KR101340079B1 - Biotransformation of ppt-type ginsenoside using terrabacter sp.-derived b-glucosidase - Google Patents

Biotransformation of ppt-type ginsenoside using terrabacter sp.-derived b-glucosidase Download PDF

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Abstract

The present invention relates to a manufacturing method, in manufacturing a deglycosylated protopanaxatriol(PPT) type second ginsenoside from a PPT type first ginsenoside, comprising a step for treating β-glucosidase derived from Terrabacter sp. to the PPT type first ginsenoside, a composition containing the β-glucosidase derived from Terrabacter sp. as an active ingredient for transforming the PPT type ginsenoside into a soluble ginsenoside for easy body absorption, and food, a food additive, feed, or a feed additive comprising: natural of recombinant β-glucosidase protein; Terrabactrer sp. bacteria expressing β-glucosidase; a transformant in which a vector including the nucleic acid sequences coding the β-glucosidase derived the Terrabacter sp. is induced; the culture medium or mixture of the Terrabacter sp.; and the PPT type ginsenoside or ginseng.

Description

테라박터 속 유래 β―글루코시다제를 이용한 ＰＰＴ 타입 진세노사이드의 생물전환{Biotransformation of PPT-type ginsenoside using Terrabacter sp.-derived β-glucosidase}Biotransformation of PPT-type ginsenoside using Terrabacter sp.-derived β-glucosidase}

본 발명은 PPT 타입의 제1 진세노사이드로부터 탈글라이코실화된 PPT 타입의 제2 진세노사이드를 제조하는 방법에 있어서, PPT 타입의 제1 진세노사이드에 테라박터 속(Terrabacter sp.) 유래의 β-글루코시다제(β-glucosidase)를 처리하는 단계를 포함하는 것인 제조방법, 테라박터 속(Terrabacter sp .) 유래의 β-글루코시다제(β-glucosidase)를 유효성분으로 포함하는, PPT 타입 진세노사이드(protopanaxatriol-type ginsenoside)의 체내 흡수가 용이한 형태의 가용성 진세노사이드로의 전환용 조성물, 및 테라박터 속(Terrabacter sp .) 유래의 천연 또는 재조합 β-글루코시다제 단백질; β-글루코시다제(β-glucosidase)를 발현하는 테라박터 속(Terrabacter sp .) 미생물, 테라박터 속(Terrabacter sp .) 유래의 β-글루코시다제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 도입시킨 형질전환체; 이들의 배양물 또는 이들의 혼합물 및 PPT 타입 진세노사이드 또는 삼을 포함하는 식품, 식품첨가제, 사료 또는 사료첨가제에 관한 것이다.
The present invention provides a method for preparing a deglycosylated PPT-type second ginsenoside from a PPT-type first ginsenoside, wherein the first ginsenoside of the PPT type is derived from the genus Terrabacter sp. Preparation method comprising the step of treating the β-glucosidase, the genus Terrabacter sp . Composition for converting PPT type ginsenoside (protopanaxatriol-type ginsenoside) into a soluble ginsenoside that is easily absorbed into the body, comprising β-glucosidase derived from Terrabacter sp . ) Natural or recombinant β-glucosidase protein; Terrabacter expressing β-glucosidase sp . ) Microorganism, Terrabacter sp . A transformant introduced with a vector comprising a nucleic acid sequence encoding β-glucosidase derived from the gene; To a food, food additive, feed or feed additive comprising these cultures or mixtures thereof and PPT type ginsenosides or hemps.

사포닌은 식물계에 널리 존재하는 배당체 중 당을 제외한 부분이 여러 개의 고리화합물로 이루어진 물질을 의미한다. 한편, 인삼 또는 홍삼의 주요 생리 활성 성분을 포함하는 사포닌 성분인, 트리테르펜사포닌(triterpene saponin)은 타 식물에서 발견되는 사포닌과 화학 구조가 상이한 바, 이러한 인삼 사포닌을 타 식물계 사포닌과 구별하기 위하여 특별히 인삼(ginseng) 배당체(glycoside)란 의미로 진세노사이드(ginsenoside)라고 칭한다.Saponin means a substance composed of a plurality of cyclic compounds in the glycosides widely present in the plant system except for sugar. On the other hand, triterpene saponin, which is a saponin component including the main physiologically active component of ginseng or red ginseng, has a chemical structure different from that of saponin found in other plants. Ginseng (ginseng) glycoside (glycoside) is called the ginsenoside (ginsenoside).

상기 진세노사이드는 아글리콘(aglycon)의 구조에 따라 프로토파낙사다이올계 진세노사이드(protopanaxadiol-type ginsenoside), 프로토파낙사트리올계 진세노사이드(protopanaxatriol-type ginsenoside) 및 올레아놀린산계 진세노사이드(oleanolic acid-type ginsenoside)의 세 가지 형태로 분류될 수 있다. 상기 세 가지 그룹의 화합물은 다시 화합물 구조 중 C-3, C-6 및 C-20 위치에 글리코시딕 결합(glycosidic bond)에 의해 부착되는 아글리콘 상에 도입된 당 모이어티(sugar moiety)의 위치 및 수에 따라 분류되는데, 그 중 Rg1, Re, Rb1, Rc 및 Rb2가 전체 진세노사이드의 90%를 차지하는 메이저 진세노사이드(major ginsenoside)이다(Park, J. H., Food Ind . Nutr., 2004, 9:23-27). 그러나, 이들 메이저 진세노사이드들은 큰 사이즈로 인하여 인체에 경구투여되는 경우, 직접 흡수되기 어렵다고 알려져 있다. 따라서, 이러한 인삼에 다량 함유된 메이저 진세노사이드들은 생체 내에서 효과적으로 생리활성을 나타내기 위하여 당 모이어티를 제거하는 전환과정(deglycosylation)을 필요로 한다(Tawab, M. A. et al., Drug Metab . Dispos., 2003, 31: 1065-1071; Akao, T. et al., J. Pharm . Pharmacol., 1998, 50: 1155-1160).The ginsenoside is a protopanaxadiol-type ginsenoside, a protopanaxatriol-type ginsenoside, and an oleolinic acid ginsenoside depending on the structure of aglycon. (oleanolic acid-type ginsenoside) can be classified into three types. The three groups of compounds in turn form sugar moieties introduced on aglycones that are attached by glycosidic bonds at the C-3, C-6 and C-20 positions in the compound structure. Classified by location and number, of which Rg1, Re, Rb1, Rc and Rb2 are major ginsenosides, accounting for 90% of the total ginsenosides (Park, JH, Food). Ind . Nutr ., 2004, 9: 23-27). However, these major ginsenosides are known to be difficult to absorb directly when orally administered to the human body due to their large size. Therefore, the major ginsenosides contained in these ginsengs require a deglycosylation process to remove sugar moieties in order to exhibit effective physiological activity in vivo (Tawab, MA et al. al ., Drug Metab . Dispos ., 2003, 31: 1065-1071; Akao, T. meat al ., J. Pharm . Pharmacol ., 1998, 50: 1155-1160).

한편, 최근 수십 년간 진세노사이드 F1, PPTA 및 화합물 K(compound K)와 같은 인삼에 미량 함유된 마이너 형태(minor form)의 진세노사이드들의 뛰어난 약리효능이 밝혀지고 있다. 이러한 연구결과가 발표됨에 따라 보다 우수한 약리 작용을 갖는 진세노사이드 F1, F2, Rg3, Rh1, Rh2, PPTA 및 화합물 K 등의 마이너 진세노사이드(minor ginsenoside)에 대한 많은 연구가 이루어지고 있으며, 이러한 마이너 형태를 갖는 특정 진세노사이드의 함량 비율을 증가시킬 수 있는 방법이 요구되고 있는 실정이다.On the other hand, in recent decades, the excellent pharmacological efficacy of the minor form of ginsenosides contained in trace amounts of ginseng such as ginsenoside F1, PPTA and compound K (compound K) has been revealed. As these findings are published, many studies have been conducted on minor ginsenosides such as ginsenosides F1, F2, Rg3, Rh1, Rh2, PPTA and compound K, which have better pharmacological action. There is a need for a method capable of increasing the content ratio of certain ginsenosides having a minor form.

이 중, 진세노사이드 F1은 항암활성 및 UVB 조사된 피부의 노화 억제에 의한 화장효과 등의 이로운 효과가 알려진 바 있으나, 상기 본 발명의 생산물인 진세노사이드 F1과 같이 인삼의 자연적 구성요소가 아닌 희귀 진세노사이드로의 전환은 산 가수분해 및 훈증(steaming)과 같은 일반적인 물리화학적 방법에 의해서는 성취되기 매우 어렵다. 단지 Rg3 및 Rh2만이 열처리된 인삼생성물의 주된 구성요소로 나타나며, 상기 Rg3 및 Rh2로의 전환도 완전하지 않다(Popovich, D. G. and Kitts, D. D., Phytochemistry, 2004, 65(3): 337-344). 고안된 방식으로 주요 진세노사이드를 효소 가수분해하여 C-K 및 F1과 같은 희귀 진세노사이드를 생산할 수 있다(Park, C. S. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 2010, 87(1): 9-19). F1의 생산은 상업적 원천의 몇몇 효소(Ko, S. R. et al., Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 2003, 51(4): 404-408), 진균류(fungus)(Kim, Y. S. et al., Biotechnology Letters, 2011, 33(12): 2457-2461) 및 세균(bacterium)(Bae, E. A. et al., Biological and Pharmaceutical Bulletin, 2005, 28(10): 1903-1908)으로부터 정제된 β-글루코시다제를 이용하여 수행되었으나, 천연형 미생물로부터 효소생산이 제한적이어서 천연형 효소에 의한 F1의 대량생산방법은 아직 확립되지 못하였다.Among these, ginsenoside F1 has been known to have beneficial effects such as anticancer activity and cosmetic effects by inhibiting aging of UVB-irradiated skin, but is not a natural component of ginseng like ginsenoside F1, which is a product of the present invention. Conversion to rare ginsenosides is very difficult to achieve by common physicochemical methods such as acid hydrolysis and steaming. Only Rg3 and Rh2 represent the major components of the heat treated ginseng product, and the conversion to Rg3 and Rh2 is also incomplete (Popovich, DG and Kitts, DD, Phytochemistry , 2004, 65 (3): 337-344). Enzymatic hydrolysis of major ginsenosides in the designed manner can produce rare ginsenosides such as CK and F1 (Park, CS et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 2010, 87 (1): 9-19 ). The production of F1 is due to several enzymes of commercial origin (Ko, SR et al., Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 2003, 51 (4): 404-408), fungus (Kim, YS et al., Biotechnology Letters, 2011 , 33 (12): 2457-2461) and β-glucosidase purified from bacterium (Bae, EA et al., Biological and Pharmaceutical Bulletin, 2005, 28 (10): 1903-1908) Although the production of enzymes from natural microorganisms is limited, a method for mass production of F1 by natural enzymes has not yet been established.

상기 프로토파낙사트리올-타입 희귀 진세노사이드(protopanaxatriol-type rare ginsenoside)의 일종인 진세노사이드 F1은 PPT 타입 아글리콘 담마란(dammarane)의 C20 위치에 하나의 글루코피라노실(glucopyranosyl) 치환기만을 갖는다. 이는 인삼 중량의 3 내지 5%을 차지하는 프로토파낙사디올(protopanaxadiol; PPD)-타입 진세노사이드 및 PPT-타입 진세노사이드 중 PPT-타입 진세노사이드에 속하는 각각 Re 및 Rg1의 C6에 위치한 이당류 글루코스-람노스 모이어티 또는 글루코스 모이어티를 가수분해하여 생산할 수 있다(도 2). 이에 글리코시다제를 이용하여 0.5 g의 PPT 타입 혼합물로부터 수백 mg의 F1, Rh1, Rg2 및 Rg1을 생물학적으로 생산하거나, 진균류로부터 분리한 β-글루코시다제를 이용하여 Rg1으로부터 F1을 생산한 경우가 보고되었으나, F1을 그램단위로 생산하는 대량생산에 성공한 사례는 보고된 바 없다.
Ginsenoside F1, a kind of the protopanaxatriol-type rare ginsenoside, has only one glucopyranosyl substituent at the C20 position of the PPT type aglycone dammarane. Have This is a disaccharide glucose located at C6 of Re and Rg1, respectively belonging to PPT-type ginsenosides of protopanaxadiol (PPD) -type ginsenosides and PPT-type ginsenosides, which account for 3 to 5% of the ginseng weight. It can be produced by hydrolysis of the rhamnose or glucose moiety (FIG. 2). Hence hundreds of mg of F1, Rh1, Rg2 and Rg1 are biologically produced from 0.5 g of PPT type mixture using glycosidase or F1 is produced from Rg1 using β-glucosidase isolated from fungi. There have been no reports of successful mass production of F1 in grams.

이에 본 발명자들은 진세노사이드에 주로 존재하는 형태인 메이저 진세노사이드 Re 및 Rg1을 가수분해하여 희귀 진세노사이드인 F1을 대량으로 생산할 수 있는 효소를 찾기 위해 예의 연구노력한 결과로서, PPD 타입 진세노사이드를 가수분해하는 것으로 알려진 테라박터 속 유래 β-글루코시다제가 이와는 다른 메커니즘을 통하여 PPT 타입 진세노사이드를 가수분해하여 F1을 생산할 수 있음을 확인하였으며, 특히, 본 발명의 재조합 β-글루코시다제를 이용한 생물전환을 통해 F1을 그램단위로 대량생산할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
Accordingly, the present inventors have diligently studied major ginsenosides Re and Rg1, which are mainly present in ginsenosides, to find an enzyme capable of producing a large amount of rare ginsenosides F1. It was found that β-glucosidase from the genus terrabacter known to hydrolyze the side could hydrolyze PPT type ginsenosides to produce F1 through a different mechanism, and in particular, the recombinant β-glucosidase of the present invention. It was confirmed that the mass production of F1 in grams through bioconversion using the present invention was completed.

