KR101438532B1 - 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이의 스크리닝 방법 - Google Patents

퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이의 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 일 구체예에 따른 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 후보 물질의 스크리닝 방법에 의하면, 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료 물질을 효과적으로 스크리닝할 수 있으며, 이에 따른 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 여러 퇴행성 뇌질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.

Description

퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이의 스크리닝 방법{Pharmaceutical compositions for pregnosing or treating degenerative brain disease and method for screening the same}
본 발명은 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
알츠하이머 병(Alzheimer's disease)를 비롯한 퇴행성 뇌질환은 대체로 기억력과 인지기능의 장애, 행동능력의 장애를 유발하며, 특히, 알츠하이머병은 수년 이상의 기간을 두고 점진적으로 악화되는 만성적 질환으로서, 환자뿐만 아니라 주위 가족들에게도 심각한 정신적 고통과 막대한 의료비 지출 등 여러 문제를 야기하고 있다. 하지만 현재까지 개발된 치료제들은 단지 일시적으로 증상만 완화시킬 뿐이므로, 병을 근본적으로 치료하거나 진행을 억제하는 약물의 개발이 절실히 요구되고 있다.
알츠하이머 병을 예로 들면, 현재까지 치료제 개발의 주 표적은 알츠하이머병에서 나타나는 신경전달물질로서, 특히 콜린성 신경세포를 표적으로 한 콜린에스테라제 억제제들(Aricept, Exelon, Reminyl 등)이 현재 시판 중이다. 최근 FDA 승인된 글루타메이트 수용체의 길항제인 메만틴(memantine)도 대표적 신경전달물질인 글루타메이트를 표적으로 한다. 하지만 이들 약물도 병의 진행 자체를 근원적으로 막을 수는 없으며, 최근에는 알츠하이머병의 주요 특징인 아밀로이드 플라크(amyloid plaque)를 이루는 β-아밀로이드(Αβ)를 주요 표적으로 하여 Αβ 생성에 중요한 역할을 하는 β-또는 γ-시크리테이즈를 억제하거나 생성된 Aβ를 분해하는 약물을 개발하려는 연구가 활발히 진행 중이다. 그러나, 이 경우는 인체 내에 정상적으로 존재하는 단백질을 표적으로 하므로 정상적인 기능을 저해할 수 있어 부작용이 발생할 수 있다.
따라서, 종래 기술에 의하더라도, 여러 퇴행성 뇌질환과 관련하여 새로운 단백질을 타겟으로 하는 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 대하여 요구된다.
일 구체예는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 후보 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
다른 구체예는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
일 양상은 다음의 단계를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) 반응성 성상세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 분석하고자 하는 시료가 상기 반응성 성상세포 내의 GABA 농도를 감소시키거나 반응성 성상세포로부터의 GABA 방출을 감소시키는지 여부를 측정하는 단계; 상기 분석하고자 하는 시료가 상기 반응성 성상세포 내의 GABA 농도를 감소시키거나 반응성 성상세포로부터의 GABA 방출을 감소시키는 것으로 측정되는 경우에는 상기 시료를 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 후보 물질로 판단한다.
다른 양상은 다음의 단계를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 후보 물질의 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) 반응성 성상세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 반응성 성상세포 내의 MAO-B를 코딩하는 유전자의 발현량, MAO-B 단백질의 양 또는 MAO-B 단백질의 활성을 측정하는 단계; 상기 MAO-B를 코딩하는 유전자의 발현량, MAO-B 단백질의 양 또는 MAO-B 단백질의 활성이 감소-조절(down-regulation)되는 것으로 측정되는 경우에는 상기 시료를 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 후보 물질로 판단한다.
또 다른 양상은 다음의 단계를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 후보 물질의 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) 반응성 성상세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 반응성 성상세포에서 베스트로핀 1 채널의 세포 내 분포 양상을 측정하는 단계; 상기 베스트로핀 1 채널의 세포 내 분포 양상이 세포체와 주돌기로부터 마이크로도메인 방향으로 변화된 것으로 측정되는 경우에는 상기 시료를 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 후보 물질로 판단한다.
또 다른 양상은 다음의 단계를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 후보 물질의 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) 반응성 성상세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 반응성 성상세포 내의 베스트로핀 1(Best1)을 코딩하는 유전자의 발현량, Best1 단백질의 양 또는 Best1 단백질의 활성을 측정하는 단계; 상기 Best1을 코딩하는 유전자의 발현량, Best1 단백질의 양 또는 Best1 단백질의 활성이 감소-조절(down-regulation)되는 것으로 측정되는 경우에는 상기 시료를 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 후보 물질로 판단한다.
다른 양상은 다음의 단계를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 후보 물질의 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) 반응성 성상세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 반응성 성상세포 내의 GABA 트랜스아미나아제를 코딩하는 유전자의 발현량, GABA 트랜스아미나아제 단백질의 양 또는 GABA 트랜스아미나아제 단백질의 활성을 측정하는 단계; 상기 GABA 트랜스아미나아제 유전자의 발현량, GABA 트랜스아미나아제 단백질의 양 또는 GABA 트랜스아미나아제 단백질의 활성이 증가-조절(up-regulation)되는 것으로 측정되는 경우에는 상기 시료를 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 후보 물질로 판단한다.
본 발명자들은 알츠하이머 질환을 비롯한 퇴행성 뇌질환의 발병과 관련된 예방 또는 치료제를 개발하고자 연구 노력하여, 결국 알츠하이머 질환을 갖는 동물 모델의 해마에 존재하는 반응성 성상세포 내에서 신경전달물질 중 하나인 감마-아미노부틸산(gamma-aminobutyric acid, GABA)의 농도가 증가함을 확인하였으며, 이는 GABA를 생성하는 과정에서 필수적인 효소인 MAO-B의 발현량 증가, 또는 GABA 트랜스아미나아제의 발현량 감소에 의한 것임을 최초로 규명하였다. 또한 반응성 성상세포에서 GABA가 통과할 수 있는 베스트로핀 1 채널의 세포 내 분포 양상 변화 또는 베스트로핀 1의 발현량 증가가 일어남을 확인하였다.
본 발명은 반응성 성상세포 내의 GABA 농도를 감소시키는 물질을 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 물질로 스크리닝하는 방법에 관한 것으로서, 퇴행성 뇌질환과 관련하여 MAO-B, 베스트로핀 1 채널 또는 GABA 트랜스아미나아제를 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료의 타겟으로 한다. 이와 같이, 퇴행성 뇌질환의 타겟으로서 상기 단백질들의 신규한 용도는 알츠하이머 질환을 갖는 마우스 모델의 해마에 존재하는 반응성 성상세포 내에서 정상 마우스 모델과 비교하여 MAO-B의 발현량이 증가하고, GABA 트랜스아미나아제의 발현량이 감소하여, 반응성 성상세포 내의 GABA 농도가 증가하고, 베스트로핀 1 채널의 세포 내 분포 양상이 변하며, 베스트로핀 1의 발현량이 증가하여 반응성 성상세포 외부로 GABA가 분비되어 지속성(tonic) GABA가 생성된다는 본 발명자들의 발견에 따른 것이다.
지속성 GABA는 신경세포의 지속성 GABA 수용체에 결합하여 염소 이온(Cl-)이 신경세포 내로 들어오도록 한다. 이는 신경세포의 세포막의 휴지전위를 낮추어 정상적인 신경신호 전달을 방해한다. 압상스 간질(absence epilepsy)에서는 지속성 GABA에 의해 신경신호 전달이 억제되어 있다는 것이 알려져 있고(David W. Cope, Giuseppe Di Giovanni, Sarah J. Fyson, Gergely Orban, Adam C. Errington, Magor L. Lorincz, Timothy M. Gould, David A. Carter, and Vincenzo Crunelli, Nat Med., 2009, 15(12):1392-1398), 뇌졸증의 경우 지속성 GABA를 억제하여 신경 회복을 촉진할 수 있다는 것이 알려져 있다(Andrew N. Clarkson, Ben S. Huang, Sarah E. MacIsaac, Istvan Mody and S. Thomas Carmichael, Nature, 2010, 468:305-309). 또한, 해마에 특이적으로 존재하는 지속성 GABA의 수용체를 억제했을 때 기억과 인지능력이 개선된다는 보고가 있다(G. R. Dawson, K. A. Maubach, N. Collinson, M. Cobain, B. J. Everitt, A. M. MacLeod, H. I. Choudhury, L. M. McDonald, G. Pillai, W. Rycroft, A. J. Smith, F. Sternfeld, F. D. Tattersall, K. A. Wafford, D. S. Reynolds, G. R. Seabrook and J. R. Atack, JPET, 2006, 316(3):1335-1345 및 H. Lal, B. Kumar, and M. J. Forster, The FASEB Journal, 1988, 2(11):2707-2711).
한편, 퇴행성 뇌질환은 중추신경계의 신경세포에 퇴행성 변화가 나타나면서 발생하는 뇌질환을 총칭하는 개념으로 해석된다. 퇴행성 뇌질환은 대부분 발병 원인이 알려져 있지 않지만, 연관 신경계를 선택적으로 침범하며, 질병의 발병이 천천히 시작해서 지속적인 진행을 보이는 것이 특징이다. 일 구체예에 따르면, 상기 퇴행성 뇌질환은 예를 들어, 알츠하이머병, 경도인지장애, 뇌졸증 및 혈관성치매, 전두측두엽치매, 루이소체 치매, 크로이츠펠트-야콥병, 외상성 두부 손상, 매독, 후천성 면역 결핍 증후군 및 기타 바이러스 감염, 뇌 농양, 뇌 종양, 다발성경화증, 대사성 질환에 의한 치매, 저산소증, 파킨슨병, 루게릭병, 헌팅턴병, 픽병, 근위축성 측색 경화증, 간질, 허혈, 중풍, 주의결결핍-과잉행동장애, 정신분열증, 우울증, 조울증, 외상후스트레스장애, 척수손상 및 척수염으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.
본 발명의 방법에 따르면, 우선 반응성 성상세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시킨다. 일 구체예에 따르면, 상기 반응성 성상세포는 뇌손상 동물 모델의 뇌조직, 바이러스 감염 동물의 뇌조직, 파긴슨병 동물 모델의 뇌조직, 또는 알츠하이머 질환을 갖는 동물 모델의 뇌조직으로부터 유래한 것일 수 있다. 상기 동물 모델은 포유류 유래일 수 있으며, 예를 들어, 마우스, 래트와 같은 설치류 또는 원숭이와 같은 영장류일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다. 또한, 일 구체예에 따르면, 상기 뇌조직은 해마, 선조체, 흑색질 치밀부 또는 시상핵일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.
상기 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어, "시료(sample)"는 상기 반응성 성상세포 내의 GABA 농도를 감소시키거나 반응성 성상세포로부터의 GABA 방출을 감소시키는 지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 GABA 농도를 감소시키거나 GABA 방출을 감소시키는 기작은, 예를 들어, ⅰ) 상기 반응성 성상세포 내의 MAO-B를 코딩하는 유전자의 발현량, MAO-B 단백질의 양 또는 MAO-B 단백질의 활성의 증가, ⅱ) 상기 반응성 성상세포에서 Best1을 코딩하는 유전자의 발현량, Best1 단백질의 양 또는 Best1 단백질의 활성의 증가, 혹은 베스트로핀 1 채널의 세포 내 분포 양상이 마이크로도메인으로부터 세포체와 주돌기 방향으로 변화, 또는 ⅲ) 상기 반응성 성상세포 내의 GABA 트랜스아미나아제를 코딩하는 유전자의 발현량, GABA 트랜스아미나아제 단백질의 양 또는 GABA 트랜스아미나아제 단백질의 활성의 감소에 의한 것일 수 있다. 상기 시료는 화학물질, 뉴클레오티드, 안티센스-RNA, shRNA(short hairpin RNA), siRNA(small interference RNA) 및 천연물 추출물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이어, 분석하고자 하는 시료가 처리된 반응성 성상세포 내에서 GABA 농도를 감소시키는지 여부를 측정한다. 이는 하기 3가지 방법으로 측정할 수 있다.
ⅰ) 상기 반응성 성상세포 내의 MAO-B를 코딩하는 유전자의 발현량, MAO-B 단백질의 양 또는 MAO-B 단백질의 활성을 측정한다. 측정 결과, 상기 MAO-B를 코딩하는 유전자의 발현량, MAO-B 단백질의 양 또는 MAO-B 단백질의 활성이 감소-조절(down-regulation)되는 것으로 측정되는 경우에는 상기 시료를 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 후보 물질로 판정될 수 있다.
ii) 상기 반응성 성상세포 내의 Best1을 코딩하는 유전자의 발현량, Best1 단백질의 양 또는 Best1 단백질의 활성을 측정한다. 측정 결과, 상기 Best1을 코딩하는 유전자의 발현량, Best1 단백질의 양 또는 Best1 단백질의 활성이 감소-조절(down-regulation)되는 것으로 측정되는 경우에는 상기 시료를 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 후보 물질로 판정될 수 있다.
iii) 상기 반응성 성상세포에서 베스트로핀 1 채널의 세포 내 분포 양상을 측정한다. 측정 결과, 상기 베스트로핀 1 채널의 세포 내 분포 양상이 세포체와 주돌기로부터 마이크로도메인 방향으로 변화된 것으로 측정되는 경우에는 상기 시료를 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 후보 물질로 판정될 수 있다.
iv) 상기 반응성 성상세포 내의 GABA 트랜스아미나아제를 코딩하는 유전자의 발현량, GABA 트랜스아미나아제 단백질의 양 또는 GABA 트랜스아미나아제 단백질의 활성을 측정을 측정한다. 측정 결과, 상기 GABA 트랜스아미나아제 유전자의 발현량, GABA 트랜스아미나아제 단백질의 양 또는 GABA 트랜스아미나아제 단백질의 활성이 증가-조절(up-regulation)되는 것으로 측정되는 경우에는 상기 시료를 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 후보 물질로 판정될 수 있다.
상기 단백질들(MAO-B, Best1, 또는 GABA 트랜스아미나아제)을 코딩하는 유전자의 발현량 변화의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있다. 예를 들어, RT-PCR, 노던 블롯팅, cDNA 마이크로어레이를 이용한 혼성화 반응 또는 인 시투(in situ) 혼성화 반응을 이용하여 실시할 수 있다. 예를 들어. RT-PCR 프로토콜에 따라 실시하는 경우에는 우선, 시료를 처리한 세포에서 총 RNA를 분리한 다음, 올리고 dT 프라이머 및 역전사효소를 이용하여 제1쇄 cDNA를 제조한다. 이어, 제1쇄 cDNA를 주형으로 이용하고, 상기 단백질을 코딩하는 유전자-특이적 프라이머 세트를 이용하여 PCR 반응을 실시한다. 이후, PCR 증폭 산물을 전기영동하고, 형성된 밴드를 분석하여 상기 단백질들을 코딩하는 유전자의 발현량 변화를 측정한다.
