상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따른 조성물은 유효 성분으로서 진세노시드 Rh2를 조성물 총 건조중량에 대하여 0.02 ~ 90 건조중량% 함유함으로써, 뇌세포 보호 효과, 특히 뇌졸중, 더욱 구체적으로는 뇌허혈성 뇌졸중의 예방 또는 치료 효과를 가짐을 특징으로 한다.
이하, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.
본 발명에 따른 조성물에 유효 성분으로서 함유되는 진세노시드 Rh2는 인삼 을 원료로 하여 제조될 수 있다. 즉, 인삼을 98∼100℃ 에서 가열하여 얻어진 산물 (홍삼)을 물 또는 유기용매 추출한 다음, 얻어진 추출액을 유산균 또는 장내세균으로 생물전환처리함으로써, 진세노시드 Rh2를 얻을 수 있다. 이렇게 얻어진 진세노시드 Rh2 는 20(R)-진세노시드 Rh2, 20(S)-진세노시드 Rh2 또는 이의 혼합물 중 어느 것이어도 된다.
보다 구체적으로는, 하기 공정 (1) 내지 (4)를 포함하는 방법에 의해서 제조될 수 있다:
(1) 인삼 원재료, 특히 수삼으로부터 이물질을 제거하기 위하여, 인삼 원재료를 물로 세척한 다음, 임의적으로 산을 함유한 물로 더 세척하는 공정 (임의적인 공정);
(2) 상기 공정 (1)을 거쳐 수득된 세척된 인삼을, 통상적인 홍삼제조기 내에서 98-100℃에서 1-10시간, 바람직하게는 2-5시간 동안 찐 다음, 수득된 생성물을 약 60℃에서 약 5시간 동안 통상적인 건조기 내에서 건조함으로써 홍삼을 제조하는 공정;
(3) 공정 (2) 에서 수득된 홍삼으로부터 물추출물 또는 유기용매 추출물을 수득하는 공정;
(4) 상기 홍삼 물추출물 또는 유기용매 추출물을 유산균 또는 장내 세균을 이용하여 생물전환하는 공정.
한편, 상기 공정 (1) 은 임의적인 공정이고, (2) 내지 (4) 의 공정은 필수적인 연속제조공정일 수 있다. 또한, 상기 공정 (4) 는 홍삼추출물과 균주를 혼합하 여 배양하지 않을 수 있고, 캡슐화하여 사람의 장내에서 반응이 일어날 수 있도록 제조할 수 있으며, 이 모든 공정은 최종 인삼제품의 형태에 따라 선택적으로 적용할 수 있다.
한편, 상기 공정들을 거치면서, 원재료에 함유된 화합물인 진세노시드 Rb1, 진세노시드 Rb2, 진세노시드 Rc 등이 홍삼제조과정에서 진세노시드 Rg3로 전환되고, 생물전환에 의해 진세노시드 Rg3 등이 유산균 또는 장내 세균을 통하여 생물 전환되어 최종 대사산물인 진세노시드 Rh2로 전환된다. 당업자는 최종산물로서 진세노시드 Rh2가 다량 함유되도록, 상기 공정들을 포함하는 방법에 적당한 변형을 수행할 수 있으며, 상기 공정 이외의 다른 공정 등도 포함할 수 있다. 이러한 당업자에게 자명한 변형 등도 본 발명의 범위내라는 것이 이해될 것이다.
이하, 각 공정에 대해서 구체적으로 설명한다.
상기 공정 (1)에서, 상기한 인삼 원재료는 인삼 및 인삼 가공품 및 부산물 등을 포함하며, 바람직하게는 수삼, 홍삼, 백삼, 미삼, 인삼잎, 인삼 엑기스 및 분말 형태의 인삼을 포함한다. 또한, 상기 공정 (1) 의 세척 공정은 물로만 세척을 수행할 수 있지만, 물 세척 후에 특히 생리학적으로 수용가능한 산을 함유한 수용액으로 세척하여, 인삼 원재료에 부착되어 있는 오염미생물들을 제거할 수 있다. 상기 산 세척에 이용될 수 있는 성분으로는 초산, 구연산, 유산 또는 산미를 갖는 식품 등이 있다.