본 발명의 목적은 PPT 타입의 제1 진세노사이드로부터 탈글라이코실화된 PPT 타입의 제2 진세노사이드를 제조하는 방법에 있어서, PPT 타입의 제1 진세노사이드에 테라박터 속(Terrabacter sp .) 유래의 β-글루코시다제(β-glucosidase)를 처리하는 단계를 포함하는 것인 제조방법을 제공하는 것이다.SUMMARY OF THE INVENTION An object of the present invention is to provide a method for preparing a deglycosylated PPT-type second ginsenoside from a PPT-type first ginsenoside, the terbacter genus of the first ginsenoside of PPT type. sp . It provides a manufacturing method comprising the step of treating β-glucosidase derived from).

본 발명의 다른 목적은 테라박터 속(Terrabacter sp .) 유래의 β-글루코시다제(β-glucosidase)를 유효성분으로 포함하는, PPT 타입 진세노사이드(protopanaxatriol-type ginsenoside)의 체내 흡수가 용이한 형태의 가용성 진세노사이드로의 전환용 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is Terrabacter sp . Provides a composition for converting PPT type ginsenoside (protopanaxatriol-type ginsenoside) into a soluble ginsenoside in the form of easy absorption in the body comprising β-glucosidase derived from It is.

본 발명의 또 다른 목적은 테라박터 속(Terrabacter sp .) 유래의 천연 또는 재조합 β-글루코시다제 단백질; β-글루코시다제(β-glucosidase)를 발현하는 테라박터 속(Terrabacter sp .) 미생물, 테라박터 속(Terrabacter sp .) 유래의 β-글루코시다제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 도입시킨 형질전환체; 이들의 배양물 또는 이들의 혼합물 및 PPT 타입 진세노사이드 또는 삼을 포함하는 식품, 식품첨가제, 사료 또는 사료첨가제를 제공하는 것이다.
Another object of the present invention is Terrabacter sp . ) Natural or recombinant β-glucosidase protein; Terrabacter expressing β-glucosidase sp . ) Microorganism, Terrabacter sp . A transformant introduced with a vector comprising a nucleic acid sequence encoding β-glucosidase derived from the gene; To provide a food, a food additive, a feed or a feed additive comprising a culture thereof or a mixture thereof and a PPT type ginsenoside or hemp.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 PPT 타입의 제1 진세노사이드로부터 탈글라이코실화된 PPT 타입의 제2 진세노사이드를 제조하는 방법에 있어서, PPT 타입의 제1 진세노사이드에 테라박터 속(Terrabacter sp.) 유래의 β-글루코시다제(β-glucosidase)를 처리하는 단계를 포함하는 것인 제조방법을 제공한다.
As one aspect for achieving the above object, the present invention provides a method for producing a deglycosylated PPT type second ginsenoside from the first ginsenoside of the PPT type, the first ginsenoside of the PPT type It provides a method comprising the step of treating the β-glucosidase derived from the genus Terrabacter sp .

"PPT 타입의 진세노사이드(protopanaxatriol-type ginsenoside)"는 예컨대 하기 화학식 1의 일반식을 갖는 화합물이다. 각각 6번 및 20번 탄소에 당류 모이어티가 치환될 수 있고, 상기 당류 치환기의 갯수, 위치 및 종류에 따라 다른 화합물을 제공한다. 이때, 당류가 치환되지 않은 자리는 히드록시기(hydroxy; -OH)로 치환된다. 바람직하게, 본 발명의 PPT 타입의 진세노사이드는 3번 탄소에는 히드록시기를 가지며, 6번 탄소 및/또는 20번 탄소에 당류 치환기를 갖는 화합물 및 이의 가수분해물을 포함한다. 바람직하게, 6번 탄소에 람노스로 치환된 글루코스 모이어티를 가지고 20번 탄소에 글루코스 모이어티를 가지는 진세노사이드 Re, 6번 탄소 및 20번 탄소에 각각 치환된 글루코스 모이어티를 가지는 진세노사이드 Rg1, 상기 진세노사이드 Re 또는 Rg1의 가수분해물인 20번 탄소에 글루코스 모이어티를 갖는 진세노사이드 F1, 6번 위치에 람노스로 치환된 글루코스 모이어티를 가지는 진세노사이드 Rg2, 6번 위치에 글루코스 모이어티를 가지는 진세노사이드 Rh1 및 상기 진세노사이드 F1, Rg2 또는 Rh1의 가수분해물인 상기 모든 당류로 치환가능한 자리에 히드록시기가 치환된 PPTA(protopanaxatriol aglacon)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 PPT 타입의 진세노사이드들의 구조는 후술할 것이다."Protopanaxatriol-type ginsenoside" is, for example, a compound having the general formula of Formula 1 below. The saccharide moiety may be substituted for carbon 6 and 20, respectively, and the compound is provided according to the number, location, and type of the saccharide substituent. At this time, the site where the sugar is not substituted is substituted with a hydroxyl group (hydroxy; -OH). Preferably, the ginsenoside of the PPT type of the present invention includes a compound having a hydroxy group on carbon 3 and a saccharide substituent on carbon 6 and / or carbon 20 and a hydrolyzate thereof. Preferably, a ginsenoside Re having a glucose moiety substituted with carbonaceum at carbon 6 and a glucose moiety at carbon 20, a ginsenoside having a glucose moiety substituted at carbon 6 and carbon 20, respectively Ginsenoside F1 having a glucose moiety at carbon 20, which is a hydrolyzate of Rg1, the ginsenoside Re or Rg1, a ginsenoside Rg2 having a glucose moiety substituted with a rhamnose at position 6 It may be a ginsenoside Rh1 having a glucose moiety and a protopanaxatriol aglacon (PPTA) in which a hydroxy group is substituted at a site which is substituted with all the saccharides which are hydrolyzates of the ginsenoside F1, Rg2 or Rh1. The structure of the ginsenosides of the PPT type will be described later.

이와 달리 "PPD 타입(protopanaxadiol-type)의 진세노사이드"는 예컨대 하기 화학식 2의 일반식을 갖는 화합물로, 각각 3번 및 20번 탄소에 당류 모이어티가 치환될 수 있고, 상기 당류 치환기의 갯수, 위치 및 종류에 따라 다른 화합물을 제공한다. 이때, 당류가 치환되지 않은 자리는 히드록시기로 치환된다.
In contrast, "ginsenoside of the protopanaxadiol-type" is, for example, a compound having the general formula of Formula 2, wherein a saccharide moiety may be substituted for carbon 3 and 20, and the number of the saccharide substituents Different compounds are provided depending on their location and type. At this time, the site where the saccharide is not substituted is substituted with a hydroxyl group.

[화학식 1][Formula 1]

Figure 112012071097988-pat00001
Figure 112012071097988-pat00001

Figure 112012071097988-pat00002
Figure 112012071097988-pat00002

[화학식 2](2)

Figure 112012071097988-pat00003
Figure 112012071097988-pat00003

Figure 112012071097988-pat00004
Figure 112012071097988-pat00004

본 발명의 용어 "탈글라이코실화"는 천연의 DNA, RNA, 단백질, 화합물 등의 히드록시기 또는 다른 작용기가 치환된 위치에 대신 결합된 탄수화물(예를 들어, 단당류, 이당류 또는 다당류 등)을 제거하는 과정이다. 바람직하게, 본 발명에서 탈글라이코실화는 메이저 진세노사이드들에 치환된 치환 또는 비치환된 글루코스 모이어티를 제거하는 과정일 수 있다.The term “deglycosylation” of the present invention refers to a process of removing carbohydrates (eg, monosaccharides, disaccharides, or polysaccharides) bound to a position where a hydroxy group or other functional group such as natural DNA, RNA, protein, compound, etc. is substituted. to be. Preferably, deglycosylation in the present invention may be a process of removing a substituted or unsubstituted glucose moiety substituted with major ginsenosides.

"β-글루코시다제(β-glucosidase)"는 두 개의 글루코스 또는 글루코스-치환 분자(예를 들어, 이당 셀로비오스(disaccharide cellobiose))를 연결하는 β1→4 결합에 작용하는 포도당분해효소이다. 본 발명은 테라박터 속 미생물로부터 유래된 β-글루코시다제가 메이저 형태의 PPT 타입의 진세노사이드를 마이너 형태로 전환시킬 수 있다는 것을 최초로 발견하였다. 이는 상기 효소가 갖는 PPT 타입의 진세노사이드의 6번 탄소에 위치한 치환 또는 비치환된 글루코스 모이어티 나아가, 20번 탄소에 위치한 글루코스 모이어티를 선택적으로 가수분해할 수 있는 능력에 기인한다. 테라박터 속(Terrabacter sp .) 미생물로부터 분리된 β-글루코시다제의 구체적인 활성에 대해서는 규명된 바 없다. 다만, 본 발명자들은 선행특허(한국공개공보 제10-2011-0044669)에서 테라박터 속 유래 β-글루코시다제를 최초로 동정하고 PPD 타입의 진세노사이드에 대한 가수분해 활성을 확인하였다. 바람직하게 상기 테라박터 속 미생물은 테라박터 진세노시디뮤탄스 Gsoil3082T(Terrabacter ginsenosidimutans Gsoil3082T)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.“β-glucosidase” is a glucose degrading enzyme that acts on a β1 → 4 bond that connects two glucose or glucose-substituted molecules (eg, disaccharide cellobiose). The present invention first discovered that β-glucosidase derived from the microorganism of the genus Terrabacter can convert ginsenosides of major PPT type to minor form. This is due to the ability of the enzyme to selectively hydrolyze the substituted or unsubstituted glucose moiety located at carbon 6 of the ginsenoside of the PPT type, and further located at carbon 20. Terrabacter sp . The specific activity of β-glucosidase isolated from microorganisms has not been elucidated. However, the present inventors first identified β-glucosidase from the genus Terrabacter in the prior patent (Korean Patent Publication No. 10-2011-0044669) and confirmed the hydrolytic activity on the ginsenoside of the PPD type. Preferably the TB bakteo in the microorganism may be a TB bakteo ginsenoside CD mutans Gsoil3082 T (T Terrabacter ginsenosidimutans Gsoil3082), but is not limited thereto.

본 발명은 또한 상기 본 발명의 β-글루코시다제가 PPT 타입 진세노사이드를 기질로 하여 가수분해반응을 일으킴에 있어, PPD 타입 진세노사이드를 기질로 하여 가수분해를 일으키는 기전과는 다른 기전에 의해 수행됨을 최초로 규명하였다. β-글루코시다제의 공지된 활성인 3번 탄소의 히드록시기에 치환된 글루코스 모이어티를 가수분해하는 PPD 타입 진세노사이드에 대한 작용 모드와는 달리, PPT 타입 진세노사이드에 대하여 6번 및 20번 탄소의 히드록시기에 치환된 글루코스 모이어티를 가수분해할 수 있음을 확인하였다.The present invention also relates to a mechanism in which the β-glucosidase of the present invention causes a hydrolysis reaction using a PPT type ginsenoside as a substrate, and a mechanism different from the mechanism that causes hydrolysis using a PPD type ginsenoside as a substrate. It was first identified as being performed. Unlike the mode of action for PPD type ginsenosides, which hydrolyze the glucose moiety substituted with the hydroxyl group of carbon 3, the known activity of β-glucosidase, 6 and 20 times for PPT type ginsenosides. It was confirmed that the glucose moiety substituted with the hydroxy group of carbon can be hydrolyzed.

구체적으로, β-글루코시다제는 PPD 타입 진세노사이드에 대해서, 3번 탄소의 히드록시기에 치환된 글루코스 모이어티를 가수분해 함에 있어서, 두 개의 글루코스가 연달아 치환된 경우 말단에 위치한 모이어티부터 하나씩 차례로 가수분해시킬 수 있음을 확인하였다. 예를 들어, 3번 및 20번 탄소의 히드록시기에 각각 차례로 연결된 2개의 글루코스 모이어티가 치환된 진세노사이드 Rb1을 본 발명의 β-글루코시다제로 가수분해시키는 경우, 20번 탄소의 히드록시기에 각각 차례로 연결된 2개의 글루코스 모이어티는 손상되지 않은 채로 3번 탄소의 히드록시기에 치환된 차례로 2개의 글루코스 모이어티가 말단으로부터 차례로 가수분해 됨으로써 각각 지페노사이드 XVII 및 LXXV를 생산하고, 최종적으로 20번 탄소의 히드록시기에 치환된 차례로 연결된 2개의 글루코스 모이어티 중 말단에 위치한 하나의 글루코스 모이어티를 가수분해하여 컴파운드 K를 생산한다(An, D. S. et al ., Appl . Environ. Microbiol ., 2010, 76: 5827-5836). 그러나 본 발명에서 β-글루코시다제를 PPT 타입 진세노사이드의 가수분해에 적용한 결과, Rg1의 6번 탄소의 히드록시기에 치환된 단일 글루코스 모이어티를 가수분해시킬 뿐만 아니라, Re의 6번 탄소의 히드록시기에 치환된 말단에 위치한 람노스 모이어티에 의해 보호된 글루코스 모이어티를 직접 가수분해시켜 상기 진세노사이드 Rg1 및 Re 모두로부터 F1을 생산할 수 있다. 나아가 상기 F1의 20번 탄소의 히드록시기에 치환된 글루코스 모이어티를 추가로 가수분해하여 PPTA를 제조할 수 있다. 또한 유사한 메커니즘에 의하여 Rh1의 6번 탄소의 히드록시기에 치환된 단일 글루코스 모이어티를 가수분해시킬 뿐만 아니라, Rg2의 6번 탄소의 히드록시기에 치환된 말단에 위치한 람노스 모이어티에 의해 보호된 글루코스 모이어티를 직접 가수분해시켜 상기 진세노사이드 Rh1 및 Rg2 모두로부터 직접 PPTA를 생산할 수 있다. 상기 본 발명의 β-글루코시다제는 람노시다제 활성을 갖지 않으므로, 상기 Re 및 Rg2를 가수분해하여 각각 F1 및 PPTA로 전환하는 것은 외부의 람노스로부터 내부의 글루코스를 순차적으로 가수분해하는 것이 아니라, 직접 내부의 글루코스를 가수분해하는 것이다. 이로써 본 발명의 β-글루코시다제가 직접 이당(disaccharide)을 가수분해할 수 있음을 규명하였다.Specifically, β-glucosidase hydrolyzes a glucose moiety substituted with a hydroxy group of carbon 3 for PPD type ginsenosides, one by one from the terminal located at the terminal when two glucoses are successively substituted. It was confirmed that it can be hydrolyzed. For example, when hydrolyzing the ginsenoside Rb1 substituted with two glucose moieties, which are connected in turn to the hydroxy groups of carbons 3 and 20, respectively with the β-glucosidase of the present invention, each of the hydroxy groups of carbon 20 is The two linked glucose moieties are intact and substituted with a hydroxyl group of carbon 3 to in turn hydrolyze the two glucose moieties from the end in turn to produce zipenosides XVII and LXXV, respectively, and finally the hydroxyl group of carbon 20 Compound K produces a compound K by hydrolyzing one glucose moiety at the end of two glucose moieties linked in turn to an substituent (An, DS et. al . , Appl . Environ. Microbiol . , 2010, 76: 5827-5836). However, in the present invention, the β-glucosidase is applied to the hydrolysis of PPT type ginsenosides, and not only hydrolyzes a single glucose moiety substituted with a hydroxy group of carbon 6 of Rg1, but also a hydroxyl group of carbon 6 of Re. The glucose moiety protected by a rhamnose moiety located at the terminal substituted at can be directly hydrolyzed to produce F1 from both ginsenosides Rg1 and Re. Furthermore, PPTA may be prepared by further hydrolyzing a glucose moiety substituted with a hydroxyl group of carbon 20 of F1. A similar mechanism also hydrolyzes a single glucose moiety substituted with a hydroxy group of carbon 6 of Rh1, as well as a glucose moiety protected by a rhamnose moiety located at the terminal substituted with a hydroxy group of carbon 6 of Rg2. Direct hydrolysis can produce PPTA directly from both ginsenosides Rhl and Rg2. Since the β-glucosidase of the present invention does not have rhamnosidase activity, the hydrolysis of Re and Rg2 to F1 and PPTA, respectively, does not sequentially hydrolyze internal glucose from external rhamnose. To directly hydrolyze the glucose inside. This revealed that the β-glucosidase of the present invention can directly hydrolyze disaccharides.

