson Laboratory)를 이용하였고, 마우스를 마취시켜 stereotaxic 장비에 고정시킨 후 시상핵 부위에 GFP 형광단백질을 발현하는 아데노바이러스를 주사하여 바이러스 감염을 유도하였다. 바이러스에 감염된 마우스로부터 실시예 1과 동일한 방법을 사용하여 면역화학적 시험을 수행하였다.A wildtype C57BL / 6 mouse (purchased from The Jackson Laboratory) was used instead of the Alzheimer model mouse. The mice were anesthetized and immobilized on a stereotaxic instrument, and the viral infection was induced by injecting adenovirus expressing GFP fluorescent protein in the thalamic nucleus region. Immunochemical tests were performed using the same method as in Example 1 from virus-infected mice.

도 11에서 보는 바와 같이, 바이러스에 감염되지 않은 시상핵에서는 성상세포(초록색)에 GABA가 거의 없으나, 아데노바이러스를 감염시킨 시상핵에서는 알츠하이머 모델과 마찬가지로 GABA를 많이 가진 성상세포(노란색)들이 나타났다. As shown in FIG. 11, in the aphasia not infected with the virus, GABA is almost absent in astrocytes (green). However, astrocytes infected with adenovirus exhibit astrocytes (yellow) having a large amount of GABA as in the Alzheimer's model.

상기 결과는 GABA를 축적하는 반응성 성상세포가 생길 수 있는 상황이 알츠하이머 병 뿐만 아니라 바이러스 감염을 포함한 다른 퇴행성 뇌질환과 뇌 손상까지 확장될 수 있음을 뒷받침한다.
These results support that the situation in which GABA-accumulating reactive astrocytes can occur extends to Alzheimer's disease as well as other degenerative brain diseases including viral infection and brain damage .

실시예Example 4-2: 파킨슨병 모델 4-2: Parkinson's disease model 랫트와With rats 마우스에서 반응성 성상세포 내 In mice, reactive astrocytes GABAGABA 증가와 MAO-B, Increase and MAO-B, 베스트로핀Best rofin 1의 발현 변화 확인 1

파킨슨병 모델 랫트로는 6-OHDA를 뇌에 주사한 wildtype 랫트를 사용하였고, 파킨슨병 모델 마우스로는 MPTP를 복강에 주사한 wildtype C57BL/6 마우스(구입처: The Jackson Laboratory)를 이용하였다. 두 모델 모두 흑색질 치밀부(substantia nigra, pars compacta) 부분에 있는 도파민을 생성하는 신경세포를 죽여 파킨슨 증상을 유도하였다. 이로부터 실시예 1과 동일한 방법을 사용하여 면역화학적 시험을 수행하였다.Wildtype rats injected with brain 6-OHDA were used as model rats for Parkinson's disease. Wildtype C57BL / 6 mice (Jackson Jackson Laboratory) injected with MPTP intraperitoneally as a Parkinson's disease model mouse were used. Both models killed neurons that produce dopamine in the substantia nigra (pars compacta), leading to Parkinsonism. From this, an immunochemical test was carried out using the same method as in Example 1.

도 12에서 보는 바와 같이, 파킨슨병 모델 랫트에서 알츠하이머 모델과 마찬가지로 반응성 성상세포 내에서 MAO-B 발현이 능가하고 GABA의 양이 늘어나는 것을 확인할 수 있었다. 또한 도 13에서 보는 바와 같이 파킨슨병 모델 마우스에서 베스트로핀 1 채널의 세포내 분포 양상이 반응성 성상세포에서 마이크로도메인으로부터 세포체와 주돌기 쪽으로 점차 변화하였으며 발현량도 증가하였다. 또한 반응성 성상세포 내에서 GABA의 양도 늘어났다. As shown in FIG. 12, it was confirmed that the MAO-B expression and the amount of GABA were increased in the reactive astrocytes in the Parkinson's model rats as in the Alzheimer's model. Also, as shown in FIG. 13, the intracellular distribution pattern of the best lopin 1 channel in the Parkinson's disease model gradually changed from the microdomain to the cell body and the main prominence in the responsive astrocytic cells, and the expression amount was also increased. The amount of GABA in the reactive astrocytes was also increased.

상기 결과는 GABA를 축적하는 반응성 성상세포가 생길 수 있는 상황이 알츠하이머 병 뿐만 아니라 파킨슨병을 포함한 다른 퇴행성 뇌질환과 뇌 손상까지 확장될 수 있음을 뒷받침한다.
These results support that the situation in which GABA-accumulating reactive astrocytes can occur extends to Alzheimer's disease as well as other degenerative brain diseases including Parkinson's disease and brain damage .

실시예Example 4-3: 해마 손상 마우스 모델에서 반응성 성상세포 내 4-3: In hippocampal injury mouse model, GABAGABA 증가와 With increasing MAOMAO -B, 베스트로핀 1 및 -B, best-pin 1 and GABAGABA 트랜스아미나아제의 발현 변화 확인 Identification of expression of transaminase

알츠하이머 모델 마우스 대신 GFAP-EGFP 형질전환 마우스(구입처: The Jackson Laboratory)를 이용하였고, 실시예 1과 동일한 방법으로 마우스를 마취시켜, 마취 상태의 마우스의 해마에 뾰족한 핀을 도입하여 해마 손상을 유도하였다. 해마 손상 후 5일째, 14일째 마우스로부터 실시예 1과 동일한 방법을 사용하여 면역화학적 시험을 수행하였다.GFAP-EGFP transgenic mice (purchased from The Jackson Laboratory) were used instead of Alzheimer's model mice, and mice were anesthetized in the same manner as in Example 1 to induce hippocampal injury by introducing sharp pins into the hippocampus of an anesthetized mouse . On the fifth day after hippocampal injury, on day 14, immunochemical tests were carried out from the mice using the same method as in Example 1.

도 6에서 보는 바와 같이, 해마 손상 후 5일째, 14일째에서 알츠하이머 모델과 마찬가지로 반응성 성상세포의 베스트로핀 1 채널의 세포내 분포 양상이 반응성 성상세포에서 마이크로도메인으로부터 세포체와 주돌기 쪽으로 점차 변화하였으며, 도 7에서 보는 바와 같이, 해마 손상 후 5일째에 반응성 성상세포 내에서 MAO-B 발현이 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 8에서 보는 바와 같이, 해마 손상 후 5일째에 성상세포의 세포체와 주돌기의 크기가 증가한 것에 비해서, 세포 면적당 GABA 트랜스아마나아제의 발현은 감소하였음을 확인할 수 있었다.As shown in FIG. 6, the distribution pattern of the best ropin 1 channel of the reactive astrocytes was gradually changed from the microdomain to the cell body and the main prominence in the reactive astrocytes, as in the Alzheimer's model at the 5th day and 14th day after hippocampal damage , As shown in FIG. 7, it was confirmed that MAO-B expression was increased in the responsive astrocytes on the fifth day after hippocampal injury. In addition, as shown in FIG. 8, it was confirmed that the expression of GABA transaminase per cell area was decreased compared to the increase in the size of cell bodies and prominence of astrocytes at 5 days after hippocampal injury.

상기 결과는 GABA를 축적하는 반응성 성상세포가 생길 수 있는 상황이 알츠하이머 병 뿐만 아니라 다른 퇴행성 뇌질환과 뇌 손상까지 확장될 수 있음을 뒷받침한다.
These results support that the situation in which reactive astrocytes accumulating GABA can occur can extend to other degenerative brain diseases and brain damage as well as Alzheimer's disease .

실시예Example 5: 5: MAOMAO -B의 활성을 저해시키는 물질의 스크리닝을 위한 화합물의 제조Preparation of compounds for the screening of substances which inhibit the activity of B

상기 실시예에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 퇴행성 뇌질환의 치료와 관련이 있는 MAO-B의 활성을 저해시키는 화합물을 스크리닝하기 위해서, 하기와 같은 방법으로 총 79종의 화합물을 얻었다.
As described in the above examples, a total of 79 compounds were obtained in the following manner in order to screen for a compound inhibiting MAO-B activity, which is related to the treatment of the degenerative brain disease of the present invention.

실시예Example 5-1: N-(2,6- 5-1: N- (2,6- 디클로로피리딘Dichloropyridine -3-일)-3 days) 벤즈아미드의Benzamide 합성 synthesis

벤조일 클로라이드(0.038 ml, 0.33 mmol)을 아세토니트릴 4 ml에 녹인 뒤, 2,6-디클로로피리딘-3-아민(50mg, 0.30mmol)을 넣고, 70℃에서 6시간 동안 환류하였다. TLC로 반응 종결을 확인하고 상온으로 식힌 다음 감압 증류하였다. 생성된 갈색 고체를 소량의 메탄올을 넣으면 하얀 고체가 생성되는데, 이를 여과 건조하여 목적화합물 58.7 mg (0.22 mmol, 수득율: 73~90%)을 얻었다. Benzoyl chloride (0.038 ml, 0.33 mmol) was dissolved in 4 ml of acetonitrile, followed by the addition of 2,6-dichloropyridin-3-amine (50 mg, 0.30 mmol) and refluxing at 70 ° C for 6 hours. The reaction was terminated by TLC, and the reaction mixture was cooled to room temperature and distilled under reduced pressure. A small amount of methanol was added to the resulting brown solid to give a white solid which was then filtered and dried to obtain 58.7 mg (0.22 mmol, yield: 73-90%) of the title compound.

¹H NMR (400 MHz, MeOD) δ 8.29 (d, J=8.4Hz,1H),8.00-7.98(m,2H),7.62(t,J=6.1Hz,1H),7.57-7.50(m,3H) ^{1 H NMR (400 MHz, MeOD} ) δ 8.29 (d, J = 8.4Hz, 1H), 8.00-7.98 (m, 2H), 7.62 (t, J = 6.1Hz, 1H), 7.57-7.50 (m, 3H )

실시예Example 5-2: 2- 5-2: 2- 클로로Chloro -N-(2,6--N- (2,6- 디클로로피리딘Dichloropyridine -3-일)-3 days) 벤즈아미드의Benzamide 합성 synthesis

시작물질로 2-클로로벤조일 클로라이드(0.04 ml, 0.33 mmol)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-1과 동일한 방법으로 목적화합물 65 mg (0.19 mmol, 75%)을 얻었다.65 mg (0.19 mmol, 75%) of the title compound was obtained in the same manner as in Example 5-1, except that 2-chlorobenzoyl chloride (0.04 ml, 0.33 mmol) was used as starting material.

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ8.98(d,J=8.6Hz,1H),8.68(s,1H),7.80(d,J=6.67Hz,1H),7.56-7.52(m,2H),7.49-7.45(m,1H),7.39(d,J=8.6Hz,1H) ^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ8.98 (d, J = 8.6Hz, 1H), 8.68 (s, 1H), 7.80 (d, J = 6.67Hz, 1H), 7.56-7.52 (m, 2H ), 7.49-7.45 (m, IH), 7.39 (d, J = 8.6 Hz, IH)

실시예Example 5-3: N-(2,6- 5-3: N- (2,6- 디클로로피리딘Dichloropyridine -3-일)-3-Yl) -3- 플루오로벤즈아미드의Fluorobenzamide 합성 synthesis

시작물질로 3-플루오로벤조일 클로라이드(0.04 ml, 0.33 mmol)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-1과 동일한 방법으로 목적화합물 45 mg (0.18 mmol, 60~100%)을 얻었다.45 mg (0.18 mmol, 60-100%) of the title compound was obtained in the same manner as in Example 5-1, except that 3-fluorobenzoyl chloride (0.04 ml, 0.33 mmol) was used as starting material.

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) 8.93(d,J=8.5Hz,1H),8.37(s,1H),7.68(t,J=7.5Hz,2H),7.57(q,J=8.0Hz,1H),7.41-7.34(m,2H) ^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) 8.93 (d, J = 8.5Hz, 1H), 8.37 (s, 1H), 7.68 (t, J = 7.5Hz, 2H), 7.57 (q, J = 8.0Hz, 1H), < / RTI > 7.41-7.34 (m, 2H)

실시예Example 5-4: 3- 5-4: 3- 클로로Chloro -N-(2,6--N- (2,6- 디클로로피리딘Dichloropyridine -3-일)-3 days) 벤즈아미드의Benzamide 합성 synthesis

시작물질로 3-클로로벤조일 클로라이드 (0.04 ml, 0.33 mmol)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-1과 동일한 방법으로 목적화합물 58.8 mg (0.19 mmol, 59%)을 얻었다.58.8 mg (0.19 mmol, 59%) of the title compound was obtained in the same manner as in Example 5-1, except that 3-chlorobenzoyl chloride (0.04 ml, 0.33 mmol) was used as starting material.

¹H NMR (400 MHz, MeOD) δ 8.22 (d, J=8.3Hz,1H),7.97(t,J=1.9Hz,1H),7.90-7.88(m,1H),7.62-7.61(m,1H),7.5(dd,J=7.9,11.6Hz,2H) ¹ H NMR (400 MHz, MeOD)? 8.22 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.97 (t, J = 1.9 Hz, 1H), 7.90-7.88 (m, 1H), 7.62-7.61 ), 7.5 (dd, J = 7.9, 11.6 Hz, 2H)

실시예Example 5-5: N-(2,6- 5-5: N- (2,6- 디클로로피리딘Dichloropyridine -3-일)-3-Yl) -3- 메틸벤즈아미드의Methylbenzamide 합성 synthesis

시작물질로 3-메틸벤조일 클로라이드 (0.63 ml, 4.7 mmol)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-1과 동일한 방법으로 목적화합물 1g (3.6 mmol, 83%)을 얻었다.1 g (3.6 mmol, 83%) of the title compound was obtained in the same manner as in Example 5-1, except that 3-methylbenzoyl chloride (0.63 ml, 4.7 mmol) was used as starting material.

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ8.92(d,J=8.4Hz,1H),8.36(s,1H),7.72(s,1H),7.70-7.67(m,1H),7.43(d,J=4.2Hz,1H),7.35(d,J=3.3Hz,1H),2.47(s,3H) ^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ8.92 (d, J = 8.4Hz, 1H), 8.36 (s, 1H), 7.72 (s, 1H), 7.70-7.67 (m, 1H), 7.43 (d , J = 4.2Hz, 1H), 7.35 (d, J = 3.3Hz, 1H), 2.47 (s, 3H)

실시예Example 5-6: N-(2,6- 5-6: N- (2,6- 디클로로피리딘Dichloropyridine -3-일)-3-Yl) -3- 니트로벤즈아미드의Nitrobenzamide 합성 synthesis

시작물질로 3-니트로벤조일 클로라이드(626 mg, 3.4 mmol)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-1과 동일한 방법으로 목적화합물 960 mg (3.07 mmol, 99%)을 얻었다.960 mg (3.07 mmol, 99%) of the title compound was obtained in the same manner as in Example 5-1, except that 3-nitrobenzoyl chloride (626 mg, 3.4 mmol) was used as starting material.