본 발명에 따르면, 물로만 세척하는 경우에는 약 13 ×103/g의 총균수가 계 수되었지만, 물 세척 후에 산 함유 수용액에 의한 세척을 더 수행한 경우에는 약 총균수 6 ×103/g의 총균수가 계수되어, 산 함유 수용액에 의한 세척은 약 50% 이상의 오염 미생물을 제거할 수 있음이 보여졌다 (계수 방법: 인삼 약 5 g을 정확이 달아 멸균팩 (한국 3M 주식회사)에 넣고 멸균 생리식염수 (9배량)를 넣어 곱게 갈아서, 다시 10배, 100배 희석하고, 이중 1 ㎖를 페트리필름 (petrifilm; 한국쓰리엠사)에 수직으로 접종하고, 상부필름을 기포생기지 않도록 덮은 다음, 누름판을 누르고 30초~60초 경과한 후에, 겔화가 완료되면 약 24-48시간 배양하여, 붉은 색 콜로니를 계수함). 한편, 이에 사용되는 산 함유 수용액으로는 특히 바람직하게는 초산 함유 수용액, 구체적으로는 0.1% 초산 함유 수용액을 이용할 수 있다.
*상기 공정 (2) 를 통해서 홍삼이 제조된다 (시중에 시판되고 있는 인삼 제품은 재배하여 바로 채취한 수삼; 이 수삼을 상온에서 건조시킨 백삼; 상기 수삼을 98 ∼100 ℃에서 가열 처리하여 제조된 홍삼이 있다). 본 발명에서 목적하는 진세노시드 Rh2를 제조하기 위해서는, 수삼으로부터 홍삼을 제조하는 것이 바람직하다.
한편, 인삼 원재료로부터 홍삼을 제조하는 방법에 대해서는 당업계에 통상적으로 알려져 있으며, 예를 들면, 상기 공정 (1)을 거쳐 수득된 세척된 인삼을 통상적인 홍삼제조기로 98-100℃에서 1-10시간, 바람직하게는 2-5시간 동안 찐 다음, 60℃에서 5시간 동안 통상적인 건조기에서 건조함으로써 제조될 수 있지만, 상기 찌는 온도 및 시간, 찐 후의 건조 과정 등에 대해서 당업계의 자명한 변형이 수행 될 수 있다. 이러한 변형도 또한 본 발명의 범위 내이다.
이어서, 공정 (3) 에서는 홍삼으로부터 물추출물 또는 유기 용매 추출물을 수득한다. 예를 들면, 건조상태의 홍삼에 약 1 내지 50배 중량/부피의 물, 유기 용매로서의 알콜, 바람직하게는 에탄올, 특히는 70% 알콜, 또는 물과 알콜의 혼합물로 20 내지 80℃, 바람직하게는 50 내지 60℃의 온도에서 1시간 내지 2일간, 바람직하게는 3시간 추출하고 농축하여, 홍삼으로부터 물추출물 또는 유기 용매 추출물을 수득할 수 있다. 그러나, 추출 용매의 종류, 추출 온도 및 추출 시간에 대해서 특별한 한정이 있는 것은 아니고, 진세노시드 Rh2를 수득가능하게 한다면, 임의로 사용될 수 있다.
상기 공정 (4)는 홍삼 추출물, 특히 물추출물 또는 유기용매 추출물을 장내세균 또는 유산균을 이용하여 생물전환시키는 공정으로서, 생물전환에 사용되는 미생물, 그 미생물을 이용하여 생물전환시키는 조건, 및 생물전환 기간은 생물전환후에 진세노시드 Rh2를 충분한 수율로 얻을 수 있다면, 특별히 한정되지는 않는다. 예를 들면, 공정 (3)에서 제조된 홍삼 물추출물 또는 유기용매 추출물을 6시간 내지 5일, 바람직하게는 24시간 내지 48시간 동안, 20 내지 50℃, 바람직하게는 25 내지 40℃의 배양온도에서, 유산균 또는 장내 세균과 함께 배양하여, 생물전환공정을 수행할 수 있다.