본 발명의 β-글루코시다제는 서열번호 1의 폴리펩티드 서열로 구성되는 서열을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게, 상기 서열뿐만 아니라 상기 서열과 70% 이상의 유사성을 가지는 아미노산 서열, 바람직하게는 80% 이상의 유사성, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 유사성, 보다 더욱 바람직하게는 95% 이상의 유사성, 가장 바람직하게는 98% 이상의 유사성을 나타내는 아미노산 서열로서 실질적으로 진세노시드 글리코시다제의 활성을 갖는 서열도 본 발명의 범위 내에 속한다. 또한, 이러한 유사성을 갖는 서열로서 실질적으로 β-글리코시다제와 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 발명의 범위 내에 포함된다.Β-glucosidase of the present invention may have a sequence consisting of the polypeptide sequence of SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto. Preferably, not only said sequence but also an amino acid sequence having at least 70% similarity with said sequence, preferably at least 80% similarity, more preferably at least 90% similarity, even more preferably at least 95% similarity, most preferably Sequences having substantially the activity of ginsenoside glycosidase as amino acid sequences exhibiting at least 98% similarity are also within the scope of the present invention. In addition, if the sequence having such similarity is an amino acid sequence having a biological activity substantially identical to or corresponding to that of β-glycosidase, a protein having an amino acid sequence in which some sequences are deleted, modified, substituted or added is also within the scope of the present invention. Included.

또한, 본 발명의 β-글루코시다제는 서열번호 2의 핵산 서열로 구성되는 유전자 서열을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게 상기 서열 뿐만 아니라 상기 서열과 70% 이상의 유사성을 가지는 서열, 바람직하게는 80% 이상의 유사성, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 유사성, 보다 더욱 바람직하게는 95% 이상의 유사성, 가장 바람직하게는 98% 이상의 유사성을 나타내는 서열로서 실질적으로 β-글리코시다제의 활성을 갖는 서열도 본 발명의 범위 내에 속한다. 바람직하게 본 발명의 유전자는 유전자는 1947bp 길이의 핵산을 포함하며 648개의 아미노산으로 구성된 폴리펩타이드를 코딩한다.In addition, the β-glucosidase of the present invention may have a gene sequence consisting of the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 2, but is not limited thereto. Preferably not only said sequence but also a sequence having at least 70% similarity with said sequence, preferably at least 80% similarity, more preferably at least 90% similarity, even more preferably at least 95% similarity, most preferably 98% Sequences having substantially the activity of β-glycosidase as sequences showing the above similarity also fall within the scope of the present invention. Preferably, the gene of the present invention encodes a polypeptide comprising a nucleic acid of 1947 bp and consisting of 648 amino acids.

본 발명의 용어 "유사성"이란 야생형(wild type) 단백질의 아미노산 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 본 발명의 진세노시드 글리코시다제를 코딩하는 서열과 상기와 같은 퍼센트 이상의 동일한 서열을 가지는 서열을 포함한다. 이러한 유사성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다. 시판되는 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열 간의 유사성을 백분율(%)로 계산할 수 있으며, 유사성(%)은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있다.The term "similarity" of the present invention is intended to indicate the degree of similarity with the amino acid sequence of a wild type protein, having a sequence encoding the ginsenoside glycosidase of the present invention and at least the same sequence as the above. Sequence. This similarity can be compared with the naked eye or using a comparison program that is easy to purchase. Commercially available computer programs can calculate the similarity between two or more sequences as a percentage, and the similarity can be calculated for adjacent sequences.

본 기술 분야의 당업자라면 이러한 인위적인 변형에 의해 일정 수준 이상의 유사성이 유지되는 동시에 본 발명에서 목적하는 단백질의 활성을 보유하는 한 균등한 단백질임을 쉽게 이해할 수 있을 것이다. 따라서 본 발명의 β-글리코시다제는 야생형의 아미노산 서열 변이체 또는 핵산 서열 변이체를 포함하는데, "변이체"란 천연 아미노산 서열 또는 핵산 서열에 대해 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기 또는 핵산 서열이 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 갖는 단백질 또는 상이한 서열을 갖는 핵산을 의미한다.Those skilled in the art will readily understand that such artificial modifications are equivalent proteins so long as they retain a certain level of similarity and retain the activity of the protein of interest in the present invention. Thus, the β-glycosidase of the present invention includes wild-type amino acid sequence variants or nucleic acid sequence variants, wherein "variants" refer to deletions, insertions, ratios of one or more amino acid residues or nucleic acid sequences relative to a native amino acid sequence or nucleic acid sequence. By conservative or conservative substitutions or a combination thereof is meant a protein having a different sequence or a nucleic acid having a different sequence.

상기 본 발명의 β-글루코시다제는 이를 발현하는 테라박터 속(Terrabacter sp.) 미생물로부터 천연형 β-글루코시다제 단백질로 제조되거나 테라박터 속(Terrabacter sp .) 유래의 β-글루코시다제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 도입시킨 형질전환체로부터 재조합 단백질로 제조된 것을 이용할 수 있다.Let the β- glucoside of the present invention or the agent is made from terra bakteo in (Terrabacter sp.) That express this microorganism to wild-type β- glucosidase protein in TB bakteo (Terrabacter sp . A recombinant protein may be used from a transformant into which a vector containing a nucleic acid sequence encoding β-glucosidase derived from a) is introduced.

본 발명의 용어 "벡터"는 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 바람직하게 본 발명은 테라박터 속(Terrabacter sp .) 유래의 β-글리코시다제를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조할 수 있는데, 상기 제조된 재조합 벡터를 숙주세포에 형질전환 (transformation) 또는 형질감염(transfection) 시킴으로써, 본 발명의 β-글리코시다제를 수득할 수 있게 된다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 재조합 β-글리코시다제의 제조를 위하여 테라박터 진세노시디뮤탄스 Gsoil3082로부터 β-글리코시다제를 코딩하는 유전자를 획득하여 pGEX-4T-1 플라스미드를 이용하여 재조합 벡터를 제작하였다.The term "vector" of the present invention refers to a gene construct, which is an expression vector capable of expressing a protein of interest in a suitable host cell, comprising an essential regulatory element operably linked to express the gene insert. Preferably the present invention is Terrabacter sp . Recombinant vector comprising a gene encoding a β-glycosidase derived from the) can be prepared, by transforming or transfecting the prepared recombinant vector into a host cell, the β- of the present invention Glycosidase can be obtained. In a preferred embodiment of the present invention, for the production of recombinant β-glycosidase, a gene encoding β-glycosidase is obtained from terabacter ginsenocidimutans Gsoil3082, and a recombinant vector is prepared using pGEX-4T-1 plasmid. Produced.

본 발명에 따른 형질전환에 사용되는 숙주세포로는 당업계에 널리 알려져 있는 숙주세포는 어떤 것이나 사용할 수 있으나, 본 발명의 β-글리코시다제를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 도입효율이 우수하고, 상기 도입된 유전자의 발현효율이 높은, 바람직하게 β-글리코시다제의 발현율이 높은 숙주세포를 사용할 수 있다. 예를 들어, 박테리아, 곰팡이(예컨대, 효모), 식물 또는 동물(예컨대, 포유동물 또는 곤충) 세포를 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기와 같은 방법으로 제조된 재조합 벡터를 대장균(E. coli)과 같은 숙주세포에 형질전환시킴으로써 형질전환체를 제조할 수 있는데, 본 발명의 구체적인 실시예에서는 E. coli C41(DE3) 세포에 상기 재조합 벡터를 형질전환함으로써 β-글리코시다제의 발현을 유도하였다.Used for transformation according to the invention As a host cell, any host cell well known in the art may be used, but the introduction efficiency of the recombinant vector including the gene encoding the β-glycosidase of the present invention is excellent, and the expression efficiency of the introduced gene is excellent. This high, preferably high host cell expression rate β-glycosidase can be used. For example, it can include bacteria, fungi (eg yeast), plants or animals (eg mammals or insects) cells. Preferably, the transformant may be prepared by transforming the recombinant vector prepared by the above method into a host cell such as E. coli . In a specific embodiment of the present invention, E. coli C41 (DE3) Expression of β-glycosidase was induced by transforming the recombinant vector into cells.

본 발명에 따라 테라박터 속(Terrabacter sp .) 유래의 β-글루코시다제(β-glucosidase)를 처리하는 단계는 테라박터 속(Terrabacter sp .) 유래의 천연 또는 재조합 β-글루코시다제 단백질; β-글루코시다제(β-glucosidase)를 발현하는 테라박터 속(Terrabacter sp .) 미생물, 테라박터 속(Terrabacter sp .) 유래의 β-글루코시다제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 도입시킨 형질전환체; 또는 이들의 배양물로 처리하는 것일 수 있다. Terrabacter according to the invention sp . ( Beta ) -glucosidase derived from the step of terrabacter sp . ) Natural or recombinant β-glucosidase protein; Terrabacter expressing β-glucosidase sp . ) Microorganism, Terrabacter sp . A transformant introduced with a vector comprising a nucleic acid sequence encoding β-glucosidase derived from the gene; Or treatment with these cultures.

예를 들어, PPT 타입의 진세노사이드를 포함하는 반응물에 테라박터 속(Terrabacter sp .) 유래의 천연 또는 재조합 β-글루코시다제 단백질를 직접 첨가하여 반응시키거나, β-글루코시다제(β-glucosidase)를 발현하는 테라박터 속 미생물, 예를 들어 본 발명의 진세노시디뮤탄스 Gsoil3082, 또는 테라박터 속(Terrabacter sp.) 유래의 β-글루코시다제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 도입시킨 형질전환체와 함께 배양하거나, 상기 미생물 또는 형질전환체의 배양물과 혼합하여 반응시킬 수 있다.For example, in a reaction containing a PPT type ginsenoside, Terrabacter sp . Or terrabacter microorganisms expressing β-glucosidase, for example, ginsenosididimutans Gsoil3082, Or incubated with a transformant incorporating a vector comprising a nucleic acid sequence encoding β-glucosidase from Terrabacter sp. , Or reacted by mixing with a culture of the microorganism or transformant. Can be.

상기 PPT 타입의 제1 진세노사이드는 삼, 삼 추출물 또는 삼 또는 이의 추출물을 포함하는 식품의 형태로 제공될 수 있다.The first ginsenoside of the PPT type may be provided in the form of ginseng, ginseng extract or food containing ginseng or extracts thereof.

바람직하게 본 발명의 구체적인 실시예에서는 건조삼 분말로부터 조 PPT 타입 진세노사이드 혼합물(crude mixture)을 에탄올 용액으로 추출하고 컬럼으로 정제하여 사용하였다. 이후 β-글루코시다제에 의한 가수분해 반응을 용액 상에서 실시하였다. 이때, 조 PPT 타입 진세노사이드 혼합물은 물에 대한 용해도가 낮으므로, 반응성을 높이기 위하여 NaCl 용액을 첨가하여 용해도를 높였다.Preferably, in a specific embodiment of the present invention, a crude PPT type ginsenoside mixture from dried ginseng powder was extracted with an ethanol solution and purified by column. The hydrolysis reaction with β-glucosidase was then carried out on solution. At this time, the crude PPT type ginsenoside mixture has low solubility in water, so that the solubility was increased by adding NaCl solution to increase the reactivity.

