JP7285599B2 - Amyotrophic lateral sclerosis therapeutic agent and therapeutic composition - Google Patents
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Description
本発明は、筋萎縮性側索硬化症(Amyotrophic Lateral Sclerosis、ALS)治療剤及びALS治療用組成物に関する。本願は、2016年9月2日に、日本に出願された特願2016-172255号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。 TECHNICAL FIELD The present invention relates to a therapeutic agent for amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and a therapeutic composition for ALS. This application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2016-172255 filed in Japan on September 2, 2016, the content of which is incorporated herein.
ALSは、重篤な筋肉の萎縮と筋力低下をきたす神経変性疾患であり、運動ニューロン病の一種である。ALSでは、運動ニューロン特異的に病変がみられ、発症後の平均生存期間が数年という極めて急速な病態進行を示す。ALSには有効な治療法が存在せず、一刻も早い治療剤の開発が望まれている。ALSは、その大半が孤発性であるが、患者の1割が家族性であり、明確な遺伝要因を有している。 ALS is a neurodegenerative disease that causes severe muscle atrophy and weakness and is a type of motor neuron disease. In ALS, motor neuron-specific lesions are observed, and the disease progresses extremely rapidly with an average survival time of several years after onset. There is no effective treatment for ALS, and the development of a therapeutic agent as soon as possible is desired. Most of ALS is sporadic, but 10% of patients are familial and have a definite genetic factor.
wobblerマウスという突然変異マウスは、成長するとともに前肢や顔面の筋萎縮を示し、やがて後肢の筋萎縮を示すことから、ALSモデルとして使用されてきた(例えば、非特許文献1を参照。)。しかしながら、ALS患者にはwobbler変異は見られないことが知られている。 A mutant mouse called a wobbler mouse has been used as an ALS model because it shows muscle atrophy in the forelimbs and face as it grows, and eventually in the hindlimbs (see, for example, Non-Patent Document 1). However, it is known that wobbler mutations are not found in ALS patients.
また、家族性ALSの主たる原因遺伝子のひとつとしてSOD1が知られており、変異SOD1を導入したトランスジェニックマウス(非特許文献2)が創薬研究に使用されているが、臨床において明確な治療効果を示す薬剤はまだ開発されていない。むしろSOD1-ALSモデルで選別された薬剤が実際のALS患者では有用性を示さないケースが大半であり、現在ではSOD1-ALSモデルと実臨床のかい離から、SOD1-ALSモデルがモデルとして機能していないのではないかと懸念されている。 In addition, SOD1 is known as one of the main causative genes of familial ALS, and transgenic mice introduced with mutant SOD1 (Non-Patent Document 2) have been used for drug discovery research, but clinically clear therapeutic effects have been demonstrated. No drug has yet been developed to show Rather, in the majority of cases, drugs selected in the SOD1-ALS model do not show usefulness in actual ALS patients, and currently the SOD1-ALS model is functioning as a model due to the gap between the SOD1-ALS model and actual clinical practice. It is feared that there will be no
このように、従来は良好なALSモデルが存在しなかった。このことが、ALSの治療剤の開発が進んでいない一因であるといえる。 Thus, there has been no good ALS model in the past. This can be said to be one of the reasons why the development of therapeutic agents for ALS has not progressed.
ALSに限らず、有効な病態モデルが存在しない難病が存在する。これらの難病に対し、疾患iPS細胞研究は近年病態モデルをもたらすものとして大いに期待されている。 In addition to ALS, there are intractable diseases for which there are no effective disease models. For these intractable diseases, disease iPS cell research has been greatly expected in recent years as a pathological model.
本発明は、ALS治療剤及びALS治療用組成物を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide an ALS therapeutic agent and an ALS therapeutic composition.
疾患特異的iPS細胞は、特に神経系においては、患者の生体内で起きていた現象を生体外で再現する唯一の手段であるといっても過言ではない。疾患特異的iPS細胞を用いることにより、既存の培養細胞や病態モデルマウスよりも正確な病態モデルの作製が可能である。特に、中枢神経疾患においては中枢神経疾患特異的iPS細胞から分化させたニューロンを用いることにより、病態メカニズムを明らかにするだけでなく、該ニューロンがより正確な病態モデル・薬効評価モデルとなり、有効な治療薬候補を高精度に選別することが可能となる。 It is no exaggeration to say that disease-specific iPS cells, especially in the nervous system, are the only means for reproducing, in vitro, the phenomena occurring in the patient's body. By using disease-specific iPS cells, it is possible to create more accurate disease models than existing cultured cells or disease model mice. In particular, in the case of central nervous system diseases, the use of neurons differentiated from central nervous system disease-specific iPS cells not only elucidates the pathological mechanism, but also makes the neurons more accurate pathological models and drug efficacy evaluation models. It is possible to select therapeutic drug candidates with high accuracy.
実施例において後述するように、本発明者らは、ALS患者由来のiPS細胞から運動ニューロンを分化誘導し、ALSの病態を反映した運動ニューロンに、後述するALS治療剤を投与することにより、該運動ニューロンのALSの病態が改善することを明らかにした。したがって、後述するALS治療剤によりALSを治療することができる。 As will be described later in Examples, the present inventors differentiated motor neurons from ALS patient-derived iPS cells, and administered an ALS therapeutic agent described later to motor neurons reflecting the pathology of ALS to induce the differentiation. It was clarified that the pathology of ALS in motor neurons was improved. Therefore, ALS can be treated with the ALS therapeutic agent described below.
また、ALS患者の大部分は孤発性であるところ、実施例において後述するように、発明者らは、後述するALS治療剤が、家族性ALSの病態を反映する運動ニューロンだけでなく孤発性ALSの病態を反映する運動ニューロンの双方の病態を改善することを明らかにした。したがって、後述するALS治療剤は、家族性ALS及び孤発性ALSの双方に対する治療効果を有する。 In addition, most of the ALS patients are sporadic, and as will be described later in Examples, the inventors have found that the ALS therapeutic agent, which will be described later, affects not only motor neurons that reflect the pathology of familial ALS, but also sporadic ALS. It was clarified that the pathology of both motor neurons, which reflects the pathology of ALS, was improved. Therefore, the therapeutic agent for ALS described later has a therapeutic effect on both familial ALS and sporadic ALS.
後述するALS治療剤は、患者由来のiPS細胞を用いた病態モデルを用いた解析から見出した表現型を評価項目とし、細胞死に近い後期ではなく、病態表現型が観察されるようになる転換期に表出する病態を指標としてスクリーニングして得られた化合物であることから、ALSの治療効果が高い。 The ALS therapeutic agent described later has a phenotype found from analysis using a pathological model using patient-derived iPS cells as an endpoint, and is not at the late stage near cell death, but at the turning point when the pathological phenotype is observed. Since it is a compound obtained by screening using the pathological condition that appears in ALS as an index, it has a high therapeutic effect on ALS.
本発明は以下の態様を含む。
[1]下記式(1)で表される化合物、その薬学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有する、ALS治療剤。
[2]上記式(1)中、nが2である、[1]に記載のALS治療剤。
[3]上記式(1)中、R1がn-プロピル基である、[1]又は[2]に記載のALS治療剤。
[4]上記式(1)で表される化合物が4-(2-ジ-n-プロピルアミノエチル)-2(3H)-インドールである、[1]~[3]のいずれかに記載のALS治療剤。
[5]上記式(1)で表される化合物の薬学的に許容される塩が4-(2-ジ-n-プロピルアミノエチル)-2(3H)-インドール塩酸塩である、[1]~[4]のいずれかに記載のALS治療剤。
[6]家族性ALS及び孤発性ALSの双方に対する治療効果を有する、[1]~[5]のいずれかに記載のALS治療剤。
[7][1]~[5]のいずれかに記載のALS治療剤及び薬学的に許容される担体を含有する、ALS治療用組成物。
The present invention includes the following aspects.
[1] A therapeutic agent for ALS, containing a compound represented by the following formula (1), a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a solvate thereof as an active ingredient.
[2] The therapeutic agent for ALS according to [1], wherein n is 2 in the above formula (1).
[3] The therapeutic agent for ALS according to [1] or [2], wherein in formula (1), R 1 is an n-propyl group.
[4] The compound according to any one of [1] to [3], wherein the compound represented by formula (1) is 4-(2-di-n-propylaminoethyl)-2(3H)-indole. ALS therapeutic agent.
[5] The pharmaceutically acceptable salt of the compound represented by formula (1) above is 4-(2-di-n-propylaminoethyl)-2(3H)-indole hydrochloride, [1] The therapeutic agent for ALS according to any one of -[4].