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ8.87(d,J=8.4Hz,1H),8.77(s,1H),8.49(dd,J=2.4,6.0Hz,1H),8.37(s,1H),8.24(d,J=7.8Hz,1H),7.89(t,J=8.1Hz,1H),7.58(d,J=3.6Hz,1H) ^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ8.87 (d, J = 8.4Hz, 1H), 8.77 (s, 1H), 8.49 (dd, J = 2.4,6.0Hz, 1H), 8.37 (s, 1H ), 8.24 (d, J = 7.8Hz, 1H), 7.89 (t, J = 8.1Hz, 1H), 7.58 (d, J = 3.6Hz, 1H)

실시예Example 5-7: 3- 5-7: 3- 시아노Cyano -N-(2,6--N- (2,6- 디클로로피리딘Dichloropyridine -3-일)-3 days) 벤즈아미드의Benzamide 합성 synthesis

시작물질로 3-시아노벤조일 클로라이드 (1 g, 6.1 mmol)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-1과 동일한 방법으로 목적화합물 1.5 g(5.1 mmol, 83%)을 얻었다.1.5 g (5.1 mmol, 83%) of the title compound was obtained in the same manner as in Example 5-1, except that 3-cyanobenzoyl chloride (1 g, 6.1 mmol) was used as starting material.

¹H NMR (300 MHz, DMSO-d ₆ )δ8.41(s,1H),8.29(d,J=10.5Hz,1H),8.18-8.09(m,2H),7.78(t,J=7.8Hz,1H),7.65(dd,J=0.9,7.2Hz,1H) ^{1 H NMR (300 MHz, DMSO-} d 6) δ8.41 (s, 1H), 8.29 (d, J = 10.5Hz, 1H), 8.18-8.09 (m, 2H), 7.78 (t, J = 7.8Hz , 1H), 7.65 (dd, J = 0.9, 7.2 Hz, 1H)

실시예Example 5-8: N-(2,6- 5-8: N- (2,6- 디클로로피리딘Dichloropyridine -3-일)-4-Yl) -4- 플루오로벤즈아미드의Fluorobenzamide 합성 synthesis

시작물질로 4-플루오로벤조일 클로라이드 (0.04 ml, 0.33 mmol)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-1과 동일한 방법으로 목적화합물 70 mg (0.28 mmol, 94%)을 얻었다.The objective compound (70 mg, 0.28 mmol, 94%) was obtained in the same manner as in Example 5-1, except that 4-fluorobenzoyl chloride (0.04 ml, 0.33 mmol) was used as starting material.

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ8.72(d,J=4.5Hz,1H),8.24(s,1H),7.72(d,J=8.0Hz,2H),7.46(d,J=8.1Hz,2H),7.28(d,J=8.0z,1H) ^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ8.72 (d, J = 4.5Hz, 1H), 8.24 (s, 1H), 7.72 (d, J = 8.0Hz, 2H), 7.46 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.28 (d, J = 8.0 Hz, 1H)

실시예Example 5-9: 4- 5-9: 4- 클로로Chloro -N-(2,6--N- (2,6- 디클로로피리딘Dichloropyridine -3-일)-3 days) 벤즈아미드의Benzamide 합성 synthesis

시작물질로 4-클로로벤조일 클로라이드 (0.04 ml, 0.33 mmol)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-1과 동일한 방법으로 목적화합물 90 mg (0.29 mmol, 99%)을 얻었다.The target compound (90 mg, 0.29 mmol, 99%) was obtained in the same manner as in Example 5-1, except that 4-chlorobenzoyl chloride (0.04 ml, 0.33 mmol) was used as starting material.

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ8.93(d,J=4.7Hz,1H),8.34(s,1H),7.89(d,J=8.3Hz,2H),7.56(d,J=8.3Hz,2H),7.39(d,J=8.6Hz,1H) ^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ8.93 (d, J = 4.7Hz, 1H), 8.34 (s, 1H), 7.89 (d, J = 8.3Hz, 2H), 7.56 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.39 (d, J = 8.6 Hz, 1 H)

실시예Example 5-10: 4- 5-10: 4- 브로모Bromo -N-(2,6--N- (2,6- 디클로로피리딘Dichloropyridine -3-일)-3 days) 벤즈아미드의Benzamide 합성 synthesis

시작물질로 4-브로모벤조일 클로라이드 (739 mg, 3.37 mmol)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-1과 동일한 방법으로 목적화합물 610 mg (1.77 mmol, 56~95%)을 얻었다.610 mg (1.77 mmol, 56% to 95%) of the desired compound was obtained in the same manner as in Example 5-1, except that 4-bromobenzoyl chloride (739 mg, 3.37 mmol) was used as starting material.

¹H NMR (300 MHz, MeOD) δ 8.27 (d, J=8.3Hz,1H),7.92-7.89(m,2H),7.76-7.73(m,2H),7.51(d,J=8.4Hz,1H) ^{1 H NMR (300 MHz, MeOD} ) δ 8.27 (d, J = 8.3Hz, 1H), 7.92-7.89 (m, 2H), 7.76-7.73 (m, 2H), 7.51 (d, J = 8.4Hz, 1H )

실시예Example 5-11: N-(2,6- 5-11: N- (2,6- 디클로로피리딘Dichloropyridine -3-일)-4-Yl) -4- 메틸벤즈아미드의Methylbenzamide 합성 synthesis

시작물질로 4-메틸벤조일 클로라이드(0.63 ml, 4.7 mmol)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-1과 동일한 방법으로 목적화합물 970 mg(3.6 mmol, 80%)을 얻었다.970 mg (3.6 mmol, 80%) of the title compound was obtained in the same manner as in Example 5-1, except that 4-methylbenzoyl chloride (0.63 ml, 4.7 mmol) was used as starting material.

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ8.97(d,J=8.6Hz,1H),8.38(s,1H),7.84(d,J=8.1Hz,2H),7.38(d,J=8.3Hz,3H),2.49(s,3H) ^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ8.97 (d, J = 8.6Hz, 1H), 8.38 (s, 1H), 7.84 (d, J = 8.1Hz, 2H), 7.38 (d, J = 8.3 Hz, 3H), 2.49 (s, 3H)

실시예Example 5-12: N-(2,6- 5-12: N- (2,6- 디클로로피리딘Dichloropyridine -3-일)-4-Yl) -4- 메톡시벤즈아미드의Methoxybenzamide 합성 synthesis

시작물질로 4-메톡시벤조일 클로라이드(0.95 ml, 6.7 mmol)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-1과 동일한 방법으로 목적화합물 1.8 g (6.0 mmol, 98%)을 얻었다.1.8 g (6.0 mmol, 98%) of the title compound was obtained in the same manner as in Example 5-1, except that 4-methoxybenzoyl chloride (0.95 ml, 6.7 mmol) was used as starting material.

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ8.96(d,J=8.6Hz,1H),8.33(s,1H),7.94-7.90(m,2H),7.38(d,J=8.5Hz,1H),7.09-7.04(m,2H),3.94(s,3H)
^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ8.96 (d, J = 8.6Hz, 1H), 8.33 (s, 1H), 7.94-7.90 (m, 2H), 7.38 (d, J = 8.5Hz, 1H ), 7.09-7.04 (m, 2H), 3.94 (s, 3H)

실시예Example 5-13: N-(2,6- 5-13: N- (2,6- 디클로로피리딘Dichloropyridine -3-일)-4-Yl) -4- 니트로벤즈아미드의Nitrobenzamide 합성 synthesis

시작물질로 4-니트로벤조일 클로라이드 (620 mg, 6.7 mmol)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-1과 동일한 방법으로 목적화합물 1.6 g (5.2 mmol, 84%)을 얻었다.1.6 g (5.2 mmol, 84%) of the desired compound was obtained in the same manner as in Example 5-1, except that 4-nitrobenzoyl chloride (620 mg, 6.7 mmol) was used as starting material.

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ8.93(d,J=8.6Hz,1H),8.45(d,J=8.6Hz,2H),8.41(s,1H),8.13(d,J=8.9Hz,2H),7.43(d,J=8.6Hz,1H) ^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ8.93 (d, J = 8.6Hz, 1H), 8.45 (d, J = 8.6Hz, 2H), 8.41 (s, 1H), 8.13 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 7.43 (d, J = 8.6 Hz, 1 H)

실시예Example 5-14: 4- 5-14: 4- 시아노Cyano -N-(2,6--N- (2,6- 디클로로피리딘Dichloropyridine -3-일)-3 days) 벤즈아미드의Benzamide 합성 synthesis

시작물질로 4-시아노벤조일 클로라이드 (1.13 ml, 6.8 mmol)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-1과 동일한 방법으로 목적화합물 1.7 g (5.9 mmol, 96%)을 얻었다.1.7 g (5.9 mmol, 96%) of the title compound was obtained in the same manner as in Example 5-1, except that 4-cyanobenzoyl chloride (1.13 ml, 6.8 mmol) was used as starting material.

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ8.92(d,J=8.6Hz,1H),8.38(s,1H),8.05(d,J=8.3Hz,2H),7.90(d,J=8.2Hz,2H),7.42(d,J=8.6Hz,1H) ^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ8.92 (d, J = 8.6Hz, 1H), 8.38 (s, 1H), 8.05 (d, J = 8.3Hz, 2H), 7.90 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.42 (d, J = 8.6 Hz, 1 H)

실시예Example 5-15: 5- 5-15: 5- 클로로Chloro -2--2- 페닐옥사졸로[5,4-b]피리딘의Phenyl oxazolo [5,4-b] pyridine 합성 synthesis

N-(2,6-디클로로피리딘-3-일)벤즈아미드(58 mg, 0.22 mmol)와 소듐 카보네이트 25 mg을 디메틸포름아미드 2.2 ml에 넣은 뒤, 160℃에서 24시간 동안 환류시켰다. TLC로 반응 종결을 확인하고, 상온에서 식힌 뒤, 감압 농축한 농축액에 소량의 증류수를 넣고 수층을 메틸렌 클로라이드로 추출하였다. 추출한 유기층을 무수 MgSO₄로 건조시킨 후, 여과하고 감압 농축하였다. 농축액을 컬럼 크로마토그래피(헥산 : 에틸아세테이트 = 20 : 1)로 분리하여 목적화합물 48 mg (0.21 mmol, 95%)을 얻었다.(58 mg, 0.22 mmol) and sodium carbonate (25 mg) were added to 2.2 ml of dimethylformamide, and the mixture was refluxed at 160 ° C for 24 hours. The reaction was terminated by TLC, and after cooling at room temperature, a small amount of distilled water was added to the concentrated solution which was concentrated under reduced pressure, and the aqueous layer was extracted with methylene chloride. The extracted organic layer was dried over anhydrous MgSO ₄ , filtered, and concentrated under reduced pressure. The concentrate was separated by column chromatography (hexane: ethyl acetate = 20: 1) to obtain 48 mg (0.21 mmol, 95%) of the desired compound.

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ8.30(d,J=6.4Hz,2H),8.05(d,J=8.2Hz,1H),7.67-7.57(m,3H),7.43(d,J=8.2Hz,1H) ^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ8.30 (d, J = 6.4Hz, 2H), 8.05 (d, J = 8.2Hz, 1H), 7.67-7.57 (m, 3H), 7.43 (d, J = 8.2 Hz, 1H)

실시예Example 5-16: 5- 5-16: 5- 클로로Chloro -2-(2--2- (2- 클로로페닐Chlorophenyl )) 옥사졸로Oxazole [5,4-b]피리딘의 합성[5,4-b] pyridine

시작물질로 2-클로로-N-(2,6-디클로로피리딘-3-일)벤즈아미드 (600 mg, 2.0 mmol)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-15와 동일한 방법으로 목적화합물 400 mg (1.5 mmol, 75%)을 얻었다.(600 mg, 2.0 mmol) was used as starting material in place of 2-chloro-N- (2,6-dichloropyridin-3-yl) 1.5 mmol, 75%).

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ8.20(d,J=8.6Hz,1H),7.99(d,J=8.2Hz,1H),7.65(d,J=8.1Hz,1H),7.45-7.33(m,3H) ^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ8.20 (d, J = 8.6Hz, 1H), 7.99 (d, J = 8.2Hz, 1H), 7.65 (d, J = 8.1Hz, 1H), 7.45- 7.33 (m, 3 H)

실시예Example 5-17: 5- 5-17: 5- 클로로Chloro -2-(3--2- (3- 플루오로페닐Fluorophenyl )) 옥사졸로Oxazole [5,4-b]피리딘의 합성[5,4-b] pyridine

시작물질로 N-(2,6-디클로로피리딘-3-일)-3-플루오로벤즈아미드 (300 mg, 1.0 mmol)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-15와 동일한 방법으로 목적화합물 130 mg (0.52 mmol, 51~80%)을 얻었다.(300 mg, 1.0 mmol) was used as starting material in place of N- (2,6-dichloropyridin-3-yl) -3-fluorobenzamide (0.52 mmol, 51-80%).

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ8.07(d,J=8.1Hz,2H),7.97(d,J=9.1Hz,1H),7.57(q,J=8.0Hz,1H),7.44(d,J=8.2Hz,1H),7.36-7.30(m,1H) ^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ8.07 (d, J = 8.1Hz, 2H), 7.97 (d, J = 9.1Hz, 1H), 7.57 (q, J = 8.0Hz, 1H), 7.44 ( d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.36-7.30 (m, 1H)

실시예Example 5-18: 5- 5-18: 5- 클로로Chloro -2-(3--2- (3- 클로로페닐Chlorophenyl )) 옥사졸로Oxazole [5,4-b]피리딘의 합성[5,4-b] pyridine

시작물질로 3-클로로-N-(2,6-디클로로피리딘-3-일)벤즈아미드 (500 mg, 1.65 mmol)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-15와 동일한 방법으로 목적화합물 275 mg (1.03 mmol, 63%)을 얻었다.(500 mg, 1.65 mmol) was used as starting material in place of 3-chloro-N- (2,6-dichloropyridin-3-yl) benzamide 1.03 mmol, 63%).

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ8.29(s,1H),8.50(dd,J=2.9,4.6Hz,1H),8.06(d,J=8.2Hz,1H),7.63-7.51(m,2H),7.45(d,J=8.2Hz,1H) ^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ8.29 (s, 1H), 8.50 (dd, J = 2.9,4.6Hz, 1H), 8.06 (d, J = 8.2Hz, 1H), 7.63-7.51 (m , 2H), 7.45 (d, J = 8.2 Hz, 1H)

실시예Example 5-19: 5- 5-19: 5- 클로로Chloro -2-m--2-m- 톨일옥사졸로[5,4-b]피리딘의To a solution of < RTI ID = 0.0 > [5,4-b] pyridine 합성 synthesis

시작물질로 N-(2,6-디클로로피리딘-3-일)-3-메틸벤즈아미드 (200 mg, 0.7 mmol)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-15와 동일한 방법으로 목적화합물 130 mg (0.53 mmol, 76%)을 얻었다.(200 mg, 0.7 mmol) was used as starting material in place of N- (2,6-dichloropyridin-3-yl) -3-methylbenzamide 0.53 mmol, 76%).