본 발명에서 β-글루코시다제를 처리하는 단계는 PPT 타입 제1 진세노사이드, 바람직하게는 β-글루코시다제가 작용하는 기질의 총 중량과 1:0.6 내지 1:1의 중량비로 β-글루코시다제를 사용하여 수행될 수 있다. 바람직하게는 80%의 농도로 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 25 mg/ml 농도의 PPT 타입 진세노사이드 혼합물을 가수분해 하는 경우, 20 mg/ml 농도의 β-글루코시다제를 사용하여 가수분해할 수 있다. 특히, 진세노사이드 F1을 생산하고자 하는 경우 상기 β-글루코시다제의 양을 조절하는 것이 중요하다. 예를 들어, 가수분해하고자 하는 기질의 농도에 비해 과량의 효소를 사용하였을 경우, 생산된 F1이 PPT 타입 진세노사이드의 최종 가수분해 산물인 PPTA로 전환될 수 있다.The step of treating β-glucosidase in the present invention is β-glucosidase at a weight ratio of 1: 0.6 to 1: 1 with the total weight of the substrate on which the PPT type first ginsenoside, preferably β-glucosidase, acts. Can be performed using agents. Preferably at a concentration of 80%. For example, when hydrolyzing a PPT type ginsenoside mixture at a concentration of 25 mg / ml, it can be hydrolyzed using β-glucosidase at a concentration of 20 mg / ml. In particular, if one wants to produce ginsenoside F1, it is important to control the amount of β-glucosidase. For example, if excess enzyme is used relative to the concentration of the substrate to be hydrolyzed, the produced F1 can be converted to PPTA, the final hydrolysis product of the PPT type ginsenoside.

또한 본 발명에서 상기 β-글루코시다제를 처리하는 단계는 100 내지 500 mM 농도로 NaCl를 첨가하여 수행될 수 있다. 메이저 형태의 PPT 타입 진세노사이드인 Re 및 Rg1 등은 난용성 화합물인 반면, 효소 반응은 용액 상에서 효과적으로 수행될 수 있다. 따라서, 상기 본 발명의 β-글루코시다제의 기질로 작용하는 난용성 메이저 형태의 PPT 타입 진세노사이드 Re 및 Rg1의 수용액에 대한 용해도를 증가시켜 수용액 상에서의 효소반응 효율을 향상시킬 수 있다. 따라서, 상기 난용성 화합물의 용해를 돕기 위하여 NaCl을 첨가하여 효소반응을 수행할 수 있다. 상기 효소반응에 첨가되는 NaCl은 바람직하게 100 내지 500 mM의 농도로 첨가될 수 있으며, 보다 바람직하게는 200 mM 농도로 첨가될 수 있다. 500 mM을 초과하는 농도로 첨가될 수 있으나, 이로 인한 더 이상의 효율증가를 나타내지는 않는다(도 4).In the present invention, the step of treating the β-glucosidase may be performed by adding NaCl at a concentration of 100 to 500 mM. The major forms of PPT type ginsenosides Re and Rg1 and the like are poorly soluble compounds, while enzymatic reactions can be carried out effectively in solution. Therefore, the solubility of the PPT-type ginsenosides Re and Rg1 in the poorly soluble major form serving as a substrate of the β-glucosidase of the present invention can be increased to improve the efficiency of the enzyme reaction in the aqueous solution. Therefore, in order to assist in dissolving the poorly soluble compound, NaCl may be added to carry out the enzymatic reaction. NaCl added to the enzyme reaction may be preferably added at a concentration of 100 to 500 mM, more preferably at a concentration of 200 mM. It may be added at a concentration exceeding 500 mM, but this does not show any further increase in efficiency (FIG. 4).

본 발명의 PPT 타입의 제1 진세노사이드는 각각 하기 화학식 3 내지 7의 구조식을 갖는 진세노사이드 Re, Rg1, Rg2, Rh1 또는 F1 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있으며, PPT 타입의 제2 진세노사이드는 각각 하기 화학식 7 및 8의 구조식을 갖는 진세노사이드 F1 또는 PPTA 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다.The first ginsenoside of the PPT type of the present invention may include a ginsenoside Re, Rg1, Rg2, Rh1 or F1 or a mixture thereof, each having a structure of Formulas 3 to 7 Cenosides may include ginsenosides F1 or PPTA or mixtures thereof having the structural formulas of Formulas 7 and 8, respectively.

[화학식 3] 진세노사이드 ReGinsenoside Re

Figure 112012071097988-pat00005
Figure 112012071097988-pat00005

[화학식 4] 진세노사이드 Rg1[Formula 4] ginsenoside Rg1

Figure 112012071097988-pat00006
Figure 112012071097988-pat00006

[화학식 5] 진세노사이드 Rg2[Formula 5] ginsenoside Rg2

Figure 112012071097988-pat00007
Figure 112012071097988-pat00007

[화학식 6] 진세노사이드 Rh1Ginsenoside Rh1

Figure 112012071097988-pat00008
Figure 112012071097988-pat00008

[화학식 7] 진세노사이드 F1Ginsenoside F1

Figure 112012071097988-pat00009
Figure 112012071097988-pat00009

[화학식 8] PPTA[Formula 8] PPTA

Figure 112012071097988-pat00010

Figure 112012071097988-pat00010

본 발명의 β-글루코시다제는 PPT 타입의 제1 진세노사이드의 6번 탄소에 위치한 치환 또는 비치환된 글루코스 모이어티를 가수분해할 수 있다. 상기 가수분해를 통하여 6번 탄소에 위치한 치환 또는 비치환된 글루코스 모이어티를 제거함으로써, 바람직하게 진세노사이드 Re로부터 진세노사이드 F1로의 전환, 진세노사이드 Rg1로부터 진세노사이드 F1로의 전환, 진세노사이드 Rg2로부터 진세노사이드 PPTA로의 전환 또는 진세노사이드 Rh1로부터 진세노사이드 PPTA로의 전환을 수행할 수 있다.Β-glucosidase of the present invention can hydrolyze a substituted or unsubstituted glucose moiety located at carbon 6 of the first ginsenoside of the PPT type. By removing the substituted or unsubstituted glucose moiety located at carbon 6 through the hydrolysis, conversion of ginsenoside Re to ginsenoside F1, conversion of ginsenoside Rg1 to ginsenoside F1, ginsenoside The conversion from side Rg2 to ginsenoside PPTA or from ginsenoside Rh1 to ginsenoside PPTA can be performed.

또한, 본 발명의 β-글루코시다제는 PPT 타입의 제1 진세노사이드의 20번 탄소에 위치한 글루코스 모이어티를 가수분해할 수 있다. 상기 가수분해를 통하여 20번 탄소에 위치한 치환 또는 비치환된 글루코스 모이어티를 제거함으로써, 바람직하게 진세노사이드 F1로부터 진세노사이드 PPTA로의 전환반응을 수행할 수 있다.
In addition, the β-glucosidase of the present invention may hydrolyze the glucose moiety located at carbon 20 of the first ginsenoside of the PPT type. By removing the substituted or unsubstituted glucose moiety located at carbon 20 through the hydrolysis, it is preferable to perform the conversion reaction from ginsenoside F1 to ginsenoside PPTA.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 테라박터 속(Terrabacter sp .) 유래의 β-글루코시다제(β-glucosidase)를 유효성분으로 포함하는, PPT 타입 진세노사이드(protopanaxatriol-type ginsenoside)의 체내 흡수가 용이한 형태의 가용성 진세노사이드로의 전환용 조성물을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a terrabacter genus sp . Provides a composition for converting PPT type ginsenoside (protopanaxatriol-type ginsenoside) into a soluble ginsenoside in the form of easy absorption in the body comprising β-glucosidase derived from do.

바람직하게 상기 본 발명의 조성물은 테라박터 속(Terrabacter sp .) 유래의 β-글루코시다제(β-glucosidase)는 테라박터 속(Terrabacter sp .) 유래의 천연 또는 재조합 β-글루코시다제 단백질; β-글루코시다제(β-glucosidase)를 발현하는 테라박터 속(Terrabacter sp .) 미생물, 테라박터 속(Terrabacter sp .) 유래의 β-글루코시다제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 도입시킨 형질전환체; 또는 이들의 배양물을 포함하는 것일 수 있다.
Preferably the composition of the present invention is Terrabacter sp . Β-glucosidase from the genus Terrabacter sp . ) Natural or recombinant β-glucosidase protein; Terrabacter expressing β-glucosidase sp . ) Microorganism, Terrabacter sp . A transformant introduced with a vector comprising a nucleic acid sequence encoding β-glucosidase derived from the gene; Or it may be one containing these cultures.

또 다른 양태로서, 본 발명은 테라박터 속(Terrabacter sp .) 유래의 천연 또는 재조합 β-글루코시다제 단백질; β-글루코시다제(β-glucosidase)를 발현하는 테라박터 속(Terrabacter sp .) 미생물, 테라박터 속(Terrabacter sp .) 유래의 β-글루코시다제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 도입시킨 형질전환체; 이들의 배양물 또는 이들의 혼합물 및 PPT 타입 진세노사이드 또는 삼을 포함하는 식품, 식품첨가제, 사료 또는 사료첨가제를 제공한다.In another aspect, the present invention provides a terrabacter genus sp . ) Natural or recombinant β-glucosidase protein; Terrabacter expressing β-glucosidase sp . ) Microorganism, Terrabacter sp . A transformant introduced with a vector comprising a nucleic acid sequence encoding β-glucosidase derived from the gene; Food, food additives, feed or feed additives are provided comprising these cultures or mixtures thereof and PPT type ginsenosides or hemps.

본 발명의 테라박터 속(Terrabacter sp .) 유래의 β-글루코시다제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 도입시킨 형질전환체를 포함하는 식품, 식품첨가제, 사료 또는 사료첨가제를 제공하기 위하여 숙주세포로서 식품과 사료에 적합한 유산균을 사용할 수 있다. 상기 유산균의 예로는 락토코커스 속, 스트렙토코커스 속, 락토바실러스 속, 류코노스톡 속, 페디오코커스 속, 브레비박테리움 속 및 프로피오니박테리움 속이 있다. 식품 발효 배양물로서 단독으로 또는 유산균과 함께 사용되기도 하는, 엄밀하게는 혐기성 균인 비피더스균(즉, 비피도박테리움 속(Bifidobacterium spp.)에 속하는 유산 생성 박테리아도 유산균 부류에 포함된다. Terrabacter of the present invention sp . To provide a food, food additive, feed, or feed additive comprising a transformant into which a vector containing a nucleic acid sequence encoding β-glucosidase derived from Can be. Examples of the lactic acid bacteria include the genus Lactococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Leukonostock, Pediococcus, Brevibacterium and Propionibacterium. Lactic acid producing bacteria belonging to the bifidus bacterium (ie, Bifidobacterium spp.), Which are strictly anaerobic bacteria, which are used alone or in combination with lactic acid bacteria, are included in the lactic acid bacteria class.

상기 식품은 건강기능식품 뿐만 아니라, 인간이 널리 통상적으로 매일 섭취하는 일반적인 식품을 포함하는 것이다. 건강기능식품으로서 이용될 경우 식품학적으로 허용 가능한 담체 또는 첨가제와 함께 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 건강기능식품의 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 건강기능식품은 예를 들어 산제, 과립제, 정제, 캅셀제, 현탁액, 에멀젼, 시럽제, 액제, 엑스제, 차, 젤리, 또는 음료 등으로 제조될 수 있다.　 상기 식품학적으로 허용 가능한 담체 또는 첨가제는 제조하고자 하는 제형의 제조에 당해 기술분야에서 사용 가능한 것으로 공지되어 있는 임의의 담체 또는 첨가제가 이용될 수 있다.The foods include not only health functional foods, but also general foods that are widely consumed by humans on a daily basis. When used as a health functional food, may be formulated into a conventional health functional food formulation known in the art together with a pharmaceutically acceptable carrier or additive. The health functional food may be prepared, for example, as a powder, a granule, a tablet, a capsule, a suspension, an emulsion, a syrup, a liquid, an extract, tea, jelly, The pharmaceutically acceptable carrier or additive may be any carrier or additive known to be usable in the art for the preparation of the formulation to be prepared.

상기 식품은 발효식품일 수 있으며, 발효식품의 예로는 김치, 채소발효물, 된장, 간장, 청국장, 젓갈, 발효된 유제품(발효유, 요구르트, 치즈) 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.The food may be fermented food, examples of fermented foods include, but are not limited to, kimchi, vegetable fermented product, soybean paste, soy sauce, cheonggukjang, salted fermented dairy products (fermented milk, yogurt, cheese) and the like.

식품, 식품 첨가제, 사료 또는 사료첨가제에서, PPT 타입의 진세노사이드 또는 삼내 PPT 타입의 진세노사이드는 β-글루코시다제에 의해 가수분해된 것일 수 있고, 가수분해되지 않은 것일 수 있다.In foods, food additives, feed or feed additives, the ginsenosides of the PPT type or the ginsenosides of the trigeminal PPT type may be hydrolyzed by β-glucosidase and may not be hydrolyzed.

사료 첨가제로서 이용될 경우, 본 발명의 테라박터 속(Terrabacter sp .) 유래의 천연 또는 재조합 β-글루코시다제 단백질; β-글루코시다제(β-glucosidase)를 발현하는 테라박터 속(Terrabacter sp.) 미생물, 테라박터 속(Terrabacter sp.) 유래의 β-글루코시다제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 도입시킨 형질전환체; 이들의 배양물 또는 이들의 혼합물은 20 내지 90wt% 고농축액이거나 분말 또는 과립형태로 제조될 수 있다. 상기 사료 첨가제는 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산 등의 유기산이나 인산나트륨, 인산칼륨, 산성 피로인산염, 폴리인산염(중합인산염) 등의 인산염이나, 폴리페놀, 카테킨, 알파-토코페롤, 로즈마리 추출물, 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제 중 어느 하나 또는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 사료로서 이용될 경우, 상기 조성물은 통상의 사료 형태로 제제화될 수 있으며, 통상의 사료 성분을 함께 포함할 수 있다.When used as a feed additive, the Terrabacter of the present invention sp . ) Natural or recombinant β-glucosidase protein; A vector containing a nucleic acid sequence encoding a terbacter sp. microorganism expressing β-glucosidase and a β-glucosidase from terrabacter sp. Transformants; Their cultures or mixtures thereof can be 20 to 90 wt% high concentrate or prepared in powder or granule form. The feed additives include organic acids such as citric acid, fumaric acid, adipic acid, lactic acid and malic acid, phosphates such as sodium phosphate, potassium phosphate, acid pyrophosphate and polyphosphate (polyphosphate), polyphenols, catechins, alpha-tocopherols and rosemary Extracts, vitamin C, green tea extracts, licorice extracts, chitosan, tannic acid, phytic acid, such as any one or more may be further included. When used as a feed, the composition may be formulated in a conventional feed form and may include common feed ingredients.