상기 단백질들(MAO-B, 베스트로핀 1 채널 또는 GABA 트랜스아미나아제)의 양 또는 세포 내 분포 변화는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있다. 예를 들어, 상기 MAO-B, Best1 또는 GABA 트랜스아미나아제 양의 변화는 면역조직화학법, 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, Western Blot, ELISA, 캡쳐-ELISA, 샌드위치 분석법에 의해 확인할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 단백질(베스트로핀 1 채널)의 세포 내 분포 변화는 면역조직화학법 및 투과전자현미경(TEM)을 통해 확인할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다. 한편, 상기 단백질들의 활성 변화는 당업계에 알려진 효소활성분석(enzyme activity assay in vitro) 방법에 의해 측정할 수 있다.
다른 양상은 반응성 성상세포 내에서 GABA 농도를 감소시키는 물질을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또 다른 양상은 반응성 성상세포 내에서 MAO-B를 코딩하는 유전자의 발현을 억제하거나 또는 MAO-B 단백질의 활성을 감소시키는 물질을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
일 구체예에 따르면, 상기 MAO-B 단백질의 활성을 감소시키는 물질은 하기 화학식 I로 표시되는 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이성질체, 용매화물, 수화물 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물일 수 있다.
화학식 I
Figure 112012065486624-pat00001
상기 식에서, 상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, 니트로, 시아노, 카르복실, 히드록시, 치환 또는 비치환된 C1-C12 알킬, 치환 또는 비치환된 C2-C12 알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C12 알키닐, 치환 또는 비치환된 C3-C15 시클로알킬, 치환 또는 비치환된 핵원자수 3 내지 40의 헤테로시클로알킬, (치환 또는 비치환된 C6-C20 아릴)C1-C12 알킬, 치환 또는 비치환된 C1-C12 알콕시, 치환 또는 비치환된 C6-C20 아릴아민, 치환 또는 비치환된 C6-C30 디아릴아민, 치환 또는 비치환된 C6-C20 아릴옥시, 치환 또는 비치환된 C6-C20 아릴, 혹은 치환 또는 비치환된 핵원자수 5 내지 20의 헤테로아릴이며, 상기 X는 -O-, -S-, 또는 -N(H)-이다.
본 명세서에서 용어, "알킬"은 모 알칸의 단일 탄소 원자로부터 1개의 수소 원자를 제거하는 것에 의해 유도된 포화, 분기된 또는 직쇄 1가 탄화수소기를 지칭한다. 전형적인 알킬기는, 예를 들어, 메틸, 에틸, 프로판-1-일, 프로판-2-일, 및 시클로프로판-1-일과 같은 프로필, 부탄-1-일, 부탄-2-일, 2-메틸-프로판-1-일, 2-메틸-프로판-2-일, 시클로부탄-1-일, tert-부틸과 같은 부틸 등을 포함하나 이에 한정하지는 않는다. 특정 구체예에서, 알킬기는 1 내지 12개 탄소 원자를 포함한다. 상기 알킬기에 존재하는 하나 이상의 수소원자는 할로겐, 히드록시, 저급알킬기 등으로 치환될 수 있다. 용어 "저급 알킬"은 1 내지 6개의 탄소 원자를 포함하는 알킬기를 지칭한다.
용어 “알케닐"은 모 알켄의 단일 탄소 원자로부터 1개의 수소 원자를 제거하여 유도된 적어도 1개의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 불포화 분기된, 직쇄 또는 시클릭 알킬기를 지칭한다. 상기 기는 이중 결합 근처에서 Z- 또는 E-형태(또는 시스 또는 트랜스 입체형태)일 수 있다. 전형적 알케닐 기는, 예를 들어, 에테닐; 프로프-1-엔-1-일, 프로프-1-엔-2-일, 프로프-2-엔-1-일(알릴), 프로프-2-엔-2-일, 시클로프로프-1-엔-1-일과 같은 프로펜일; 시클로프로프-2-엔-1-일; 부트-1-엔-1-일, 부트-1-엔-2-일, 2-메틸-프로프-1-엔-1-일, 부트-2-엔-1-일, 부트-2-엔-2-일, 부타-1,3-디엔-1-일, 부타-1,3-디엔-2-일, 시클로부트-1-엔-1-일, 시클로부트-1-엔-3-일, 시클로부타-1,3-디엔-1-일과 같은 부테닐 등을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다. 특정 구체예에서, 알케닐 기는 2 내지 12개 탄소 원자를 갖고 또는 다른 구체예에서, 2 내지 6개 탄소 원자를 가지며, 즉 "저급 알케닐"이다.
용어 "알키닐"은 모 알킨의 단일 탄소 원자로부터 1개의 수소 원자를 제거하는 것에 의해 유도된 적어도 1개의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖는 불포화 분기된 또는 직쇄를 지칭한다. 전형적인 알키닐 기는, 예를 들어, 에티닐; 프로피닐; 부티닐, 2-펜티닐, 3-펜티닐, 2-헥시닐, 3-헥시닐 등을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다. 일 구체예에서, 알키닐 기는 2 내지 12개 탄소 원자를 갖고 또 다른 구체예에서, 2 내지 6개 탄소 원자(즉 "저급 알키닐")를 갖는다.
용어 "알콕시"는 라디칼 -OR을 지칭하며, 이때 R은 알킬이다. 예를 들어, 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 부톡시, 시클로헥실옥시 등을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다.
용어 "아릴"은 모 방향족 고리 계의 단일 탄소 원자로부터 1개의 수소 원자를 제거하여 유도된 일가의 방향족 탄화수소 기를 지칭한다. 아릴은 5- 및 5-원 카보시클릭 방향족 고리를 포함하며, 예를 들어, 벤젠; 바이시클릭(bicyclic) 고리 계, 이때 적어도 1개의 고리는 카보시클릭 및 방향족, 예를 들어, 나프탈렌, 인단, 및 테트랄린임; 및 트라이시클릭 고리 계, 이때 적어도 1개의 고리는 카보시클릭 및 방향족, 예를 들어, 플루오렌이다. 예를 들어, 아릴은 N, O 및 S로부터 선택된 1 이상의 헤테로원자를 함유하는 5- 내지 7-원 헤테로시클로알킬 고리에 융합된 5- 및 5-원 카보시클릭 방향족 고리를 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 아릴 기는 6 내지 10개 탄소 원자를 포함할 수 있다. 그러나, 아릴은 이하에 개별적으로 정의된 헤테로아릴을 포함하지 않거나 또는 중첩되지 않는다. 따라서, 1 이상의 카보시클릭 방향족 고리가 헤테로시클로알킬 방향족 고리와 융합되면, 생성한 고리 계는 본 명세서에 정의한 바와 같이 헤테로아릴이고, 아릴이 아니다.
용어 "카르복시"는 라디칼 -C(O)OH을 지칭한다.
용어 "시아노"는 라디칼 -CN을 지칭한다.
용어 "시클로알킬"은 포화 또는 불포화이지만, 비방향족, 시클릭 알킬기를 지칭한다. 특정 수준의 포화를 목적하는 경우, 명칭 "시클로알칸일" 또는 "시클로알케닐"이 사용된다. 전형적 시클로알킬기는, 비제한적으로, 시클로프로판, 시클로부탄, 시클로펜탄, 시클로헥산, 등으로부터 유도된 기를 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 시클로알킬기는 C3-10 시클로알킬, 예를 들어, C3-6 시클로알킬일 수 있다.
용어 "헤테로시클로알킬"은 포화 또는 불포화이지만, 비방향족, 시클릭 알킬기며, 1 이상의 탄소원자(및 관련 수소원자)는 독립적으로 적절하게는 동일하거나 상이한 헤테로원자 및 그의 관련 수소원자에 의해 치환된다. 탄소 원자(들)을 치환할 전형적인 헤테로원자는, 비제한적으로, N, P, O, S, 및 Si를 포함한다. 전형적 헤테로시클로알킬기는, 비제한적으로, 에폭사이드, 이미다졸리딘, 모폴린, 피페라진, 피페리딘, 피라졸리딘, 피롤리딘, 퀴누클리딘, 테트라히드로퓨란, 테트라히드로피란 등으로부터 유도된 기를 포함한다. 치환된 헤테로시클로알킬은 또한 피페리딘일 N-옥사이드, 모폴리닐-N-옥사이드, 1-옥소-1-티오모폴리닐 및 1,1-디옥소-1-티오모폴리닐과 같은 1 이상의 옥소(=0) 또는 옥사이드(-O-) 치환기에 의해 치환된 고리 계를 포함한다.
용어 "할로"는 플루오로, 클로로, 브로모, 또는 요오도기를 지칭한다.
용어 "헤테로아릴"은 모 헤테로방향족 고리 계의 단일 원자로부터 1개의 수소 원자를 제거하는 것에 의해 유도된 일가 헤테로방향족기를 지칭한다. 헤테로아릴은 N, O, 및 S로부터 선택된 1 이상의, 예를 들어 1 내지 4개의, 또는 특정 구체예에서, 1 내지 3개의 헤테로원자를 함유하고 나머지 고리 원자는 탄소인 5- 내지 7-원 방향족, 모노시클릭 고리; N, O 및 S로부터 선택되는 1 이상의, 예를 들어, 1 내지 4개의, 또는 특정 구체예에서 1 내지 3개의 헤테로원자를 함유하고 나머지 고리 원자는 탄소이고 또 적어도 1개의 헤테로원자가 방향족 고리에 존재하는 폴리시클릭 헤테로시클로알킬 고리를 포함한다. 예를 들어, 헤테로아릴은 5- 내지 7-원 시클로알킬 고리에 융합된 5- 내지 7-원 헤테로방향족 고리 및 5- 내지 7-원 헤테로시클로알킬 고리에 융합된 5- 내지 7-원 헤테로방향족 고리를 포함한다. 고리의 오직 하나가 1 이상의 헤테로원자를 함유하는 이러한 융합된 바이시클릭 헤테로아릴 고리의 경우, 부착점은 헤테로방향족 고리 또는 시클로알킬 고리에서 일 수 있다. 헤테로아릴 기 중의 S 및 O 원자의 전체 수가 1을 초과하면, 헤테로원자는 서로 인접하지 않는다. 특정 구체예에서, 헤테로아릴 기 중의 S 및 O 원자의 전체 수는 2 이하이다. 특정 구체예에서, 헤테로아릴 기 중의 S 및 O 원자의 전체 수는 1 이하이다. 헤테로아릴은 상기 정의한 바와 같은 아릴을 포함하지 않거나 또는 그와 중첩되지 않는다. 전형적 헤테로아릴 기는, 비제한적으로, 아크리딘, 아르신돌, 카바졸, β-카볼린, 크로만, 크로멘, 신놀린, 퓨란, 이미다졸, 인다졸, 인돌,, 인돌린, 인돌리진, 이소벤조퓨란, 이소크로멘, 이소인돌, 이소인돌린, 이소퀴놀린, 이소티아졸, 이소옥사졸, 나프티리딘, 옥사디아졸, 옥사졸, 페리니딘, 페난트리딘, 페난트롤린, 페나진, 프탈아진, 프테리딘, 퓨린, 피란, 피라진, 피라졸, 피리다진, 피리딘, 피리미딘, 피롤, 피롤리진, 퀸아졸린, 퀴놀린, 퀴놀리진, 퀸옥살린, 테트라졸, 티아디아졸, 티아졸, 티오펜, 트리아졸, 크산텐, 등으로부터 유도된 기를 포함한다. 특정 구체예에서, 헤테로아릴 기는 예를 들어, 5 내지 10원 헤테로아릴과 같은 5 내지 20원 헤테로아릴일 수 있다. 특정 구체예에서, 헤테로아릴 기는 티오펜, 피롤, 벤조티오펜, 벤조퓨란, 인돌, 피리딘, 퀴놀린, 이미다졸, 옥사졸, 및 피라진으로부터 유도된 기일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 화학식 I로 표시되는 화합물에서, 상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, 니트로, 시아노, 치환 또는 비치환된 C1-C12 알킬, 혹은 치환 또는 비치환된 C1-C12 알콕시이며, 상기 X는 -O-, 또는 -S-일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 MAO-B 단백질의 활성을 감소시키는 물질은 N-시클로헥실-2-페닐옥사졸로[5,4-b]피리딘, 2-페닐-5-(피롤리딘-1-일)옥사졸로[5,4-b]피리딘, 2-페닐-5-(피롤리딘-1-일)티아졸로[5,4-b]피리딘, 2-(2-클로로페닐)-5-(피롤리딘-1-일)옥사졸로[5,4-b]피리딘, 2-(3-클로로페닐)-5-(피롤리딘-1-일)옥사졸로[5,4-b]피리딘, 2-(4-플루오로페닐)-5-(피롤리딘-1-일)옥사졸로[5,4-b]피리딘, 2-페닐-5-(피페리딘-1-일)옥사졸로[5,4-b]피리딘, 2-페닐-5-(피페리딘-1-일)티아졸로[5,4-b]피리딘, 2-(2-클로로페닐)-5-(피페리딘-1-일)옥사졸로[5,4-b]피리딘, 2-(3-플루오로페닐)-5-(피페리딘-1-일)옥사졸로[5,4-b]피리딘, 2-(3-클로로페닐)-5-(피페리딘-1-일)옥사졸로[5,4-b]피리딘, 3-(5-(피페리딘-1-일)옥사졸로[5,4-b]피리딘-2-일)벤조니트릴, 2-(4-플루오로페닐)-5-(피페리딘-1-일)옥사졸로[5,4-b]피리딘, 2-(4-브로모페닐)-5-(피페리딘-1-일)옥사졸로[5,4-b]피리딘, 2-(4-메톡시페닐)-5-(피페리딘-1-일)옥사졸로[5,4-b]피리딘, 2-(3-클로로페닐)-N-메틸옥사졸로[5,4-b]피리딘-5-아민 또는 2-(4-클로로페닐)-N-메틸옥사졸로[5,4-b]피리딘-5-아민일 수 있다.
다른 양상은 반응성 성상세포 내에서 베스트로핀 1 채널의 세포 내 분포 양상을 세포체와 주돌기로부터 마이크로도메인 방향으로 변화시키는 물질을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또 다른 양상은 반응성 성상세포 내에서 GABA 트랜스아미나아제를 코딩하는 유전자의 발현을 유도하거나 또는 GABA 트랜스아미나아제 단백질의 활성을 증가시키는 물질을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학적 조성물은 화학물질, 뉴클레오티드, 안티센스, shRNA, siRNA 올리고뉴클레오티드 및 천연물 추출물을 유효성분으로 포함할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 퇴행성 뇌질환은 알츠하이머병, 경도인지장애, 뇌졸증 및 혈관성치매, 전두측두엽치매, 루이소체 치매, 크로이츠펠트-야콥병, 외상성 두부 손상, 매독, 후천성 면역 결핍 증후군 및 기타 바이러스 감염, 뇌 농양, 뇌 종양, 다발성경화증, 대사성 질환에 의한 치매, 저산소증, 파킨슨병, 루게릭병, 헌팅턴병, 픽병, 근위축성 측색 경화증, 간질, 허혈, 중풍, 주의결결핍-과잉행동장애, 정신분열증, 우울증, 조울증, 외상후스트레스장애, 척수손상 및 척수염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.