[6] The therapeutic agent for ALS according to any one of [1] to [5], which has a therapeutic effect on both familial ALS and sporadic ALS.
[7] A composition for treating ALS, comprising the therapeutic agent for ALS according to any one of [1] to [5] and a pharmaceutically acceptable carrier.
本発明によれば、ALS治療剤及びALS治療用組成物を提供することができる。 INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, an ALS therapeutic agent and an ALS therapeutic composition can be provided.
[ALS治療剤]
1実施形態において、本発明は、下記式(1)で表される化合物、その薬学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有する、ALS治療剤を提供する。
[ALS therapeutic agent]
In one embodiment, the present invention provides a therapeutic agent for ALS containing, as an active ingredient, a compound represented by the following formula (1), a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a solvate thereof.
本実施形態のALS治療剤により治療することができる家族性ALSとしては、FUS遺伝子に変異を有するALS、TAR DNA-binding protein 43kDa(TDP-43)遺伝子に変異を有するALS等が挙げられる。また、実施例において後述するように、本実施形態のALS治療剤は、家族性ALS及び孤発性ALSの双方に対する治療効果を有する。
Examples of familial ALS that can be treated with the therapeutic agent for ALS of this embodiment include ALS with a mutation in the FUS gene, ALS with a mutation in the TAR DNA-binding
本実施形態のALS治療剤において、上記式(1)中、nは1であってもよく、2であってもよく、3であってもよい。 In the ALS therapeutic agent of the present embodiment, n may be 1, 2, or 3 in the above formula (1).
また、上記式(1)中、R1は、炭素数1~6の直鎖状、分岐状若しくは環状のアルキル基であってもよく、より具体的には、メチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、シクロブチル基、n-ペンチル基、シクロペンチル基、n-ヘキシル基、シクロヘキシル基等が挙げられる。 In the above formula (1), R 1 may be a linear, branched or cyclic alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, more specifically, a methyl group, an ethyl group, an n- propyl group, isopropyl group, n-butyl group, isobutyl group, sec-butyl group, tert-butyl group, cyclobutyl group, n-pentyl group, cyclopentyl group, n-hexyl group, cyclohexyl group and the like.
本実施形態のALS治療剤において、上記式(1)で表される化合物は4-[2-(ジプロピルアミノ)エチル]-1,3-ジヒドロ-2H-インドール-2-オンであってもよい。すなわち、上記式(1)で表される化合物はロピニロールであってもよい。ロピニロールの化学式を下記式(2)に示す。
In the ALS therapeutic agent of the present embodiment, the compound represented by the above formula (1) may be 4-[2-(dipropylamino)ethyl]-1,3-dihydro-2H-indol-2-one good. That is, the compound represented by formula (1) above may be ropinirole. The chemical formula of ropinirole is shown in the following formula (2).
ロピニロールは、ドーパミンニューロンへのドーパミンD2受容体アゴニスト活性を有することから、パーキンソン病治療薬として開発されたものである。このため、すでに治験が終了しており、生体に投与した場合の安全性が十分に確認されている。ロピニロールは薬効メカニズムが明らかな既存薬であることから、適応拡大により迅速にALS治療剤を開発することができる。 Ropinirole was developed as a therapeutic agent for Parkinson's disease because it has dopamine D2 receptor agonist activity on dopamine neurons. For this reason, clinical trials have already been completed, and the safety of administration to living bodies has been sufficiently confirmed. Since ropinirole is an existing drug with a clear mechanism of efficacy, it will be possible to rapidly develop an ALS therapeutic agent by expanding its indications.
ALSは運動ニューロンの障害により生じる疾患である。D2受容体を有しない運動ニューロンの変性疾患にD2受容体アゴニストである化合物が治療効果を示すことは驚くべき結果であった。ロピニロールの薬効メカニズムの解析からALSの病態メカニズム及びALSの病態の全容解明への糸口が見出されることも期待できる。 ALS is a disease caused by damage to motor neurons. It was a surprising result that compounds that are D2 receptor agonists show therapeutic effects on degenerative diseases of motor neurons that do not have D2 receptors. It is also expected that the analysis of the drug efficacy mechanism of ropinirole will lead to the discovery of clues to the complete elucidation of the pathological mechanism of ALS and the pathological condition of ALS.
本実施形態のALS治療剤は、上記式(1)で表わされる化合物の塩であってもよく、上記式(1)で表わされる化合物の溶媒和物であってもよく、上記式(1)で表わされる化合物の塩の溶媒和物であってもよい。 The ALS therapeutic agent of the present embodiment may be a salt of the compound represented by the above formula (1), or may be a solvate of the compound represented by the above formula (1). It may be a solvate of a salt of the compound represented by.
塩としては、薬学的に許容される塩であれば特に制限されず、例えば、塩酸塩、硫酸塩、臭化水素酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩;酢酸塩、メシル酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩等の有機酸塩;ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩;マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩;アルミニウム塩、亜鉛塩等の金属塩;アンモニウム塩、テトラメチルアンモニウム塩等のアンモニウム塩;モルホリン、ピペリジン等の有機アミン付加塩;グリシン、フェニルアラニン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸等のアミノ酸付加塩等が挙げられる。 Salts are not particularly limited as long as they are pharmaceutically acceptable salts. Examples include inorganic acid salts such as hydrochlorides, sulfates, hydrobromides, nitrates, and phosphates; , organic acid salts such as succinate, maleate, fumarate, citrate, tartrate; alkali metal salts such as sodium salts and potassium salts; alkaline earth metal salts such as magnesium salts and calcium salts; aluminum metal salts such as salts and zinc salts; ammonium salts such as ammonium salts and tetramethylammonium salts; organic amine addition salts such as morpholine and piperidine; and amino acid addition salts such as glycine, phenylalanine, lysine, aspartic acid and glutamic acid. .
また、上記式(1)で表わされる化合物の溶媒和物、上記式(1)で表わされる化合物の塩の溶媒和物としては、薬学的に許容される溶媒和物であれば特に制限されず、例えば、水和物、有機溶媒和物等が挙げられる。 In addition, the solvate of the compound represented by the above formula (1) and the solvate of the salt of the compound represented by the above formula (1) are not particularly limited as long as they are pharmaceutically acceptable solvates. , for example, hydrates, organic solvates, and the like.
本実施形態のALS治療剤は、4-[2-(ジプロピルアミノ)エチル]-1,3-ジヒドロ-2H-インドール-2-オン塩酸塩、すなわちロピニロール塩酸塩であってもよい。
The ALS therapeutic agent of this embodiment may be 4-[2-(dipropylamino)ethyl]-1,3-dihydro-2H-indol-2-one hydrochloride, ie ropinirole hydrochloride.
[ALS治療用組成物]
1実施形態において、本発明は、上述したALS治療剤及び薬学的に許容される担体を含有する、ALS治療用組成物を提供する。
[ALS treatment composition]
In one embodiment, the present invention provides a composition for treating ALS, comprising the ALS therapeutic agent described above and a pharmaceutically acceptable carrier.
本実施形態のALS治療用組成物は、医薬組成物として製剤化されていてもよく、例えば、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤等の形態で経口的に、あるいは、注射剤、坐剤、皮膚外用剤等の形態で非経口的に投与することができる。皮膚外用剤としては、より具体的には、軟膏剤、貼付剤等の剤型が挙げられる。 The composition for treating ALS of this embodiment may be formulated as a pharmaceutical composition, for example, orally in the form of tablets, capsules, elixirs, microcapsules, etc., or injections, suppositories, etc. It can be administered parenterally in the form of an agent, an external skin preparation, and the like. More specifically, external preparations for skin include dosage forms such as ointments and patches.
薬学的に許容される担体としては、通常医薬組成物の製剤に用いられるものを特に制限なく用いることができる。より具体的には、例えば、ヒプロメロース、デキストリン、マクロゴール400、ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴム等の結合剤;乳糖水和物、D-マンニトール、デンプン、結晶性セルロース、アルギン酸等の賦形剤;水、エタノール、グリセリン等の注射剤用溶剤;ゴム系粘着剤、シリコーン系粘着剤等の粘着剤等が挙げられる。 As the pharmaceutically acceptable carrier, those that are usually used for formulation of pharmaceutical compositions can be used without particular limitation. More specifically, binders such as hypromellose, dextrin, macrogol 400, gelatin, corn starch, gum tragacanth, gum arabic; excipients such as lactose hydrate, D-mannitol, starch, crystalline cellulose, and alginic acid. solvents for injections such as water, ethanol and glycerin; and adhesives such as rubber-based adhesives and silicone-based adhesives.