상기 사료 첨가제 및 사료는 곡물, 예를 들면 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들면 평지, 콩, 및 해바라기를 주성분으로 하는 사료; 동물성 단백질 사료, 예를 들면 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조 성분 등을 더 포함할 수 있으며, 이외에도 영양 보충제, 소화 및 흡수 향상제, 성장 촉진제 등을 더 포함할 수 있다.The feed additives and feeds may be selected from the group consisting of cereals, such as ground or crushed wheat, oats, barley, corn and rice; Feeds based on vegetable protein such as rapeseed, soybeans and sunflower; Animal protein feeds such as blood, meat, bone meal and fish meal; A sugar or a milk product, for example, a dry component comprising various powdered milk and whey powder, and may further include nutritional supplements, digestion and absorption enhancers, growth promoters, and the like.

상기 사료 첨가제는 동물에게 단독으로 투여하거나 식용 담체 중에서 다른 사료 첨가제와 조합하여 투여할 수도 있다. 또한, 상기 사료 첨가제는 탑 드레싱으로서 또는 이들을 동물 사료에 직접 혼합하거나 또는 사료와 별도의 경구 제형으로 용이하게 동물에게 투여할 수 있다. 상기 사료 첨가제를 동물 사료와 별도로 투여할 경우, 당해 기술분야에 잘 알려진 바와 같이 약제학적으로 허용 가능한 식용 담체와 조합하여, 즉시 방출 또는 서방성 제형으로 제조할 수 있다. 이러한 식용 담체는 고체 또는 액체, 예를 들어 옥수수 전분, 락토오스, 수크로오스, 콩 플레이크, 땅콩유, 올리브유, 참깨유 및 프로필렌글리콜일 수 있다. 고체 담체가 사용될 경우, 사료 첨가제는 정제, 캡슐제, 산제, 트로키제 또는 함당정제 또는 미분산성 형태의 탑 드레싱일 수 있다. 액체담체가 사용될 경우, 사료 첨가제는 젤라틴 연질 캡슐제, 또는 시럽제나 현탁액, 에멀젼제, 또는 용액제의 제형일 수 있다.The feed additive may be administered to animals singly or in combination with other feed additives in edible carriers. The feed additives can also be administered to the animal either as a top dressing or they can be mixed directly with the animal feed or in a separate oral form separate from the feed. When the feed additive is administered separately from an animal feed, it can be prepared in an immediate release or sustained release formulation, in combination with a pharmaceutically acceptable edible carrier as is well known in the art. Such edible carriers may be solid or liquid, such as corn starch, lactose, sucrose, soy flakes, peanut oil, olive oil, sesame oil and propylene glycol. When a solid carrier is used, the feed additive can be a tablet, capsule, powder, troche or emulsion or top-dressing in finely divided form. When a liquid carrier is used, the feed additive can be a gelatin soft capsule, or a syrup or suspension, emulsion, or solution formulation.

상기 사료는 동물의 식이 욕구를 충족시키는데 통상적으로 사용되는 임의의 단백질-함유 유기 곡분을 포함할 수 있다. 이러한 단백질-함유 곡분은 통상적으로 옥수수, 콩 곡분, 또는 옥수수/콩 곡분 믹스로 주로 구성되어 있다.The feed may comprise any protein-containing organic fructose commonly used to meet an animal's dietary needs. These protein-containing flours usually consist mainly of corn, soy flour, or corn / soy flour mix.

또한, 상기 사료 첨가제 및 사료는 보조제, 예를 들어 보존제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 용액 촉진제 등을 함유할 수 있다. 상기 사료 첨가제는 침투, 분무 또는 혼합하여 동물의 사료에 첨가하여 이용될 수 있다.The feed additives and feeds may also contain adjuvants such as preservatives, stabilizers, wetting or emulsifying agents, solution promoters and the like. The feed additive may be used by being added to animal feed by infiltration, spraying or mixing.

본 발명의 사료 또는 사료 첨가제는 포유류, 가금 및 어류를 포함하는 다수의 동물 식이에 적용할 수 있다. 상기 포유류로서 돼지, 소, 양, 염소, 실험용 설치 동물, 및 실험용 설치 동물 뿐만 아니라, 애완 동물(예: 개,고양이) 등에게 사용할 수 있으며, 상기 가금류로서 닭, 칠면조, 오리, 거위, 꿩, 및 메추라기 등에도 사용할 수 있고, 상기 어류로서 송어 등에 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
The feed or feed additive of the present invention is applicable to many animal diets, including mammals, poultry and fish. The mammal can be used not only for pigs, cows, sheep, goats, experimental rodents, and experimental rodents, but also for pets (eg, dogs, cats). As poultry, chickens, turkeys, ducks, geese, pheasants, And can also be used for quail, etc., may be used in trout, etc. as the fish, but is not limited thereto.

본 발명에 따라 테라박터 속(Terrabacter sp .) 유래 β-글루코시다제를 사용하여 최적화된 기질 및 NaCl 농도에서 PPTx로부터 희귀 PPT 타입 진세노사이드 F1을 대량으로 생산할 수 있다. 또한, 상기 효소를 이용하면 희귀 진세노사이드의 대량 생산이 가능해져, 본 발명에서는 최초로 그램단위로 F1을 생산하였다.
 Terrabacter according to the invention sp . ) -Glucosidase) can be used to produce large quantities of rare PPT type ginsenosides F1 from PPTx at optimized substrate and NaCl concentrations. In addition, the use of the enzyme enables mass production of rare ginsenosides, and in the present invention, F1 was first produced in grams.

도 1은 본 발명에 따른 β-글루코시다제의 PPT 타입 진세노사이드 생물전환 활성을 나타낸 도이다. 레인 1, 2, 3, 4, 5 및 6은 각각 표준 진세노사이드 Re, Rg2, Rg1, Rh1, F1 및 PPTA를; 레인 7, 9, 11, 13 및 15는 효소 처리 하지 않은 진세노사이드 Re, Rg2, Rg1, Rh1 및 F1을; 레인 8, 10, 12, 14 및 16은 진세노사이드 Re, Rg2, Rg1, Rh1 및 F1을 β-글루코시다제와 24시간 동안 인큐베이션 후의 결과물을 나타낸다.
도 2는 본 발명에 따른 β-글루코시다제에 의한 PPT 타입 진세노사이드의 탈글리코실화 생물전환 경로를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명에 따른 β-글루코시다제에 의한 진세노사이드 F1 생산시 PPTx 농도의 영향을 나타낸 도이다. 40mg/ml 농도의 β-글루코시다제(BgpA)를 표시된 농도의 같은 부피의 기질(PPTx) 용액과 혼합하여 반응시켰다. 도면에서 각각의 기호가 나타내는 농도는 동일한 부피의 β-글루코시다제와 혼합한 혼합물에서 기질의 최종농도에 상응한다; 5 (●), 10 (▽), 15 (■), 20 (◇), 25 (○) 및 50 (▲) mg/ml.
도 4는 본 발명에 따른 β-글루코시다제에 의한 진세노사이드 Re 및 Rg1로부터 F1으로의 생물전환시 NaCl의 영향을 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명에 따른 β-글루코시다제에 의한 생물전환 시간에 따른 각각의 PPTx의 생산 또는 잔존량을 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명에 따른 효소에 의한 생물전환에 의해 생산된 F1 정제에 대한 HPLC 크로마토그램이다. 각각의 진세노 사이드 성분에 대한 농도를 HPLC로 정량 분석하였다. (A)는 기질, (B)는 에탄올 추출물, (C)는 컬럼을 통해 정제된 F1에 대한 결과를 나타낸다.1 is a diagram showing the PPT type ginsenoside bioconversion activity of β-glucosidase according to the present invention. Lanes 1, 2, 3, 4, 5 and 6, respectively, represent the standard ginsenosides Re, Rg 2, Rg 1, Rh 1, F 1 and PPTA; Lanes 7, 9, 11, 13 and 15 show ginsenosides Re, Rg2, Rg1, Rh1 and F1 which were not enzymatically treated; Lanes 8, 10, 12, 14 and 16 show the results after 24 hours of incubation of ginsenosides Re, Rg2, Rg1, Rh1 and F1 with β-glucosidase.
2 is a diagram showing a deglycosylated bioconversion pathway of PPT type ginsenosides by β-glucosidase according to the present invention.
Figure 3 is a diagram showing the effect of PPTx concentration in ginsenoside F1 production by β-glucosidase according to the present invention. Β-glucosidase (BgpA) at a concentration of 40 mg / ml was reacted by mixing with a solution of the same volume of substrate (PPTx) at the indicated concentration. The concentration represented by each symbol in the figure corresponds to the final concentration of the substrate in a mixture mixed with the same volume of β-glucosidase; 5 (●), 10 (▽), 15 (■), 20 (◇), 25 (○) and 50 (▲) mg / ml.
4 is a diagram showing the effect of NaCl during bioconversion from ginsenosides Re and Rg1 to F1 by β-glucosidase according to the present invention.
5 is a view showing the production or residual amount of each PPTx according to the bioconversion time by β-glucosidase according to the present invention.
Figure 6 is an HPLC chromatogram for F1 purification produced by bioconversion by enzymes according to the present invention. Concentrations for each ginsenoside component were quantitated by HPLC. (A) shows the results for the substrate, (B) the ethanol extract, and (C) the purified F1 through the column.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are for further illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not limited to these examples.

실시예Example 1: 화합물, 박테리아 균주 및 플라스미드 1: compound, bacterial strain and plasmid

표준 진세노사이드 Re, Rg1, Rg2, Rh1, F1 및 PPTA(protopanaxatriol aglycon)을 Nanjing Zelang Medical Tehnological Co. Ltd.(Nanjing, China)로부터, p-니트로페닐-β-D-글루코피라노시드(p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside; pNPGlc)를 시그마로부터 구입하였다. Diaion HP-20 수지(resin)는 Mitsubishi Co. Ltd.(Japan)로부터 구입하였다. 재조합 β-글루코시다제(β-glucosidase)는 한국의 인삼밭으로부터 분리한 테라박터 진세노시디뮤탄스 Gsoil3082T(Terrabacter ginsenosidimutans Gsoil3082T)로부터 복제하였다. 상기 균주는 KCTC19421T의 번호로 기탁되어 있다. β-글루코시다제를 코딩하는 유전자 β-글루코시다제를 복제하기 위하여 pGEX-4T-1(GE Healthcare)을 이용하여 상기 β-글루코시다제 유전자의 N-말단에 글루타치온 S-전이효소(glutathione S-transferase; GST)를 포함하는 pGEX-bgpA를 제조하였다. E.coli C41(DE3)(Lucigen Corporation, USA)에 상기 제조한 벡터를 형질전환시켜 유전자를 발현시켰다. 본 발명에 사용한 다른 화학물질은 적어도 분석시약 등급(analytical reagent grade)의 것을 사용하였으며, 출처는 방법 부분에 각각 표기하였다.
Standard ginsenosides Re, Rg1, Rg2, Rh1, F1 and protopanaxatriol aglycon (PPTA) were prepared using Nanjing Zelang Medical Tehnological Co. P-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside (pNPGlc) was purchased from Sigma from Ltd. (Nanjing, China). Diaion HP-20 resin is available from Mitsubishi Co. It was purchased from Ltd. (Japan). Recombinant β-glucosidase was isolated from terrabacter ginsenocidimutans Gsoil3082 T ( Terrabacter isolated from Korean ginseng fields. ginsenosidimutans Cloned from Gsoil3082 T ). The strain has been deposited with the number of KCTC19421 T. Glutathione S-transferase at the N-terminus of the β-glucosidase gene using pGEX-4T-1 (GE Healthcare) to clone the gene encoding β-glucosidase. pGEX-bgpA comprising -transferase (GST) was prepared. E. coli C41 (DE3) (Lucigen Corporation, USA) was transformed into the vector prepared above to express the gene. Other chemicals used in the present invention used at least analytical reagent grade, and the source is indicated in the method section respectively.

실시예Example 2: β- 2: β- 글루코시다제의Glucosidase 제조 Produce

E. coli 배양을 위하여 앰피실린(ampicillin; 50 μg/ml)을 첨가한 LB(Luria-Bertani) 배지를 사용하였다. 배양물을 600 nm에서 흡광도가 0.6에 도달할 때까지 37℃에서 배양하고, 이후 온도를 20℃로 낮추었다. 배지의 pH는 50 mM 인산나트륨을 이용하여 7.5로 조절하였다. 최종 농도가 0.1 mM이 되도록 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside; IPTG)를 첨가하여 단백질 발현을 유도하였다. 25℃에서 12시간 더 배양하고 4℃에서 5,000×g로 20분간 원심분리하여 균체(bacterial cell)를 회수하였다. 상기 회수한 균체를 50 mM 인산염완충액(pH 7.5)으로 현탁시킨 후 초음파처리(Vibra-cell, Sonics & Materials, CT)하여 파쇄하였다. 조효소(crude enzyme)의 상등액을 회수하기 위하여 수득한 용해물을 20,000×g로 4℃에서 30분간 원심분리하였다. 수득한 조효소는 50 mM 인산염완충액으로 원하는 농도로 희석시켜 진세노사이드의 생물전환에 이용하였다. For E. coli culture, LB (Luria-Bertani) medium with ampicillin (50 μg / ml) was used. Cultures were incubated at 37 ° C. at 600 nm until the absorbance reached 0.6 and then the temperature was lowered to 20 ° C. The pH of the medium was adjusted to 7.5 using 50 mM sodium phosphate. Protein expression was induced by addition of isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) to a final concentration of 0.1 mM. The cells were further incubated at 25 ° C. for 12 hours and centrifuged at 5,000 × g for 20 minutes at 4 ° C. to recover the bacterial cells. The recovered cells were suspended in 50 mM phosphate buffer (pH 7.5) and then disrupted by sonication (Vibra-cell, Sonics & Materials, CT). The obtained lysate was centrifuged at 20,000 × g for 30 minutes at 4 ° C. to recover the supernatant of crude enzyme. The obtained coenzyme was diluted to a desired concentration with 50 mM phosphate buffer and used for bioconversion of ginsenosides.