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ8.07-7.97(m,3H),7.46-7.32(m,3H), 2.46(s,3H) ^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ8.07-7.97 (m, 3H), 7.46-7.32 (m, 3H), 2.46 (s, 3H)

실시예Example 5-20: 5- 5-20: 5- 클로로Chloro -2-(3--2- (3- 니트로페닐Nitrophenyl )) 옥사졸로Oxazole [5,4-b]피리딘의 합성[5,4-b] pyridine

시작물질로 N-(2,6-디클로로피리딘-3-일)-3-니트로벤즈아미드 (230 mg, 0.74 mmol)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-15와 동일한 방법으로 목적화합물 103 mg (0.37 mmol, 50%)을 얻었다.(3-nitrobenzamide) (230 mg, 0.74 mmol) was used as starting material in the same manner as in Example 5-15, except that 103 mg ( 0.37 mmol, 50%).

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ9.11(s,1H),8.56(d,J=5.4Hz,1H),8.44(d,J=5.1Hz,1H),8.08(d,J=8.4Hz,1H),7.78(t,J=8.1Hz,1H),7.45(d,J=8.4Hz,1H)
^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ9.11 (s, 1H), 8.56 (d, J = 5.4Hz, 1H), 8.44 (d, J = 5.1Hz, 1H), 8.08 (d, J = 8.4 J = 8.1 Hz, 1H), 7.45 (d, J = 8.4 Hz, 1H)

실시예Example 5-21: 3-(5- 5-21: 3- (5- 클로로옥사졸로[5,4-b]피리딘Chlorooxazolo [5,4-b] pyridine -2-일)-2 days) 벤조니트릴의Benzonitrile 합성 synthesis

시작물질로 3-시아노-N-(2,6-디클로로피리딘-3-일)벤즈아미드 (500 mg, 1.0 mmol)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-15와 동일한 방법으로 목적화합물 165 mg (0.65 mmol, 38%)을 얻었다.(500 mg, 1.0 mmol) was used as the starting material, the objective compound (165 mg, 0.12 mmol) was obtained as light yellow crystals in the same manner as in Example 5-15, except that 3-cyano- (0.65 mmol, 38%).

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃)δ8.55(s,1H),8.47(d,J=5.2Hz,1H),8.06(d,J=8.2Hz,1H),7.87(d,J=5.1Hz,1H),7.70(t,J=7.8Hz,1H),7.44(d,J=8.2Hz,1H) ^{1 H NMR (400 MHz, CDCl} 3) δ8.55 (s, 1H), 8.47 (d, J = 5.2Hz, 1H), 8.06 (d, J = 8.2Hz, 1H), 7.87 (d, J = 5.1 J = 7.8 Hz, 1H), 7.44 (d, J = 8.2 Hz, 1H)

실시예Example 5-22: 5- 5-22: 5- 클로로Chloro -2-(4--2- (4- 플루오로페닐Fluorophenyl )) 옥사졸로Oxazole [5,4-b]피리딘의 합성[5,4-b] pyridine

시작물질로 N-(2,6-디클로로피리딘-3-일)-4-플루오로벤즈아미드 (400 mg, 1.37 mmol)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-15와 동일한 방법으로 목적화합물 250 mg (1.01 mmol, 73%)을 얻었다.(400 mg, 1.37 mmol) was used as starting material in place of N- (2,6-dichloropyridin-3-yl) -4-fluorobenzamide (1.01 mmol, 73%).

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ8.32-8.26(m,2H),8.04(d,J=8.2Hz,1H),7.43(d,J=8.2Hz,1H),7.32-7.21(m,2H) ^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ8.32-8.26 (m, 2H), 8.04 (d, J = 8.2Hz, 1H), 7.43 (d, J = 8.2Hz, 1H), 7.32-7.21 (m , 2H)

실시예Example 5-23: 5- 5-23: 5- 클로로Chloro -2-(4--2- (4- 클로로페닐Chlorophenyl )) 옥사졸로Oxazole [5,4-b]피리딘의 합성[5,4-b] pyridine

시작물질로 4-클로로-N-(2,6-디클로로피리딘-3-일)벤즈아미드 (500 mg, 1.65 mmol)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-15와 동일한 방법으로 목적화합물 255 mg (0.96 mmol, 60%)을 얻었다.(500 mg, 1.65 mmol) was used as starting material in place of 4-chloro-N- (2,6-dichloropyridin-3-yl) 0.96 mmol, 60%).

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃)δ8.51(dd,J=1.8,5.1Hz,2H),8.01(d,J=8.2Hz,1H),7.54(dd,J=1.8,5.2Hz,2H),7.40(d,J=8.2Hz,1H) ^{1 H NMR (400 MHz, CDCl} 3) δ8.51 (dd, J = 1.8,5.1Hz, 2H), 8.01 (d, J = 8.2Hz, 1H), 7.54 (dd, J = 1.8,5.2Hz, 2H ), 7.40 (d, J = 8.2 Hz, 1H)

실시예Example 5-24: 2-(4- 5-24: 2- (4- 브로모페닐Bromophenyl )-5-) -5- 클로로옥사졸로[5,4-b]피리딘의A solution of the chlorooxazolo [5,4-b] pyridine 합성 synthesis

시작물질로 4-브로모-N-(2,6-디클로로피리딘-3-일)벤즈아미드 (600 mg, 1.7 mmol)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-15와 동일한 방법으로 목적화합물 300 mg (0.97 mmol, 57%)을 얻었다.(600 mg, 1.7 mmol) was used as starting material in place of 4-bromo-N- (2,6-dichloropyridin-3-yl) benzamide (0.97 mmol, 57%).

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ8.15(d,J=8.6Hz,2H),8.05(d,J=8.2Hz,1H),7.74(d,J=8.6Hz,2H),7.44(d,J=8.2Hz,1H) ^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ8.15 (d, J = 8.6Hz, 2H), 8.05 (d, J = 8.2Hz, 1H), 7.74 (d, J = 8.6Hz, 2H), 7.44 ( d, J = 8.2 Hz, 1H)

실시예Example 5-25: 5- 5-25: 5- 클로로Chloro -2-p--2-p- 톨일옥사졸로[5,4-b]피리딘의To a solution of < RTI ID = 0.0 > [5,4-b] pyridine 합성 synthesis

시작물질로 N-(2,6-디클로로피리딘-3-일)-4-메틸벤즈아미드 (450 mg, 1.6 mmol)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-15와 동일한 방법으로 목적화합물 346 mg (1.4 mmol, 88%)을 얻었다.The objective compound (346 mg, yield: 82%) was prepared in the same manner as in Example 5-15, except that N- (2,6-dichloropyridin- 1.4 mmol, 88%).

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ8.18(d,J=8.3Hz,2H),8.02(d,J=8.2Hz,1H),7.42-7.37(m,3H),2.50(s,4H) ^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ8.18 (d, J = 8.3Hz, 2H), 8.02 (d, J = 8.2Hz, 1H), 7.42-7.37 (m, 3H), 2.50 (s, 4H )

실시예Example 5-26: 5- 5-26: 5- 클로로Chloro -2-(4--2- (4- 메톡시페닐Methoxyphenyl )) 옥사졸로Oxazole [5,4-b]피리딘의 합성[5,4-b] pyridine

시작물질로 N-(2,6-디클로로피리딘-3-일)-4-메톡시벤즈아미드 (700 mg, 2.3 mmol)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-15와 동일한 방법으로 목적화합물 434 mg (1.6 mmol, 72%)을 얻었다.The objective compound (434 mg, 0.34 mmol) was prepared in the same manner as in Example 5-15, except for using N- (2,6-dichloropyridin-3-yl) -4- methoxybenzamide (1.6 mmol, 72%).

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ8.23(dd,J=2.0,4.9Hz,2H),7.99(d,J=8.2Hz,1H),7.39(d,J=8.2Hz,1H),7.09(dd,J=2.0,4.9Hz,2H),3.95(s,3H) ^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ8.23 (dd, J = 2.0,4.9Hz, 2H), 7.99 (d, J = 8.2Hz, 1H), 7.39 (d, J = 8.2Hz, 1H), 7.09 (dd, J = 2.0, 4.9 Hz, 2H), 3.95 (s, 3H)

실시예Example 5-27: 5- 5-27: 5- 클로로Chloro -2-(4--2- (4- 니트로페닐Nitrophenyl )) 옥사졸로Oxazole [5,4-b]피리딘의 합성[5,4-b] pyridine

시작물질로 N-(2,6-디클로로피리딘-3-일)-4-니트로벤즈아미드 (230 mg, 0.7 mmol)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-15와 동일한 방법으로 목적화합물 103 mg (0.4 mmol, 51%)을 얻었다.(230 mg, 0.7 mmol) was used as starting material in place of N- (2,6-dichloropyridin-3-yl) -4-nitrobenzamide 0.4 mmol, 51%).

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ8.47(s,4H),8.13(d,J=8.3Hz,1H),7.50(d,J=8.3Hz,1H) ^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ8.47 (s, 4H), 8.13 (d, J = 8.3Hz, 1H), 7.50 (d, J = 8.3Hz, 1H)

실시예Example 5-28: 4-(5- 5-28: 4- (5- 클로로옥사졸로[5,4-b]피리딘Chlorooxazolo [5,4-b] pyridine -2-일)-2 days) 벤조니트릴의Benzonitrile 합성 synthesis

시작물질로 4-시아노-N-(2,6-디클로로피리딘-3-일)벤즈아미드 (500 mg, 1.7 mmol)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-15와 동일한 방법으로 목적화합물 197 mg (0.8 mmol, 45%)을 얻었다.(500 mg, 1.7 mmol) of 4-cyano-N- (2,6-dichloropyridin-3-yl) benzamide was used as starting material in a similar manner to Example 5-15. (0.8 mmol, 45%).

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ8.41(d,J=8.3Hz,2H),8.11(d,J=8.3Hz,1H),7.90(d,J=8.3Hz,2H),7.49(d,J=8.3Hz,1H) ^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ8.41 (d, J = 8.3Hz, 2H), 8.11 (d, J = 8.3Hz, 1H), 7.90 (d, J = 8.3Hz, 2H), 7.49 ( d, J = 8.3 Hz, 1H)

실시예Example 5-29: 5- 5-29: 5- 클로로Chloro -2--2- 페닐티아졸로[5,4-b]피리딘의Phenylthiazolo [5,4-b] pyridine 합성 synthesis

N-(2,6-디클로로피리딘-3-일)벤즈아미드 (50 mg, 0.2 mmol)과 lawesson’s reagent (117 mg, 0.3 mmol) 을 3 ml의 톨루엔에 넣은 뒤, 110℃에서 5시간 동안 환류시켰다. TLC로 반응의 진행을 확인하고 식힌 뒤, 감압 증류한 농축액에 K₂CO₃(80 mg, 0.6 mmol)과 디메틸포름아미드 3 ml를 넣고 160℃에서 3시간 동안 환류시켰다. 이후, TLC로 반응 종결을 확인하고 상온에서 식힌 뒤, 소량의 증류수를 넣고 수층을 메틸렌 클로라이드로 추출하였다. 유기층을 무수 Mg₂SO₄로 건조시킨 후, 여과하고 감압 농축한 농축액을 컬럼 크로마토그래피(헥산 : 에틸아세테이트 = 20 : 1)로 분리하여 목적화합물 22 mg (0.1 mmol, 50~70%)을 얻었다.(50 mg, 0.2 mmol) and Lawesson's reagent (117 mg, 0.3 mmol) were added to 3 ml of toluene, and the mixture was refluxed at 110 ° C for 5 hours . After confirming the progress of the reaction by TLC and cooling, K ₂ CO ₃ (80 mg, 0.6 mmol) and 3 ml of dimethylformamide were added to the concentrate which was distilled under reduced pressure, and the mixture was refluxed at 160 ° C. for 3 hours. After completion of the reaction was confirmed by TLC and cooling at room temperature, a small amount of distilled water was added, and the aqueous layer was extracted with methylene chloride. The organic layer was dried over anhydrous Mg ₂ SO ₄ , filtered and concentrated under reduced pressure. The concentrate was separated by column chromatography (hexane: ethyl acetate = 20: 1) to obtain 22 mg (0.1 mmol, 50-70% .

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃)δ8.22(d,J=8.5Hz,1H),8.09-8.07(m,2H),7.55-7.50(m,3H),7.45(d,J=8.5Hz,1H) ^{1 H NMR (400 MHz, CDCl} 3) δ8.22 (d, J = 8.5Hz, 1H), 8.09-8.07 (m, 2H), 7.55-7.50 (m, 3H), 7.45 (d, J = 8.5Hz , 1H)

실시예Example 5-30: 2- 5-30: 2- 페닐Phenyl -5-(-5- ( 피롤리딘Pyrrolidine -1-일)-1 day) 옥사졸로Oxazole [5,4-b]피리딘의 합성[5,4-b] pyridine

5-클로로-2-페닐옥사졸로[5,4-b]피리딘 (200 mg, 0.9 mmol)과 10당량의 피롤리딘을 디메틸포름아미드 1 ml에 넣은 뒤, 135℃에서 4시간 동안 환류시켰다. TLC로 반응 종결을 확인하고, 상온에서 식힌 뒤, 감압증류하여 피롤리딘을 제거하였다. 농축액에 포화 NaHCO₃용액을 넣고 수층을 메틸렌 클로라이드로 추출하고 유기층을 무수 Na₂SO₄로 건조시킨 후, 여과하고 감압 농축하였다. 농축액을 컬럼 크로마토그래피(헥산 : 에틸아세테이트 = 20 : 1)로 분리하여 목적화합물 33 mg (0.1 mmol, 15%)을 얻었다.5-Chloro-2-phenyloxazolo [5,4-b] pyridine (200 mg, 0.9 mmol) and 10 equivalents of pyrrolidine were added to 1 ml of dimethylformamide and refluxed at 135 ° C for 4 hours. The reaction was terminated by TLC, and after cooling at room temperature, pyrrolidine was removed by distillation under reduced pressure. Saturated NaHCO ₃ solution was added to the concentrate, and the aqueous layer was extracted with methylene chloride. The organic layer was dried over anhydrous Na ₂ SO ₄ , filtered, and concentrated under reduced pressure. The concentrate was separated by column chromatography (hexane: ethyl acetate = 20: 1) to obtain 33 mg (0.1 mmol, 15%) of the desired compound.

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ8.23-8.20(m,2H),7.82(d,J=8.7Hz,1H),7.53-7.49(m,3H),6.40(d,J=8.7Hz,1H),3.56(t,J=6.7Hz,4H),2.10-2.06(m,4H) ^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ8.23-8.20 (m, 2H), 7.82 (d, J = 8.7Hz, 1H), 7.53-7.49 (m, 3H), 6.40 (d, J = 8.7Hz , 3.56 (t, J = 6.7 Hz, 4H), 2.10-2.06 (m, 4H)

실시예Example 5-31: 2- 5-31: 2- 페닐Phenyl -5-(-5- ( 피롤리딘Pyrrolidine -1-일)티아졸로[5,4-b]피리딘의 합성-1-yl) thiazolo [5,4-b] pyridine

시작물질로 5-클로로-2-페닐티아졸로[5,4-b]피리딘 (100 mg, 0.4 mmol)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 74 mg (0.3 mmol, 65%)을 얻었다.(100 mg, 0.4 mmol) was used as starting material in place of 5-chloro-2-phenylthiazolo [5,4-b] pyridine 65%).