ALS治療用組成物は添加剤を含んでいてもよい。添加剤としては、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤;ショ糖、乳糖、サッカリン、マルチトール等の甘味剤;ペパーミント、アカモノ油等の香味剤;カルメロースナトリウム、硬化油、軽質無水ケイ酸、ポビドン、グリセリン脂肪酸エステル、ベンジルアルコール、フェノール等の安定剤;リン酸塩、酢酸ナトリウム等の緩衝剤;安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等の溶解補助剤;黄色三二酸化鉄、三二酸化鉄、黒酸化鉄、酸化チタン等の着色剤等が挙げられる。 The composition for treating ALS may contain additives. Additives include lubricants such as calcium stearate and magnesium stearate; sweeteners such as sucrose, lactose, saccharin, and maltitol; flavoring agents such as peppermint and red oil; carmellose sodium, hydrogenated oil, and light anhydrous silicic acid. Stabilizers such as , povidone, glycerin fatty acid ester, benzyl alcohol, phenol; buffers such as phosphate and sodium acetate; solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol; yellow iron sesquioxide, iron sesquioxide, black oxide Coloring agents such as iron and titanium oxide are included.
ALS治療用組成物は、上述したALS治療剤と、上述した薬学的に許容される担体及び添加剤を適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することができる。本実施形態のALS治療用組成物において、ALS治療剤は1種を単独で用いてもよく、2種以上を混合して用いてもよい。 A composition for treating ALS is prepared by appropriately combining the above-described ALS therapeutic agent with the above-described pharmaceutically acceptable carriers and additives and mixing them in a unit dose form generally required for pharmaceutical practice. can be In the composition for treating ALS of the present embodiment, the therapeutic agent for ALS may be used singly or in combination of two or more.
一般的には、ALS治療用組成物の適切な1日あたりの投与量は、治療効果を生む上で有効な最低投与量の有効成分(ALS治療剤)を含む量である。上記の有効な最低投与量は、ALS治療用組成物が含有する有効成分の活性、脂溶性・水溶性を規定する官能基修飾、投与経路、投与時間、使用される特定の有効成分の排出率、治療期間、併用される他の薬物、化合物及び/又は物質、年齢、性別、体重、病気、健康状態及び患者の既往症、及び医術において周知の他の要素を含む様々な要素に依存する。通常、患者に対するALS治療用組成物の投与量は、1日あたり約0.0001~約100mg/kg体重の有効成分を含む量である。ALS治療用組成物は、1日1回又は2~4回程度に分けて投与すればよい。 In general, a suitable daily dose of a composition for treating ALS is that amount containing the lowest dose of active ingredient (ALS treating agent) effective to produce a therapeutic effect. The above effective minimum dosage is the activity of the active ingredient contained in the composition for treating ALS, the functional group modification that defines fat solubility and water solubility, the administration route, the administration time, and the excretion rate of the specific active ingredient used , duration of treatment, other drugs, compounds and/or substances used in combination, age, sex, weight, disease, health condition and medical history of the patient, and other factors well known in the medical arts. Generally, the dosage of the composition for treating ALS to a patient will be from about 0.0001 to about 100 mg/kg body weight of the active ingredient per day. The composition for treating ALS may be administered once a day or divided into 2 to 4 times a day.
特に、ALS治療剤が式(2)で表される化合物である場合においては、ALS治療用組成物の投与量は、1日1回2mgの有効成分を経口投与し、1週間ごとに増量し、1日量16mgの有効成分を超えない範囲で経口投与する量であることが好ましい。 In particular, when the therapeutic agent for ALS is a compound represented by formula (2), the dosage of the composition for treating ALS is to orally administer 2 mg of the active ingredient once a day and increase the dose every week. , preferably in an amount administered orally in a range not exceeding a daily dose of 16 mg of the active ingredient.
[その他の実施形態]
1実施形態において、本発明は、上記式(1)で表される化合物、その薬学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物の有効量を、治療を必要とする患者に投与する工程を含む、ALSの治療方法を提供する。本実施形態の治療方法において、上記式(1)で表される化合物、その薬学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物としては、上述したものと同様のものが挙げられる。
[Other embodiments]
In one embodiment, the present invention provides a step of administering an effective amount of a compound represented by formula (1), a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a solvate thereof to a patient in need of treatment. A method of treating ALS is provided, comprising: In the treatment method of this embodiment, the compound represented by the above formula (1), a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a solvate thereof includes those similar to those described above.
1実施形態において、本発明は、ALSの治療のための上記式(1)で表される化合物、その薬学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物を提供する。本実施形態の治療方法において、上記式(1)で表される化合物、その薬学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物としては、上述したものと同様のものが挙げられる。 In one embodiment, the present invention provides a compound represented by formula (1) above, or a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof, for the treatment of ALS. In the treatment method of this embodiment, the compound represented by the above formula (1), a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a solvate thereof includes those similar to those described above.
1実施形態において、本発明は、ALS治療剤を製造するための上記式(1)で表される化合物、その薬学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物の使用を提供する。本実施形態の治療方法において、上記式(1)で表される化合物、その薬学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物としては、上述したものと同様のものが挙げられる。 In one embodiment, the present invention provides use of a compound represented by the above formula (1), a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a solvate thereof for manufacturing a therapeutic agent for ALS. In the treatment method of this embodiment, the compound represented by the above formula (1), a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a solvate thereof includes those similar to those described above.
次に実験例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。 Next, the present invention will be described in more detail by showing experimental examples, but the present invention is not limited to the following experimental examples.
<I.家族性ALS患者由来のiPS細胞を用いた検討>
[実験例I-1]
(運動ニューロンへの分化)
家族性ALSには、FUS遺伝子の変異が原因であるものと、TDP-43遺伝子の変異が原因であるものが存在することが知られている。
<I. Study using iPS cells derived from familial ALS patients>
[Experimental example I-1]
(Differentiation into motor neurons)
It is known that there are familial ALS caused by mutations in the FUS gene and those caused by mutations in the TDP-43 gene.
そこで、健常者由来のiPS細胞、FUSに変異を有するALS患者由来のiPS細胞、及びTDP-43に変異を有するALS患者由来のiPS細胞を運動ニューロンに分化させた。使用したiPS細胞株は表1の通りであり、いずれも皮膚線維芽細胞に由来するものであった。 Accordingly, iPS cells derived from healthy subjects, iPS cells derived from ALS patients having a mutation in FUS, and iPS cells derived from ALS patients having a mutation in TDP-43 were differentiated into motor neurons. The iPS cell lines used are shown in Table 1, and all were derived from skin fibroblasts.
具体的には、まず、上記の各細胞株を、終濃度3μMのSB431542(CAS番号:301836-41-9)、終濃度3μMのCHIR99021(CAS番号:252917-06-9)、及び終濃度3μMのDorsomorphin(CAS番号:866405-64-3)を含有する培地で5日間培養し、分化促進型多能性幹細胞(DiSC)を誘導した。培地は毎日交換した。以下、分化誘導開始時とは、DiSC誘導の開始時を指すものとする。 Specifically, first, each of the above cell lines was treated with SB431542 (CAS number: 301836-41-9) at a final concentration of 3 μM, CHIR99021 (CAS number: 252917-06-9) at a final concentration of 3 μM, and 3 μM final concentration. of dorsomorphin (CAS number: 866405-64-3) for 5 days to induce differentiation-promoting pluripotent stem cells (DiSC). Medium was changed daily. Hereinafter, the time of initiation of differentiation induction refers to the time of initiation of DiSC induction.
続いて、得られたDiSCを細胞1個ずつに解離させ、低酸素インキュベーター中、表2に示す組成の培地で更に7日間培養した。酸素濃度は5%(v/v)に設定した。培地は2~3日おきに交換した。 Subsequently, the resulting DiSCs were dissociated into individual cells and cultured in a hypoxic incubator in a medium having the composition shown in Table 2 for an additional 7 days. The oxygen concentration was set at 5% (v/v). The medium was changed every 2-3 days.
続いて、低酸素インキュベーター中、表3に示す組成の培地で更に4日間培養した。酸素濃度は5%(v/v)に設定した。培地は2~3日おきに交換した。表3に示す組成の培地で培養4日目に、終濃度5μMとなるようにDAPT(CAS番号:208255-80-5)を培地に添加した。
Subsequently, the cells were cultured in a medium having the composition shown in Table 3 in a hypoxic incubator for another 4 days. The oxygen concentration was set at 5% (v/v). The medium was changed every 2-3 days. On
表3に示す組成の培地で培養14日目に、再度細胞1個ずつに解離させ、表4に示す組成の神経分化誘導培地で更に5~40日間培養した。これにより、運動ニューロンへの分化が誘導された。 After 14 days of culture in the medium having the composition shown in Table 3, the cells were again dissociated individually and cultured in the neuronal differentiation-inducing medium having the composition shown in Table 4 for 5 to 40 days. This induced differentiation into motor neurons.