상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 상기 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여(예를 들어, 정맥내 투여, 복강내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 또는 국부 투여)할 수 있다.
상기 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 상기 약학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001-100 mg/kg(체중)일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
일 구체예에 따른 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 후보 물질의 스크리닝 방법에 의하면, 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료 물질을 효과적으로 스크리닝할 수 있으며, 이에 따른 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 여러 퇴행성 뇌질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.
도 1은 알츠하이머 마우스 모델의 해마에서 관찰한 반응성 성상세포 및 반응성 성상세포 내에서의 GABA를 나타내는 공초점 형광 이미지이다.
도 2는 알츠하이머 마우스 모델의 해마에서 관찰한 반응성 성상세포 내에서의 MAO-B의 발현량을 나타내는 공초점 형광 이미지이다.
도 3은 알츠하이머 마우스 모델의 해마에서 관찰한 반응성 성상세포 내에서의 베스트로핀 1 채널의 세포 내 분포를 나타내는 공초점 형광 이미지이다.
도 4는 알츠하이머 마우스 모델의 해마에서 관찰한 반응성 성상세포 내에서의 GABA 트랜스아미나아제의 발현량을 나타내는 공초점 형광 이미지이다.
도 5는 알츠하이머 마우스 모델의 해마 조직에서 관찰한 GABA의 분포를 나타낸 공초점 형광 이미지이다.
도 6은 뇌손상 마우스 모델의 해마에서 관찰한 반응성 성상세포 내에서의 베스트로핀 1 채널의 세포 내 분포를 나타내는 공초점 형광 이미지이다.
도 7은 뇌손상 마우스 모델의 해마에서 관찰한 반응성 성상세포 내에서의 MAO-B의 발현량을 나타내는 공초점 형광 이미지이다.
도 8은 뇌손상 마우스 모델의 해마에서 관찰한 반응성 성상세포 내에서의 GABA 트랜스아미나아제의 발현량을 나타내는 공초점 형광 이미지이다.
도 9는 사람 알츠하이머 환자의 사후 대뇌 조직에서 관찰한 반응성 성상세포 내에서의 GABA를 나타내는 광학현미경 이미지이다.
도 10은 사람 알츠하이머 환자의 사후 대뇌 조직에서 관찰한 반응성 성상세포 내에서의 MAO-B 발현량과 GABA를 나타내는 공초점 형광 이미지와, GFAP와 MAO-B mRNA 발현량 증가를 나타내는 그래프이다.
도 11은 바이러스 감염 모델 생쥐의 시상핵에서 관찰한 반응성 성상세포 및 반응성 성상세포 내에서의 GABA를 나타내는 공초점 형광 이미지이다.
도 12는 파킨슨병 모델 랫트의 흑색질 치밀부에서 관찰한 반응성 성상세포 및 반응성 성상세포 내에서의 MAO-B와 GABA를 나타내는 공초점 형광 이미지이다.
도 13은 파킨슨병 모델 마우스의 흑색질 치밀부에서 관찰한 반응성 성상세포 및 반응성 성상세포 내에서의 Best1과 GABA를 나타내는 공초점 형광 이미지이다.
도 14는 알츠하이머 모델 마우스의 해마 추출물의 MAO-B효소 활성 정도를 나타내는 그래프이다.
도 15는 알츠하이머 모델 마우스의 해마 조직내 세포에 존재하는 GABA의 농도를 나타내는 고성능액체크로마토그래피 결과 그래프이다.
도 16은 알츠하이머 모델 마우스의 해마 치아이랑 과립세포가 지속성 가바에 의해 받는 억제성 전류의 크기를 비교한 자취 그림과 그래프이다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1-1: 알츠하이머 모델 마우스에서 반응성 성상세포 내 GABA 증가 확인
알츠하이머병에서 정상 성상세포가 반응성 성상세포로 변하면서 세포 내 GABA의 양이 증가하는지 여부를 확인하기 위하여, 잘 알려진 알츠하이머병 모델인 APPswe/PSEN1 형질 전환 마우스(구입처: The Jackson Laboratory, http://www.jax.org) 에서 면역조직화학법을 수행하였다. 또한, 면역염색을 마친 조직에 티오플라빈-S 염색을 추가로 수행하여 알츠하이머 병의 특징인 아밀로이드 플라크(plaque)를 함께 관찰하였다.
8~9개월령의 APPswe/PSEN1 마우스를 애버틴(Avertin)으로 깊이 마취시킨 후, 4% 파라포름알데히드로 관류 교정시켰다. 뇌를 꺼내어 해마의 30 ㎛ 두께의 관상 초냉동 박절 박편(coronal cryostat sections)을 얻어 PBS로 3회 헹구고, 블로킹 용액(0.3% Triton-X, 2% normal serum in 0.1M PBS, sigma)에서 1시간 동안 반응시켰다. 닭 항-GFAP 항체(1:500, Chemmicon) 및 기니아피그 항-GABA 항체(1:1000, Chemicon)의 혼합물과 함께 4℃에서 밤새 진탕 배양하였다. PBS로 3회 세척하고, 이어서 대응하는 이차항체가 접합된 항-닭 Alexa 488 (1:200, Invitrogen) 및 항-기니아피그 Alexa 647(1:200, Invitrogen)로 3시간 동안 반응시킨 후 다시 PBS로 3회 세척하였다. 50% 에탄올 수용액에 녹인 1 mM 티오플라빈-S(thioflavin-S)에 8분 동안 반응시키고, 80% 에탄올에 10초 동안 2번, 3차 증류수에 10초 동안 3번 세척하였다. 염색이 끝난 조직은 PBS로 옮기고 슬라이드 글라스 위에 올려서 마운팅 배지(Dako)로 마운팅하였다. FV1000 공초점 현미경(Olympus)을 사용하여 일련의 공초점 형광 이미지를 얻었다. 상기 이미지는 Olympus FLUOVIEW software ver.2.1로 가공하였다.
상기에서 얻어진 APPswe/PSEN1 형질전환 마우스 해마에서의 GFAP 및 GABA에 대한 항체를 이용한 고배율(x40) 면역조직화학 공초점 이미지를 도 1에 나타내었다. 도 1에서 알츠하이머 모델 마우스 해마에서는 정상 마우스에서는 없는 아밀로이드 플라크(파란색)가 관찰되었다. 성상세포 마커인 GFAP(초록색)로 염색된 세포는 알츠하이머 모델에서 반응성 성상세포로 변화하면서 GFAP로 염색된 정도가 크게 증가하였고 세포체의 크기와 주돌기의 굵기가 증가한 것을 볼 수 있다. 정상 성상세포 내부에는 GABA(붉은색)가 없거나 거의 없는 반면, 알츠하이머 모델에서는 세포 내 GABA의 양이 극적으로 증가함을 확인할 수 있었다. 반면, GFAP로는 염색되지 않지만 GABA로 염색된 인터뉴런(interneuron)은 정상 마우스와 알츠하이머 모델 마우스에서 크기나 GABA 염색 정도에 차이가 없었다.
실시예 1-2: 알츠하이머 환자 뇌에서 반응성 성상세포 내 GABA 증가 확인
알츠하이머병에 걸린 환자에서 정상 성상세포가 반응성 성상세포로 변하면서 세포 내 GABA의 양이 증가하는지 여부를 확인하기 위하여, 정상인과 알츠하이머병 환자의 사후 뇌 조직 (출처: 보스턴 의과대학) 대뇌 부분에서 면역조직화학법을 수행하였다. 고정된 사후 뇌 조직을 30 ㎛ 두께의 관상 초냉동 박절 박편(coronal cryostat sections)을 얻어 과산화수소수 용액에 반응시켜 조직내에 남아있는 페록시다아제 효소의 활성을 억제한 후 PBS로 3회 헹구고, 블로킹 용액(0.3% Triton-X, 2% normal serum in 0.1M PBS, sigma)에서 1시간 동안 반응시켰다. 다음으로, 기니아피그 항-GABA 항체(1:1000, Chemicon)의 혼합물과 함께 4℃에서 밤새 진탕 배양하였다. PBS로 3회 세척하고, 이어서 대응하는 이차항체가 접합된 항-기니아피그 HRP (1:200, Invitrogen)로 3시간 동안 반응시킨 후 다시 PBS로 3회 세척하였다. 다음으로 DAB용액과 반응시켜 HRP 활성에 의해 갈색의 염색 반응이 나오도록 한 후, 염색이 끝난 조직은 PBS로 옮기고 슬라이드 글라스 위에 올려서 마운팅 배지(Dako)로 마운팅하여 광학현미경으로 관찰하였다. 정상인과 알츠하이머 환자 사후 대뇌조직에서 GABA에 대한 항체를 이용한 고배율(x40) 면역조직화학 광학 이미지를 도 9에 나타내었다. 도 9에서 정상인의 대뇌 성상세포 내부에는 GABA(갈색)가 없거나 거의 없는 반면, 알츠하이머 환자의 대뇌 성상세포 내부에는 세포 내 GABA의 양이 극적으로 증가함을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터 GABA를 축적하는 반응성 성상세포가 나타나는 현상이 알츠하이머 모델 생쥐 뿐만 아니라 실제 사람 환자에서도 동일하게 나타나므로, 본 기술이 알츠하이머 병 예방과 치료에 적용될 수 있음을 뒷받침한다.
실시예 2-1: 반응성 성상세포의 MAO -B, 베스트로핀 1 및 GABA 트랜스아미나아제의 발현 변화 확인
반응성 성상세포 내의 MAO-B, 베스트로핀 1 및 GABA 트랜스아미나아제의 발현 변화를 확인하기 위해, 하기와 같이, 항체의 종류를 추가 한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법을 사용하여, 면역조직화학염색을 수행하였다.
일차 항체는 닭 항-GFAP 항체(1:500, Chemmicon) 및 기니아피그 항-GABA 항체(1:1000, Chemicon)를 기본으로 하여 토끼 항-MAO-B 항체 (1:50, Sigma) 또는 토끼 항-Best1 항체 (1:100, Soria et al. 2006) 또는 토끼 항-GABA 트랜스아미나아제 항체 (1:100 Epitomics)를 추가하였다. 이차 항체는 항-닭 DyLight 488 (1:200, JacksonIR) 및 항-기니아피그 Alexa 647(1:200, Invitrogen)에 항-토끼 Alexa 555 (1:200 Invitrogen) 항체를 추가하여 반응시켰다.
그 결과, 도 2에서 보는 바와 같이, 반응성 성상세포 내에서 MAO-B가 증가하였음을 확인할 수 있었고, 도 3에서 보는 바와 같이, 반응성 성상세포 내의 GABA 트랜스아미나아제가 감소함을 확인할 수 있었으며, 이와 같은 MAO-B의 발현량 증가 및 GABA 트랜스아미나아제의 발현량 감소에 의해 반응성 성상세포 내에 GABA의 양이 증가함을 알 수 있었다. 또한, 도 4에서 보는 바와 같이, 대조군(wild type)과 비교하여 베스트로핀 1 채널의 세포내 분포 위치(subcellular localization)가 변화하였음을 확인할 수 있었으며, 이에 의해 GABA의 분비 양상이 변화하여 알츠하이머 질환을 유도한다는 것을 알 수 있었다.
실시예 2-2: 알츠하이머 모델 생쥐의 뇌에서 MAO -B의 단백질 활성 증가 확인
본 실험은 알드리치에서 구매한 휴먼 MAO-B 효소와 Amplex® Red monoamine oxidase assay kit를 이용하여 스탁 용액 준비는 매뉴얼에 따랐다. 이 키트 안에는 5X reaction buffer, Amplex®red reagent(1mg), HRP(horseradish peroxidase), DMSO, H2O2, p-타이라민(MAO-A,B의 기질), 벤질아민(MAO-B의 기질), 클로길린(MAO-A의 저해제), 파길린(MAO-B의 저해제)가 들어있다. 그 중에서 우리는 MAO-B 기질로 벤질아민을 사용하였고, MAO-B의 저해제로는 파길린을 사용하였다. 전체 기질로 작용할 용액의 준비과정은 다음과 같다.
Amplex® red 1mg에 DMSO 200 ul을 넣어 충분히 녹인 200 ul, HRP와 1ml의 1X buffer 을 섞은 100 ul, 벤질아민과 1.2 ml의 dH2O에 녹인 200 ul를 9.5 ml의 1X buffer에 넣어 총 10 ml를 만든다. 이 양은 100개의 well에 사용할 수 있다. MAO-B 저해제인 파길린에 1 ml의 dH2O을 섞어 각 well 당 0.5 ul를 넣는다.
먼저, 준비한 96well 의 첫번째 줄과 두번째 줄에 알츠하이머 생쥐로부터 분리한 해마 추출물을 넣고, 세번째 줄과 네번째 줄에 와 정상 생쥐로부터 분리한 해마 추출물을 넣는다. 생쥐를 마취시킨 후 뇌를 꺼내어 해마를 적출하고, 해마에서 CA1 부위와 DG 부위를 따로 분리하였다. 분리한 조직은 신선한 상태로 균질화용액에 넣고 갈아서 균질화시켰다. 원심분리기에 약하게 돌려 큰 덩어리를 제거하고 상층액만 채취한 다음 고속 원심분리 (13000rpm 20분)하여 미토콘드리아가 농축된 침전물을 얻었다. 해마에서 추출한 이 침전물을 50 마이크로그램씩 MAO-B효소활성 측정에 이용하였다.
두 번째 줄과 네 번째 줄에는 파길린 저해제제를 0.5 ul씩 추가로 넣어준다. 실험의 오차를 줄이고 정확성을 높이기 위해 한 화합물당 3번씩 실험을 반복 하였다. 30분 뒤, 암실에서 기질로 작용할 용액을 100 ul씩 넣어준다. Amplex® reagent가 빛에 민감하기 때문에 암실에서 실험을 한다. 결국, 각 well 당 200 ul의 양이 되는 것이다. 2~3 시간 뒤, 발색의 정도를 측정하면 첫번째 줄과 두번째 줄의 데이터 값의 차가 알츠하이머 생쥐의 해마에서 순수하게 MAO-B 효소와 그의 기질과의 반응에 의한 활성이고, 세번째 줄과 네번째 줄의 데이터 값의 차가 정상 생쥐의 해마에서 순수하게 MAO-B 효소와 그의 기질과의 반응에 의한 활성이다.