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ8.03(d,J=8.9Hz,3H),7.50-7.45(m,3H),6.54(d,J=9.0Hz,1H),3.58(t,J=6.7Hz,4H),2.10-2.05(m,4H) ^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ8.03 (d, J = 8.9Hz, 3H), 7.50-7.45 (m, 3H), 6.54 (d, J = 9.0Hz, 1H), 3.58 (t, J = 6.7 Hz, 4H), 2.10-2.05 (m, 4H)

실시예Example 5-32: 2-(2- 5-32: 2- (2- 클로로페닐Chlorophenyl )-5-() -5- ( 피롤리딘Pyrrolidine -1-일)-1 day) 옥사졸로Oxazole [5,4-b]피리딘의 합성 [5,4-b] pyridine

시작물질로 5-클로로-2-(2-클로로페닐)옥사졸로[5,4-b]피리딘 (100 mg, 0.4 mmol)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 38 mg (0.13 mmol, 32%)을 얻었다.The objective compound 38 (5 mg) was synthesized in the same manner as in 5-6 except that 5-chloro-2- (2-chlorophenyl) oxazolo [5,4- b] pyridine mg (0.13 mmol, 32%).

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ8.21-8.16(m,1H),7.91(d,J=8.7Hz,1H),7.60-7.54(m,1H),7.44-7.38(m,2H),6.43(d,J=8.8Hz,1H),3.58(s,4H),2.08(s,4H) ^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ8.21-8.16 (m, 1H), 7.91 (d, J = 8.7Hz, 1H), 7.60-7.54 (m, 1H), 7.44-7.38 (m, 2H) , 6.43 (d, J = 8.8 Hz, 1 H), 3.58 (s, 4 H), 2.08 (s,

실시예Example 5-33: 2-(3- 5-33: 2- (3- 클로로페닐Chlorophenyl )-5-() -5- ( 피롤리딘Pyrrolidine -1-일)-1 day) 옥사졸로Oxazole [5,4-b]피리딘의 합성[5,4-b] pyridine

시작물질로 5-클로로-2-(3-클로로페닐)옥사졸로[5,4-b]피리딘 (100 mg, 0.4 mmol)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 30 mg (0.1 mmol, 26%)을 얻었다.The objective compound 30 (5 mg) was synthesized in the same manner as in 5-6 except that 5-chloro-2- (3-chlorophenyl) oxazolo [5,4- b] pyridine mg (0.1 mmol, 26%).

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ8.22(s,1H),8.09-8.06(m,1H),7.82(d,J=8.7Hz,1H),7.46-7.44(m,2H),6.42(d,J=8.7Hz,1H),3.57(t,J=6.6Hz,4H),2.11-2.07(m,4H) ^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ8.22 (s, 1H), 8.09-8.06 (m, 1H), 7.82 (d, J = 8.7Hz, 1H), 7.46-7.44 (m, 2H), 6.42 (d, J = 8.7 Hz, 1 H), 3.57 (t, J = 6.6 Hz, 4H), 2.11-2.07

실시예Example 5-34: 2-(4- 5-34: 2- (4- 플루오로페닐Fluorophenyl )-5-() -5- ( 피롤리딘Pyrrolidine -1-일)-1 day) 옥사졸로Oxazole [5,4-b]피리딘의 합성[5,4-b] pyridine

시작물질로 5-클로로-2-(4-플루오로페닐)옥사졸로[5,4-b]피리딘 (100 mg, 0.4 mmol)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 25 mg (0.1 mmol, 22%)을 얻었다.The target compound (100 mg, 0.4 mmol) was prepared in the same manner as in Example 5-30, except that 5-chloro-2- (4-fluorophenyl) oxazolo [5,4- b] pyridine 25 mg (0.1 mmol, 22%) was obtained.

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ8.11(d,J=8.9Hz,2H),7.90(d,J=8.1Hz,1H),7.34-7.32(m,1H),6.67(d,J=8.9Hz,2H),3.44(t,J=6.6Hz,4H),2.12-2.09(m,4H) ^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ8.11 (d, J = 8.9Hz, 2H), 7.90 (d, J = 8.1Hz, 1H), 7.34-7.32 (m, 1H), 6.67 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 3.44 (t, J = 6.6 Hz, 4H), 2.12-2.09 (m, 4H)

실시예Example 5-35: 2-(4- 5-35: 2- (4- 클로로페닐Chlorophenyl )-5-() -5- ( 피롤리딘Pyrrolidine -1-일)-1 day) 옥사졸로Oxazole [5,4-b]피리딘의 합성[5,4-b] pyridine

시작물질로 5-클로로-2-(4-클로로페닐)옥사졸로[5,4-b]피리딘 (100 mg, 0.4 mmol)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 40 mg (0.13 mmol, 34%)을 얻었다.The objective compound 40 (5 mg) was obtained as a starting material in the same manner as in Example 5-30 except that 5-chloro-2- (4-chlorophenyl) oxazolo [5,4- b] pyridine mg (0.13 mmol, 34%).

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ8.16-8.12(m,2H),7.84-7.80(m,1H),7.51-7.47(m,2H),7.30(s,1H),6.44(m,1H),3.57(d,J=4.4Hz,4H),2.09(d,J=4.7Hz,4H) ^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ8.16-8.12 (m, 2H), 7.84-7.80 (m, 1H), 7.51-7.47 (m, 2H), 7.30 (s, 1H), 6.44 (m, 2H), 3.57 (d, J = 4.4 Hz, 4H), 2.09 (d, J = 4.7 Hz,

실시예Example 5-36: 2-(4- 5-36: 2- (4- 브로모페닐Bromophenyl )-5-() -5- ( 피롤리딘Pyrrolidine -1-일)-1 day) 옥사졸로Oxazole [5,4-b]피리딘의 합성[5,4-b] pyridine

시작물질로 2-(4-브로모페닐)-5-클로로옥사졸로[5,4-b]피리딘 (100 mg, 0.4 mmol)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 20 mg (0.06 mmol, 15%)을 얻었다.The objective Compound (5) was obtained in the same manner as in Example 5-30, except that 2- (4-bromophenyl) -5-chlorooxazolo [5,4- b] pyridine 20 mg (0.06 mmol, 15%) of the title compound.

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ8.06(d,J=8.6Hz,2H),7.81(d,J=8.7Hz,1H),7.64(d,J=8.6Hz,2H),6.40(d,J=8.7Hz,1H),3.56(t,J=6.5Hz,4H),2.11-2.06(m,4H) ^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ8.06 (d, J = 8.6Hz, 2H), 7.81 (d, J = 8.7Hz, 1H), 7.64 (d, J = 8.6Hz, 2H), 6.40 ( J = 8.7 Hz, 1H), 3.56 (t, J = 6.5 Hz, 4H), 2.11-2.06 (m, 4H)

실시예Example 5-37: 2- 5-37: 2- 페닐Phenyl -5-(피페리딘-1-일)-5- (piperidin-1-yl) 옥사졸로Oxazole [5,4-b]피리딘의 합성[5,4-b] pyridine

시작물질로 5-클로로-2-페닐옥사졸로[5,4-b]피리딘 (100 mg, 0.4 mmol)과 10당량의 피페리딘을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 28 mg (0.1 mmol, 26%)을 얻었다.The procedure of Example 5-30 was repeated except that 5-chloro-2-phenyloxazolo [5,4-b] pyridine (100 mg, 0.4 mmol) and 10 equivalents of piperidine were used as starting materials 28 mg (0.1 mmol, 26%) of the compound was obtained.

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ8.22-8.16(m,2H),7.80(d,J=8.7Hz,1H),7.83-7.47(m,3H),6.70(d,J=8.7Hz,1H),3.63(s,4H),1.68(s,6H) ^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ8.22-8.16 (m, 2H), 7.80 (d, J = 8.7Hz, 1H), 7.83-7.47 (m, 3H), 6.70 (d, J = 8.7Hz , &Lt; / RTI > 1H), 3.63 (s, 4H), 1.68 (s,

실시예Example 5-38: 2- 5-38: 2- 페닐Phenyl -5-(피페리딘-1-일)티아졸로[5,4-b]피리딘의 합성-5- (piperidin-1-yl) thiazolo [5,4-b] pyridine

시작물질로 5-클로로-2-페닐티아졸로[5,4-b]피리딘 (100 mg, 0.4 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 83 mg (0.3 mmol, 73%)을 얻었다.(100 mg, 0.4 mmol) was used as starting material in place of 5-chloro-2-phenylthiazolo [5,4-b] pyridine 73%).

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ8.04(d,J=9.2Hz,3H),7.51-7.48(m,3H),6.84(d,J=9.2Hz,1H),3.67(s,4H),1.71(s,6H)
^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ8.04 (d, J = 9.2Hz, 3H), 7.51-7.48 (m, 3H), 6.84 (d, J = 9.2Hz, 1H), 3.67 (s, 4H ), 1.71 (s, 6H)

실시예Example 5-39: 2-(2- 5-39 2- (2- 클로로페닐Chlorophenyl )-5-(피페리딘-1-일)) -5- (piperidin-1-yl) 옥사졸로Oxazole [5,4-b]피리딘의 합성[5,4-b] pyridine

시작물질로 5-클로로-2-(2-클로로페닐)옥사졸로[5,4-b]피리딘 (100 mg, 0.4 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 21 mg (0.06 mmol, 18%)을 얻었다.The objective compound 21 (5 mg) was synthesized in the same manner as in 5-6 except that 5-chloro-2- (2-chlorophenyl) oxazolo [5,4- b] pyridine mg (0.06 mmol, 18%).

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ8.19-8.16(m,1H),7.91(d,J=8.9Hz,1H),7.59-7.56(m,1H),7.44-7.41(m,2H),6.73(d,J=8.9Hz,1H),3.67(s,4H),1.72(s,6H) ^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ8.19-8.16 (m, 1H), 7.91 (d, J = 8.9Hz, 1H), 7.59-7.56 (m, 1H), 7.44-7.41 (m, 2H) , 6.73 (d, J = 8.9 Hz, 1 H), 3.67 (s, 4 H), 1.72

실시예Example 5-40: 2-(3- 5-40: 2- (3- 플루오로페닐Fluorophenyl )-5-(피페리딘-1-일)) -5- (piperidin-1-yl) 옥사졸로Oxazole [5,4-b]피리딘의 합성[5,4-b] pyridine

시작물질로 5-클로로-2-(3-플루오로페닐)옥사졸로[5,4-b]피리딘 (100 mg, 0.4 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 23 mg (0.1 mmol, 19%)을 얻었다.The target compound (100 mg, 0.4 mmol) was prepared in the same manner as in Example 5-30, except that 5-chloro-2- (3-fluorophenyl) oxazolo [5,4- b] pyridine 23 mg (0.1 mmol, 19%) was obtained.

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ8.00(d,J=7.8Hz,1H),7.90(d,J=8.0Hz,1H),7.84(d,J=8.9Hz,1H),7.53-7.18(m,1H0,7.21(t,J=5.9Hz,1H),6.73(d,J=8.9Hz,1H),3.67(s,4H),1.72(s,6H) ^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ8.00 (d, J = 7.8Hz, 1H), 7.90 (d, J = 8.0Hz, 1H), 7.84 (d, J = 8.9Hz, 1H), 7.53- 7.18 (m, 1H0,7.21 (t, J = 5.9Hz, 1H), 6.73 (d, J = 8.9Hz, 1H), 3.67 (s, 4H), 1.72 (s, 6H)

실시예Example 5-41: 2-(3- 5-41 2- (3- 클로로페닐Chlorophenyl )-5-(피페리딘-1-일)) -5- (piperidin-1-yl) 옥사졸로Oxazole [5,4-b]피리딘의 합성[5,4-b] pyridine

시작물질로 5-클로로-2-(3-클로로페닐)옥사졸로[5,4-b]피리딘 (100 mg, 0.4 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 67 mg (0.2 mmol, 56%)을 얻었다.The objective Compound 67 (100 mg, 0.4 mmol) was obtained as a starting material except that 5-chloro-2- (3-chlorophenyl) oxazolo [5,4- b] pyridine mg (0.2 mmol, 56%).

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ8.22(s,1H),8.09(d,J=6.5Hz,1H),7.84(d,J=8.8Hz,1H),7.47(s,2H),6.72(d,J=8.9Hz,1H),3.67(s,4H),1.72(s,6H) ^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ8.22 (s, 1H), 8.09 (d, J = 6.5Hz, 1H), 7.84 (d, J = 8.8Hz, 1H), 7.47 (s, 2H), 6.72 (d, J = 8.9 Hz, 1 H), 3.67 (s, 4 H), 1.72 (s,

실시예Example 5-42: 5-(피페리딘-1-일)-2-m- 5-42: 5- (Piperidin-1-yl) -2-m- 톨일옥사졸로[5,4-b]피리딘의To a solution of < RTI ID = 0.0 > [5,4-b] pyridine 합성 synthesis

시작물질로 5-클로로-2-m-톨일옥사졸로[5,4-b]피리딘 (100 mg, 0.4 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 61 mg (0.2 mmol, 52%)을 얻었다.The procedure of Example 5-30 was repeated except for using 5-chloro-2-m-tolyloxrazolo [5,4-b] pyridine as starting material (100 mg, 0.4 mmol) 0.2 mmol, 52%).

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ8.07(s,1H),8.02(d,J=7.7Hz,1H),7.41(t,J=7.6Hz,1H),7.32(d,J=7.6Hz,1H),3.66(s,4H),2.47(s,3H),1.72(s,6H) ^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ8.07 (s, 1H), 8.02 (d, J = 7.7Hz, 1H), 7.41 (t, J = 7.6Hz, 1H), 7.32 (d, J = 7.6 Hz), 3.66 (s, 4H), 2.47 (s, 3H), 1.72

실시예Example 5-43: 2-(3- 5-43: 2- (3- 니트로페닐Nitrophenyl )-5-(피페리딘-1-일)) -5- (piperidin-1-yl) 옥사졸로Oxazole [5,4-b]피리딘의 합성[5,4-b] pyridine

시작물질로 5-클로로-2-(3-니트로페닐)옥사졸로[5,4-b]피리딘 (100 mg, 0.4 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 39 mg (0.12 mmol, 30%)을 얻었다.The objective compound 39 (5 mg) was obtained as a white solid in the same manner as in 5-6 except that 5-chloro-2- (3-nitrophenyl) oxazolo [5,4- b] pyridine mg (0.12 mmol, 30%).

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ9.06(s,1H),8.51(d,J=7.8Hz,1H),8.35(d,J=5.0Hz,1H),7.87(d,J=8.9Hz,1H),7.71(t,J=8.0Hz,1H),6.75(d,J=8.9Hz,1H),3.70(s,4H),1.73(s,6H) ^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ9.06 (s, 1H), 8.51 (d, J = 7.8Hz, 1H), 8.35 (d, J = 5.0Hz, 1H), 7.87 (d, J = 8.9 1H), 7.71 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 6.75 (d, J = 8.9 Hz,

실시예Example 5-44: 3-(5-(피페리딘-1-일) 5-44: 3- (5- (Piperidin-1-yl) 옥사졸로Oxazole [5,4-b]피리딘-2-일)[5,4-b] pyridin-2-yl) 벤조니트릴의Benzonitrile 합성 synthesis

시작물질로 3-(5-클로로옥사졸로[5,4-b]피리딘-2-일)벤조니트릴 (100 mg, 0.4 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 26 mg(0.09 mmol, 22%)을 얻었다.(100 mg, 0.4 mmol) was used as starting material in place of 3- (5-chlorooxazolo [5,4- b] pyridin-2-yl) benzonitrile 26 mg (0.09 mmol, 22%) was obtained.