分化誘導した運動ニューロンを用いて、Neurogenic differentiation 1 (NeuroD1)、SRY-Box 1(SOX1)、Oligodendrocyte Lineage Transcription Factor 2(OLIG2)、LIM Homeobox 3(LHX3)、ISLET1、HB9、Choline acetyltransferase(ChAT)の各遺伝子の発現レベルを検討した。陽性対照として脊髄組織を使用した。その結果、得られた運動ニューロンは、脊髄と近似した遺伝子発現パターンを示していることが確認された。この結果から、iPS細胞を運動ニューロンに分化誘導できたことが確認された。 Using differentiation-induced motor neurons, Neurogenic differentiation 1 (NeuroD1), SRY-Box 1 (SOX1), Oligodendrocyte Lineage Transcription Factor 2 (OLIG2), LIM Homeobox 3 (LHX3), ISLET1, H B9, of Choline acetyltransferase (ChAT) The expression level of each gene was examined. Spinal cord tissue was used as a positive control. As a result, it was confirmed that the obtained motor neurons exhibited a gene expression pattern similar to that of the spinal cord. This result confirmed that iPS cells could be induced to differentiate into motor neurons.
また、分化誘導した運動ニューロンを免疫染色し、Glial Fibrillary Acidic Protein(GFAP)、βIII-チューブリン、HB9、ChATの発現を検討した。その結果、免疫染色の結果からも、iPS細胞を運動ニューロンに分化誘導できたことが確認された。 In addition, differentiation-induced motor neurons were immunostained to examine the expression of Glial Fibrillary Acid Protein (GFAP), βIII-tubulin, HB9, and ChAT. As a result, the results of immunostaining also confirmed that iPS cells could be induced to differentiate into motor neurons.
[実験例I-2]
(神経突起長の解析)
実験例I-1で分化誘導した各運動ニューロンについて、神経突起長の経時変化を測定した。神経突起長の経時測定にはバイオステーションCT(ニコン社)を使用した。図1は、神経突起長の経時変化の測定結果を示すグラフである。縦軸は神経突起長(相対値)を示し、横軸は分化誘導開始からの培養日数を示す。その結果、健常者由来のiPS細胞から分化誘導した運動ニューロンでは神経突起長が継続的に伸びたのに対し、ALS患者由来のiPS細胞から分化誘導した運動ニューロンでは、分化誘導開始から約40日目をピークとして神経突起長が短縮することが明らかとなった。この結果は、分化誘導した運動ニューロンがALSの病態を反映していることを示す。
[Experimental example I-2]
(Analysis of neurite length)
For each motor neuron differentiated in Experimental Example I-1, changes in neurite length over time were measured. Biostation CT (Nikon) was used to measure neurite length over time. FIG. 1 is a graph showing the measurement results of changes in neurite length over time. The vertical axis indicates the neurite length (relative value), and the horizontal axis indicates the number of culture days from the initiation of differentiation induction. As a result, the neurite length of motor neurons induced to differentiate from iPS cells derived from healthy subjects continued to grow, whereas the motor neurons induced to differentiate from iPS cells derived from ALS patients showed about 40 days from the start of differentiation induction. It was clarified that the neurite length shortened with the eye as the peak. This result indicates that differentiation-induced motor neurons reflect the pathology of ALS.
[実験例I-3]
(切断型カスパーゼ3陽性率の解析)
実験例I-1で分化誘導した、分化誘導開始から40日目の各運動ニューロンを、切断型(Cleaved、CV)カスパーゼ3(以下、「CVカスパーゼ3」という場合がある。)に対する抗体を用いて免疫染色し、切断型(Cleaved、CV)カスパーゼ3(以下、「CVカスパーゼ3」という場合がある。)陽性ニューロンの割合を計測した。CVカスパーゼ3陽性ニューロンは、アポトーシスが誘導されたニューロンである。
[Experimental example I-3]
(Analysis of cleaved
Each
図2は、各運動ニューロンにおけるCVカスパーゼ3陽性ニューロンの割合を示すグラフである。図中、「**」は、危険率1%未満で有意差が存在することを示す。その結果、健常者由来のiPS細胞から分化誘導した運動ニューロンと比較して、ALS患者由来のiPS細胞から分化誘導した運動ニューロンでは、CVカスパーゼ3陽性ニューロンの割合が有意に高いことが明らかとなった。この結果は、分化誘導した運動ニューロンがALSの病態を反映していることを更に支持するものである。 FIG. 2 is a graph showing the ratio of CV caspase-3 positive neurons in each motor neuron. In the figure, "**" indicates that there is a significant difference at a risk rate of less than 1%. As a result, compared to motor neurons differentiated from iPS cells derived from healthy subjects, motor neurons differentiated from iPS cells derived from ALS patients had a significantly higher proportion of CV caspase 3-positive neurons. rice field. This result further supports that differentiation-induced motoneurons reflect the pathology of ALS.
[実験例I-4]
(LDH漏出率の解析)
実験例I-1で分化誘導した、分化誘導開始から40日目の各運動ニューロンを用いて、細胞からの乳酸脱水素酵素(LDH)の漏出を測定した。培地へのLDHの漏出量は細胞傷害性の指標となる。LDH漏出率の測定には市販のキット(型式「LDH Cytotoxicity Detection Kit」、タカラバイオ社)を使用した。
[Experimental example I-4]
(Analysis of LDH leakage rate)
Leakage of lactate dehydrogenase (LDH) from cells was measured using each
図3は、各運動ニューロンにおけるLDH漏出率の測定結果(相対値)を示すグラフである。図中、「**」は、危険率1%未満で有意差が存在することを示す。その結果、健常者由来のiPS細胞から分化誘導した運動ニューロンと比較して、ALS患者由来のiPS細胞から分化誘導した運動ニューロンでは、LDH漏出率が有意に高いことが明らかとなった。この結果は、分化誘導した運動ニューロンがALSの病態を反映していることを更に支持するものである。 FIG. 3 is a graph showing the measurement results (relative values) of the LDH leakage rate in each motor neuron. In the figure, "**" indicates that there is a significant difference at a risk rate of less than 1%. As a result, it was revealed that motor neurons differentiated from iPS cells derived from ALS patients had a significantly higher LDH leakage rate than motor neurons differentiated from iPS cells derived from healthy subjects. This result further supports that differentiation-induced motoneurons reflect the pathology of ALS.
[実験例I-5]
(FUSタンパク質の局在の解析)
FUSタンパク質は、核内に局在するRNA結合タンパク質である。これに対し、FUSに変異を有するALS患者では、FUSタンパク質の細胞質内への異所性局在が認められることが知られている。
[Experimental example I-5]
(Analysis of localization of FUS protein)
The FUS protein is an RNA-binding protein localized in the nucleus. In contrast, ALS patients with mutations in FUS are known to exhibit ectopic localization of the FUS protein in the cytoplasm.
そこで、実験例I-1で分化誘導した、分化誘導開始から40日目の各運動ニューロンを免疫染色し、FUSタンパク質の細胞質への局在を検討した。
Therefore, each
図4は、各運動ニューロンにおいて、FUSタンパク質の細胞質への局在が認められたニューロンの割合を測定した結果を示すグラフである。図中、「**」は、危険率1%未満で有意差が存在することを示す。 FIG. 4 is a graph showing the results of measuring the ratio of neurons in which localization of FUS protein to the cytoplasm was observed in each motor neuron. In the figure, "**" indicates that there is a significant difference at a risk rate of less than 1%.
その結果、健常者由来のiPS細胞から分化誘導した運動ニューロンと比較して、FUSに変異を有するALS患者(FUS-ALS)由来のiPS細胞から分化誘導した運動ニューロンでは、FUSタンパク質の細胞質への局在が認められたニューロンの割合が有意に高いことが明らかとなった。 As a result, compared with motor neurons differentiated from iPS cells derived from healthy subjects, motor neurons differentiated from iPS cells derived from ALS patients with FUS mutations (FUS-ALS) showed that the FUS protein was transferred to the cytoplasm. It became clear that the ratio of neurons in which localization was recognized was significantly high.
一方、TDP-43に変異を有するALS患者(TDP-43-ALS)由来のiPS細胞から分化誘導した運動ニューロンでは、FUSタンパク質の細胞質への局在の有意な上昇は認められなかった。 On the other hand, no significant increase in cytoplasmic localization of FUS protein was observed in motor neurons differentiated from iPS cells derived from an ALS patient with a TDP-43 mutation (TDP-43-ALS).