도 14로부터, 알츠하이머 생쥐에서 정상 생쥐에 비해 해마의 MAO-B 활성이 증가되어있음을 알 수 있다. 전체 해마 추출물은 물론이고 특히 해마의 DG 부분에서 MAO-B의 활성이 25% 가량 증가되었다. 이로부터 MAO-B의 활성이 증가하여 알츠하이머 질환을 유도한다는 것을 알 수 있었다.
실시예 2-3: 알츠하이머 환자 뇌에서 반응성 성상세포의 MAO -B 발현 증가 확인
반응성 성상세포 내의 MAO-B의 발현 변화를 확인하기 위해, 하기와 같이, 항체의 종류를 추가한 것을 제외하고는, 실시예 2과 동일한 방법을 사용하여, 알츠하이머 환자의 사후 대뇌 조직에서 면역조직화학염색을 수행하였다.
일차 항체는 닭 항-GFAP 항체(1:500, Chemmicon) 와 기니아피그 항-GABA 항체(1:1000, Chemicon) 및 토끼 항-MAO-B 항체 (1:50, Sigma) 를 사용하였다. 이차 항체는 항-닭 DyLight 488 (1:200, JacksonIR) 및 항-기니아피그 Alexa 647(1:200, Invitrogen)에 항-토끼 Alexa 555 (1:200 Invitrogen) 항체를 추가하여 반응시켰다.
그 결과, 도 10A에서 보는 바와 같이, 반응성 성상세포 내에서 MAO-B가 증가하였음을 확인할 수 있었다. 이와 같은 MAO-B의 발현량 증가에 의해 반응성 성상세포 내에 GABA의 양이 증가함을 알 수 있었다. 이로부터 사람 알츠하이머 환자에서도 반응성 성상세포 내의 MAO-B의 발현량 증가에 의해 GABA가 증가하여 알츠하이머 질환을 유도한다는 것을 알 수 있었다.
또한 quantitative RT-PCR 방법을 이용하여 알츠하이머 환자 뇌에서 MAO-B의 mRNA 발현량이 증가한 것을 확인하였다. 알츠하이머 환자 사후 뇌 조직으로부터 총 RNA를 채취하여, 올리고 dT 프라이머 및 역전사효소를 이용하여 제 1쇄 cDNA를 제조한다. 이어, 제1쇄 cDNA를 주형으로 이용하고, MAO-B 단백질과 GFAP 단백질을 코딩하는 유전자-특이적 프라이머 세트를 이용하여 PCR 반응을 실시한다. 이후, PCR 증폭 산물을 전기영동하고, 형성된 밴드를 분석하여 상기 단백질들을 코딩하는 유전자의 발현량 변화를 측정한다.
그 결과, 도 10B에서 보는 것과 같이 성상세포 마커인 GFAP의 발현량이 알츠하이머 환자의 뇌에서 증가하였으며, 도 10C에서와 같이 GABA를 만드는 효소인 MAO-B의 발현량도 알츠하이머 환자의 뇌에서 증가해 있었다. 도 10D는 각 환자 샘플의 GFAP와 MAO-B 발현량의 상관관계를 나타낸 것이다. 이로부터 알츠하이머 환자의 뇌에서 MAO-B 단백질의 양뿐만 아니라 mRNA 발현량도 증가되어 있음을 알 수 있었다.
실시예 3-1: 알츠하이머 모델 마우스에서 반응성 성상세포의 GABA 생산에 의한 해마 조직 내 지속성 GABA 의 증가 확인
실시예 1에 의해 제작된 슬라이드로부터 FV1000 공초점 현미경 (Olympus)을 사용하여 저배율(x10)에서 공초점 형광 이미지를 얻었다. 도 5에서 보는 바와 같이, 알츠하이머 모델 마우스의 해마에서 치아이랑(dentate gyrus)의 분자층(molecular layer) 부분에 GABA 염색이 전체적으로 증가되었다(흰색 화살표). 이는 세포 내외의 GABA 양이 늘어났음을 의미하는 것으로, 실시예 2의 결과와 같이, 반응성 성상세포 내에서 MAO-B가 증가함으로써, 세포 내부의 GABA가 축적되고, 베스트로핀 1 채널의 세포내 분포 위치(subcellular localization)가 변화함으로써, 세포 외로 GABA가 분비되어 지속성 GABA가 됨을 확인할 수 있었다. 이러한 GABA의 분비 양상 변화에 의해 알츠하이머 질환을 유도한다는 것을 예상할 수 있었다.
실시예 3-2: 알츠하이머 모델 마우스에서 반응성 성상세포의 GABA 생산에 의한 해마 조직 내 세포 밖 GABA 농도의 증가 확인
알츠하이머 모델 마우스의 해마에서 microdialysis 미세투석법과 HPLC 고성능액체크로마토그래피 방법을 이용하여 조직 내 세포 밖 GABA 농도가 증가함을 확인하였다. 상기의 모델 마우스를 isoflurane으로 마취 후 stereotaxic에 고정시키고 도15a,b와 같이 해마에서 아밀로이드 플라크가 많이 생기는 부위에 guide cannula와 미세투석 프로브를 이식하였다. 마우스가 마취에서 완전히 깨어난 뒤 probe를 통해 인공뇌척수액을 흘려주면서 미세투석되어 나온 액체를 20분 간격으로 채집하고, 이 액체에 들어있는 GABA의 양을 고성능액체크로마토그래피로 분석했다.
도 15에서 알츠하이머 모델 마우스는 조직 내 세포 밖 GABA의 농도가 정상 생쥐에 비해 2배 가량 증가되어있음을 알 수 있었다. 이는 반응성 성상세포 내에서 만들어진 GABA가 축적된 후 세포 밖으로 분비되어 지속성 GABA를 형성하고 있음을 의미하는 것으로 이러한 GABA의 분비 증가에 의해 알츠하이머 질환을 유도한다는 것을 예상할 수 있었다.
실시예 3-3: 알츠하이머 모델 마우스에서 반응성 성상세포의 GABA 생산에 의한 해마 신경세포가 받는 억제신호의 증가 확인
알츠하이머 모델 마우스의 해마에 있는 신경세포가 GABA에 의해 매개된 억제신호를 받는 정도를 전세포 패치 클램프 기록 (whole-cell patch clamp) 방법으로 측정하였다.
알츠하이머 모델 마우스를 halothane으로 마취시킨 후 머리를 자르고 두개골로부터 뇌를 신속하게 꺼내어, 절단 용액(ice-cold cutting solution)에 침지시켰다: 상기 용액은 250 mM 슈크로오스, 26 mM NaHCO3, 10 mM D(+)-글루코오스, 4 mM MgCl2, 3 mM myo-inositol, 2.5 mM KCl, 2 mM Sodium pyruvate, 1.25 mM NaH2PO4, 0.5 mM Ascorbic acid, 0.1 mM CaCl2, 및 1 mM Kynurenic acid (pH 7.4) 포함. 모든 용액을 95% O2-5% CO2로 가스처리하였다. 뇌 앞부분과 소뇌부분을 칼로 잘라 제거한 후 해마를 포함하는 300 마이크로미터 두께의 박편을 마이크로톰(Leica VT 1000)으로 절단하고, 인공뇌척수액으로 옮겼다; 상기 용액은 126 mM NaCl, 24 mM NaHCO3, 1 mM NaH2PO4, 2.5 mM KCl, 2.5 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 및 10 mM D(+)-Glucose (pH 7.4)를 포함. 박편들을 적어도 상온에서 40분 동안 인큐베이팅하였다. 전세포 패치 기록을 위하여 해마 박편들을 flow controller (Synaptosoft)와 진공펌프 (Charles Austen, model Capex 8C)에 의하여 조절되는 인공뇌척수액으로 계속적으로 흘려주는(superfusing, flow rate; 2ml/min) 전자생리학적 기록 챔버(RC-26G, Warner Instruments)로 옮겼다. 슬라이스 챔버를 정립현미경 (upright microscope, Olympus, Japan)의 재물대 위에 올려놓고, 미분간섭대비(differential interference contrast) 및 적외선 옵틱으로 X60 수침체 (water immersion objective)로 관찰하였다. 세포 형태를 Imaging Workbench 6.0 (INDEC Systems, Inc), camera controller (Hamamatsu, C4742-95), 및 light microscope controller (Olympus, TH4-200)를 통하여 시각적으로 확인하였다. 대부분 해마의 치아이랑 부분에 위치하는 신경세포인 과립세포(granule cell) 몸체(somata)로부터 전세포 전압-클램프 기록을 얻었다.
과립세포 기록을 위하여, 후벽 보로실리케이트 유리 모세관(thick-walled borosilicate glass capillaries, SC150F-10, Warner instrument Corp)으로부터 패치 피펫(8-12 MΩ)를 만들고, 피펫을 다음의 조성을 갖는 내부 용액으로 충전시켰다: 135 mM CsCl, 4 mM NaCl, 0.5 mM CaCl2, 10 mM HEPES, 5 mM EGTA, 2 mM Mg-ATP, 0.5 mM Na2-GTP 및 10 mM QX-314, CsOH로 pH 7.2로 조정 (278-285 mOsmol) (Rossi, et al., 2003). 이와 같은 내부 용액, 전압 클램프 Ecl=0 mV, 및 유지전위 -70 mV로 내향전류(inward current)가 유도되었다. 과립세포를 패치 피펫으로 전세포 패치 클램프 기록을 하면서 흥분성 물질인 glutamate에 의한 신경신호 전달을 억제 하기 위해 AP-5와 CNQX를 포함한 인공뇌척수액을 5분 이상 흘려주어 억제성 물질인 GABA에 의한 신경신호만 선택적으로 기록하였다. 5분이 경과하면 GABA에 의한 신경신호 전달을 억제하는 bicuculline을 포함한 인공뇌척수액을 3분간 흘려주어 GABA 신호를 억제했다. bicuculilline으로 억제되기 전과 후의 baseline을 비교하면 과립세포가 받는 지속성 GABA 신호의 양을 알 수 있었다.
상기 얻어진 신호를 계수화하고, pCLAMP 10.2 software (Molecular Devices)를 사용하여 Digidata 1440A (Molecular Devices) 및 Multiclamp 700B amplifier (Molecular Devices)으로 50 μs 간격으로 샘플링하였다. Clampfit 10.2 (Molecular Devices), SigmaPlot 10.0 (SPSS) 및 Excel 2003 (Microsoft)를 이용하여 오프라인 분석을 수행하였다.
본 실시예에서 사용된 모든 약물과 화학물질은 다음과 같은 별도의 언급이 없는 한 SIGMA사로부터 구입한 것이다: QX-314 (Tocris), AP-5(Tocris), CNQX(Tocris), bicuculline methobromide (Tocris).
수치 데이터는 means±S.E.M로 나타내었다. 비교용 데이터의 유의성은 Student's two-tailed unpaired t test에 의하여 구하였고, 유의수준은 * (p < 0.05), ** (p < 0.01), 및 ***(p < 0.001)로 나타내었다. 데이터는 2kHz에서 필터링하였다.
실험 결과, 알츠하이머 모델 생쥐의 해마 치아이랑 과립세포는 정상생쥐에서와 비교하여 더 많은 지속성 GABA에 의한 억제를 받고 있었다.(도 16) GABA에 의한 세포내 염소이온의 유입을 나타내는 전류의 크기는 알츠하이머 모델 생쥐에서 평균 12pA, 정상 생쥐에서 8pA였다. 세포의 면적을 고려한 지속성 전류 밀도 또한 알츠하이머 생쥐에서 정상에 비해 2개 정도 증가해 있었다. 이로부터 알츠하이머 병의 해마 내의 반응성 성상세포 가 만든 GABA가 세포밖 조직내로 분비되어 신경세포를 억제함을 알 수 있다. 이는 결과적으로 신경세포의 원활한 신호전달을 억제하여 정상적인 뇌 기능을 방해하고 알츠하이머 병의 주된 증상인 기억력 감퇴 등으로 나타나는 것이라 예상할 수 있다.
실시예 4-1: 바이러스 감염 모델 마우스에서 반응성 성상세포 내 GABA 증가 확인
알츠하이머 모델 마우스 대신 wildtype C57BL/6 마우스 (구입처: The Jackson Laboratory)를 이용하였고, 마우스를 마취시켜 stereotaxic 장비에 고정시킨 후 시상핵 부위에 GFP 형광단백질을 발현하는 아데노바이러스를 주사하여 바이러스 감염을 유도하였다. 바이러스에 감염된 마우스로부터 실시예 1과 동일한 방법을 사용하여 면역화학적 시험을 수행하였다.
도 11에서 보는 바와 같이, 바이러스에 감염되지 않은 시상핵에서는 성상세포(초록색)에 GABA가 거의 없으나, 아데노바이러스를 감염시킨 시상핵에서는 알츠하이머 모델과 마찬가지로 GABA를 많이 가진 성상세포(노란색)들이 나타났다.
상기 결과는 GABA를 축적하는 반응성 성상세포가 생길 수 있는 상황이 알츠하이머 병 뿐만 아니라 바이러스 감염을 포함한 다른 퇴행성 뇌질환과 뇌 손상까지 확장될 수 있음을 뒷받침한다.
실시예 4-2: 파킨슨병 모델 랫트와 마우스에서 반응성 성상세포 내 GABA 증가와 MAO-B, 베스트로핀 1의 발현 변화 확인
파킨슨병 모델 랫트로는 6-OHDA를 뇌에 주사한 wildtype 랫트를 사용하였고, 파킨슨병 모델 마우스로는 MPTP를 복강에 주사한 wildtype C57BL/6 마우스(구입처: The Jackson Laboratory)를 이용하였다. 두 모델 모두 흑색질 치밀부(substantia nigra, pars compacta) 부분에 있는 도파민을 생성하는 신경세포를 죽여 파킨슨 증상을 유도하였다. 이로부터 실시예 1과 동일한 방법을 사용하여 면역화학적 시험을 수행하였다.
도 12에서 보는 바와 같이, 파킨슨병 모델 랫트에서 알츠하이머 모델과 마찬가지로 반응성 성상세포 내에서 MAO-B 발현이 능가하고 GABA의 양이 늘어나는 것을 확인할 수 있었다. 또한 도 13에서 보는 바와 같이 파킨슨병 모델 마우스에서 베스트로핀 1 채널의 세포내 분포 양상이 반응성 성상세포에서 마이크로도메인으로부터 세포체와 주돌기 쪽으로 점차 변화하였으며 발현량도 증가하였다. 또한 반응성 성상세포 내에서 GABA의 양도 늘어났다.
상기 결과는 GABA를 축적하는 반응성 성상세포가 생길 수 있는 상황이 알츠하이머 병 뿐만 아니라 파킨슨병을 포함한 다른 퇴행성 뇌질환과 뇌 손상까지 확장될 수 있음을 뒷받침한다.