한편, 상기 공정 (4)에 사용될 수 있는 장내 세균은 인삼 사포닌을 대사시켜 생물 전환체인 진세노시드 Rh2를 생성시킬 수 있는 것이면 어느 것이나 가능하며, 바람직하게는 박테리오이드(Bacterioides)속, 푸소박테리움(Fusobacterium)속 장내 세균, 좀더 바람직하게는 박테리오이드 JY-6 (Biol. Pharm. Bull., 23, pp1481-1485, 2000), 푸소박테리움 K-60 (Biol. Pharm. Bull., 23, pp1481-1485, 2000)이 가능하다.
또한, 공정 (4) 의 홍삼 추출물의 생물전환 공정에 사용되는 유산균은 인삼 사포닌을 대사시켜 생물전환체인 진세노시드 Rh2를 생성시킬 수 있는 것이면 어느 것이나 가능하며, 바람직하게는 비피도박테리움(Bifidobacterium)속 유산균, 좀더 바람직하게는 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis), 락토바실러스 락티스(Lactobacillus lactis), 비피도박테리움 H-1 (KCCM-10493), 비피도박테리움 C-13 (경희대 약대 김동현 교수실), 비피도박테리움 C-34 (경희대 약대 김동현 교수실)의 유산균 중에서 선택된 하나 또는 이들의 혼합 균주를 사용할 수 있다.
이중에서, 비피도박테리움 H-1은 진세노시드 Rh2를 다량함유한 홍삼 추출물의 생물전환산물을 수득하기 위해 본 발명자들에 의해 개발된 미생물로서, 상기 비피도박테리움 H-1은 기탁번호 KCCM-10493 (기탁일자: 2003.05.01)로 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms)에 기탁되어 있다.
본 발명에 따른 비피도박테리움 H-1 균주는 그람양성균이고, 간균이며, 혐기성 균주이고, 프룩토오스 6-포스페이트 포스포케토라아제(fructose 6-phosphate phosphoketolase) 양성을 나타내며, 하기와 같은 당 이용성을 갖는다.
종류 |
당이용성 (+,양성;-음성) |
종류 |
당이용성 (+,양성;-음성) |
아미그달린(amygdalin) 아라비노오스(arabinose) 셀로비오스(cellobiose) 덱스티린 에스쿠린(esculin) 프룩토오스 갈락토오스 글루코네이트 글루코오스 글리코겐 이노시톨 이눌린(inulin) 락토오스 |
- + - - +/- + + - + - - +/- + |
말토오스 만니톨(mannitol) 만노오스(mannose) 멜레지토오스(melezitose) 멜리비오스(melibiose) 라피노오스(raffinose) 리보오스 살리신 소르비톨 스타취(starch) 수크로오스 트레할로오스(trehalose) 크실로오스(xylose) |
+ + + - + + +/- + - - + - + |
한편, 상기 비피도박테리움 H-1은 기존의 비피도박테리움과 비교할 때 일반적인 분류학적 특성은 동일하지만, 인삼의 유산균 발효에 이용할 경우, 보다 많은 함량의 진세노시드 Rg3를 진세노시드 Rh2로 전환시켜, 진세노시드 Rh2를 다량 함유하는 생물전환산물을 제공할 수 있다.
상기 제조 공정 (1) 내지 (4) 를 거쳐 얻어낸 본 발명의 인삼 추출물은 (진세노시드 Rh2/(진세노시드 Rg3+Rc+Rd+Rb1+Rb2)의 비율이 0.1 이상이고, 이는 상기 제조공정 (1) 내지 (3)을 거쳐서 얻어낸 홍삼추출물 보다 진세노시드 Rh2 가 10배이상 많이 함유된 것이다.