この結果は、分化誘導した運動ニューロンが、FUSに変異を有するALSの病態を反映していることを更に支持するものである。 This result further supports that differentiation-induced motoneurons reflect the pathology of ALS with mutations in FUS.
[実験例I-6]
(リン酸化されたTDP-43タンパク質の封入体の形成)
TDP-43タンパク質は、核内に局在するRNA結合タンパク質である。TDP-43に変異を有するALS患者では、異常にリン酸化されたTDP-43タンパク質の封入体の出現が見られることが知られている。
[Experimental example I-6]
(Formation of inclusion bodies of phosphorylated TDP-43 protein)
The TDP-43 protein is an RNA-binding protein localized in the nucleus. ALS patients with mutations in TDP-43 are known to develop inclusion bodies of abnormally phosphorylated TDP-43 protein.
そこで、実験例I-1で分化誘導した、分化誘導開始から40日目の各運動ニューロンを免疫染色し、リン酸化されたTDP-43タンパク質封入体の形成を検討した。
Therefore, each
図5は、各運動ニューロンにおいて、ニューロン1個あたりのリン酸化TDP-43タンパク質(pTDP-43)の封入体の数を測定した結果を示すグラフである。図中、「**」は、危険率1%未満で有意差が存在することを示す。 FIG. 5 is a graph showing the results of measuring the number of inclusions of phosphorylated TDP-43 protein (pTDP-43) per neuron in each motor neuron. In the figure, "**" indicates that there is a significant difference at a risk rate of less than 1%.
その結果、健常者由来のiPS細胞から分化誘導した運動ニューロンと比較して、TDP-43に変異を有するALS患者(TDP-43-ALS)由来のiPS細胞から分化誘導した運動ニューロンでは、ニューロン1個あたりのリン酸化TDP-43タンパク質の封入体の数が有意に増加していることが明らかとなった。
As a result, compared with motor neurons differentiated from iPS cells derived from healthy subjects, motor neurons differentiated from iPS cells derived from ALS patients with mutations in TDP-43 (TDP-43-ALS) showed that
一方、FUSに変異を有するALS患者(FUS-ALS)由来のiPS細胞から分化誘導した運動ニューロンでは、リン酸化TDP-43タンパク質の封入体の数の有意な増加は認められなかった。 On the other hand, no significant increase in the number of phosphorylated TDP-43 protein inclusion bodies was observed in motor neurons differentiated from iPS cells derived from ALS patients with FUS mutations (FUS-ALS).
この結果は、分化誘導した運動ニューロンが、TDP-43に変異を有するALSの病態を反映していることを更に支持するものである。 This result further supports that differentiation-induced motor neurons reflect the pathology of ALS with mutations in TDP-43.
[実験例I-7]
(ストレス顆粒の解析)
実験例I-1で分化誘導した、分化誘導開始から40日目の各運動ニューロンを用いて、ストレス顆粒の形成を検討した。ストレス顆粒の検出は、ストレス顆粒のマーカーであるG3BPの免疫染色により行った。
[Experimental example I-7]
(Analysis of stress granules)
Formation of stress granules was examined using each
図6は、各運動ニューロンにおける、ニューロン1個あたりのストレス顆粒の数の測定結果を示すグラフである。図中、「**」は、危険率1%未満で有意差が存在することを示す。その結果、健常者由来のiPS細胞から分化誘導した運動ニューロンと比較して、ALS患者由来のiPS細胞から分化誘導した運動ニューロンでは、ニューロン1個あたりのストレス顆粒の数が有意に増加していることが明らかとなった。この結果は、分化誘導した運動ニューロンがALSの病態を反映していることを更に支持するものである。 FIG. 6 is a graph showing the measurement results of the number of stress granules per neuron in each motor neuron. In the figure, "**" indicates that there is a significant difference at a risk rate of less than 1%. As a result, the number of stress granules per neuron was significantly increased in motor neurons differentiated from iPS cells derived from ALS patients, compared with motor neurons differentiated from iPS cells derived from healthy subjects. It became clear. This result further supports that differentiation-induced motoneurons reflect the pathology of ALS.
[実験例I-8]
(ALS治療剤のスクリーニング)
実験例I-1で分化誘導した運動ニューロンを用いて、神経突起長、FUSタンパク質の異所性局在、ストレス顆粒の形成、LDH漏出率、CV-カスパーゼ3陽性率、リン酸化されたTDP-43タンパク質の封入体の形成等を指標として、ALSの表現型を回復させる薬物を、既存薬ライブラリーからスクリーニングした。
[Experimental Example I-8]
(Screening for ALS therapeutic agents)
Using motor neurons differentiated in Experimental Example I-1, neurite length, ectopic localization of FUS protein, formation of stress granules, LDH leakage rate, CV-
スクリーニングの結果、有望なALS治療剤として、ロピニロールが見出された。表5及び6に、ロピニロールの培地への添加による、ALSの表現型の改善率(%)示す。ここで、ロピニロールは、各iPS細胞の分化誘導開始から35~40日目に培地に添加した。なお、分化誘導開始から35~40日目はALSの病態初期の段階に相当すると想定される。 As a result of screening, ropinirole was found as a promising therapeutic agent for ALS. Tables 5 and 6 show the improvement rate (%) of the ALS phenotype by adding ropinirole to the medium. Here, ropinirole was added to the medium 35 to 40 days after initiation of differentiation induction of each iPS cell. It is assumed that 35 to 40 days after the start of differentiation induction corresponds to the initial stage of ALS pathology.
ALSの表現型の改善率(%)は次の計算式(1)によって算出した。
改善率(%)=(A-B)/(A-C)×100 …(1)
[式(1)中、Aはロピニロール非存在下における、ALS患者由来のiPS細胞から分化誘導した運動ニューロンの測定値を表し、Bはロピニロール存在下における、ALS患者由来のiPS細胞から分化誘導した運動ニューロンの測定値を表し、Cはロピニロール非存在下における、健常者由来のiPS細胞から分化誘導した運動ニューロンの測定値を表す。]
The ALS phenotype improvement rate (%) was calculated by the following formula (1).
Improvement rate (%) = (A - B) / (A - C) x 100 (1)
[In the formula (1), A represents the measured value of motor neurons differentiated from ALS patient-derived iPS cells in the absence of ropinirole, and B represents the ALS patient-derived iPS cells in the presence of ropinirole. Measured values of motor neurons are shown, and C represents measured values of motor neurons differentiated from iPS cells derived from healthy subjects in the absence of ropinirole. ]
表5に、FUSに変異を有するALS患者(FUS-ALS)由来のiPS細胞から分化誘導した運動ニューロンの培地に終濃度0.1、1、10μMのロピニロールを添加した結果を示し、表6に、TDP-43に変異を有するALS患者(TDP-43-ALS)由来のiPS細胞から分化誘導した運動ニューロンの培地に終濃度0.1、1、10μMのロピニロールを添加した結果を示す。 Table 5 shows the results of adding ropinirole at a final concentration of 0.1, 1, 10 μM to the medium of motor neurons differentiated from iPS cells derived from ALS patients with FUS mutations (FUS-ALS). Table 6 shows the results. 3 shows the results of adding ropinirole at final concentrations of 0.1, 1, and 10 μM to the medium of motor neurons differentiated from iPS cells derived from an ALS patient with a mutation in TDP-43 (TDP-43-ALS).
表5及び6に示すように、ロピニロールは、FUSに変異を有するALS及びTDP-43に変異を有するALSの双方に対する顕著な改善効果を示すことが明らかとなった。 As shown in Tables 5 and 6, ropinirole was found to show significant improvement effects on both ALS with mutations in FUS and ALS with mutations in TDP-43.
続いて、上記と同様にして、より低濃度のロピニロールを投与した場合の薬効を評価した。表7に、FUSに変異を有するALS患者(FUS-ALS)由来のiPS細胞から分化誘導した運動ニューロンの培地に終濃度0.1、1、10nMのロピニロールを添加した結果を示し、表8に、TDP-43に変異を有するALS患者(TDP-43-ALS)由来のiPS細胞から分化誘導した運動ニューロンの培地に終濃度0.1、1、10nMのロピニロールを添加した結果を示す。 Subsequently, in the same manner as described above, efficacy was evaluated when lower concentrations of ropinirole were administered. Table 7 shows the results of adding ropinirole at a final concentration of 0.1, 1, 10 nM to the medium of motor neurons differentiated from iPS cells derived from ALS patients with FUS mutations (FUS-ALS). Table 8 shows the results. 3 shows the results of adding ropinirole at final concentrations of 0.1, 1, and 10 nM to the medium of motor neurons differentiated from iPS cells derived from an ALS patient with a mutation in TDP-43 (TDP-43-ALS).