실시예 4-3: 해마 손상 마우스 모델에서 반응성 성상세포 내 GABA 증가와 MAO -B, 베스트로핀 1 및 GABA 트랜스아미나아제의 발현 변화 확인
알츠하이머 모델 마우스 대신 GFAP-EGFP 형질전환 마우스(구입처: The Jackson Laboratory)를 이용하였고, 실시예 1과 동일한 방법으로 마우스를 마취시켜, 마취 상태의 마우스의 해마에 뾰족한 핀을 도입하여 해마 손상을 유도하였다. 해마 손상 후 5일째, 14일째 마우스로부터 실시예 1과 동일한 방법을 사용하여 면역화학적 시험을 수행하였다.
도 6에서 보는 바와 같이, 해마 손상 후 5일째, 14일째에서 알츠하이머 모델과 마찬가지로 반응성 성상세포의 베스트로핀 1 채널의 세포내 분포 양상이 반응성 성상세포에서 마이크로도메인으로부터 세포체와 주돌기 쪽으로 점차 변화하였으며, 도 7에서 보는 바와 같이, 해마 손상 후 5일째에 반응성 성상세포 내에서 MAO-B 발현이 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 8에서 보는 바와 같이, 해마 손상 후 5일째에 성상세포의 세포체와 주돌기의 크기가 증가한 것에 비해서, 세포 면적당 GABA 트랜스아마나아제의 발현은 감소하였음을 확인할 수 있었다.
상기 결과는 GABA를 축적하는 반응성 성상세포가 생길 수 있는 상황이 알츠하이머 병 뿐만 아니라 다른 퇴행성 뇌질환과 뇌 손상까지 확장될 수 있음을 뒷받침한다.
실시예 5: MAO -B의 활성을 저해시키는 물질의 스크리닝을 위한 화합물의 제조
상기 실시예에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 퇴행성 뇌질환의 치료와 관련이 있는 MAO-B의 활성을 저해시키는 화합물을 스크리닝하기 위해서, 하기와 같은 방법으로 총 79종의 화합물을 얻었다.
실시예 5-1: N-(2,6- 디클로로피리딘 -3-일) 벤즈아미드의 합성
Figure 112012065486624-pat00002
벤조일 클로라이드(0.038 ml, 0.33 mmol)을 아세토니트릴 4 ml에 녹인 뒤, 2,6-디클로로피리딘-3-아민(50mg, 0.30mmol)을 넣고, 70℃에서 6시간 동안 환류하였다. TLC로 반응 종결을 확인하고 상온으로 식힌 다음 감압 증류하였다. 생성된 갈색 고체를 소량의 메탄올을 넣으면 하얀 고체가 생성되는데, 이를 여과 건조하여 목적화합물 58.7 mg (0.22 mmol, 수득율: 73~90%)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, MeOD) δ 8.29 (d, J=8.4Hz,1H),8.00-7.98(m,2H),7.62(t,J=6.1Hz,1H),7.57-7.50(m,3H)
실시예 5-2: 2- 클로로 -N-(2,6- 디클로로피리딘 -3-일) 벤즈아미드의 합성
Figure 112012065486624-pat00003
시작물질로 2-클로로벤조일 클로라이드(0.04 ml, 0.33 mmol)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-1과 동일한 방법으로 목적화합물 65 mg (0.19 mmol, 75%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.98(d,J=8.6Hz,1H),8.68(s,1H),7.80(d,J=6.67Hz,1H),7.56-7.52(m,2H),7.49-7.45(m,1H),7.39(d,J=8.6Hz,1H)
실시예 5-3: N-(2,6- 디클로로피리딘 -3-일)-3- 플루오로벤즈아미드의 합성
Figure 112012065486624-pat00004
시작물질로 3-플루오로벤조일 클로라이드(0.04 ml, 0.33 mmol)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-1과 동일한 방법으로 목적화합물 45 mg (0.18 mmol, 60~100%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3) 8.93(d,J=8.5Hz,1H),8.37(s,1H),7.68(t,J=7.5Hz,2H),7.57(q,J=8.0Hz,1H),7.41-7.34(m,2H)
실시예 5-4: 3- 클로로 -N-(2,6- 디클로로피리딘 -3-일) 벤즈아미드의 합성
Figure 112012065486624-pat00005
시작물질로 3-클로로벤조일 클로라이드 (0.04 ml, 0.33 mmol)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-1과 동일한 방법으로 목적화합물 58.8 mg (0.19 mmol, 59%)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, MeOD) δ 8.22 (d, J=8.3Hz,1H),7.97(t,J=1.9Hz,1H),7.90-7.88(m,1H),7.62-7.61(m,1H),7.5(dd,J=7.9,11.6Hz,2H)
실시예 5-5: N-(2,6- 디클로로피리딘 -3-일)-3- 메틸벤즈아미드의 합성
Figure 112012065486624-pat00006
시작물질로 3-메틸벤조일 클로라이드 (0.63 ml, 4.7 mmol)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-1과 동일한 방법으로 목적화합물 1g (3.6 mmol, 83%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.92(d,J=8.4Hz,1H),8.36(s,1H),7.72(s,1H),7.70-7.67(m,1H),7.43(d,J=4.2Hz,1H),7.35(d,J=3.3Hz,1H),2.47(s,3H)
실시예 5-6: N-(2,6- 디클로로피리딘 -3-일)-3- 니트로벤즈아미드의 합성
Figure 112012065486624-pat00007
시작물질로 3-니트로벤조일 클로라이드(626 mg, 3.4 mmol)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-1과 동일한 방법으로 목적화합물 960 mg (3.07 mmol, 99%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.87(d,J=8.4Hz,1H),8.77(s,1H),8.49(dd,J=2.4,6.0Hz,1H),8.37(s,1H),8.24(d,J=7.8Hz,1H),7.89(t,J=8.1Hz,1H),7.58(d,J=3.6Hz,1H)
실시예 5-7: 3- 시아노 -N-(2,6- 디클로로피리딘 -3-일) 벤즈아미드의 합성
Figure 112012065486624-pat00008
시작물질로 3-시아노벤조일 클로라이드 (1 g, 6.1 mmol)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-1과 동일한 방법으로 목적화합물 1.5 g(5.1 mmol, 83%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 )δ8.41(s,1H),8.29(d,J=10.5Hz,1H),8.18-8.09(m,2H),7.78(t,J=7.8Hz,1H),7.65(dd,J=0.9,7.2Hz,1H)
실시예 5-8: N-(2,6- 디클로로피리딘 -3-일)-4- 플루오로벤즈아미드의 합성
Figure 112012065486624-pat00009
시작물질로 4-플루오로벤조일 클로라이드 (0.04 ml, 0.33 mmol)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-1과 동일한 방법으로 목적화합물 70 mg (0.28 mmol, 94%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.72(d,J=4.5Hz,1H),8.24(s,1H),7.72(d,J=8.0Hz,2H),7.46(d,J=8.1Hz,2H),7.28(d,J=8.0z,1H)
실시예 5-9: 4- 클로로 -N-(2,6- 디클로로피리딘 -3-일) 벤즈아미드의 합성
Figure 112012065486624-pat00010
시작물질로 4-클로로벤조일 클로라이드 (0.04 ml, 0.33 mmol)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-1과 동일한 방법으로 목적화합물 90 mg (0.29 mmol, 99%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.93(d,J=4.7Hz,1H),8.34(s,1H),7.89(d,J=8.3Hz,2H),7.56(d,J=8.3Hz,2H),7.39(d,J=8.6Hz,1H)
실시예 5-10: 4- 브로모 -N-(2,6- 디클로로피리딘 -3-일) 벤즈아미드의 합성
Figure 112012065486624-pat00011
시작물질로 4-브로모벤조일 클로라이드 (739 mg, 3.37 mmol)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-1과 동일한 방법으로 목적화합물 610 mg (1.77 mmol, 56~95%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, MeOD) δ 8.27 (d, J=8.3Hz,1H),7.92-7.89(m,2H),7.76-7.73(m,2H),7.51(d,J=8.4Hz,1H)
실시예 5-11: N-(2,6- 디클로로피리딘 -3-일)-4- 메틸벤즈아미드의 합성
Figure 112012065486624-pat00012
시작물질로 4-메틸벤조일 클로라이드(0.63 ml, 4.7 mmol)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-1과 동일한 방법으로 목적화합물 970 mg(3.6 mmol, 80%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.97(d,J=8.6Hz,1H),8.38(s,1H),7.84(d,J=8.1Hz,2H),7.38(d,J=8.3Hz,3H),2.49(s,3H)
실시예 5-12: N-(2,6- 디클로로피리딘 -3-일)-4- 메톡시벤즈아미드의 합성
Figure 112012065486624-pat00013
시작물질로 4-메톡시벤조일 클로라이드(0.95 ml, 6.7 mmol)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-1과 동일한 방법으로 목적화합물 1.8 g (6.0 mmol, 98%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.96(d,J=8.6Hz,1H),8.33(s,1H),7.94-7.90(m,2H),7.38(d,J=8.5Hz,1H),7.09-7.04(m,2H),3.94(s,3H)
실시예 5-13: N-(2,6- 디클로로피리딘 -3-일)-4- 니트로벤즈아미드의 합성
Figure 112012065486624-pat00014
시작물질로 4-니트로벤조일 클로라이드 (620 mg, 6.7 mmol)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-1과 동일한 방법으로 목적화합물 1.6 g (5.2 mmol, 84%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.93(d,J=8.6Hz,1H),8.45(d,J=8.6Hz,2H),8.41(s,1H),8.13(d,J=8.9Hz,2H),7.43(d,J=8.6Hz,1H)
실시예 5-14: 4- 시아노 -N-(2,6- 디클로로피리딘 -3-일) 벤즈아미드의 합성
Figure 112012065486624-pat00015
시작물질로 4-시아노벤조일 클로라이드 (1.13 ml, 6.8 mmol)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-1과 동일한 방법으로 목적화합물 1.7 g (5.9 mmol, 96%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.92(d,J=8.6Hz,1H),8.38(s,1H),8.05(d,J=8.3Hz,2H),7.90(d,J=8.2Hz,2H),7.42(d,J=8.6Hz,1H)
실시예 5-15: 5- 클로로 -2- 페닐옥사졸로[5,4-b]피리딘의 합성
Figure 112012065486624-pat00016
N-(2,6-디클로로피리딘-3-일)벤즈아미드(58 mg, 0.22 mmol)와 소듐 카보네이트 25 mg을 디메틸포름아미드 2.2 ml에 넣은 뒤, 160℃에서 24시간 동안 환류시켰다. TLC로 반응 종결을 확인하고, 상온에서 식힌 뒤, 감압 농축한 농축액에 소량의 증류수를 넣고 수층을 메틸렌 클로라이드로 추출하였다. 추출한 유기층을 무수 MgSO4로 건조시킨 후, 여과하고 감압 농축하였다. 농축액을 컬럼 크로마토그래피(헥산 : 에틸아세테이트 = 20 : 1)로 분리하여 목적화합물 48 mg (0.21 mmol, 95%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.30(d,J=6.4Hz,2H),8.05(d,J=8.2Hz,1H),7.67-7.57(m,3H),7.43(d,J=8.2Hz,1H)
실시예 5-16: 5- 클로로 -2-(2- 클로로페닐 ) 옥사졸로 [5,4-b]피리딘의 합성
Figure 112012065486624-pat00017
시작물질로 2-클로로-N-(2,6-디클로로피리딘-3-일)벤즈아미드 (600 mg, 2.0 mmol)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-15와 동일한 방법으로 목적화합물 400 mg (1.5 mmol, 75%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.20(d,J=8.6Hz,1H),7.99(d,J=8.2Hz,1H),7.65(d,J=8.1Hz,1H),7.45-7.33(m,3H)
실시예 5-17: 5- 클로로 -2-(3- 플루오로페닐 ) 옥사졸로 [5,4-b]피리딘의 합성
Figure 112012065486624-pat00018
시작물질로 N-(2,6-디클로로피리딘-3-일)-3-플루오로벤즈아미드 (300 mg, 1.0 mmol)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-15와 동일한 방법으로 목적화합물 130 mg (0.52 mmol, 51~80%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.07(d,J=8.1Hz,2H),7.97(d,J=9.1Hz,1H),7.57(q,J=8.0Hz,1H),7.44(d,J=8.2Hz,1H),7.36-7.30(m,1H)
실시예 5-18: 5- 클로로 -2-(3- 클로로페닐 ) 옥사졸로 [5,4-b]피리딘의 합성
Figure 112012065486624-pat00019
시작물질로 3-클로로-N-(2,6-디클로로피리딘-3-일)벤즈아미드 (500 mg, 1.65 mmol)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-15와 동일한 방법으로 목적화합물 275 mg (1.03 mmol, 63%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.29(s,1H),8.50(dd,J=2.9,4.6Hz,1H),8.06(d,J=8.2Hz,1H),7.63-7.51(m,2H),7.45(d,J=8.2Hz,1H)
실시예 5-19: 5- 클로로 -2-m- 톨일옥사졸로[5,4-b]피리딘의 합성
Figure 112012065486624-pat00020
시작물질로 N-(2,6-디클로로피리딘-3-일)-3-메틸벤즈아미드 (200 mg, 0.7 mmol)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-15와 동일한 방법으로 목적화합물 130 mg (0.53 mmol, 76%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.07-7.97(m,3H),7.46-7.32(m,3H), 2.46(s,3H)
실시예 5-20: 5- 클로로 -2-(3- 니트로페닐 ) 옥사졸로 [5,4-b]피리딘의 합성
Figure 112012065486624-pat00021
시작물질로 N-(2,6-디클로로피리딘-3-일)-3-니트로벤즈아미드 (230 mg, 0.74 mmol)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-15와 동일한 방법으로 목적화합물 103 mg (0.37 mmol, 50%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ9.11(s,1H),8.56(d,J=5.4Hz,1H),8.44(d,J=5.1Hz,1H),8.08(d,J=8.4Hz,1H),7.78(t,J=8.1Hz,1H),7.45(d,J=8.4Hz,1H)
실시예 5-21: 3-(5- 클로로옥사졸로[5,4-b]피리딘 -2-일) 벤조니트릴의 합성
Figure 112012065486624-pat00022
시작물질로 3-시아노-N-(2,6-디클로로피리딘-3-일)벤즈아미드 (500 mg, 1.0 mmol)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-15와 동일한 방법으로 목적화합물 165 mg (0.65 mmol, 38%)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ8.55(s,1H),8.47(d,J=5.2Hz,1H),8.06(d,J=8.2Hz,1H),7.87(d,J=5.1Hz,1H),7.70(t,J=7.8Hz,1H),7.44(d,J=8.2Hz,1H)
실시예 5-22: 5- 클로로 -2-(4- 플루오로페닐 ) 옥사졸로 [5,4-b]피리딘의 합성