또한, 상기 제조 공정 (1) 내지 (4) 를 거친 홍삼의 생물전환산물은 그대로 농축하여 사용할 수도 있고, 그를 동결 건조시켜 사용할 수도 있다. 또는, 홍삼의 생물전환산물을 물 또는 유기용매 추출한 추출액을 원심분리한 다음, 상등액을 여과한 후, 여액을 감압 농축하여 생물전환 홍삼추출물 내에 있는 불순물 및 침전물을 제거함과 동시에 농축한 후에 동결건조와 같은 건조공정을 거쳐 농축시킨 형태로 사용할 수도 있다.
상기 생물전환산물의 추출액으로부터 활성 성분으로서 진세노시드 Rh2를 추출하기 위한 적절한 용매로서 물, 메탄올 및 에탄올 등과 같은 저급알콜 용액을 사용할 수 있고, 추출 방법으로는 초임계 추출법과 같은 특수한 추출법을 사용하여 유효성분을 분리할 수도 있으며, 이어서 동결건조법에 의한 건조공정(Drying Process) 및 가공음료나 가공식품을 제조하기 위한 교반과정(Agitation Process) 또는 희석공정(Dilution Process)을 추가로 수행할 수 있다.
또한, 본 발명에 따르면, 상기 공정 (1) 내지 (4) 를 포함하는 제조방법을 통해서 제조된 홍삼의 생물전환산물을 BuOH로 추출한 다음, 농축하고 실리카겔 컬럼 (5 ×50 cm, 용출용매: 클로로포름: 메탄올=20:1)을 수행하여, 진세노시드 Rh2를 단리할 수 있다. 그의 화학적 특성은 다음과 같다:
20(R)-진세노시드 Rh2 : 백색 결정, mp 208-210℃ (dec.) FAB-MS (m/z) 623 [M+1]+.
또한, 이의 13C-NMR 스펙트럼 분석 결과는, 하기 표 1에서 보는 바와 같다:
13C-NMR 스펙트럼에서 단리된 20(S)-진세노시드 Rh2 의 화학적 변위(變位)
탄소 |
화학적 변위 (δ/ppm) |
탄소 |
화학적 변위 (δ/ppm) |
C-1 |
39.12 |
3-Glc1 |
106.92 |
C-2 |
27.05 |
2 |
75.76 |
C-3 |
88.78 |
3 |
78.72 |
C-4 |
39.66 |
4 |
71.65 |
C-5 |
56.35 |
5 |
78.34 |
C-6 |
18.43 |
6 |
63.05 |
C-7 |
35.15 |
|
|
C-8 |
40.00 |
|
|
C-9 |
50.38 |
|
|
C-10 |
36.94 |
|
|
C-11 |
32.02 |
|
|
C-12 |
70.96 |
|
|
C-13 |
49.54 |
|
|
C-14 |
51.69 |
|
|
C-15 |
31.32 |
|
|
C-16 |
26.70 |
|
|
C-17 |
54.77 |
|
|
C-18 |
16.77 |
|
|
C-19 |
15.61 |
|
|
C-20 |
72.94 |
|
|
C-21 |
26.83 |
|
|
C-22 |
35.88 |
|
|
C-23 |
22.97 |
|
|
C-24 |
126.30 |
|
|
C-25 |
130.73 |
|
|
C-26 |
25.78 |
|
|
C-27 |
17.66 |
|
|
C-28 |
28.14 |
|
|
C-29 |
16.34 |
|
|
C-30 |
17.65 |
|
|
상기 진세노시드 Rh2 의 제조 방법에 의해서 얻어지는 진세노시드 Rh2 는 20(R)-진세노시드 Rh2, 20(S)-진세노시드 Rh2 또는 이의 혼합물 중 어느 것이어도 된다.