表7及び8に示すように、ロピニロールは、終濃度0.1~10nMにおいてもFUSに変異を有するALS及びTDP-43に変異を有するALSの双方に対する改善効果を示し、特に1~10nMにおいてはいずれの項目においても顕著な改善効果を示すことが明らかとなった。 As shown in Tables 7 and 8, ropinirole showed an improvement effect on both ALS with mutations in FUS and ALS with mutations in TDP-43 even at a final concentration of 0.1 to 10 nM, especially at 1 to 10 nM. It was clarified that a remarkable improvement effect was shown in all items.
また、下記表9及び10に、ロピニロールの代わりに既存のALS治療薬であるリルゾール及びエダラボン、以前にALSの臨床試験に用いられた薬剤であるセフトリアキソンを添加した以外は上記と同様の検討を行った結果を示す。各薬剤はそれぞれ終濃度10μMで培地に添加した。 In addition, in Tables 9 and 10 below, the same examination as above was performed except that riluzole and edaravone, which are existing ALS therapeutic agents, and ceftriaxone, a drug previously used in clinical trials for ALS, were added instead of ropinirole. shows the results of Each drug was added to the medium at a final concentration of 10 μM.
表9は、FUSに変異を有するALS患者(FUS-ALS)由来のiPS細胞から分化誘導した運動ニューロンの培地に各薬剤を添加した結果である。また、表10は、TDP-43に変異を有するALS患者(TDP-43-ALS)由来のiPS細胞から分化誘導した運動ニューロンの培地に各薬剤を添加した結果である。 Table 9 shows the results of adding each drug to the medium of motor neurons differentiated from iPS cells derived from ALS patients with FUS mutations (FUS-ALS). Table 10 shows the results of adding each drug to the medium of motor neurons differentiated from iPS cells derived from an ALS patient with a mutation in TDP-43 (TDP-43-ALS).
その結果、ロピニロールは、リルゾール、エダラボン及びセフトリアキソンと比較して、FUSに変異を有するALS及びTDP-43に変異を有するALSの双方に対するより顕著な改善効果を示すことが明らかとなった。 As a result, it was revealed that ropinirole exhibits a more pronounced improving effect on both ALS with mutations in FUS and ALS with mutations in TDP-43 compared to riluzole, edaravone and ceftriaxone.
[実験例I-9]
(ALSの病態後期におけるロピニロールの薬効評価)
ロピニロールの添加時期を各iPS細胞の分化誘導開始から50~62日目に変更した点以外は実験例I-8と同様にして、ロピニロールの薬効を評価した。分化誘導開始から50~62日目はALSの病態後期の段階に相当すると想定される。
[Experimental example I-9]
(Efficacy evaluation of ropinirole in the late stage of ALS)
The efficacy of ropinirole was evaluated in the same manner as in Experimental Example I-8, except that the timing of addition of ropinirole was changed to 50 to 62 days after initiation of induction of differentiation of each iPS cell. It is assumed that 50 to 62 days after the start of differentiation induction corresponds to the late stage of ALS.
具体的には、FUSに変異を有するALS患者(FUS-ALS)由来のiPS細胞から分化誘導した運動ニューロン、及びTDP-43に変異を有するALS患者(TDP-43-ALS)由来のiPS細胞から分化誘導した運動ニューロンの培地にロピニロールを添加し、神経突起長の経時変化を測定した。神経突起長の測定は実験例I-2と同様にして行った。ロピニロールは終濃度1μMで培地に添加した。 Specifically, motor neurons induced to differentiate from iPS cells derived from ALS patients with mutations in FUS (FUS-ALS), and from iPS cells derived from ALS patients with mutations in TDP-43 (TDP-43-ALS) Ropinirole was added to the medium of differentiation-induced motor neurons, and changes in neurite length over time were measured. Neurite length was measured in the same manner as in Experimental Example I-2. Ropinirole was added to the medium at a final concentration of 1 μM.
図14(a)は、各運動ニューロンの神経突起長の経時変化を測定した結果を示すグラフである。図14(a)中、縦軸は神経突起長(相対値)を示し、横軸は分化誘導開始からの培養日数を示し、「+ROPI」はロピニロールを培地に添加した結果であることを示す。また、図14(b)は、図14(a)のグラフの四角で囲んだ部分を拡大したグラフである。また、図14(c)は、分化誘導開始から50日目及び62日目における各運動ニューロンの神経突起長を示すグラフである。図14(c)中、「**」及び「††」は危険率1%未満で有意差が存在することを示し、「+ROPI」はロピニロールを培地に添加した結果であることを示す。 FIG. 14(a) is a graph showing the results of measuring changes over time in the neurite length of each motor neuron. In FIG. 14(a), the vertical axis indicates neurite length (relative value), the horizontal axis indicates the number of culture days from the start of differentiation induction, and "+ROPI" indicates the result of adding ropinirole to the medium. Moreover, FIG.14(b) is the graph which expanded the part enclosed with the square of the graph of Fig.14 (a). Moreover, FIG. 14(c) is a graph showing the neurite length of each motor neuron on the 50th day and the 62nd day from the initiation of differentiation induction. In FIG. 14(c), "**" and "††" indicate that there is a significant difference at a risk rate of less than 1%, and "+ROPI" indicates the result of adding ropinirole to the medium.
その結果、分化誘導開始から50~62日目においても、ロピニロールを添加することにより、神経保護作用(神経突起長の維持)が認められた。この結果は、ALSの病態後期の段階においてもロピニロールがALSの病態の改善効果を有することを示す。 As a result, neuroprotective action (maintenance of neurite length) was observed by addition of ropinirole even 50 to 62 days after initiation of differentiation induction. This result indicates that ropinirole has the effect of improving the pathology of ALS even in the late stages of ALS pathology.
<II.孤発性ALS患者由来のiPS細胞を用いた検討>
[実験例II-1]
(運動ニューロンへの分化)
実験例I-1と同様にして、孤発性ALS(Sporadic-ALS、以下「SALS」という場合がある。)患者由来のiPS細胞を運動ニューロンに分化させた。使用したiPS細胞は、いずれも皮膚線維芽細胞に由来するものであった。使用したiPS細胞が由来する患者の臨床情報を表11に示す。以下、分化させた各運動ニューロンをそれが由来する患者番号で識別する。
<II. Study using iPS cells derived from sporadic ALS patients>
[Experimental Example II-1]
(Differentiation into motor neurons)
In the same manner as in Experimental Example I-1, sporadic-ALS (hereinafter sometimes referred to as "SALS") patient-derived iPS cells were differentiated into motor neurons. All iPS cells used were derived from skin fibroblasts. Table 11 shows the clinical information of the patients from whom the iPS cells used were derived. Hereinafter, each differentiated motor neuron is identified by the patient number from which it originated.
[実験例II-2]
(神経突起長の解析)
実験例II-1で分化誘導した各運動ニューロンについて、実験例I-2と同様にして神経突起長の経時変化を解析した。その結果、分化誘導開始から40~45日において、それまで伸長を続けていた神経突起長が短縮することが明らかとなった。この結果は、分化誘導した運動ニューロンがALSの病態を反映していることを示す。
[Experimental Example II-2]
(Analysis of neurite length)
For each motor neuron induced to differentiate in Experimental Example II-1, changes in neurite length over time were analyzed in the same manner as in Experimental Example I-2. As a result, 40 to 45 days after initiation of differentiation induction, the length of neurites, which had continued to grow until then, was found to be shortened. This result indicates that differentiation-induced motor neurons reflect the pathology of ALS.
[実験例II-3]
(LDH漏出率の解析)
実験例II-1で分化誘導した各運動ニューロンを用いて、細胞からのLDHの漏出率を経時的に測定した。LDH漏出率の測定は実験例I-4と同様にして行った。
[Experimental Example II-3]
(Analysis of LDH leakage rate)
Using each motor neuron induced to differentiate in Experimental Example II-1, the rate of LDH leakage from the cells was measured over time. The LDH leakage rate was measured in the same manner as in Experimental Example I-4.
図7は、各運動ニューロンにおけるLDH漏出率(相対値)の経時変化を示すグラフである。横軸は分化誘導開始からの日数を示す。その結果、孤発性ALS患者由来のiPS細胞から分化誘導した運動ニューロンでは、LDH漏出率が経時的に上昇することが明らかとなった。この結果は、分化誘導した運動ニューロンがALSの病態を反映していることを更に支持するものである。 FIG. 7 is a graph showing changes over time in the LDH leakage rate (relative value) in each motor neuron. The horizontal axis indicates the number of days from the initiation of differentiation induction. As a result, it was revealed that the LDH leakage rate increased over time in motor neurons differentiated from iPS cells derived from sporadic ALS patients. This result further supports that differentiation-induced motoneurons reflect the pathology of ALS.