Figure 112012065486624-pat00023
시작물질로 N-(2,6-디클로로피리딘-3-일)-4-플루오로벤즈아미드 (400 mg, 1.37 mmol)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-15와 동일한 방법으로 목적화합물 250 mg (1.01 mmol, 73%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.32-8.26(m,2H),8.04(d,J=8.2Hz,1H),7.43(d,J=8.2Hz,1H),7.32-7.21(m,2H)
실시예 5-23: 5- 클로로 -2-(4- 클로로페닐 ) 옥사졸로 [5,4-b]피리딘의 합성
Figure 112012065486624-pat00024
시작물질로 4-클로로-N-(2,6-디클로로피리딘-3-일)벤즈아미드 (500 mg, 1.65 mmol)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-15와 동일한 방법으로 목적화합물 255 mg (0.96 mmol, 60%)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ8.51(dd,J=1.8,5.1Hz,2H),8.01(d,J=8.2Hz,1H),7.54(dd,J=1.8,5.2Hz,2H),7.40(d,J=8.2Hz,1H)
실시예 5-24: 2-(4- 브로모페닐 )-5- 클로로옥사졸로[5,4-b]피리딘의 합성
Figure 112012065486624-pat00025
시작물질로 4-브로모-N-(2,6-디클로로피리딘-3-일)벤즈아미드 (600 mg, 1.7 mmol)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-15와 동일한 방법으로 목적화합물 300 mg (0.97 mmol, 57%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.15(d,J=8.6Hz,2H),8.05(d,J=8.2Hz,1H),7.74(d,J=8.6Hz,2H),7.44(d,J=8.2Hz,1H)
실시예 5-25: 5- 클로로 -2-p- 톨일옥사졸로[5,4-b]피리딘의 합성
Figure 112012065486624-pat00026
시작물질로 N-(2,6-디클로로피리딘-3-일)-4-메틸벤즈아미드 (450 mg, 1.6 mmol)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-15와 동일한 방법으로 목적화합물 346 mg (1.4 mmol, 88%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.18(d,J=8.3Hz,2H),8.02(d,J=8.2Hz,1H),7.42-7.37(m,3H),2.50(s,4H)
실시예 5-26: 5- 클로로 -2-(4- 메톡시페닐 ) 옥사졸로 [5,4-b]피리딘의 합성
Figure 112012065486624-pat00027
시작물질로 N-(2,6-디클로로피리딘-3-일)-4-메톡시벤즈아미드 (700 mg, 2.3 mmol)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-15와 동일한 방법으로 목적화합물 434 mg (1.6 mmol, 72%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.23(dd,J=2.0,4.9Hz,2H),7.99(d,J=8.2Hz,1H),7.39(d,J=8.2Hz,1H),7.09(dd,J=2.0,4.9Hz,2H),3.95(s,3H)
실시예 5-27: 5- 클로로 -2-(4- 니트로페닐 ) 옥사졸로 [5,4-b]피리딘의 합성
Figure 112012065486624-pat00028
시작물질로 N-(2,6-디클로로피리딘-3-일)-4-니트로벤즈아미드 (230 mg, 0.7 mmol)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-15와 동일한 방법으로 목적화합물 103 mg (0.4 mmol, 51%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.47(s,4H),8.13(d,J=8.3Hz,1H),7.50(d,J=8.3Hz,1H)
실시예 5-28: 4-(5- 클로로옥사졸로[5,4-b]피리딘 -2-일) 벤조니트릴의 합성
Figure 112012065486624-pat00029
시작물질로 4-시아노-N-(2,6-디클로로피리딘-3-일)벤즈아미드 (500 mg, 1.7 mmol)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-15와 동일한 방법으로 목적화합물 197 mg (0.8 mmol, 45%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.41(d,J=8.3Hz,2H),8.11(d,J=8.3Hz,1H),7.90(d,J=8.3Hz,2H),7.49(d,J=8.3Hz,1H)
실시예 5-29: 5- 클로로 -2- 페닐티아졸로[5,4-b]피리딘의 합성
Figure 112012065486624-pat00030
N-(2,6-디클로로피리딘-3-일)벤즈아미드 (50 mg, 0.2 mmol)과 lawesson’s reagent (117 mg, 0.3 mmol) 을 3 ml의 톨루엔에 넣은 뒤, 110℃에서 5시간 동안 환류시켰다. TLC로 반응의 진행을 확인하고 식힌 뒤, 감압 증류한 농축액에 K2CO3(80 mg, 0.6 mmol)과 디메틸포름아미드 3 ml를 넣고 160℃에서 3시간 동안 환류시켰다. 이후, TLC로 반응 종결을 확인하고 상온에서 식힌 뒤, 소량의 증류수를 넣고 수층을 메틸렌 클로라이드로 추출하였다. 유기층을 무수 Mg2SO4로 건조시킨 후, 여과하고 감압 농축한 농축액을 컬럼 크로마토그래피(헥산 : 에틸아세테이트 = 20 : 1)로 분리하여 목적화합물 22 mg (0.1 mmol, 50~70%)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ8.22(d,J=8.5Hz,1H),8.09-8.07(m,2H),7.55-7.50(m,3H),7.45(d,J=8.5Hz,1H)
실시예 5-30: 2- 페닐 -5-( 피롤리딘 -1-일) 옥사졸로 [5,4-b]피리딘의 합성
Figure 112012065486624-pat00031
5-클로로-2-페닐옥사졸로[5,4-b]피리딘 (200 mg, 0.9 mmol)과 10당량의 피롤리딘을 디메틸포름아미드 1 ml에 넣은 뒤, 135℃에서 4시간 동안 환류시켰다. TLC로 반응 종결을 확인하고, 상온에서 식힌 뒤, 감압증류하여 피롤리딘을 제거하였다. 농축액에 포화 NaHCO3용액을 넣고 수층을 메틸렌 클로라이드로 추출하고 유기층을 무수 Na2SO4로 건조시킨 후, 여과하고 감압 농축하였다. 농축액을 컬럼 크로마토그래피(헥산 : 에틸아세테이트 = 20 : 1)로 분리하여 목적화합물 33 mg (0.1 mmol, 15%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.23-8.20(m,2H),7.82(d,J=8.7Hz,1H),7.53-7.49(m,3H),6.40(d,J=8.7Hz,1H),3.56(t,J=6.7Hz,4H),2.10-2.06(m,4H)
실시예 5-31: 2- 페닐 -5-( 피롤리딘 -1-일)티아졸로[5,4-b]피리딘의 합성
Figure 112012065486624-pat00032
시작물질로 5-클로로-2-페닐티아졸로[5,4-b]피리딘 (100 mg, 0.4 mmol)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 74 mg (0.3 mmol, 65%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.03(d,J=8.9Hz,3H),7.50-7.45(m,3H),6.54(d,J=9.0Hz,1H),3.58(t,J=6.7Hz,4H),2.10-2.05(m,4H)
실시예 5-32: 2-(2- 클로로페닐 )-5-( 피롤리딘 -1-일) 옥사졸로 [5,4-b]피리딘의 합성
Figure 112012065486624-pat00033
시작물질로 5-클로로-2-(2-클로로페닐)옥사졸로[5,4-b]피리딘 (100 mg, 0.4 mmol)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 38 mg (0.13 mmol, 32%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.21-8.16(m,1H),7.91(d,J=8.7Hz,1H),7.60-7.54(m,1H),7.44-7.38(m,2H),6.43(d,J=8.8Hz,1H),3.58(s,4H),2.08(s,4H)
실시예 5-33: 2-(3- 클로로페닐 )-5-( 피롤리딘 -1-일) 옥사졸로 [5,4-b]피리딘의 합성
Figure 112012065486624-pat00034
시작물질로 5-클로로-2-(3-클로로페닐)옥사졸로[5,4-b]피리딘 (100 mg, 0.4 mmol)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 30 mg (0.1 mmol, 26%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.22(s,1H),8.09-8.06(m,1H),7.82(d,J=8.7Hz,1H),7.46-7.44(m,2H),6.42(d,J=8.7Hz,1H),3.57(t,J=6.6Hz,4H),2.11-2.07(m,4H)
실시예 5-34: 2-(4- 플루오로페닐 )-5-( 피롤리딘 -1-일) 옥사졸로 [5,4-b]피리딘의 합성
Figure 112012065486624-pat00035
시작물질로 5-클로로-2-(4-플루오로페닐)옥사졸로[5,4-b]피리딘 (100 mg, 0.4 mmol)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 25 mg (0.1 mmol, 22%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.11(d,J=8.9Hz,2H),7.90(d,J=8.1Hz,1H),7.34-7.32(m,1H),6.67(d,J=8.9Hz,2H),3.44(t,J=6.6Hz,4H),2.12-2.09(m,4H)
실시예 5-35: 2-(4- 클로로페닐 )-5-( 피롤리딘 -1-일) 옥사졸로 [5,4-b]피리딘의 합성
Figure 112012065486624-pat00036
시작물질로 5-클로로-2-(4-클로로페닐)옥사졸로[5,4-b]피리딘 (100 mg, 0.4 mmol)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 40 mg (0.13 mmol, 34%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.16-8.12(m,2H),7.84-7.80(m,1H),7.51-7.47(m,2H),7.30(s,1H),6.44(m,1H),3.57(d,J=4.4Hz,4H),2.09(d,J=4.7Hz,4H)
실시예 5-36: 2-(4- 브로모페닐 )-5-( 피롤리딘 -1-일) 옥사졸로 [5,4-b]피리딘의 합성
Figure 112012065486624-pat00037
시작물질로 2-(4-브로모페닐)-5-클로로옥사졸로[5,4-b]피리딘 (100 mg, 0.4 mmol)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 20 mg (0.06 mmol, 15%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.06(d,J=8.6Hz,2H),7.81(d,J=8.7Hz,1H),7.64(d,J=8.6Hz,2H),6.40(d,J=8.7Hz,1H),3.56(t,J=6.5Hz,4H),2.11-2.06(m,4H)
실시예 5-37: 2- 페닐 -5-(피페리딘-1-일) 옥사졸로 [5,4-b]피리딘의 합성
Figure 112012065486624-pat00038
시작물질로 5-클로로-2-페닐옥사졸로[5,4-b]피리딘 (100 mg, 0.4 mmol)과 10당량의 피페리딘을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 28 mg (0.1 mmol, 26%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.22-8.16(m,2H),7.80(d,J=8.7Hz,1H),7.83-7.47(m,3H),6.70(d,J=8.7Hz,1H),3.63(s,4H),1.68(s,6H)
실시예 5-38: 2- 페닐 -5-(피페리딘-1-일)티아졸로[5,4-b]피리딘의 합성
Figure 112012065486624-pat00039
시작물질로 5-클로로-2-페닐티아졸로[5,4-b]피리딘 (100 mg, 0.4 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 83 mg (0.3 mmol, 73%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.04(d,J=9.2Hz,3H),7.51-7.48(m,3H),6.84(d,J=9.2Hz,1H),3.67(s,4H),1.71(s,6H)
실시예 5-39: 2-(2- 클로로페닐 )-5-(피페리딘-1-일) 옥사졸로 [5,4-b]피리딘의 합성
Figure 112012065486624-pat00040
시작물질로 5-클로로-2-(2-클로로페닐)옥사졸로[5,4-b]피리딘 (100 mg, 0.4 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 21 mg (0.06 mmol, 18%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.19-8.16(m,1H),7.91(d,J=8.9Hz,1H),7.59-7.56(m,1H),7.44-7.41(m,2H),6.73(d,J=8.9Hz,1H),3.67(s,4H),1.72(s,6H)
실시예 5-40: 2-(3- 플루오로페닐 )-5-(피페리딘-1-일) 옥사졸로 [5,4-b]피리딘의 합성
Figure 112012065486624-pat00041
시작물질로 5-클로로-2-(3-플루오로페닐)옥사졸로[5,4-b]피리딘 (100 mg, 0.4 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 23 mg (0.1 mmol, 19%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.00(d,J=7.8Hz,1H),7.90(d,J=8.0Hz,1H),7.84(d,J=8.9Hz,1H),7.53-7.18(m,1H0,7.21(t,J=5.9Hz,1H),6.73(d,J=8.9Hz,1H),3.67(s,4H),1.72(s,6H)
실시예 5-41: 2-(3- 클로로페닐 )-5-(피페리딘-1-일) 옥사졸로 [5,4-b]피리딘의 합성
Figure 112012065486624-pat00042
시작물질로 5-클로로-2-(3-클로로페닐)옥사졸로[5,4-b]피리딘 (100 mg, 0.4 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 67 mg (0.2 mmol, 56%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.22(s,1H),8.09(d,J=6.5Hz,1H),7.84(d,J=8.8Hz,1H),7.47(s,2H),6.72(d,J=8.9Hz,1H),3.67(s,4H),1.72(s,6H)
실시예 5-42: 5-(피페리딘-1-일)-2-m- 톨일옥사졸로[5,4-b]피리딘의 합성
Figure 112012065486624-pat00043
시작물질로 5-클로로-2-m-톨일옥사졸로[5,4-b]피리딘 (100 mg, 0.4 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 61 mg (0.2 mmol, 52%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.07(s,1H),8.02(d,J=7.7Hz,1H),7.41(t,J=7.6Hz,1H),7.32(d,J=7.6Hz,1H),3.66(s,4H),2.47(s,3H),1.72(s,6H)
실시예 5-43: 2-(3- 니트로페닐 )-5-(피페리딘-1-일) 옥사졸로 [5,4-b]피리딘의 합성
Figure 112012065486624-pat00044
시작물질로 5-클로로-2-(3-니트로페닐)옥사졸로[5,4-b]피리딘 (100 mg, 0.4 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 39 mg (0.12 mmol, 30%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ9.06(s,1H),8.51(d,J=7.8Hz,1H),8.35(d,J=5.0Hz,1H),7.87(d,J=8.9Hz,1H),7.71(t,J=8.0Hz,1H),6.75(d,J=8.9Hz,1H),3.70(s,4H),1.73(s,6H)
실시예 5-44: 3-(5-(피페리딘-1-일) 옥사졸로 [5,4-b]피리딘-2-일) 벤조니트릴의 합성
Figure 112012065486624-pat00045
시작물질로 3-(5-클로로옥사졸로[5,4-b]피리딘-2-일)벤조니트릴 (100 mg, 0.4 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 26 mg(0.09 mmol, 22%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.50(s,1H),8.42(d,J=5.3Hz,1H),7.85(d,J=8.9Hz,1H),7.78(d,J=3.56Hz,1H),7.65(t,J=7.9Hz,1H),6.75(d,J=8.9Hz,1H),3.71(s,4H),1.73(s,6H)