본 발명자들은 테라박터 진세노시디뮤탄스 Gsoil3082T로부터 β-글루코시다제 유전자(1947 bp; 서열번호 2)를 복제하여 과발현시키고 이를 특성화하는 방법을 보고한 바 있다(An, D. S. et al ., Appl . Environ . Microbiol ., 2010, 76: 5827-5836). 활성형 및 가용성 β-글루코시다제를 생산하기 위한 최상의 조건을 찾기 위하여, 다양한 농도의 IPTG 및 온도 조건 하에서 실험하였다. 50 mM 인산나트륨 완충액으로 pH를 7.5로 조절하고 1%(w/v) 글루코스를 포함하는 배지에 배양온도를 20℃로 하여 배양하였을 때, 단백질 발현이 최대화되었다. 또한 β-글루코시다제 대부분이 가용성 형태로 발현되었다. β-글루코시다제를 과발현시킨 세포의 습윤 펠렛(wet pellet)을 10 부피(w/v)의 50 mM 인산나트륨 완충액(pH 7.5)에 재현탁시켜 세포를 초음파처리기로 파쇄하였다. 12,500×g로 30분간 원심분리하여 세포 파편(debris)을 제거하고, 상층액을 진세노사이드 생물전환을 위한 조효소로 사용하였다.
We have reported a method for cloning and overexpressing and characterizing the β-glucosidase gene (1947 bp; SEQ ID NO: 2) from terabacter ginsenosidicantans Gsoil3082 T (An, DS et. al . , Appl . Environ . Microbiol . , 2010, 76: 5827-5836). To find the best conditions for producing active and soluble β-glucosidase, experiments were carried out under varying concentrations of IPTG and temperature conditions. Protein expression was maximized when the pH was adjusted to 7.5 with 50 mM sodium phosphate buffer and incubated at 20 ° C. in a medium containing 1% (w / v) glucose. In addition, most β-glucosidase was expressed in soluble form. Wet pellets of cells overexpressing β-glucosidase were resuspended in 10 volumes (w / v) of 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.5) to disrupt cells by sonication. Cell debris was removed by centrifugation at 12,500 × g for 30 minutes, and the supernatant was used as a coenzyme for ginsenoside bioconversion.

실시예Example 3:  3: PPTPPT 타입  type 진세노사이드Gin Senocide ReRe 및  And Rg1Rg1 혼합물의 조혼합물( Crude mixture of mixture crudecrude mixture)의 제조 preparation of mixtures)

건조 고려삼(Korean ginseng; Panax ginseng, C. A. Meyer) 및 회기삼(American ginseng; Panax quinquefolius) 뿌리 분말 혼합물(4:1, w/w)을 이용하여 진세노사이드를 추출하였다. 10 kg의 인삼 뿌리 분말을 100 L의 70% 에탄올로 2회 반복 추출하였다. 추출물은 거름종이로 여과하여 회전증발기(rotary evaporator)로 건조시켰다. 생성된 건조 분말을 물에 녹여 Diaion HP-20 수지를 채운 유리컬럼(400 mm 길이×100 mm 직경)에 로딩하였다. 비드에 흡착된 HP-20으로부터 자유 설탕 분자(free sugar molecule) 및 원하지 않는 친수성 화합물을 8 컬럼 부피의 물로 세척한 후, PPT 타입 진세노사이드를 4 컬럼 부피의 40% 에탄올로 용출시켰다. 에탄올 추출물을 진공에서 증발시키고 남은 건조 잔류물을 β-글루코시다제를 이용한 희귀 진세노사이드 F1 생산을 위한 기질 진세노사이드(substrate ginsenoside)로 사용하였다. HPLC 분석에 따르면, 혼합물은 32.4% Rg1, 31.9% Re, 6.6% Rb1, 6.2% Rd 및 6.0% Rc로 구성되었다. 상기 진세노사이드 조혼합물(crude ginsenoside mixture)을 PPTx라 명명하고 본 발명의 효소반응의 최적화 및 F1 생산에 사용하였다. 효소반응을 위하여 50 mM 인산염완충액에 녹인 PPTx는 최고 100 mg/ml의 용해도를 갖는다.Ginsenosides were extracted using a mixture of dried Korean ginseng (Panax ginseng, C. A. Meyer) and Korean ginseng (Panax quinquefolius) root powder (4: 1, w / w). 10 kg of ginseng root powder was extracted twice with 100 L of 70% ethanol. The extract was filtered through a filter paper and dried on a rotary evaporator. The resulting dry powder was dissolved in water and loaded into a glass column (400 mm long × 100 mm diameter) filled with Diaion HP-20 resin. After free sugar molecules and unwanted hydrophilic compounds were washed with 8 column volumes of water from HP-20 adsorbed on the beads, PPT type ginsenosides were eluted with 4 column volumes of 40% ethanol. The ethanol extract was evaporated in vacuo and the remaining dry residue was used as the substrate ginsenoside for rare ginsenoside F1 production using β-glucosidase. According to HPLC analysis, the mixture consisted of 32.4% Rg1, 31.9% Re, 6.6% Rb1, 6.2% Rd and 6.0% Rc. The crude ginsenoside mixture was named PPTx and used to optimize the enzyme reaction of the present invention and to produce F1. PPTx dissolved in 50 mM phosphate buffer for enzymatic reaction has a solubility of up to 100 mg / ml.

순수한 진세노사이드 Re는 소수성으로 인해 50 mM 인산완충액(pH7.5)에 용해되기 어렵다. 따라서, β-글루코시다제는 단지 낮은 농도(0.2 mg/ml 미만)의 순수한 Re만을 가수분해할 수 있다. 반면, 진세노사이드 Rg1은 50 mM 인산완충액에 쉽게 용해되므로, 고농도(100 mg/ml)에서도 β-글루코시다제에 의해 F1으로 쉽게 가수분해될 수 있다. 한편, 흥미롭게도, Re의 용해도는 Re와 Rg1이 공존할 때, 증가될 수 있다. 이에 따라, 진세노사이드 Re에 대한 β-글루코시다제의 가수분해활성 또한 향상될 수 있다.Pure ginsenoside Re is difficult to dissolve in 50 mM phosphate buffer (pH 7.5) due to its hydrophobicity. Thus, β-glucosidase can only hydrolyze pure Re at low concentrations (less than 0.2 mg / ml). On the other hand, ginsenoside Rg1 is easily dissolved in 50 mM phosphate buffer, and thus can be easily hydrolyzed to F1 by β-glucosidase even at high concentrations (100 mg / ml). On the other hand, interestingly, the solubility of Re can be increased when Re and Rg1 coexist. Accordingly, the hydrolytic activity of β-glucosidase on ginsenoside Re can also be improved.

본 발명에서는 상기 에탄올 추출 과정을 통해 10 kg의 인삼 혼합 분말로부터 2,894 g의 조인삼추출물(crude ginseng extract)을 수득하였다. 상기 수득한 조인삼추출물은 셋으로 균등하게 나누어 그 중 일 분획을 HP-20 수지를 채운 유리 컬럼에 로딩하였다. 컬럼을 물로 세척하여 원치않는 분획을 제거한 후, 40% 에탄올로 용출시켜 62 g의 PPTx를 수득하였다.
In the present invention, 2,894 g of crude ginseng extract was obtained from 10 kg of ginseng mixed powder through the ethanol extraction process. The obtained ginseng extract was divided equally into three and one fraction thereof was loaded on a glass column filled with HP-20 resin. The column was washed with water to remove unwanted fractions, then eluted with 40% ethanol to give 62 g of PPTx.

실시예Example 4:  4: PPTPPT 타입  type 진세노사이드에Ginsenoside 대한 β-글루코시다제의 기질 특이성 Substrate Specificity of β-glucosidase for

효소의 생물전환 활성을 확인하기 위하여 37℃에서 40 mg/ml의 조효소를 동일한 부피의 50 mM 인산나트륨완충액(pH 7.5)을 이용하여 최종 농도 0.1%(w/v)로 제조한 표준 PPT 타입 진세노사이드 Re, Rg1, Rg2, F1 및 Rh1 용액과 반응시켰다. 24시간 동안 인큐베이션시킨 후 시료를 회수하여 선처리 후 TLC(thin layer chromatography)로 분석하였다.Standard PPT type gin prepared with 40 mg / ml coenzyme at 37 ° C using an equal volume of 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.5) to confirm the bioconversion activity of the enzyme at a final concentration of 0.1% (w / v). Reaction with cenosides Re, Rg1, Rg2, F1 and Rh1 solutions. After incubation for 24 hours, the samples were collected and analyzed by thin layer chromatography (TLC) after pretreatment.

본 발명의 β-글루코시다제의 PPT 타입 진세노사이드에 대한 생물전화 과정에서의 가수분해 경향을 찾기 위하여, 정제된 효소를 표준 PPT 타입 진세노사이드 Re, Rg1, Rg2, Rh1 및 F1과 반응시켰다. 상기 β-글루코시다제에 의한 상기 진세노사이드의 가수분해 산물은 TLC로 확인하였다(도 1). 도 1에 나타낸 바와 같이, 조 β-글루코시다제는 진세노사이드 Re 및 Rg1 모두를 각각 F1으로 가수분해 하였다. 상기 F1은 β-글루코시다제의 농도가 증가되거나 반응기간이 연장되었을 때, PPTA로 더 가수분해되었다. 나아가, Rg2 및 Rh1 역시 직접 PPTA로 가수분해되었다. 본 효소반응의 기질 및 반응 생성물의 관계를 도 2에 나타내었다. 도 2에 나타낸 바와 같이, β-글루코시다제의 공지된 활성인 3번 탄소의 히드록시기에 치환된 글루코스 모이어티를 가수분해하는 PPD 타입 진세노사이드에 대한 작용 모드와는 달리, PPT 타입 진세노사이드에 대하여 6번 및 20번 탄소의 히드록시기에 치환된 글루코스 모이어티를 가수분해할 수 있음을 확인하였다.In order to find the tendency of hydrolysis in the bioconversion process of the β-glucosidase of the present invention to the PPT type ginsenoside, the purified enzyme was reacted with the standard PPT type ginsenosides Re, Rg1, Rg2, Rh1 and F1. . Hydrolysis products of the ginsenosides by the β-glucosidase were confirmed by TLC (FIG. 1). As shown in Figure 1, crude β-glucosidase hydrolyzed both ginsenosides Re and Rg1 to F1, respectively. The F1 was further hydrolyzed with PPTA when the concentration of β-glucosidase was increased or the reaction period was prolonged. Furthermore, Rg2 and Rh1 were also directly hydrolyzed with PPTA. The relationship between the substrate of the present enzyme reaction and the reaction product is shown in FIG. 2. As shown in FIG. 2, unlike the mode of action for PPD type ginsenosides that hydrolyse the glucose moiety substituted with the hydroxyl group of carbon 3, the known activity of β-glucosidase, PPT type ginsenosides. It was confirmed that the glucose moiety substituted with the hydroxy groups of carbons 6 and 20 can be hydrolyzed.