[実験例II-4]
(CVカスパーゼ3陽性率の解析)
実験例II-1で分化誘導した各運動ニューロンを用いて、実験例I-3と同様にして、CVカスパーゼ3陽性ニューロンの割合を経時的に測定した。
[Experimental Example II-4]
(Analysis of CV caspase 3 positive rate)
Using each motor neuron induced to differentiate in Experimental Example II-1, the ratio of CV caspase-3 positive neurons was measured over time in the same manner as in Experimental Example I-3.
図8は、各運動ニューロンにおけるCVカスパーゼ3陽性ニューロンの割合の経時変化を示すグラフである。横軸は分化誘導開始からの日数を示す。その結果、孤発性ALS患者由来のiPS細胞から分化誘導した運動ニューロンでは、CVカスパーゼ3陽性ニューロンの割合が経時的に上昇することが明らかとなった。この結果は、分化誘導した運動ニューロンがALSの病態を反映していることを更に支持するものである。 FIG. 8 is a graph showing temporal changes in the ratio of CV caspase-3 positive neurons in each motor neuron. The horizontal axis indicates the number of days from the initiation of differentiation induction. As a result, it was revealed that the proportion of CV caspase 3-positive neurons increased over time in motor neurons differentiated from iPS cells derived from sporadic ALS patients. This result further supports that differentiation-induced motoneurons reflect the pathology of ALS.
[実験例II-5]
(ストレス顆粒の解析)
実験例II-1で分化誘導した各運動ニューロンを用いて、実験例I-7と同様にして、ストレス顆粒の形成を経時的に測定した。
[Experimental Example II-5]
(Analysis of stress granules)
Using each motor neuron induced to differentiate in Experimental Example II-1, the formation of stress granules was measured over time in the same manner as in Experimental Example I-7.
図9は、各運動ニューロンにおける、ニューロン1個あたりのストレス顆粒の数の経時変化を示すグラフである。横軸は分化誘導開始からの日数を示す。その結果、孤発性ALS患者由来のiPS細胞から分化誘導した運動ニューロンでは、ストレス顆粒の数が経時的に増加することが明らかとなった。この結果は、分化誘導した運動ニューロンがALSの病態を反映していることを更に支持するものである。 FIG. 9 is a graph showing the time course of the number of stress granules per neuron in each motor neuron. The horizontal axis indicates the number of days from the initiation of differentiation induction. As a result, it was revealed that the number of stress granules increased over time in motor neurons induced to differentiate from iPS cells derived from sporadic ALS patients. This result further supports that differentiation-induced motoneurons reflect the pathology of ALS.
<III.孤発性ALSモデルを用いたロピニロールの薬効評価>
[実験例III-1]
(神経突起長の解析)
実験例II-1と同様にして、孤発性ALS(SALS)患者由来のiPS細胞を運動ニューロンに分化させた後、培地に終濃度1μMのロピニロールを添加した。より詳細には、分化誘導開始から35~40日目の期間、培地に終濃度1μMのロピニロールを添加した。また、対照として、ロピニロールを培地に添加しなかった群を用意した。また、比較のために、健常人由来のiPS細胞を、実験例I-1と同様にして運動ニューロンに分化させた。この運動ニューロンの培地にはロピニロールを添加しなかった。健常人由来のiPS細胞としては、実験例I-1で用いたものと同様のものを用いた。
<III. Efficacy evaluation of ropinirole using sporadic ALS model>
[Experimental Example III-1]
(Analysis of neurite length)
In the same manner as in Experimental Example II-1, iPS cells derived from patients with sporadic ALS (SALS) were differentiated into motor neurons, and then 1 μM ropinirole was added to the culture medium. More specifically, ropinirole was added to the medium at a final concentration of 1 μM for a period of 35 to 40 days after initiation of differentiation induction. Also, as a control, a group in which ropinirole was not added to the medium was prepared. For comparison, iPS cells derived from healthy subjects were differentiated into motor neurons in the same manner as in Experimental Example I-1. No ropinirole was added to the motor neuron medium. As the iPS cells derived from healthy subjects, the same ones as those used in Experimental Example I-1 were used.
続いて、分化誘導開始から40日目の各運動ニューロンについて、実験例I-2と同様にして神経突起長を測定した。
Subsequently, the neurite length of each
図10は、各運動ニューロンの神経突起長の測定結果を示すグラフである。図中、「**」及び「††」は、危険率1%未満で有意差が存在することを示す。その結果、ロピニロールの存在下では、SALS患者由来のiPS細胞から分化誘導した運動ニューロンにおける神経突起長減少が、有意に抑制されることが明らかとなった。 FIG. 10 is a graph showing the measurement results of the neurite length of each motor neuron. In the figure, "**" and "††" indicate that there is a significant difference at a risk rate of less than 1%. As a result, it was found that in the presence of ropinirole, neurite length reduction in motor neurons differentiated from SALS patient-derived iPS cells was significantly suppressed.
この結果は、ロピニロールが、家族性ALSだけでなく、孤発性ALSの治療にも有効であることを示す。 This result indicates that ropinirole is effective in treating sporadic ALS as well as familial ALS.
[実験例III-2]
(CVカスパーゼ3陽性率の解析)
実験例II-1と同様にして、孤発性ALS(SALS)患者由来のiPS細胞を運動ニューロンに分化させた後、培地に終濃度1μMのロピニロールを添加した。より詳細には、分化誘導開始から35~40日目の期間、培地に終濃度1μMのロピニロールを添加した。また、対照として、ロピニロールを培地に添加しなかった群を用意した。また、比較のために、健常人由来のiPS細胞を、実験例I-1と同様にして運動ニューロンに分化させた。この運動ニューロンの培地にはロピニロールを添加しなかった。健常人由来のiPS細胞としては、実験例I-1で用いたものと同様のものを用いた。
[Experimental Example III-2]
(Analysis of CV caspase 3 positive rate)
In the same manner as in Experimental Example II-1, iPS cells derived from sporadic ALS (SALS) patients were differentiated into motor neurons, and then ropinirole was added to the culture medium at a final concentration of 1 μM. More specifically, ropinirole was added to the medium at a final concentration of 1 μM for a period of 35 to 40 days after initiation of differentiation induction. Also, as a control, a group in which ropinirole was not added to the medium was prepared. For comparison, iPS cells derived from healthy subjects were differentiated into motor neurons in the same manner as in Experimental Example I-1. No ropinirole was added to the motor neuron medium. As the iPS cells derived from healthy subjects, the same ones as those used in Experimental Example I-1 were used.
続いて、分化誘導開始から40日目の各運動ニューロンについて、実験例I-3と同様にして、CVカスパーゼ3陽性ニューロンの割合を測定した。
Subsequently, the ratio of CV caspase-3 positive neurons was measured for each
図11は、CVカスパーゼ3陽性ニューロンの割合の測定結果を示すグラフである。図中、「**」及び「††」は、危険率1%未満で有意差が存在することを示す。その結果、ロピニロールの存在下では、SALS患者由来のiPS細胞から分化誘導した運動ニューロンにおけるCVカスパーゼ3陽性ニューロンの割合が有意に低下することが明らかとなった。 FIG. 11 is a graph showing the measurement results of the ratio of CV caspase-3 positive neurons. In the figure, "**" and "††" indicate that there is a significant difference at a risk rate of less than 1%. As a result, it was revealed that in the presence of ropinirole, the ratio of CV caspase-3 positive neurons in motor neurons differentiated from SALS patient-derived iPS cells was significantly reduced.
この結果は、ロピニロールが、家族性ALSだけでなく、孤発性ALSの治療にも有効であることを更に支持するものである。 This result further supports that ropinirole is effective in treating sporadic ALS as well as familial ALS.
[実験例III-3]
(LDH漏出率の解析)
実験例II-1と同様にして、孤発性ALS(SALS)患者由来のiPS細胞を運動ニューロンに分化させた後、培地に終濃度1μMのロピニロールを添加した。より詳細には、分化誘導開始から35~40日目の期間、培地に終濃度1μMのロピニロールを添加した。また、対照として、ロピニロールを培地に添加しなかった群を用意した。また、比較のために、健常人由来のiPS細胞を、実験例I-1と同様にして運動ニューロンに分化させた。この運動ニューロンの培地にはロピニロールを添加しなかった。健常人由来のiPS細胞としては、実験例I-1で用いたものと同様のものを用いた。
[Experimental Example III-3]
(Analysis of LDH leakage rate)
In the same manner as in Experimental Example II-1, iPS cells derived from sporadic ALS (SALS) patients were differentiated into motor neurons, and then ropinirole was added to the culture medium at a final concentration of 1 μM. More specifically, ropinirole was added to the medium at a final concentration of 1 μM for a period of 35 to 40 days after initiation of differentiation induction. Also, as a control, a group in which ropinirole was not added to the medium was prepared. For comparison, iPS cells derived from healthy subjects were differentiated into motor neurons in the same manner as in Experimental Example I-1. No ropinirole was added to the motor neuron medium. As the iPS cells derived from healthy subjects, the same ones as those used in Experimental Example I-1 were used.