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ8.50(s,1H),8.42(d,J=5.3Hz,1H),7.85(d,J=8.9Hz,1H),7.78(d,J=3.56Hz,1H),7.65(t,J=7.9Hz,1H),6.75(d,J=8.9Hz,1H),3.71(s,4H),1.73(s,6H) ^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ8.50 (s, 1H), 8.42 (d, J = 5.3Hz, 1H), 7.85 (d, J = 8.9Hz, 1H), 7.78 (d, J = 3.56 J = 7.9 Hz, 1H), 6.75 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 3.71 (s, 4H), 1.73

실시예Example 5-45: 2-(4- 5-45: 2- (4- 플루오로페닐Fluorophenyl )-5-(피페리딘-1-일)) -5- (piperidin-1-yl) 옥사졸로Oxazole [5,4-b]피리딘의 합성[5,4-b] pyridine

시작물질로 5-클로로-2-(4-플루오로페닐)옥사졸로[5,4-b]피리딘 (100 mg, 0.4 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 20 mg (0.1 mmol, 11%)을 얻었다.The target compound (100 mg, 0.4 mmol) was prepared in the same manner as in Example 5-30, except that 5-chloro-2- (4-fluorophenyl) oxazolo [5,4- b] pyridine 20 mg (0.1 mmol, 11%) was obtained.

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ8.11(d,J=9.1Hz,2H),7.92(d,J=8.2Hz,1H),7.33(t,J=8.1Hz,1H),7.36(d,J=9.1Hz,2H),3.43(s,4H),1.72(s,6H) ^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ8.11 (d, J = 9.1Hz, 2H), 7.92 (d, J = 8.2Hz, 1H), 7.33 (t, J = 8.1Hz, 1H), 7.36 ( d, J = 9.1 Hz, 2H), 3.43 (s, 4H), 1.72 (s, 6H)

실시예Example 5-46: 2-(4- 5-46: 2- (4- 클로로페닐Chlorophenyl )-5-(피페리딘-1-일)) -5- (piperidin-1-yl) 옥사졸로Oxazole [5,4-b]피리딘의 합성[5,4-b] pyridine

시작물질로 5-클로로-2-(4-클로로페닐)옥사졸로[5,4-b]피리딘 (150 mg, 0.6 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 30 mg (0.1 mmol, 17%)을 얻었다.The objective compound 30 (0.15 g, 0.25 mmol) was obtained as a white solid in the same manner as in 5-6 except that 5-chloro-2- (4-chlorophenyl) oxazolo [5,4- b] pyridine mg (0.1 mmol, 17%).

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ8.14(d,J=8.7Hz,2H),7.83(d,J=8.9Hz,1H),7.50(d,J=8.7Hz,2H),6.72(d,J=8.9Hz,1H),3.67(s,4H),1.72(s,6H) ^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ8.14 (d, J = 8.7Hz, 2H), 7.83 (d, J = 8.9Hz, 1H), 7.50 (d, J = 8.7Hz, 2H), 6.72 ( d, J = 8.9 Hz, 1 H), 3.67 (s, 4 H), 1.72 (s,

실시예Example 5-47: 2-(4- 5-47 2- (4- 브로모페닐Bromophenyl )-5-(피페리딘-1-일)) -5- (piperidin-1-yl) 옥사졸로Oxazole [5,4-b]피리딘의 합성[5,4-b] pyridine

시작물질로 2-(4-브로모페닐)-5-클로로옥사졸로[5,4-b]피리딘 (150 mg, 0.5 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 40 mg (0.1 mmol, 23%)을 얻었다.The objective Compound (5) was synthesized in the same manner as in Example 5-30, except that 2- (4-bromophenyl) -5-chlorooxazolo [5,4- b] pyridine 40 mg (0.1 mmol, 23%) was obtained.

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ8.11(d,J=9.1Hz,2H),7.92(d,J=8.2Hz,1H),7.33(t,J=8.1Hz,1H),7.35(d,J=9.1Hz,2H),3.43(s,4H),1.72(s,6H) ^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ8.11 (d, J = 9.1Hz, 2H), 7.92 (d, J = 8.2Hz, 1H), 7.33 (t, J = 8.1Hz, 1H), 7.35 ( d, J = 9.1 Hz, 2H), 3.43 (s, 4H), 1.72 (s, 6H)

실시예Example 5-48: 5-(피페리딘-1-일)-2-p- 5-48: 5- (Piperidin-1-yl) -2-p- 톨일옥사졸로[5,4-b]피리딘의To a solution of < RTI ID = 0.0 > [5,4-b] pyridine 합성 synthesis

시작물질로 5-클로로-2-p-톨일옥사졸로[5,4-b]피리딘 (100 mg, 0.4 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 30 mg (0.1 mmol, 25%)을 얻었다.The procedure of Example 5-30 was repeated except for using 5-chloro-2-p-toluyloxazolo [5,4-b] pyridine as starting material (100 mg, 0.4 mmol) 0.1 mmol, 25%).

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ8.11(d,J=8.2Hz,2H),7.83(d,J=8.8Hz,1H),7.34(d,J=8.0Hz,2H),6.70(d,J=8.8Hz,1H),3.66(s,4H),2.46(s,3H),1.72(s,6H) ^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ8.11 (d, J = 8.2Hz, 2H), 7.83 (d, J = 8.8Hz, 1H), 7.34 (d, J = 8.0Hz, 2H), 6.70 ( (d, J = 8.8 Hz, 1H), 3.66 (s, 4H), 2.46

실시예Example 5-49: 2-(4- 5-49: 2- (4- 메톡시페닐Methoxyphenyl )-5-(피페리딘-1-일)) -5- (piperidin-1-yl) 옥사졸로Oxazole [5,4-b]피리딘의 합성[5,4-b] pyridine

시작물질로 5-클로로-2-(4-메톡시페닐)옥사졸로[5,4-b]피리딘 (100 mg, 0.4 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 20 mg (0.06 mmol, 17%)을 얻었다.The objective compound (1) was prepared in the same manner as in Example 5-30, except that 5-chloro-2- (4-methoxyphenyl) oxazolo [5,4- b] pyridine 20 mg (0.06 mmol, 17%) was obtained.

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ8.15(d,J=9.0Hz,2H),7.80(d,J=8.8Hz,1H),7.04(dd,J=2.8,6.9Hz,2H),6.69(d,J=8.8Hz,1H),3.91(s,3H),3.64(s,4H),1.71(s,6H) ^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ8.15 (d, J = 9.0Hz, 2H), 7.80 (d, J = 8.8Hz, 1H), 7.04 (dd, J = 2.8,6.9Hz, 2H), 6.69 (d, J = 8.8Hz, 1H), 3.91 (s, 3H), 3.64 (s, 4H), 1.71 (s, 6H)

실시예Example 5-50: 4-(5-(피페리딘-1-일) 5-50: 4- (5- (Piperidin-1-yl) 옥사졸로Oxazole [5,4-b]피리딘-2-일)[5,4-b] pyridin-2-yl) 벤조니트릴의Benzonitrile 합성 synthesis

시작물질로 4-(5-클로로옥사졸로[5,4-b]피리딘-2-일)벤조니트릴 (100 mg, 0.4 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 18 mg (0.06 mmol, 15%)을 얻었다.The target compound (100 mg, 0.4 mmol) was obtained as a colorless oil by the same method as in Example 5-30, except that 4- (5-chlorooxazolo [5,4- b] pyridin-2-yl) benzonitrile 18 mg (0.06 mmol, 15%).

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ8.30(d,J=8.5Hz,2H),7.83(q,J=8.9Hz,3H),6.75(d,J=8.9Hz,1H),3.70(s,4H),1.73(s,6H) ^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ8.30 (d, J = 8.5Hz, 2H), 7.83 (q, J = 8.9Hz, 3H), 6.75 (d, J = 8.9Hz, 1H), 3.70 ( s, 4H), 1.73 (s, 6H)

실시예Example 5-51: 2-(3- 5-51 2- (3- 클로로페닐Chlorophenyl )-N-) -N- 시클로펜틸옥사졸로[5,4-b]피리딘Cyclopentyl oxazolo [5,4-b] pyridine -5--5- 아민의Amine 합성 synthesis

시작물질로 5-클로로-2-(3-클로로페닐)옥사졸로[5,4-b]피리딘 (100 mg, 0.4 mmol)과 10 당량의 시클로펜틸아민을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 18 mg (0.06 mmol, 15%)을 얻었다.Example 5-30 was repeated except that 5-chloro-2- (3-chlorophenyl) oxazolo [5,4- b] pyridine (100 mg, 0.4 mmol) and 10 equivalents of cyclopentylamine were used as starting materials. (18 mg, 0.06 mmol, 15%) was obtained.

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ8.21(s,1H),8.10-8.06(m,1H),7.80(d,J=8.6Hz,1H),7.50-7.45(m,2H),6.44(d,J=8.6Hz,1H),4.75(d,J=6.2Hz,1H),4.25-4.19(m,1H),2.21-2.11(m,2H),1.83-1.68(m,4H),1.58-1.50(m,2H) ^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ8.21 (s, 1H), 8.10-8.06 (m, 1H), 7.80 (d, J = 8.6Hz, 1H), 7.50-7.45 (m, 2H), 6.44 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 4.75 (d, J = 6.2 Hz, 1H), 4.25-4.19 (m, 1H), 2.21-2.11 (m, 2H), 1.83-1.68 1.58-1.50 (m, 2 H)

실시예Example 5-52: N- 5-52: N- 시클로헥실Cyclohexyl -2--2- 페닐티아졸로[5,4-b]피리딘Phenylthiazolo [5,4-b] pyridine -5--5- 아민의Amine 합성 synthesis

시작물질로 5-클로로-2-페닐티아졸로[5,4-b]피리딘 (99 mg, 0.4 mmol)과 10당량의 시클로펜틸아민을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 10 mg (0.03 mmol, 9%)을 얻었다.The procedure of Example 5-30 was repeated except for using 5-chloro-2-phenylthiazolo [5,4-b] pyridine (99 mg, 0.4 mmol) and 10 equivalents of cyclopentylamine as starting materials 10 mg (0.03 mmol, 9%) of the compound was obtained.

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ8.03-7.99(m,3H),7.48(s,3H),6.53(d,J=8.9Hz,1H),4.68(d,J=6.4Hz,1H),3.75(t,J=3.4Hz,1H),2.13(d,J=12.1Hz,2H),1.84-1.80(m,2H),1.73-1.69(m,1H),1.54-1.42(m,2H),1.33-1.22(m,3H) ^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ8.03-7.99 (m, 3H), 7.48 (s, 3H), 6.53 (d, J = 8.9Hz, 1H), 4.68 (d, J = 6.4Hz, 1H ), 3.75 (t, J = 3.4Hz, 1H), 2.13 (d, J = 12.1Hz, 2H), 1.84-1.80 (m, 2H), 1.73-1.69 (m, 1H), 1.54-1.42 (m, 2H), 1.33-1. 22 (m, 3H)

실시예Example 5-53: 2-(3- 5-53: 2- (3- 클로로페닐Chlorophenyl )-N-) -N- 시클로헥실옥사졸로[5,4-b]피리딘Cyclohexyloxazolo [5,4-b] pyridine -5--5- 아민의Amine 합성 synthesis

시작물질로 5-클로로-2-(3-클로로페닐)옥사졸로[5,4-b]피리딘 (100 mg, 0.4 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 24 mg (0.07 mmol, 19%)을 얻었다.The objective compound 24 (0.15 g, 0.15 mmol) was obtained as a colorless oil in the same manner as in Example 5-30, except that 5-chloro-2- (3- chlorophenyl) oxazolo [5,4- b] pyridine mg (0.07 mmol, 19%).

¹H NMR (300 MHz, MeOD) δ 8.07 (s, 1H), 8.03-8.00 (m, 1H0, 7.68 (d, J=8.7Hz,1H),7.54-7.51(m,2H),6.53(d,J=8.7Hz,1H),3.79-7.75(m,1H),2.06(d,J=9.7Hz,2H),1.82(d,J=6.2Hz,2H),1.70(d,J=3.6Hz,1H),1.54-1.40(m,2H),1.33-1.25(m,3H) ^{1 H NMR (300 MHz, MeOD} ) δ 8.07 (s, 1H), 8.03-8.00 (m, 1H0, 7.68 (d, J = 8.7Hz, 1H), 7.54-7.51 (m, 2H), 6.53 (d, J = 8.7Hz, 1H), 3.79-7.75 (m, 1H), 2.06 (d, J = 9.7Hz, 2H), 1.82 (d, J = 6.2Hz, 2H), 1.70 (d, J = 3.6Hz, 1H), 1.54-1.40 (m, 2H), 1.33-1.25 (m, 3H)

실시예Example 5-54: 5-( 5-54: 5- ( 아제판Ajay Pan -1-일)-2-Yl) -2- 페닐옥사졸로[5,4-b]피리딘의Phenyl oxazolo [5,4-b] pyridine 합성 synthesis

시작물질로 5-클로로-2-페닐옥사졸로[5,4-b]피리딘 (97 mg, 0.4 mmol)과 10당량의 헥사메틸렌이민을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 70 mg (0.2 mmol, 57%)을 얻었다.The procedure of Example 5-30 was repeated except that 5-chloro-2-phenyloxazolo [5,4-b] pyridine (97 mg, 0.4 mmol) and 10 equivalents of hexamethyleneimine were used as starting materials 70 mg (0.2 mmol, 57%) of the compound was obtained.

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ8.24-8.20(m,2H),7.82(d,J=8.8Hzm1H),7.54-7.50(m,3H),6.54(d,J=8.9Hz,1H),3.74(t,J=5.9Hz,4H),1.88(s,4H),1.63-1.59(m,4H) ^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ8.24-8.20 (m, 2H), 7.82 (d, J = 8.8Hzm1H), 7.54-7.50 (m, 3H), 6.54 (d, J = 8.9Hz, 1H ), 3.74 (t, J = 5.9 Hz, 4H), 1.88 (s, 4H), 1.63 - 1.59

실시예Example 5-55: 5-( 5-55: 5- ( 아제판Ajay Pan -1-일)-2-Yl) -2- 페닐티아졸로[5,4-b]피리딘의Phenylthiazolo [5,4-b] pyridine 합성 synthesis

시작물질로 5-클로로-2-페닐티아졸로[5,4-b]피리딘 (85 mg, 0.35 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 51 mg (0.2 mmol, 47%)을 얻었다.The objective compound (51 mg, 0.2 mmol, prepared according to the method of Example 5) was reacted in the same manner as in Example 5-30 except that 5-chloro-2-phenylthiazolo [5,4- b] pyridine (85 mg, 0.35 mmol) 47%).