본 발명에 따르면, 홍삼의 생물전환산물로부터 분리된 진세노시드 Rh2를 단독으로 사용하여 뇌세포 보호 효과, 특히 뇌졸중 치료 또는 예방 효과를 더욱 향상시킬 수 있지만, 홍삼 추출물에 함유되어 있는 약리활성 성분으로서 파낙시트리올, 파낙시돌, 파낙시놀, 진세노시드 Rc, 진세노시드 Rb1, Rb2, 화합물 K, 20(R)-프로토파낙사디올, 20(S)-프로토파낙사디올, 20(S)-진세노시드 Rh1, 20(S)-프로토파낙사트리올로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 사포닌 유도체를 더 함유할 수 있다. 바람직하게는, 홍삼 추출물의 유산균 또는 장내세균에 의한 생물전환산물 (이하, '홍삼 추출물의 생물전환산물'이라 함)의 형태로 사용된다.
한편, 본 발명은 상기 홍삼 추출물의 생물전환산물을 이용하여 다양한 가공 인삼 제품을 제공할 수 있다.
예를 들면, 상기 가공 인삼 (또는, 홍삼) 제품에는 인삼 건조 분말, 엑기스제, 앰플 제제, 차류, 정제 등을 포함한다.
또한, 본 발명은 뇌세포 보호 및 뇌졸중에 대한 예방효과를 나타내는 본 발명에 따른 뇌세포 보호 조성물 및 식품학적으로 허용가능한 식품보조 첨가제를 포함함을 특징으로 하는 건강보조식품을 제공한다. 상기 식품학적으로 허용가능한 식품보조 첨가제에 대해서는 당업계에 통상적으로 알려져 있으며, 상기 건강보조식품의 제조 방법에 대해서도 당업자는 자명하게 인식하고 있다. 또한, 상기 건강보조식품은 예컨대 건강 음료, 젤리, 사탕, 과자 등 다양한 임의의 형태일 수 있다. 본 발명은 이들 형태에 의해서 제한되지 않는다.
진세노시드 Rh2를 유효성분으로서 함유하는 본 발명에 따른 조성물의 뇌졸중 예방 및 치료에 대한 효과는 이미 시험법이 확립되어 있는 중뇌대동맥 폐색 모델을 이용하여 생체내 시험법에서 우고닌 및 그 유도체의 허혈성 뇌졸중을 억제하는 효과로써 확인할 수 있다.
상기 방법은 나일론 필라멘트를 내경동맥 (internal carotid artery)으로 삽입하여 중뇌대동맥을 폐색시킨 후, 120분 후에 다시 필라멘트를 제거함으로써 재관류시키는 방법으로 이 때 시료들을 경구로 투여하여 허혈성 뇌졸중에 대한 효과를 확인하는 것이다.
한편, 진세노시드 Rh2를 유효성분으로서 함유하는 본 발명에 따른 조성물은 당업계에 통상적으로 공지된 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
진세노시드 Rh2를 유효성분으로서 함유하는 본 발명에 따른 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등이 있다.
진세노시드 Rh2를 유효성분으로서 함유하는 본 발명에 따른 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화되어 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물내에 함유되는 진세노시드 Rh2의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 0.1 내지 100㎎/㎏의 양을 일일 1회 내지 수회에 걸쳐 투여할 수 있다. 또한 그 추출물 또는 화합물의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
진세노시드 Rh2를 유효성분으로서 함유하는 본 발명에 따른 조성물은 상기와 같은 제형으로 뇌세포 보호 및 뇌졸중의 예방 및 치료를 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 인삼 추출물 또는 화합물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있다.
본 발명에 따른 조성물내에 함유되는 진세노시드 Rh2 자체는 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.
진세노시드 Rh2를 유효성분으로서 함유하는 본 발명에 따른 조성물은 뇌세포 보호 및 뇌졸중의 예방을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물 또는 화합물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강 식품 조성물은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 식품 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02∼0.1g, 바람직하게는 0.3∼1g의 비율로 가할 수 있다.