続いて、分化誘導開始から40日目の各運動ニューロンについて、実験例I-4と同様にして、LDH漏出率を測定した。
Subsequently, the LDH leakage rate was measured for each
図12は、LDH漏出率の測定結果を示すグラフである。図中、「**」及び「††」は、危険率1%未満で有意差が存在することを示す。その結果、ロピニロールの存在下では、SALS患者由来のiPS細胞から分化誘導した運動ニューロンにおけるLDH漏出率が有意に低下することが明らかとなった。 FIG. 12 is a graph showing the measurement results of the LDH leakage rate. In the figure, "**" and "††" indicate that there is a significant difference at a risk rate of less than 1%. As a result, it was found that in the presence of ropinirole, the LDH leakage rate in motor neurons differentiated from iPS cells derived from SALS patients was significantly reduced.
この結果は、ロピニロールが、家族性ALSだけでなく、孤発性ALSの治療にも有効であることを更に支持するものである。 This result further supports that ropinirole is effective in treating sporadic ALS as well as familial ALS.
[実験例III-4]
(ストレス顆粒の解析)
実験例II-1と同様にして、孤発性ALS(SALS)患者由来のiPS細胞を運動ニューロンに分化させた後、培地に終濃度1μMのロピニロールを添加した。より詳細には、分化誘導開始から35~40日目の期間、培地に終濃度1μMのロピニロールを添加した。また、対照として、ロピニロールを培地に添加しなかった群を用意した。また、比較のために、健常人由来のiPS細胞を、実験例I-1と同様にして運動ニューロンに分化させた。この運動ニューロンの培地にはロピニロールを添加しなかった。健常人由来のiPS細胞としては、実験例I-1で用いたものと同様のものを用いた。
[Experimental Example III-4]
(Analysis of stress granules)
In the same manner as in Experimental Example II-1, iPS cells derived from sporadic ALS (SALS) patients were differentiated into motor neurons, and then ropinirole was added to the culture medium at a final concentration of 1 μM. More specifically, ropinirole was added to the medium at a final concentration of 1 μM for a period of 35 to 40 days after initiation of differentiation induction. Also, as a control, a group in which ropinirole was not added to the medium was prepared. For comparison, iPS cells derived from healthy subjects were differentiated into motor neurons in the same manner as in Experimental Example I-1. No ropinirole was added to the motor neuron medium. As the iPS cells derived from healthy subjects, the same ones as those used in Experimental Example I-1 were used.
続いて、分化誘導開始から40日目の各運動ニューロンについて、実験例I-7と同様にして、ストレス顆粒の数を測定した。
Subsequently, the number of stress granules was measured for each
図13は、ストレス顆粒の数の測定結果を示すグラフである。図中、「**」及び「††」は、危険率1%未満で有意差が存在することを示す。その結果、ロピニロールの存在下では、SALS患者由来のiPS細胞から分化誘導した運動ニューロンにおけるストレス顆粒の数が有意に低下することが明らかとなった。 FIG. 13 is a graph showing the measurement results of the number of stress granules. In the figure, "**" and "††" indicate that there is a significant difference at a risk rate of less than 1%. As a result, it was revealed that in the presence of ropinirole, the number of stress granules in motor neurons induced to differentiate from iPS cells derived from SALS patients was significantly reduced.
この結果は、ロピニロールが、家族性ALSだけでなく、孤発性ALSの治療にも有効であることを更に支持するものである。 This result further supports that ropinirole is effective in treating sporadic ALS as well as familial ALS.
[実験例III-5]
(孤発性ALSモデルを用いたロピニロールの薬効評価)
実験例II-1と同様にして、24症例の孤発性ALS(SALS)患者由来のiPS細胞を運動ニューロンに分化させた後、培地に終濃度1μMのロピニロールを添加した。また、比較のために、ロピニロールを培地に添加しなかった群を用意した。また、対照として、健常人由来のiPS細胞を、実験例I-1と同様にして運動ニューロンに分化させたものを使用した。この運動ニューロンの培地にはロピニロールを添加しなかった。健常人由来のiPS細胞としては、実験例I-1で用いたものと同様のものを用いた。
[Experimental Example III-5]
(Efficacy evaluation of ropinirole using sporadic ALS model)
In the same manner as in Experimental Example II-1, iPS cells derived from 24 cases of sporadic ALS (SALS) patients were differentiated into motor neurons, and then 1 μM ropinirole was added to the culture medium. For comparison, a group was prepared in which ropinirole was not added to the medium. As a control, iPS cells derived from a healthy subject were differentiated into motor neurons in the same manner as in Experimental Example I-1. No ropinirole was added to the motor neuron medium. As the iPS cells derived from healthy subjects, the same ones as those used in Experimental Example I-1 were used.
下記表12に、使用したiPS細胞が由来する患者の臨床情報を示す。以下、分化させた各運動ニューロンをそれが由来する患者番号で識別する。 Table 12 below shows the clinical information of the patients from whom the iPS cells used were derived. Hereinafter, each differentiated motor neuron is identified by the patient number from which it originated.
いずれの運動ニューロンにおいても、ロピニロールの添加期間は5日間とした。ロピニロールの添加開始時期は症例により異なっており、各iPS細胞の分化誘導開始から30~70日目のいずれかであった。 In both motor neurons, the period of ropinirole addition was 5 days. The timing at which addition of ropinirole was started differed depending on the case, and was anywhere from 30 to 70 days after the start of differentiation induction of each iPS cell.
続いて、ロピニロールを添加してから5日目の各運動ニューロンについて、実験例I-3と同様にしてCVカスパーゼ3陽性ニューロンの割合を測定した。
Subsequently, the percentage of CV caspase-3 positive neurons was measured in each motor neuron on
図15は、CVカスパーゼ3陽性ニューロンの割合の測定結果を示すグラフである。図中、「**」及び「††」は、危険率1%未満で有意差が存在することを示し、「+ROPI」はロピニロールを培地に添加した結果であることを示す。その結果、24症例のSALSモデルのうち、CVカスパーゼ3陽性率の増加が確認された症例は22症例であった。また、これらの22症例のうち、ロピニロールの添加によりCVカスパーゼ3陽性率の増加が抑制された症例は16症例であった(SALS症例の72.73%)。 FIG. 15 is a graph showing the measurement results of the ratio of CV caspase-3 positive neurons. In the figure, "**" and "††" indicate that there is a significant difference at a risk rate of less than 1%, and "+ROPI" indicates the result of adding ropinirole to the medium. As a result, of the 24 SALS models, 22 cases confirmed an increase in the CV caspase-3 positive rate. Furthermore, among these 22 cases, the addition of ropinirole suppressed the increase in the CV caspase-3 positive rate in 16 cases (72.73% of SALS cases).
この結果は、ロピニロールが、家族性ALSだけでなく、孤発性ALSの治療にも有効であることを更に支持するものである。 This result further supports that ropinirole is effective in treating sporadic ALS as well as familial ALS.
本発明によれば、ALS治療剤及びALS治療用組成物を提供することができる。本発明のALS治療剤又はALS治療用組成物によって、家族性ALSだけでなく孤発性ALSも治療することができる。また、ALS患者由来iPS細胞から分化させた運動ニューロンに対する、本発明のALS治療剤の薬効メカニズムを解析することにより、ALSの病態メカニズムを解明することができる。
INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, an ALS therapeutic agent and an ALS therapeutic composition can be provided. Not only familial ALS but also sporadic ALS can be treated with the ALS therapeutic agent or ALS therapeutic composition of the present invention. Furthermore, by analyzing the efficacy mechanism of the therapeutic agent for ALS of the present invention on motor neurons differentiated from ALS patient-derived iPS cells, the pathological mechanism of ALS can be elucidated.
Claims (8)
Sporadic ALS and familial ALS having a mutation in the FUS gene and/or the TDP-43 gene, containing the therapeutic agent for human ALS according to any one of claims 1 to 7 and a pharmaceutically acceptable carrier A therapeutic composition against human ALS selected from
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