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ8.05-8.00(m,3H),7.50-7.48(m,3H),6.68(d,J=9.2Hz,1H),3.75(t,J=5.9Hz,4H),1.87(s,4H),1.63-1.59(m,4H) ^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ8.05-8.00 (m, 3H), 7.50-7.48 (m, 3H), 6.68 (d, J = 9.2Hz, 1H), 3.75 (t, J = 5.9Hz , 4H), 1.87 (s, 4H), 1.63 - 1.59 (m, 4H)

실시예Example 5-56: 5-( 5-56: 5- ( 아제판Ajay Pan -1-일)-2-(4--1-yl) -2- (4- 플루오로페닐Fluorophenyl )) 옥사졸로Oxazole [5,4-b]피리딘의 합성[5,4-b] pyridine

시작물질로 5-클로로-2-(4-플루오로페닐)옥사졸로[5,4-b]피리딘 (100 mg, 0.4 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 29 mg (0.1 mmol, 23%)을 얻었다.The target compound (100 mg, 0.4 mmol) was prepared in the same manner as in Example 5-30, except that 5-chloro-2- (4-fluorophenyl) oxazolo [5,4- b] pyridine 29 mg (0.1 mmol, 23%) was obtained.

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ8.23-8.18(m,2H),7.80(d,J=8.8Hz,1H),7.20(t,J=8.7Hz,2H),6.54(d,J=8.9Hz,1H0,3.73(t,J=5.9Hz,4H),1.88(s,4H),1.63-1.60(m,4H) ^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ8.23-8.18 (m, 2H), 7.80 (d, J = 8.8Hz, 1H), 7.20 (t, J = 8.7Hz, 2H), 6.54 (d, J = 8.9Hz, 1H0,3.73 (t, J = 5.9Hz, 4H), 1.88 (s, 4H), 1.63-1.60 (m, 4H)

실시예Example 5-57: N-벤질-2- 5-57: N-Benzyl-2- 페닐옥사졸로[5,4-b]피리딘Phenyl oxazolo [5,4-b] pyridine -5--5- 아민의Amine 합성 synthesis

시작물질로 5-클로로-2-페닐옥사졸로[5,4-b]피리딘 (97 mg, 0.4 mmol)과 10당량의 벤질아민을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 30 mg (0.1 mmol, 25%)을 얻었다.The target compound (100 mg) was obtained as a colorless oil by the same method as in Example 5-30 except that 5-chloro-2-phenyloxazolo [5,4- b] pyridine (97 mg, 0.4 mmol) and 10 equivalents of benzylamine were used as starting materials 30 mg (0.1 mmol, 25%) was obtained.

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ8.24-8.21(m,2H),7.82(d,J=8.6Hz,1H),7.55-7.51(m,3H),7.46-7.31(m,5H),6.46(d,J=8.6Hz,1H),5.04(s,1H),4.67(d,J=5.7Hz,2H) ¹ H NMR (300 MHz, CDCl ₃ )? 8.24-8.21 (m, 2H), 7.82 (d, J = 8.6 Hz, , 6.46 (d, J = 8.6Hz , 1H), 5.04 (s, 1H), 4.67 (d, J = 5.7Hz, 2H)

실시예Example 5-58: N-벤질-2- 5-58: N-benzyl-2- 페닐티아졸로[5,4-b]피리딘Phenylthiazolo [5,4-b] pyridine -5--5- 아민의Amine 합성 synthesis

시작물질로 5-클로로-2-페닐티아졸로[5,4-b]피리딘 (60 mg, 0.24 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 49 mg (0.2 mmol, 65%)을 얻었다. (50 mg, 0.24 mmol) was used in the same manner as in Example 5-30 except that 5-chloro-2-phenylthiazolo [5,4- b] pyridine was used as a starting material. 65%).

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ8.06-8.00(m,3H),7.54-7.31(m,8H),6.57(d,J=8.9Hz,1H),5.10(s,1H),4.67(d,J=5.7Hz,2H) ^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ8.06-8.00 (m, 3H), 7.54-7.31 (m, 8H), 6.57 (d, J = 8.9Hz, 1H), 5.10 (s, 1H), 4.67 (d, J = 5.7 Hz, 2H)

실시예Example 5-59: N-벤질-2-(3- 5-59: N-Benzyl-2- (3- 플루오로페닐Fluorophenyl )) 옥사졸로Oxazole [5,4-b]피리딘-5-[5,4-b] pyridin-5- 아민의Amine 합성 synthesis

시작물질로 5-클로로-2-(3-플루오로페닐)옥사졸로[5,4-b]피리딘 (70 mg, 0.3 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 30 mg (0.1 mmol, 35%)을 얻었다. The target compound (5 mg) was obtained as a colorless oil by the same procedure as a production example 5-30 except that 5-chloro-2- (3-fluorophenyl) oxazolo [5,4- b] pyridine 30 mg (0.1 mmol, 35%) was obtained.

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ8.00(d,J=7.8Hz,1H),7.93-7.88(m,1H),7.82(d,J=8.6Hz,1H),7.54-7.32(m,6H),7.26-7.19(m,1H),6.48(d,J=8.6Hz,1H),5.07(s,1H),4.67(d,J=5.8Hz,2H) ^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ8.00 (d, J = 7.8Hz, 1H), 7.93-7.88 (m, 1H), 7.82 (d, J = 8.6Hz, 1H), 7.54-7.32 (m , 6H), 7.26-7.19 (m, 1H), 6.48 (d, J = 8.6Hz, 1H), 5.07 (s, 1H), 4.67 (d, J = 5.8Hz, 2H)

실시예Example 5-60: N-벤질-2-(3- 5-60: N-Benzyl-2- (3- 클로로페닐Chlorophenyl )) 옥사졸로Oxazole [5,4-b]피리딘-5-[5,4-b] pyridin-5- 아민의Amine 합성 synthesis

시작물질로 5-클로로-2-(3-클로로페닐)옥사졸로[5,4-b]피리딘 (70 mg, 0.3 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 20 mg (0.1 mmol, 23%)을 얻었다. The objective compound 20 (5 mg) was obtained as a white solid in the same manner as in 5-6 except that 5-chloro-2- (3-chlorophenyl) oxazolo [5,4- b] pyridine mg (0.1 mmol, 23%).

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ8.22(s,1H),8.10-8.08(m,1H),7.81(d,J=8.6Hz,1H),7.51-7.34(m,7H),6.48(d,J=8.6Hz,1H),5.08(s,1H),4.67(d,J=5.6Hz,2H) ^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ8.22 (s, 1H), 8.10-8.08 (m, 1H), 7.81 (d, J = 8.6Hz, 1H), 7.51-7.34 (m, 7H), 6.48 (d, J = 8.6Hz, 1H ), 5.08 (s, 1H), 4.67 (d, J = 5.6Hz, 2H)

실시예Example 5-61: N-벤질-2-(4- 5-61: N-Benzyl-2- (4- 클로로페닐Chlorophenyl )) 옥사졸로Oxazole [5,4-b]피리딘-5-[5,4-b] pyridin-5- 아민의Amine 합성 synthesis

시작물질로 5-클로로-2-(4-클로로페닐)옥사졸로[5,4-b]피리딘 (70 mg, 0.3 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 29 mg (0.09 mmol, 32%)을 얻었다. The objective compound 29 (5 mg) was synthesized in the same manner as in 5-6 except that 5-chloro-2- (4-chlorophenyl) oxazolo [5,4- b] pyridine mg (0.09 mmol, 32%).

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ8.15(d,J=8.8Hz,2H),7.81(d,J=8.6Hz,1H),7.51(d,J=8.8Hz,2H),7.46-7.30(m,5H),6.47(d,J=8.6Hz,1H),5.06(s,1H0,4.67(d,J=5.7Hz,2H) ^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ8.15 (d, J = 8.8Hz, 2H), 7.81 (d, J = 8.6Hz, 1H), 7.51 (d, J = 8.8Hz, 2H), 7.46- 7.30 (m, 5H), 6.47 (d, J = 8.6Hz, 1H), 5.06 (s, 1H0,4.67 (d, J = 5.7Hz, 2H)

실시예Example 5-62: N-(2- 5-62: N- (2- 모르포리노에틸Morpholinoethyl )-2-)-2- 페닐티아졸로[5,4-b]피리딘Phenylthiazolo [5,4-b] pyridine -5--5- 아민의Amine 합성 synthesis

시작물질로 5-클로로-2-페닐티아졸로[5,4-b]피리딘 (50 mg, 0.2 mmol)과 2-모르포리노에탄아민 3당량을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 31 mg (0.1 mmol, 50%)을 얻었다. The same procedure as in Example 5-30 was conducted except that 3-equivalent amounts of 5-chloro-2-phenylthiazolo [5,4-b] pyridine (50 mg, 0.2 mmol) and 2-morpholinoethanamine were used as starting materials. , 31 mg (0.1 mmol, 50%) of the desired compound was obtained.

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ8.05-8.00(m,3H),7.54-7.47(m,3H),6.59(d,J=8.9Hz,1H),5.38(s,1H),3.78(t,J=4.6Hz,4H),3.52(q,J=5.1Hz,2H),2.69(t,J=6.0Hz,2H),2.55(t,J=4.4Hz,4H) ^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ8.05-8.00 (m, 3H), 7.54-7.47 (m, 3H), 6.59 (d, J = 8.9Hz, 1H), 5.38 (s, 1H), 3.78 (t, J = 4.6Hz, 4H ), 3.52 (q, J = 5.1Hz, 2H), 2.69 (t, J = 6.0Hz, 2H), 2.55 (t, J = 4.4Hz, 4H)

실시예Example 5-63: N-벤질-N- 5-63: N-Benzyl-N- 메틸methyl -2--2- 페닐옥사졸로[5,4-b]피리딘Phenyl oxazolo [5,4-b] pyridine -5--5- 아민의Amine 합성 synthesis

시작물질로 5-클로로-2-페닐옥사졸로[5,4-b]피리딘 (200 mg, 0.9 mmol)과 5당량의 N-벤질메틸아민을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 218 mg (0.7 mmol, 80%)을 얻었다.The same procedure as in Example 5-30 was conducted except that 5-chloro-2-phenyloxazolo [5,4-b] pyridine (200 mg, 0.9 mmol) and 5 equivalents of N-benzylmethylamine were used as starting materials To obtain 218 mg (0.7 mmol, 80%) of the desired compound.

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ8.25-8.21(m,2H),7.85(d,J=8.8Hz,1H),7.54-7.50(m,3H),7.39-7.27(m,5H),6.58(d,J=8.8Hz,1H),4.91(s,2H),3.21(s,3H) ^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ8.25-8.21 (m, 2H), 7.85 (d, J = 8.8Hz, 1H), 7.54-7.50 (m, 3H), 7.39-7.27 (m, 5H) , 6.58 (d, J = 8.8 Hz, 1 H), 4.91 (s, 2H), 3.21 (s, 3H)

실시예Example 5-64: N-벤질-N- 5-64: N-Benzyl-N- 메틸methyl -2--2- 페닐티아졸로[5,4-b]피리딘Phenylthiazolo [5,4-b] pyridine -5--5- 아민의Amine 합성 synthesis

시작물질로 5-클로로-2-페닐티아졸로[5,4-b]피리딘 (100 mg, 0.4 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 100 mg (0.3 mmol, 72%)을 얻었다.(100 mg, 0.3 mmol) was obtained in the same manner as in Example 5-30 except that 5-chloro-2-phenylthiazolo [5,4-b] pyridine (100 mg, 0.4 mmol) 72%).

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ8.05(d,J=9.1Hz,3H),7.54-7.47(m,3H),7.40-7.29(m,5H),6.71(d,J=9.1Hz,1H),4.93(s,2H),3.21(s,3H) ^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ8.05 (d, J = 9.1Hz, 3H), 7.54-7.47 (m, 3H), 7.40-7.29 (m, 5H), 6.71 (d, J = 9.1Hz , &Lt; / RTI > 1H), 4.93 (s, 2H), 3.21 (s,

실시예Example 5-65: N-벤질-2-(2- 5-65: N-Benzyl-2- (2- 클로로페닐Chlorophenyl )-N-) -N- 메틸옥사졸로[5,4-b]피리딘Methyl oxazolo [5,4-b] pyridine -5--5- 아민의Amine 합성 synthesis

시작물질로 5-클로로-2-(2-클로로페닐)옥사졸로[5,4-b]피리딘 (80 mg, 0.3 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 70 mg (0.2 mmol, 67%)을 얻었다.The objective compound 70 (5 mg) was obtained as a starting material except that 5-chloro-2- (2-chlorophenyl) oxazolo [5,4- b] pyridine mg (0.2 mmol, 67%).

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ8.19-8.16(m,1H),7.92(d,J=8.8Hz,1H),7.60-7.57(m,1H),7.46-7.28(m,7H),6.60(d,J=8.9Hz,1H),4.92(s,2H),3.22(s,3H) ^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ8.19-8.16 (m, 1H), 7.92 (d, J = 8.8Hz, 1H), 7.60-7.57 (m, 1H), 7.46-7.28 (m, 7H) , 6.60 (d, J = 8.9 Hz, IH), 4.92 (s, 2H), 3.22

실시예Example 5-66: N-벤질-2-(3- 5-66: N-Benzyl-2- (3- 플루오로페닐Fluorophenyl )-N-) -N- 메틸옥사졸로[5,4-b]피리딘Methyl oxazolo [5,4-b] pyridine -5--5- 아민의Amine 합성 synthesis

시작물질로 5-클로로-2-(3-플루오로페닐)옥사졸로[5,4-b]피리딘 (90 mg, 0.4 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 118 mg (0.4 mmol, 98%)을 얻었다.The target compound (5 mg) was obtained as a white solid in the same manner as in Example 5-30, except that 5-chloro-2- (3-fluorophenyl) oxazolo [5,4- b] pyridine 118 mg (0.4 mmol, 98%) was obtained.

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ8.01(d,J=7.8Hz,1H),7.93(d,J=5.6Hz,1H),7.85(d,J=8.8Hz,1H),7.53-7.46(m,1H),7.40-7.28(m,5H),7.24-7.18(m,1H),6.59(d,J=8.8Hz,1H),4.91(s,2H),3.21(s,3H) ^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ8.01 (d, J = 7.8Hz, 1H), 7.93 (d, J = 5.6Hz, 1H), 7.85 (d, J = 8.8Hz, 1H), 7.53- 7.46 (m, 1H), 7.40-7.28 (m, 5H), 7.24-7.18 (m, 1H), 6.59 (d, J = 8.8Hz, 1H), 4.91 (s, 2H), 3.21 (s, 3H)

실시예Example 5-67: N-벤질-2-(3- 5-67: N-Benzyl-2- (3- 클로로페닐Chlorophenyl )-N-) -N- 메틸옥사졸로[5,4-b]피리딘Methyl oxazolo [5,4-b] pyridine -5--5- 아민의Amine 합성 synthesis

시작물질로 5-클로로-2-(3-클로로페닐)옥사졸로[5,4-b]피리딘 (80 mg, 0.3 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 57 mg (0.2 mmol, 65%)을 얻었다.The objective Compound 57 (0.42 g, 0.15 mmol) was obtained as a colorless oil in the same manner as in Example 5-30 except that 5-chloro-2- (3- chlorophenyl) oxazolo [5,4- b] pyridine mg (0.2 mmol, 65%).