본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 것 외에는 액체성분에 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 m1당 일반적으로 약 1 ∼ 20g, 바람직하게는 약 5 ∼ 12g이다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명은 다음의 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명되나, 본 발명이 이에 의해 제한되지는 않는다.
[실시예]
실시예 1. 가공 처리 인삼 추출물의 제조예 (1)
금산인삼시장에서 구입한 5 년근 수삼 1 ㎏을 물로 세척하고 마지막으로 0.1% 함유 초산으로 세척하여 98-100℃에서 증삼기 (KI-HT01; 두성엔지니어링)로 4시간 동안 찌고, 60℃에서 건조기 (KU-DR99; (주)국제기업)로 5시간 건조한다. 이 건조한 홍삼을 70% 알콜로 추출하여 홍삼추출물을 얻었다. 이를 농축하고 물에 현탁하여 BuOH로 추출하고 농축하여 홍삼추출물을 얻었다 (이하 HB라 함).
실시예 2. 가공 처리 인삼(홍삼) 추출물의 제조예 (2)
금산인삼시장에서 구입한 5 년근 수삼 1 ㎏을 물로 세척하고 마지막으로 0.1% 함유 초산으로 세척하여 98-100℃에서 증삼기 (KI-HT01; 두성엔지니어링)로 4시간 동안 찌고, 60℃에서 건조기 (KU-DR99; (주)국제기업)로 5시간 건조한다. 이 건조한 홍삼을 70% 알콜로 추출하여 홍삼추출물을 얻었다. 이 홍삼 추출물을 5%가 되도록 멸균 증류수에 현탁하고 비피도박테리움 H-1 균주(습중량 10그램)를 첨가하여 24시간 넣어 37℃에서 72시간 배양한 후 BuOH로 추출하고 농축하여 가공처리된 인삼 4g을 얻었다 (이하 HM이라 함).
실시예 3. 가공 처리 인삼 추출물의 제조예 (3)
금산인삼시장에서 구입한 5 년근 수삼 1 ㎏을 물로 세척하고 마지막으로 0.1% 함유 초산으로 세척하여 98-100℃에서 증삼기 (KI-HT01; 두성엔지니어링)로 4시간 동안 찌고, 60℃에서 건조기 (KU-DR99; (주)국제기업)로 5시간 건조한다. 이 건조한 홍삼을 70% 알콜로 추출하여 홍삼추출물을 얻었다. 이 홍삼 추출물을 5%가 되도록 멸균 증류수에 현탁하고 장내세균총(사람의 신선한 분변을 트립트산 소이 브로쓰(tryptic soy broth)에 현탁하여 얻은 균체 습중량 10그램)를 첨가하여 24시간 넣어 37℃에서 72시간 배양한 후 BuOH로 추출하고 농축하여 가공처리된 인삼 4g을 얻었다 (이하 HIM이라 함).
실시예 4. 가공처리인삼추출물로부터 진세노시드 Rh2의 생산 제조예 (9)
금산인삼시장에서 구입한 5 년근 수삼 1 ㎏을 물로 세척하고 마지막으로 0.1% 함유 초산으로 세척하여 98-100℃에서 증삼기 (KI-HT01; 두성엔지니어링)로 4시간 동안 찌고, 60℃에서 건조기 (KU-DR99; (주)국제기업)로 5시간 건조한다. 이 건조한 홍삼을 70% 알콜로 추출하여 홍삼추출물을 얻었다. 이 홍삼 추출물을 5%가 되도록 멸균 증류수에 현탁하고 장내세균총(사람의 신선한 분변을 트립트산 소이 브로쓰에 현탁하여 얻은 균체 습중량 10그램)를 첨가하여 24시간 넣어 37℃에서 72시간 배양한 후 BuOH로 추출하고 이를 농축하여 가공처리된 인삼 12g을 얻었고 이를 실리카겔 컬(5 ×50 cm, 용출용매: 클로로포름: 메탄올=20:1)로 용출시켜 0.5g 진세노시드 Rh2를 분리하였다.