구체적으로, β-글루코시다제는 PPD 타입 진세노사이드에 대해서, 3번 탄소의 히드록시기에 치환된 글루코스 모이어티를 가수분해 함에 있어서, 두 개의 글루코스가 연달아 치환된 경우 말단에 위치한 모이어티부터 하나씩 차례로 가수분해시킬 수 있음을 확인하였다. 예를 들어, 3번 및 20번 탄소의 히드록시기에 각각 차례로 연결된 2개의 글루코스 모이어티가 치환된 진세노사이드 Rb1을 본 발명의 β-글루코시다제로 가수분해시키는 경우, 20번 탄소의 히드록시기에 각각 차례로 연결된 2개의 글루코스 모이어티는 손상되지 않은 채로 3번 탄소의 히드록시기에 치환된 차례로 2개의 글루코스 모이어티가 말단으로부터 차례로 가수분해 됨으로써 각각 지페노사이드 XVII 및 LXXV를 생산하는 것이 관찰되었으며, 최종적으로 20번 탄소의 히드록시기에 치환된 차례로 연결된 2개의 글루코스 모이어티 중 말단에 위치한 하나의 글루코스 모이어티를 가수분해하여 컴파운드 K를 생산할 수 있었다(An, D. S. et al ., Appl . Environ. Microbiol ., 2010, 76: 5827-5836). 그러나 본 발명에서 β-글루코시다제를 PPT 타입 진세노사이드의 가수분해에 적용한 결과, Rg1의 6번 탄소의 히드록시기에 치환된 단일 글루코스 모이어티를 가수분해시킬 뿐만 아니라, Re의 6번 탄소의 히드록시기에 치환된 말단에 위치한 람노스 모이어티에 의해 보호된 글루코스 모이어티를 직접 가수분해시켜 상기 진세노사이드 Rg1 및 Re 모두로부터 F1을 생산할 수 있음을 확인하였다. 나아가 상기 F1의 20번 탄소의 히드록시기에 치환된 글루코스 모이어티를 추가로 가수분해하여 PPTA를 제조할 수 있었다. 또한 유사한 메커니즘에 의하여 Rh1의 6번 탄소의 히드록시기에 치환된 단일 글루코스 모이어티를 가수분해시킬 뿐만 아니라, Rg2의 6번 탄소의 히드록시기에 치환된 말단에 위치한 람노스 모이어티에 의해 보호된 글루코스 모이어티를 직접 가수분해시켜 상기 진세노사이드 Rh1 및 Rg2 모두로부터 직접 PPTA를 생산할 수 있음을 확인하였다. 상기 본 발명의 β-글루코시다제는 람노시다제 활성을 갖지 않으므로, 상기 Re 및 Rg2를 가수분해하여 각각 F1 및 PPTA로 전환하는 것은 외부의 람노스로부터 내부의 글루코스를 순차적으로 가수분해하는 것이 아니라, 직접 내부의 글루코스를 가수분해하는 것이다. 이는 본 발명의 β-글루코시다제가 직접 이당(disaccharide)을 가수분해할 수 있음을 나타낸다.
Specifically, β-glucosidase hydrolyzes a glucose moiety substituted with a hydroxy group of carbon 3 for PPD type ginsenosides, one by one from the terminal located at the terminal when two glucoses are successively substituted. It was confirmed that it can be hydrolyzed. For example, when hydrolyzing the ginsenoside Rb1 substituted with two glucose moieties, which are connected in turn to the hydroxy groups of carbons 3 and 20, respectively with the β-glucosidase of the present invention, each of the hydroxy groups of carbon 20 is It was observed that the two glucose moieties linked intact were hydrolyzed from the end to the two glucose moieties, one after the other, substituted in turn with a hydroxyl group of carbon 3 to produce Zipenosides XVII and LXXV, respectively. Compound K could be produced by hydrolyzing one glucose moiety at the end of two sequentially linked glucose moieties substituted with a hydroxy group of carbon (An, DS et al. al . , Appl . Environ. Microbiol . , 2010, 76: 5827-5836). However, in the present invention, the β-glucosidase is applied to the hydrolysis of PPT type ginsenosides, and not only hydrolyzes a single glucose moiety substituted with a hydroxy group of carbon 6 of Rg1, but also a hydroxyl group of carbon 6 of Re. It was confirmed that the glucose moiety protected by the rhamnose moiety located at the terminal substituted at was directly hydrolyzed to produce F1 from both the ginsenosides Rg1 and Re. Furthermore, PPTA could be prepared by further hydrolysis of the glucose moiety substituted with the hydroxyl group of carbon 20 of F1. A similar mechanism also hydrolyzes a single glucose moiety substituted with a hydroxy group of carbon 6 of Rh1, as well as a glucose moiety protected by a rhamnose moiety located at the terminal substituted with a hydroxy group of carbon 6 of Rg2. Direct hydrolysis confirmed that PPTA can be produced directly from both ginsenosides Rhl and Rg2. Since the β-glucosidase of the present invention does not have rhamnosidase activity, the hydrolysis of Re and Rg2 to F1 and PPTA, respectively, does not sequentially hydrolyze internal glucose from external rhamnose. To directly hydrolyze the glucose inside. This indicates that the β-glucosidase of the present invention can directly hydrolyze disaccharides.

실시예Example 5: 반응조건의 최적화 5: optimization of reaction conditions

PPTx를 F1으로 생물전환시키기 위한 최적의 조건을 찾기 위하여 반응에 사용한 PPTx의 기질 농도를 변화시키며 최적화하였다.
In order to find the optimal conditions for the bioconversion of PPTx to F1, the substrate concentration of PPTx used in the reaction was changed and optimized.

5.1. 기질 농도의 최적화5.1. Optimization of Substrate Concentration

조 β-글루코시다제(crude β-글루코시다제) 농도를 40 mg/ml로 고정시키고 동일한 부피의 10, 20, 30, 40, 50 및 100 mg/ml(도 3에는 5, 10, 15, 20, 25, 50) 농도의 PPTx와 반응시켰다. 시료를 일정한 시간 간격으로 채취하여 HPLC로 분석하였다.The crude β-glucosidase concentration was fixed at 40 mg / ml and the same volumes of 10, 20, 30, 40, 50 and 100 mg / ml (5, 10, 15, 20, 25, 50) at a concentration of PPTx. Samples were taken at regular time intervals and analyzed by HPLC.

상기 HPLC 분석 결과를 도 3에 나타내었다. HPLC 분석을 통해 생성된 F1을 정량한 결과, 동일한 부피의 효소와 기질용액을 혼합한 반응액에서 조 β-글루코시다제 농도를 20 mg/ml로 고정하였을 때, 최적 PPTx 농도는 25 mg/ml로 결정되었다. 즉, 40 mg/ml의 조 β-글루코시다제를 동일한 부피의 50 mg/ml PPTx 용액과 혼합하였을 때 최적의 효율로 F1을 생산할 수 있었다. 한편, 배양 2일째부터는 PPTA의 생산이 증가하기 시작하였다.
The HPLC analysis results are shown in FIG. 3. As a result of quantitative determination of F1 generated by HPLC analysis, when the crude β-glucosidase concentration was fixed at 20 mg / ml in the reaction solution of the same volume of enzyme and substrate solution, the optimal PPTx concentration was 25 mg / ml. Was decided. That is, when 40 mg / ml of crude β-glucosidase was mixed with an equal volume of 50 mg / ml PPTx solution, it was possible to produce F1 with optimum efficiency. On the other hand, production of PPTA began to increase from the second day of culture.

5.2. 5.2. NaClNaCl 농도의 최적화 Optimization of concentration

수용액에서 난용성인 PPTx의 용해도를 증가시키기 위하여 사용하는 NaCl의 효과를 확인하였다. 200, 500 및 1000 mM NaCl을 포함하는 효소반응에서 20 mg/ml의 고정된 효소농도에서 PPTx로부터 F1으로의 전환을 시험하였다.The effect of NaCl used to increase the solubility of poorly soluble PPTx in aqueous solution was confirmed. The conversion from PPTx to F1 was tested at a fixed enzyme concentration of 20 mg / ml in enzyme reactions containing 200, 500 and 1000 mM NaCl.

PPTx의 용해도 및 효소활성을 증가시키기 위한 최적의 NaCl 농도를 찾기 위하여, 고정농도 20 mg/ml의 효소를 이용하여 F1 생산에 대한 200, 500 및 1000 mM 농도의 NaCl의 영향을 확인하였다. 두 가지 기질(Re 및 Rg1) 및 생산물(F1 및 PPTA)의 시간대별 변화(time course change)를 HPLC를 이용하여 분석하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4는 반응 1일째부터 반응 일수에 따른 반응 기질 및 생산물의 비율을 나타낸 도이다. 반응 1일 후 Rg1은 더이상 검출되지 않았다. 즉, Rg1은 쉽고 빠르게 F1으로 전환되었음을 나타낸다. NaCl 농도에 따라 F1의 생산 속도가 증가하는 경향을 나타내었다. 그러나, 500 mM 또는 그 이상의 농도에서 더이상 F1의 생산량이 크게 증가하지 않으므로 본 발명에서는 3일째에 F1 농도가 최대에 이르는 200 mM NaCl을 최적 조건으로 결정하였다.
In order to find the optimal NaCl concentration to increase the solubility and enzymatic activity of PPTx, the effects of 200, 500 and 1000 mM concentrations of NaCl on F1 production were determined using a fixed concentration of 20 mg / ml enzyme. Time course changes of the two substrates (Re and Rg1) and the products (F1 and PPTA) were analyzed using HPLC. The results are shown in Fig. Figure 4 is a view showing the ratio of the reaction substrate and the product according to the number of reaction days from the first day of the reaction. After 1 day of reaction, Rg1 was no longer detected. In other words, Rg1 indicates that it is quickly and easily converted to F1. The production rate of F1 increased with increasing NaCl concentration. However, at a concentration of 500 mM or more, the production of F1 no longer increased significantly, so in the present invention, 200 mM NaCl was determined as the optimal condition at the maximum of the F1 concentration on the third day.

실시예Example 6: 대규모( 6: large scale ( scalescale -- upup ) 생물전환에 의한 F1의 생산) Production of F1 by Bioconversion

대규모 생물전환을 위해 5 L 교반-탱크 반응기(KoBioTech Co., Korea)에서 2.4 L 작업부피로 37℃에서 72시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 상기 반응은 실시예 5에서 실험적으로 결정한 최적화된 기질 및 NaCl 농도 조건 하에서 수행되었다. 구체적으로, 반응 혼합물은 25 mg/ml 농도의 기질 PPTx, 20 mg/ml β-글루코시다제 및 200 mM 염화나트륨을 포함하는 50 mM 인산염완충액(pH 7.5)으로 구성되었다. 일정한 시간 간격으로 시료를 채취하여 HPLC로 분석하면서 진세노사이드 PPTx로부터 F1으로의 생물전환을 확인하였다.For large-scale bioconversion, the reaction was stirred with 72 L working volume at 37 ° C. for 72 hours in a 5 L stirred-tank reactor (KoBioTech Co., Korea). The reaction was performed under optimized substrate and NaCl concentration conditions determined experimentally in Example 5. Specifically, the reaction mixture consisted of 50 mM phosphate buffer (pH 7.5) comprising substrate PPTx, 20 mg / ml β-glucosidase and 200 mM sodium chloride at a concentration of 25 mg / ml. Samples were taken at regular time intervals and analyzed by HPLC to confirm bioconversion from ginsenoside PPTx to F1.

상기 실시예 5에서 결정한 최적의 반응조건 즉, 25 mg/ml 기질농도, 200 mM NaCl 및 20 mg/ml 효소농도에서 2.4 L 규모의 효소반응을 수행하였다. PPTx 중 주요 기질의 하나인 Rg1은 반응 6시간째부터 빠르게 반응물로부터 사라지면서 F1으로 전환된 반면, Re는 점차적으로 사라지면서 F1으로 전환되었다(도 5). 추가적인 반응은 β-글루코시다제에 의한 가수분해 최종 산물인 PPTA의 생산을 증가시키므로 F1의 생산을 원하는 경우 3일째에 반응을 중단시키고 상등액을 회수하였다.
In the optimum reaction conditions determined in Example 5, namely, 25 mg / ml substrate concentration, 200 mM NaCl and 20 mg / ml enzyme concentration was carried out the 2.4 L scale enzyme reaction. Rg1, one of the major substrates of PPTx, quickly disappeared from the reaction from the reaction at 6 hours and was converted to F1, while Re gradually disappeared to F1 (FIG. 5). Additional reactions increased the production of PPTA, the hydrolysis end product by β-glucosidase, so the reaction was stopped on day 3 and the supernatant was recovered if desired to produce F1.

실시예Example 7: 생산된  7: produced 진세노사이드Gin Senocide F1의 정제 Tablet of F1

상기 실시예 6의 결과로 수득한 PPTx와 β-글루코시다제의 2.4 L 반응 혼합물을 4℃로 식히고 6,000 rpm으로 15분간 원심분리하였다. 상층액과 침전 중의 대사물을 각각 분리하였다. 상층액 중의 진세노사이드의 조성은 동일한 부피의 수용액-포화 부탄올로 진세노사이드 추출 후 HPLC로 확인하였다. 침전물은 1.5 L의 70% 에탄올로 2회 용해시키고 거름종이(Advantec, Japan)를 통해 여과시켰다. 에탄올 추출물은 함께 모아 진공으로 증발시켰다. 그 결과로 수득한 분말을 50% 메탄올에 녹이고 ODS 수지(octadecylsilyl resin)(ZEOprep 60C18 40-63 μm, ZEOCHEM)를 채운 역상 실리카겔 컬럼(Biotage 180×70 φ mm)에 로딩하였다. 메탄올의 비율을 100%까지 증가시키면서 F1을 용출시켰다.The 2.4 L reaction mixture of PPTx and β-glucosidase obtained as a result of Example 6 was cooled to 4 ° C. and centrifuged at 6,000 rpm for 15 minutes. The supernatant and the metabolite during precipitation were separated respectively. The composition of ginsenosides in the supernatant was confirmed by HPLC after ginsenoside extraction with an equal volume of aqueous solution-saturated butanol. The precipitate was dissolved twice with 1.5 L of 70% ethanol and filtered through a filter paper (Advantec, Japan). The ethanol extracts were collected together and evaporated in vacuo. The resulting powder was dissolved in 50% methanol and loaded onto an inverted silica gel column (Biotage 180 × 70 φ mm) filled with ODS resin (octadecylsilyl resin) (ZEOprep 60C 18 40-63 μm, ZEOCHEM). F1 was eluted while increasing the proportion of methanol to 100%.

상기 상층액과 침전을 분리하여 HPLC로 진세노사이드 F1 함량을 확인한 결과, 상층액 중에는 매우 적은 양의 진세노사이드 F1만이 존재하므로 제거하고, 침전으로부터 진세노사이드 F1을 정제하였다. 상기 에탄올 추출 및 컬럼 정제과정을 통해 9.6 g의 진세노사이드 F1(HPLC 순도 95.3%)을 회수하였다.As a result of separating the supernatant and the precipitate and confirming the ginsenoside F1 content by HPLC, only a very small amount of ginsenoside F1 was present in the supernatant, and the ginsenoside F1 was purified from the precipitate. 9.6 g of ginsenoside F1 (HPLC purity 95.3%) was recovered through the ethanol extraction and column purification.

본 발명에 따른 진세노사이드 F1 제조의 각 과정에서 얻어진 생산물의 중량, 순도 및 회수율을 표 1에 나타내었다.Table 1 shows the weight, purity and recovery of the product obtained in each process of preparing ginsenoside F1 according to the present invention.