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ8.24-8.22(m,1H),8.11-8.08(m,1H),7.85(d,J=8.8Hz,1H),7.48-7.46(m,2H),7.40-7.35(m,2H),7.35-7.28(m,4H),6.59(d,J=8.9Hz,1H),4.91(s,2H),3.22(s,3H) ^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ8.24-8.22 (m, 1H), 8.11-8.08 (m, 1H), 7.85 (d, J = 8.8Hz, 1H), 7.48-7.46 (m, 2H) 2H), 7.20-7.35 (m, 2H), 7.35-7.28 (m, 4H), 6.59 (d, J = 8.9 Hz,

실시예Example 5-68: N-벤질-2-(4- 5-68: N-Benzyl-2- (4- 클로로페닐Chlorophenyl )-N-) -N- 메틸옥사졸로[5,4-b]피리딘Methyl oxazolo [5,4-b] pyridine -5--5- 아민의Amine 합성 synthesis

시작물질로 5-클로로-2-(4-클로로페닐)옥사졸로[5,4-b]피리딘 (100 mg, 0.4 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 121 mg (0.3 mmol, 92%)을 얻었다.The objective compound 121 (5 mg) was obtained as a starting material except for using 5-chloro-2- (4-chlorophenyl) oxazolo [5,4- b] pyridine mg (0.3 mmol, 92%).

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ8.15(d,J=8.6Hz,2H),7.83(d,J=8.8Hz,1H),7.50(d,J=8.6Hz,2H),7.40-7.28(m,5H),6.58(d,J=8.8Hz,1H),4.90(s,2H),3.21(s,3H) ^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ8.15 (d, J = 8.6Hz, 2H), 7.83 (d, J = 8.8Hz, 1H), 7.50 (d, J = 8.6Hz, 2H), 7.40- 2H), 3.21 (s, 3H), 7.28 (m, 5H), 6.58 (d, J = 8.8 Hz,

실시예Example 5-69: N-벤질-N- 5-69: N-Benzyl-N- 메틸methyl -2-p--2-p- 톨일옥사졸로[5,4-b]피리딘Tallowyoxazolo [5,4-b] pyridine -5--5- 아민의Amine 합성 synthesis

시작물질로 5-클로로-2-p-톨일옥사졸로[5,4-b]피리딘 (172 mg, 0.7 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 130 mg (0.4 mmol, 60%)을 얻었다.The procedure of Example 5-30 was repeated except for using 5-chloro-2-p-toluyloxazolo [5,4-b] pyridine as starting material (172 mg, 0.7 mmol) 0.4 mmol, 60%).

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ8.12(d,J=8.2Hz,2H),7.83(d,J=8.7Hz,1H),7.39-7.28(m,7H),6.56(d,J=8.8Hz,1H),4.90(s,2H),3.21(s,3H),2.46(s,3H) ^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ8.12 (d, J = 8.2Hz, 2H), 7.83 (d, J = 8.7Hz, 1H), 7.39-7.28 (m, 7H), 6.56 (d, J = 8.8 Hz, IH), 4.90 (s, 2H), 3.21 (s, 3H), 2.46

실시예Example 5-70: N-벤질-2-(4- 5-70: N-Benzyl-2- (4- 메톡시페닐Methoxyphenyl )-N-) -N- 메틸옥사졸로[5,4-b]피리딘Methyl oxazolo [5,4-b] pyridine -5--5- 아민의Amine 합성 synthesis

시작물질로 5-클로로-2-(4-메톡시페닐)옥사졸로[5,4-b]피리딘 (88 mg, 0.3 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 67 mg (0.2 mmol, 57%)을 얻었다.The objective compound (5 mg) was obtained as a starting material, in the same manner as in Example 5-30 except that 5-chloro-2- (4-methoxyphenyl) oxazolo [5,4- b] pyridine 67 mg (0.2 mmol, 57%) was obtained.

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ8.17(d,J=9.0Hz,2H0,7.81(d,J=8.7Hz,1H),7.37-7.28(m,5H),7.04(d,J=6.9Hz,2H),6.55(d,J=8.8Hz,1H),4.90(s,2H),3.92(s,3H),3.20(s,3H) ^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ8.17 (d, J = 9.0Hz, 2H0,7.81 (d, J = 8.7Hz, 1H), 7.37-7.28 (m, 5H), 7.04 (d, J = 6.9Hz, 2H), 6.55 (d , J = 8.8Hz, 1H), 4.90 (s, 2H), 3.92 (s, 3H), 3.20 (s, 3H)

실시예Example 5-71: N-벤질-N- 5-71: N-Benzyl-N- 메틸methyl -2-(4--2- (4- 니트로페닐Nitrophenyl )) 옥사졸로Oxazole [5,4-b]피리딘-5-[5,4-b] pyridin-5- 아민의Amine 합성 synthesis

시작물질로 5-클로로-2-(4-니트로페닐)옥사졸로[5,4-b]피리딘 (45 mg, 0.2 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 65 mg (0.2 mmol, 99%)을 얻었다.The objective compound 65 (0.44 g, 0.2 mmol) was obtained as a starting material, in the same manner as in Example 5-30 except that 5-chloro-2- (4- nitrophenyl) oxazolo [5,4- b] pyridine mg (0.2 mmol, 99%).

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ8.36(s,4H),7.88(d,J=8.9Hz,1H),7.40-7.26(m,5H),6.63(d,J=8.9Hz,1H),4.92(s,2H),3.24(s,3H) ^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ8.36 (s, 4H), 7.88 (d, J = 8.9Hz, 1H), 7.40-7.26 (m, 5H), 6.63 (d, J = 8.9Hz, 1H ), 4.92 (s, 2 H), 3.24 (s, 3 H)

실시예Example 5-72: 4-(5-( 5-72: 4- (5- ( 벤질(메틸)아미노Benzyl (methyl) amino )) 옥사졸로Oxazole [5,4-b]피리딘-2-일)[5,4-b] pyridin-2-yl) 벤조니트릴의Benzonitrile 합성 synthesis

시작물질로 4-(5-클로로옥사졸로[5,4-b]피리딘-2-일)벤조니트릴 (63 mg, 0.3 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 61 mg (0.2 mmol, 71%)을 얻었다.The objective Compound (5) was synthesized in the same manner as in Example 5-30, except that 4- (5-chlorooxazolo [5,4- b] pyridin-2-yl) benzonitrile 61 mg (0.2 mmol, 71%).

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ8.30(d,J=8.4Hz,2H0,7.88-7.28(m,3H),7.40-7.28(m,5H),6.62(d,J=8.9Hz,1H),4.92(s,2H),3.23(s,3H) ^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ8.30 (d, J = 8.4Hz, 2H0,7.88-7.28 (m, 3H), 7.40-7.28 (m, 5H), 6.62 (d, J = 8.9Hz, 1H), 4.92 (s, 2H), 3.23 (s, 3H)

실시예Example 5-73: N- 5-73: N- 메틸methyl -2--2- 페닐옥사졸로[5,4-b]피리딘Phenyl oxazolo [5,4-b] pyridine -5--5- 아민의Amine 합성 synthesis

N-벤질-N-메틸-2-페닐옥사졸로[5,4-b]피리딘-5-아민 (50 mg, 0.16 mmol)과 95% H₂SO₄0.25 ml를 넣고 12시간 교반하였다. TLC로 반응 종결을 확인하고 상온에서 식힌 후, 1.25 ml H₂O를 적가하였다. 15% NaOH를 사용하여 pH4로 적정하였다. 이때 생성되는 고체를 여과시킨 뒤, 여액을 다시 pH10으로 맞춘 후, 수층을 메틸렌클로라이드로 추출하고 감압 증류하여 목적화합물 25 mg (0.1 mmol, 69%)을 얻었다.N-Benzyl-N-methyl-2-phenyloxazolo [5,4-b] pyridin- (50 mg, 0.16 mmol) and 0.25 ml of 95% H ₂ SO ₄ were added and stirred for 12 hours. The reaction was completed by TLC, and after cooling at room temperature, 1.25 ml of H ₂ O was added dropwise. And titrated to pH 4 with 15% NaOH. The resulting solid was filtered, and the filtrate was adjusted to pH 10. The aqueous layer was extracted with methylene chloride and distilled under reduced pressure to obtain the desired compound (25 mg, 0.1 mmol, 69%).

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ8.24-8.20(m,2H0,7.83(d,J=8.6Hz,1H),7.55-7.51(m,3H),6.46(d,J=8.6Hz,1H0,4.75(s,1H),3.07(d,J=5.1Hz,3H) ^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ8.24-8.20 (m, 2H0,7.83 (d, J = 8.6Hz, 1H), 7.55-7.51 (m, 3H), 6.46 (d, J = 8.6Hz, 1H, 4.75 (s, 1H), 3.07 (d, J = 5.1 Hz, 3H)

실시예Example 5-74: N- 5-74: N- 메틸methyl -2--2- 페닐티아졸로[5,4-b]피리딘Phenylthiazolo [5,4-b] pyridine -5--5- 아민의Amine 합성 synthesis

시작물질로 N-벤질-N-메틸-2-페닐티아졸로[5,4-b]피리딘-5-아민 (70 mg, 0.2 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-73과 동일한 방법으로 목적화합물 47 mg (0.2 mmol, 92%)을 얻었다.Benzyl-N-methyl-2-phenylthiazolo [5,4- b] pyridin-5-amine 47 mg (0.2 mmol, 92%) of the desired compound was obtained in the same manner as in Example 5-73 except that the title compound (70 mg, 0.2 mmol) was used.

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ8.05-8.01(m,3H),7.52-7.48(m,3H),6.56(d,J=8.9Hz,1H),4.87(s,1H),3.06(d,J=5.1Hz,3H) ^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ8.05-8.01 (m, 3H), 7.52-7.48 (m, 3H), 6.56 (d, J = 8.9Hz, 1H), 4.87 (s, 1H), 3.06 (d, J = 5.1 Hz, 3H)

실시예Example 5-75: 2-(3- 5-75: 2- (3- 플루오로페닐Fluorophenyl )-N-) -N- 메틸옥사졸로[5,4-b]피리딘Methyl oxazolo [5,4-b] pyridine -5--5- 아민의Amine 합성 synthesis

시작물질로 N-벤질-2-(3-플루오로페닐)-N-메틸옥사졸로[5,4-b]피리딘-5-아민 (70 mg, 0.2 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-73과 동일한 방법으로 목적화합물 31 mg (0.1 mmol, 58%)을 얻었다.Benzyl-2- (3-fluorophenyl) -N-methyloxazolo [5,4- b] pyridin- 5- amine 31 mg (0.1 mmol, 58%) of the title compound was obtained in the same manner as in Example 5-73 except that the title compound (70 mg, 0.2 mmol) was used.

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ8.00(d,J=5.4Hz,1H),7.90(d,J=5.6Hz,1H),7.83(d,J=8.6Hz,1H),7.54-7.47(m,1H),7.25-7.18(m,1H),6.47(d,J=8.6Hz,1H),4.79(s,1H),3.07(d,J=5.1Hz,3H) ^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ8.00 (d, J = 5.4Hz, 1H), 7.90 (d, J = 5.6Hz, 1H), 7.83 (d, J = 8.6Hz, 1H), 7.54- 7.47 (m, 1H), 7.25-7.18 (m, 1H), 6.47 (d, J = 8.6Hz, 1H), 4.79 (s, 1H), 3.07 (d, J = 5.1Hz, 3H)

실시예Example 5-76: 2-(3- 5-76 2- (3- 클로로페닐Chlorophenyl )-N-) -N- 메틸옥사졸로[5,4-b]피리딘Methyl oxazolo [5,4-b] pyridine -5--5- 아민의Amine 합성 synthesis

시작물질로 N-벤질-2-(3-클로로페닐)-N-메틸옥사졸로[5,4-b]피리딘-5-아민 (57 mg, 0.2 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-73과 동일한 방법으로 목적화합물 30 mg (0.1 mmol, 72%)을 얻었다.The title compound was prepared in analogy to Example 5-1, except that N-benzyl-2- (3-chlorophenyl) -N-methyloxazolo [5,4- b] pyridin- 5- amine (57 mg, 0.2 mmol) The target compound (30 mg, 0.1 mmol, 72%) was obtained in the same manner as in 73).

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ8.22(s,1H),8.10-8.07(m,1H),7.82(d,J=8.6Hz,1H),7.50-7.43(m,2H),6.47(d,J=8.6Hz,1H),4.79(s,1H), 3.08(d,J=5.1Hz,3H) ^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ8.22 (s, 1H), 8.10-8.07 (m, 1H), 7.82 (d, J = 8.6Hz, 1H), 7.50-7.43 (m, 2H), 6.47 (d, J = 8.6Hz, 1H ), 4.79 (s, 1H), 3.08 (d, J = 5.1Hz, 3H)

실시예Example 5-77: 2-(4- 5-77 2- (4- 클로로페닐Chlorophenyl )-N-) -N- 메틸옥사졸로[5,4-b]피리딘Methyl oxazolo [5,4-b] pyridine -5--5- 아민의Amine 합성 synthesis

시작물질로 N-벤질-2-(4-클로로페닐)-N-메틸옥사졸로[5,4-b]피리딘-5-아민 (70 mg, 0.2 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-73과 동일한 방법으로 목적화합물 43 mg (0.2 mmol, 83%)을 얻었다.The title compound was synthesized in analogy to Example 5- (2) except that N-benzyl-2- (4-chlorophenyl) -N-methyloxazolo [5,4- b] pyridin- 43 mg (0.2 mmol, 83%) of the desired compound was obtained in the same manner as in 73).

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ8.13(d,J=8.6Hz,2H),7.80(d,J=8.6Hz,1H),7.50(d,J=8.6Hz,2H),6.45(d,J=8.6Hz,1H),4.78(s,1H),3.06(d,J=5.1Hz,3H) ^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ8.13 (d, J = 8.6Hz, 2H), 7.80 (d, J = 8.6Hz, 1H), 7.50 (d, J = 8.6Hz, 2H), 6.45 ( J = 8.6 Hz, 1H), 4.78 (s, 1H), 3.06 (d, J = 5.1 Hz,

실시예Example 5-78: N- 5-78: N- 메틸methyl -2-p--2-p- 톨일옥사졸로[5,4-b]피리딘Tallowyoxazolo [5,4-b] pyridine -5--5- 아민의Amine 합성 synthesis

시작물질로 N-벤질-N-메틸-2-p-톨일옥사졸로[5,4-b]피리딘-5-아민 (40 mg, 0.12 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-73과 동일한 방법으로 목적화합물 21 mg (0.09 mmol, 75%)을 얻었다.Example 5-73 was repeated except that N-benzyl-N-methyl-2-p-tolyloxazoquiro [5,4- b] pyridin- 5- amine (40 mg, 0.12 mmol) 21 mg (0.09 mmol, 75%) of the desired compound was obtained in the same manner.