비교예 1. 미가공처리 인삼 추출물의 제조
금산인삼시장에서 구입한 5 년근 수삼 20g을 세절하여 5배 분량의 물을 넣고 60℃에서 5시간 추출하고 이를 농축기(Eyella, KN-IN Evaporator, 일본)로 감압농축하고 동결건조기(삼원냉열 SFDSM24L 모델, 한국)로 건조하여 미가공 처리 백삼 건조 분말 1g을 얻었다.
실시예 5. 함량분석 실험
상기 비교예 1의 미가공 처리 수삼 (비교예1) 과 실시예 1, 2 및 3 처리 인삼 분말을 각 2g씩 취하여 메탄올 100㎖씩 3회 추출하였다. 이 추출물을 감압 농축시킨 후에 이에 물 1OO㎖를 넣어 현탁시키고, 에테르 100㎖씩으로 3회 추출하고 감압 농축시켰다. 이어서 부탄올 100㎖씩으로 3회 추출하고 감압 농축시킨 후에 수득된 농축물을 메탄올 1OO㎖에 용해시켜 사포닌 분획 100㎎을 얻고 이를 TLC(전개용매: CHCl3:MeOH:H2O = 65:35:10, 발색시약: 5% 황산 메탄올 용액, 탐지기(Detector): 시마쯔사(Shimadzu) TLC Scanner CS-9301PC)로 분석하여 표 2와 같은 사포닌 함량 분석결과를 얻었다.
성 분 |
사포닌 분획 중의 함량 (%) |
비교예 1 |
실시예 1 |
실시예 2 |
실시예 3 |
진세노시드 Rb1 |
13.4 |
5.1 |
2.7 |
2.3 |
진세노시드 Rb2 |
8.9 |
3.5 |
2.1 |
1.9 |
진세노시드 Rc |
9.2 |
1.2 |
2.5 |
2.0 |
진세노시드 Rd |
3.3 |
1.1 |
2.1 |
1.2 |
진세노시드 Rg3 |
<1 |
6.8 |
2.5 |
2.3 |
Δ20-진세노시드 Rg3 |
<1 |
2.5 |
1.2 |
<1 |
compound K |
<1 |
<1 |
2.6 |
2.8 |
진세노시드 Rh2 |
<1 |
<1 |
3.2 |
3.9 |
프로토파낙사디올 |
<1 |
<1 |
<1 |
<1 |
실험 결과, 인삼를 쪘을 때 진세노시드 Rg3 성분함량이 급격하게 증가하고, 이 인삼를 유산균으로 처리하였을 때 찐인삼 (홍삼) 중의 진세노시드 Rg3 가 대사된 진세노시드 Rh2의 성분함량이 급격하게 증가함을 확인할 수 있었다.