실시예 5-45: 2-(4- 플루오로페닐 )-5-(피페리딘-1-일) 옥사졸로 [5,4-b]피리딘의 합성
Figure 112012065486624-pat00046
시작물질로 5-클로로-2-(4-플루오로페닐)옥사졸로[5,4-b]피리딘 (100 mg, 0.4 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 20 mg (0.1 mmol, 11%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.11(d,J=9.1Hz,2H),7.92(d,J=8.2Hz,1H),7.33(t,J=8.1Hz,1H),7.36(d,J=9.1Hz,2H),3.43(s,4H),1.72(s,6H)
실시예 5-46: 2-(4- 클로로페닐 )-5-(피페리딘-1-일) 옥사졸로 [5,4-b]피리딘의 합성
Figure 112012065486624-pat00047
시작물질로 5-클로로-2-(4-클로로페닐)옥사졸로[5,4-b]피리딘 (150 mg, 0.6 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 30 mg (0.1 mmol, 17%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.14(d,J=8.7Hz,2H),7.83(d,J=8.9Hz,1H),7.50(d,J=8.7Hz,2H),6.72(d,J=8.9Hz,1H),3.67(s,4H),1.72(s,6H)
실시예 5-47: 2-(4- 브로모페닐 )-5-(피페리딘-1-일) 옥사졸로 [5,4-b]피리딘의 합성
Figure 112012065486624-pat00048
시작물질로 2-(4-브로모페닐)-5-클로로옥사졸로[5,4-b]피리딘 (150 mg, 0.5 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 40 mg (0.1 mmol, 23%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.11(d,J=9.1Hz,2H),7.92(d,J=8.2Hz,1H),7.33(t,J=8.1Hz,1H),7.35(d,J=9.1Hz,2H),3.43(s,4H),1.72(s,6H)
실시예 5-48: 5-(피페리딘-1-일)-2-p- 톨일옥사졸로[5,4-b]피리딘의 합성
Figure 112012065486624-pat00049
시작물질로 5-클로로-2-p-톨일옥사졸로[5,4-b]피리딘 (100 mg, 0.4 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 30 mg (0.1 mmol, 25%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.11(d,J=8.2Hz,2H),7.83(d,J=8.8Hz,1H),7.34(d,J=8.0Hz,2H),6.70(d,J=8.8Hz,1H),3.66(s,4H),2.46(s,3H),1.72(s,6H)
실시예 5-49: 2-(4- 메톡시페닐 )-5-(피페리딘-1-일) 옥사졸로 [5,4-b]피리딘의 합성
Figure 112012065486624-pat00050
시작물질로 5-클로로-2-(4-메톡시페닐)옥사졸로[5,4-b]피리딘 (100 mg, 0.4 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 20 mg (0.06 mmol, 17%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.15(d,J=9.0Hz,2H),7.80(d,J=8.8Hz,1H),7.04(dd,J=2.8,6.9Hz,2H),6.69(d,J=8.8Hz,1H),3.91(s,3H),3.64(s,4H),1.71(s,6H)
실시예 5-50: 4-(5-(피페리딘-1-일) 옥사졸로 [5,4-b]피리딘-2-일) 벤조니트릴의 합성
Figure 112012065486624-pat00051
시작물질로 4-(5-클로로옥사졸로[5,4-b]피리딘-2-일)벤조니트릴 (100 mg, 0.4 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 18 mg (0.06 mmol, 15%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.30(d,J=8.5Hz,2H),7.83(q,J=8.9Hz,3H),6.75(d,J=8.9Hz,1H),3.70(s,4H),1.73(s,6H)
실시예 5-51: 2-(3- 클로로페닐 )-N- 시클로펜틸옥사졸로[5,4-b]피리딘 -5- 아민의 합성
Figure 112012065486624-pat00052
시작물질로 5-클로로-2-(3-클로로페닐)옥사졸로[5,4-b]피리딘 (100 mg, 0.4 mmol)과 10 당량의 시클로펜틸아민을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 18 mg (0.06 mmol, 15%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.21(s,1H),8.10-8.06(m,1H),7.80(d,J=8.6Hz,1H),7.50-7.45(m,2H),6.44(d,J=8.6Hz,1H),4.75(d,J=6.2Hz,1H),4.25-4.19(m,1H),2.21-2.11(m,2H),1.83-1.68(m,4H),1.58-1.50(m,2H)
실시예 5-52: N- 시클로헥실 -2- 페닐티아졸로[5,4-b]피리딘 -5- 아민의 합성
Figure 112012065486624-pat00053
시작물질로 5-클로로-2-페닐티아졸로[5,4-b]피리딘 (99 mg, 0.4 mmol)과 10당량의 시클로펜틸아민을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 10 mg (0.03 mmol, 9%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.03-7.99(m,3H),7.48(s,3H),6.53(d,J=8.9Hz,1H),4.68(d,J=6.4Hz,1H),3.75(t,J=3.4Hz,1H),2.13(d,J=12.1Hz,2H),1.84-1.80(m,2H),1.73-1.69(m,1H),1.54-1.42(m,2H),1.33-1.22(m,3H)
실시예 5-53: 2-(3- 클로로페닐 )-N- 시클로헥실옥사졸로[5,4-b]피리딘 -5- 아민의 합성
Figure 112012065486624-pat00054
시작물질로 5-클로로-2-(3-클로로페닐)옥사졸로[5,4-b]피리딘 (100 mg, 0.4 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 24 mg (0.07 mmol, 19%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, MeOD) δ 8.07 (s, 1H), 8.03-8.00 (m, 1H0, 7.68 (d, J=8.7Hz,1H),7.54-7.51(m,2H),6.53(d,J=8.7Hz,1H),3.79-7.75(m,1H),2.06(d,J=9.7Hz,2H),1.82(d,J=6.2Hz,2H),1.70(d,J=3.6Hz,1H),1.54-1.40(m,2H),1.33-1.25(m,3H)
실시예 5-54: 5-( 아제판 -1-일)-2- 페닐옥사졸로[5,4-b]피리딘의 합성
Figure 112012065486624-pat00055
시작물질로 5-클로로-2-페닐옥사졸로[5,4-b]피리딘 (97 mg, 0.4 mmol)과 10당량의 헥사메틸렌이민을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 70 mg (0.2 mmol, 57%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.24-8.20(m,2H),7.82(d,J=8.8Hzm1H),7.54-7.50(m,3H),6.54(d,J=8.9Hz,1H),3.74(t,J=5.9Hz,4H),1.88(s,4H),1.63-1.59(m,4H)
실시예 5-55: 5-( 아제판 -1-일)-2- 페닐티아졸로[5,4-b]피리딘의 합성
Figure 112012065486624-pat00056
시작물질로 5-클로로-2-페닐티아졸로[5,4-b]피리딘 (85 mg, 0.35 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 51 mg (0.2 mmol, 47%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.05-8.00(m,3H),7.50-7.48(m,3H),6.68(d,J=9.2Hz,1H),3.75(t,J=5.9Hz,4H),1.87(s,4H),1.63-1.59(m,4H)
실시예 5-56: 5-( 아제판 -1-일)-2-(4- 플루오로페닐 ) 옥사졸로 [5,4-b]피리딘의 합성
Figure 112012065486624-pat00057
시작물질로 5-클로로-2-(4-플루오로페닐)옥사졸로[5,4-b]피리딘 (100 mg, 0.4 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 29 mg (0.1 mmol, 23%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.23-8.18(m,2H),7.80(d,J=8.8Hz,1H),7.20(t,J=8.7Hz,2H),6.54(d,J=8.9Hz,1H0,3.73(t,J=5.9Hz,4H),1.88(s,4H),1.63-1.60(m,4H)
실시예 5-57: N-벤질-2- 페닐옥사졸로[5,4-b]피리딘 -5- 아민의 합성
Figure 112012065486624-pat00058
시작물질로 5-클로로-2-페닐옥사졸로[5,4-b]피리딘 (97 mg, 0.4 mmol)과 10당량의 벤질아민을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 30 mg (0.1 mmol, 25%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.24-8.21(m,2H),7.82(d,J=8.6Hz,1H),7.55-7.51(m,3H),7.46-7.31(m,5H),6.46(d,J=8.6Hz,1H),5.04(s,1H),4.67(d,J=5.7Hz,2H)
실시예 5-58: N-벤질-2- 페닐티아졸로[5,4-b]피리딘 -5- 아민의 합성
Figure 112012065486624-pat00059
시작물질로 5-클로로-2-페닐티아졸로[5,4-b]피리딘 (60 mg, 0.24 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 49 mg (0.2 mmol, 65%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.06-8.00(m,3H),7.54-7.31(m,8H),6.57(d,J=8.9Hz,1H),5.10(s,1H),4.67(d,J=5.7Hz,2H)
실시예 5-59: N-벤질-2-(3- 플루오로페닐 ) 옥사졸로 [5,4-b]피리딘-5- 아민의 합성
Figure 112012065486624-pat00060
시작물질로 5-클로로-2-(3-플루오로페닐)옥사졸로[5,4-b]피리딘 (70 mg, 0.3 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 30 mg (0.1 mmol, 35%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.00(d,J=7.8Hz,1H),7.93-7.88(m,1H),7.82(d,J=8.6Hz,1H),7.54-7.32(m,6H),7.26-7.19(m,1H),6.48(d,J=8.6Hz,1H),5.07(s,1H),4.67(d,J=5.8Hz,2H)
실시예 5-60: N-벤질-2-(3- 클로로페닐 ) 옥사졸로 [5,4-b]피리딘-5- 아민의 합성
Figure 112012065486624-pat00061
시작물질로 5-클로로-2-(3-클로로페닐)옥사졸로[5,4-b]피리딘 (70 mg, 0.3 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 20 mg (0.1 mmol, 23%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.22(s,1H),8.10-8.08(m,1H),7.81(d,J=8.6Hz,1H),7.51-7.34(m,7H),6.48(d,J=8.6Hz,1H),5.08(s,1H),4.67(d,J=5.6Hz,2H)
실시예 5-61: N-벤질-2-(4- 클로로페닐 ) 옥사졸로 [5,4-b]피리딘-5- 아민의 합성
Figure 112012065486624-pat00062
시작물질로 5-클로로-2-(4-클로로페닐)옥사졸로[5,4-b]피리딘 (70 mg, 0.3 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 29 mg (0.09 mmol, 32%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.15(d,J=8.8Hz,2H),7.81(d,J=8.6Hz,1H),7.51(d,J=8.8Hz,2H),7.46-7.30(m,5H),6.47(d,J=8.6Hz,1H),5.06(s,1H0,4.67(d,J=5.7Hz,2H)
실시예 5-62: N-(2- 모르포리노에틸 )-2- 페닐티아졸로[5,4-b]피리딘 -5- 아민의 합성
Figure 112012065486624-pat00063
시작물질로 5-클로로-2-페닐티아졸로[5,4-b]피리딘 (50 mg, 0.2 mmol)과 2-모르포리노에탄아민 3당량을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 31 mg (0.1 mmol, 50%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.05-8.00(m,3H),7.54-7.47(m,3H),6.59(d,J=8.9Hz,1H),5.38(s,1H),3.78(t,J=4.6Hz,4H),3.52(q,J=5.1Hz,2H),2.69(t,J=6.0Hz,2H),2.55(t,J=4.4Hz,4H)
실시예 5-63: N-벤질-N- 메틸 -2- 페닐옥사졸로[5,4-b]피리딘 -5- 아민의 합성
Figure 112012065486624-pat00064
시작물질로 5-클로로-2-페닐옥사졸로[5,4-b]피리딘 (200 mg, 0.9 mmol)과 5당량의 N-벤질메틸아민을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 218 mg (0.7 mmol, 80%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.25-8.21(m,2H),7.85(d,J=8.8Hz,1H),7.54-7.50(m,3H),7.39-7.27(m,5H),6.58(d,J=8.8Hz,1H),4.91(s,2H),3.21(s,3H)
실시예 5-64: N-벤질-N- 메틸 -2- 페닐티아졸로[5,4-b]피리딘 -5- 아민의 합성
Figure 112012065486624-pat00065
시작물질로 5-클로로-2-페닐티아졸로[5,4-b]피리딘 (100 mg, 0.4 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 100 mg (0.3 mmol, 72%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.05(d,J=9.1Hz,3H),7.54-7.47(m,3H),7.40-7.29(m,5H),6.71(d,J=9.1Hz,1H),4.93(s,2H),3.21(s,3H)
실시예 5-65: N-벤질-2-(2- 클로로페닐 )-N- 메틸옥사졸로[5,4-b]피리딘 -5- 아민의 합성
Figure 112012065486624-pat00066
시작물질로 5-클로로-2-(2-클로로페닐)옥사졸로[5,4-b]피리딘 (80 mg, 0.3 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 70 mg (0.2 mmol, 67%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.19-8.16(m,1H),7.92(d,J=8.8Hz,1H),7.60-7.57(m,1H),7.46-7.28(m,7H),6.60(d,J=8.9Hz,1H),4.92(s,2H),3.22(s,3H)
실시예 5-66: N-벤질-2-(3- 플루오로페닐 )-N- 메틸옥사졸로[5,4-b]피리딘 -5- 아민의 합성
Figure 112012065486624-pat00067
시작물질로 5-클로로-2-(3-플루오로페닐)옥사졸로[5,4-b]피리딘 (90 mg, 0.4 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 118 mg (0.4 mmol, 98%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.01(d,J=7.8Hz,1H),7.93(d,J=5.6Hz,1H),7.85(d,J=8.8Hz,1H),7.53-7.46(m,1H),7.40-7.28(m,5H),7.24-7.18(m,1H),6.59(d,J=8.8Hz,1H),4.91(s,2H),3.21(s,3H)
실시예 5-67: N-벤질-2-(3- 클로로페닐 )-N- 메틸옥사졸로[5,4-b]피리딘 -5- 아민의 합성
Figure 112012065486624-pat00068