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ8.09(d,J=7.6Hz,2H),7.79(d,J=8.5Hz,1H),7.32(d,J=7.8Hz,2H),6.42(d,J=8.4Hz,1H),3.04(s,3H),2.44(s,3H) ^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ8.09 (d, J = 7.6Hz, 2H), 7.79 (d, J = 8.5Hz, 1H), 7.32 (d, J = 7.8Hz, 2H), 6.42 ( d, J = 8.4 Hz, 1H), 3.04 (s, 3H), 2.44 (s, 3H)

실시예Example 5-79: 2-(4- 5-79: 2- (4- 메톡시페닐Methoxyphenyl )-N-) -N- 메틸옥사졸로[5,4-b]피리딘Methyl oxazolo [5,4-b] pyridine -5--5- 아민의Amine 합성 synthesis

시작물질로 N-벤질-2-(4-메톡시페닐)-N-메틸옥사졸로[5,4-b]피리딘-5-아민 (40 mg, 0.12 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-73과 동일한 방법으로 목적화합물 18 mg (0.07 mmol, 60%)을 얻었다.The title compound was prepared in analogy to Example 5 (5) except that N-benzyl-2- (4-methoxyphenyl) -N-methyloxazolo [5,4- b] pyridin- -73, 18 mg (0.07 mmol, 60%) of the title compound was obtained.

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ8.14(d,J=9.0Hz,2H),7.77(d,J=8.5Hz,1H),7.03(d,J=9.0Hz,2H),6.42(d,J=8.6Hz,1H),3.90(s,3H),3.04(d,J=5.1Hz,3H) ^{1 H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ8.14 (d, J = 9.0Hz, 2H), 7.77 (d, J = 8.5Hz, 1H), 7.03 (d, J = 9.0Hz, 2H), 6.42 ( (d, J = 8.6 Hz, 1H), 3.90 (s, 3H), 3.04

실시예Example 5-80: N- 5-80: N- 시클로헥실Cyclohexyl -2--2- 페닐옥사졸로[5,6-b]피리딘Phenyl oxazolo [5, 6-b] pyridine -5--5- 아민의Amine 합성 synthesis

시작물질로 5-클로로2-페닐옥사졸로[5,4-b]피리딘 (50 mg, 0.2 mmol) 과 10당량의 시클로펜틸아민을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 20 mg (0.07 mmol, 34%)을 얻었다. The objective Compound (5) was synthesized in the same manner as in Example 5-30, except that 5-chloro-2-phenyloxazolo [5,4- b] pyridine (50 mg, 0.2 mmol) and 10 equivalents of cyclopentylamine were used as starting materials. 20 mg (0.07 mmol, 34%) was obtained.

¹H NMR (300 MHz, MeOD) δ 8.12-8.11 (m, 2H), 7.70 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.57-7.53 (m, 3H), 6.54 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 3.79 (s, 1H), 2.08 (d, J = 12.2 Hz, 2H), 1.83 (dd, J = 3.9, 5.7 Hz, 2H), 1.71 (d, J = 13.2 Hz, 1H), 1.52-1.42 (m, 2H), 1.30 (t, J = 12.0 Hz, 3H) ^{1 H NMR (300 MHz, MeOD} ) δ 8.12-8.11 (m, 2H), 7.70 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.57-7.53 (m, 3H), 6.54 (d, J = 8.7 Hz, 1H ), 3.79 (s, 1H) , 2.08 (d, J = 12.2 Hz, 2H), 1.83 (dd, J = 3.9, 5.7 Hz, 2H), 1.71 (d, J = 13.2 Hz, 1H), 1.52-1.42 (m, 2H), 1.30 (t, J = 12.0 Hz, 3H)

실시예Example 6: 6: MAOMAO -B의 활성을 저해시키는 물질의 스크리닝Screening of substances that inhibit the activity of B

상기 실시예 5에서 제작한 화합물을 대상으로, 상기 화합물들이 MAO-B의 활성을 저해하는지 여부를 실험하였다.The compounds prepared in Example 5 were tested whether the compounds inhibited the activity of MAO-B.

본 실험은 알드리치에서 구매한 휴먼 MAO-B 효소와 Amplex^®Red monoamine oxidase assay kit를 이용하여 스탁 용액 준비는 매뉴얼에 따랐다. 상기 키트 안에는 5X reaction buffer, Amplex^®red reagent(1mg), HRP(horseradish peroxidase), DMSO, H₂O₂, p-타이라민(MAO-A,B의 기질), 벤질아민(MAO-B의 기질), 클로길린(MAO-A의 저해제), 파길린(MAO-B의 저해제)가 들어있다. 그 중에서 본 실험에서는 MAO-B 기질로 벤질아민을 사용하였고, MAO-B의 저해제로는 파길린을 사용하였다. 전체 기질로 작용할 용액의 준비과정은 다음과 같이 하였다. This test was followed by manual preparation of Stock solution using human MAO-B enzyme purchased from Aldrich and Amplex ^® Red monoamine oxidase assay kit. Within the kit ^{5X reaction buffer, Amplex ® red reagent} (1mg), HRP (horseradish peroxidase), DMSO, H 2 O 2, p- tyramine (MAO-A, of the substrate B), benzylamine (substrate for MAO-B ), Clogiline (an inhibitor of MAO-A), and pagiline (an inhibitor of MAO-B). Among them, benzylamine was used as the MAO-B substrate and pagyline was used as the inhibitor of MAO-B. The preparation of the solution to act as a whole substrate was as follows.

Amplex® red 1mg에 DMSO 200 ul을 넣어 충분히 녹인 200 ul, HRP와 1ml의 1X buffer 을 섞은 100 ul, 벤질아민과 1.2 ml의 dH₂O에 녹인 200 ul를 9.5 ml의 1X buffer에 넣어 총 10 ml를 제조하였다. 이 양은 100개의 well에 사용할 수 있다. MAO-B 저해제인 파길린에 1 ml의 dH₂O을 섞어 각 well 당 0.5 ul를 넣었다. 합성한 화합물의 농도는 10 uM을 기준으로 먼저 MAO-B의 활성을 확인하였다. Add 200 μL of DMSO to 1 μL of Amplex® red, add 100 μL of the dissolved HRP and 1 μL of 1 × buffer, 200 μL of benzylamine and 1.2 μL of dH ₂ O in 9.5 mL of 1 × buffer, and add 10 mL . This amount can be used in 100 wells. The MAO-B inhibitor, pazirin, was mixed with 1 ml of dH ₂ O and 0.5 μl per well. The activity of MAO-B was first determined on the basis of 10 uM of the concentration of the synthesized compound.

먼저, 준비한 96well에 기준이 되는 Positive, Negative 그리고 Wild type 을 준비하였다. Positive type의 경우 기질과 과산화수소만을 넣어주고, Negative type의 경우엔 기질만을 넣어주었다. 마지막으로 Wild type은 합성한 화합물을 넣지 않고 효소와 기질 그리고 MAO-B의 저해제를 넣어주었따. 그런 다음, 1 mM농도의 합성한 화합물을 2 ul씩 나눠 넣고, 첫번째 줄에는 휴먼 MAO-B 효소만을 넣어줬다. 이때 휴먼MAO-B 효소는 각 well당 0.5 ug씩 1X buffer 100 ul과 함께 넣어줬다. 두 번째 줄에는 휴먼MAO-B 효소에 파길린 저해제제를 0.5 ul씩 함께 넣어줬다. 실험의 오차를 줄이고 정확성을 높이기 위해 한 화합물당 3번씩 실험을 반복 하였다. 30분 뒤, 암실에서 기질로 작용할 용액을 100 ul씩 넣어줬다. Amplex®reagent가 빛에 민감하기 때문에 암실에서 실험을 하였다. 결국, 각 well 당 200 ul의 양이 되도록 하였다. 2~3 시간 뒤, 발색의 정도를 측정하면 첫번째 줄에서 두번째 줄의 데이터 값의 차가 순수하게 MAO-B 효소와 그의 기질과의 반응에 의한 활성이며 합성한 화합물을 추가한 경우는 화합물에 의해 MAO-B가 저해되고 남은 활성(remaining activity)의 값을 구할 수 있게 된다. 이와 같은 방법을 통해 MAO-B 효소 외의 다른 효소의 활성을 제외할 수 있기 때문이다. 실험한 화합물의 농도가 10 uM 일 때 활성 값이 좋은 것을 모아 0.001 uM, 0.01 uM, 0.1 uM, 1 uM, 10 uM 의 농도별로 활성 실험을 통해 농도에 의존하는 IC₅₀ 값을 구할 수 있다. First, we prepared Positive, Negative and Wild type which are the standard of 96 wells. For the positive type, only the substrate and hydrogen peroxide were added. For the negative type, only the substrate was added. Finally, the wild type did not contain the synthesized compound but added the enzyme and substrate and the inhibitor of MAO-B. Then, 2 μl of the compound synthesized at a concentration of 1 mM was added, and only the human MAO-B enzyme was added to the first row. At this time, human MAO-B enzyme was added to each well with 0.5 μg of each 1 × buffer (100 μl). In the second row, 0.5 μl of a pazyline inhibitor was added to human MAO-B enzyme. The experiment was repeated three times per compound to reduce the error of the experiment and to improve the accuracy. After 30 minutes, 100 μl of the solution to serve as a substrate in the dark room was added. Because Amplex® reagent is sensitive to light, it was experimented in the darkroom. Eventually, the amount was 200 ul per well. When the degree of coloration is measured after 2-3 hours, the difference in the data value of the second row from the first row is purely due to the reaction between the MAO-B enzyme and its substrate, and when the synthesized compound is added, -B can be suppressed and the remaining activity value can be obtained. This is because the activity of enzymes other than the MAO-B enzyme can be excluded. When the concentration of the tested compound is 10 uM, the IC ₅₀ value depending on the concentration can be obtained through the activity test for each concentration of 0.001 uM, 0.01 uM, 0.1 uM, 1 uM, and 10 uM.

상기 화합물의 MAO-B 활성에 대한 저해 효과를 측정한 결과를 하기 표 1에 기재하였다.The inhibitory effect of the compound on MAO-B activity was measured and the results are shown in Table 1 below.

화합물compound MAO-B의 남은 활성 정도(%)Remaining activity of MAO-B (%) IC₅₀(μM)IC ₅₀ ([mu] M) 실시예 5-30Example 5-30 2.312.31 0.410.41 실시예 5-31Examples 5-31 1.71.7 7.37.3 실시예 5-32Example 5-32 7.77.7 111.9111.9 실시예 5-33Example 5-33 14.214.2 16.316.3 실시예 5-34Examples 5-34 8.48.4 8.78.7 실시예 5-35Examples 5-35 42.442.4 -- 실시예 5-36Examples 5-36 33.533.5 -- 실시예 5-37Examples 5-37 3.093.09 22 실시예 5-38Examples 5-38 1.81.8 8.38.3 실시예 5-39Examples 5-39 0.60.6 13.213.2 실시예 5-40Examples 5-40 13.813.8 0.270.27 실시예 5-41Example 5-41 1717 38.438.4 실시예 5-42Examples 5-42 -7.8-7.8 -- 실시예 5-43Examples 5-43 -21.5-21.5 -- 실시예 5-44Examples 5-44 10.110.1 -- 실시예 5-45Examples 5-45 26.526.5 10.110.1 실시예 5-46Examples 5-46 56.056.0 -- 실시예 5-47Examples 5-47 28.628.6 0.0960.096 실시예 5-48Examples 5-48 46.246.2 -- 실시예 5-49Examples 5-49 15.815.8 1.521.52 실시예 5-50Examples 5-50 71.271.2 -- 실시예 5-51Examples 5-51 37.237.2 -- 실시예 5-52Example 5-52 4343 -- 실시예 5-53Example 5-53 39.339.3 -- 실시예 5-54Example 5-54 57.557.5 -- 실시예 5-55Examples 5-55 -1.8-1.8 -- 실시예 5-56Example 5-56 61.461.4 -- 실시예 5-57Example 5-57 63.163.1 -- 실시예 5-58Examples 5-58 60.860.8 1.9 × 10³ 1.9 × 10 ³ 실시예 5-59Example 5-59 51.951.9 -- 실시예 5-60Examples 5-60 55.455.4 -- 실시예 5-61Example 5-61 46.446.4 -- 실시예 5-62Example 5-62 42.742.7 -- 실시예 5-63Example 5-63 53.253.2 5.2 × 10⁴ 5.2 × 10 ⁴ 실시예 5-64Example 5-64 47.847.8 -- 실시예 5-65Examples 5-65 84.184.1 -- 실시예 5-66Example 5-66 4343 -- 실시예 5-67Examples 5-67 47.347.3 68.268.2 실시예 5-68Examples 5-68 24.124.1 5.085.08 실시예 5-69Examples 5-69 84.184.1 -- 실시예 5-70Examples 5-70 52.452.4 -- 실시예 5-71Examples 5-71 101.2101.2 -- 실시예 5-72Examples 5-72 108.8108.8 -- 실시예 5-73Example 5-73 5151 -- 실시예 5-74Examples 5-74 27.227.2 15.715.7 실시예 5-75Examples 5-75 2222 9.869.86 실시예 5-76Example 5-76 4.44.4 2.992.99 실시예 5-77Examples 5-77 4.144.14 3.023.02 실시예 5-78Examples 5-78 45.845.8 -- 실시예 5-79Examples 5-79 84.584.5 -- 실시예 5-80Examples 5-80 11.111.1 8.728.72 SelegilineSelegiline 0.10.1 9.79.7

Claims

다음의 단계를 포함하는 알츠하이머병, 파킨슨병, 바이러스성 퇴행성 뇌질환, 및 해마손상에서 선택된 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 후보 물질의 스크리닝 방법:
(a) 알츠하이머병, 파킨슨병, 바이러스성 퇴행성 뇌질환, 또는 해마손상을 갖는 동물모델의 해마에서 유래한 반응성 성상세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 분석하고자 하는 시료가 상기 반응성 성상세포 내의 GABA 농도를 감소시키거나 반응성 성상세포로부터의 GABA 방출을 감소시키는지 여부를 측정하는 단계; 상기 분석하고자 하는 시료가 상기 반응성 성상세포 내의 GABA 농도를 감소시키거나 반응성 성상세포로부터의 GABA 방출을 감소시키는 것으로 측정되는 경우에는 상기 시료를 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 후보 물질로 판단한다.

A method of screening for candidate substances for the prevention or treatment of degenerative brain diseases selected from Alzheimer's disease, Parkinson's disease, viral degenerative brain disease, and hippocampal damage, comprising the steps of:
(a) contacting a sample to be analyzed with a reactive astrocyte derived from hippocampus of an animal model having Alzheimer's disease, Parkinson's disease, viral degenerative brain disease, or hippocampal injury; And
(b) determining whether the sample to be analyzed reduces GABA concentration in the responsive astrocytic cells or reduces GABA release from reactive astrocytes; If the sample to be analyzed is determined to decrease the GABA concentration in the responsive astrocytic cells or decrease the GABA release from the reactive astrocytic cells, the sample is judged to be a candidate for the prevention or treatment of degenerative brain diseases.

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