실험예 1: 뇌세포 보호 및 뇌졸중에 대한 효과 실험
본 발명의 가공 처리된 인삼 추출물 및 이로부터 분리된 화합물들의 뇌세포 보호 및 뇌졸증에 대한 치료 효과를 비교예 1의 미가공 처리 백삼 건조 분말, 비교예 2의 산처리 백삼 건조 분말들의 약리 효과와 상호 비교하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
랫트 (바이오제노믹스, 한국)를 이용한 뇌허혈 동물 모델에 재관류를 시작하기 약 5 분전에 1, 3, 10, 50 ㎎/㎏으로 투여하고 재관류시킨 후, 최초 수술 후 약 24시간 후에 동물을 치사시켜 뇌를 적출하고, 뇌 매트릭스(brain matrix)를 이용하여 2 mm 두께로 뇌절편(brain slice)을 만든 다음, 2, 3, 5-트리페닐테트라졸리눔 클로리드 (TTC) 염색법을 이용하여 염색한 다음, 뇌경색 부위를 영상분석 시스템을 이용하여 분석하였다. 그 결과는 하기 도 1에 나타낸 바와 같이, 실시예 2 및 3에서 제조된 홍삼 추출물의 생물전환산물, 및 실시예 4에서 수득된 진세노시드 Rh2 는 유의성있는 뇌세포 보호활성을 나타내었다. 진세노시드 Rh2 가 뇌세포 보호활성이 있다는 것은 선행기술에서 전혀 보고된바 없다. 한편, 도 1에서, Cont 은 대조군 (비히클 투여군), GB는 비교예 1, HB는 실시예 1, HM은 실시예 2, HIM은 실시예 3, 진세노시드 Rh2는 실시예 4의 시료를 나타내고, *는 대조군과 비교시 95% 유의수준에서 유의성이 있음을 의미한다.
이상과 같은 결과를 종합하여 볼 때, 인삼를 쪄서 유산균 또는 장내세균을 처리를 시키면 뇌세포 보호, 특히 뇌졸중에 예방 및 치료효과가 증강된 약효를 나타내므로 보다 우수한 품질의 인삼함유 의약품이나 건강보조식품을 제조하는데 효과적일 수 있다는 것이 확인되었다.
하기에 상기 약학조성물의 제제예를 설명하나, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1. 산제의 제조
약전 제제총칙중 산제의 제조방법에 따라 1 포당 하기의 성분 함량으로 제조한다.
실시예 3 의 건조분말 ㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍ 50 ㎎
유당 ㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍ100 ㎎
탈크 ㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍ ㆍ10 ㎎
제제예 2. 정제의 제조
약전 제제총칙중 정제의 제조방법에 따라 1정 당 하기의 성분 함량으로 제조한다.
실시예 3 의 건조분말 ㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍ50 ㎎
옥수수전분 ㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍ 100 ㎎
유당 ㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍ 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 ㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍ ㆍ 2 ㎎
제제예 3. 캅셀제의 제조
약전 제제총칙중 캅셀제의 제조방법에 따라 1 캅셀당 하기의 성분 함량으로 제조한다.
실시예 3 의 건조분말ㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍ 50 ㎎
옥수수전분ㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍ 100 ㎎
유당 ㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍ 100 ㎎
스테아린산 마그네슘ㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍ 2 ㎎
제제예 4. 주사제의 제조
약전 제제총칙중 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 하기의 성분 함량으로 제조한다.
실시예 3 의 건조분말 ㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍ 50 ㎎
주사용 멸균 증류수 ㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍ 적량
pH 조절제 ㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍ 적량
제제예 5. 액제의 제조
약전 제제총칙중 액제의 제조방법에 따라 액제 100㎖당 하기의 성분 함량으로 제조한다.
실시예 3 의 건조분말 ㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍ 50 ㎎
이성화당ㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍ 10 g
만니톨 ㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍ 5 g
정제수 ㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍㆍ 적량
또한 하기와 같은 방법으로 건강음료를 제조한다.
실시예 3 의 건조분말 0.1∼80%, 설탕 5~10%, 구연산 0.05~0.3%, 캬라멜 0.005~0.02%, 비타민C 0.1~1%의 첨가물을 혼합하고 여기에 79~94%의 정제수를 섞어서 시럽을 만들고, 상기 시럽을 85~98℃에서 20~180초간 살균하여 냉각수와 1 : 4의 비율로 혼합한 다음 탄산가스를 0.5~0.82%를 주입하여서 되는 진세노시드 Rh2 함량이 높은 홍삼 추출물의 생물전환산물을 함유하는 탄산음료를 제조하였다.
액상과당 (0.5%), 올리고당 (2%), 설탕 (2%), 식염 (0.5%), 물 (75%)와 같은 부재료와 실시예 3 의 건조분말을 균질하게 배합하여 순간살균을 한 후 이를 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 건강음료를 제조하였다.
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용 용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.