시작물질로 5-클로로-2-(3-클로로페닐)옥사졸로[5,4-b]피리딘 (80 mg, 0.3 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 57 mg (0.2 mmol, 65%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.24-8.22(m,1H),8.11-8.08(m,1H),7.85(d,J=8.8Hz,1H),7.48-7.46(m,2H),7.40-7.35(m,2H),7.35-7.28(m,4H),6.59(d,J=8.9Hz,1H),4.91(s,2H),3.22(s,3H)
실시예 5-68: N-벤질-2-(4- 클로로페닐 )-N- 메틸옥사졸로[5,4-b]피리딘 -5- 아민의 합성
Figure 112012065486624-pat00069
시작물질로 5-클로로-2-(4-클로로페닐)옥사졸로[5,4-b]피리딘 (100 mg, 0.4 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 121 mg (0.3 mmol, 92%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.15(d,J=8.6Hz,2H),7.83(d,J=8.8Hz,1H),7.50(d,J=8.6Hz,2H),7.40-7.28(m,5H),6.58(d,J=8.8Hz,1H),4.90(s,2H),3.21(s,3H)
실시예 5-69: N-벤질-N- 메틸 -2-p- 톨일옥사졸로[5,4-b]피리딘 -5- 아민의 합성
Figure 112012065486624-pat00070
시작물질로 5-클로로-2-p-톨일옥사졸로[5,4-b]피리딘 (172 mg, 0.7 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 130 mg (0.4 mmol, 60%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.12(d,J=8.2Hz,2H),7.83(d,J=8.7Hz,1H),7.39-7.28(m,7H),6.56(d,J=8.8Hz,1H),4.90(s,2H),3.21(s,3H),2.46(s,3H)
실시예 5-70: N-벤질-2-(4- 메톡시페닐 )-N- 메틸옥사졸로[5,4-b]피리딘 -5- 아민의 합성
Figure 112012065486624-pat00071
시작물질로 5-클로로-2-(4-메톡시페닐)옥사졸로[5,4-b]피리딘 (88 mg, 0.3 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 67 mg (0.2 mmol, 57%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.17(d,J=9.0Hz,2H0,7.81(d,J=8.7Hz,1H),7.37-7.28(m,5H),7.04(d,J=6.9Hz,2H),6.55(d,J=8.8Hz,1H),4.90(s,2H),3.92(s,3H),3.20(s,3H)
실시예 5-71: N-벤질-N- 메틸 -2-(4- 니트로페닐 ) 옥사졸로 [5,4-b]피리딘-5- 아민의 합성
Figure 112012065486624-pat00072
시작물질로 5-클로로-2-(4-니트로페닐)옥사졸로[5,4-b]피리딘 (45 mg, 0.2 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 65 mg (0.2 mmol, 99%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.36(s,4H),7.88(d,J=8.9Hz,1H),7.40-7.26(m,5H),6.63(d,J=8.9Hz,1H),4.92(s,2H),3.24(s,3H)
실시예 5-72: 4-(5-( 벤질(메틸)아미노 ) 옥사졸로 [5,4-b]피리딘-2-일) 벤조니트릴의 합성
Figure 112012065486624-pat00073
시작물질로 4-(5-클로로옥사졸로[5,4-b]피리딘-2-일)벤조니트릴 (63 mg, 0.3 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 61 mg (0.2 mmol, 71%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.30(d,J=8.4Hz,2H0,7.88-7.28(m,3H),7.40-7.28(m,5H),6.62(d,J=8.9Hz,1H),4.92(s,2H),3.23(s,3H)
실시예 5-73: N- 메틸 -2- 페닐옥사졸로[5,4-b]피리딘 -5- 아민의 합성
Figure 112012065486624-pat00074
N-벤질-N-메틸-2-페닐옥사졸로[5,4-b]피리딘-5-아민 (50 mg, 0.16 mmol)과 95% H2SO4 0.25 ml를 넣고 12시간 교반하였다. TLC로 반응 종결을 확인하고 상온에서 식힌 후, 1.25 ml H2O를 적가하였다. 15% NaOH를 사용하여 pH4로 적정하였다. 이때 생성되는 고체를 여과시킨 뒤, 여액을 다시 pH10으로 맞춘 후, 수층을 메틸렌클로라이드로 추출하고 감압 증류하여 목적화합물 25 mg (0.1 mmol, 69%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.24-8.20(m,2H0,7.83(d,J=8.6Hz,1H),7.55-7.51(m,3H),6.46(d,J=8.6Hz,1H0,4.75(s,1H),3.07(d,J=5.1Hz,3H)
실시예 5-74: N- 메틸 -2- 페닐티아졸로[5,4-b]피리딘 -5- 아민의 합성
Figure 112012065486624-pat00075
시작물질로 N-벤질-N-메틸-2-페닐티아졸로[5,4-b]피리딘-5-아민 (70 mg, 0.2 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-73과 동일한 방법으로 목적화합물 47 mg (0.2 mmol, 92%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.05-8.01(m,3H),7.52-7.48(m,3H),6.56(d,J=8.9Hz,1H),4.87(s,1H),3.06(d,J=5.1Hz,3H)
실시예 5-75: 2-(3- 플루오로페닐 )-N- 메틸옥사졸로[5,4-b]피리딘 -5- 아민의 합성
Figure 112012065486624-pat00076
시작물질로 N-벤질-2-(3-플루오로페닐)-N-메틸옥사졸로[5,4-b]피리딘-5-아민 (70 mg, 0.2 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-73과 동일한 방법으로 목적화합물 31 mg (0.1 mmol, 58%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.00(d,J=5.4Hz,1H),7.90(d,J=5.6Hz,1H),7.83(d,J=8.6Hz,1H),7.54-7.47(m,1H),7.25-7.18(m,1H),6.47(d,J=8.6Hz,1H),4.79(s,1H),3.07(d,J=5.1Hz,3H)
실시예 5-76: 2-(3- 클로로페닐 )-N- 메틸옥사졸로[5,4-b]피리딘 -5- 아민의 합성
Figure 112012065486624-pat00077
시작물질로 N-벤질-2-(3-클로로페닐)-N-메틸옥사졸로[5,4-b]피리딘-5-아민 (57 mg, 0.2 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-73과 동일한 방법으로 목적화합물 30 mg (0.1 mmol, 72%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.22(s,1H),8.10-8.07(m,1H),7.82(d,J=8.6Hz,1H),7.50-7.43(m,2H),6.47(d,J=8.6Hz,1H),4.79(s,1H), 3.08(d,J=5.1Hz,3H)
실시예 5-77: 2-(4- 클로로페닐 )-N- 메틸옥사졸로[5,4-b]피리딘 -5- 아민의 합성
Figure 112012065486624-pat00078
시작물질로 N-벤질-2-(4-클로로페닐)-N-메틸옥사졸로[5,4-b]피리딘-5-아민 (70 mg, 0.2 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-73과 동일한 방법으로 목적화합물 43 mg (0.2 mmol, 83%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.13(d,J=8.6Hz,2H),7.80(d,J=8.6Hz,1H),7.50(d,J=8.6Hz,2H),6.45(d,J=8.6Hz,1H),4.78(s,1H),3.06(d,J=5.1Hz,3H)
실시예 5-78: N- 메틸 -2-p- 톨일옥사졸로[5,4-b]피리딘 -5- 아민의 합성
Figure 112012065486624-pat00079
시작물질로 N-벤질-N-메틸-2-p-톨일옥사졸로[5,4-b]피리딘-5-아민 (40 mg, 0.12 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-73과 동일한 방법으로 목적화합물 21 mg (0.09 mmol, 75%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.09(d,J=7.6Hz,2H),7.79(d,J=8.5Hz,1H),7.32(d,J=7.8Hz,2H),6.42(d,J=8.4Hz,1H),3.04(s,3H),2.44(s,3H)
실시예 5-79: 2-(4- 메톡시페닐 )-N- 메틸옥사졸로[5,4-b]피리딘 -5- 아민의 합성
Figure 112012065486624-pat00080
시작물질로 N-벤질-2-(4-메톡시페닐)-N-메틸옥사졸로[5,4-b]피리딘-5-아민 (40 mg, 0.12 mmol)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-73과 동일한 방법으로 목적화합물 18 mg (0.07 mmol, 60%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.14(d,J=9.0Hz,2H),7.77(d,J=8.5Hz,1H),7.03(d,J=9.0Hz,2H),6.42(d,J=8.6Hz,1H),3.90(s,3H),3.04(d,J=5.1Hz,3H)
실시예 5-80: N- 시클로헥실 -2- 페닐옥사졸로[5,6-b]피리딘 -5- 아민의 합성
Figure 112012065486624-pat00081
시작물질로 5-클로로2-페닐옥사졸로[5,4-b]피리딘 (50 mg, 0.2 mmol) 과 10당량의 시클로펜틸아민을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-30과 동일한 방법으로 목적화합물 20 mg (0.07 mmol, 34%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, MeOD) δ 8.12-8.11 (m, 2H), 7.70 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.57-7.53 (m, 3H), 6.54 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 3.79 (s, 1H), 2.08 (d, J = 12.2 Hz, 2H), 1.83 (dd, J = 3.9, 5.7 Hz, 2H), 1.71 (d, J = 13.2 Hz, 1H), 1.52-1.42 (m, 2H), 1.30 (t, J = 12.0 Hz, 3H)
실시예 6: MAO -B의 활성을 저해시키는 물질의 스크리닝
상기 실시예 5에서 제작한 화합물을 대상으로, 상기 화합물들이 MAO-B의 활성을 저해하는지 여부를 실험하였다.
본 실험은 알드리치에서 구매한 휴먼 MAO-B 효소와 Amplex®Red monoamine oxidase assay kit를 이용하여 스탁 용액 준비는 매뉴얼에 따랐다. 상기 키트 안에는 5X reaction buffer, Amplex®red reagent(1mg), HRP(horseradish peroxidase), DMSO, H2O2, p-타이라민(MAO-A,B의 기질), 벤질아민(MAO-B의 기질), 클로길린(MAO-A의 저해제), 파길린(MAO-B의 저해제)가 들어있다. 그 중에서 본 실험에서는 MAO-B 기질로 벤질아민을 사용하였고, MAO-B의 저해제로는 파길린을 사용하였다. 전체 기질로 작용할 용액의 준비과정은 다음과 같이 하였다.
Amplex® red 1mg에 DMSO 200 ul을 넣어 충분히 녹인 200 ul, HRP와 1ml의 1X buffer 을 섞은 100 ul, 벤질아민과 1.2 ml의 dH2O에 녹인 200 ul를 9.5 ml의 1X buffer에 넣어 총 10 ml를 제조하였다. 이 양은 100개의 well에 사용할 수 있다. MAO-B 저해제인 파길린에 1 ml의 dH2O을 섞어 각 well 당 0.5 ul를 넣었다. 합성한 화합물의 농도는 10 uM을 기준으로 먼저 MAO-B의 활성을 확인하였다.
먼저, 준비한 96well에 기준이 되는 Positive, Negative 그리고 Wild type 을 준비하였다. Positive type의 경우 기질과 과산화수소만을 넣어주고, Negative type의 경우엔 기질만을 넣어주었다. 마지막으로 Wild type은 합성한 화합물을 넣지 않고 효소와 기질 그리고 MAO-B의 저해제를 넣어주었따. 그런 다음, 1 mM농도의 합성한 화합물을 2 ul씩 나눠 넣고, 첫번째 줄에는 휴먼 MAO-B 효소만을 넣어줬다. 이때 휴먼MAO-B 효소는 각 well당 0.5 ug씩 1X buffer 100 ul과 함께 넣어줬다. 두 번째 줄에는 휴먼MAO-B 효소에 파길린 저해제제를 0.5 ul씩 함께 넣어줬다. 실험의 오차를 줄이고 정확성을 높이기 위해 한 화합물당 3번씩 실험을 반복 하였다. 30분 뒤, 암실에서 기질로 작용할 용액을 100 ul씩 넣어줬다. Amplex®reagent가 빛에 민감하기 때문에 암실에서 실험을 하였다. 결국, 각 well 당 200 ul의 양이 되도록 하였다. 2~3 시간 뒤, 발색의 정도를 측정하면 첫번째 줄에서 두번째 줄의 데이터 값의 차가 순수하게 MAO-B 효소와 그의 기질과의 반응에 의한 활성이며 합성한 화합물을 추가한 경우는 화합물에 의해 MAO-B가 저해되고 남은 활성(remaining activity)의 값을 구할 수 있게 된다. 이와 같은 방법을 통해 MAO-B 효소 외의 다른 효소의 활성을 제외할 수 있기 때문이다. 실험한 화합물의 농도가 10 uM 일 때 활성 값이 좋은 것을 모아 0.001 uM, 0.01 uM, 0.1 uM, 1 uM, 10 uM 의 농도별로 활성 실험을 통해 농도에 의존하는 IC50 값을 구할 수 있다.
상기 화합물의 MAO-B 활성에 대한 저해 효과를 측정한 결과를 하기 표 1에 기재하였다.
화합물 MAO-B의 남은 활성 정도(%) IC50(μM)
실시예 5-30 2.31 0.41
실시예 5-31 1.7 7.3
실시예 5-32 7.7 111.9
실시예 5-33 14.2 16.3
실시예 5-34 8.4 8.7
실시예 5-35 42.4 -
실시예 5-36 33.5 -
실시예 5-37 3.09 2
실시예 5-38 1.8 8.3
실시예 5-39 0.6 13.2
실시예 5-40 13.8 0.27
실시예 5-41 17 38.4
실시예 5-42 -7.8 -
실시예 5-43 -21.5 -
실시예 5-44 10.1 -
실시예 5-45 26.5 10.1
실시예 5-46 56.0 -
실시예 5-47 28.6 0.096
실시예 5-48 46.2 -
실시예 5-49 15.8 1.52
실시예 5-50 71.2 -
실시예 5-51 37.2 -
실시예 5-52 43 -
실시예 5-53 39.3 -
실시예 5-54 57.5 -
실시예 5-55 -1.8 -
실시예 5-56 61.4 -
실시예 5-57 63.1 -
실시예 5-58 60.8 1.9 × 103
실시예 5-59 51.9 -
실시예 5-60 55.4 -
실시예 5-61 46.4 -
실시예 5-62 42.7 -
실시예 5-63 53.2 5.2 × 104
실시예 5-64 47.8 -
실시예 5-65 84.1 -
실시예 5-66 43 -
실시예 5-67 47.3 68.2
실시예 5-68 24.1 5.08
실시예 5-69 84.1 -
실시예 5-70 52.4 -
실시예 5-71 101.2 -
실시예 5-72 108.8 -
실시예 5-73 51 -
실시예 5-74 27.2 15.7
실시예 5-75 22 9.86
실시예 5-76 4.4 2.99
실시예 5-77 4.14 3.02
실시예 5-78 45.8 -
실시예 5-79 84.5 -
실시예 5-80 11.1 8.72
Selegiline 0.1 9.7

Claims (17)

  1. 다음의 단계를 포함하는 알츠하이머병, 파킨슨병, 바이러스성 퇴행성 뇌질환, 및 해마손상에서 선택된 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 후보 물질의 스크리닝 방법:
    (a) 알츠하이머병, 파킨슨병, 바이러스성 퇴행성 뇌질환, 또는 해마손상을 갖는 동물모델의 해마에서 유래한 반응성 성상세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 분석하고자 하는 시료가 상기 반응성 성상세포 내의 GABA 농도를 감소시키거나 반응성 성상세포로부터의 GABA 방출을 감소시키는지 여부를 측정하는 단계; 상기 분석하고자 하는 시료가 상기 반응성 성상세포 내의 GABA 농도를 감소시키거나 반응성 성상세포로부터의 GABA 방출을 감소시키는 것으로 측정되는 경우에는 상기 시료를 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 후보 물질로 판단한다.

  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
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