Figure 112012071097988-pat00011
Figure 112012071097988-pat00011

실시예Example 8: 분석방법 8: Analysis method

상기 생물전환에 사용된 기질 및 반응 결과로 수득한 생성물 중의 진세노사이드의 조성을 분석하기 위하여, 반응 혼합물을 동일한 부피의 수용액-포화 n-부탄올로 추출하였다. 그 결과로 수득한 n-부탄올 분획을 건조시까지 증발시켰다. 잔여물(residual material)을 메탄올에 녹여 TLC 및/또는 HPLC로 분석하였다.
In order to analyze the composition of ginsenosides in the substrate obtained for the bioconversion and the product obtained as a result of the reaction, the reaction mixture was extracted with an equal volume of aqueous solution-saturated n-butanol. The resulting n-butanol fraction was evaporated to dryness. The residue material was dissolved in methanol and analyzed by TLC and / or HPLC.

8.1. 8.1. 박막크로마토그래피Thin layer chromatography (( thinthin -- layerlayer chromatographychromatography ; ; TLCTLC ) 분석) analysis

용매로는 클로로포름(chloroform), 메탄올 및 물을 65:35:10의 부피비로 혼합한 용매를 사용하고, 60F254 실리카겔 플레이트(Merck, Germany)를 이용하여 TLC를 수행하였다. TLC 플레이트 상의 스팟은 10%(v/v) 황산을 분무하고 110℃에서 5분간 가열하여 가시화한 후 표준 진세노사이드의 것과 비교하여 동정하였다.
As a solvent, a solvent in which chloroform, methanol and water were mixed at a volume ratio of 65:35:10 was used, and TLC was performed using a 60F 254 silica gel plate (Merck, Germany). Spots on TLC plates were identified by spraying 10% (v / v) sulfuric acid and visualizing by heating at 110 ° C. for 5 minutes and then comparing with that of standard ginsenosides.

8.2. 고성능 액체 크로마토그래피(8.2. High Performance Liquid Chromatography ( highhigh -- performanceperformance liquidliquid chromatographychromatography ; HPLC) 분석; HPLC) analysis

진세노사이드의 HPLC 분석은 4용매 펌프(quaternary pump), 자동주입기, 단일파장 UV 검출기(모델 730D) 및 피크 동정(identification) 및 통합(integration)을 위한 Younglin's Auto Chro 3000 소프트웨어를 구비한 HPLC 시스템(Younglin Co. Ltd., Korea)을 이용하여 수행하였다. 보호컬럼(guard column; Eclipse XDB C18, 5 μm, 12.5×4.6 mm 내경)을 구비한 Prodigy ODS(2) C18 컬럼(5 μm, 150×4.6 mm 내경) 상에서 분리를 수행하였다. 이동상으로는 아세토니트릴(용매 A) 및 물(용매 B)을 혼합하여 사용하였다. 구배용리(gradient elution)를 17% 용매 A 및 83% 용매 B로부터 시작하여 하기와 같이 변화시켰다: 12 내지 20분에 걸쳐 용매 A를 17%로부터 25%로, 20 내지 30분에 걸쳐 25%로부터 32%로, 30 내지 35분에 걸쳐 32%로부터 55%로, 35 내지 40분에 걸쳐 55%로부터 60%로, 40분 내지 45분에 걸쳐 60%로부터 80%로, 45분 내지 50분에 걸쳐 80%로부터 100%로 증가시키고 50 내지 54분에는 100% 용매 A로, 54.0 내지 54.1분에 걸쳐 용매 A의 비율을 100%로부터 17%로 다시 감소시킨 후 54.1분으로부터 65분까지 17% 용매 A로. 유속은 1.0 ml/min으로 고정하였고, 203 nm에서 흡광도를 측정하여 검출하였다. 주입한 시료의 부피는 25 μl이다.
Ginsenoside HPLC analysis was performed using an HPLC system with a four-solvent pump, autoinjector, single wavelength UV detector (Model 730D) and Younglin's Auto Chro 3000 software for peak identification and integration ( Younglin Co. Ltd., Korea). Separation was performed on a Prodigy ODS (2) C 18 column (5 μm, 150 × 4.6 mm inner diameter) with a guard column (Eclipse XDB C 18 , 5 μm, 12.5 × 4.6 mm inner diameter). As a mobile phase, acetonitrile (solvent A) and water (solvent B) were mixed and used. Gradient elution was varied starting from 17% Solvent A and 83% Solvent B as follows: Solvent A from 17% to 25% over 12-20 minutes, from 25% over 20-30 minutes. From 32% to 32% over 30 to 35 minutes, from 55% to 60% over 35 to 40 minutes, from 60% to 80% over 40 to 45 minutes, from 45 to 50 minutes Increase from 80% to 100% over 50% with 54% solvent A, then reduce the proportion of solvent A back from 100% to 17% over 54.0-54.1 minutes and then 17% solvent from 54.1 minutes to 65 minutes. With A. The flow rate was fixed at 1.0 ml / min and the absorbance was detected at 203 nm. The volume of the injected sample is 25 μl.

한국생명공학연구원 생물자원센터Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KCTC19421KCTC19421 2009091520090915

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Claims (17)

PPT 타입의 제1 진세노사이드로부터 탈글라이코실화된 PPT 타입의 제2 진세노사이드를 제조하는 방법에 있어서,
PPT 타입의 제1 진세노사이드에 테라박터 속(Terrabacter sp .) 유래의 β-글루코시다제(β-glucosidase)를 처리하는 단계를 포함하는 것인 제조방법.
A process for preparing a deglycosylated second ginsenoside of PPT type from a first ginsenoside of PPT type,
Terrabacter on the first ginsenoside of the PPT type sp . ) Β-glucosidase (β-glucosidase) method comprising the step of treating.
제1항에 있어서,
상기 테라박터 속 미생물은 테라박터 진세노시디뮤탄스 Gsoil3082T(Terrabacter ginsenosidimutans Gsoil3082T)인 것인 제조방법.
The method of claim 1,
The microorganism of the genus Therabacter is terbacter ginsenosidimutans Gsoil3082 T ( Terrabacter ginsenosidimutans Gsoil3082 T ) manufacturing method.
제1항에 있어서,
상기 β-글루코시다제는 서열번호 1의 폴리펩티드 서열을 갖는 것인 제조방법.
The method of claim 1,
The β-glucosidase has a polypeptide sequence of SEQ ID NO: 1.
제1항에 있어서,
상기 테라박터 속(Terrabacter sp .) 유래의 β-글루코시다제(β-glucosidase)를 처리하는 단계는 테라박터 속(Terrabacter sp .) 유래의 천연 또는 재조합 β-글루코시다제 단백질; β-글루코시다제(β-glucosidase)를 발현하는 테라박터 속(Terrabacter sp .) 미생물, 테라박터 속(Terrabacter sp .) 유래의 β-글루코시다제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 도입시킨 형질전환체; 또는 이들의 배양물로 처리하는 것인 제조방법.
The method of claim 1,
The terrabacter genus sp . ( Beta ) -glucosidase derived from the step of terrabacter sp . ) Natural or recombinant β-glucosidase protein; Terrabacter expressing β-glucosidase sp . ) Microorganism, Terrabacter sp . A transformant introduced with a vector comprising a nucleic acid sequence encoding β-glucosidase derived from the gene; Or a treatment with these cultures.
제1항에 있어서,
상기 PPT 타입의 제1 진세노사이드는 삼, 삼 추출물 또는 삼 또는 이의 추출물을 포함하는 식품의 형태인 것인 제조방법.
The method of claim 1,
The first ginsenoside of the PPT type is a preparation method of a food comprising ginseng, hemp extract or hemp or an extract thereof.
제1항에 있어서,
상기 β-글루코시다제를 처리하는 단계는 PPT 타입 제1 진세노사이드의 총 중량과 1:0.6 내지 1:1의 중량비로 β-글루코시다제를 사용하는 것인 제조방법.
The method of claim 1,
The step of treating the β-glucosidase is a method of using β-glucosidase in a weight ratio of 1: 0.6 to 1: 1 with the total weight of the PPT type first ginsenoside.
제1항에 있어서,
상기 PPT 타입의 제1 진세노사이드는 각각 하기 화학식 3 내지 7의 구조식을 갖는 진세노사이드 Re, Rg1, Rg2, Rh1 또는 F1 또는 이들의 혼합물인 것인 제조방법.
[화학식 3]
Figure 112012071097988-pat00012

[화학식 4]
Figure 112012071097988-pat00013

[화학식 5]
Figure 112012071097988-pat00014

[화학식 6]
Figure 112012071097988-pat00015

[화학식 7]
Figure 112012071097988-pat00016

The method of claim 1,
The first ginsenosides of the PPT type are ginsenosides Re, Rg1, Rg2, Rh1 or F1 or mixtures thereof having the structural formulas of Formulas 3 to 7, respectively.
(3)
Figure 112012071097988-pat00012

[Chemical Formula 4]
Figure 112012071097988-pat00013

[Chemical Formula 5]
Figure 112012071097988-pat00014

[Chemical Formula 6]
Figure 112012071097988-pat00015

(7)
Figure 112012071097988-pat00016

 제1항에 있어서,
상기 PPT 타입의 제2 진세노사이드는 각각 하기 화학식 7 및 8의 구조식을 갖는 진세노사이드 F1 또는 PPTA 또는 이들의 혼합물인 것인 제조방법.
[화학식 7]
Figure 112012071097988-pat00017

[화학식 8]
Figure 112012071097988-pat00018

The method of claim 1,
The second ginsenoside of the PPT type is ginsenoside F1 or PPTA or a mixture thereof having the structural formulas of Formulas 7 and 8, respectively.
(7)
Figure 112012071097988-pat00017

[Chemical Formula 8]
Figure 112012071097988-pat00018

 제1항에 있어서,
상기 β-글루코시다제는 PPT 타입의 제1 진세노사이드의 6번 탄소에 위치한 치환 또는 비치환된 글루코스 모이어티를 가수분해하는 것인 제조방법.
The method of claim 1,
Wherein the β-glucosidase hydrolyzes the substituted or unsubstituted glucose moiety located at carbon 6 of the first ginsenoside of the PPT type.
제9항에 있어서,
진세노사이드 Re로부터 진세노사이드 F1로의 전환, 진세노사이드 Rg1로부터 진세노사이드 F1로의 전환, 진세노사이드 Rg2로부터 진세노사이드 PPTA로의 전환 및 진세노사이드 Rh1로부터 진세노사이드 PPTA로의 전환으로 이루어진 군에서 선택된 전환반응을 수행하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
10. The method of claim 9,
Group consisting of ginsenoside Re to ginsenoside F1, ginsenoside Rg1 to ginsenoside F1, ginsenoside Rg2 to ginsenoside PPTA and ginsenoside Rh1 to ginsenoside PPTA Method for producing a conversion reaction characterized in that carried out.
제1항에 있어서,
상기 β-글루코시다제는 PPT 타입의 제1 진세노사이드의 20번 탄소에 위치한 글루코스 모이어티를 가수분해하는 것인 제조방법.
The method of claim 1,
Wherein the β-glucosidase hydrolyzes the glucose moiety located at carbon 20 of the first ginsenoside of the PPT type.
제11항에 있어서,
진세노사이드 F1로부터 진세노사이드 PPTA로의 전환반응을 수행하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
12. The method of claim 11,
A process for producing ginsenoside F1 from ginsenoside PPTA.
테라박터 속(Terrabacter sp .) 유래의 β-글루코시다제(β-glucosidase)를 유효성분으로 포함하는, PPT 타입 진세노사이드(protopanaxatriol-type ginsenoside)의 체내 흡수가 용이한 형태의 가용성 진세노사이드로의 전환용 조성물.
 Terrabacter sp . A composition for converting a PPT type ginsenoside (protopanaxatriol-type ginsenoside) into a soluble ginsenoside in an easily absorbable form, comprising β-glucosidase derived from the).
제13항에 있어서,
상기 테라박터 속(Terrabacter sp .) 유래의 β-글루코시다제(β-glucosidase)는 테라박터 속(Terrabacter sp .) 유래의 천연 또는 재조합 β-글루코시다제 단백질; β-글루코시다제(β-glucosidase)를 발현하는 테라박터 속(Terrabacter sp .) 미생물, 테라박터 속(Terrabacter sp .) 유래의 β-글루코시다제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 도입시킨 형질전환체; 또는 이들의 배양물인 것인 조성물.
The method of claim 13,
The terrabacter genus sp . Β-glucosidase from the genus Terrabacter sp . ) Natural or recombinant β-glucosidase protein; Terrabacter expressing β-glucosidase sp . ) Microorganism, Terrabacter sp . A transformant introduced with a vector comprising a nucleic acid sequence encoding β-glucosidase derived from the gene; Or a culture thereof.
테라박터 속(Terrabacter sp .) 유래의 천연 또는 재조합 β-글루코시다제 단백질; β-글루코시다제(β-glucosidase)를 발현하는 테라박터 속(Terrabacter sp .) 미생물, 테라박터 속(Terrabacter sp .) 유래의 β-글루코시다제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 도입시킨 형질전환체; 이들의 배양물 또는 이들의 혼합물 및 PPT 타입 진세노사이드 또는 삼을 포함하는 식품, 식품첨가제, 사료 또는 사료첨가제.
 Terrabacter sp . ) Natural or recombinant β-glucosidase protein; Terrabacter expressing β-glucosidase sp . ) Microorganism, Terrabacter sp . A transformant introduced with a vector comprising a nucleic acid sequence encoding β-glucosidase derived from the gene; Food, food additives, feed or feed additives comprising their cultures or mixtures thereof and PPT type ginsenosides or hemps.
제15항에 있어서,
상기 식품은 발효식품인 것이 특징인 식품, 식품첨가제, 사료 또는 사료첨가제.
16. The method of claim 15,
The food is characterized in that the fermented food, food additives, feed or feed additives.
제15항에 있어서,
PPT 타입 진세노사이드 또는 삼내 PPT 타입 진세노사이드가 β-글루코시다제에 의해 가수분해된 것이 특징인 식품, 식품첨가제, 사료 또는 사료첨가제.
16. The method of claim 15,
A food, food additive, feed or feed additive characterized by the hydrolysis of PPT type ginsenosides or intradermal PPT type ginsenosides by β-glucosidase.
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